KR20230077611A - 근아세포의 증식과 근육세포로의 분화를 촉진하는 신규 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents
근아세포의 증식과 근육세포로의 분화를 촉진하는 신규 펩티드 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 근아세포의 증식과 분화를 촉진하는 신규 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 미오스타틴(myostatin; MSTN) 단백질의 일부 중 파이브로모둘린(fibromodulin) 단백질과 결합하는 아미노산 부위를 중심으로 신규 펩티드를 디자인한 후 마우스 근아세포주인 C2C12 세포에 처리하여 세포의 증식, 분화 및 근육의 재생 등을 관찰하였고, 디자인한 펩티드를 처리한 후 근아세포의 증식, 분화 및 근육의 재생이 증가함을 확인하였다.
Description
본 발명은 근아세포의 증식과 근육세포로의 분화를 촉진하는 신규 펩티드 및 이의 용도를 제공한다.
근육(muscle)은 인체를 구성하는 중요한 요소로, 중배엽의 줄기세포에서 발현되는 조직이다. 근육은 우리 몸의 40% 정도를 담당하며, 뼈와 힘줄에 지지해서 위치하고 근섬유 다발들로 이루어져 서로 움직이고 세포의 크기를 변하도록 하여 수축을 유발한다. 근육은 골격근육, 심장근육, 내장근육으로 구분되는데, 각각의 위치에서 힘을 만들어내고 움직임을 유발하며, 뼈, 관절, 내장 등의 신체기관을 보호하는 역할도 한다. 또한, 근육은 재생 능력을 가지고 있어, 근육이 손상을 받게 되면 위성세포와 그 주변 환경에 의해서 변성된 후 다시 원래의 수축 이완 능력을 가진 근육으로 재생될 수 있다.
근육질환은 선천적인 유전이나 환경적인 원인에 의해서 발생되며, 최근 고령화 사회 및 수명 연장의 흐름에 따라 근 감소와 관련된 질환이 증가하고 있다. 사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하고, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소됨으로써, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 원인으로 인식되고 있다. 이러한 근육질환은 과거에 비해 전 세계적으로 증가 추세에 있다.
하지만, 근육질환은 그 원인이 다른 질환에 비해 다양하기 때문에 정확한 진단이 쉽지 않고, 그 종류에 따라 증상 및 질환의 강도도 다양하며, 희귀 질환의 형태로 정확한 메커니즘이 밝혀지지 못한 경우가 많다. 근육질환은 그 증상이 급격하게 진행되고, 근육질환 환자들은 상기 질환이 진행됨에 따라 혼자서는 일상적인 생활이 어려울 정도로 고통 받고 있으나, 근본적인 관련 질환에 대한 치료제들은 거의 없는 실정이다.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드; 및 상기 펩티드를 유효성분으로하는 약학 조성물 및 시약 조성물에 관한 것으로, 펩티드를 처리한 후 근아세포의 증식, 분화 및 근육의 재생이 증가하는 것을 확인하였는바, 1) 근아세포의 증식 촉진, 2) 근아세포의 분화 촉진 및 3) 손상된 근육의 재생 등을 위한 물질로 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 (이하, MIF1이라함)의 존재 및 부재에 따른 미오스타틴 (myostatin; 이하, MSTN이라함)과 ACVRIIB (activin IIb receptor)의 세포외 도메인의 상호 작용을 나타낸다.
도 2는 MIF1 여부에 따른 MSTN 및 ACVRIIB 단백질의 결합 아미노산을 나타낸다.
도 3은 MSTN 단백질 처리에 따른 근아세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 4는 다양한 변형 MIF1 처리에 따른 근아세포의 증식을 나타낸다.
도 5는 MIF1 처리에 따른 근모세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 6은 근육분화 중 MIF1 처리에 따른 Atrogin1, MuRF1 및 ACVRIIB 발현을 나타낸다.
도 7은 Ac-MIF1 처리에 따른 근모세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 8은 근육분화 중 Ac-MIF1 처리에 따른 Atrogin1, MuRF1 및 ACVRIIB 발현을 나타낸다.
도 9는 근육분화 동안 Ac-MIF1 펩티드 및 MSTN 단백질 처리를 나타낸다.
도 10은 Ac-MIF1 펩티드 처리에 따른 근육재생 효과를 나타낸다.
도 2는 MIF1 여부에 따른 MSTN 및 ACVRIIB 단백질의 결합 아미노산을 나타낸다.
도 3은 MSTN 단백질 처리에 따른 근아세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 4는 다양한 변형 MIF1 처리에 따른 근아세포의 증식을 나타낸다.
도 5는 MIF1 처리에 따른 근모세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 6은 근육분화 중 MIF1 처리에 따른 Atrogin1, MuRF1 및 ACVRIIB 발현을 나타낸다.
도 7은 Ac-MIF1 처리에 따른 근모세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 8은 근육분화 중 Ac-MIF1 처리에 따른 Atrogin1, MuRF1 및 ACVRIIB 발현을 나타낸다.
도 9는 근육분화 동안 Ac-MIF1 펩티드 및 MSTN 단백질 처리를 나타낸다.
도 10은 Ac-MIF1 펩티드 처리에 따른 근육재생 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
기존의 근육장애로 인하여 근성장에 문제가 있는 환자군들에 대해서, MSTN 단백질을 억제시켜 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화 (amidation) 또는 N-말단이 아세틸화 (acetylation)될 수 있다.
상기 펩티드는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 가질 수 있으며, 바람직하게 미오스타틴 (myostatin; MSTN) 단백질을 억제시켜 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 근육장애는 근육위축증, 근질환, 근육 손상, 근이영양증, 근육감소증, 근신경 전도성 질병 또는 신경 손상 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 점안제 및 주사용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 유효성분은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량부에 1 중량부 내지 90 중량부 포함되도록 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[준비예 1] 펩티드 확보
MIF1, Ac-MIF1, MIF1-NH2 및 Ac-MIF1-NH2 (이하, MIF 펩티드라함)는 펩트론 (Peptron)사에서 합성되었으며, DMSO (dimethyl sulfoxide)로 희석하고 -20 ℃에서 보관하였다.
[준비예 2] C2C12 세포배양 및 MIF 펩티드 처리에 따른 증식관찰
마우스 근아세포주인 C2C12 세포는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + 10 % FBS (Fetal bovine serum) + 1 % Penicillin / Streptomycin(P/S)에서 배양하였다. MIF 펩티드의 효과를 검증하기 위해 C2C12 세포 (2x103 cells/ml)를 12 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착 시킨 후, MIF 펩티드 (1000 nM)를 1일 동안 처리한 하고, 세포의 증식을 MTT 법으로 확인하였다. 배지는 2일에 한번 씩 교체하였으며 세포는 37 ℃에서 배양하였다.
[실험예 1] 단백질-단백질 상호작용 분석
MSTN (pdb id: 3HH2) 및 ACVRIIB (pdb id: 1S4Y)의 구조는 RCSB 단백질 데이터뱅크에서 검색되었다. 모든 물 분자와 헤테로 원자는 두 구조에서 모두 제거되었다. FMOD의 구조는 I-TASSER (미국 미시간주 앤아버에 있는 미시간 대학교 Yang Zhang 연구소, http://zhanglab.ccmb.med.umich)를 사용하여 초기 접힘 및 스레딩 방법의 조합을 사용하여 모델링되었다. 상동체의 단백질 데이터 뱅크 구조에서 서열 동일성의 낮은 비율은 FMOD에 대한 강력한 모델을 가져오지 못할 수 있어서, 최첨단 구조에 대한 객관적인 평가를 제공하기 위해 설계된 세계적인 실험인 CASP (Critical Assessment of Structure Prediction) -7 및 -8에 의해 결정된 최상의 단백질 모델을 제공하는 I-TASSER 서버를 사용했다. 이 분석에서 모든 단백질-단백질 연구는 패치독을 사용하여 수행되었다. MSTN과 그 수용체 ACVRIIB 사이의 결합을 조사하기 위해 단백질-단백질 상호작용 연구가 수행되었다. ACVRIIB와 MSTN (FMOD가 있거나 없는 복합) 간의 단백질-단백질 상호 작용은 PatchDock 서버(Institute of Molecular Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel; http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/)를 사용하여 수행되었다.
[실험예 2] 패턴분석
몇 가지 공통된 결합 패턴을 찾기 위해 일련의 평가가 수행되었다. FMOD 및 ACVRIIB에 대한 MSTN의 결합을 심층 분석하고, 상호작용에 최대 참여하는 MSTN의 잔기 세그먼트를 선택했다. 접근 가능한 표면적의 변화 및 가상 알라닌 스캐닝 (http://robetta.bakerlab.org/alaninescan에서 사용 가능)과 같은 다양한 접근 방식을 사용하여 패턴 연구를 수행하여 복합체에 기여하는 최대 잔류물을 예측하였다.
[실험예 3] 펩티드 스크리닝
MSTN에 대한 설계된 펩티드의 효능은 in silico 결합 접근법을 사용하여 예측되었다. 여기에서 설계된 모든 펩티드는 MSTN에 대해 도킹되었다. 결합 연구는 Patchdock을 사용하여 수행되었다. Patchdock에서 얻은 결과는 각각 1000단계에 대해 Firedock을 사용하여 추가 개선을 거쳤으며 최상위 스코어링 펩티드는 MSTN에 대한 전체적인 결합 에너지를 기반으로 선택되었다. 펩티드 정보는 표 1과 같다.
| 펩티드 | 서열정보 | 크기 (mer) | 분자식 | 분자량 |
| MIF1 | VDFEAFWDWG | 10 | C63H74N12O17 | 1270.53 |
| Ac-MIF1 | Ac-VDFEAFWDWG | 10 | C65H76N12O18 | 1312.54 |
[실험예 4] 스크래치 (Scratch) 실험
C2C12 세포가 100 % 성장하였을 때 세포 표면에 스크래치를 가하고 1000 nM MIF1 또는 Ac-MIF1 펩티드를 처리하고, 1일 동안 배양한 후 세포의 회복 정도를 관찰하였다.
[실험예 5] 세포증식 검증 (MTT 법)
세포의 증식을 검증하기 위해 세포의 배양 배지를 제거하고 DMEM으로 세포를 세척한 후 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS)에 용해된 MTT 시약 (0.5 mg/ml) 500 ㎕를 각 well에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 방치하였다. 반응액을 제거하고 1000 ㎕의 DMSO를 각 well에 첨가하였다. 보라색의 포마잔 크리스탈 (formazan crystals)을 DMSO에 완전히 용해시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
[실험예 6] MSTN 단백질 처리
C2C12 세포가 70 % 성장 하였을 때, 증식배지에서 MSTN 단백질 (1 ng), Ac-MIF1 (1000 nM) 및 Ac-MIF1 (1000 nM) + MSTN 단백질 (1 ng)가 첨가된 근육분화 배지로 교체한 후 3일 동안 배양하였다.
[실험예 7] 근육분화
근아세포의 근육세포로의 분화를 위해 세포가 약 70 % 이상 성장하였을 때, 분화배지 (DMEM + 2 % FBS + 1 % P/S)로 교체하여 3일 동안 배양하였다. 배지는 매일 한번 씩 교체하였으며 세포는 37 ℃에서 배양하였다.
[실험예 8] Giemsa 염색 및 융합지수 계산
세포의 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하였다. 세척 후 1:1 부피비율의 메탄올 (Methanol): PBS 시약을 처리한 후 2분 동안 고정하였다. 추가적으로 2:1 부피비율의 메탄올 : PBS 시약을 첨가한 후 2분 동안 추가로 고정하였다. 2분 후 0.04 % Giemsa 시약을 첨가한 후 30분 동안 방치하고 30분 후 PBS로 세척을 하고 세포의 모습을 현미경으로 관찰하고 세포의 사진을 3장씩 찍었다 (300x). 찍은 사진에서 근관세포 내에서 융합 (fusion)된 핵의 수를 세고, 총 세포의 핵 수를 센 후 융해된 핵 수를 총 세포의 핵 수로 나누어 % 값을 산출하였다.
[실험예 9] RNA 추출 및 cDNA 합성
TRIzol™ 시약 1 ml을 첨가한 후 초고주파 분쇄기 (sonicator)를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄한 샘플을 원심분리 한 후 (12,000 rpm, 10분, 4℃) 상층액을 새 튜브에 옮기고 클로로포름 200 ㎕를 넣고 실온에 10분 동안 방치하였다. 10분 후 원심 분리하여 (12,000 rpm, 10분, 4 ℃) 투명색의 상층액을 수득하였다. 다음으로 이소프로판올 (isopropanol) 500 ㎕를 넣고 10분 동안 방치하고 원심분리 하여 RNA 펠렛을 얻었다. RNA 펠렛에 70 % 에탄올 (에탄올 + 디에틸피로카르본산(diethylpyrocarbonate, 이하, DEPC라함)가 처리된 증류수)을 첨가하여 세척한 후, 완벽하게 제거하고 건조시켰다. 건조된 투명색의 RNA에 DEPC가 처리된 증류수를 넣고 -80 ℃에 보관하였다. 전체 RNA 양은 나노드롭 (Nanodrop)으로 측정하였으며, 1.2 % 아가로즈 젤 (Agarose gel)에서 18s, 28s 밴드를 확인하였다. cDNA는 2 μg의 전체 RNA (total RNA), 랜덤 헥사머 (random hexamer) 프라이머 및 역전사효소 (Reverse Transcriptase)와 함께 합성하였다 (25 ℃: 10분, 37 ℃: 120분 85 ℃: 5분).
[실험예 10] 유전자 발현 확인 (Real-time PCR)
유전자 발현 확인을 위해 실시간 PCR (Real-time PCR; RT-PCR)을 수행하였다. 실시간 유전자 발현 관찰을 위해 SYBR 그린(green)의 형광물질을 포함한 Power SYBR Green PCR Master Mix를 이용하여 유전자 발현을 분석하였다 (7500 Real-time PCR system). PCR 프라이머는 NCBI GenBank에서 확보된 염기서열 (nucleotide sequence)에 따라 Primer 3 software (http://frodo.wi.mit.edu)로 디자인하였다. PCR은 95 ℃에서 10분, 다시 95 ℃에서 33초, 유전자 프라이머 온도 (tm)에 따라 33초 및 72 ℃에서 33초 동안 40회 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 분석을 통해 나온 c(t) 값의 분석을 통해 유전자 발현 값을 분석하였다 (fold change 2-△△Ct formula). 처리하지 않은 세포의 유전자의 발현 값을 1로 두고 처리한 세포의 유전자 발현 값을 계산하였다. 유전자 c(t) 값 분석 시 평준화 (normalization)는 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 이용하였다. 상기 PCR 프라이머의 서열은 표 2과 같다.
| 프라이머 | 크기(bp) | 온도 | Forward | Reverse |
| GAPDH | 155 | 59 | 5'-tgctggtgctgagtatgtcg-3' | 5'-caagcagttggtggtacagg-3' |
| MSTN | 163 | 59 | 5'-acgctaccacggaaacaatc-3' | 5'-ggagtcttgacgggtctgag-3' |
| MYOG | 185 | 59 | 5'-tccagtacattgagcgccta-3' | 5'-caaatgatctcctgggttgg-3' |
| MYL2 | 177 | 59 | 5'-aaagaggctccaggtccaat-3' | 5'-cctctctgcttgtgtggtca-3' |
| MYH | 248 | 59 | 5'-gggttccattgacattgacc-3' | 5'-agggccagtgtttcacattc-3' |
| Atrogin1 | 160 | 59 | 5'-ttcagcagcctgaactacga-3' | 5'-tgaaagcttcccccaaagta-3' |
| MuRF1 | 206 | 59 | 5'-tgaggtgcctacttgctcct-3' | 5'-tcacctggtggctattctcc-3' |
| ACVRIIB | 197 | 59 | 5'-aacttccagagagacgcctt-3' | 5'-atcgtgggcctcatcttctt-3' |
[실험예 11] 세포조직면역염색법 (Immunocytochemistry)
배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 1번 세척하였다. 세척한 세포에 4 % 포름알데히드(formaldehyde, Sigma)를 처리하여 15분간 세포를 고정한 후, PBS를 이용하여 세포를 세척하고 0.2 % 트립톤(tipton) X-100 (Sigma)을 넣은 후 5분 간 방치하였다. 다시 PBS를 이용하여 세척하고 1 %의 정상 염소 혈청 (normal goat serum)을 넣고 30분 간 방치한 후 1차 항체 (MYOD, myogenin(MYOG) : Myosin light chain(MYL2); 1:50)를 넣고 4 ℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 3번 세척한 후, 2차 항체 (Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse & rabbit SFX kit)와 1시간 동안 방치하였다. 1시간 후 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 세척한 후 DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol)로 핵을 염색하고 형광현미경을 이용하여 단백질의 발현을 관찰하였다.
[실험예 12] 웨스턴 블랏 (Western blot)
배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 세척한 세포에 LIPA 버퍼와 단백질분해효소 억제제를 넣은 후 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상층액에 포함된 단백질을 수집하였다. 추출한 단백질 중 40 μg을 8 내지 10 %의 아크릴아마이드 겔 (Acrylamide gel)에서 전기영동 한 후 PVDF 멤브레인 (Polyvinylidene fluoride membrane, Milipore)에 옮겼다. 이를 3 % 탈지유 (skim milk)나 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블록킹 (blocking)하였다. 그 후, 1 % 탈지유 또는 BSA에 희석한 1차 항체 (Pax7; 1:500, MYOD; 1:500, MYOG; 1:400, MYL2; 1:1000, MYH; 1: 500, MSTN; 1:1000, ß-actin; 1:1000, MuRF1; 1:400 및 Atrogin; 1: 1:400)를 첨가하고 16시간 이상 4 ℃에서 반응시켰다. 16시간 후 TBST (Tween 20이 포함된 Tris-Buffered Saline)로 3번 세척하고, HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 TBST로 3번 세척하고, Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate를 넣어준 후 현상하였다.
[실험예 13] 조직면역염색법 (Immunohistochemistry)
파라핀이 함유된 근육조직에 각각 자일렌 (xylene)과 에탄올로 디파라핀화 (deparaffinization) 및 수분을 공급하였으며, 내생성 과산화효소 활동 (endogenous peroxidase activity)을 중지 시키기 위해 0.3 % 과산화수소수(H2O2) / 메탄올에서 15분 동안 조직을 담구어 두었다. 그 다음, 형태학 관찰을 위해 헤마톡실린(hematoxylin) / 에오신(eosin)으로 염색하거나, 1 %의 정상 염소 혈청 (Normal goat serum)으로 비특이적 항체와의 반응을 차단하기 위해 조직과 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 1차 항체 (1:50)와 16시간 이상 4 ℃ 반응시켰다. 16시간 후 PBS에 3번 세척하고 HRP가 부착된 2차 항체 (1:100)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. Horse radish peroxidase-conjugated streptavidin를 첨가하여 단백질의 발현을 검출한 후 현미경을 통해 관찰하였다.
[실험예 14]
Ac
-MIF1 펩티드 주입에 따른 근육재생효과 관찰
MIF 펩티드 주입에 따른 근육재생효과를 관찰하기 위해 마우스에 Ac-MIF1 펩티드 주입 및 카디오톡신 (Cardiotoxin; 이하, CTX라함)을 근육에 주입 / 비주입을 한 후 근육의 형태 및 재생을 관찰하였다. C57BL/6 마우스에 Ac-MIF1 펩티드 (1.125 mM)를 주입 시킨 1일 후 100 mM의 카디오톡신을 비복근 (gastrocnemius) 근육에 주입하였다. CTX 주입 7일 후 근육조직을 샘플링 하였다.
[실험예 15] 근육직경 측정
파라핀이 포매된 근육 절편을 자일렌을 사용하여 탈파라핀화하고 에탄올의 농도 구배를 사용하여 재수화한 다음 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하고 400x 비율로 확대하여 사진을 찍은 후 근섬유의 직경을 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
[실험예 16] 통계분석
정규화된 유전자 발현의 평균 간의 차이의 유의성은 Tukey의 스튜던트화 범위 (HSD) 및 T 테스트를 사용하여 결정되었다. 내부대조군에서는 GAPDH를 사용하였으며, 통계분석은 SAS ver. 9.0 프로그램으로 분석하였다. p≤0.05의 값은 통계적 유의성을 나타냈다.
[실시예 1] MIF1 펩티드 설계 및
in silico
분석
펩티드는 MSTN과 FMOD의 결합 부분에서 디자인 되었다. in silico 분석을 통해서 MIF1 펩티드의 여부에 따라 ACVRIIB에 대한 MSTN 결합 에너지를 분석한 결과, 도 1 및 2에 따를 때, MSTN은 MIF1 펩티드가 존재할 때 결합 에너지가 -59.69로 감소하였다.
[실시예 2] MIF1 처리에 따른
근아세포의 증식 및 분화
C2C12 세포에서 MSTN 단백질의 처리에 따른 세포의 증식을 관찰하기 위해 증식 또는 분화 배지를 처리한 후 세포의 증식과 분화를 관찰한 결과, 도 3에 따를 때, 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 증식과 분화가 감소하였다.
근아세포의 증식과 분화를 억제하는 MSTN 단백질의 효과를 차단하고 세포의 증식 및 분화를 촉진하기 위해 MSTN 억제를 C2C12 세포의 증식 및 분화시기에 처리하였다. 펩티드의 화학적인 변형에 따른 효과를 먼저 검증하기 위해 다양한 변형을 한 MSTN 억제 펩티드 (MIF1, MIF1-NH2, Ac-MIF1 및 Ac-MIF1-NH2)를 C2C12 세포의 증식 기간 동안 처리한 후 세포의 증식을 처리하지 않은 세포와 관찰하였다. 그 결과, 도 4에 따를 때, 세포의 증식은 처리하지 않은 세포(대조군)와 비교하여 MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 11 % 증가) 및 Ac-MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 24 % 증가)를 처리한 세포에서 증가했다.
MIF1 및 Ac-MIF1 펩티드가 추가 연구를 위해서 선택되었다. MIF1 펩티드의 근아세포의 증식에 미치는 영향을 관찰하기 위해 100 % 성장한 세포에서 스크래치를 수행하고 MIF1 펩티드가 처리된 증식 배지에서 1일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 5A에 따를 때, 처리하지 않은 세포에 비해 MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 22 % 증가) 펩티드를 처리한 세포의 스크래치 회복정도가 증가하였다. 세포를 MIF1 펩티드를 성장배지에서 부터 처리 한 후 세포가 100 % 이상 성장하였을 때 MIF1 펩티드를 포함하는 분화배지를 처리하고 3일 동안 배양하한 후 근관 형성 및 융합지수를 관찰하였다. 그 결과, 도 5B에 따를 때, MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 4 % 증가) 펩티드의 처리에 따라 세포의 융합지수가 처리하지 않은 세포에 비해 증가하였다.
관련 근육세포 분화 관련 인자들의 발현을 실시간 PCR, 웨스턴 블랏 및 세포조직면역염색법 법으로 관찰하였다. 그 결과, 도 5의 C 및 D에 따를 때, MIF1 펩티드 처리 세포에서 MYH mRNA 발현이 증가하였고 MSTN mRNA 발현이 감소하였고, MYOD, MYOG, MYL2 및 MYH 단백질의 발현은 MIF1 펩티드가 처리된 세포에서 증가하였다. 그러나, MIF1 펩티드가 처리된 세포에서 MSTN 단백질 발현이 증가하였다. 또한, 도 6에 따를 때, 근감소 관련 인자인 Atrogin1 mRNA의 발현이 MIF1 펩티드의 처리에 따라 감소하였으며, MuRF1 단백질의 발현이 감소하였다.
[실시예 3]
Ac
-MIF1
펩티드 처리에 따른
근아세포의 증식 및 분화
C2C12 세포에서 Ac-MIF1 펩티드의 효과를 관찰하기 위해 스크래치를 수행하고, Ac-MIF1 첨가된 증식 배지와 함께 1일 동안 배양하고 세포 회복을 측정하였다. 그 결과, 도 7A에 따를 때, Ac-MIF1 (처리하지 않은 세포에 비해 28 % 증가) 펩티드가 처리된 세포의 회복력이 처리하지 않은 세포보다 우수했다.
세포를 Ac-MIF1 펩티드를 성장배지에서 부터 처리 한 후 세포가 100 % 이상 성장하였을 때 Ac-MIF1 펩티드를 포함하는 분화배지를 처리하고 3일 동안 배양하한 후 근관형성 및 융합지수를 관찰하였다. 그 결과, 도 7B에 따를 때, Ac-MIF1 (처리하지 않은 세포에 비해 세포의 핵이 융합된 융합지수 11 %증가) 처리는 미처리 세포보다 근관 형성이 증가하였다.
도 7의 C 및 D에 의할 때, MYOD 및 MYL2 mRNA; 및 MYOD, MYOG 및 MYH 단백질; 발현은 Ac-MIF1 처리된 세포에서 증가하였다. 그러나 MSTN 단백질 발현은 Ac-MIF1 처리된 세포에서 감소하였다. 또한, 도 8에 의할 때, Atrogin1 및 ACVRIIB 단백질 발현도 Ac-MIF1 펩티드 처리에서 감소하였다.
[실시예 4] 근육에서의 분화에서 MSTN 단백질과
Ac
-MIF1 펩티드 효과
C2C12 세포의 분화과정에서 MSTN 단백질의 MIF 펩티드 처리에 따른 효과를 관찰하기 위해 C2C12 세포를 최대 100 % 까지 성장 배지로 배양하고, 100% 성장하였을 때 MSTN 단백질, Ac-MIF1 또는 MSTN 단백질+ Ac-MIF1이 포함된 근육 분화 배지로 3일 동안 배양하였다. 융합 지수는 MSTN 단백질, Ac-MIF1 또는 MSTN 단백질+ Ac-MIF1가 처리된 세포에서 분석되었다. 그 결과, 도 9에 따를 때, MSTN 단백질이 처리된 세포에서는 처리하지 않은 세포에 비해 근관 형성이 감소하였으며, Ac-MIF1 펩티드를 처리한 세포의 융합지수는 처리하지 않은 세포에 비해 증가하였다. MSTN 단백질 + Ac-MIF1 펩티드가 처리된 세포들의 근관 형성은 MSTN 단백질만 처리된 세포에 비해 증가했다.
[실시예 5]
Ac
-MIF1 펩티드 주입에 따른 근육 재생 효과
Ac-MIF1 펩티드가 손상된 근육의 재생에 미치는 확인하기 위해, Ac-MIF1를 다리의 비복근에 주사하고 1일 후, CTX를 주사한 후 7일 동안 유지하였다. 표 3에 의할 때, 7일 후 체중 (g)과 근육의 무게 (g)을 측정하였으며, Ac-MIF1 펩티드의 주입에 따라 근육의 무게는 주입하지 않은 근육에 비해 유의적 차이를 보이지 않았다. 도 10에 의할 때, 유전자 발현의 경우 MYOD, MYL2 및 MSTN의 mRNA 발현은 Ac-MIF1 펩티드가 주사된 근육에서 증가하였고 (도 10A), Pax7, MYOD, MYOG 및 MYL2의 단백질 발현은 Ac-MIF1 펩티드를 주입 근육에서 증가하였으며 (도 10B), 근섬유의 직경 (um)은 펩티드를 주입하지 않은 세포에 비해 Ac-MIF1 펩티드를 주입한 근육에서 증가하였다 (도 10C).
| 펩티드 | CTX (g) | CTX + Ac -MIF1 (g) |
| Ac-MIF1 | 0.140±0.002 | 0.140±0.003 |
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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differentiation into muscle cells and uses thereof
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<151> 2021-11-25
<160> 17
<170> KopatentIn 1.71
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Val Asp Phe Glu Ala Phe Trp Asp Trp Gly
1 5 10
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atcgtgggcc tcatcttctt 20
Claims (10)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
- 제1항에 있어서, 상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화 (amidation) 또는 N-말단이 아세틸화 (acetylation)된 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제3항에 있어서, 상기 펩티드는 미오스타틴 (myostatin; MSTN) 단백질을 억제시켜 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 근육장애는 근육위축증, 근질환, 근육 손상, 근이영양증, 근육감소증, 근신경 전도성 질병 또는 신경 손상 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 점안제 및 주사용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물.
- 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물.
- 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102239331B1 (ko) | 2016-09-15 | 2021-04-12 | 니혼 노산 고교 가부시키가이샤 | 지방 축적 억제제, 지방 전구 세포의 분화 억제제, 내장 지방 저감제 및 내장 지방 저감용 음식품 |
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2022
- 2022-05-11 KR KR1020220057546A patent/KR20230077611A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102239331B1 (ko) | 2016-09-15 | 2021-04-12 | 니혼 노산 고교 가부시키가이샤 | 지방 축적 억제제, 지방 전구 세포의 분화 억제제, 내장 지방 저감제 및 내장 지방 저감용 음식품 |
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