KR102171141B1

KR102171141B1 - Lgi3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102171141B1
Application number: KR1020180060762A
Authority: KR
Inventors: 윤혜영; 김동석; 김현아
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2020-10-28
Also published as: KR20190135378A

Abstract

본 발명은 아디포카인 LGI3로부터 유래된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 등에 관한 것으로서, LGI3 유래의 P25 내지 P28 펩타이드는 LGI3와 같이 지방세포 분화 억제 활성을 가지며, P32 내지 P34 펩타이드는 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단하는 기능을 수행한다. 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 비만과 비만 관련 대사 이상 유발의 중요한 원인인 내장 지방의 감소를 촉진하고, 혈중 렙틴(leptin)과 지질 조성을 개선시키고, 간의 중성지방을 감소시키고 간 기능을 개선시켜 고지방식으로 유래되는 각종 비만 관련 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선이 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 지방세포 분화 조절과 지방조직 염증의 제어를 유도하는 것으로서, 기존의 비만 치료제들이 중추신경계 또는 소화기계에 작용 시 나타내는 부작용이 없거나 적은 장점이 있다. 이에, 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드와 이를 선도물질로 사용되어 개발될 수 있는 물질들은 비만 및 관련 대사 이상의 예방과 치료를 위한 의약용, 의약외용, 식품 첨가물용, 향장소재용 조성물 등 다양한 방면으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물{Composition for preventing, treating, or improving obesity comprising the peptides derived from LGI3 as the active ingredients}

본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 등에 관한 것이다.

최근 전세계적으로 대사성 질환(metabolic syndrome)인 비만, 당뇨병, 고지혈증, 심장혈관질환(coronary vascular disease, CVD), 및 고혈압 등의 발병율이 증가하고 있는 추세이다. 대사성 질환 중 하나인 비만은 에너지 대사 불균형이 그 원인으로, 과잉의 에너지원이 지방세포로 축적되어 인슐린 저항성을 유발하고 염증반응을 증가시켜 다른 대사성 질환을 일으키는 원인이 될 수 있다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 전 세계적으로 과체중 혹은 비만에 해당되는 인구는 전체의 10% 이상에 이르며, 현 비만인구 증가 추세가 지속되면 2030년도 이후에는 미국의 경우 비만 인구가 전체의 약 40%까지 증가할 것이라고 보고되고 있다. 2017년 대한비만학회 발행 보고서에 의하면, 제2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심근경색, 뇌줄중, 유방암 등의 유병률과 비만과의 상관성이 매년 뚜렷이 나타나고 있다.

비만 및 비만으로 유발되는 다양한 합병증들의 중요성에 비하여, 효과적인 비만 치료제 개발은 부족한 상태로 미충족 수요가 큰 분야이다. 전 세계적으로 효과적이고 부작용이 적은 새로운 기전의 차세대 비만치료제 개발 및 글로벌 시장 진출 경쟁이 활발하다.

현재 미국 FDA가 승인하여 널리 처방되는 대표적인 비만치료 약물은 중추신경계에 작용하여 식욕억제제로 작용하는 약물군과 췌장에서 분비되는 소화효소 리파제(lipase)의 억제제인 오르리스타트(orlistat; Xenical)가 있다. 중추신경계 작용 약물은 심혈관계와 정신과적 부작용 등으로 시부트라민 등 다수의 약물이 승인 취소되었으며, 오르리스타트는 다양한 부작용과 함께 지방섭취량에 따라 약물의 효과가 가변적이라는 제한점이 있다. 한편, 내분비 펩타이드 표적 약물로서는 glucagon-like peptide-1(GLP-1) 수용체 촉진제인 liraglutide가 승인되어 사용되고 있으나, 갑상선암의 위험성이 대두되고 있다.

상기로부터, 중추신경계와 위장관에 작용하는 약물들의 한계를 극복하는 미충족 수요(unmet needs)는 차세대 비만 치료제 개발의 화두이다. 최근 비만 치료제 개발의 방향은 중추신경 및 위장관 작용 약물에서 국소 작용 약물 개발의 방향으로, 경구투여 저분자 합성 화합물에서 피하 또는 혈관 주사용 합성 펩타이드 개발로 중요성이 확대되는 추세이다. 또한 치료용 항체, RNAi, aptamer 등 새로운 바이오기술이 응용된 신약개발도 모색되고 있다. 합성 펩타이드 치료제 개발은 미래의 바이오 의약품 산업의 유망한 동력으로, 비만 치료제 개발 분야에서도 임상적 유효성의 잠재력이 크기 때문에 새로운 약물표적 및 기전 발굴, 펩타이드 기반 약물 개발과 전달 최적화 기술 개발이 매우 중요하다.

LGI3(leucine-rich repeat LGI family member 3 또는 leucine-rich glioma inactivated 3)는 사람을 비롯한 척추동물에만 존재하는 분비 단백질로서, 신경세포에서의 분비와 그 분화의 조절, 피부 각질 형성세포의 생존과 이동 조절, 멜라닌 세포의 색소 생성 조절, 지방세포의 분화 및 비만 지방조직의 염증 조절 등의 기능이 알려져 있다(reviewed in Int. J. Mol. Med. 2017, 40:251-259). 그러나, LGI3은 548개의 아미노산을 가지는 약 60 kDa 분자량의 단백질로서 이를 그대로 인체에 적용시키는 것에는 제약이 있다.

본 발명자들은 고지방식이 비만 유도 동물모델에서 LGI3 단백질이 지방조직에서 현저히 증가하며, 비만 지방조직에서 LGI3의 발현과 분비가 대사성 염증에 의해 증가하고, LGI3가 지방세포 분화 지표단백질인 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)와 C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins alpha)를 억제함으로써 지방세포 분화를 억제함을 발견하여, LGI3가 아디포카인(adipokine, 지방조직 사이토카인)임을 규명하였다. 이를 근거로, 비만 치료에 LGI3를 사용하기 위하여, 인체에 적용하기에 바람직한 LGI3 유래 펩타이드를 탐색하고, 이를 고지방식이 동물모델에 투여한 결과, LGI3 유래 펩타이드가 비만 치료 효과와 비만 또는 고지방식이로 유발된 고혈당, 간 및 혈중 지질이상, 간손상 등 대사 이상에 개선 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 기존의 비만 치료제가 갖는 부작용과 한계를 극복하는 새로운 치료용 조성물울 제공하고, 동시에 비만으로부터 유발되는 대사 이상을 개선하는 조성물을 제공하는 것으로서, 상기 양 조성물은 지방조직에서 지방세포의 분화 억제 및 대사성 염증 촉진에 중요한 역할을 수행하는 LGI3의 생리활성을 제어함으로써 비만의 치료효과 및 그 관련 대사 이상의 개선 효과를 나타낼 수 있는 LGI3 유래 합성 펩타이드를 포함하여 완성될 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 또는 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 개체에 투여하여 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 비만의 예방 또는 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 LGI3 유래 펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 38 또는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 LGI3 단백질 서열 중 361번째 아미노산 내지 420번째 아미노산 영역; 또는 466번째 아미노산 내지 510번째 아미노산 영역;을 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 LGI3 유래 펩타이드는 LGI3 단백질 서열 중 361번째 아미노산 내지 420번째 아미노산 영역; 또는 466번째 아미노산 내지 510번째 아미노산 영역;에서 임의의 아미노산을 기준으로 상기 영역 안에서 연속된 3 내지 30개 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 25 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 32 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 지방세포의 분화를 촉진 또는 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 증가 또는 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명은 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 증가 또는 감소시키는 것에 의하여 지방세포의 분화를 촉진 또는 억제시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 38 또는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 LGI3 단백질 서열 중 361번째 아미노산 내지 420번째 아미노산 영역 또는 466번째 아미노산 내지 510번째 아미노산 영역으로부터 유래된, 비만과 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 치료용 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 비만 관련 대사 이상은 고혈당, 간 또는 혈중 지질 이상, 및 간 손상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 현상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 비만 관련 대사 이상은 비만 또는 고지방식이로 유발되는 것일 수 있다.

본 발명의 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 비만과 비만 관련 대사 이상의 중요한 원인인 내장 지방의 감소를 촉진하고, 혈중 렙틴(leptin)과 지질 조성을 개선시키고, 간의 중성지방을 감소시킬 뿐만 아니라, 간 기능을 개선시켜 비만 또는 고지방식이로 유발되는 각종 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선이 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물은 지방세포 분화 조절과 지방조직 염증의 제어를 유도하는 것으로서, 기존의 비만 치료제들이 중추신경계 또는 소화기계에 작용 시 나타내는 부작용이 없거나 적은 장점이 있다. 이에, 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드와 이를 선도물질로 사용되어 개발될 수 있는 물질들은 비만 및 관련 대사 이상의 예방과 치료를 위한 의약용, 의약외용, 식품 첨가물용, 향장소재용 조성물 등 다양한 방면으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a 및 도 1b는 LGI3 유래 펩타이드를 처리한 3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 마커인 PPARγ, C/EBPα, 및 FABP의 발현 수준을 측정하여, LGI3 유래 펩타이드 혼합물 M3가 LGI3와 같이 지방세포 분화 억제 활성이 뛰어나며(도 1a), 구체적으로 M3에 포함된 P25 내지 P28이 지방세포 분화 억제 활성을 나타냄을 확인한 도면이다(도 1b).
도 2a 및 도 2b는 LGI3와 LGI3 유래 펩타이드를 동시에 처리한 3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 마커인 PPARγ, C/EBPα, 및 FABP의 발현 수준을 측정하여, LGI3 유래 펩타이드 혼합물 M4가 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단하는 효과를 나타내며(도 2a), 구체적으로 M4에 포함된 P32 내지 P34가 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단함을 확인한 도면이다(도 2b).
도 3a 및 도 3b은 고지방 식이와 함께 P25 또는 P34를 투여한 마우스에서, 부형제 투여군과 비교하여, 체중 증가의 억제(도 3a)와 동일한 사료 섭취량(도 3b)을 확인한 그래프이다.
도 4는 고지방 식이와 함께 P25 또는 P34를 투여한 마우스에서, 부형제 투여군과 비교하여, 지방조직의 무게가 감소됨을 확인한 그래프이다.
도 5는 고지방 식이 동물모델에서 P25 또는 P34의 투여에 따른 혈중 AST, ALT, Glucose, 총콜레스테롤(TCHOL), 및 중성지방(TG)의 변화(도 5a)와 알부민(ALB), 크레아티닌(CRE), 인슐린(insulin), 및 렙틴(leptin)의 변화(도 5b)를 나타낸 그래프이다.
도 6a 및 도 6b은 고지방 식이 동물모델에서 P25 또는 P34의 투여에 따른 혈중 요소질소(BUN), 저밀도 지질단백질(LDL), 및 고밀도 지질단백질(HDL)의 변화를 측정한 그래프와(도 6a), 고밀도 지질단백질/총콜레스테롤 비(HDL/TCHOL), 및 저밀도 지질단백질/고밀도 지질단백질 비(LDL/HDL)의 변화를 계산한 그래프이다(도 6b).
도 7a 및 도 7b는 고지방 식이 동물모델에서 P25 또는 P34의 투여에 따른 간 무게 감소 효과(도 7a)와, P34 투여에 따른 간 중성지방 감소 효과(도 7b)를 확인한 그래프이다.
도 8은 사람과 마우스의 LGI3 아미노산 서열의 비교를 표시한 도면이다. 두 종에서 동일한 아미노산은 회색으로 표시하였으며, P25와 P34 펩타이드의 서열에 해당하는 마우스 LGI3 서열은 테두리선으로 표시하였다.

본 발명자들은 기존의 비만 치료제가 가지는 부작용과 한계를 극복하기 위하여 비만의 새로운 치료 표적을 연구하였다. 그 결과, LGI3는 비만 지방조직의 만성 염증에 의해 증가되며, LGI3가 만성 염증을 더욱 심화시키고 지방세포 분화를 억제하여 내장과 간 등에 과잉 지질의 비정상적 축적을 증가시켜 대사 이상을 유발한다는 기전을 제시하였다. 이를 토대로, LGI3 단백질의 활성을 제어하는 LGI3 유래 펩타이드를 사용한 비만 치료 전략을 수립하였고, 이에 비만 지방조직의 비정상적 LGI3 활성을 제어할 수 있는 LGI3 유래 합성 펩타이드를 탐색하여, 동물실험을 통해 상기 LGI3 유래 합성 펩타이드가 비만뿐만 아니라 고혈당, 간 및 혈중 지질이상, 간손상 등 비만 관련 대사 이상을 개선시키는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고, LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 하는 고혈당, 간 및 혈중 지질이상, 또는 간 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 LGI3(leucine-rich repeat LGI family member 3 또는 leucine-rich glioma inactivated 3)는 사람을 비롯한 척추동물에만 존재하는 사이토카인으로서, 서열번호 38 또는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이때 서열번호 38의 아미노산 서열은 마우스로부터 획득된 LGI3 단백질의 아미노산 서열이고, 서열번호 39의 아미노산 서열은 인간으로부터 획득된 LGI3 단백질의 아미노산 서열이다. 마우스의 LGI3 아미노산 서열과 인간의 아미노산 서열은 97% 상동성을 가지며, 각각의 LGI3 유래 펩타이드는 두 종에서 동일한 기능을 수행할 수 있음이 자명하다.

본 명세서에서 “LGI3 유래 펩타이드”는 서열번호 38 또는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 LGI3 단백질로부터 특정 영역의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 선별한 것으로, 본 명세서에서 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 LGI3 유래 펩타이드는 LGI3 단백질을 조각내어 획득할 수 있으며, 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques) 또는 액상 합성 기술에 따라 제조될 수 있다.

비만 지방조직의 지방세포(adipocytes)는 과도한 세포비대(hypertrophy)와 산소 부족 스트레스로 인해 세포사멸과 조직 손상이 나타나며, 세포사멸 잔유물로 인해 국소적 염증이 유발되어 혈관으로부터 단핵구(monocytes) 등 면역 세포들이 유입되고 염증 부위의 대식세포의 축적과 거품세포 형성에 의해 지방조직의 손상과 염증이 더욱 확대된다. 비만 지방조직에서 분비가 증가되는 염증 아디포카인은 TNF-α, IL-1, IL-6, MCP-1 등 다양하며, 분비가 감소되는 항 염증 아디포카인은 아디포넥틴(adiponectin)이다. 이들 아디포카인에 의해 유발되는 비만환자의 전신성 만성 염증은 대사성 염증(metabolic inflammation)이라고도 하며, 인슐린의 조직 민감성을 감소시켜 제2형 당뇨병을 일으키고 간 대사 항상성을 교란하여 이상지질혈증(dyslipidemia)과 각종 심혈관계 질환을 유발한다.

이에 본 발명자들은, LGI3가 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 활성을 가지고 있음에 착안하여, 서열번호 38의 아미노산 서열을 가지는 LGI3 유래 펩타이드 집합 중 LGI3의 활성을 재현 또는 차단하는 펩타이드를 탐색하고자 하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 LGI3 단백질 유래의 펩타이드를 합성(37종)하였으며, LGI3 유래 합성 펩타이드 집합(bundle peptides)은 15mer 아미노산 길이의 36개의 펩타이드와, LGI3 단백질의 카르복시 말단의 서열에 해당하는 8mer 아미노산 길이의 펩타이드로 구성되어 있다. 합성된 펩타이드 집합은 다시 M1 내지 M4의 네 혼합물로 구분해 조제하였으며, 각 펩타이드 혼합물을 3T3-L1 분화 배지에 첨가하여 지방세포 분화의 지표 단백질(PPARγ, C/EBPα, FABP)의 발현 수준 관찰을 통해 M3 혼합물이 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성과 가장 유사한 활성을 나타냄을 확인하고, 보다 구체적으로 M3 혼합물 내의 펩타이드 중 펩타이드 25 내지 28이 지방세포 분화 억제 활성을 나타냄을 확인하였다(실시예 1-2 참조). 나아가, LGI3와 상기 각 펩타이드 혼합물(M1~M4)를 3T3-L1 분화 배지에 첨가하여 지방세포 분화의 지표 단백질의 발현 수준을 관찰하였으며, 그 결과 M4 혼합물이 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단함을 확인하고, 보다 구체적으로 M4 혼합물 내의 펩타이드 중 펩타이드 32 내지 34가 LGI3의 길항제(antagonist)로서 작용함을 확인하였다(실시예 1-3 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예를 통해, 본 발명자들은 LGI3 agonist인 P25 내지 P28 중에서 P25를 선정하고, LGI3 antagonist인 P32 내지 P34 중에서 P34를 선정하여 LGI3 유래 펩타이드의 약리적 효과를 확인하고자 하였다. 이에 고지방식이 유도 비만 동물모델을 제작하고 상기 P25 또는 P34를 투여하여 매주 체중을 측정하였다. 그 결과, P25 또는 P34 투여군에서 약 4%의 체중 감소효과를 보였으며, P25는 7주 후, P34는 5주 후 체중 감소 효과의 통계적 유의성(p<0.05)을 보였다(실시예 2-2 및 도 3a 참조). 반면, 사료섭취량은 P25 또는 P34 펩타이드 투여군에서 부형제 투여군과 비교하여 유의한 차이를 확인할 수 없었는바, 상기 두 펩타이드가 뇌 식욕중추에는 영향을 주지 않는 것을 알 수 있다(실시예 2-2 및 도 3b 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 고지방 식이 유도 비만 마우스에 P25 또는 P34 펩타이드를 6주간 투여 후 고환 주변부(epididymal), 신장 주위(perirenal), 후복막(retroperitoneal), 및 장간막(mesenteric) 주변의 지방조직의 무게를 측정하였다. 그 결과 장간막 지방조직의 크기가 P25 투여군에서는 약 15%, P34 투여군에서는 약 19%의 감소효과가 유의성 있게 나타났다(p<0.05). P34 투여군에서는 신장주위 지방조직도 약 18%의 감소효과가 유의성 있게 나타났다(p<0.05). 반면, 부고환(epididymal) 지방조직과 후복막 지방조직에는 P25와 P34 펩타이드의 영향이 없었다. 상기 결과로부터 P25와 P34 펩타이드가 비만과 그 관련 대사이상 유발에 중요한 내장지방 중 주로 장간막 지방에 선택적으로 감소효과가 있음을 알 수 있다(실시예 2-3 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 고지방 식이 유도 비만 마우스에 P25 또는 P34 펩타이드를 6주 투여 후 각종 비만 혈중 지표에 대한 영향을 조사하였다. P25 투여군 및 P34 투여군 모두에서 혈중 ALT, 포도당, 총콜레스테롤, 저밀도 지질단백질 및 렙틴이 부형제 투여군보다 감소됨을 확인할 수 있었는바, P25 또는 P34의 투여에 따라 고지방 식이에 의해 증가하는 혈당 감소 효과, 간기능 보호 효과, 및 혈액 내 지질 감소 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있으며, 고지방 식이에 의해 감소된 고밀도 지질단백질/총콜레스테롤 비(HDL/TCHOL)가 증가되고, 저밀도 지질단백질/고밀도 지질단백질 비(LDL/HDL)는 감소됨을 확인할 수 있었으며, 특히 P34 투여군에서 HDL/TCHOL 지표의 뚜렷한 개선 효과를 확인할 수 있었다(실시예 2-4 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 고지방 식이 유도 비만 마우스에 P25 또는 P34 펩타이드를 6주 투여 후 간의 무게와 간 중성지방 대한 영향을 조사하였다. 그 결과, P34 펩타이드 투여군에서 간의 무게 감소(약 18%)와 중성지방 감소(약 21%) 효과가 유의성있게 나타났다(p<0.05). 상기로부터 P34 펩타이드가 고지방식이에 의해 증가하는 간 지질 이상의 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다(실시예 2-5 참조).

상기로부터, 본 발명자들은 P25 내지 P28 펩타이드를 포함하는 LGI3 agonist 펩타이드와, P32 내지 P34 펩타이드를 포함하는 LGI3 antagonist 펩타이드가 내장지방, 특히 장간막 지방을 선택적으로 감소시켜 비만의 예방 또는 치료 효과를 보일 수 있음을 확인하였고, 혈당, 간 및 혈중 지질, 간손상 등의 비만 관련 대사 이상에 개선 효과가 있음을 확인하였으며, LGI3 antagonist인 P34는 상대적으로 우수한 효과를 나타내었다. 한편, P25 내지 P28 및 P32 내지 P34 펩타이드 모두 인체에 적용하기에 적절한 크기를 가지며, 특히 P25, P28, 및 P34 펩타이드는 높은 수용성(P25, 10mg/ml; P28, P34, 1mg/ml)을 나타내어 제제화와 투여가 용이하다.

본 발명의 LGI3 유래 펩타이드를 포함하는 조성물은 중추신경계에 작용하여 식욕을 억제하거나 소화관의 소화효소를 억제하는 기존의 비만 치료제들과 달리, 지방조직에 작용하여 내장 지방의 감소를 촉진하고 각종 대사 이상의 지표들을 개선할 수 있는 효과를 보이므로, 기존의 약물들이 보이는 부작용과 한계를 극복한 LGI3 기반 신규(First-in-class) 비만 치료제로 이용되거나 치료제 개발의 선도물질로 사용될 수 있으며, 고지방식이 만연한 현대인을 위한 건강기능식품에 이용될 수 있다.

또한, LGI3 antagonist 활성을 갖는 LGI3 유래 펩타이드를 투여하여 비만의 지표를 개선시킬 수 있음을 확인하였는바, LGI3의 지방세포 분화 억제 작용을 차단할 경우 지방조직 염증을 제어하여 지방세포의 분화와 인슐린 민감성이 증가하고 혈중 포도당의 흡수와 지방 저장능의 증가를 통하여 피하지방의 기능 향상과 내장 및 간 지방의 감소로써 대사 이상을 개선할 것이라는 기전이 추정된다. 즉, 본 발명에서 LGI3 antagonist 활성을 갖는 LGI3 유래 펩타이드를 포함하는 조성물은 비만 환자에서 일반적으로 결핍된 지방세포 분화 능력의 복구를 통하여 비만을 치료하는 것으로서, 지방세포 분화 억제제의 탐색에 맞추어진 기존의 지방세포 표적 비만치료 물질과 차별화되어 있다.

상기 결과를 종합하여, 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드는 비만의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 이용될 수 있으며, 비만의 치료제 개발의 선도물질로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드는, 비만과 함께, 고지방식이 또는 비만으로 유도되는 고혈당, 간 및 혈중 지질 이상, 및 간 손상의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드는 내장지방을 감소시키거나 또는 비만 지표의 개선 효과를 나타내는 범위 내에서 하나 이상의 아미노산 변경을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 아미노 말단 또는 카르복시 말단의 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체 내 투여 시의 증가된 반감기를 가질 수 있다.

본 발명의 LGI3 유래 펩타이드의 아미노 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있으며, 펩타이드의 카르복시 말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드의 말단 또는 아미노산의 R-잔기(R-group)에 지방산(fatty acids), 당쇄(oligosaccharides chains), 모든 나노입자(골드입자, 리포솜, 헤파린, 하이드로젤 등), 아미노산, 담체 단백질(carrier proteins) 등을 결합할 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 역가(potency)와 안정성을 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 생체 내(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(상온, 냉장, 냉동 보관 시 저장 안정성 포함)도 의미한다.

본 발명의 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 38 또는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 LGI3 단백질 서열 중 361번째 아미노산 내지 420번째 아미노산 영역 또는 466번째 아미노산 내지 510번째 아미노산 영역에서 임의의 아미노산을 기준으로 연속된 아미노산 서열을 포함하는 것이라면 그 길이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 3 내지 30 mer, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 mer 의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드의 길이가 너무 길면 그 적용에 어려움이 있고, 너무 짧으면 그 기능을 수행하지 못할 수 있다.

본 발명의 LGI3 유래 펩타이드는 비만과 비만 관련 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 조성물에 1 pg 내지 30g w/v%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만과 비만 관련 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 “개체”란 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서“예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 지방조직의 비대 또는 그에 따른 대사 이상을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 비만과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 비만 또는 고지방식이에 의해 유도되는 대사 이상과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 “비만 관련 대사 이상(obesity-associated metabolic disorders)”이란 비만 또는 고지방식이로부터 유래되는 포도당, 지방, 단백질 등의 대사 이상에서 기원하는 증상을 말하며, 주로 포도당과 지방대사의 이상으로 유발되는 고혈당, 간 및 혈중 지질 이상, 및 간 손상 등을 통칭하며, 보다 구체적으로 ‘간 손상’이란 간(liver)이 외인적 또는 내인적 요인에 의해 그 기능을 다하지 못하는 것을 의미하며, ‘혈중 지질 이상’이란 정상 상태보다 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질-콜레스테롤, 및/또는 중성지방이 증가하거나 고밀도 지질단백질-콜레스테롤이 감소하는 것을 의미하며, ‘간 지질 이상’이란 간내의 중성지방이 축적되는 것을 의미하고, ‘고혈당’이랑 혈당이 증가하는 현상을 의미한다.

본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 “담체(carrier)”란 비이클(vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

본 발명에서 “희석제(diluent)”란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명은 LGI3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 또한, LGI3 유래 펩타이드는 비만 또는 비만 관련 대사 이상 증상의 개선을 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다. 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 LGI3 유래 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 LGI3 유래 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 지방세포 분화 실험을 통한 LGI3 유래 펩타이드 탐색

1-1. 3T3-L1 세포의 배양 및 지방세포로의 분화 유도

3T3-L1 세포(American Type Culture Collection, 미국)의 배양, 분화 실험과 재조합 LGI3 단백질의 조제는 본 발명자의 논문(Biochim. Biophys. Acta 2012, 1821:914-922)에 상술된 방법으로 수행하였다. 보다 구체적으로, 3T3-L1 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; 10% calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin을 포함)에서 37°C, 5% CO₂. 조건에서 배양하였다. 배양기의 표면에 세포가 가득 찬 상태에서 2일 경과 후 세포를 MDI 혼합물(1 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine), 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin이 포함된 분화 유도 DMEM 배지에서 3일간 배양하여 지방세포로의 분화를 유도하였다.

1-2. LGI3의 지방세포 분화 억제 활성과 유사한 활성을 갖는 LGI3 유래 펩타이드의 탐색

LGI3는 아래와 같이 548개의 아미노산을 가지는 단백질로서, 큰 분자량으로 인해 인체에 적용시키기에는 제조 및 사용에 제약이 있을 수 있다. 이에, 지방세포로의 분화를 제어하는 LGI3 유래 펩타이드를 탐색하기 위하여 총 37종의 LGI3 유래 펩타이드 집합을 합성하였다. 이어서, 상기 37종의 합성 펩타이드를 M1(펩타이드 1-10 혼합물), M2(펩타이드 11-20 혼합물), M3(펩타이드 21-30 혼합물), 및 M4(펩타이드 31-37 혼합물)로 구분하였다. LGI3 유래 합성 펩타이드 및 상기 합성 펩타이드의 혼합물의 정보는 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에서 각 펩타이드의 수용성 여부는 +(수용성)와 -(비수용성)로 표시하였고, 이하 펩타이드의 일련번호에 따라 P일련번호(예. P25)로 호칭하였다.

보다 구체적으로, MDI 혼합물을 포함하는 상기 분화 유도 DMEM 배지에서 배양을 시작하기 1시간 전에 재조합 LGI3 단백질(10 ng/ml, 165 pM) 또는 상기 펩타이드 혼합물 M1, M2, M3, 또는 M4 (재조합 LGI3의 50배 M 농도)를 첨가하고, 3일간의 배양 시간동안 계속 처리하였다. 처리 종료 후 세포를 RIPA (radioimmunoprecipitation assay) buffer(50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, cocktails of protease/protein phosphatase inhibitors; Roche, 미국)를 사용하여 수득하고, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 수행하여 지방세포 분화에 지표단백질인 PPARγ, C/EBPα, 및 FABP의 발현 수준을 확인하였다. 대조단백질은 항존단백질인 β-actin을 이용하였으며, 각 단백질의 항체는 Santa Cruz 사(미국)에서 구입하여 사용하였다.

번호 (서열번호)	아미노산 서열	수용성	펩타이드 혼합물
1	MAGLRARRGPGRRLL	-	M1 (1-10)
2	VLSTLGFCLMLQVSA	-
3	KRPPKTPPCPPSCSC	+
4	TRDTAFCVDSKSVPK	+
5	NLPSEVISLTLVNAA	-
6	FSEIQDGAFSHLPLL	-
7	QFLLLNSNKFTLIGD	-
8	NAFIGLSHLQYLFIE	-
9	NNDIWALSKFTFRGL	-
10	KSLTHLSLANNNLQT	-
11	LPRDIFRPLDILSDL	-	M2 (11-20)
12	DLRGNALNCDCKVKW	-
13	LVEWLAHTNTTVAPI	-
14	YCASPPRFQEHKVQD	+
15	LPLREFDCITTDFVL	-
16	YQTLSFPAVSAEPFL	-
17	YSSDLYLALAQPGAS	-
18	ACTILKWDYVERQLR	-
19	DYDRIPAPSAVHCKP	+
20	MVVDGQLYVVVAQLF	-
21	GGSYIYHWDPNTTRF	-	M3 (21-30)
22	TKLQDIDPQRVRKPN	+
23	DLEAFRIDGDWFFAV	-
24	ADSSKAGATSLYRWH	+
25	QNGFYSHQALHAWHR	+
26	DTDLEFVDGEGKPRL	-
27	IVSSSSQAPVIYQWS	-
28	RSQKQFVAQGEVTQV	+
29	PDAQAVKHFRAGRDS	+
30	YLCLSRYIGDSKILR	-
31	WEGTRFSEVQALPSR	-	M4 (31-37)
32	GSLALQPFLVGGHRY	-
33	LALGSDFSFTQIYQW	-
34	DEGRQKFVRFQELAV	+
35	QAPRAFCYMPAGDAQ	+
36	LLLAPSFKGQTLVYR	-
37	HVVVDLSA	-

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, M3 혼합물이 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성과 가장 유사한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

이에, 보다 구체적으로, LGI3의 지방세포 분화 억제 활성과 유사한 활성을 나타내는 펩타이드를 탐색하기 위하여, M3 혼합물을 구성하는 펩타이드 21 내지 30을 각각 상기 분화유도 배지에 첨가하여 상기와 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, M3 혼합물 내의 펩타이드 중 P25 내지 P28이 지방세포 분화 억제 활성을 나타내었다. 이에, P25 내지 P28 중에서 임의의 펩타이드인 P25를 대표로 선정하고, 이하 실험에서 P25를 고지방식이 동물모델에 투여함으로써 LGI3 agonist 펩타이드의 비만 및 비만 관련 대사 이상 치료에 대한 유용성을 검증하고자 하였다.

1-3. LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단하는 LGI3 유래 펩타이드의 탐색

상기 실시예 1-2로부터 합성 펩타이드 P25 내지 P28이 LGI3과 마찬가지로 지방세포 분화를 억제하는 활성을 가짐을 확인할 수 있었다. 이에 나아가, LGI3 유래 펩타이드 중에서 LGI3의 길항제(antagonist)로 작용하는 펩타이드를 탐색하였다. 실험은 상기 실시예 1-2와 동일하게 수행하였으며, 다만 상기 분화 유도 DMEM 배지에 LGI3 펩타이드 혼합물인 M1, M2, M3, 또는 M4와 함께 LGI3를 추가로 첨가하여 3T3-L1 세포를 3일동안 배양하였다. 3일동안 배양된 세포는 웨스턴 블롯을 수행하여 지방세포 분화 지표단백질의 발현 수준을 확인하여, 지방세포로의 분화 정도를 판별하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, LGI3와 M4 혼합물을 첨가한 분화 배지에서 배양한 세포는 지방세포 분화지표단백질의 발현 수준이 LGI3의 단독처리에 의해 분화를 억제한 대조군보다 더 높았으며, 이는 M4 혼합물이 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단함을 시사한다.

이에, 보다 구체적으로, LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단하는 펩타이드를 탐색하기 위하여, M4 혼합물을 구성하는 P31 내지 P37을 각각 상기 분화유도 배지에 첨가하여 상기와 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, M4 혼합물 내의 펩타이드 중 P32 내지 P34가 LGI3의 지방세포 분화 억제 활성을 차단함을 확인할 수 있었다. 이에, P32 내지 P34 중에서 임의의 펩타이드인 P34를 대표로 선정하고, 이하 실험에서 P34를 고지방식이 동물모델에 투여함으로써 LGI3 antagonist 펩타이드의 비만 및 비만 관련 대사 이상 치료에 대한 유용성을 검증하고자 하였다.

실시예 2. 동물모델에서 LGI3 유래 펩타이드의 비만과 비만 관련 대사 이상에 대한 효과 확인

실시예 2-1. 고지방 식이 비만 유도 동물모델의 제조

실험동물은 특정병원체 부재(SPF) C57BL/6 마우스(C57BL/6NCrljOri, 수컷, 오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 동물은 온도 23±3°C, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10-20 회/hr, 조명시간 12시간/일, 및 조도 150-300 Lux로 유지되는 조건에서 사육하였다. 정상군은 정상사료(Rodent diet with 10% kcal fat, D12450B, Research Diet Inc., 미국)를, 비만 유도군은 고지방사료(HFD, Rodent diet with 60 % kcal fat, D12492, Research Diet Inc., 미국)를 8주 간 자유섭취 하도록 하였다.

실험동물의 군 분리는 대조군으로서 정상사료 급이군(Normal), 고지방식이 실험군으로서 부형제 투여군(고지방사료 급이 및 부형제(vehicle) 투여; 부형제는 phosphate buffered saline, Welgene, 한국), P25 투여군 (고지방사료 급이 및 P25 투여), P34 투여군(고지방사료 급이 및 P34 투여)으로 하였으며, 군당 개체 수는 8마리로 하였다. LGI3 유래 펩타이드의 투여 경로는 복강투여, 투여횟수 및 기간은 2 회/주, 6 주간, 총 12 회이며, 투여 용량은 10 mg/kg, 투여액량은 10 ml/kg로 하였다.

LGI3 유래 펩타이드를 투여 후 일반증상의 종류 및 증상의 정도를 1 일 1 회 관찰하였고, 시험기간 동안 일반증상 관찰 결과, 모든 군에서 이상 증상 및 사망 동물은 관찰되지 않았다.

실시예 2-2. LGI3 유래 펩타이드 투여가 체중 및 식욕에 미치는 영향 확인

상기 실시예 2-1에서 고지방 식이와 함께 투여한 P25 또는 P34의 체지방 감소 효과를 확인하기 위하여, 사양성적 결과를 확인하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, P25 투여군 및 P34 투여군에서 모두 체중 감소효과를 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, P25 투여군에서는 7주, P34 투여군에서는 5~7주에서 유의성있는 체중 감소(약 4%, P<0.05)를 확인할 수 있었다. 한편, 도 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, P25 및 P34 투여군은 부형제 투여군과 비교하여 사료섭취량의 차이가 없었다. 상기 결과는, P25 또는 P34가 개체에 투여되어 개체의 식욕에 영향을 미치지 않으면서도 고지방식이에 따른 체중 증가를 억제하는 효과가 있음을 의미한다.

실시예 2-3. LGI3 유래 펩타이드 투여에 따른 내장지방 감소 효과 확인

상기 실시예 2-1에서 고지방 식이와 함께 투여한 P25 또는 P34의 내장지방 감소 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1의 방법으로 제조한 비만유도 마우스를 희생시킨 후 고환 주변부(epididymal), 신장 주위(perirenal), 후복막(retroperitoneal), 및 장간막(mesenteric) 주변의 지방조직을 분리하여 생리식염수로 혈액을 씻어내고 여과지에 흡착시켜 수분을 제거한 후 각 기관 주변부의 지방조직 무게를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 타나낸 바와 같이, P25 투여군에서는 장간막 지방조직 무게의 유의한 감소를 확인할 수 있었으며(약 15%), P34 투여군에서는 장간막 지방조직과 신장주위 지방조직 무게의 유의한 감소를 확인할 수 있었다(각각 약 19%, 18%).

실시예 2-4. LGI3 유래 펩타이드 투여에 따른 혈중 지수의 변화 확인

상기 실시예 2-1에서 고지방 식이와 함께 투여한 P25 또는 P34의 혈액 내 지질 감소 효과, 간손상 보호 효과, 및 혈당 조절 효과를 확인하기 위하여, 혈중 간 기능 지표효소인 AST(aspartate transaminase)와 ALT(alanine transaminase), 포도당(Glucose), 총콜레스테롤(TCHOL: Total cholesterol), 중성지방(TG: triglyceride), 알부민(ALB: albumin), 크레아티닌(CRE: Creatinine), 인슐린(insulin), 렙틴(leptin), 혈중 요소질소(BUN: Blood urea nitrogen), 저밀도 지질단백질(LDL: Low-density lipoprotein), 및 고밀도 지질단백질(HDL: High-density lipoprotein)를 측정하고, 고밀도 지질단백질/총콜레스테롤 비(HDL/TCHOL), 저밀도 지질단백질/고밀도 지질단백질 비(LDL/HDL)를 계산하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, P25 투여군 및 P34 투여군 모두에서 혈중 ALT, 포도당, 총콜레스테롤, LDL 및 렙틴이 부형제 투여군보다 감소됨을 확인할 수 있었는바, P25 또는 P34의 투여에 의해 고지방 식이에 의해 증가하는 혈당 감소 효과, 간기능 보호 효과, 및 혈액 내 지질 감소 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, P25 투여군 및 P34 투여군 모두 고지방 식이에 의해 감소된 고밀도 지질단백질/총콜레스테롤 비(HDL/TCHOL)가 증가되고, 저밀도 지질단백질/고밀도 지질단백질 비(LDL/HDL)는 감소됨을 확인할 수 있었으며, 특히 P34 투여군에서 HDL/TCHOL 지표의 뚜렷한 개선 효과를 확인할 수 있었다.

실시예 2-5. LGI3 유래 펩타이드 투여에 따른 간 무게 감소 및 간 중성지방 감소 효과 확인

상기 실시예 2-1에서 고지방 식이와 함께 투여한 P25 또는 P34의 간 무게 및 간 내 중성지방(TG) 감소 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1의 방법으로 제조한 비만유도 마우스를 희생시킨 후 간을 떼어 생리식염수로 혈액을 씻어내고 여과지에 흡착시켜 수분을 제거한 후 간의 무게와 간 중성지방의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, P25 투여군 및 P34 투여군 모두 부형제 투여군보다 간 중량이 감소하였으며, P34 투여군은 대조군보다도 간 중량이 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, P34 투여군은 고지방 식이에 의해 증가된 간내 중성지방의 양이 대조군 수준으로 감소됨을 확인할 수 있었다.

이상의 실시예를 종합하여, 본 발명자들은 LGI3 유래 펩타이드 집합 중 P25 내지 P28이 LGI3의 활성을 재현하는 기능을 수행하고, P32 내지 P34가 LGI3의 활성을 차단하는 펩타이드임을 확인할 수 있었다. 이에 LGI3의 활성을 재현하는 펩타이드 중 P25와 LGI3의 활성을 차단하는 펩타이드 중 P34를 선택하여 동물실험을 수행한 결과로부터, P25 펩타이드(QNGFYSHQALHAWHR)와 P34 펩타이드(DEGRQKFVRFQELAV)는 고지방 식이 유도 비만 마우스에서 체중과 내장지방의 감소효과가 있음을 확인하였다. 특히, P34 펩타이드는 ALT, 렙틴, 고밀도 지질단백질/총콜레스테롤 비(HDL/TCHOL)비, 간 중성지방에 대해 유의한 개선효과를 나타내었으며, 혈당, 인슐린, 총콜레스테롤, LDL, LDL/HDL 비에서도 통계적 유의성에 근접하는 개선 효과를 보였는바, LGI3의 활성을 재현하는 펩타이드인 P25 내지 P28 펩타이드와 LGI3의 활성을 차단하는 펩타이드인 P32 내지 P34 펩타이드는 비만과 비만 관련 대사 이상의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 약제 및 건강기능식품에 이용될 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Composition for preventing, treating, or improving obesity comprising the peptides derived from LGI3 as an active ingredients <130> MP18-092 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGI3 derived peptide 1 <400> 1 Met Ala Gly Leu Arg Ala Arg Arg Gly Pro Gly Arg Arg Leu Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGI3 derived peptide 2 <400> 2 Val Leu Ser Thr Leu Gly Phe Cys Leu Met Leu Gln Val Ser Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGI3 derived peptide 3 <400> 3 Lys Arg Pro Pro Lys Thr Pro Pro Cys Pro Pro Ser Cys Ser Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGI3 derived peptide 4 <400> 4 Thr Arg Asp Thr Ala Phe Cys Val Asp Ser Lys Ser Val Pro Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGI3 derived peptide 5 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Claims

LGI3(leucine-rich repeat LGI family member 3) 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 25 내지 28; 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 LGI3 유래 펩타이드가 서열번호 25 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 경우,
상기 조성물은 지방세포(adipocyte) 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 및 C/EBPα (CCAAT-enhancer-binding proteins alpha)의 발현을 감소시키는 것에 의해 지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 LGI3 유래 펩타이드가 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 경우,
상기 조성물은 지방세포(adipocyte) 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 조성물은 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 및 C/EBPα (CCAAT-enhancer-binding proteins alpha)의 발현을 증가시키는 것에 의해 지방세포 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
LGI3(leucine-rich repeat LGI family member 3) 유래 펩타이드를 유효성분으로 하는, 비만 또는 비만 관련 대사 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 25 내지 28; 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하고,
상기 비만 관련 대사 이상은 고혈당, 간 지질 이상, 혈중 지질 이상, 및 간 손상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
LGI3(leucine-rich repeat LGI family member 3) 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 지방세포 분화 억제용 조성물로서,
상기 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 25 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
LGI3(leucine-rich repeat LGI family member 3) 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 지방세포 분화 촉진용 조성물로서,
상기 LGI3 유래 펩타이드는 서열번호 32 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.