NO332460B1

NO332460B1 - Renset humant NOGO protein, fusjon- eller kimaert protein, isolert nukleinsyre, kloningsvektor, rekombinant celle, fremgangsmate for fremstilling av proteinet, samt anvendelse av proteinet for fremstilling av et medikament for behandling.

Info

Publication number: NO332460B1
Application number: NO20012223A
Authority: NO
Inventors: Martin E Schwab; Maio S Chen
Original assignee: Univ Zuerich
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 2001-05-04
Publication date: 2012-09-24
Also published as: CA2350395C; SK6222001A3; ES2529196T3; CN1721444A; AU1469200A; ES2329635T3; HUP0301829A2; BR9915137A; RU2009103533A; NO20012223L; CA2350395A1; CN101684155A; US7781188B1; ATE435232T1; HUP0301829A3; US20090162367A1; RU2004103555A; US20110086034A1; CN1354755B; WO2000031235A3

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår genet Nogo, dets kodede proteinprodukter samt derivater og analoger til disse. Fremstilling av Nogo-proteiner, -derivater og -antistoffer er også tilveiebrakt. Oppfinnelsen angår dessuten terapeutiske preparater og fremgangsmåter for diagnostisering og terapi.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår genet Nogo og spesielt Nogo, dets kodede proteinprodukter, samt fremstilling av Nogo-proteiner. Oppfinnelsen angår også anvendelse av proteinet for fremstilling av et medikament.

I sentralnervesystemet (CNS) hos høyere virveldyr er regenerering av aksoner etter skade nesten fraværende, og den strukturelle plastisitet er begrenset. Det er sannsynlig at vekstinhibitorer forbundet med CNS-myelin spiller en viktig rolle. Dette er vist ved hjelp av et monoklonalt antistoff (mAb), IN-1, som nøytraliserer et potent neurittvekst-inhiberende myelinprotein, hvorved langdistanse-aksonregenerering befordres og kompenserende plastisitet etter ryggmarg- eller hjernelesjoner hos voksne rotter økes.

En rekke in vitro- og in vivo-observasjoner har vist et nytt aspekt ved neurittvekst-regulering, som er tilstedeværelse av repulsive og inhiberende signaler og faktorer (Keynes og Cook, 1995. Curr. Opin. Neurosci. 5:75-82). De fleste av disse signaler så ut til å være proteiner eller glykoproteiner. Et første gjennombrudd mot identifisering av faktorene var rensing og cDNA-kloning av et kyllinghjerne-avledet vekstkonus-kollaps-induserende molekyl, Collapsin-1, nå kalt Semaphorin 3 A.

En andre gruppe repulsive styrerekker («guidance cues») som nylig er blitt renset og klonet, er nå betegnet efriner. De er ligander for Eph-reseptor-tyrosinkinasefamilien. Efrin-A5 og Efrin-A2 uttrykkes som gradienter i det optiske tectum i kyllingfosteret, og deres ektopiske ekspresjon eller delesjon forårsaker styringsfeil hos innvoksende retina-aksoner. I likhet med semaforinene har efrinfamilien 15-20 medlemmer, hvert med en kompleks og dynamisk ekspresjon i og utenfor nervesystemet. De fleste av disse molekylers funksjoner står tilbake å bli analysert.

En tredje gruppe av styrerekker som kan støte tilbake voksende aksoner og som uttrykkes i nervesystemet som er under utvikling, er netrinene. Netrin er blitt renset som et bunnplate-avledet kjemo-tiltrekkingsmiddel for kommisurale aksoner i tidlige ryggmarger, så som dets C- elegans-ortolog unc-6. Netrin-1 har vist seg å ha repulsive virkninger for visse typer neuroner, avhengig av typen reseptor som er tilstede på mål-neuron-vekstkonusene (Tessier-Lavigne et al., 1996, Science 274:1123-33).

Tidligere ble en potent neurittvekst-inhiberende aktivitet forbundet med fullt utviklede CNS-oligodendrocytter og myelin rapportert av Canoni og Schwab (1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288). En hovedbestanddel er et membranprotein med høy molekylvekt (NI-250, med en mindre komponent, NI-35, hos rotter) som nylig er blitt renset, og som er beslektet med gjenstanden for foreliggende oppfinnelse, og bindes av det nøytraliserende mAb, IN-1 (Canoni og Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288; US-patent nr. 5 684 133, 5 250 414; PCT-publikasjoner WO 93/00427).

Myelin-tilknyttede neurittvekst-inhibitorer spiller en avgjørende rolle når det gjelder forhindring av regenerering av skadde CNS-aksoner. Når oligodendrocytt-utvikling og myelindannelse blokkeres hos kyllinger eller rotter, forlenges det regenererings-tillatte tidsrom etter CNS-lesjoner. Faktisk samsvarer myelindannelsen i tid med slutten av utviklingstidsrommet hvor CNS viser høy strukturell plastisitet og et høyt potensial for regenerering.

NI-250 og NI-35 er sannsynligvis hovedkomponenter i den myelintilknyttede vekstinhibering, vist ved in vivo-tilføring av IN-1 til ryggmargskadede voksne rotter, som induserte regenerering av kortikospinal-aksoner over lange avstander og muliggjorde motorisk og oppførsels-funksjonell restitusjon spesielt med hensyn til bevegelsesevne. Liknende forsøk angående synsnerven og den kolinerge septo-hippocampusvei viste også in vivo-relevans av det IN-1-gjenkjente antigen, NI-35/250 (Schnell og Schwab, 1990, Nature 343:269-272; Bregman et al, 1995, Nature 378:498-501).

Uskadde fibersystemer responderer også på nøytralisering av neurittvekstinhibitorer med IN-1. Nylige forsøk har vist på en avgjørende måte at etter en selektiv kortikospinal-system-lesjon (pyramidotomi), skyter intakte fibrer over midtlinjen i ryggmargen og hjernestammen og oppretter et bilateralt innervasjonsmønster, fulgt av en nesten fullstendig oppførsels-restitusjon av presisjonsbevegelser i nærvær av IN-1 (Z'Graggen et al., 1998, J. Neuroscience 18(12):4744-4757).

Isolasjon av genet som koder for det neurittvekst-inhiberende protein, tilveiebringer multiple anledninger til utvikling av produkter som er nyttige ved neuron-regenerering, og ved behandling av forskjellige neurologiske forstyrrelser, innbefattende CNS-tumor.

A.A. Spillmann et al.,The Journal of Biological Chemistry, 1998, Vol 273 (30), side 19283-10293 beskriver identifikasjon og karakteristikk av en bovin neurittvekstinhibitor, bNI-220, isolert fra bovin ryggmarg. bNI-220 har både samme sekvens som bovin Nogo A og samme egenskaper som for eksempel hemming av neurittutvekst og inhibering av spredning av NIH-3T3 celler D.S. Cadelli et al., Experimental Neurology, 1992, Vol 115, side 189-192 gjør kjent at proteiner som som inhiberer neurittutvekst, NI-250 og NI-35, er isolert fra rotte, bovin og human benmarg.

WO 98/17687 A2 beskriver en sekvens SEQIDNO: 9 med over 98% identitet til et 646 aminosyrer langt fragment av foreliggende SEQ ID:29, som er det humane NogoA proteinet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter renset humant protein, kjennetegnet ved at det består av en aminosyresekvens med mer enn 95% identitet over hele lengden til SEQ ID NO: 29 og som er (i) fritt for alt sentralnervesystem-myelinmateriale som det er naturlig forbundet med og (ii) som har en inhibitorisk effekt på nevritt utvekst.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fusjonsprotein eller kimært protein, kjennetegnet ved at det omfatter proteinet ifølge kravene 1 til 4.

Videre omfatter oppfinnelsen isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved at det koder for proteinet ifølge krav 1.

Omfattet av oppfinnelsen er også kloningsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyren ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 8 operasjonelt koblet til en ikke-nativ promoter.

Videre omfattes rekombinant celle, kjennetegnet ved at den er transformert med nuleinsyren ifølge SEQ ID NO: 1 eller med vektoren ifølge et hvilket som helst av kravene 9 og 10.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også fremgangsmåte for å fremstille proteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) dyrking av cellen ifølge krav 11 eller 12; og (b) gjenvinne nevnte protein.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse protein ifølge et hvilket som helst av kravene

1 til 5 for anvendelse som et medikament.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også anvendelse av et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor proteinet er aktivt ved å inhibere celleproliferering hos et individ, for fremstilling av et medikament for behandling av en neoplastisk sykdom i sentralnervesystemet, der den neoplastiske sykdommen er gliom, glioblastom, medulloblastom, kraniofaryngiom, ependymom, pineaiom, hemangioblastom, akustisk neurom, oligodendrogliom, menangiom, neuroblastom eller retinoblastom.

Fremgangsmåte for identifisering av gener som vekselvirker med Nogo er også mulig.

Nogo er et gen tilveiebrakt ved foreliggende oppfinnelse, identifisert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, som både koder for og vekselvirker med nervevekst-regulerende proteiner.

Det er også mulig å fremskaffe Afogo-derivater og analoger som er funksjonelt aktive, dvs. at de kan oppvise én eller flere kjente funksjonelle aktiviteter forbundet med et naturlig forekommende Nogo-protein. Det er for eksempel blitt identifisert et hoved-inhiberingsområde mellom aminosyrene 542-722. Slike funksjonelle aktiviteter innbefatter, neurittvekstinhibering av nerveceller, utbredelse og vandring av fibroblaster eller en hver celle som oppviser neoplastisk vekst, evne til å vekselvirke med eller konkurrere med hensyn til vekselvirkning med nervevekst-regulerende proteiner, antigenisitet som er evnen til å bindes (eller konkurrere med Nogo med hensyn til binding) til et anti-Nogo-antistoff, immunogenitet som er evnen til å danne antistoff som bindes til Nogo. Disse antistoffer har potensial til å indusere neuritt-utvekst eller forhindre dorsalrotganglie-vekstkonussammenbrudd ved inhibering av Nogos funksjon, og funksjonelle fragmenter eller derivater av Nogo, med evne til å inhibere neuritt-utvekst.

Også fragmenter (og derivater og analoger til disse) av Nogo som omfatter ett eller flere doméner av et Nogo-protein er mulig å fremskaffe, så som den sure og prolinrike aminoterminale ende (f.eks. ved aminosyrer 31-58 av SEKV ID NR: 2), den sterkt konserverte karboksyterminale ende, og to hydrofobe perioder med lengde 35 og 36 aminosyrer i rotte-Nogo, også i den karboksyterminale ende (f.eks. ved aminosyrer 988-1023, og ved 1090-1125 av SEKV ID NR:2).

Det er mulig å tilveiebringe antistoffer mot de forskjellige Nogo og Nogo-derivater og -analoger. Som eksempel er det spesielt to antistoffer, det første antistoff, betegnet AS 472, ble oppnådd idet man som immunogen anvendte et syntetisk peptid svarende til aminosyrene 623-640 i SEKV UD NR:2, og det annet antistoff, betegnet AS Bruna, ble dannet mot de karboksyterminale aminosyrer 762-1163 i SEKV ID NR:2, i Nogo. Fremgangsmåter for fremstilling av Nogo-proteinene, -derivatene og -analogene, f.eks. på rekombinant måte, er også tilveiebrakt.

Det er også mulig å anvende terapeutiske og diagnostiske fremgangsmåter og preparater basert på Nogo-proteiner og -nukleinsyrer. Terapeutiske forbindelser kan omfatte Nogo-proteiner og analoger og derivater derav; antistoffer overfor dem; nukleinsyrer som koder for Nogo-proteinene, -analogene eller -derivatene; og Nogo-ribozymer eller Nogo-antisense-nukleinsyrer.

Det er også mulig å frembringe terapeutiske og diagnostiske fremgangsmåter og preparater basert på Nogo-proteiner og nukleinsyrer og anti-Nogo-antistoffer. Oppfinnelsen tilveiebringer behandling av CNS- og nerveavledede tumorer ved administrering av forbindelser som befordrer Nogo-aktivitet (f.eks.Nogo-proteiner og funksjonelt aktive analoger og derivater innbefattende fragmenter derav; nukleinsyrer som koder for Nogo-proteinene, -analogene eller -derivatene, agonister til Nogo).

Videre er det mulig å behandle sykdommer, forstyrrelser eller ødeleggelse som til slutt resulterer i ødeleggelse av nervesystemet; slike sykdommer, forstyrrelser eller ødeleggelse innbefatter, men er ikke begrenset til, sentralnervesystem-(CNS)-traume (f.eks. ryggmarg- eller hjerneskader), infarkt, infeksjon, malignitet, utsettelse for toksiske midler, næringsmangel, paraneoplastiske syndromer og degenerative nervesykdommer, slike som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons chorea, multippel sklerose, amyotrofisk lateral sklerose, samt progressiv supranukleær lammelse); ved administrering av forbindelser som innvirker på Nogo-aktiviteten (f.eks. et dominant negativt Nogo-derivat; antistoffer mot Nogo; anti-sense-nukleinsyrer i Nogo; Nogo- ribozymer eller kjemiske grupper som binder et aktivt sete på Nogo).

Dyremodeller, diagnostiske fremgangsmåter og screening-fremgangsmåter med hensyn til disponering for forstyrrelser, samt fremgangsmåter for identifisering og vurdering av Nogo-agonister og -antagonister, er også mulig å tilveiebringe.

Anvendt i det foreliggende angir understreking eller kursivering av navnet på et gen genet, i motsetning til dets kodede proteinprodukt, som er angitt med navnet på genet uten understreking eller kursivering. For eksempel angir «Nogo» Nogo- genet, mens «Nogo» angir proteinproduktet av Nogo- genet.

Fig. la-lb: (a) Afogo-cDNA-kloner: CWP1-3 er en bovin cDNA-klon isolert fra screening av et bovint ryggmarg-hvitsubstans-cDNA-bibliotek med degenererte oligonukleotider MSC5-8 (blandet) og MSC9. Komplementær RNA som stammer fra denne klon, ble anvendt for påfølgende rotte-cDNA-bibliotekscreening. OH3 og Oli 18 er isolert fra et oligo-d(T)-primet rotte-oligodendrocyttbibliotek. R1-3U21, R018U1 og R018U37-3 er isolert fra et heksanukleotid-primet rotte-hjernestamme/ryggmarg-bibliotek (Stratagene). Posisjonene for de 6 bovine NI220- (bNI220)-peptidsekvenser er angitt på CWP1-3 og R13U21. Sekvenser ved forbindelsene mellom forskjellige eksoner er merket på toppen av hver klon. Spørsmålstegnene angitt på R018U1 identifiserer sekvensen på denne klon som ikke passer til sekvensene fra noen andre Afogo-kloner. R018U37-3 var sekvensert bare fra 5'-enden, og den ikke-sekvenserte del er representert ved prikker, (b) Skjematiske fremstillinger som viser en hypotetisk mekanisme for dannelsen av tre Afogø-transkripter. Pl og P2 representerer den antatte beliggenhet av de alternative promoterer. Det minimale antall av tre eksoner er nødvendig for frembringelse av de tre transkripter som vist skjematisk, skjønt hver ekson potensielt kan deles i multiple eksoner. Fig. 2a-2b: (a) Nukleotid- (SEKV ID NR:1) og aminosyresekvenser (SEKV ID NR:2) av Afogø-transkript A (sekvens frembrakt ved sammenbinding av R018U37-3-, OH18-og Rl-3U21-cDNA-sekvenser). Oval ramme: antatt startkodon; understreket med prikker: sur periode; Dpotensielle PKC-seter; ♦: potensielle kaseinkinase H-seter; tykk understreking: karboksyterminale hydrofobe områder og potensielle transmembran-doméner; tynn understreking: potensielle N-glykosyleringsseter. (b) Peptidsekvens-sammenlikning mellom sekvensert, renset bovint NI220 (bNI220; SEKV ID NR:3-8) og de tilsvarende bovine (SEKV ID NR:9-14) og rotte-(SEKV ID NR:15-20)-sekvenser translatert fra rotte- og bovine cDNA. Rotte- og bovine aminosyresekvenser, som ikke passer til bNI220-peptidsekvensene, er innført nederst. Fig. 3a-3b: (a) Aminosyresekvens-sammenlikning mellom de karboksyterminale felles 180 aminosyreområder av NSP (human; SEKV ID NR:21), S-REX (rotte) (SEKV ID NR:22), CHS-REX (kylling; SEKV ID NR:23), NOGOBOV (bovin; SEKV ID NR:24), NOGORAT (rotte; SEKV ID NR:25), en C. elegans-EST-klon (W06A7A; SEKV ID NR:26) og D. melanogaster EST-klon (US51048; SEKV ID NR:27). (b) Evolusjonær konservering av de to hydrofobe områder. Prosentvise likheter innenfor og på tvers av arter for de felles hydrofobe områder er vist. Skjermede («shaded») bokstaver: konserverte aminosyrer. Fig. 4a-4c: (a) Northern-hybridisering av forskjellige vev med Afogø-fellesproben. Felles probe inneholder transkript A-sekvens mellom nukleotider 2583-4678. ON - synsnerve; SC - ryggmarg; C - hjernebarken; DRG - dorsalrotganglier; SN - isjasnerve; PC12 - PC12-cellelinje. (b) Northern-hybridisering av ryggmarg og PC12-celle-RNA med en ekson 1-spesifikk probe (venstre felt) og lillehjerne- (HB) og skjelettmuskel-(M)-RNA med en ekson 2-spesifikk probe (høyre felt), (c) Northern-hybridisering med Nogo-fellesproben. K - nyre; B - brusk (fra brystben); Sk - hud; M - skjelettmuskel; Lu - lunge; Li - lever; Sp - milt. De tre hovedtranskripter er merket (4,6 kilobaser (kb), 2,6 kb og 1,7 kb). ♦: et diffust, men ensartet bånd med størrelse ca. 1,3 kb. Fig. 5a-5f: In situ-hybridisering av ryggmarg- og lillehjernesnitt fra voksne rotter, (a, d) Rekker av oligodendrocytter (OL) i hvit substans fra henholdsvis ryggmarg og lillehjerne kan sees merket med Nogo-antisense-«felles»-riboproben. Dette er meget likt signalene påvist når et påfølgende ryggmargsnitt ble hybridisert til en antisense-plop-riboprobe (b). (c) Neuroner i grå substans (GM) ble også merket med Nogo-antisense-«felles»-riboproben. WM: hvit substans. Lyst felt og fluorescerende bilde av henholdsvis et lillehjerne-snitt dobbeltmerket med den «felles» Nogo-antisense-riboprobe (e) og av et anti-GFAP-antistoff (f). Purkinje-celler (doble pilhoder) er sterkt merket med Nogo-proben, mens astrocytter (pilhoder, svarte og hvite) er negative. Noen få celler i granulærcelle-laget (Gr) er også merket med Afogo-proben, m: molekyllag. Målestokk: a, b, d-f: 50 p.m; c: 280 p.m. Fig. 6a-6i: In situ-hybridisering av synsnerver på forskjellige postnatale dager (a,f: PO; b,g: P3; c,h: P7; d,e,i: P22) med enten Nogo- eller />#?-(antisense- eller sense-)prober. (a-d) Nogo-antisenseprobe; (e) Afogo-senseprobe; (g-i) /?/fp-antisenseprobe; (f) plp-senseprobe. Afogø-ekspresjon i oligodendrocytt-forløpere kan påvises så tidlig som PO,

mens plp-ekspresjon bare begynte å bli påvisbar i P3-synsnerver nær chiasma (g).

Fig. 7: AS Bruna og AS 472 gjenkjenenr begge et myelinprotein på ca. 200 kD. Rottemyelinekstrakt og bovin q-pool ble preparert ifølge Spillmann et al., 1998, J. Biol. Chem., 273(30):19283-19293. AS Bruna og AS 472 gjenkjente begge et 200 kD-bånd samt flere lavere bånd i bovint myelin, som kan være nedbrytningsprodukter av bNI220. AS Bruna farget et bånd 200 kD i rottemyelin. I: AS Bruna; P: AS Bruna, preimmunserum; E: AS 472 affinitetsrenset. Fig. 8a-8i: Immunhistokjemi for rotte-ryggmarg og lillehjerne under anvendelse av IN-1 (a-e), AS Bruna (d-f), og AS 472 (g-i), som angitt til venstre i hvert felt. En sterk myelinmerking ble observert i begge vev med alle tre antistoffer når de frosne snitt ble fiksert med etanol/eddiksyre (a, b, d, e, g, h). Behandling av snittene med metanol opphevet myelinmerkingen, bortsett fra når det gjaldt oligodendrocytt-cellelegemer (piler; c, f,i). Pilspisser: Purkinje-celler, WM - hvit substans; GM - grå substans, DR: dorsalrot; Gr - granulærcelle-lag; m - molekyllag.Målestokk: a, d, g: 415 um; b, c, e, f, h, i: 143 u.m.

Fig. 9a-9d: Nøytraliserende aktivitet av AS 472 og AS bruna i forskjellige bioanalyser. (a) NTH 3T3-fibroblastene ble utplatet på cellekulturskåler belagt med q-pool og for-behandlet med IN-1, AS Bruna, AS 472 eller de tilsvarende pre-immunsera. Begge polyklonale sera viste til og med en litt bedre nøytralisering av det inhiberende substrat enn IN-1. Pre-immunseraene hadde ingen signifikant effekt på utbredelsen av NIH 3T3-cellene. Tilsetting av et overskudd av peptidet (P472) som ble anvendt til fremkallelse av AS 472, utkonkurrererte den nøytraliserende aktivitet, mens et uspesifikt peptid (Px) ikke hadde noen effekt, (b) For-behandling av det inhiberende substrat med AS Bruna eller AS 472 resulterte i DRG-neurittutvekst tilsvarende det som kan oberveres på et lamininsubstrat. Eksempler på neuritt-utvekst fra DRG på q-pool for-behandlet med PBS (c; poeng = 0) og for-behandlet med AS Bruna (d; poeng = 4). Fig. 10a-10d: Injeksjon av synsnerve-eksplantater med AS 472 resulterer i innvekst av aksoner. (a) Par av synsnerver fra voksne rotter ble dissekert, injisert med AS 472 eller preimmunserum og anbrakt i kammerkulturer slik at én ende av nervene var i kontakt med dissosierte PO-rotte-DRG-neuroner. (b) Etter to uker in vitro, ble EM-snitt av nervene uttatt med 3,5 mm fra kuttstedet (piler i A) og screening-undersøkt systematisk med hensyn til intakte aksoner (3 forsøk), (c) Regenererte aksonbunter (piler) vokser gjennom degenererende AS 472-injisert synsnerve. (d) Regenererende aksoner i kontakt med myelin. Forstørrelse: c - 12 000x; d - 35 000x. Fig. 1 la-1 lc: Rekombinant Nogo A-ekspresjon i transfekterte COS-celler, (a) Western blot som viser immunreaktivitet av AS Bruna overfor rekombinant Nogo A (felt 2) og endogent Nogo A fra primære dyrkede rotte-oligodendrocytter (felt 3). Mobilitetene hos disse to proteiner er praktisk talt identiske ved ca. 200 kD på en 5% denaturerende SDS-gel. En kontroll-LacZ-konstruksjons-transfektert prøve (felt 1) viste ingen immunreaktivitet med AS Bruna. Det samme blot ble også probeundersøkt med anti-myc-antistoff, 9E10, som angitt. Båndet som reagerte med AS Bruna, reagerte også med anti-myc-merkingsantistoffet, 9E10 (felt 5), mens det endogene Nogo A ikke reagerte (felt 6). LacZ-kontroll-transfeksjonsprøven viste det ventede bånd ved ca. 118 kD (felt 4). COS-celler forbigående transfektert med en Nogo A-konstruksjon ble dobbeltmerket med AS Bruna (b) og IN-1 (c). Celler som ble positivt merket med AS Bruna, var også positive med IN-1.

Fig. 12: Nukleotidsekvensen (SEKV ID NR:28) for den bovine Nogo- cDNA.

Fig. 13: Aminosyresekvensen i rotte-Nogo A (SEKV ID NR:2) innrettet med den teoretiske aminosyresekvens i humant Nogo (SEKV UD NR:29). Den humane Nogo-aminosyresekvens ble oppnådd ved innretting av uttrykte sekvensmerkematerialer (EST) med rotte-Nogo-sekvensen og translatering av de innrettede humane EST'er under anvendelse av rotte-Nogo som styringstemplat. Fig. 14: Rotte-Nogo C-nukleinsyre (SEKV ID NR:31)-sekvens og dens tilsvarende aminosyresekvens (SEKV ID NR:32). Fig. 15a-15e: Nogo A er tilstede på oligodendrocytt-plasmamembranen, påvist ved immuncytokjemi og celleoverflate-biotinylering av oligodendrocytter i kultur.

Immuncytokjemi (a-d): Oligodendrocytter fra synsnerver i P10-rotter ble atskilt og dyrket i 2 dager. Merking av levende celler med mAb IN-1 (a) eller AS 472 (c) viste immunreaktivitet på oligodendrocytt-cellelegemer og -utspring. I nærvær av det konkurrerende peptid P472 viste AS 472 bare bakgrunnsmerking (alle celletyper) (d). Liknende ikke-spesifikk merking kunne sees når primære antistoffer var utelatt (b). Evaluering: Tallkodede skåler ble tilfeldig blandet og klassifisert av 3 uavhengige obsevatører. 8/10 skåler ble korrekt klassifisert som AS 472-positive, mAb IN-1-positive eller kontroller av alle de tre observatører.

Biotinylering (e): Rotte-P4-kulturer av hel hjerne anriket med oligodendrocytter ble celleoverflate-biotinylert med et membran-ugjennomtrengelig reagens etter sju dager i kultur. Deretter ble cellehomogenatene behandlet med streptavidin-Dynabeads. Utfelt materiale (Ppt) og supernatant (sup) ble «blottet» med AS 472; de viste et forskjellig proteinmønster: Celleoverfiate-Nogo A funnet i det utfelte materiale viste en høyere tilsynelatende molekylvekt enn intracellulært Nogo A. Dette skifte skyldes sannsynligvis glykosylering. Det luminale ER-protein BiP og størstedelen av P-tubulin kunne bare finnes i den intracellulære fraksjon.

Fig. 16a-16j: Funksjonelle analyser viser tilstedeværelse av Nogo A på cellemembranen hos oligodendrocytter. Pre-inkubering av synsnervekulturer med AS 472 (a, b) ga mulighet for NTH 3T3-fibroblastene til å utbres over de sterkt forgrenede oligodendrocytter som er skissert ved immunfluorescensmerking med hensyn til GalC (01-antistoff) (a). Pilene i det tilsvarende fasekontrastbilde (b) viser at NIH 3T3 fibroblastene utbres på toppen av oligodendrocyttene. (c, d): Når AS 472 ble tilsatt

sammen med P472, unngikk NIH 3T3-fibroblastene fullstendig territoriene for de GalC-positive oligodendrocytter (pilspisser) (Caroni og Schwab, 1988 Neuron 1:85-96). (e,f): I nærvær av AS 472 var atskilte PO-rotte-DRG-neuroner i stand til å utbre neuritter over territoriet for sterkt forgrenede oligodendrocytt (piler i f), (g, h): Peptidet P472 utkonkurrerte effektivt den nøytraliserende aktivitet av AS 472: neurittene unngikk fullstendig oligodendrocyttene. AS 472 anvendt i disse forsøk ble dannet mot rotte-472-peptidsekvensen. (i j): Kvantifisering av disse resultater (som beskrevet under metoder) viste den sterke nøytraliserende aktivitet av AS 472 i begge typer analyser. Målestokk: 40 um.

Fig. 17a-17e: Rekombinant Nogo A er et inhiberende substrat, og dets inhiberende aktivitet nøytraliseres av mAb IN-1. RecNogo A-anrikede ekstrakter fra en stabil CHO-Nogo A-cellelinje, eller p-galaktosidase, isolert parallelt fra den stabile CHO-LacZ-cellelinje, ble belagt for NIH 3T3-fibroblastutbredelses- og DRG-neurittutvekst-analysene. (a) Sølvgel av myc-his-merket recLacZ (felt 1) og recNogo A (felt 2) viser Nogo A-båndet ved 180 kD. Identiteten av Nogo A-båndet ble bekreftet ved Western-blot inkubert med AS Bruna (felt 3) og et anti-myc-antistoff 9E10 (felt 4). (b) RecNogo A-belagte plater var lydelig inhiberende for NIH 3T3-utbredelseen. Pre-inkubering med mAb IN-1 eller AS Bruna resulterte i en meget signifikant (p<0,01) nøytralisering av inhiberende aktivitet. Kontroll-IgM mAb Ol og preimmunserumet var ineffektive. CHO-LacZ-ekstrakt hadde en delvis inhiberende effekt på NIH 3T3-cellene, sannsynligvis på grunn av endogene CHO-proteiner. Denne inhiberende aktivitet var ikke påvirket av pre-inkubering med antistoffer.

(c) For DRG-neurittutvekstanalyser ble det samme proteinmateriale som under (b) blandet med laminin og belagt. RecNogo A hadde en meget potent inhiberende effekt på neurittutvekst i dissosiert DRG på en doseavhengig måte. Aktiviteten ble nøytralisert av mAb IN-1 (p<0,001), men ikke av kontroll-mAb 01. Proteinmateriale isolert fra CHO-LacZ-celler var ikke inhiberende i noen av de anvendte konsentrasjoner, og heller ikke hadde inkubering med antistoffer noen effekt på neuritt-utvekst. Elsempler på poengbedømmelse er vist under (d): 1 ug recNogo A, ingen eller korte neuritter (piler)

poeng: 2, og under (e): 1 ug CHO-LacZ, lange, forgrenede neuritter (pilspisser) poeng: 5-6. Statistisk analyse ble utført med tohalet Students test. Målestokk: 280 um.

Fig. 18: Funksjonell analyse av Nogo-delesjonsmutanter. Følgende delesjons-konstruksjoner som koder for fusjonsproteiner inneholdende fragmenter av Nogo eller avkuttede deler av Nogo (som oppregnet nedenfor) ble frembrakt som beskrevet i avsnitt 6.2.7 nedenfor.

Nogo-A: His-merking/T7-merking/vektor/Nogo A sekv. aal -1162

Nogo-B: His-merking/T7-merking/vektor/Nogo A sekv. aal-171 + 975-1162 Nogo-C: His-merking/T7-merking/Nogo-C N-terminus (11 aa) + Nogo-A sekv. aa

975-1162

NiAext: His-merking/T7-merking/vektor/Nogo-A sekv. aal-974/T7-merking NiR: His-merking/T7-merking/vektor/Nogo-A sekv. aal-17l/vektor NiG: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-974/His-merking

EST: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 760-1162

NiG-D 1: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-908/vektor NiG-D2: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-866/His-merking NiG-D3: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-723/His-merking NiG-D4: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-646/vektor NiG-D5: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 291 -646/His-merking NiG-D7: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-234 + 292-974/His-merking

NiG-D8: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-628

NiG-D9: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-259 + 646-974/His-merking

NiG-D 10: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 291 -974/His-merking NiG-D 14: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-259

NiG-D 15: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-189 + 491 -974/His-merking

NiG-D 16: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-189 + 619-974/His-merking

NiG-D 17: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-189 + 257-974/His-merking

NiG-D 18: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 172-189 + 261-974/His-merking

NiG-D20: His-merking/T7-merking/Nogo-A sekv. aa 542-722/His-merking

Aminosyre-(aa)-numrene er basert på rotte-Nogo A-aminosyresekvensnummerering (SEKV ID NR:2), idet man starter med det første metionin. His-merkemateriale og T7-merkemateriale består av 34 aminosyrer. De N- og C-terminale vektorsekvenser stammer fra ekspresjonsvektoren pET28.

Foreliggende oppfinnelse angår nukleotidsekvenser av Afogo-gener, samt aminosyresekvenser i deres kodede proteiner. Oppfinnelsen angår dessuten også andre derivater, samt analoger, til Nogo-proteiner. Nukleinsyrer som koder for slike derivater, er også innenfor oppfinnelsens ramme. Oppfinnelsen tilveiebringer Afogø-gener og deres kodede proteiner av mange forskjellige arter. Afogø-genene kan omfatte humane, rotte- og bovine Nogo- og beslektede gener (homologer) i andre arter. Bovin-subsekvensene beskrevet i Spillman et al, 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-19293, er ikke patentsøkt som en del av foreliggende oppfinnelse. Ved spesifikke utførelsesformer er Nogo-genene og -proteinene fra virveldyr, eller mer spesielt pattedyr. Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er Afogo-genene og -proteinene av human opprinnelse. Fremstilling av de forannevnte proteiner og derivater, f.eks. ved rekombinante metoder, er tilveiebrakt.

Afogo-genet kan omfatte nukleinsyremolekyler som koder for tre isoformer av Nogo; nemlig Nogo A, Nogo B og Nogo C. Henvisning til genet «Nogo» innbefatter nukleinsyremolekyler som koder for alle de tre isoformer, dersom ikke annet er angitt. Likeledes innbefatter henvisning til Nogo-protein alle de tre isoformer av Nogo, dersom ikke annet er angitt. Nogo-proteiner ifølge oppfinnelsen kan forhindre regenerering av neuroner i ryggmargen eller hjernen (dvs. ikke-tillatelige substrategenskaper), inhibere dorsalrotganglie-neurittutvekst, indusere dorsalrotganglie-vekstkonussammenbrudd, blokkere NIH 3T3-celleutbredelse, blokkere PC12-neurittutvekst osv.

Nogo-proteinene, samt derivater derav er fri for alt myelinmateriale fra sentralnervesystemet; de er spesielt fri for alt myelinmateriale fra sentralnervesystemet som Nogo-proteinet er naturlig forbundet med. Slikt materiale kan innbefatte andre CNS-myelinproteiner, -lipider og -karbohydrater. Nogo-proteinene, samt fragmentene og derivatene derav ifølge oppfinnelsen er også fortrinnsvis fri for reagenser anvendt ved rensing fra biologiske prøver, så som detergenter.

Ved en spesifikk utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen rekombinante Nogo-proteiner, derivater derav fremstilt ved hjelp av fremgangsmåter kjent på området, så som ved ekspresjon av Afogo-genet i en gentekonologisk oppbygd celle. Nogo-derivater og -analoger som er funksjonelt aktive, dvs. at de kan fremvise én eller flere kjente funksjonelle aktiviteter forbundet med et Nogo-protein i hel lengde (villtype). Slike funksjonelle aktiviteter kan innbefatte evnen til å vekselvirke med (eller konkurrere med hensyn til binding til) nervevekst-regulerende proteiner, antigenisitet [evne til å bindes (eller konkurrere med Nogo med hensyn til binding) til et anti-Nogo-antistoff], immunogenitet (evne til å danne antistoff som bindes til Nogo), forhindring av regenerering av neuroner i ryggmargen eller hjernen, tilveiebringelse av den egenskap til et substrat at vekst, utbredelse og vandring av nerveceller og neoplastiske celler begrenses, inhibering av dorsalrotganglie-neurittutvekst, induksjon av dorsalrotganglie-vekstkonus-sammenbrudd, blokkering av NIH 3T3-celleutbredelse in vitro, blokkering av PC12-neurittutvekst, begrensning av nerveplastisitet, osv.

Det er også mulig og tileveibringe antistoffer mot Nogo, dets derivater og analoger.

Videre er det også mulig å frembringe terapeutiske og diagnostiske fremgangsmåter og preparater basert på Nogo-proteiner og nukleinsyrer og anti-Nogo-antistoffer. Det er også mulig å behandle forstyrrelser i vekstregulerte celler eller organer ved administrering av forbindelser som befordrer Nogo-aktivitet (f.eks. Nogo-proteiner og funksjonelt aktive analoger og derivater (innbefattende fragmenter) derav; nukleinsyrer som koder for Nogo-proteinene, -analogene, eller -derivatene, agonister til Nogo).

Fremgangsmåter for behandling av ødeleggelse eller forstyrrelse i nervesystemet ved administrering av forbindelser som motvirker eller inhiberer Nogo-funksjonen (f.eks. antistoffer, Nogo-antisense-nukleinsyrer, Nogo-antagonistderivater) er mulig.

Dyremodeller, diagnostiske fremgangsmåter og screening-fremgangsmåter med hensyn til disposisjon for forstyrrelser er også mulig å bringe tilveie.

5.1 ISOLASJON AV iVOGO- GENER

Oppfinnelsen angår nukleotidsekvensene i Afogø-gener eller nukleinsyrer.

Afogo-nukleinsyrer kan omfatte rotte-cDNA-sekvensen ifølge fig. 2a (SEKV ID NR:1) identifisert som Nogo A som angitt på fig. lb, eller kodingsområdene for denne, eller nukleotidsekvenser som koder for et Nogo-protein med en lengde på 1163 aminosyrer eller hvilket som helst funksjonelt fragment eller derivat derav (f.eks. et protein med sekvensen ifølge SEKV ID NR:2, som vist på fig. 2a).

Afogo-nukleinsyrer kan videre omfatte nukleotidsekvensen som koder for Nogo B, mens Nogo B-proteinet er ekvivalent med de aminoterminale 172 aminosyrer koplet til de karboksyterminale 188 aminosyrer i Nogo A, noe som resulterer i et avkuttet 360 aminosyre-protein. Transkriptene for Nogo B oppstår som et resultat av alternativ spleising som fjerner den inngripende nukleotidkodende sekvens.

Afogo-nukleinsyrer kan også omfatte nukleotidsekvensene som koder for Nogo C, mens Nogo C-proteinet inneholder 11 aminosyrer i sin aminoterminale ende som ikke er tilstede i Nogo A, samt de karboksyterminale 188 aminosyrer i Nogo A og B. Nogo C-proteinet har 199 aminosyrer. Transkriptet som koder for Nogo C, er resultatet av transkripsjon fra en alternativ Nogo-promoter.

Det er også mulig å tilveiebringe bovine Nogo-nukleinsyresekvenser (SEKV ID NR:28). Ved en spesifikk utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nukleotidsekvensene som koder for humant Nogo. Den humane Nogo-nukleinsyresekvens belyses ved anvendelse av rotte-Nogo A-transkriptet som templat, og sammenspleising av humane uttrykte sekvens-merkematerialer (EST) under avsløring av en kontinuerlig nukleotidsekvens. Rotte- og bovine aminosyresekvenser i Nogo ga også informasjon om den riktige translasjons-leseramme slik at en aminosyresekvens i humant Nogo utledes. Det er også mulig å tilveiebringe aminosyresekvenser i fragmenter av det humane Nogo- gen.

Videre er det mulig å tilveiebringe rensede nukleinsyrer bestående av minst 8 nukleotider (dvs. en hybridiserbar del) av en Afogo-sekvens; eller at nukleinsyrene består av minst 25 (kontinuerlige) nukleotider, 50 nukleotider, 100 nukleotider, 150 nukleotider, 20 nukleotider, 500 nukleotider, 700 nukleotider eller 800 nukleotider av en Afogo-sekvens, eller en Afogo-kodingssekvens i hel lengde. Nukleinsyrene kan ha en lengde som er mindre enn 35,200 eller 500 nukleotider. Nukleinsyrer kan være enkelt-eller dobbeltstrenget. Nukleinsyrer kan også hybridiseres til eller er komplementære til forannevnte sekvenser. Det kan også tilveiebringes nukleinsyrer som omfatter en sekvens som er komplementær til minst 10, 25, 50, 100 eller 200 nukleotider eller hele kodingsområdet i et Nogo- gen.

Det kan tilveiebringes en nukleinsyre som kan hybridiseres til en Afogo-nukleinsyre (f.eks. som har sekvens SEKV ID NR:2; fig. 2a), eller til en nukleinsyre som koder for et Nogo-derivat, under betingelser med lav stringens. Som eksempel, er metoder hvor det anvendes slike betingelser med lav stringens, som følger (se også Shilo og Weinberg, 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:6789-6792): Filtre inneholdende DNA for-behandles i 6 timer ved 40°C i en oppløsning inneholdende 35% formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA og 500 ug/ml denaturert laksespermie-DNA. Hybridiseringer utføres i samme oppløsning med følgende modifikasjoner: Det anvendes 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 ug/ml laksespermie-DNA, 10% (på vekt/volum-basis) dekstransulfat og 5-20 X IO<6>cmp (tellinger pr. minutt)<32>P-merket probe. Filtrene inkuberes i hybridiseringsblanding i 18-20 timer ved 40°C og blir så vasket i 1 Vi time ved 55°C i en oppløsning inneholdende 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA og 0,1% SDS. Vaskeoppløsningen erstattes med frisk oppløsning og inkuberes i ytterligere 1 Vi time ved 60°C. Filtrene «blottes» tørre og eksponeres for autoradiografi. Hvis nødvendig, blir filtrene vasket en tredje gang ved 65-68°C og igjen eksponert for film. Andre betingelser med lav stringens som kan anvendes, er velkjente på området (f.eks. som anvendt for kryss-art-hybridiseringer som vist i eksemplet i avsnitt 6.1.1).

Ved en spesifikk utførelsesform er det tilveiebrakt en nukleinsyre som er hybridiserbar til en Atøgo-nukleinsyre under betingelser med høy stringens. Som eksempel, er metoder som anvender slike betingelser med høy stringens, som følger: For-hybirdisering av filtre inneholdende DNA utføres i fra 8 timer til over natten ved 65°C i buffer bestående av 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA og 500 ug/ml denaturert laksespermie-DNA. Filtrene hybridiseres i 48 timer ved 65°C i prehybridiseringsblanding inneholdende 100 ug/ml denaturert laksespermie-DNA og 5-20 X IO<6>cpm (tellinger pr. minutt)<32>P-merket probe. Vasking av filtrene utføres ved 37°C i 1 time i en oppløsning inneholdende 2X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll og 0,01% BSA. Dette følges av en vasking i 0,1X SSC ved 50°C i 45 minutter før autoradiografi. Andre betingelser med høy stringens som kan anvendes, er velkjente på området.

Ved en annen spesifikk utførelsesform er det tilveiebrakt en nukleinsyre som er hybridiserbar til en Afogo-nukleinsyre under betingelser med moderat stringens. Metoder hvor det anvendes slike betingelser med moderat stringens, er for eksempel, men ikke begrenset til, følgende: Filtre inneholdende DNA for-behandles i 6 timer ved 55°C i en oppløsning inneholdende 6X SSC, 5X Denharts oppløsning, 0,5% SDS og 100 ug/ml denaturert laksespermie-DNA. Hybridiseringene utføres i samme oppløsning, og det anvendes 5-20 X IO<6>cpm<32>P-merket probe. Filtrene inkuberes i hybridiseringsblanding i 18-20 timer ved 55°C og blir så vasket to ganger i 30 minutter ved 60°C i en oppløsning inneholdende IX SSC og 0,1% SDS. Filtrene «blottes» tørre og eksponeres for autoradiografi. Andre betingelser med moderat stringens som kan anvendes, er velkjente på området. Vasking av filtrene utføres ved 37°C i 1 time i en oppløsning inneholdende 2X SSC, 0,1% SDS. Slike stringensbetingelser er egnet for isolering av nukleinsyre-molekyler omfattende Afogo-gensekvenser fra en annen art, f.eks. under anvendelse av rotte- eller bovine Nogo-cDNA-kloner som probe til isolasjon av den humane Nogo-cDNA.

En rekke humane uttrykte sekvensmerkematerialer (EST'er) referert i publiserte nukleinsyresekvens-databaser viser høy grad av sekvensidentitet sammenliknet med segmenter av Afogo-gensekvensene ifølge oppfinnelsen. Følgende foreløpige liste over humane EST'er ble identifisert og er oppregnet med sine Genbank-adkomstnumre: AA158636 (SEKV ID NR:35), AA333267 (SEKV ID NR:36), AA081783 (SEKV ID NR:37), AA167765 (SEKV ID NR:38), AA322918 (SEKV ID NR:39), AA092565 (SEKV ID NR:40), AA081525 (SEKV ID NR:41) og AA081840 (SEKV ID NR:42) under anvendelse av ENTREZ Nucleotide Query. Før foreliggende oppfinnelse var ingen av de ovenfor identifiserte EST'er blittkarakterisertmed hensyn til aminosyresekvensene disse EST'er kan kode for in vivo. Intet var kjent om funksjonen av proteinene omfattende de forutsette aminosyresekvenser i humane EST'er. Videre er en EST, så som AA158636, som er rettet inn med 5'-enden av rotte-Nogo-cDNA og en annen EST, så som AA081840, som er rettet inn med 3'-enden av rotte-cDNA, ikke overlappende og ville ikke bli oppfattet som å være en del av den samme humane cDNA-sekvens.

Basert på Afogo-gensekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse antas det at disse humane EST representerer deler av det humane Nogo- gen som uttrykkes i vevet som EST-materialene ble tatt fra. EST-materialene kan uttrykkes i det samme humane vev eller i forskjellige humane vev. Nukleinsyre-molekylene kan omfatte fortrinnsvis nuklotidsekvensene fra minst to humane EST som ikke overlapper med hensyn til hverandre, eller som ikke overlapper en tredje eller flere humane EST.

Siden de ovenfor identifiserte humane EST nå er identifisert som fragmenter av det humane Nogo- gen på grunn av kloning av bovine og rotte-Afogo-nukleinsyrer, forventer man at de humane EST har liknende funksjoner i forhold til de andre Nogo- nukleinsyremolekyler ved forskjellige fremgangsmåter, så som for eksempel ekspresjon av humane Nogo-polypeptider, hybridiseringsanalyser og inhibering av Nogo-ekspresjon som antisense-nukleinsyre-molekyler, osv.

Videre er det mulig og tilveiebringe den forutsette aminosyresekvens av det humane Nogo-protein, samt fragmenter derav. Som vist på fig. 13, er aminosyresekvensen i rotte-Nogo-protein (fig. 2a; SEKV ID NR:2) rettet inn med den forutsette aminosyresekvens av humant Nogo-protein (fig. 13, SEKV ID NR:29). Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig humane Nogo-proteiner omfattende den forutsette aminosyresekvens av humant Nogo, fig. 13, og SEKV UD NR:29.

En subsekvens av den forutsette aminosyresekvens av humant Nogo, bestående av minst 6 aminosyrerester, eller én eller flere av følgende forutsette aminosyresekvenser av humane Nogo-fragmenter: MEDLDQSPLVSSS (humant Nogo, svarende til aminosyrene 1-13 med SEKV ID NR:43), KIMDLKEQPGNTISAG (humant Nogo, svarende til aminosyrene 187-203 med SEKV ID NR:44), KEDEWSSEKAKDSFNEKR (humant Nogo, svarende til aminosyrene 340-358 med SEKV ID NR:45),

QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS (humant

Nogo, svarende til aminosyrene 570-619 med SEKV ID NR:46) er også mulig.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten nukleinsyremolekyler som koder for et humant Nogo-protein med en aminosyresekvens som i det vesentlige er lik aminosyresekvensen som vist på fig. 13 (fig. 13; SEKV ID NR:29). Ved spesifikke utførelses-former er nukleinsyremolekyler som koder for fragmenter av humant Nogo-protein med en aminosyresekvens som i det vesentlige er lik aminosyresekvensen som vist på fig. 13 (SEKV UD NR:29) også påtenkt, med det forbehold at slike nukleinsyremolekyler ikke omfatter nukleotidsekvensen i de ovenfor identifiserte humane EST.

En aminosyresekvens regnes for å være hovedsakelig lik den forutsette aminosyresekvens i humant Nogo-protein når mer enn 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 97% av aminosyrerestene i de to molekyler er identiske når det anvendes en datamaskin-algoritme hvor innrettingen utføres ved hjelp av et datamaskin-homologiprogram kjent på området, for eksempel en BLAST-datamaskinsøking (Altschul et al, 1994, Nature Genet. 6:119-129).

Som eksempel, innbefatter egnede datamaskin-homologi-programmer følgende: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschyl et al., 1990, J. of Molec. Biol, 215:403-410, «The BLAST Algorithm; Altschul et al, 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402), en heuristisk søkealgoritme tilpasset til søking etter sekvenslikhet som tilskriver signifikans ved anvendelse av de statistiske metoder ifølge Karlin og Altschul 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:2264-68; 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:5873-77. Fem spesifikke BLAST-programmer utfører følgende oppgaver: 1) BLASTP-programmet sammenlikner en aminosyre-undersøkelses-(«query»)-sekvens med en proteinsekvens-database. 2) BLASTN-programmet sammenlikner en nukleotidundersøkelsessekvens med en nukleinsyre-database. 3) BLASTX-programmet sammenlikner de konseptuelle seksramme-translasjons-produkter i en nukleotid-undersøkelsessekvens (begge strenger) med en proteinsekvens-database. 4) TBLASTN-programmet sammenlikner en proteinundersøkelsessekvens med en nukleotidsekvens-database translatert i alle seks leserammer (begge strenger). 5) TBLASTX-programmet sammenlikner seksramme-translasjonene av en nukleotid-undersøkelsessekvens med seksramme-translasjonene av en nukleotidsekvens-database.

Som fagfolk på området vil forstå, er TBLASTN-programmet spesielt nyttig til identifisering av nukleinsyrer med en ønsket identitetsprosent, og BLASTP-programmet er spesielt nyttig til identifisering av aminosyresekvenser med en ønsket identitetsprosent.

Smith-Waterman (database: European Bioinformatics Institute wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/)

(Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197) er en matematisk rigorøs algoritme for sekvensinnrettinger.

FASTA (se Pearson et al, 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:2444-2448) er en heuristisk tilnærming til Smith-Waterman-algoritmen. For en generell omtale av metoden og fordelene med BLAST-, Smith-Waterman- og FASTA-algoritmer, se Nicholas et al, 1998, «A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods» (www.psc.edu) og referanser angitt deri.

Anvendelsene av de forutsette aminosyresekvenser av humant Nogo, eller nukleotidsekvensene av humane EST, innbefattende degenererte sekvenser som koder for den forutsette aminosyresekvens av humant Nogo, for isolering eller identifisering av det humane Nogo- gen, fragmenter, naturlig forekommende mutanter og varianter derav, er innenfor oppfinnelsens ramme. Slike anvendelser, som vil være kjent for en fagperson på området, innbefatter, men er ikke begrenset til, anvendelse av informasjonen til fremstilling av nukleinsyreprober for DNA-bibliotek-screening, DNA-amplifikasjon, genetisk screening av den humane populasjon, samt til fremstilling av syntetiske peptider for fremstilling av antistoffer. Detaljert beskrivelse av en del slike anvendelser er tilveiebrakt i det foreliggende i senere avsnitt.

Nukleinsyrer som koder for derivater og analoger til Nogo-proteiner, samt Nogo-antisense-nukleinsyrer, kan dessuten tilveiebringes. Som man lett vil se, skal en «nukleinsyre som koder for et fragment eller en del av et Nogo-protein» forstås å angi en nukleinsyre som koder for bare det angitte fragment eller delen av Nogo-proteinet, og ikke de andre tilgrensende deler av Nogo-proteinet som en kontinuerlig sekvens. I denne sammenheng angir en del én eller flere aminosyrer.

Fragmenter av A^gø-nukleinsyrer omfattende områder konservert mellom (med homologi til) andre Afogo-nukleinsyrer, fra samme art eller andre arter, er også tilveiebrakt. Nukleinsyrer som koder for ett eller flere Nogo-doméner, er tilveiebrakt på fig. 2a, for eksempel det konserverte karboksyterminale doméne av rotte-Nogo, som har ca. 180 aminosyrer, og kodes for av de siste 540 nukleotider i kodingssekvensen før stoppkodonet. Nukleotid- og aminosyresekvensene for to hydrofobe doméner i det konserverte karboksyterminale doméne, dvs. fra aminosyre 988 til 1023, og fra aminosyre 1090 til 1125, i rotte-Nogo A, er også tilveiebrakt. Nukleotid- og aminosyresekvensene i det aminoterminale sure doméne av rotte-Nogo A, fra rest 31 til 58, er også tilveiebrakt.

For utførelse av funksjonsanalyser for forskjellige områder av Nogo er en serie delesjoner i Nogo- genet blitt frembrakt og klonet i en ekspresjonsvektor ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker, og uttrykt som et fusjonsprotein. Nukleinsyrer som koder for et fragment av et Nogo-protein, er tilveiebrakt, f.eks. nukleinsyrer som koder for aminosyrerestene 1-171,172-974,259-542, 542-722,172-259,722-974 eller 975-1162 av SEK ID NR:2, eller kombinasjoner derav; og nukleinsyrer som koder for aminosyrerestene 1-131,132-939, 206-501, 501-680,132-206, 680-939 og 940-1127 fra SEKV ID NR:29, eller kombinasjoner derav. En del av delesjonskonstruksjonene omfatter avkuttede deler av Nogo og ytterligere nukleotidsekvenser som koder for et heksahistidin-merkemateriale og/eller et T7-merkemateriale. Nukleinsyrer som koder for avkuttede Nogo-proteiner som mangler aminosyrerestene 172-259, aminosyrerestene 974-1162 eller aminosyrerestene 172-259 og 974-1162 fra SEKV ID NR:2, men som ellers omfatter resten av SEKV ID NR:2; eller aminosyrerestene 132-206, aminosyrerestene 939-1127 eller aminosyrerestene 132-206 og 939-1127 fra SEKV ID NR:29, men ellers omfatter resten av SEKV ID NR:29, er tilveiebrakt. Strukturen av delesjons-konstruksjonseksempler er vist på fig. 18. Delesjonskonstruksjonene danner fragmenter eller avkuttet (avkuttede) del(er) av Nogo når de innføres i en celle. De biologiske aktiviteter av disse mutanter ble testet i forskjellige funksjonsanalyser som beskrevet i tabell 2 i avsnitt 6.2.7.

Spesifikke utførelsesformer for kloning av et Nogo- gen, presentert som et spesielt eksempel, følger: For ekspresjonskloning (en teknikk som er vanlig kjent på området) konstrueres et ekspresjonsbibliotek ved hjelp av metoder kjent på området. For eksempel isoleres mRNA (f.eks. human), og cDNA lages og ligeres i en ekspresjonsvektor (f.eks. et bakteriofag-derivat) slik at den kan uttrykkes av vertscellen som den da innføres i. Det kan anvendes forskjellige screeninganalyser til selektering med hensyn til det uttrykte Nogo-produkt. Ved én utførelsesform kan anti-Nogo-antistoffer anvendes for seleksjon.

Ved en annen utførelsesform anvendes polymerasekjedereaksjon (PCR) til amplifikasjon av den ønskede sekvens i et genom- eller cDNA-bibliotek, før seleksjon. Oligonukleotid-primere som representerer kjente Afogo-sekvenser, kan anvendes som primere ved PCR. Ved et foretrukket aspekt representerer oligonukleotid-primerne minst en del av de konserverte Nogo-segmenter med sterk homologi mellom Nogo fra forskjellige arter. De syntetiske oligonukleotider kan anvendes som primere for amplifikasjon med PCR-sekvenser fra en kilde (RNA eller DNA), fortrinnsvis et cDNA-bibliotek, av potensiell interesse. PCR kan f.eks. utføres ved anvendelse av et termisk Perkin-Elmer Cetus-sykliseringsapparat og Taq-polymerase (Gene Amp™). DNA som forøkes, kan innbefatte mRNA eller cDNA eller genom-DNA fra hvilken som helst eukaryot art. Man kan velg å syntetisere flere forskjellige degenererte primere, for anvendelse ved PCR-reaksjonene. Det er også mulig å variere stringensen ved hybridiseringsbetingelsene som anvendes ved priming i PCR-reaksjonene, for å muliggjøre større eller mindre grader av nukleotidsekvens-liknet mellom den kjente Afogo-nukleotidsekvens og nukleinsyre-homologen som isoleres. For kryssart-hybridisering er lavstringensbetingelser foretrukket. For hybridisering av samme art er moderat stringente betingelser foretrukket.

Etter vellykket amplifikasjon av et segment av en Afogø-homolog, kan segmentet klones og sekvenseres molekylært og anvendes som probe for isolering av en komplett cDNA-eller genom-klon. Dette vil i sin tur muliggjøre bestemmelse av genets komplette nukleotidsekvens, analysering av ekspresjonen av det, samt fremstilling av dets proteinprodukt for funksjonsanalyse, som beskrevet nedenfor. På denne måte kan ytterligere gener som koder for Nogo-proteiner og Nogo-analoger, identifiseres.

Ovennevnte fremgangsmåter er ikke ment å begrense følgende generelle beskrivelse av fremgangsmåter ved hvilke man kan få kloner av Nogo.

En hver eukaryot celle kan potensielt tjene som nukleinsyrekilde for molekylær kloning av Afogø-genet. Nukleinsyresekvensene som koder for Nogo, kan isoleres fra virveldyr-, pattedyr-, menneske-, porcin-, muse-, bovine, katte-, fugle-, heste-, hunde- samt ytterligere primatkilder, insekter osv. DNA kan fås ved hjelp av standardmetoder kjent på området, ut fra klonet DNA (f.eks. et DNA-«bibliotek»), ved kjemisk syntese, ved cDNA-kloning eller ved kloning av genom-DNA eller fragmenter derav, renset fra den ønskede celle. (Se for eksempel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; D.M. Glover (red.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). Kloner som stammer fra genom-DNA, kan inneholde regulator- og intron-DNA-områder i tillegg til kodingsområder; kloner som stammer far cDNA, vil inneholde bare eksonsekvenser. Uansett kilde, bør genet klones molekylært i en egnet vektor for formering av genet.

Ved molekylær kloning av genet fra genom-DNA dannes DNA-fragmenter, hvorav noen vil kode for det ønskede gen. DNA kan spaltes på spesifikke steder under anvendelse av forskjellige restriksjonsenzymer. Alternativt kan man anvende DNAse i nærvær av mangan til fragmentering av DNA, eller DNA kan utsettes for fysisk skjærkraft, så som f.eks. sonikering. De lineære DNA-fragmenter kan så separeres i henhold til størrelse ved hjelp av standardteknikker, innbefattende, men ikke begrenset til, agarose- og polyakrylamidgel-elektroforese og kolonnekromatografi.

Når DNA-fragmentene er dannet, kan identifisering av det spesifikke DNA-fragment inneholdende det ønskede gen utføres på en rekke måter. Hvis for eksempel en del av et Nogo- gen (av hvilken som helst art) eller dets spesifikke RNA, eller et fragment derav (se avsnitt 6.6.1) er tilgjengelig og kan renses og merkes, kan de dannede DNA- fragmenter screening-undersøkes ved hjelp av nukleinsyrehybridisering til den merkede probe (W. Benton og R. Davis, 1977, Science 196:180; M. Grunstein og D. Hogness, 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72:3961). DNA-fragmentene med hovedsakelig homologi til proben vil hybridisere. Det er også mulig å identifisere det hensiktsmessige fragment ved hjelp av restriksjonsenzym-nedbrytning(er) og sammenlikning av fragmentstørrelsene med dem som ventes i henhold til et kjent restriksjonskart, hvis dette er tilgjengelig. Ytterligere seleksjon kan utføres på basis av genets egenskaper.

Tilstedeværelse av genet kan alternativt påvises ved hjelp av analyser basert på de fysiske, kjemiske eller immunologiske egenskaper hos dets uttrykte produkt. For eksempel kan det selekteres cDNA-kloner eller DNA-kloner som hybrid-selekterer de passende mRNA, og som danner et protein som f.eks. har liknende eller identisk elektroforetisk vandring, oppførsel ved isoelektrisk fokusering, proteolytiske nedbrytningskart, post-translasjonelle modifikasjoner, sure eller basiske egenskaper eller antigene egenskaper som kjent for Nogo. Antistoffer mot Nogo er tilgjengelige, så som IN-1 og IN-2 (US-patent nr. 5 684 133), AS Bruna og AS 472. Fremstilling av AS Bruna og AS 472 er beskrevet under avsnitt 6.1.7. Nogo-proteinet kan identifiseres ved binding av merket antistoff til de antatt Nogo-syntetiserende kloner, ved en ELISA (enzymbundet immunsorpsjonsmiddel-analyse)-metodetype eller ved Western-blotting av rensede eller hele celle-ekstrakter.

Afogo-genet kan også identifiseres ved mRNA-seleksjon ved nukleinsyrehybridisering fulgt av in vitro-translasjon. Ved denne metode anvendes fragmenter til å isolere komplementære mRNA ved hybridisering. Slike DNA-fragmenter kan representere tilgjengelig, renset Afogø-DNA fra en annen art (f.eks. fra mus, mennesker). Immunutfellings-analyse eller funksjonsanalyser (f.eks. aggregeringsevne in vitro; binding til reseptor; se nedenfor) av in vitro-translasjonsproduktene av de isolerte produkter av de isolerte mRNA identifiserer mRNA og derfor de komplementære DNA-fragmenter som inneholder de ønskede sekvenser. Dessuten kan spesifikke mRNA selekteres ved adsorpsjon av polysomer isolert fra celler til immobiliserte antistoffer som er spesifikt rettet mot Nogo-protein. En radiomerket Afogø-cDNA kan syntetiseres under anvendelse av den valgte mRNA (fra de adsorberte polysomer) som templat. Den radiomerkede mRNA eller cDNA kan så anvendes som probe til identifisering av Nogo-DNA-fragmentene blant andre genom-DNA-fragmenter.

Alternativer til isolering av Afogø-genom-DNA innbefatter, men er ikke begrenset til, kjemisk syntetisering av selve gensekvensen fra en kjent sekvens, eller å gjøre cDNA til mRNA som koder for Nogo-proteinet. For eksempel kan RNA for cDNA-kloning av Nogo- genet isoleres fra celler som uttrykker Nogo. Andre fremgangsmåter er mulige og innenfor oppfinnelsens ramme.

Det identifiserte og isolerte gen kan så innføres i en hensiktsmessig kloningsvektor. Et stort antall vektor-vert-systemer kjent på området kan anvendes. Mulige vektorer innbefatter, men er ikke begrenset til, plasmider eller modifiserte virus, men vektorsystemet må være forenlig med den anvendte vertscelle. Slike vektorer innbefatter, men er ikke begrenset til, bakteriofager så som lambda-derivater, eller plasmider så som pBR322, eller pUC-plasmid-derivater eller Bluescript-vektoren (Stratagene). I et spesifikt eksempel klones Nogo i pcDNA3 med epitop-merkematerialer for forenklet proteinekspresjonsanalyse (avsnitt 6.1.10).

Innføringen i en kloningsvektor kan for eksempel utføres ved ligering av DNA-fragmentet i en kloningsvektor som har komplementære kohesive ender. Hvis imidlertid de komplementære restriksjonsseter som anvendes til fragmentering av DNA, ikke er tilstede i kloningsvektoren, kan endene av DNA-molekylene modifiseres enzymatisk. Alternativt kan hvilket som helst ønsket sete dannes ved ligering av nukleotidsekvenser (linkere) på de DNA-terminale ender; disse ligerte linkere kan omfatte spesifikke kjemisk syntetiserte oligonukleotider som koder for restriksjonsendonuklease-gjenkjennelses-sekvenser. Ved en alternativ metode kan den spaltede vektor og Nogo-genet modifiseres ved homopolymer haledannelse («tailing»). Rekombinante molekyler kan innføres i vertsceller via transformasjon, transfeksjon, infeksjon, elektroporering osv. slik at mange kopier av gensekvensen dannes.

Ved en alternativ metode kan det ønskede gen identifiseres og isoleres etter innføring i en egnet kloningsvektor ved en «shot gun»-fremgangsmåte. Anriking av det ønskede gen, for eksempel ved størrelsesfraksjonering kan utføres før innføring i kloningsvektoren.

Ved spesifikke utførelsesformer muliggjør transformasjon av vertsceller med rekombinante DNA-molekyler som innlemmer det isolerte Nogo- gen, cDNA eller syntetisert DNA-sekvens, dannelse av multiple kopier av genet. Således kan genet fås i store mengder ved dyrking av transformanter, isolasjon av de rekombinante DNA-molekyler fra transformantene og, når nødvendig, gjenvinning av det innførte gen fra den isolerte rekombinante DNA.

Nogo-sekvensene som tilveiebringes ved foreliggende oppfinnelse, innbefatter de nukleotid-sekvenser som koder for hovedsakelig samme aminosyresekvenser som de som finnes i naturlige Nogo-proteiner, og kodede aminosyresekvenser med funksjonelt ekvivalente aminosyrer, samt slike som koder for andre Nogo-derivater eller -analoger, som beskrevet i avsnittene 6.2.1 og 6.2.2 nedenfor for Nogo-derivater og -analoger.

5.2 EKSPRESJON AV iVOGO- GENENE

Nukleotidsekvensen som koder for et Nogo-protein eller en funksjonelt aktiv analog eller andre derivater derav (se fig. lb og 2a; avsnittene 6.2.1 og 6.2.2), kan innføres i en passende ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementer for transkripsjon og translasjon av den innførte proteinkodende sekvens. De nødvendige transkripsjons- og translasjonssignaler kan også tilføres ved det naturlige Nogo- gen og/eller dets flankerende områder. Den kodende sekvens kan også merkes med en sekvens som koder for et grundig beskrevet antigen eller biologisk molekyl som har kjente bindingsegenskaper til en bindingspartner (f.eks. myc-epitop-merkemateriale, histidin-merkemateriale, T7-epitop-merkesmateriale osv.; se avsnitt 6.2.6 og fig. Ha-lle). Denne ytterligere sekvens kan så utforskes for rensing av Nogo-proteinet, - proteinfragmentet eller -derivatet under anvendelse av vekselvirkningen mellom den bindende gruppe og dens tilsvarende partner, som er festet til en fast matriks.

Det kan anvendes mange forskjellige verts-vektor-systemer for ekspresjon av den proteinkodende sekvens. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, pattedyrcellesystemer infisert med virus (f.eks.vaccinia-virus, adenovirus osv.); insektcellesystemer infisert med virus (f.eks. baculovirus); mikroorganismer så som gjærceller inneholdende gjærvektorer, eller bakterier transformert med bakteriofag, DNA, plasmid-DNA eller cosmid-DNA. Ekspresjonselementene i vektorer varierer når det gjelder styrke og spesifisitet. Avhengig av det anvendte vert-vektor-system kan hvilket som helst av en rekke egnede transkripsjons- og translasjonselementer anvendes. Ved spesifikke utførelsesformer uttrykkes det humane Nogo- gen, eller en sekvens som koder for en funksjonelt aktiv del av humant Nogo; som et spesifikt eksempel uttrykkes enten Nogo A, Nogo B eller Nogo C (fig. lb). Ved enda en annen utførelsesform uttrykkes et fragment av Nogo omfattende et doméne av Nogo-proteinet.

Anvendt i det foreliggende er en celle «transformert» med en nukleinsyre når en slik celle inneholder en nukleinsyre som ikke er naturlig tilstede i cellen, etter innføring av nukleinsyren i cellen eller dens stamcelle, f.eks. ved transfeksjon, elektroporering, transduksjon osv.

Nukleotidsekvenser som koder for fragmenter av humant Nogo A, omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrerestene 1-131, 132-939, 206-501, 501-680,132-206, 680-939 og 940-1127 fra SEKV ID NR:29, er også tilveiebrakt. Nukleotidsekvenser som koder for avkuttede deler av humant Nogo A, er også tilveiebrakt; de avkuttede proteiner mangler aminosyrerestene 132-206, aminosyrerestene 939-1127 eller aminosyrerestene 132-206 og 939-1127, av SEKV ID NR:29, men omfatter ellers resten av SEKV ID NR:29.

Hvilken som helst av metodene beskrevet tidligere for innføring av DNA-fragmenter i en vektor kan anvendes for konstruksjon av ekspresjonsvektorer inneholdende et kimærisk gen bestående av passende transkripsjons/translasjonsreguleringssignaler og de protein-kodende sekvenser. Disse metoder kan innbefatte in vitro-DNA-rekombinasjons- og synteseteknikker og in vivo-rekombinante systemer (genetisk rekombinasjon). Ekspresjon av nukleinsyresekvens som koder for et Nogo-protein eller

-peptidfragment, kan reguleres ved hjelp av en andre nukleinsyresekvens slik at Nogo-proteinet eller -peptidet uttrykkes i en vert som er transformert med det rekombinante DNA-molekyl. For eksempel kan ekspresjon av et Nogo-protein reguleres ved hjelp av hvilket som helst promoter/-forøkningselement kjent på området. Et eksempel på en utførelsesform er å anvende én av Nogos naturlige promoterer, enten Pl eller P2, omtalt i avsnitt 6.2.1. Det kan også anvendes en ikke-naturlig promoter. Promoterer som kan anvendes til regulering av Afogo-ekspresjon, innbefatter, men er ikke begrenset til, SV40-tidligpromoterområdet (Bernoist og Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promoteren som finnes i 3'-langterminal-repeteringen av Rous-sarkomvirus (Yamamoto et al, 1980, Cell 22:787-797), herpes-thymidinkinasepromoteren (Wagner et al, 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:1441-1445), regulatorsekvensene i metalltionein-genet (Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42); prokaryote ekspresjonsvektorer så som P-laktamasepromoteren (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:3727-3731) eller tøc-promoteren (DeBoer et al, 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:21-25); se også «Useful proteins from recombinant bacteria» i Scientific American, 1980, 242:74-94; planteekspresjons-vektorer omfattende nopalinsyntetasepromoterområdet (Herrera-Estrelle et al, Nature 303:209-213) eller blomkål-mosaikkvirus-35S RNA-promoteren (Gardner et al, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) og promoteren for det fotosyntetiske enzym ribulosebifosfat-karboksylase (Herrera-Estrella et al, 1984, Nature 310:115-120); promoterelementer fra gjærsopp eller annen sopp så som Gal 4-promoteren, ADC-(alkoholdehydrogenase)-promoteren, PGK-(fosfoglycerolkinase)-promoter, alkalisk fosfatase-promoter og følgende animalske transkripsjonsregulerings-

områder, som oppviser vevsspesifisitet og er blitt anvendt i transgene dyr: elastase I-genreguleringsområde som er aktivt i acinære pankreasceller (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); insulin-genreguleringsområde som er aktivt i pankreas-betaceller (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), immunglobulin-genreguleringsområde som er aktivt i lymfoide celler (Grosschedl et al, 1984, Cell 38:647-658; Adames et al, 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al, 1987, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444), muse-brysttumorvirus-reguleringsområde som er aktivt i testikkel-, bryst-, lymfoide og mastceller (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), albumin-genreguleringsområde som er aktivt i lever (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), alfa-føtoprotein-genreguleringsområde som er aktivt i lever (Krumlauf et al, 1985, Mol. Cell Biol. 5:1639-1648; Hammer et al, 1987, Science 235:53-58; alfa-1-antitrypsin-genreguleringsområde som er aktivt i leveren (Kelsey et al, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), beta-globin-genreguleringsområde som er aktivt i myeloide celler (Mogram et al, 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al, 1986, Cell 46:89-94; myelinbasisprotein-genreguleringsområde som er aktivt i oligodendrocyttceller i hjernen (Readhead et al, 1987, Cell 48:703-712); myosm-lettkjeme-2-genregulermgsornråde som er aktivt i skjelettmuskel (Sani, 1985, Nature 314:283-286) og genreguleringsområde for gonadotropinfrigjørende hormon, som er aktivt i hypotalamus (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Ved en spesifikk utførelsesform anvendes en vektor som omfatter en promoter som er operabelt knyttet til en Nogo-kodende nukleinsyre, ett eller flere replikasjonsorigo og eventuelt én eller flere selekterbare markører (f.eks. et antibiotikaresistens-gen).

Ved en spesifikk utførelsesform lages en ekspresjonskonstruksjon ved subkloning av en Afogo-kodingssekvens i ÆcøRI-restirksjonssetet på hver av de tre pGEX-vektorer (Glutation S-transferase-ekspresjonsvektorer; Smith og Johnson, 1988, Gene 7:31-40). Dette muliggjør ekspresjon av Nogo-proteinproduktet fra subklonen i den riktige leseramme.

Ekspresjonsvektorer inneholdende Afogo-geninnskudd kan identifiseres ved tre generelle fremgangsmåter: (a) nukleinsyrehybridisering, (b) tilstedeværelse eller fravær av «markøD>-genfunksjoner, og (c) ekspresjon av innførte sekvenser. Ved den første fremgangsmåte kan tilstedeværelse av et Nogo- gen innført i en ekspresjonsvektor påvises ved nukleinsyrehybridisering ved anvendelse av prober omfattende sekvenser som er homologe til et innført Nogo- gen. Ved den andre fremgangsmåte kan det rekombinante vektor/vert-system identifiseres og selekteres basert på tilstedeværelse eller fravær av visse <<markør>>-genfunksjoner (f.eks.thymidinkinase-aktivitet, resistens overfor antibiotika, tranformasjons-fenotype, okklusjonslegeme-dannelse i baculovirus osv.) forårsaket av innføringen av et Nogo- gen i vektoren. Hvis for eksempel Nogo-genet innføres i markørgensekvensen i vektoren, kan rekombinante systemer inneholdende Afogo-innskuddet identifiseres ved fravær av markørgenfunksjonen. Ved den tredje fremgangsmåte kan rekombinante ekspresjonsvektorer identifiseres ved analysering av Nogo-produktet som er uttrykt ved det rekombinante system. Slike analyser kan for eksempel baseres på de fysiske eller funksjonelle egenskaper hos Nogo-proteinet i in vitro-analysesystemer, f.eks. binding med anti-Nogo-antistoff.

Når et spesielt rekombinant DNA-molekyl er identifisert og isolert, kan det anvendes flere metoder kjent på området til formering av det. Når et egnet vertssystem og vekstbetingelser er opprettet, kan rekombinante ekspresjonsvektorer formeres og fremstilles i mengder. Som tidligere forklart, innbefatter ekspresjonsvektorene som kan anvendes, følgende vektorer eller deres derivater, men er ikke begreset til disse: humane eller animalske virus så som vacciniavirus eller adenovirus; insektvirus så som baculovirus; gjærsoppvektorer; bakteriofag-vektorer (f.eks. lambda) og plasmid- og cosmid-DNA-vektorer, bare for å nevne noen få.

I tillegg kan det velges en en vertscellestamme som modulerer ekspresjonen av de innførte sekvenser, eller modifiserer og bearbeider genproduktet på den spesifikke måte som ønskes. Ekspresjon fra visse promoterer kan forøkes, i nærvær av visse induktorer; således kan ekspresjon av det genetisk konstruerte Nogo-protein reguleres. Videre har forskjelige vertsceller egenskaper og spesifikke mekanismer for translasjonen og post-translasjonell prosessering og modifisering (f.eks.glykosylering, fosforylering av proteiner). Det kan velges passende cellelinjer eller vertssystemer for å sikre den ønskede modifisering og prosessering av det uttrykte fremmede protein. For eksempel kan ekspresjon i et bakteriesystem anvendes til fremstilling av et ikke-glykosylert kjerneproteinprodukt. Ekspresjon i gjærsopp vil gi et glykosylert produkt. Ekspresjon i pattedyrceller kan anvendes for å sikre «naturlig» glykosylering av et heterologt protein. Videre kan forskjellige vektor/vert-ekspresjonssystemer bevirke prosesseringsreaksjoner i forskjellige omfang.

Ved andre spesifikke utførelsesformer kan Nogo-proteinet, -analogen eller

-derivatet uttrykkes som et fusjons- eller kimærisk proteinprodukt (omfattende proteinet, fragmentet, analogen eller derivatet sammenknyttet via en peptidbinding til en heterolog

proteinsekvens (av et annet protein)). Et slikt kimærisk produkt kan lages ved ligering av de passende nukleinsyresekvenser som koder for de ønskede aminosyresekvenser, til hverandre ved hjelp av metoder kjent på området, i den passende kodingsramme, og ekspresjon av det kimæriske produkt ved hjelp av metoder som er alminnelig kjent på området. Alternativt kan et slikt kimærisk produkt lages ved hjelp av proteinsynteseteknikker, f.eks. ved anvendelse av et peptidsyntetiseringsapparat.

Både cDNA og genom-sekvenser kan klones og uttrykkes.

5.3 IDENTIFISERING OG RENSING AV iVOGO- GENPRODUKTENE

Ved spesielle aspekter tilveiebringer oppfinnelsen aminosyresekvenser av Nogo, fortrinnsvis humant Nogo, og fragmenter og derivater derav som omfatter en antigen determinant (dvs. som kan gjenkjennes av et antistoff) eller som på annen måte er funksjonelt aktive, samt nukleinsyresekvenser som koder for disse. «Funksjonelt aktivt» Nogo-materiale anvendt i det foreliggende angir et slikt materiale som oppviser én eller flere kjente funksjonelle aktiviteter forbundet med et Nogo A-protein i hel lengde (villtype), f.eks. ikke-tillatelige substrategenskaper, dorsalrotganglie-vekstkonus-sammenbrudd, inhibering av NIH 3T3-utbredelse, inhibering av neurittutvekst, binding til et Nogo-substrat eller en Nogo-bindingspartner, antigenisitet (binding til et anti-Nogo-antistoff), immunogenitet osv.

Det er mulig å tilveiebringe fragmenter av et Nogo-protein bestående av minst 6 aminosyrer, 10 aminosyrer, 17 aminosyrer, 50 aminosyrer, 100 aminosyrer eller minst 220 aminosyrer. Ved noen utførelsesformer omfatter proteinene, eller består i det vesentlige av, det sterkt konserverte karboksyterminale Nogo-doméne (karboksyterminale 188 aminosyrer i Nogo A). Fragmenter, eller proteiner omfattende fragmenter, som mangler det konserverte karboksyterminale doméne, eller de hydrofobe karboksyterminale perioder, eller det aminoterminale sure doméne, eller det aminoterminale poly-prolinområde eller hvilken som helst kombinasjon derav, av et Nogo-protein, er også mulig. Nukleinsyrer som koder for forannevnte, er tilveiebrakt.

Når et rekombinant system som uttrykker Aføgø-gensekvensen, er identifisert, kan genproduktet analyseres. Dette oppnås ved analyser basert på de fysiske eller funksjonelle egenskaper hos produktet, innbefattende radioaktiv merking av produktet fulgt av analyse ved hjelp av gel-elektroforese, immunanalyse osv.

Når Nogo-proteinet er identifisert, kan det isoleres og renses ved hjelp av standardmetoder innbefattende kromatografi (f.eks. ionebytter-, affinitets- og størrelses-sorterings-kolonnekromatografi), sentrifugering, differensial-løselighet eller ved hjelp av hvilken som helst annen standardteknikk for rensing av proteiner. De funksjonelle egenskaper kan vurderes ved anvendelse av hvilken som helst egnet analyse innbefattende dorsalrotganglie-vekstkonussammenbrudd, inhibering av NIH 3T3-utbredelse, inhibering av neuritt-regenerering i synsnerver (se avsnittene 6.2.4-6.2.5).

Når et Nogo-protein som er dannet av et rekombinant system, er identifisert, kan alternativt proteinets aminosyresekvens utledes fra nukleotidsekvensen hos det kimæriske gen som finnes i det rekombinante system. Som resultat av dette kan proteinet syntetiseres ved hjelp av kjemiske standardmetoder kjent på området (se f.eks.M. Hunkapiller et al, 1984, Nature 310:105-111).

Naturlig Nogo C kan renses fra naturlige kilder, ved hjelp av standardmetoder så som dem som er beskrevet ovenfor (f.eks. immun-affinitetsrensing).

Nogo-proteiner (enten de er fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker eller ved hjelp av kjemiske syntesemetoder eller ved rensing av naturlige proteiner), kan også omfatte slike som som primær aminosyresekvens inneholder hele eller en del av aminosyresekvensen i det vesentlige som angitt på fig. 2a (SEKV ID NR:2), bovint på fig. 12 (SEKV ID NR:24) eller humant på fig. 13 (SEKV ID NR:29), samt fragmenter og andre derivater (så som, men ikke begrenset til, dem som er angitt på fig. 18) og analoger til disse, innbefattende proteiner som er homologe til disse. Nogo-proteinene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis fri for alt CNS-myelinmateriale som de normalt er bundet til.

5.4 STRUKTUR AV iVOGO- GENET OG - PROTEINET

Strukturen av Afogo-genet og -proteinet kan analyseres ved hjelp av forskjellige metoder kjent på området, og flere av disse metoder er beskrevet i følgende underavsnitt.

5.4.1 GENETISK ANALYSE

Den klonede DNA eller cDNA svarende til Afogø-genet kan analyseres ved hjelp av metoder innbefattende, men ikke begrenset til, Southern-hybridisering (E.M. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), Northern-hybridisering (se f.eks. Freeman et al, 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:4094-4098), restriksjonsendonuklease-kartlegging (T. Maniatis, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New

York) og DNA-sekvensanalyse. Polymerasekjedereaksjon (PCR; US-patenter nr.

4 683 202,4 683 195 og 4 889 818; Gyllenstein et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:7652-7656; Ochman et al, 1988, 1988, Genetics 120:621-623; Loh et al, 1989, Science 243:217-220), fulgt av Southern-hybridisering med en Afogø-spesifikk probe, kan muliggjøre påvisning av Afogo-genet i DNA fra forskjellige celletyper. Andre amplifikasjonsmetoder enn PCR er alminnelig kjente og kan også anvendes. Ved én utførelsesform kan Southern-hybridisering anvendes til bestemmelse av den genetiske kopling i Nogo. Northern-hybridiseringsanalyse kan anvendes til bestemmelse av ekspresjonen av Aføgo-genet. Forskjellige celletyper i forskjellige utviklingsstadier eller -aktivitet kan testes med hensyn til Afogo-ekspresjon. Hybridiseringsbetingelsenes stringens både for Southern- og Northern-hybridisering kan manipuleres for å sikre påvisning av nukleinsyrer med den ønskede grad av tilknytning til den spesifikke Nogo-probe som anvendes. Modifikasjoner av disse metoder og andre metoder som er alminnelig kjent på området, kan anvendes.

Restriksjonsendonuklease-kartlegging kan anvendes til omtrentlig bestemmelse av Afogo-genets genetiske struktur. Restriksjonskart som fås ved restriksjonsendonuklease-spalting, kan bekreftes ved DNA-sekvensanalyse.

DNA-sekvensanalyse kan utføres ved hjelp av hvilke som helst teknikker kjent på området, innbefattende, men ikke begrenset til, metoden ifølge Maxam og Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), Sanger-dideoksymetoden (F. Sanger et al, 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463), anvendelse av T7 DNA-polymerase (US-patent nr. 4 795 699) eller anvendelse av et automatisk DNA-sekvenseringsapparat (f.eks. Applied Biosystems, Foster City, CA).

5.4.2 PROTEIN ANALYSE

Aminosyresekvensen i Nogo-proteinet kan fås ved utleding fra DNA-sekvensen, eller alternativt ved direkte sekvensering av proteinet, f.eks. med et automatisk aminosyre-sekvenseringsapparat.

Nogo-proteinsekvensen kan ytterligere karakteriseres ved hjelp av en hydrofilisitets-analyse (T. Hopp og K. Woods, 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:3824). En hydrofilitetsprofil kan anvendes til identifisering av de hydrofobe og hydrofile områder av Nogo-proteinet og de tilsvarende områder av gensekvensen som koder for slike områder.

For det annet kan det også utføres strukturanalyse (P. Chou og G. Fasman, 1974, Biochemistry 13:222) for identifisering av områder av Nogo som antar spesifikke sekundære strukturer.

Manipulering, translasjon og sekundærstruktur-forutsigelse, forutsigelse og avsetting av åpen leseramme samt bestemmelse av sekvenshomologier kan også utføres under anvendelse av datamaskinprogrammer som er tilgjengelige på området.

Andre metoder for strukturanalyse kan også anvendes. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, røntgenkrystallografi (A. Engstrøm, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) og datamaskinmodellering (R. Fletterick og M. Zoller (red.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, i Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

5.5 DANNELSE AV ANTISTOFFER MOT NOGO-PROTEINER OG DERIVATER DERAV

Nogo-proteinet, dets fragmenter eller andre derivater, eller analoger til disse, kan anvendes som immunogen for frembringlse av antistoffer som immunspesifikt binder et slikt immunogen. Slike antistoffer innbefatter, men er ikke begrenset til, polyklonale, monoklonale, kimæriske, enkeltkjedede, Fab-fragmenter og et Fab-ekspresjonsbibliotek. Antistoffer rettet mot et rekombinant fragment av rotte- og bovint Nogo, fremstilles (avsnitt 6.1.7), og disse antistoffer kryssreagerer også med andre arts-epitoper. Fragmenter av et Nogo-protein identifisert som hydrofilt, kan anvendes som immunogener for antistoff-fremstilling.

Forskjellige metoder kjent på området kan anvendes for fremstilling av polyklonale antistoffer mot et Nogo-protein eller -derivat eller -analog. Det kan oppnås polyklonale kanin-antistoffer mot en epitop på et Nogo-protein som kodes for ved en sekvens ifølge SEKV ID NR:2 på fig. 2a, SEKV ID NR:24 på fig. 12, SEKV ID NR:32 på fig. 14 eller SEKV ID NR:29 på fig. 13, (henholdsvis rotte-Nogo A, bovint Nogo, rotte-Nogo C eller humant Nogo) eller en subsekvens derav. For fremstilling av antistoff kan forskjellige vertsdyr immuniseres ved injeksjon med det naturlige Nogo-protein eller en syntetisk versjon eller et derivat (f.eks. fragment) derav, innbefattende, men ikke begrenset til, kaniner, mus, rotter osv. Forskjellige adjuvanser kan anvendes til øking av den immunologiske respons, avhengig av verts-arten, og innbefatter, men er ikke begrenset til, Freunds (komplett og ikke-komplett), mineralgeler så som aluminiumhydroksid, overflateaktive substanser så som lysolecitin, pluronpolyoler, polyanioner, peptider, olj e-emulsj oner, «keyhole limpet»-hemocyaniner, dinitrofenol og potensielt nyttige humane adjuvanser så som BCG (bacille Calmette-Guerin) og corynebacterium parvum.

For fremstilling av monoklonale antistoffer rettet mot en Nogo-proteinsekvens eller analog til denne kan det anvendes hvilken som helst teknikk som gir dannelse av antistoffmolekyler med kontinuerlige cellelinjer i kultur, for eksempel hybridomteknikken opprinnelig utviklet av Kohler og Milstein (1975, Nature 256:495-497) samt triom-teknikken, teknikken med humane B-cellehybridomer (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), og EBV-hybridomteknikken for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Cole et al., 1985, i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96). Monoklonale antistoffer kan fremstilles i bakteriefrie dyr under anvendelse av senere teknologi (PCT/US90/02545). I henhold til oppfinnelsen kan humane antistoffer anvendes og fås ved anvendelse av humane hybridomer (Cote et al, 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:2026-2030) eller ved transformering av humane B-celler med EBV-virus in vitro (Cole et al, 1985, i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77-96). Det kan faktisk også anvendes teknikker utviklet for fremstilling av «kimæriske antistoffer» (Morrison et al, 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6851-6855; Neuberger et al, 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) ved spleising av genene fra et museantistoff-molekyl spesifikt for Nogo med gener fra et humant antistoffmolekyl med passende biologisk aktivitet.

Teknikker beskrevet for fremstilling av enkeltkjede-antistoffer (US-patent nr. 4 946 778) kan tilpasses for fremstilling av Nogo-spesifikke enkeltkjede-antistoffer. Teknikker beskrevet for konstruksjon av Fab-ekspresjons-biblioteker kan også anvendes (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) for å muliggjøre hurtig og lett identifisering av monoklonale Fab-fragmenter med den ønskede spesifisitet for Nogo-proteiner, - derivater eller -analoger.

Antistoff-fragmenter som inneholder molekylets idiotype, kan frembringes ved hjelp av kjente teknikker. Slike fragmenter innbefatter for eksempel, men er ikke begrenset til: F(ab')2-fragmentet som kan fremstilles ved pepsin-nedbrytning av antistoffmolekylet; Fab'-fragmentene som kan frembringes ved reduksjon av disulfidbroene i F(ab')2-fragmentet, Fab-fragmentene som kan frembringes ved behandling av antistoffmolekylet med papain og et reduksjonsmiddel, samt Fv-fragmenter.

Ved fremstillingen av antistoffer kan screening med hensyn til det ønskede antistoff utføres ved hjelp av teknikker kjent på området, f.eks. ELISA (enzymbundet immunsorpsjonsmiddel-analyse). For selektering av antistoffer som gjenkjenner et spesifikt doméne av et Nogo-protein kan man for eksempel analysere dannede hybridomer med hensyn til et produkt som bindes til et Nogo-fragment inneholdende et slike doméne. For seleksjon av et antistoff som spesifikt binder en første Nogo-homolog, men som ikke spesifikt binder en annen Nogo-homolog, kan man selektere på basis av positiv binding til den første Nogo-homolog og en mangel på binding til den andre Nogo-homolog.

Antistoffer som er spesifikke for et doméne i et Nogo-protein, er også mulig å tilveiebringe.

Forannevnte antistoffer kan anvendes i metoder kjent på området som angår lokalisasjonen og aktiviteten av Nogo-proteinsekvensene ifølge oppfinnelsen, f.eks. for avbilding av disse proteiner, måling av nivåer derav i passende fysiologiske prøver, ved diagnostiske metoder osv.

Anti-Nogo-antistoffer og fragmenter derav inneholdende bindingsdoménet er terapeutika.

5.6 NOGO- PROTEINER, - DERIVATER OG - ANALOGER

Oppfinnelsen angår Nogo-proteiner, samt derivater og analoger til Nogo-proteiner. Nukleinsyrer som koder for Nogo-proteinderivater og -proteinanaloger er også tilveiebrakt. Ved én utførelsesform kodes Nogo-proteinene for ved Nogo-nukleinsyrene beskrevet i avsnitt 5.1 ovenfor.

Fremstilling og anvendelse av derivater og analoger knyttet til Nogo er også mulig. Derivatet eller analogen kan være funksjonelt aktiv(t), dvs. at det (den) kan oppvise én eller flere funksjonelle aktiviteter forbundet med et villtype-Nogo-protein i hel lengde. Som et eksempel kan slike derivater eller analoger som har den ønskede immunogenitet eller antigenisitet, for eksempel anvendes i immunanalyser, for immunisering, for inhibering av Nogo-aktivitet osv. Derivater eller analoger som bibeholder, eller alternativt mangler eller inhiberer, en ønsket aktuell Nogo-egenskap (f.eks. binding til en Nogo-bindingspartner), kan anvendes som henholdsvis induktorer eller inhibitorer for en slik egenskap og dens fysiologiske korrelater. Derivater eller analoger til Nogo kan testes med hensyn til den ønskede aktivitet ved fremgangsmåter kjent på området, innbefattende, men ikke begrenset til, analysene beskrevet i avsnittene 6.1.10-6-1.12.

For kartlegging av det (de) aktive område(r) av Nogo er det blitt fremstilt en serie av Nogo-delesjonsmutanter ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker som beskrevet i avsnitt 6.2.7. Andelene av Nogo som finnes i delesjonsmutantgene, er vist på fig. 18. Det er mulig å fremstille fragmenter av Nogo, f.eks. fragmenter omfattende (eller alternativt bestående av) Nogo A- (SEKV UD NR:2) aminosyrenumre 1-171, 172-974, 259-542,542-722, 722-974,172-259 eller 975-1162, eller kombinasjoner av disse. Avkuttede mutanter av Nogo som mangler aminosyre-numrene 172-259 og/eller 975-1162 av SEKV ID NR:2, er også mulig, siden disse områder ser ut til å være ikke-essensielle og kan fjernes fra Nogo uten at det påvirker den biologiske aktivitet. De tilsvarende fragmenter av humant Nogo A omfattende (eller alternativt bestående av) aminosyrenumrene 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 eller 940-1127 av SEKV ID NR:29, er også tilveiebrakt. Det er også tilveiebrakt avkuttede mutanter av humant Nogo A som mangler aminosyrenumrene 132-206, aminosyrerestene 939-1127 eller aminosyrerestene 132-206 og 939-1127, av SEKV ID NR:29.

Ved en spesifikk utførelsesform er fragmentene fri for alt CNS-myelinmateriale og/eller oppviser inhiberende aktivitet som hos Nogo. Fusjonsproteiner omfattende ett eller flere av ovennevnte fragmenter koplet til en ikke-Nogo-sekvens er også tilveiebrakt.

Afogo-genderivater kan lages ved forandring av Afogø-sekvenser ved substitusjoner, addisjoner eller delesjoner som tilveiebringer funksjonelt ekvivalente molekyler. På grunn av degenerering av nukleotid-kodende sekvenser, kan andre DNA-sekvenser som koder for hovedsakelig samme aminosyresekvens som et Nogo- gen, anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, nukleotidsekvenser omfattende hele eller en del av Nogo- gener som er forandret ved substitusjon av forskjellige kodoner som koder for en funksjonelt ekvivalent aminosyrerest i sekvensen, hvorved det dannes en stum forandring. Nogo-derivatene ifølge oppfinnelsen innbefatter likeledes, men er ikke begrenset til, slike som som primær aminosyresekvens inneholder hele eller en del av aminosyresekvensen i et Nogo-protein innbefattende forandrede sekvenser hvor funksjonelt ekvivalente aminosyrerester er innsatt i stedet for rester i sekvensen, noe som resulterer i en stum forandring. For eksempel kan én eller flere aminosyrerester i sekvensen konservativt substitueres med en annen aminosyre med liknende polaritet, som virker som en funksjonell ekvivalent, noe som resulterer i en stum forandring. Erstatninger for en aminosyre i sekvensen kan velges blant andre medlemmer i klassen som aminosyren hører til. De ikke-polare (hydrofobe) aminosyrer innbefatter for eksempel alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare nøytrale aminosyrer innbefatter glycin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer innbefatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrer innbeftter asparaginsyre og glutaminsyre.

Det er mulig å tilveiebringe proteiner bestående av eller omfattende et fragment av et Nogo-protein bestående av minst 10 (kontinuerlige) aminosyrer av Nogo-proteinet. Fragmenter bestående av minst 17 eller 50 aminosyrer av Nogo-proteinet er også mulig. Slike fragmenter kan være ikke større enn 35,100 eller 200 aminosyrer. Derivater eller analoger til Nogo innbefatter, molekyler omfattende områder som i det vesentlige er homologe til Nogo eller fragmenter derav (for eksempel minst 60% eller 70% eller 80% eller 90% eller 95% identitet i forhold til en aminosyresekvens med identisk størrelse, eller sammenliknet med en innrettet sekvens hvor innrettingen er utført ved hjelp av et datamaskin-homologiprogram kjent på området, for eksempel BLAST-datamaskinsøking (Altschul et al., 1994, Nature Genet. 6:119-129)) eller hvis kodende nukleinsyre kan hybridisere til en kodende Nogo-sekvens, under stringente, moderat stringente eller ikke-stringente betingelser.

Det er også mulig å tilveiebringe molekyler omfattende Nogo-fragmenter, f.eks. inneholdende hydrokarbonbindinger til andre deler innbefattende merkematerialer eller bioaktive deler.

Nogo-derivatene og -analogene kan fremstilles ved hjelp av forskjellige metoder kjent på områder. Manipuleringene som resulterer i fremstilling av dem, kan skje på gen- eller proteinnivået. For eksempel kan den klonede Afogo-gensekvens modifiseres ved hjelp av hvilken som helst av tallrike strategier kjent på området (T. Maniatis, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Sekvensen kan spaltes på passende steder med restriksjonsendonuklease(r), fulgt av ytterligere enzymatisk modifisering hvis ønskelig, isoleres og ligeres in vitro. Ved fremstilling av genet som koder for et derivat eller en analog til Nogo, må man passe på å forsikre seg om at det modifiserte gen forblir innenfor den samme translasjons-leseramme som Nogo, ikke avbrutt av translasjons-stoppsignaler, i genområdet hvor den ønskede Nogo-aktivitet kodes.

Den Nogo-kodende nukleinsyresekvens kan dessuten muteres in vitro eller in vivo, under frembringelse og/eller ødeleggelse av translasjons-, initierings- og/eller terminerings-sekvenser, eller under frembringelse av variasjoner i kodingsområder og/eller dannelse av nye restriksjonsendonuklease-seter eller ødeleggelse av slike som finnes på forhånd, for å gjøre ytterligere in vitro-modiflsering lettere. Det kan anvendes hvilken som helst teknikk for mutagenese kjent på området, innbefattende, men ikke begrenset til, kjemisk mutagenese, setedirigert in vitro-mutagenese (C. Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), anvendelse av TAB®-linkere (Pharmacia) osv.

Manipuleringer av Nogo-sekvensen kan også utføres på proteinnivået. Innenfor oppfinnelsens ramme inngår Nogo-proteinfragmenter eller andre derivater eller analoger som er differensielt modifisert under eller etter translasjon, f.eks. ved glykosylering, acetylering, fosforylering, amidering, derivatisering med kjente beskyttende/- blokkerende grupper, proteolytisk spaltning, binding til et antistoffmolekyl eller annen cellulær ligand, osv. Hvilken som helst av tallrike kjemiske modifiseringer kan utføres ved hjelp av kjente teknikker, innbefattende, men ikke begrenset til, spesifikk kjemisk spaltning med cyanogenbromid, trypsin, chymotrypsin, papain, V8-protease, NaBIL;; acetylering, formylering, oksidasjon, reduksjon; metabolsk syntese i nærvær av tunicamycin; osv.

Analoger og derivater av Nogo kan dessuten syntetiseres kjemisk. For eksempel kan et peptid svarende til en del av et Nogo-protein som omfatter det ønskede doméne, eller som formidler den ønskede aktivitet in vitro, syntetiseres ved anvendelse av et peptidsyntetiseringsapparat. Hvis ønskelig, kan dessuten ikke-klassiske aminosyrer eller kjemiske aminosyreanaloger innføres som substitusjon eller addisjon i Nogo-sekvensen. Ikke-klassiske aminosyrer innbefatter, men er ikke begrenset til, D-isomerene av de vanlige aminosyrer, a-aminoisomørsyre, 4-aminosmørsyre, Abu, 2-aminosrnørsyre, y-Abu,6-Ahx, 6-aminoheksansyre, Aib, 2-aminoisomørsyre, 3-aminopropionsyre, ornitin, norleucin, norvalin, hydroksyprolin, sarcosin, citrullin, cysteinsyre, t-butylglycin, t-butylalanin, fenylglycin, cykloheksylalanin, P-alanin, fluoraminosyrer, formgivnings-(«designer»)-aminosyrer så som P-metylaminosyrer, Ca-metylaminosyrer, Na-metylaminosyrer og aminosyreanaloger generelt. Aminosyren kan dessuten være D (høyreroterende) eller L (venstreroterende).

Ved en spesifikk utførelsesform er Nogo-derivatet et kimærisk protein, eller fusjonsprotein, omfattende et Nogo-protein eller et fragment derav (fortrinnsvis bestående av minst et doméne eller mønster av Nogo-proteinet, eller minst 10 aminosyrer av Nogo- proteinet) knyttet i sin amino- eller karboksyterminale ende via en peptidbinding til en aminosyresekvens av et annet protein. Ved én utførelsesform fremstilles et slikt kimærisk protein ved rekombinant ekspresjon av en nukleinsyre som koder for proteinet (omfattende en Nogo-kodende sekvens sammenknyttet i ramme med en kodingssekvens for et annet protein). Et slike kimærisk produkt kan lages ved ligering av de passende nukleinsyresekvenser som koder for de ønskede aminosyresekvenser, til hverandre ved hjelp av metoder kjent på området, i den riktige koderamme, og ekspresjon av det kimæriske produkt ved metoder som er alminnelig kjente på området. Alternativt kan et slikt kimærisk produkt lages ved hjelp av proteinsynteseteknikker, f.eks. ved anvendelse av et peptidsyntetiseringsapparat. Det kan konstrueres kimæriske gener omfattende deler av Nogo koplet til eventuelle heterologe proteinkodende sekvenser. Slike heterologe proteinkodende sekvenser innbefatter for eksempel heksahistidin-merkematerialet og T7 -merkematerialet.

Nogo-derivatet kan være et molekyl omfattende et område med homologi til et Nogo-protein.

Nogo-derivatene (f.eks. fragmenter) kan være proteiner som ikke er naturlig forekommende.

5.6.1 DERIVATER AV NOGO INNEHOLDENDE

ETT ELLER FLERE DOMENER AV PROTEINET

Nogo-derivater og -analoger, spesielt Nogo-fragmenter og derivater av slike fragmenter kan omfatte, eller alternativt bestå av, ett eller flere doméner av et Nogo-protein, innbefattende, men ikke begrenset til, de konserverte karboksyterminale og hydrofobe doméner eller de aminoterminale sure eller polyprolinrike doméner, funksjonelle (f.eks. bindende) fragmenter av hvilke som helst av disse eller hvilken som helst kombinasjon av disse.

Molekyler som omfatter spesifikke fragmenter av Nogo som er de fragmenter i det respektive Nogo-protein som er mest homologe med spesifikke fargmenter av et rotte- eller bovint Nogo-protein er mulige. Et fragment omfattende et doméne av en Nogo-homolog kan identifiseres ved proteinanalysemetoder som beskrevet i avsnittene 6.1.2, 6.1.8, 6.1.9,6.1.10, 6.1.11 eller 6.1.12.

Det er også mulig å tilveiebringe et molekyl som omfatter ett eller flere doméner (eller funksjonell del derav) av et Nogo-protein, men som også mangler ett eller flere doméner

(eller funksjonell del derav) av et Nogo-protein. Videre er det mulig å tilveiebringe et molekyl som omfatter ett eller flere doméner (eller funksjonell del derav) av et Nogo-protein, og som har ett eller flere mutante (f.eks. på grunn av delesjon eller punktmutasjon(er)) doméner av et Nogo-protein (f.eks. slik at det mutante doméne har nedsatt funksjon).

5.7 ANALYSER AV NOGO- PROTEINER, - DERIVATER OG - ANALOGER

Den funksjonelle aktivitet av Nogo-proteiner, -derivater og -analoger kan analyseres ved hjelp av forskjellige metoder. Beskrivelse av funksjonsanalyser i de følgende avsnitt, kan innbefatte andre analyser kjent for en fagperson på området.

5.7.1 ANALYSER AV NOGO- IN VITRO- NEURITTVEKSTINHIBERING

Det er mulig å analysere Nogo-proteiner, -derivater og -analoger med hensyn til inhibering av NIH 3T3-utbredelse eller inhibering av PC12-neurittutvekst under anvendelse av in vitro-vevskultur (avsnitt 6.1.10).

Nogo-proteiner, -derivater og -analoger kan anvendes til analysering med hensyn til eksplantert kylling-dorsalrotganglie-vekstkonus-sammenbrudd indusert ved tilstedeværelse av Nogo. Likeledes kan Nogo-funksjonen analyseres med hensyn til inhibering av neuritt-utvekst av eksplanterte kylling-dorsalrotganglier (Spillman et al., 1998 J. Biol. Chem. 273:19283-19293).

5.7.2 ANALYSER AV FUNKSJONELLE NOGO- IN VIVO- EGENSKAPER

Det kan anvendes antagonister til Nogo-proteiner, -derivater og -analoger for in vivo-analyser av funksjonen under anvendelse av en dyremodell for regenerering av kortikospinalsystem (CST) over lange avstander, samt restitusjon av oppførsel.

Gnager-kortikospinalsystem kan ødelegges ved kirurgisk reseksjon eller ryggmargkvestelse, og antagonister til Nogo administreres til dyret. Nerveplastisitet, - regenerering og funksjonell restitusjon, sammenliknet med ikke-behandlede kontrolldyr eller kotroll-antistoff-behandlede dyr, kontrolleres med hensyn til strukturell plastisitet eller regenerering ved hjelp av anatomiske teknikker, hovedsakelig ved merking av definerte nervesystemer. Funksjonell restitusjon måles ved bevegelse og ved elektrofysiologi-ferdighetstester som utføres av gnageren (f.eks. klebepapirtest, oppgave med å nå matpellet, osv.) (Thallmair et al., 1998 Nat. Neuroscience 1(2): 124-131).

5.7.3 NOGO- LIGANDBINDINGSINHIBERING OG ANALYSER FOR DETTE

Der hvor man analyserer med henblikk på evnen til å binde eller konkurrere med villtype-Nogo med hensyn til binding til anti-Nogo-antistoff, kan det anvendes forskjellige immunanalyser kjent på området, innbefattende, konkurrerende og ikke-konkurrerende analysesystemer ved anvendelse av teknikker så som radioimmunanalyser, ELISA (enzymbundet immunsorpsjonsmiddel-analyse), «sandwich»-immunanalyser, immunradiometriske analyser, geldiffusjonsutfellingsreaksjoner, immundiffusjonsanalyser, in situ-immunanalyser (ved anvendelse av for eksempel kolloidalt gull, enzym- eller radioisotop-merkematerialer, Western blot, utfellingsreaksjoner, agglutinasjonsanalyser (f.eks. gelagglutinasjonsanalyser, hemagglutinasjonsanalyser), komplementfikseringsanalyser, immunfluorescensanalyser, protein A-analyser og immunelektroforeseanalyser, osv. Det er mulig å påvise antistoffbinding ved påvisning av en merkesubstans på det primære antistoff. Det er også mulig å påvise det primære antistoff ved påvisning av binding av et sekundært antistoff eller reagens til det primære antistoff. Ytterligere er mulig å merke det sekundære antistoff. Det er på området kjent mange måter for påvisning av binding i en immunanalyse.

Der hvor et Nogo-bindende protein identifiseres, kan bindingen analyseres f.eks. ved hjelp av metoder som er velkjente på området, også fysiologiske korrelater til Nogo-binding til dets substrater kan analyseres.

5.8 TERAPEUTISKE ANVENDELSER

Oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse av et protein slik det fremgår av kravene 1-5 for fremstilling av et medikament for behandling av forskjellige sykdommer og forstyrrelser ved administrering av en terapeutisk forbindelse (i det foreliggende betegnet

«terapeutikum»). Slike «terapeutika» kan være Nogo-proteiner og analoger og derivater derav (f.eks. som beskrevet i det foregående); antistoffer mot disse (som beskrevet i det foregående); nukleinsyrer som koder for Nogo-proteinene, -analogene eller -derivatene (f.eks. som beskrevet i det foregående); Atogo-antisense-nukleinsyrer, og Nogo-agonister og -antagonister. Forstyrrelser som innbefatter deregulert cellevekst, f.eks. CNS-tumorer, behandles eller forebygges ved administrering av et terapeutikum som befordrer Nogo-funksjon. Forstyrrelser hvor neurittvekst, -regenerering eller - opprettholdelse er mangelfull eller ønsket, behandles ved administrering av et terapeutikum som motvirker (inhiberer) Nogo-funksjon. Ovenstående er beskrevet detaljert i under-avsnittene nedenfor.

Således kan et humant Nogo-protein, -derivat eller -analog eller -nukleinsyre, eller et antistoff mot et humant Nogo-protein, terapeutisk eller profylaktisk administreres til et menneske.

5.8.1 BEHANDLING OG FOREBYGGING AV FORSTYRRELSER

INNBEFATTENDE DEREGULERT CELLEVEKST

Sykdommer og forstyrrelser som innbefatter deregulert cellevekst, kan behandles eller forebygges ved administrering av et terapeutikum som befordrer (dvs. øker eller frembringer) Nogo-funksjon. Eksempler på et slikt terapeutikum kan være Nogo-proteiner, -derivater eller -fragmenter som er funksjonelt aktive, spesielt som er aktive når det gjelder inhibering av neurittekstensjon eller cellevekst-inhibering (f.eks. som påvist ved in vitro-analyser eller i dyremodeller), og nukleinsyrer som koder for et Nogo-protein eller et funksjonelt aktivt derivat eller fragment derav (f.eks. for anvendelse ved genterapi). Nogo-proteinene, derivatene eller fragmentene derav er fortrinnsvis fri for alt CNS-myelinmateriale som det er naturlig forbundet med. Andre terapeutika som kan anvendes, f.eks. Nogo-agonister, kan identifiseres ved anvendelse av in vitro-analyser eller dyremodeller, og eksempler på disse er beskrevet i det følgende.

Terapeutika som befordrer Nogo-funksjonen kan administreres terapeutisk (innbefattende profylaktisk): (1) ved sykdommer eller forstyrrelser som innebærer fravær av eller et nedsatt (i forhold til normalt eller ønskelig) nivå av Nogo-protein eller -funksjon, for eksempel hos pasienter hvor Nogo-protein mangler, er genetisk mangelfullt, biologisk inaktivt eller underaktivt eller under-uttrykt; eller (2) ved sykdommer eller forstyrrelser hvor in vitro- (eller in vivo-) analyser (se nedenfor) indikerer anvendbarheten av administrering av Nogo-agonister. Fravær av eller øket nivå av Nogo-protein eller -funksjon kan lett påvises, f.eks. ved at det tas en vevspøve fra en pasient (f.eks. fra biopsivev) som analyseres in vitro med henblikk på RNA- eller protein-nivåer, strukturen og/eller aktiviteten av den (det) uttrykte Nogo-RNA eller - protein. Mange metoder som er standard på området, kan således anvendes, eks. på slike kan være kinaseanalyser, immunanalyser for påvisning og/eller visualisering av Nogo-protein (f.eks. Western blot, immunutfelling fulgt av natriumdodekylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese, immuncytokjemi osv.) og/eller hybridiseringsanalyser for påvisning av Nogo-ekspresjon ved påvisning og/eller visualisering av Nogo-mRNA (f.eks. Northern-analyser, «dot blot», in situ-hybridisering osv.), osv.

Sykdommer og forstyrrelser som innebærer deregulert cellevekst som det er mulig å behandle eller forebygge kan være proliferative forstyrrelser, maligne tumorer, nervesystem-tumorer osv. Eksempler på disse er angitt detaljert nedenfor.

5.8.1.1 NEOPLASTISK VEKST

Nneoplastisk vekst og tilknyttede forstyrrelser som kan behandles eller forebygges ved administrering av et terapeutikum som befordrer Nogo-funksjon, kan innbefatte de som er oppført i tabell 1 (for en oversikt over slike forstyrrelser, se Fishman et al., 1985, Medicine, 2. utg., J.B. Lippincott Co., Philadelphia):

Det er mulig å behandle eller forebygge malignitet eller dysproliferative forandringer (så som metaplasier og dysplasier) eller hyperproliferative forstyrrelser i sentralnervesystemet, ryggmargen eller hvilke som helst nervevev.

5.8.1.2 PREMALIGNE TILSTANDER

Terapeutikaene som befordrer Nogo-aktivitet, kan også administreres for behandling av premaligne tilstander og for forhindring av utvikling til en neoplastisk eller malign tilstand, som for eksempel, de forstyrrelser som er oppført i tabell 1. Slik profylaktisk eller terapeutisk anvendelse er indikert ved tilstander som er kjent for å gå forut for, eller som man antar går forut for, utvikling til neoplasi eller kreft, spesielt hvor ikke-neoplastisk cellevekst bestående av hyperplasi, metaplasi eller mest spesielt dysplasi har funnet sted (for oversikt over slike unormale veksttilstander, se Robbins og Angell, 1976, Basic Pathology, 2. utg., W.B. Saunders Co., Philadelphia, s. 68-79). Hyperplasi er en form for regulert celleproliferasjon som innebærer en økning i celleantall i et vev eller organ, uten noen betydelig forandring i struktur eller funksjon. Metaplasi er en form for regulert cellevekst hvor én type fullt utviklet eller fullstendig differensiert celle erstatter en annen type fullt utviklet celle. Metaplasi kan oppstå i epitel- eller bindevevceller. Atypisk metaplasi innebærer et noe uordnet metaplastisk epitel. Dysplasi er ofte en forløper for kreft og finnes hovedsakelig i epitelet; det er den mest uordnede form av ikke-neoplastisk cellevekst og innbefatter et tap i ensartethet hos de individuelle celler og i cellers bygningsorientering. Dysplastiske celler har ofte unormalt store, dypfargede kjerner, og oppviser pleomorfisme. Dysplasi finner karakteristisk sted hvor det finnes kronisk irritasjon eller inflammasjon.

Alternativt, eller i tillegg til, tilstedeværelse av unormal cellevekstkarakterisertsom hyperplasi, metaplasi eller dysplasi, kan tilstedeværelse av én eller flere egenskaper som hos en transformert fenotype, eller hos en malign fenotype, fremvist in vivo eller fremvist in vitro av en celleprøve fra en pasient, angi at det vil være ønskelig med profylaktisk/-terapeutisk administrering av et terapeutikum som befordrer Nogo-funksjon. Som nevnt ovenfor, innbefatter slike egenskaper hos en transformert fenotype morfologi-forandringer, løsere substrat-tilknytning, tap av kontaktinhibering, tap av forankrings-avhengighet, proteasefrigjøring, øket sukkertransport, redusert serumbehov, ekspresjon av føtale antigener, forsvinning av celleoverflateproteinet på 250 000 dalton, osv. (se også id. på s. 84-90 for egenskaper forbundet med en transformert eller malign fenotype).

Det er mulig å behandle en pasient som oppviser én eller flere av følgende disposisjonsfaktorer for malignitet, ved administrering av en effektiv mengde av et terapeutikum: nevrofibromatose ifølge Von Recklinghausen, eller retinoblastom; se Robbins og Angell, 1976, Basic Pathology, 2. utg., W.B. Saunders Co., Philadelphia, s. 112-113 osv.

Videre er det mulig å administrere et terapeutikum som nevnt over til en pasient for forhindring av spredning av kreft, melanom eller sarkom til nyre, brusk (i brystbenet), hud, skjelettmuskel, lunger eller milt.

5.8.1.3 HYPERPROLIFERATIVE OG

DYSPROLIFERATIVE FORSTYRRELSER

Anvendelse av et terapeutikum som befordrer Nogo-aktivitet, til behandling eller forebygging av hyperproliferative eller benigne dysproliferative forstyrrelser er mulig. Behandling eller forebygging kan være rettet mot cirrhose i leveren (en tilstand hvor arrdannelse har overtatt normale lever-regenereringsprosesser), behandling av keloid-(hypertrofisk arr-)dannelse (vansiring av huden hvor arrdannelsesprosessen innvirker på normal fornyelse), psoriasis (en vanlig hudtilstand kjennetegnet ved sterk proliferasjon av huden og forsinkelse i den riktige bestemmelse av cellenes skjebne), benigne tumorer, fibrocystiske tilstander og vevshypertrofi (f.eks. prostata-hyperplasi).

5.8.1.4 GENTERAPI

Genterapi som omfatter en sekvens som koder for et Nogo-protein eller et funksjonelt derivat derav, for befordring av Nogo-funksjon er i dag mulig. Genterapi angir terapi utført ved administrering av en nukleinsyre til et individ, ved en slik terapi danner nukleinsyren sitt kodede protein som formidler en terapeutisk effekt ved befordring av Nogo-funksjon.

Eksempler på metoder er beskrevet nedenfor.

For generelle oversikter over genterapimetodene, se Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu og Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; og Morgan og Andersom, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mai, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215). Metoder som er alminnelig kjent på området rekombinant DNA-teknologi, og som kan anvendes, er beskrevet i Ausubel et al. (red.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; og Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

Terapeutikumet kan omfatte en Nogo-nukleinsyre som er en del av en ekspresjonsvektor som uttrykker et Nogo-protein eller et fragment eller et kimærisk protein derav i en egnet vert. En slik nukleinsyre har spesielt en promoter som er operabelt knyttet til det Nogo-kodende område, idet promoteren er induserbar eller konstitutiv, og eventuelt vevsspesifikk. Ved en annen spesiell utførelsesform anvendes et nukleinsyremolekyl hvor de Nogo-kodende sekvenser og eventuelle andre ønskede sekvenser er flankert av områder som befordrer homolog rekombinasjon på et ønsket sted i genomet, hvorved det tilveiebringes intrakromosomal ekspresjon av Nogo-nukleinsyren (Koller og Smithies, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al, 1989, Nature 342:435-438).

Avgivelse av nukleinsyren i en pasient kan enten skje direkte, i hvilket tilfelle pasienten er direkte eksponert for nukleinsyren eller den nukleinsyre-bærende vektor, eller indirekte, i hvilket tilfelle cellene først transformeres med nukleinsyren in vitro, og så transplanteres i pasienten. Disse to fremgangsmåter er kjent som henholdsvis in vivo-eller ex vivo-genterapi.

Nukleinsyren kan administreres direkte in vivo, hvor den uttrykkes under fremstilling av det kodede produkt. Dette kan utføres ved hjelp av hvilken som helst av tallrike metoder kjent på området, f.eks. ved å konstruere den som en del av en passende nukleinsyre-ekspresjonsvektor og administrere den slik at den blir intracellulær, f.eks. ved infisering under anvendelse av en defekt eller svekket retrovirus- eller annen virusvektor (se US-patent nr. 4 980 286), eller ved direkte injisering av ren DNA, eller ved anvendelse av mikropartikkelbombardering (f.eks. en genpistol; Biolistic, Dupont), eller belegging med lipider eller celleoverflatereseptorer eller transfekterings-midler, innkapsling i liposomer, mikropartikeler eller mikrokapsler, eller ved administrering av den i tilknytning til et peptid som er kjent for å gå inn i kjernen, ved administrering av den i tilknytning til en ligand som er utsatt for reseptor-mediert endocytose (se f.eks. Wu og Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (som kan anvendes til innsikting av celletyper som spesifikt uttrykker reseptorene), osv. Videre er det også mulig at det dannes et nukleinsyre-ligand-kompleks hvor liganden omfatter et fusogent viruspeptid for sprenging av endosomer, idet nukleinsyren får mulighet til å unngå lysosomal nedbrytning. Videre kan nukleinsyren innsiktes in vivo for cellespesifikt opptak og ekspresjon, ved innsikting av en spesifikk reseptor (se f.eks. PCT-publikasjoner WO 92/06180 datert 16. april 1992 (Wu et al); WO 92/22635 datert 23. desember 1992 (Wilson et al); WO 92/20316 datert 26. november 1992 (Findeis et al); WO 93/14188 datert 22. juli 1993 (Clarke et al.), WO 93/290221 datert 14. oktober 1993 (Young)). Alternativt kan nukleinsyren innføres intracellulært og innlemmes i vertscelle-DNA for ekspresjon, ved homolog rekombinasjon (Koller og Smithies, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al, 1989, Nature 342:435-438).

En virusvektor kan anvendes som inneholder Nogo-nukleinsyren. Det kan for eksempel anvendes en retrovirusvektor (se Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Disse retrovirusvektorer er blitt modifisert under delesjon av retrovirus-seksvenser som ikke er nødvendige for innpakking av virusgenomet og integrering i vertscelle-DNA. Nogo-nukleinsyren for anvendelse ved genterapi klones i vektoren, som gjør avgivelse av genet til en pasient lettere. Mer detalj om retrovirus-vektorer kan finnes i Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, som beskriver anvendelse av en retrovirusvektor til avgivelse av mdrl-genet til hematopoetiske stamceller for å gjøre stamcellene mer bestandige overfor kjemoterapi. Andre referanser som illustrerer anvendelse av retrovirusvektorer ved genterapi, er: Clowes et al, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al, 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons og Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; og Grossman og Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.

Adenovirus er andre virusvektorer som kan anvendes ved genterapi. Adenovirus er spesielt attraktive bærersubstanser for avgivelse av gener til sentralnerve-systemet. Adenovirus infiserer naturlig respiratoriske epiteler hvor de forårsaker en mild sykdom. Andre målsubstanser for adenovirus-baserte avgivelsessystemer er lever, de respiratoriske epiteler, endotelceller og muskel. Adenovirus har den fordel at de er i stand til å infisere ikke-delende celler. Kozarsky og Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 presenterer en oversikt over adenovirusbasert genterapi. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 påviste anvendelse av adenovirusvektorer til overføring av gener til de respiratoriske epiteler i rhesus-aper. Andre eksempler på anvendelse av adenovirus ved genterapi kan finnes i Rosenfeld et al, 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al, 1992, Cell 68:143-155; og Mastrangeli et al, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234.

I tillegg til adenovirus, er adenoassosiert virus (AAV) også blitt foreslått for anvendelse ved genterapi (Walsh et al, 1993, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300.

En annen fremgangsmåte ved genterapi innbefatter overføring av et gen til celler i

vevskultur ved slike metoder som elektroporering, lipofektering, kalsiumfosfat-mediert transfektering eller virusinfisering. Overføringsmetoden innbefatter vanligvis overføring av en selekterbar markør til cellene. Cellene blir så anbrakt under seleksjon for isolasjon av de celler som har tatt opp og uttrykker det overførte gen. Disse celler blir så avgitt til en pasient.

Ved denne anvendelsen innføres nukleinsyren i en celle før in vivo-administrering av den resulterende rekombinante celle. Slik innføring kan utføres ved hjelp av hvilken som helst metode kjent på området, som for eksempel, transfektering, elektroporering, mikroinjisering, infisering med en virus- eller bakteriofagvektor inneholdende nukleinsyresekvensene, cellefusjon, kromosom-mediert genoverføring, mikrocelle-mediert genoverføring, sferoplastfusjon osv. Tallrike teknikker er kjent på området for innføring av fremmede gener i celler (se f.eks.Loeffler og Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92) og kan anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse, under forutsetning av at de nødvendige utviklings- og fysiologiske funksjoner hos mottakercellene ikke avbrytes. Teknikken bør tilveiebringe stabil overføring av nukleinsyren til cellen, slik at nukleinsyren kan uttrykkes av cellen og fortrinnsvis arves og uttrykkes av dens celleavkom.

De resulterende rekombinante celler kan avgis til en pasient ved hjelp av forskjellige metoder kjent på området. Det kan injiseres epitelceller f.eks. subkutant. En annen måte er at rekombinante hudceller påføres som et hudtransplantat på pasienten. Rekombinante blodceller (f.eks. hematopoetiske stam- eller progenitorceller) blir fortrinnsvis administrert intravenøst. Mengden av celler man tenker seg for anvendelse, avhenger av den ønskede effekt, pasientens tilstand osv., og kan bestemmes av en fagperson på området.

Celler i hvilke en nukleinsyre kan innføres for genterapiformål, kan omfatte hvilken som helst ønsket, tilgjengelig celletype, og kan innbefatte epitelceller, endotelceller, keratinocytter, fibroblaster, muskelceller, hepatocytter; blodceller så som T-lymfocytter, B-lymfocytter, monocytter, makrofager, nøytrofile celler, eosinofile celler, megakaryocytter, granulocytter; forskjellige stam- eller progenitorceller, spesielt hematopoetiske stam- eller progenitorceller, f.eks. tatt fra benmarg, navlestrengblod, perifert blod, føtal lever osv.

Cellen som anvendes for genterapi kan være autolog i forhold til pasienten.

Der hvor rekombinante celler anvendes i genterapi, innføres en Nogo-nukleinsyre i cellene, slik at den kan uttrykkes av cellene eller deres avkom, og de rekombinante celler blir så administrert in vivo for terapeutisk effekt. Det er mulig å anvende stam-eller progenitorceller. Hvilke som helst stam- og/eller progenitorceller som kan isoleres og opprettholdes in vitro, kan potensielt anvendes. Slike stamceller kan være nervestamceller (Stemple og Anderson, 1992, Cell 71:973-985).

Nukleinsyren som skal innføres for genterapiformål kan omfatteen induserbar promoter som er operabelt knyttet til kodingsområdet, slik at ekspresjon av nukleinsyren kan reguleres ved regulering av tilstedeværelse eller fravær av den passende induktor for transkripsjon.

Ytterligere metoder som kan tilpasses for anvendelse til avgivelse av en nukleinsyre som koder for et Nogo-protein eller funksjonelt derivat.

5.8.2 BEHANDLING OG FOREBYGGING AV FORSTYRRELSER

HVOR NOGO BLOKKERER REGENERERING

Sykdommer og forstyrrelser hvor neurittekstensjon, -vekst eller -regenerering er ønskelig, behandles ved administrering av et terapeutikum som motvirker (inhiberer) Nogo-funksjonen. Sykdommene, forstyrrelsene eller ødeleggelsen som til slutt resulterer i ødeleggelse av nervesystemet, kan være sentralnervesystem-(CNS)-traumer, (f.eks.ryggmarg- eller hjerneskader), infarkt, infeksjon, malignitet, utsettelse for toksiske midler, næringsmangel, paraneoplastiske syndromer og degenerative nervesykdommer (innbefattende, men ikke begrenset til, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons chorea, multippel sklerose, amyotrofisk lateral sklerose samt progressiv supranukleær lammelse); ved administrering av forbindelser som innvirker på Nogo-aktiviteten (f.eks. et dominant negativt Nogo-derivat; antistoffer mot Nogo; antisense-nukleinsyrer som koder for Nogo; Nogo-ribozymer eller kjemiske grupper som binder et aktivt sete på Nogo).

Terapeutika som kan anvendes er Afogo-antisense-nukleinsyrer, og Nogo-nukleinsyrer som er dysfunksjonelle (f.eks. på grunn av et heterologt (ikke-Afogø-sekvens) innskudd i den Afogo-kodende sekvens) som anvendes til «knockout» av endogen Afogo-funksjon ved homolog rekombinasjon (se f.eks. Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Anti-Nogo-antistoffer (og fragmenter og derivater derav inneholdende bindingsområdet på disse) kan anvendes som en antagonist til Nogo. Det er videre mulig å anvende en nukleinsyre innholdende en del av et Nogo- gen hvor Afogø-sekvenser flankerer (er både 3' og 5' i forhold til) en annen gensekvens, som Nogo-antagonist, under befordring av Afogø-inaktivering ved homolog rekombinasjon (se også Koller og Smithies, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al, 1989, Nature 342:435-438). Andre terapeutika som inhiberer Nogo-funksjonen, kan identifiseres ved anvendelse av kjente hensiktsmessige in vitro-analyser, f.eks. basert på deres evne til å inhibere binding av Nogo til et annet protein, eller inhibere hvilken som helst kjent Nogo-funksjon, fortrinnsvis analysert in vitro eller i cellekultur, skjønt genetiske analyser kan også anvendes. Fortrinnsvis anvendes egnede in vitro- eller in vivo-analyser for bestemmelse av effekten av et spesifikt terapeutikum og om hvorvidt administrering av det er indikert for behandling av det rammede vev.

Terapeutika som inhiberer Nogo-funksjonen, administrert terapeutisk (innbefattende profylaktisk): (1) ved sykdommer eller forstyrrelser som innebærer økt (i forhold til det normale eller ønskede) nivå av Nogo-protein eller -funksjon, for eksempel hos pasienter hvor Nogo-protein er overaktivt eller over-uttrykt; eller (2) ved sykdommer eller forstyrrelser hvor in vitro- (eller in vivo-) analyser (se nedenfor) tyder på anvendbarhet av Nogo-antagonist-administrering. De økte nivåer når det gjelder Nogo-protein eller - funksjon kan lett påvises f.eks. ved kvantifisering av protein og/eller RNA, ved at en vevsprøve tas fra en pasient (f.eks. fra biopsivev) og analyseres in vitro med hensyn til RNA- eller proteinnivåer, struktur og/eller aktivitet av den (det) uttrykte Nogo-RNA eller -protein. Det kan således anvendes mange metoder som er standard på området, som for eksempel kinaseanalyser, immunanalyser til påvisning og/eller visualisering av Nogo-protein (f.eks.Western blot, immunutfelling fulgt av natriumdodekylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese, immuncytokjemi osv.) og/eller hybridiseringsanalyser for påvisning av Nogo-ekspresjon ved henholdsvis påvisning og/eller visualisering av Nogo-mRNA (f.eks. Northern-analyser, dot blot, in situ-hybirdisering osv.), osv.

5.8.2.1 ANTISENSE- REGULERING AV iVOGO- EKSPRESJON

Nogo-funksjonen kan inhiberes ved anvendelse av Atøgø-antisense-nukleinsyrer. Det er mulig å tilveibringe terapeutisk og profylaktisk anvendelse av nukleinsyrer med minst seks nukleotider som er antisense i forhold til et gen eller en cDNA som koder for Nogo eller en del derav. En Afogø-røntisense^nukleinsyre som anvendes kan angi en nukleinsyre som kan hybridisere til en del av en Nogo- KNA (fortrinnsvis mRNA) ved hjelp av en viss sekvenskomplementaritet. Antisense-nukleinsyren kan være komplementær til et kodende og/eller ikke-kodende område av en Afogo-mRNA. Slike antisense-nukleinsyrer har anvendbarhet som terapeutika som inhiberer Nogo-funksjonen, og kan anvendes ved behandling eller forebygging av forstyrrelser som beskrevet ovenfor.

Antisense-nukleinsyrene kan være oligonukleotider som er dobbeltkjedede eller enkeltkjedede, RNA eller DNA eller en modifikasjon eller et derivat derav, som kan administreres direkte til en celle, eller som kan dannes intracellulært ved transkripsjon av eksogene, innførte sekvenser.

Afogo-antisense-nukleinsyrene kan anvendes til befordring av regenerering av neuroner i sentralnervesystemet spesielt, innbefattende regenerering av kortikospinalsystemet, plastisitet under restitusjon, ny vekst av neuroner og restitusjon av ødeleggelse i forbindelse med traumatiske skader, slag og neurodegenerative sykdommer.

Farmasøytiske preparater omfattende en effektiv mengde av Afogo-antisense-nukleinsyrene i en farmasøytisk akseptabel bærer, som beskrevet i det følgende er mulig å fremstille.

Fremgangsmåter for inhibering av ekspresjonen av en Afogo-nukleinsyresekvens i en prokaryot eller eukaryot celle, som omfatter at det til cellen tilføres en effektiv mengde av et preparat omfattende en Afogo-antisense-nukleinsyre er mulige.

Afogo-antisense-nukleinsyrer og deres anvendelser er beskrevet detaljert nedenfor.

5.8.2.1.1 M7GO- ANTISENSE- NULEINSYRER Afogø-antisense-nukleinsyrene inneholder minst seks nukleotider og er fortrinnsvis oligonukleotider (i området fra 6 til ca. 50 oligonukleotider). Ved spesifikke aspekter omfatter oligonukleotidet minst 10 nukleotider, minst 15 nukleotider, minst 100 nukleotider eller minst 200 nukleotider. Oligonukleotidene kan være DNA eller RNA eller kimæriske blandinger eller derivater eller modifiserte versjoner derav, enkeltkjedede eller dobbeltkjedede. Oligonukleotidet kan være modifisert i basedelen, sukkerdelen eller fosfatskjelettet. Oligonukleotidet kan innbefatte andre vedhengende grupper så som peptider, eller agenser som gjør transport over cellemembranen lettere (se f.eks. Letsinger et al, 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. 84:648-652; PCT-publikasjon nr. WO 88/09810, publisert 15. desember 1988) eller blod-hjerne-barrieren (se f.eks. PCT-publikasjon nr. WO 89/10134, publisert 25. april 1988), hybridiserings-triggede spaltningsmidler (se f.eks. Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976) eller interkaleringsmidler (se f.eks. Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549).

Det er mulig å tilveiebringe et Afogo-antisense-oligonukleotid, fortrinnsvis en enkeltstrenget DNA. Et slikt oligonukleotid kan omfatte en sekvens som er antisense i forhold til sekvensen nær én av de to promotersekvensene i Afogo-genet, eller en sekvens som koder for karboksyterminal del av Afogø-genet. Det kan være ønskelig selektivt å inhibere ekspresjon av Nogo-isoformene. Oligonukleotidet kan modifiseres i hvilken som helst stilling på dets struktur med substituenter som er alminnelig kjent på området.

Nogo-antisense-oligonukleotidet kan omfatte minst én modifisert base-del som er valgt fra gruppen kan innbefatte, 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-kloruracil, 5-joduracil, hypoxantin, xantin, 4-acetylcytosin, 5-(karboksyhydroksylmetyl)-uracil, 5-karboksymetylaminometyl-2-tiouridin, 5-karboksymetylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktosylqueosin, inosin, N6-isopentenyladenin, 1-metylguanin, 1-metylinosin, 2,2-dimetylguanin, 2-metyladenin, 2-metylguanin, 3-metylcytosin, 5-metylcytosin, N6-adenin, 7-metylguanin, 5-metylaminometyluracil, 5-metoksyamino-metyl-2-tiouracil, beta-D-mannosylqueosin, 5'-metoksykarboksymetyluracil, 5-metoksy-uracil, 2-metyltio-N6-isopentenyladenin, uracil-5-oksyeddiksyre (v), wybutoxosin, pseudo-uracil, queosin, 2-tiocytosin, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, uracil-5-oksyeddiksyremetylester, uracil-5-oksyeddiksyre (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropyl)uracil, (acp3)w og 2,6-diaminopurin.

Oligonukleotidet kan omfatte minst én modifisert sukkerdel valgt fra gruppen innbefattende, men ikke begrenset til, arabinose, 2-fluorarabinose, xylulose og heksose.

Videre kan oligonukleotidet omfatte minst ett modifisert fosfatskjelett valgt fra gruppen bestående av et fosfortioat, et fosforditioat, et fosforamidtioat, et fosforamidat, et fosfordiamidat, et metylfosfonat, en alkylfosfotriester og et formacetal eller analog til dette.

Oligonukleotidet kan også være et a-anomert oligonukleotid. Et a-anomert oligonukleotid danner spesifikke dobbeltkjedede hybrider med komplementær RNA hvor, i motsetning til de vanlige P-enheter, strengene løper parallelt med hverandre (Gautier et al, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641).

Oligonukleotidet kan være konjugert til et annet molekyl, f.eks. et peptid, et hybridiserings-trigget tverrbindingsmiddel, et transportmiddel, et hybridiserings-trigget spaltningsmiddel osv.

Oligonukleotidene kan syntetiseres ved hjelp av standardmetoder kjent på området, f.eks. ved anvendelse av et automatisert DNA-syntetiseringsapparat (f.eks. som kommersielt tilgjengelig fra Biosearch, Applied Biosystems, osv.) Som eksempler kan fosfortioat-oligonukleotider syntetiseres ved hjelp av metoden ifølge Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209); metylfosfonat-oligonukleotider kan fremstilles ved anvendelse av regulerte poreglasspolymerbærere (Sarin et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:7448-7451), osv.

Atogø-antisense-oligonukleotidet kan omfatte katalytisk RNA, eller et ribozym (se f.eks. internasjonal PCT-publikasjon WO 90/11364, publisert 4. oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Oligonukleotidet kan også være et et 2'-0-metylribonukleotid (Inoue et al, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), eller en kimærisk RNA-DNA-analog (Inoue et al, 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

Atogø-antisense-nukleinsyren kan fremstilles intracellulært ved transkripsjon fra en eksogen sekvens. For eksempel kan en vektor innføres in vivo slik at den tas opp av en celle, i hvilken celle vektoren eller en del derav transkriberes, under dannelse av en antisense-nukleinsyre (RNA) ifølge oppfinnelsen. En slik vektor vil inneholde en sekvens som koder for Afogo-antisense-nukleinsyren. En slik vektor kan forbli episomal eller integreres kromosomalt, så lenge den kan transkriberes under fremstilling av den ønskede antisense-RNA. Slike vektorer kan konstrueres ved rekombinant DNA-teknologimetoder som er standard på området. Vektorer kan være plasmid-, virus- eller andre vektorer kjent på området som anvendes for replikasjon og ekspresjon i pattedyrceller.

Ekspresjon av sekvensen som koder for Nogo-antisense-RNA, kan skje ved hjelp av hvilken som helst promoter kjent på området for å virke i pattedyr-, fortrinnsvis humane, celler. Slike promoterer kan være induserbare eller konstitutive. Slike promoterer kan innbefatte: SV40-tidligpromoterområdet (Bernoist og Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promoteren som finnes i den lange 3'-terminale repetering av Rous-sarkomvirus (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), herpes-thymidinkinasepromoteren (Wagner et al, 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:1441-1445), regulatorsekvensene i metalltionein-genet (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), osv.

Antisense-nukleinsyrene kan omfatte en sekvens som er komplementær til minst en del av et RNA-transkript av et Nogo- gen, fortrinnsvis et humant Nogo- gen. Imidlertid er

absolutt komplementaritet ikke nødvendig, skjønt det er foretrukket. En sekvens som er «komplementær til minst en del av en RNA», omtalt i det foreliggende, betyr en sekvens med tilstrekkelig komplementaritet til at den er i stand til å hybridisere med RNA under

dannelse av et stabilt dupleks; når det gjelder dobbeltstrengede Nogo-antisense-nukleinsyrer, kan det således testes en enkelt kjede av den duplekse DNA, eller tripleksdannelse kan analyseres. Evnen til å hybridisere vil avhenge både av graden av komplementaritet og lengden av antisense-nukleinsyren. Jo lengre den hybridiserende nukleinsyre er, jo flere umake baser i forhold til en Nogo- RNA vil den vanligvis kunne inneholde og likevel danne et stabilt dupleks (eller tripleks, alt etter hvilket tilfelle det gjelder). En fagperson på området kan forsikre seg om en tolererbar umake-grad ved anvendelse av standardmetoder for bestemmelse av smeltepunktet for det hybridiserte kompleks.

5.8.2.1.2 TERAPEUTISK ANVENDELSE AV

iVOGO- ANTISENSE- NUKLEINSYRER

Afogø-antisense-nukleinsyrene kan anvendes til behandling (eller forebygging) av forstyrrelser i en celletype som uttrykker, eller fortrinnsvis over-uttrykker, Nogo. En slik forstyrrelse kan være en vekstproliferativ forstyrrelse. Det er da mulig å anvende et enkeltstrenget DNA-antisense-Nogo-oligonukleotid.

Celletyper som uttrykker eller over-uttrykker Nogo- RNA, kan identifiseres ved forskjellige metoder kjent på området. Slike metoder kan innbefatte, hybridisering med en Afogo-spesifikk nukleinsyre (f.eks. ved Northern-hybridisering, dot blot-hybridisering, in situ hybridisering), observering av evnen hos RNA fra en celletype til og translateres in vitro i Nogo, immunanalyse, osv. Primært vev fra en pasient kan analyseres med hensyn til Nogo-ekspresjon før behandling, f.eks. ved immuncytokjemi eller in situ-hybridisering.

Farmasøytiske preparater kan omfatte en effektiv mengde av en Afogo-antisense-nukleinsyre i en farmasøytisk akseptabel bærer, og kan administreres til en pasient med en sykdom eller forstyrrelse som er av en type som uttrykker eller overuttrykker Nogo-RNA- eller -protein.

Mengden av Afogo-antisense-nukleinsyre som vil være effektiv ved behandling av en spesiell forstyrrelse eller tilstand, vil avhenge av beskaffenheten av forstyrrelsen eller tilstanden, og kan bestemmes ved hjelp av kliniske standardteknikker. Hvis mulig, er det ønskelig å bestemme antisense-cytotoksisiteten av tumortypen som skal behandles, in vitro, og så i egnede dyremodellsystemer før testing og anvendelse i mennesker. Farmasøytiske preparater omfattende Afogø-antisense-nukleinsyrer via liposomer, mikropartikler eller mikrokapsler kan anvendes. Det kan være nyttig å anvende slike preparater for oppnåelse av langvarig frigjøring av Atøgo-antisense-nukleinsyrene. Videre kan det være ønskelig å anvende liposomer som via antistoffer er innsiktet mot spesifikke identifiserbare tumor-antigener (Leonetti et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:2448-2451; Renneisen et al, 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342).

5.9 PÅVISNING AV TERAPEUTISK ELLER

PROFYLAKTISK ANVENDBARHET

Terapeutikaene kan testes fortrinnsvis in vitro og deretter in vivo med hensyn til den ønskede terapeutiske eller profylaktiske aktivitet, før anvendelse i mennesker. For eksempel vil in vitro-analyser som kan anvendes til å bestemme om hvorvidt administrering av et spesifikt terapeutikum er indikert, innbefatte in vitro-cellekultur-analyser hvor vevsprøve fra en pasient dyrkes i kultur og eksponeres for et terapeutikum eller får dette administrert på annen måte, og virkningen av dette terapeutikum på vevsprøven observeres. For eksempel kan et terapeutikum som er en inhibitor for Nogo-funksjon, analyseres ved måling av neuritt-nyvekst eller funksjonell gjenvinning av motorisk kontroll i pasienten.

In vitro-analyser kan utføres med representative celler av celletyper som inngår ved en forstyrrelse hos en pasient, for bestemmelse av om hvorvidt et terapeutikum har en ønsket virkning på slike celletyper.

Forbindelser for anvendelse ved terapi kan testes i egnede dyremodellsystemer før testing i mennesker, innbefattende, men ikke begrenset til, rotter, mus, kyllinger, kyr, aper, kaniner osv. For in vivo-testing kan det før administrering til mennesker anvendes hvilket som helst dyremodellsystem kjent på området.

5.10 TERAPEUTISK/PROFYLAKTISK

ADMINISTRERING OG PREPARATER

Fremgangsmåter for behandling (og profylakse) ved administrering av en effektiv mengde av et terapeutikum til et individ er mulig. Terapeutikumet kan da være betydelig renset. Individet er fortrinnsvis et dyr, så som kyr, griser, hester, kyllinger, katter, hunder osv., og er fortrinnsvis et pattedyr, og mest foretrukket et menneske. Individet kan også være et ikke-humant pattedyr.

Utformninger og fremgangsmåter for administrering som kan anvendes når terapeutikumet omfatter en nukleinsyre, er beskrevet ovenfor; ytterligere hensiktsmessige utformninger og administreringsmåter kan velges blant dem som er beskrevet i det følgende.

Forskjellige avgivelsessystemer er kjent og kan anvendes til administrering av et terapeutikum, f.eks. innkapsling i liposomer, mikropartikler, mikrokapsler, rekombinante celler som kan uttrykke terapeutikumet, reseptor-mediert endocytose (se f.eks.Wu og Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), konstruksjon av en terapeutisk nukleinsyre som en del av et retrovirus eller annen vektor osv. Innføringsmetoder kan innbefatte intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs, subkutan, intranasal, epidural og oral måte. Forbindelsene kan administreres på hvilken som helst hensiktsmessig måte, for eksempel ved infusjon eller bolusinjeksjon, ved absorpsjon gjennom epitel- eller mucokutane belegg (f.eks. munnslimhinne, rektal og intestinal slimhinne osv.), og kan administreres sammen med andre biologisk aktive midler. Administreringen kan være systemisk eller lokal. Det kan dessuten være ønskelig å innføre de farmasøytiske preparater i sentralnervesystemet på hvilken som helst egnet måte, innbefattende intraventrikulær og intrathecal injeksjon; intraventrikulær injeksjon kan gjøres lettere med et intraventrikulært kateter, for eksempel knyttet til et reservoar, så som et Ommaya-reservoar. Pulmonær administrering kan også anvendes, f.eks. ved anvendelse av en inhalator eller forstøver, og utforming med et aerosoliseringsmiddel.

Det kan være ønskelig å administrere de farmasøytiske preparater lokalt på området som trenger behandling; dette kan oppnås med for eksempel lokal infusjon under kirurgi, topisk påføring, f.eks. i forbindelse med en sårbandasje etter kirurgi, ved injeksjon, ved hjelp av et kateter, eller ved hjelp av et implantat, idet implantatet er av et porøst, ikke-porøst eller gelatinøst materiale, innbefattende membraner, så som sialastiske membraner, eller fibrer. Administreringen kan også skje ved direkte injeksjon på stedet (eller et tidligere sted) for en malign tumor eller neoplastisk eller pre-neoplastisk vev.

Terapeutikumet kan avgis i en vesikkel, spesielt et liposom (se Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al, i Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein og Fidler (red.), Liss, New York, s. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, samme sted, s. 317-327; se generelt samme sted).

Videre kan terapeutikumet avgis i et system med regulert frigjøring. En pumpe kan også anvendes (se Langer, som ovenfor; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al, Surgery 88:507 (1980); Saudek et al, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)) også polymere materialer kan anvendes (se Medical Applications of Controlled Release, Langer og Wise (red.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen og Ball (red.), Wiley, New York (1984); Ranger og Peppas, J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61

(1983); se også Levy et al, Science 228:190 (1985); During et al, Ann. Neurol. 25:351

(1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Videre kan et system med regulert frigjøring anbringes i nærheten av det terapeutiske mål, dvs. hjernen, hvorved det bare fordres en fraksjon av den systemiske dose (se f.eks. Goodson, i Medical Applications of Controlled Release, som ovenfor, vol. 2, s. 115-138 (1984)).

Andre systemer for regulert frigjøring er omtalt i oversikten ifølge Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Der hvor terapeutikumet er en nukleinsyre som koder for et protein-terapeutikum, kan nukleinsyren administreres in vivo for befordring av ekspresjon av dens kodede protein, ved at den konstrueres som en del av en hensiktsmessig nukleinsyre-ekspresjonsvektor og administreres slik at den blir intracellulær, f.eks.ved anvendelse av en retrovirusvektor (se US-patent nr. 4 980 286) eller ved direkte injeksjon, eller ved anvendelse av mikropartikkel-bombardering (f.eks. en genpistol; Biolistic, Dupont), eller belegging med lipider eller celleoverflatereseptorer eller transfekteirngsmidler, eller ved administrering av den i tilknytning til et homeoboks-liknende peptid som er kjent for å gå inn i kjernen (se f.eks. Joliot et al, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:1864-1868), osv. Alternativt kan et nukleinsyre-terapeutikum innføres intracellulært og innlemmes i vertscelle-DNA for ekspresjon, ved homolog rekombinasjon.

Farmasøytiske preparater kan omfatte en terapeutisk effektiv mengde av et terapeutikum, samt en farmasøytisk akseptabel bærer. «Farmasøytisk akseptabel» kan angi: godkjent av et regulerende organ i den føderale regjering eller en stats regjering, eller oppført i U.S. Farmakopé eller annen alminnelig anerkjent farmakopé for anvendelse i dyr, og mer spesielt i mennesker. Betegnelsen «bærer» angir et fortynningsmiddel, en adjuvans, et formgivningsmateriale eller et bærermateriale som terapeutikumet administreres med. Slike farmasøytiske bærere kan være sterile væsker, så som vann og oljer, innbefattende bærere av petroleum-, dyre-, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, så som jordnøttolje, soyaolje, mineralolje, sesamolje og liknende. Vann er en foretrukket bærer når det farmasøytiske preparat administreres intravenøst. Saltoppløsninger og vandige dekstrose- og glyceroloppløsninger kan også anvendes som flytende bærere, spesielt for injiserbare oppløsninger. Egnede farmasøytiske formgivningsmaterialer innbefatter stivelse, glukose, laktose, sakkarose, gelatin, malt, ris, mel, kritt, silikagel, natriumstearat, glycerolmonostearat, talk, natriumklorid, tørket skummet melk, glycerol, propylen, glykol, vann, etanol og liknende. Preparatet kan, om ønskelig, også inneholde mindre mengder av fuktemidler eller emulgeringsmidler, eller pH-bufringsmidler. Disse preparater kan ha form av oppløsninger, suspensjoner, emulsjoner, tabletter, piller, kapsler, pulver, utformninger med langvarig frigjøring, og liknende. Orale utformninger kan innbefatte standardbærere så som farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose, magnesiumkarbonat osv. Eksempler på egnede farmasøytiske bærere er beskrevet i «Remington's Pharmaceutical Sciences» av E.W. Martin. Slike preparater vil inneholde en terapeutisk effektiv mengde av terapeutikumet, fortrinnsvis i renset form, sammen med en egnet mengde bærer for tilveiebringelse av formen for hensiktsmessig administrering til pasienten. Utformningen bør passe til administreringsmåten.

Preparatet kan utformes i henhold til rutinemetoder som et farmasøytisk preparat tilpasset for intravenøs administrering til mennesker. Preparater for intravenøs administrering er typisk oppløsninger i steril isoton vandig buffer. Hvor nødvendig, kan preparatet også innbefatte et solubiliseirngsmiddel og et lokal- anestetikum så som lignocain for å lette smerten på injeksjonsstedet. Bestanddelene tilføres vanligvis enten separat eller sammenblandet i enhetsdoseirngsform, for eksempel som et tørt lyofilisert pulver eller vannfritt konsentrat i en hermetisk forseglet beholder så som en ampulle eller pute som angir mengden av den aktive bestanddel. Når preparatet skal administreres ved infusjon, kan det avgis med en infusjonsflaske inneholdende sterilt vann eller saltoppløsning av farmasøytisk kvalitet. Når preparatet administreres ved injeksjon, kan det tilveiebringes en ampulle med sterilt vann for injeksjon eller saltoppløsning slik at bestanddelene kan blandes før administrering.

Terapeutikaene kan utformes som nøytral form eller som saltform. Farmasøytisk akseptable salter innbefatter slike som dannes med frie aminogrupper, så som dem som fås fra saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, oksalsyre, vinsyre osv. og slike som dannes med frie karboksylgrupper så som dem som stammer fra natrium, kalium, ammonium, kalsium, jern(III)hydroksider, isopropylamin, trietylamin, 2-etylaminoetanol, histidin, procain osv.

Mengden av terapeutikumet som vil være effektiv ved behandling av en spesiell forstyrrelse eller tilstand, vil avhenge av beskaffenheten av forstyrrelsen eller tilstanden, og kan bestemmes ved kliniske standardteknikker. Dessuten kan in vitro-analyser eventuelt anvendes til å hjelpe til med identifisering av optimale doseringsområder. Den nøyaktige dose for anvendelse i preparatet vil også avhenge av administreringsmåten, samt graden av sykdommen eller forstyrrelsen, og bør avgjøres i henhold til bedømmelsen hos den utøvende lege og omstendighetene rundt hver pasient. Imidlertid er egnede doseringsområder for intravenøs administrering vanligvis ca. 20-500 mikrogram aktiv forbindelse pr. kilo kroppsvekt. Egnede doseringsområder for intranasal administrering er vanligvis omtrent fra 0,01 pg pr. kg kroppsvekt til 1 mg pr. kg kroppsvekt. Effektive doser kan ekstrapoleres fra doseresponskurver avledet fra in vitro- eller dyremodell-testsystemer.

En farmasøytisk pakke eller sett omfattende én eller flere beholdere fylt med én eller flere av bestanddelene i de farmasøytiske preparater er mulig å tilveiebringe. Sammen med slik(e) beholder(e) kan det eventuelt følge en meddelelse i den form som er foreskrevet av et regjeringsorgan som regulerer fremstilling, anvendelse eller salg av farmasøytiske midler eller biologiske produkter, hvilken meddelelse gjenspeiler godkjennelse av organet med hensyn til fremstilling, anvendelse eller salg for administrering til mennesker.

5.11 DIAGNOSTISERING OG SCREENING

Nogo-proteiner, analoger, derivater og subsekvenser derav, Afogø-nukleinsyrer (og sekvenser komplementære til disse), anti-Nogo-antistoffer, har anvendelser i diagnostiske preparater. Slike molekyler kan anvendes i analyser, så som immunanalyser, for påvisning, forutsigelse, diagnostisering eller kontrollering av forskjellige tilstander, sykdommer og forstyrrelser som påvirker Nogo-ekspresjonen, eller kontrollering av behandlingen av disse. En slik immunanalyse utføres spesielt ved hjelp av en metode som omfatter bringe sammen en prøve fra en pasient med et anti-Nogo-antistoff, under slike betingelser at immunspesifikk binding kan finne sted, og påvising eller måling av mengden av eventuell immunspesifikk binding av antistoffet. En slik binding av antistoff i vevssnitt kan anvendes til påvisning av avvikende Nogo-lokalisasjon eller avvikende (f.eks. lave eller fraværende) nivåer av Nogo. Antistoff mot Nogo kan anvendes til analysering av et pasientvev eller en serumprøve med hensyn til tilstedeværelse av Nogo hvor et avvikende nivå av Nogo er en indikasjon på en sykdomstilstand. Med «avvikende nivåer» menes økte eller nedsatte nivåer i forhold til det som er tilstede, eller et standardnivå som representerer det som er tilstede, i en analog prøve fra en del av kroppen eller fra et individ som ikke har forstyrrelsen. Immunanalysene som kan anvendes er konkurrerende og ikke-konkurrerende analysesystemer ved anvendelse av teknikker så som immunhistokjemi, patologi, Western blot, radioimmunanalyser, ELISA (enzymbundet immunsorpsjonsmiddel-analyse), «sandwich»-immunanalyser, immunutfellingsanalyser, utfellingsreaksjoner, geldiffusjonsutfellingsreaksjoner, immundiffusjonsanalyser, agglutineringsanalyser, komplementfikseringsanalyser, immunradiometriske analyser, fluorescens-immunanalyser, immunhistokjemianalyser, protein A-immunanalyser, bare for å nevne noen få.

Afogo-gener og beslektede nukleinsyresekvenser og -subsekvenser, innbefattende komplementære sekvenser, kan også anvendes i hybridiseringsanalyser. Nogo-nukleinsyresekvenser eller subsekvenser derav omfattende omtrent minst 8 nukleotider kan anvendes som hybridiseirngsprober. Hybridiseringsanalyser kan anvendes til påvisning, forutsigelse, diagnostisering eller kontrollering av tilstander, forstyrrelser eller sykdomstilstander forbundet med avvikende forandringer i Nogo-ekspresjon og/eller -aktivitet som beskrevet ovenfor. En slik hybridiseirngsanalyse utføres spesielt ved hjelp av en metode som omfatter at en prøve inneholdende nukleinsyre bringes i kontakt med en nukleinsyreprobe som kan hybridisere til Nogo- DNA eller -RNA, under betingelser slik at hybridisering kan finne sted, og eventuell resulterende hybridisering påvises eller måles.

Sykdommer og forstyrrelser innbefattende cellevekst- og utviklingsforstyrrelser kan diagnostiseres, eller det kan foretas screenings-undersøkelse med henblikk på en antatt tilstedeværelse av dem, eller det kan påvises en disposisjon for utvikling av slike forstyrrelser, ved påvisning av reduserte nivåer av Nogo-protein, Nogo-RNA eller funksjonell Nogo-aktivitet, som påvist ved vekstinhibering, eller ved påvisning av mutasjoner i Nogo-RNA, -DNA eller -protein (f.eks. translokasjoner i Nogo-nukleinsyrer, avkuttinger i Nogo-genet eller -proteinet, forandringer i nukleotid- eller aminosyresekvens i forhold til villtype-Nogo) som forårsaker redusert ekspresjon eller aktivitet av Nogo. Slike sykdommer og forstyrrelser kan innbefatte, de som er beskrevet i avsnitt 3 og avsnitt 5.8.1.1. Som eksempel kan nivåer av Nogo-protein påvises ved immunanalyse; nivåer av Nogo-RNA kan påvises ved hybridiseringsanalyser (f.eks. Northern blot, dot blot); Nogo-binding til cellevekst-inhibitorprotein-reseptorer kan utføres ved bindingsanalyser som er alminnelig kjent på området; translokasjoner og punktmutasjoner i Nogo-nukleinsyrer kan påvises ved Southern-blotting, RFLP-analysering, PCR med anvendelse av primere som fortrinnsvis frembringer et fragment som strekker seg over størstedelen av Nogo-genet, sekvensering av Nogo-genom-DNA eller -cDNA tatt fra pasienten, osv.

Utstyrssett for diagnostisk anvendelse er også mulig å tilveiebringe, som i én eller flere beholdere omfatter et anti-Nogo-antistoff, og eventuelt en merket bindingspartner til antistoffet. Anti-Nogo-antistoffet kan alternativt merkes (med en påvisbar markør, f.eks. en kjemiluminescerende, enzymatisk, fluorescerende eller radioaktiv del). Det er også tilveiebrakt utstyrssett sett som i én eller flere beholdere omfatter en nukleinsyre-probe som kan hybridisere til Nogo- KNA. Et sett kan, i én eller flere beholdere, omfatte et par primere (f.eks. hver i størrelsesområdet 6-30 nukleotider) som er i stand til priming-amplifikasjon [f.eks. ved polymerasekjedereaksjon (se f.eks. Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), ligasekjedereaksjon (se EP 320 308), anvendelse av QP-replikase, syklisk probereaksjon, eller andre metoder kjent på området] under passende reaksjonsbetingelser for minst en del av en Afogo-nukleinsyre. Et sett kan eventuelt videre omfatte, i en beholder, en for-bestemt mengde av et renset Nogo-protein eller -nukleinsyre, f.eks. for anvendelse som standard eller kontroll.

5.12 SCREENING MED HENBLIKK PÅ NOGO-AGONISTER OG - ANTAGONISTER

Nogo-nukleinsyrer, -proteiner og -derivater har også anvendelser i screening-analyser for påvisning av molekyler som spesifikt bindes til Nogo-nukleinsyrer, -proteiner eller - deri-vater, og som følgelig har potensiell anvendelse som agonister eller antagonister til Nogo, spesielt molekyler som således påvirker cellevekstregulering. Slike analyser for screening kan utføres med hensyn til molekyler med potensiell anvendbarhet som nervevekstpromoterer for legemiddelutvikling. Det er derfor mulig å fremskaffe analyser til påvisning av molekyler som spesifikt bindes til Nogo-nukleinsyrer, - proteiner eller -derivater. For eksempel kan rekombinante celler som uttrykker Nogo-nukleinsyrer, anvendes til rekombinant fremstilling av Nogo-proteiner i disse analyser, til screening med hensyn til molekyler som bindes til et Nogo-protein. Molekyler (f.eks. antatte bindingspartnere til Nogo) bringes i kontakt med Nogo-proteinet (eller fragmentet derav) under betingelser som bidrar til binding, og deretter identifiseres molekyler som spesifikt bindes til Nogo-proteinet. Liknende metoder kan anvendes til screening med hensyn til molekyler som bindes til Nogo-derivater eller -nukleinsyrer. Metoder som kan anvendes til utførelse av det forannevnte, er alminnelig kjent på området.

Som eksempel kan diversitets-biblioteker, så som biblioteker med tilfeldige eller kombinasjonspeptider eller ikke-peptider, screening-undersøkes med hensyn til molekyler som spesifikt bindes til Nogo. Mange biblioteker kjent på området kan anvendes, f.eks. kjemisk syntetiserte biblioteker, rekombinante (f.eks. fagfremvisningsbiblioteker) og in vitro-translasjonsbaserte biblioteker.

Eksempler på kjemisk syntetiserte biblioteker er beskrevet i Fodor et al, 1991, Science 251:767-773; Houghten et al, 1991, Nature 354:84-86; Lam et al, 1991, Nature 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallop et al, 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9): 1233-1251; Ohlmeyer et al, 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:10922-10926; Erb et al, 1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., 1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:1614-1618; Salmon et al, 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:11708-11712; PCT-publikasjon nr. WO 93/20242; og Brenner og Lerner, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:5381-5383.

Eksempler på fagfremvisningsbiblioteker er beskrevet i Scott og Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin et al, 1990, Science, 249:404-406; R.B. Christian et al, 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay et al., 1993, Gene 128:59-65; og PCT-publikasjon nr. WO 94/18318 datert 18. august 1994.

In vitro-translasjonsbaserte biblioteker kan innbefatte, de som er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 91/05058 datert 18. april 1991; og Mattheakis et al, 1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:9022-9026.

Som eksempler på ikkepeptid-biblioteker kan et benzodiazepin-bibliotek (se f.eks. Bunin et al, 1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:4708-4712) tilpasses for anvendelse. Peptoid-biblioteker (Simon et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9367-9371) kan også anvendes. Et annet eksempel på et bibliotek som kan anvendes, og hvor amid-funksjonalitetene i peptider er blitt permetylert for frembringelse av et kjemisk transformert kombinasjonsbibliotek, er beskrevet av Ostresh et al. (1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:11138-11142).

Screening av bibliotekene kan utføres ved hjelp av hvilken som helst av mange forskjellige alminnelig kjente metoder. Se f.eks. følgende referanser, som beskriver screening av peptidbiblioteker: Parmley og Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott og Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes et al, 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:5393-5397; Yu et al, 1994, Cell 76:933-945; Staudt et al, 1988, Science 241:577-580; Bock et al, 1992, Nature 355:564-566; Tuerk et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6988-6992; Ellington et al, 1992, Nature 355:850-852; US-patent nr. 5 096 815, US-patent nr. 5 223 409 og US-patent nr. 5 198 346; Rebar og Pabo, 1993, Science 263:671-673; og PCT-publikasjon nr. WO 94/18318.

Screening kan utføres ved sammenbringing av bibliotek-elementene med et Nogo-protein (eller -nukleinsyre eller -derivat) immobilisert på en fast fase, og høsting av de bibliotek-elementer som bindes til proteinet (eller nukleinsyren eller derivatet). Eksempler på slike screeningmetoder, betegnet «panning»-teknikker, er beskrevet ved eksempel i Parmley og Smith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkes et al, 1992, BioTechniques 13:422-427; PCT-publikasjon nr. WO 94/18318; og i referanser angitt i det foregående.

Tohybrid-systemet for selektering av vekselvirkende proteiner i gjærsopp (Fields og Song, 1989, Nature 340:245-246; Chien et al, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:9578-9582) kan anvendes til identifisering av molekyler som spesifikt bindes til et Nogo-protein eller -derivat.

5.13 DYREMODELLER

Dyremodeller er mulig å anvende som kan innbefatte modeller i mus, hamstere, sauer, griser, kveg og fortrinnsvis ikke-humane pattedyr.

Det er mulig å tilveiebringe dyremodeller for sykdommer og forstyrrelser som innbefatter neurittekstensjon, -vekst og -regenerering. Et slikt dyr kan innledningsvis dannes ved befordring av homolog rekombinasjon mellom et Nogo-gen i sitt kromosom og et eksogent Nogo-gen som er blitt gjort biologisk inaktivt (fortrinnsvis ved innføring av en heterolog sekvens, f.eks. et antibiotikaresistens-gen). Dette kan utføres ved homologe rekombinasjon ved transformering av embryo-avledede stam-(ES)-celler med en vektor inneholdende Nogo-genet som er blitt inaktivert ved innskudd, slik at homolog rekombinasjon finner sted, fulgt av injeksjon av ES-cellene i en blastocyste, og implantering av blastocysten i en fostermor, fulgt av fødsel av det kimæriske dyr («knockout-dyr») hvor et Nogo-gen er blitt inaktivert (se Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Det kimæriske dyr kan formeres under dannelse av ytterligere knockout-dyr. Slike dyr kan være mus, hamstere, sauer, griser, kveg, osv., og er fortrinnsvis ikke-humane pattedyr. Det er også mulig å danne en knockout-mus.

Slike knockout-dyr er ventet å utvikle, eller å være disponert for å utvikle, sykdommer eller forstyrrelser som innbefatter sentralnervesystemet, og kan følgelig ha anvendelse som dyremodeller for slike sykdommer og forstyrrelser, f.eks. for screening med henblikk på eller testing av molekyler (f.eks. potensielle terapeutika for forstyrrelser i nervesystemet) med hensyn til evnen til å inhibere tumorer i nervevev og følgelig behandle eller forebygge slike sykdommer eller forstyrrelser.

I det følgende følger eksempler og referanseeksempler

6. EKSEMPEL: KARAKTERISERING AV NUKLEOTIDET OG PROTEINPRODUKTET AV NOGO- GENET

Eksemplene beskrevet i det foreliggende viser at det klonede gen, Nogo, koder for et protein som er en potent nervecellevekst-inhibitor og som dessuten gjenkjennes av de monoklonale antistoffer beskrevet i Schwab et al., US-patent nr. 5 684 133.

6.1 MATERIALER OG METODER

De følgende avsnitt beskriver materialer og metoder

6.1.1 RENSING AV BOVINT NOGO FRA MYELIN

Alle rensetrinn ble utført ved 4°C, og aktiviteten av inhiberende substrat i de oppnådde fraksjoner ble rutinemessig bestemt ved NIH 3T3-utbredelses- og PC12-neurittutvekst-analysene (avsnitt 6.1.10). Bovine ryggmargsvev ble omhyggelig renset ved fjerning av meningene, og kuttet i små stykker. Myelinet ble så ekstrahert i ekstraksjonsbuffer (60 mM CHAPS, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0,10 mM EDTA-buffer, pH 8,0,2,5 mM jodacetamid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,1 ug/ml apotinin, 1 ug/ml leupeptin, 1Hg/ml pepstatin A).

For oppnåelse av ryggmarg-ekstrakt ble vevet homogenisert direkte i CHAPS - ekstraksjonsbuffer i forholdet (1:1, på vekt/volum-basis). Homogenatet ble sentrifugert to ganger ved 100 000 X g (Kontron type: K50,13, fast vinkel) i 1 time ved 4°C. Den klare supernatant (ekstrakt) ble umiddelbart påsatt på en Q-Sepharose-kolonne (2,6 X 11,5 cm), ekvilibrert i buffer A (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5% (på vekt/volumbasis) CHAPS). Bundne proteiner ble eluert med en femsjikts-volum lineær gradient på fra 0 til 1 M NaCl i buffer A (100 ml gradient på 50 minutter). Aktive fraksjoner inneholdende bovint NI220 eluerte rundt 0,4 M NaCl og ble blandet (q-blanding 1) for påfølgende påsettinger på Superdex 200 (2,6 X 60 cm) kolonner, ekvilibrert i buffer B (150 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5% (på vekt/volum-basis) CHAPS).

Aktive fraksjoner ble etter gelfiltrering (s-blanding 1) separert ved hjelp av 6% SDS-PAGE under reduserende betingelser og lav konstant energi (2 watt pr. gel) i totalt 2500 Volt-timer. Bånd og gelområder ble identifisert etter farging med Coomassie-blått (0,1 vekt/volum% R250 i 50% metanol og 10% eddiksyre), skåret ut og ekstrahert i 800^1 gel-elueringsbuffer (0,5 vekt/volum% CHAPS, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0,10 mM EDTA, pH 8,0,2,5 mM jodacetamid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,1^g/ml aprotinin, 1 Hg/ml leupeptin, 1^g/ml pepstatin A) i minst 48 timer ved 4°C.

6.1.2 MIKROSEKVENSERING AV RENSET NOGO

Det IN-l-nøytraliserbare aktive gel-eluerte materiale fra flere geler ble kjørt på nytt på en 10% SDS-polyakrylamid-gel under reduserende betingelser og farget med 0,1 vekt/volum% Coomassie-blått R250 i 50% metanol og 10% eddiksyre. 220 KDa-båndet ble skåret ut, og endoproteinase Lys-C-nedbrytning (molforhold 1:50) ble utført direkte i gelen. Prøven ble surgjort og påsatt på en reversert fase-høyytelses-væskekromatografi-kolonne, peptidene ble separert med en lineær gradient (0-100%) av 0,04% trifluoreddiksyre og 80% acetonitril, og fraksjoner inneholdende enkeltpeptidforbindelser ble underkastet automatisk Edman-nedbrytning.

6.1.3 ELEKTROFORESE AV RENSET NOGO

SDS-PAGE med høy oppløsning ble utført under anvendelse av 6 vekt/volum% SDS-polyakrylamidgeler (10 X 24 X 0,01 cm) under reduserende betingelser (100 mM ditiotreitol). Overføring på Immobilon-P-membraner (Millipore) ble utført i 20 mM Tris-base, 192 mM glycin, pH 8,3, 0,037 vekt/volum% SDS, 20% metanol, med et apparat for halvtørr overføring (Bio-Rad, Trans Blot SD). Overføringstiden var 2 timer med 0,8 mA/cm . Blokkeringsreagens (1 time ved romtemperatur) var 3% gelatin i PBS (fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,2, 8 g NaCl, 0,2 g KH2P04, 2,8 g Na2HP04.12 H20 og 0,2 g KC1, oppløst i 1 liter vann), og vaskeoppløsningen inneholdt 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,4% Tween (3X10 minutter ved romtemperatur). Inkuberingstid for det første antistoff (for fortynning med 1% gelatin i PBS) var vanligvis over natten ved 4°C. Pepperrotperoksidase-konjugert sekundært anti-muse-IgG-antistoff (1:2000) ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. ECL-kjemiluminescenssystemet ble anvendt for påvisning (Amersham Pharmacia Biotech).

6.1.4 cDNA- BIBLIOTEK- PROBING

Hvit substans ble dissekert friskt fra bovin ryggmarg, og poly(A)<+->RNA ble ekstrahert under anvendelse av FastTrack-settet (Invitrogen). Konstruksjon av cDNA-biblioteker ble utført under anvendelse av Uni-ZAP-settet (Stratagene) ifølge leverandørens instruksjoner. Bibliotekenes kompleksitet var større enn 4xl0<6>plakkdannende enheter totalt, og den gjennomsnittlige størrelse av innskuddene var omtrent 1,8 kilobaser.

Degenererte oligonukleotider MSC5-8 (MSC5:

TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEKV ID NR:50)) ble utformet fra bNI200-peptid 1-sekvensen, og MSC9 (GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA (SEKV ID NR:51)) ble utformet fra bNI220-peptid 2-sekvensen. Oligonukleotidene ble syntetisert ved hjelp av MWG Biotech (Munchenstein, Sveits) og merket med DIG DNA-3'-ende-merkingssettet. Riboprober ble syntetisert under anvendelse av DIG RNA-merkingssettet (Boehringer Mannheim).

Probehybridiserings- og vaskebetingelser var som beskrevet av leverandøren (MSC5-8 og MSC9 ble anvendt ved en hybridiserings- og vasketemperatur på 57°C. Probe-påvisning ble utført under anvendelse av CDP-stjernesystemet (Boehringer Mannheim). cDNA-bibliotekhåndtering og -screening ble foretatt i henhold til protokollene for lambda-ZAP-cDNA-biblioteker (Stratagene). Genescreen-(DuPont)-nylonmembraner ble anvendt for plakkløftinger.

6.1.5 DNA- SEKVENSERING

Begge strenger av CWP1-3, 01il8, OU3 og R1-3U21 ble sekvensert med Perkin Eimer AB1377-systemet ved Microsynth (Balgach, Sveits). DNA-sekvensene ble analysert ved hjelp av DNASIS-programmet (Hitachi). Database-søk ble utført med BLAST-programmet (NCBI).

6.1.6 RNA- ANALYSE

Total-RNA og poly(A)<+->RNA ble ekstrahert fra vev under anvendelse av henholdsvis RNAgent- (Promega) eller FastTrack-settet (Invitrogen). RNA ble separert ved elektroforese på 1% formaldehyd-geler og overført til Genescreen-membraner. Blot ble hybridisert med antisense-riboprober, som ble frembrakt med DIG RNA-merkingssettet (Boehringer Mannheim), ut fra relevante plasmider. Blot-hybridiserings-, vaske- og CDP-stjerne-påvisningsbetingelsene var som beskrevet av leverandøren. Den «felles» probe, EST111410 (TIGR, ATCC, Rockville, MD, USA) inneholder transkript A-sekvens mellom nukleotider 2535-4678, den ekson 1-spesifikke probe inneholder transkript A-sekvens mellom nukleotider 65-769, og den ekson 2-spesifikke probe inneholder transkript A-sekvens mellom nukleotidene 815-3183.

6.1.7 FREMSTILLING AV ANTISERA

Antiserum 472 (AS 472) ble frembrakt av Research Genetics, Inc. (Huntsville AL, USA) mot det syntetiske peptid P472, SYDSIKLEPENPPPYEEA (bovin sekvens; SEKV ID NR:33), som svarer til rotte-Nogo-aminosyresekvens 623-640 av SEKV ID NR:2, med tre umake par.

Antiserum Bruna (AS Bruna) ble frembrakt mot et fragment av rekombinant Nogo-protein, uttrykt i E. coli som et fusjonsprotein. Spesifikt ble den karboksyterminale ende av rotte-Nogo A-nukleotidsekvensen som koder for aminosyrene 762-1 163 i SEKV UD NR:2 (uttrykt i E. coli under anvendelse av Novagen-pET-systemet), anvendt til frembringelse av AS Bruna-anti-Nogo-antisera.

6.1.8 ELEKTROFORESE OG WESTERN BLOTTING

SDS-PAGE og Western-blotting ble utført ved hjelp av standardmetoder som er velkjente for fagfolk på området. Antistoffene ble fortynnet som følger: AS Bruna 1: 7 500; AS 472 1:2 000; anti-myc (9E10) 1:5 000 (Invitrogen); anti-BiP 2 ug/ml (Stressgen); mAb IN-l-hybridom-supernatant ble anvendt ufortynnet. Sekundære antistoffer var: HRP-konjugert anti-kanin (Pierce; 1:20 000); anti-muse-IgM (1:50 000); og alkalisk fosfatase-konjugert anti-mus (Milan Analytica AG, La Roche, Sveits; 1:5 000).

6.1.9 IMMUNHISTOKJEMI

Ryggmarg eller lillehjerne fra voksne rotter ble hurtig dissekert, innstøpt i OTC-forbindelse og frosset ved -40°C. Tjue post mortem-snitt ble kuttet og fiksert i etanol/eddiksyre ved 40°C. Immunmerking ble utført som beskrevet av Rubin et al., 1994, J. Neurocytol. 23:209-217, bortsett fra at bråslukningstrinnet ble utelatt. Vevssnittene ble alternativt fiksert med metanol (2 minutter ved -20°C), og immunmerking ble utført som ifølge Rubin et al, som ovenfor. Anvendte primære antistoffer var (antistoff: (fortynning)): Hybridom-supernatant av IN-1: (ufortynnet); AS Bruna (1:5000); eller affinitetsrenset AS 472: (1:50).

6.1.10 NIH 3T3- FIBROBLASTUTBREDELSESANALYSE

NIH 3T3-fibroblaster ble utplatet på dyrkningsskåler for-belagt med 5^g q-blanding pr. brønn (=1 cm<2>). Q-blanding er de blandede aktive fraksjoner av bovint ryggmarg-ekstrakt separert på en Q-sepharosekolonne. IN-1 ble anvendt som ufortynnet dyrkningssupernatant (1-10 ug/ml), AS Bruna og preimmunserum ble fortynnet 1:1000 i PBS, og AS 472 og preimmunserum ble fortynneet 1:500 i PBS. For å kompensere for aktivitetsvariasjoner i forskjellige q-blandingspreparater ble antallet av inhiberte, runde celler utplatet på q-blandingen normalisert til 100% og til 0% utplatet på bufferkontroll (Spillman et al, 1988, J. Biol. Chem. 273:19283-93).

6.1.11 DRG- NEURITTUTVEKSTANALYSE

Dorsalrot-ganglier (DRG) ble dissekert fra E16-embryokylling i Hank's balansert saltoppløsning (HBSS), delt i to deler og utplatet på skåler for-belagt med q-blanding i 100^1 F12-medium med 10% (FCS) og 1% metocel. Neuritt-utvekst fra individuelle DRG ble bedømt etter 24 timers inkubering ved 37°C på halv-kvantitativ måte under anvendelse av en skale på fra 0 (ingen utvekst) til 4 (maksimal utvekst).

6. 1. 12 ANALYSE AV DRG/ SYNSNERVE- KOKULTUR

Synsnerver ble dissekert fra voksne rotter, bestrålt med 5500 Gray og injisert enten med AS 472 eller det tilsvarende pre-immunserum (1:10 fortynning). Nervepar ble dyrket i 3-kammer-kulturer slik at én ende av hver nerve nådde gjennom en silikonfett/teflonring-barriere i midtkammeret, hvor dissosierte dyrkede primære DRG-neuroner fra P0-rotter ble anbrakt. Etter to uker i kultur ble nervene fiksert ved hjelp av standardteknikker kjent på området og innstøpt for elektronmikroskopi (EM), og ultratynne snitt ble tatt i en avstand på ca. 3,5 mm fra den DRG-eksponerte stump. Snittene ble systematisk analysert med henblikk på nærvær av ny-utvoksende aksoner, under anvendelse av et Zeiss EM 902.

6.1.13 NOGO A- EKSPRESJON ICOS- CELLER

Den åpne Nogo A-leseramme ble subklonet i pcDNA3.1mychis-vektoren (Invitrogen) under anvendelse av standard-kloningsteknikker kjent på området. Det resulterende plasmid (Nogo-mycl9) ga opphav til et rekombinant protein inneholdende Nogo A-sekvensen koplet til myc-his-merkematerialet (21 aminosyrer). Nogo-mycl9 (2^g DNA pr. 35 mm skål) eller kontrollplasmid (pcDNAmychisLacZ) ble transfektert i COS-celler under anvendelse av superfect (Qiagen) i henhold til leverandørens oppskrift. Transfekterte celler ble høstet 36-48 timer etter transfektering. Basert på immunfluorescensmerking med anti-myc-antistoff og enzymatisk p-galaktosidase- fargereaksjon ble den gjennomsnittlige transfeksjonshastighet beregnet til ca. 20%. Transfekterte COS-celler ble fiksert med 95% etanol/5% eddiksyre (4°C, 25 minutter), blokkert i PBS/10% FCS og inkubert med AS Bruna (1:200) eller IN-1 (1:2) i 2 timer i PBS /1% FCS ved romtemperatur. Cellene ble vasket med PBS og omsatt med fluorescerende sekundære antistoffer (geit-antikanin-FITC for AS Bruna og geit-antimus-TRITC for IN-1-påvisning, Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove,

PA).

6.1.14 OLIGODENDROCYTT- KULTURER

Oligodendrocytter isolert fra hjerne fra nyfødte rotter ble utplatet på 75 cm<2>polylysin-kolber (Sigma, St. Louis, MO) og dyrket i 10-12 dager i DMEM supplert med 5% FCS. Anrikede, blandede populasjoner av oligodendrocytter og deres progenitorceller ble frigjort fira astrocytt-monolaget ved rysting over natten ved 210 omdr. pr. min. i en orbital-ryster. Cellene ble utplatet med en tetthet på l-2xl06 celler på polylysin-belagte 35 cm<2>skåler. Progenitorcellene fikk differensiere i kjemisk definert medium (CDM) i 3-4 dager.

6.1.15 CELLEOVERFLATE- BIOTINYLERING

Kulturer av hel hjerne fra P4-rotter ble preparert som beskrevet i van der Haar et al.

(1998, J. Neurosci. Res. 51:371-81). På dag 7 in vitro ble de biotinylert med det celle-ugjennomtrengelige EZ-LINK-Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) som beskrevet, bortsett fra at alle trinnene ble utført ved 15°C, og cellene ble lysert i 1 ml lysebuffer (0,05 M NaH2P04pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,5% CHAPS (Sigma), 2,5 mM jodacetamid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,1 ug/ml aprotinin, 1 ^g/ml leupeptin, 1^g/ml pepstatin A). Biotinylerte proteiner ble immunutfelt med Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal), underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulose-membraner som ble probe-undersøkt med AS 472, a-BiP og a-P-tubulin. Membranene ble avdrevet med Re-Blot Western Blot-resirkuleringssett (Chemicon).

6.1.16 IMMUNCYTOKJEMI

Oligodendrocytter fra synsnerve ble preparert som beskrevet i Schwab og Caroni (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393). To dager gamle kulturer ble inkubert med AS 472 (1:200) eller mAb IN-1 (1:3 i medium i 25 minutter ved romtemperatur (rt). Kulturene ble vasket, fiksert med 4% paraformaldehyd / 5% sakkarose i PBS og blokkert i 0,1 M maleinsyre / 2% blokkeringsreagens (Boehringer Mannheim) i 1 time. Sekundære antistoffer konjugert med alkalisk fosfatase (Miulan Analytica) ble anvendt med 1:7 500 i 0,1 M maleinsyre /1% blokkeringsreagens (1 time, rt). Transfekterte COS-celler ble fiksert med 95% etanol / 5% eddiksyre (4°C, 25 minutter), blokkert og inkubert med AS Bruna (1:200) eller mAb IN-1 i 2 timer ved rt. Cellene ble omsatt med geit-antikanin-FITC og geit-antimus-TRITC (Jackson Immuno Research Lab).

6.1.17 SYNSNERVE- KAMMER

Synsnerve-par ble dyrket i et 3-kammers dyrkningssystem som beskevet i Schwab et al.

(1988, J. Neurosci. 8:2381-2393), injisert med og eksponert for enten AS 472 eller det tilsvarende preimmunserum (1:10). Synsnerver ble innleiret for elektronmikroskopi (EM), og ultratynne snitt ble tatt med en avstand på ca. 3,5 mm fra den DRG-eksponerte stump. Snittene ble systematisk analysert med hensyn til tilstedeværelse av ny-utvoksende aksoner, under anvendelse av et mikroskop av typen Zeiss EM 902.

6.2 FORSØKSRESULTATER

Følgende avsnitt beskriver forsøksresultatene oppnådd fra metodeavsnittene i 6.1 og under-avsnittene.

6.2.1 ISOLASJON AV NOGO- cDNA

Den bovine homolog til rotte-NI-250 ble renset, bNI220, og peptider fra det rensede protein ble frembrakt ved proteasenedbrytning. Multiple digoxygenin-merkede degenererte oligonukleotider ble utformet i henhold til seks forskjellige bNI220-peptidsekvenser. Flere cDNA-kloner ble isolert fra screeningen av et bovint hvitsubstans-bibliotek under anvendelse av disse oligonukleotider. Innskuddet i den lengste klon (CWP1-3, fig. la) ble anvendt til syntetisering av prober for påfølgende screening av rotte-cDNA-biblioteker. Selekterte kloner fra slike screening-analyser er vist på fig. la. DNA-sekvensanalyse av disse cDNA-kloner tydet på at tre forskjellige transkripter stammer fra ett gen, og dette gen ble betegnet Nogo. De forskjellige transkripter er sannsynligvis et resultat av både alternativ promoteranvendelse og alternativ spleising (Nogo A, Nogo B og Nogo C; fig. lb). DNA-sekvenser ble kompilert fra klonene vist på fig. IA under dannelse av transkript A, hvis DNA-sekvens er vist på fig. 2a.

Konseptuell translasjon av de tre transkripter gir opphav til proteinprodukter betegnet Nogo A (1163 aminosyrer), Nogo B (360 aminosyrer) og Nogo C (199 aminosyrer). Siden Nogo A inneholder alle de seks peptidsekvenser man fikk fra renset bNI220 (fig. 2b), er det sannsynligvis ekvivalent med det rensede protein, rotte-NI-250. Nogo A, B og C har en felles karboksyterminal ende på 188 aminosyrer (det felles doméne), og Nogo A og B deler en aminoterminal ende på 172 aminosyrer. Nogo A er 803 aminosyrer lengre enn Nogo B på grunn av alternativ spleising.

Ingen av Nogo-isoformene har en hydrofob periode av aminosyrer i den N-terminale ende, som kan anvendes som et vanlig signalpeptid. Det er imidlertid beskrevet proteiner som mangler et vanlig signalpeptid, men som likevel transporteres gjennom membraner, for eksempel fibroblast-vekstfaktor (Florkiewicz et al., 1995, J. Cell Physiology 162:388-399), ciliar neurotrofisk faktor (Sendtner et al, 1994, J. Neurobiology 25:1436-1353) og interleukin-1 (Rubartelli et al., 1990, EMBO J. 9:1503-1510). Membranproteiner så som kommissur-manglende (Tear et al., 1996, Neuron 16:501-514) mangler også et vanlig signalpeptid og innføres likevel i membranen.

Skjønt det ikke er noe stoppkodon i rammen i det antatte 5'-ikketranslaterte område som utvetydig vil definere startkodonet, tyder følgende tegn på at metioninet angitt på fig. 2a er startkodonet for Nogo A og Nogo B: (1) Sekvensen rundt dette antatte startkodon samsvarer godt med konsensus-sekvensen for translasjons-startseter (GCCGCC A/G CC ATGG; SEKV ID NR:34), (2) Det ble gjort utstrakte forsøk på å søke etter mer oppstrøms sekvenser både ved bibliotek-screening og 5'-RACE. Ingen av disse søk har resultert i identifikasjon av mer oppstrøms sekvenser; og (3) Eukaryot rekombinant Nogo A uttrykt fra ovennevnte metionin har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 200 kD, ifølge bestemmelse med SDS-PAGE, som ikke kan skjelnes fra endogent Nogo A frarotte-oligodendrocytter (fig. Ila).

6.2.2 NOGO- SEKVENSANALYSE

Nogo A inneholder sju potensielle N-glykosyleringsseter, men biokjemisk sannsynlighet tyder på at Nogo A ikke har noen hoved-polysakkaridkomponent. Nogo A har dessuten nitten gjenkjennelsesseter for PKC, og sju gjenkjennelsesseter for kaseinkinase II (fig. 2a). Alle de tre Nogo har to felles karboksyterminale hydrofobe doméner på henholdsvis 35 og 36 aminosyrer. Én av dem eller begge kan anvendes som trans- eller intramembran-doméner, noe som er i overensstemmelse med karakteriseringen av bNI220 som et integralt membranprotein. Nogo A (samt Nogo B og Nogo C) inneholder ikke noen mønstre av kjente celleadhesjonsmolekyler, ekstracellulære matriksproteiner eller andre styringsmolekyler.

Nogo-sekvenser ble anvendt til søking i forskjellige databaser etter homologe gener; det karboksyterminale felles doméne for de tre Nogo-produkter likner (62,5%) et identifisert humant gen, nsp ( cl 13 og s- rex i rotte, og chs- rex i kylling) (fig. 3). Et EST fra C elegans og et Drosophila melangogaster- EST har også betydelig likhet (henholdsvis 16,6% og 13,6%) både med Nogo og nsp i dette samme område. De karboksyterminale doméner på 180 aminosyrer hos både Nogo og Nsp er sterkt konserverte på tvers av pattedyrarter (henholdsvis 98,3% og 97,3%), noe som tyder på at de kan utføre liknende og essensielle funksjoner. Utenfor dette område er likheten for et gitt protein artene imellom også høy (73% mellom rotte- og bovint Nogo A; 76,2% mellom NSP-A og S-rexb; 50% mellom Chs-rexb og NSP-A eller S-rexb). Likheten mellom NSP'er og Nogo'er er imidlertid begrenset til deres karboksyterminale, hydrofobe, felles doméne (fig. 3a), og til den sure beskaffenheten av proteinene utenfor dette konserverte område. NSP'ene (NSP-A, -B og -C) er tidligere beskrevet som neuro-endokrine spesifikke produkter med ukjente funksjoner. In situ-hybridisering og immunhistologi viste en neuronal lokalisasjon av NSP'er i nervesystemet. Et annet humant gen, nsp-liknende-1, som også har et karboksyterminalt hydrofobt område med 50% likhet med både Nsp og Nogo, er nylig blitt identifisert.

6.2.3 NOGO- VEVSEKSPRESJON

Afogø-ekspresjonsmønsteret ble undersøkt ved hjelp av Northern-blotting og in situ-hybridisering. Når det ble anvendt en «felles» probe (avsnitt 6.1.6), ble tre hoved-Nogo-transkripter (betegnet: A - 4,6 kb; B - 2,6 kb; og C - 1,7 kb) påvist i synsnerven, ryggmargen og hjernebarken (fig. 4a). I dorsalrotganglier ble bare de to større transkripter påvist. Et hovedtranskript på 2,6 kb ble påvist i PC12-celle, mens et 4,6 kb bånd først kan påvises etter lange eksponeringer (fig. 4a). I isjasnerven ble lavere nivåer av transkripter påvist, idet båndet på 2,6 kb var hovedtranskriptet. Når ryggmarg- og PC 12-celle-poly (A)<+->RNA ble hybridisert til en ekson 1-spesifikk probe, ble bare transkriptene på 4,6 kb og 2,6 kb påvist; når lillehjerne- og skjelettmuskel-poly (A)<+->RNA ble hybridisert til en ekson 2-spesifikk probe, ble bare transkriptet på 4,6 kb i lillehjernen påvist (fig. 4b). Disse resultater bekrefter transkriptkartet vist på fig. IB. Northern blotting-resultater viste imidlertid også at Afogo-ekspresjon ikke er begrenset til nervesystemet (fig. 4c); Aføga-transkripter ble også påvist i skjelettmuskel (1,7 kb), nyre (2,6 kb og 1,7 kb), brusk (fra brystbenet, 1,7 kb), hud (1,7 kb), lunge (2,6 kb) og milt (2,6 kb). Bortsett fra når det gjelder skjelettmuskelen, som uttrykker Nogo C-transkripter på et høyt nivå, er nivået av Afogo-transkripter utenfor nervesystemet lavere enn nivået i nervesystemet. Så langt ser det ut til at Nogo A-transkriptene på 4,6 kb transkriberes unikt i nervesystemet.

In situ-hybridisering på CNS-vevssnitt fra voksne rotter, med anvendelse av den felles probe, viste moderat merking av rader av cellelegemer i den hvite substatns i forskjellige deler av hjernen og ryggmargen. Denne anordning er typisk for interfascikulære oligodendrocytter (fig. 5a, d). I tillegg til oligodendrocytter, uttrykker flere typer neuroner også Nogo-transkripter ved høye nivåer (fig. 5c, e). I lillehjernen viste dobbeltmerking av snitt med et anti-GFAP-antistoff og in situ-hybridisering lydelig en sterk merking av Purkinje-cellene med Nogo-proben, mens astrocyttene ikke var merket (fig. 5e, f). I synsnerver under utvikling ble Afogo-transkripter påvist så tidlig som postnatal-dag 0 (PO), dvs. flere dager før mRNA i hoved-myelinproteinene proteolipid-protein (PLP) og myelin-basisk protein (MBP) kan påvises (fig. 6). Denne tidspunkt-avpassing er i overensstemmelse med tilsynekomsten av de første galaktocerebrosid-positive oligodendrocytter og ekspresjon av en neurittvekst-inhiberende aktivitet, som kan nøytraliseres av IN-1.

Det ble frembrakt antisera mot et syntetisk peptid basert på en bovin Nogo A-spesifikk sekvens (AS 472), og mot en 45 kD rekombinant, partial-rotte-Nogo A (AS Bruna)

(avsnitt 6.1.7). AS 472 og AS Bruna gjenkjente begge et protein på ca. 200 kD i bovint myelin, og AS Bruna gjenkjente dessuten et 200 kD rotte-myelinprotein på Western blot (fig. 7). Snitt av ryggmarg og lillehjerne fra voksne rotter ble merket med AS 472, AS Bruna og IN-1. Når snittene ble fiksert med etanol/eddiksyre (en metode som var tidligere vist å være nødvendig for konservering og tilgjengelighet av IN-1-antigener), kunne det sees sterk merking av hvit substans/myelin for alle de tre antistoffer (fig. 8). Merking av oligodendrocytt-cellelegemer var spesielt tydelig med AS Bruna. Behandling av de friske frosne snitt med metanol i stedet for etanol/eddiksyre opphevet myelinmerkingen, bortsett fra når det gjaldt oligodendrocytt-cellelegemer.

AS Bruna og AS 472 merket også en del typer neuroner innbefattende motoriske neuroner i ryggmargen, og granulære og molekylære lag i lillehjernen. Purkinje-celler ble sterkt merket med AS 472 og AS Bruna, men det var ingen påvisbar merking med IN-1.

6.2.4 NOGO-ANTISTOFFER INHIBERER NOGO-

INDUSERT VEKST- INHIBERING IN VITRO

Halvrensede NI-220-preparater av bovin ryggmarg (q-blanding) kan forhindre NIH 3T3-fibroblastutbredelse og neuritt-utvekst. I nærvær av Nogo-antisera, enten AS Bruna, AS 472 eller IN-1, ble den inhiberende q-blandings-aktivitet redusert, dvs. at det foregikk NIH 3T3-fibroblastutbredelse, og dorsalrotganglier (DRG) fra embryoniske kyllinger strakk ut neurittene på skåler belagt med q-blanding (fig. 9). Spesifisitet ble påvist ved tilsetting av peptid P472, som var peptidet som ble anvendt til fremkallelse av AS 472

(avsnitt 6.1.7). P472 blokkerte på vellykket måte den inhiberende virkning av AS 472, mens et kontrollpeptid ikke hadde noen virkning på inhiberingen.

Videre ble tilstedeværelse av Nogo A på celleoverflaten av oligodendrocytter påvist immuncytokjemisk, funksjonelt og biokjemisk under anvendelse av AS 472. Når levende primære dyrkede oligodendrocytter ble merket med enten mAb IN-1 eller AS 472, ble det observert en forholdsvis svak (sammenliknet med immuncytokjemi for galakto-cerebrosid), men tydelig overflatemerking på differensierte oligodendrocytter (fig. 15a, c). Tilsetting av det konkurrerende peptid (P472) i forhold til AS 472 eller utelatelse av det primære antistoff opphevet den spesifikke merking (fig. 15b, d). Celleoverflate-biotinylering og påfølgende utfelling med streptavidin viste dessuten tilstedeværelse av Nogo A på plasmamembranen hos oligodendrocytter. I det utfelte materiale påviste AS 472 et bånd som gikk omtrent 40 kD over det intracellulære, sannsynligvis ikke-prosesserte og ikke-glykosylerte AS 472-immunpositive bånd. ER-proteinet BiP kunne ikke påvises i den biotinylerte fraksjon (fig. 15e).

Nogo A som et oligodendrocytt-overflatemolekyl ble også analysert funksjonelt. Ko-dyrking av oligodendrocytter og NIH 3T3-fibroblaster eller oligodendrocytter og DRG-neuroner viste tydelig de inhiberende egenskaper hos fullt utviklede oligodendrocytter. Disse analyser viser at NIH 3T3-fibroblastene og DRG-neurittene sterkt unngikk oligodendrocyttenes territorium, en effekt som ble nøytralisert av mAb IN-1.1 nærvær av AS 472 ble denne inhibering likeledes redusert (fig. 16a, b og e, f), mens pre-inkubering av AS 472 med P472 gjenopprettet den oligodendrocytt-medierte inhibering (fig. 16c, d og g, h). Kvantifisering viste den sterkt signifikante nøytraliserende evne hos mAb IN-1 og AS 472 i begge analysetyper (fig. 16i og j).

RecNogo-A (fig. 17a) fremstilt ved hjelp av en stabilt transfektert CHO-cellelinje ble testet med hensyn til sin aktivitet på NIH 3T3-fibroblastutbrdelse og DRG-neurittutvekst. Rekombinant fremstilt p-galaktosidase isolert fra en stabil CHO-cellelinje (CHO-LacZ) ble anriket parallelt med recNogo-A og ble anvendt som kontroll for inhiberende aktivitet av endogene CHO-proteiner i begge analyser. I NIH 3T3-fibroblastutbredelsesanalysen oppviste recNogo-A-holdig CHO-ekstrakt (Nogo A: ca. 1-5% av totalt protein; fig. 9a) tydelige inhiberende virkninger på celleutbredelsen i en mengde på 10^g/cm<2>(fig. 17b). Denne virkning var doseavhengig: i en mengde på 20fig/cm<2>var den inhiberende virkning høyere, mens 5^g/cm<2>ikke var inhiberende (data ikke vist). Den inhiberende virkning kunne nøytraliseres til bakgrunnsnivåer ved for-inkubering av det belagte protein med mAb IN-1 eller AS Bruna, mens et kontroll- antistoff mot galaktocerebrosid (mAb Ol)- eller AS Bruna-preimmunserum ikke hadde noen virkning (fig. 17b).

I tillegg til sin sterke effekt på NIH 3T3-fibroblastutbredelsen hadde recNogo-A-holdig CHO-ekstrakt, men ikke CHO-LacZ-ekstrakt, en potent inhiberende effekt på neuritt-utvekst fra primære dyrkede neuroner: Dissosierte DRG-neuroner ble inhibert av recNogo-A på en doseavhengig måte (fig. 17c). Denne inhiberende virkning kunne nøytraliseres av mAb IN-1, men ikke av kontrol-mAb Ol (fig. 17c-e). Rekombinant protein isolert fra CHO-LacZ var ikke inhiberende i en mengde på 1 og 5^g, og tilsetting av mAb Ol eller IN-1 hadde ingen effekt på neurittutvekst.

6.2.5 NEURITT- NYVEKST IN VITRO

Evnen hos DRG-neuritter fra nyfødt rotte til å regenereres og vokse gjennom fullt utviklet CNS-vev ble undersøkt. Par av synsnerver ble dissekert fra voksne rotter og dyrket i et spesielt kammerdyrkningssystem slik at DRG-neuritter hadde adkomst til én ende av hver nerve (fig. 10a). I hver kultur ble én av de to nerver injisert med og eksponert for pre-immun-kaninserum, den andre nerve ble injisert med AS 472, som også var tilstede i sidekammeret rundt nerven. Etter to uker in vitro i nærvær av NGF ble kulturene fiksert, tatt fra hverandre og innstøpt for elektronmikroskopi (EM). EM-snittene ble tatt omtrent 3,5 mm fra enden av nerven i kontakt med DRG-neuroner. Pre-immunserum-injiserte nerver inneholdt ingen eller bare noen få aksoner (fig. 10b). Sistnevnte ble eksklusivt funnet forbundet med basismembraner og astrocytter på nervenes overflate. I motsetning til dette inneholdt hovedandelen av synsnervene injisert med AS 472 betydelige antall aksoner, ofte opp til flere hundre. Kontakt med myelin kunne ofte sees (fig. 10c, d).

6.2.6 REKOMBINANT NOGO A- GJENKJENNELSE AV IN- 1

Når Nogo A ble uttrykt som et karboksyterminalt myc-his-merket rekombinant protein i transfekterte COS-celler, viste Western blotting med anvendelse av både anti-myc-antistoff og AS Bruna at det rekombinante Nogo A har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 200 kD på denaturerende SDS-geler (fig. 1 la). På den samme «blot» ble et bånd med liknende mobilitet påvist med AS Bruna i rotte-primærkultur-oligodendrocytter, noe som tydet på at rekombinant Nogo A har en nesten identisk molekylvekt med det endogene Nogo A fra oligodendrocytter (fig. la). Når transfekterte COS-celler ble merket med immunfluorescens med IN-1 og AS Bruna, gjenkjente IN-1 og AS Bruna de samme transfekterte celler (fig. 1 lb, c). Hovedandelen av immunreaktiviteten var lokalisert intracellulært og var tilgjengelig først etter permeabilisering.

6.2.7 KARTLEGGING AV DET ( DE) AKTIVE OMRÅDEfR) I NOGO

Det ble frembrakt en serie av delesjonsmutanter av Nogo for kartlegging av det (de) inhiberende doméne(r) eller område(r) i Nogo. Delesjonskonstruksjonene i Nogo- genet ble frembrakt ved anvendelse av indre restriksjonsseter, eksonuklease HI-mungbønne-nedbrytninger og polymerasekjedereaksjoner. En beskrivelse av mutantene er tilveiebrakt fig. 18 og den kortfattede beskrivelse av denne. Hovedandelen av konstruksjoner har en N-terminal T7-merking for identifikasjon med monoklonale anti-T7-antistoffer; samt et N- eller C-terminalt heksahistidin-merkemateriale («His-merking») for rensing med anvendelse av immobolisert Co(II)-affinitetskromatografi. Nogo-delesjonsmutantene, kalt NiG-Dl, NiG-D2, opp til NiG-D20, ble alle testet under anvendelse av NIH 3T3-fibroblast-utbredelsesanalysen for bestemmelse av inhiberende aktivitet. En del mutanter ble testet i PC12-neurittutvekst-, dissosiert rotte-DRG-neurittutvekst- eller retinalgangliestripe-analyser. Resultatene er vist i tabell 2 nedenfor. Et positivt resultat ved NIH 3T3-fibroblastanalysen (3T3) eller PC12-analysen oppnås når fibroblaster eller PC12-celler inhiberes med hensyn til utbredelse på en plate belagt med et preparat av Nogo tatt fra en delesjonsmutant. Et positivt resultat i analysen for embryokylling-dorsalrotganglie-neurittutvekst (DRG) eller analysen for ganglie-vekstkonussammenbrudd (RGC) viser at neuritt-utvekst inhiberes eller at det forårsakes at vekstkonusen bryter sammen i nærvær av et preparat av Nogo tatt fra en delesjonsmutant.

Dataene tyder på at et hoved-inhiberingsdoméne ble identifisert i det Nogo A-spesifikke område fra aminosyrenumre 172-974, spesielt aminosyrenumre 542-722. Dessuten var den N-terminale sekvens av Nogo A og Nogo B (aminosyrenumre 1-171) også inhiberende for 3T3-utbredelse. Basert på resultatene ser det ut til at områder av Nogo fra aminosyrenumre 172-259, og fra numre 975-1162, er ikke-essensielle og kan fjernes uten tap av inhiberende aktivitet.

7. EKSEMPEL: HUMANE NOGO-NUKLEINSYRER OG

- PROTEINER, - DERIVATER OG - FRAGMENTER

Det er mulig å tilveiebringe nukleotidsekvensene som koder for humant Nogo-protein, og fragmenter av humane Nogo-proteiner, innbefattende de humane ekvivalenter til rotte-Nogo A, -Nogo B og en del av -Nogo C. Den humane Nogo-aminosyresekvens er angitt på fig. 13 og er blitt betegnet SEKV ID NR:29.

Nukleotidsekvenser av fragmenter av det humane Nogo- gen. Den humane Nogo-nukleotidsekvens kan bestemmes under anvendelse av rotte-Nogo A-transkriptet som en hjelp til å innstille og spleise sammen humane uttrykte sekvensmerkematerialer (EST) som er homologe med rotte-cDNA-sekvensen eller den bovine cDNA-sekvens kan også tilveiebringes.

For eksempel overlapper EST AA081783 og AA333267 (avsnitt 5.1) med hverandre og svarer til rotte-Nogo A (fig. 2a; SEKV ID NR:l)-nukleinsyrestillinger 765-1272. EST AA322592, AA092565 og AA081525 (avsnitt 5.1) overlapper også med hverandre, og de overlappende sekvenser svarer til rotte-Nogo-nukleinsyrer 1642-2131. Disse to uavhengige sett av overlappende EST kan ikke innrettes under dannelse av den humane sekvens uten direkte datamaskinsammenlikning med rotte-Nogo-nukleotidsekvensen eller den bovine Nogo-nukleotidsekvens. Når det gjelder den innledende datamaskin-innretting, er ENTREZ Nucleotide QUERY foretrukket. Andre datamaskin-innretnings-programmer er oppført i avsnitt 5.1, som alternative eksempler, og er ikke ment å begrense rammen for datamaskinprogrammer som kan anvendes.

8. DRØFTING

8.1 KLONING AV NEURITTVEKST- INHIBITOREN NOGO

Nogo A har mange egenskaper som underbygger at det er det tidligere beskrevne rotte-NI-250, et hoved-neurittutvekst-inhiberende protein i CNS-myelin og antigenet til IN-1. På molekylnivå inneholder Nogo A alle de seks peptider opprinnelig oppnådd ved sekvensering av bNI-220, den mest inhiberende komponent i bovint ryggmarg-myelin. På ekspresjonsnivået er oligodendrocytter hoved-celletypen i fullt utviklet CNS for Nogo A-ekspresjon, og tidsinnstillingen for Afogo-ekspresjon i synsnerven passer til den tidligere beskrivelse av en IN-1-inhiberende aktivitet av nøytralisert mye lin med hensyn til neurittvekst. Videre viste Western-blotting tilstedeværelse av Nogo A i aktive q-blandingsfraksjoner, og hvit substans fra forskjellige CNS-områder ble merket med AS Bruna samt AS 472 (spesifikt for Nogo A) i et mønster identisk med mønsteret for IN-1. Begge disse fakta er i overensstemmelse med den tolkning at Nogo A er NI-250.

To antisera frembrakt mot Nogo A-sekvenser, AS Bruna og AS 472, reduserte sterkt den inhiberende virkning av et delvis renset preparat av bovin ryggmarg (q-blanding). AS 472 muliggjorde også innvekst av store antall dorsalrotganglie-aksoner over flere millimeter i fullt utviklede synsnerve-eksplantater, meget likt IN-1.

Skjønt den beregnede molekylvekt for Nogo A er ca. 140 kD, har det en tilsynelatende molekylvekt på ca. 200 kD på denaturerende SDS-geler, som er i området for den tidligere beregning på ca. 250 kD. Den avvikende mobilitet av Nogo A i SDS-geler forårsakes sannsynligvis av dets sure beskaffenhet snarere enn post-translasjonelle modifikasjoner. Avvikende mobilitet av proteiner på SDS-PAGE er blitt postulert for andre sterkt sure proteiner så som det vekst-tilknyttede protein GAP-43, samt NSP-A. Dessuten har bakterielt uttrykt rekombinant Nogo A den samme tilsynelatende molekylvekt som for det endogene Nogo A uttrykt av rotte-oligodendrocytter. Dette taler mot større modifikasjoner av Nogo A ved en mekanisme så som glykosylering.

8.2 NOGO FORHINDRER REGENERERING OG BEGRENSER

PLASTISITET AV DET FULLT UTVIKLEDE CNS

Ekspresjon av Nogo i synsnerve-oligodendrocytter fra rotter fra PO og videre samsvarer godt med de tidligere funn når det gjelder en IN-l-nøytraliserbar neurittvekst-inhiberende aktivitet. Denne ekspresjon går forut for ekspresjonen av hoved-myelinproteinene og kompakt myelindannelse, med flere dager, noe som er interessant. Tilsynekomst av Nogo, eventuelt som svar på aksonsignaler, kan forhindre ytterligere aksonvekst i de tilsvarende fibersystemer (aksonnumrene har en topp ved E20 i rotte-synsnerver). Nogo kan også inhibere kollateral dannelse og derved stabilisere den generelle struktur av det differensierte CNS. I grå substans i forskjellige CNS-områder samsvarer innholdet av mye lin og IN-1-immunreaktivitet omvendt med nivået av GAP-43 og det plastiske potensial i de gitte områder. Faktisk muliggjør IN-1-antistoffer påført på det fullt utviklede CNS at det kan finne sted utskyting og plastisitet i hjernestammen og ryggmargen i et omfang som tidligere bare er kjent for CNS hos nyfødte. Den store funksjonelle restitusjon som er parallel med denne plastisitet, angir at utskytende aksoner er i stand til å danne funksjonelt hensiktsmessige forbindelser.

Det er tidligere påvist at responsen hos neuroner overfor inhiberende Nogo-proteiner er forskjellig imellom neuroner i forskjellige aldrer. Dette skyldes sannsynligvis en

differensialekspresjon av reseptorer, som forhåpentligvis snart vil blikarakterisert. Som for netriner og mange vekstfaktorer, forblir eksistensen av forskjellige Nogo-reseptorer, som setter i gang forskjellige responser, en mulighet. Det faktum at Nogo-proteiner også uttrykkes i noen typer neuroner, peker mot mulige vekselvirkninger mellom disse og/eller forskjellige Nogo-isoformer.

8.3 NOGO HØRER TIL EN NY FAMILIE AV

NEURITTREGULERINGS- MOLEKYLER

Sekvensanalyse av Nogo viser ingen kjente mønstre hos celleoverflate- eller matriksproteiner som inngår i aksonstyring (repulsiv eller attraktiv); dvs. at ingen immunglobulin-, fibronektin type IH- eller EGF-doméner kan identifiseres. Heller ikke var det homologi med beskrevne nervevekst-inhibitorer, semaforinene, netrinene eller efrinene.

Nogo-proteiner utgjør en ny familie med en gruppe nylig beskrevne proteiner, NSP/s-rex-proteinene og de NSP-liknende 1-proteiner, basert på likheten mellom deres karboksyterminale 180 aminosyrer. I likhet med Nogo, er både alternativ promoteranvendelse (både Nsp og Nsp- liknende i-gen) og alternativ spleising (kun Nsp) ansvarlig for dannelsen av alternative proteinprodukter med felles karboksyterminale ender inneholdende to perioder av hydrofobe aminosyrer. Som angitt ved navnet, uttrykkes NSP'ene (neuroendokrin-spesifikke proteiner) hovedsakelig i neuroner og flere endokrine celletyper. De er hovedsakelig lokalisert intracellulært i tilknytning til det endoplasmatiske retikulum. Det NSP liknende 1-gen uttrykkes hovedsakelig i hjerne og muskel. Funksjonene er ikke kjent verken for NSP eller de NSP-liknende 1-familier. Det faktum at potensielle ortologer finnes i både C. elegans og Drosophila melanogaster tyder på at Nogo, med sin nerve-regenererende og utskytings-inhiberende aktivitet, kan være et nylig utviklet og hittil ubeskrevet medlem av NSP-familien.

8.4 NOGO IIKKE- NEURONALE VEV

Nogo C-transkriptet uttrykkes i skjelettmuskel i et nivå som er sammenliknbart med nivået i nervesystemet. Én tenkelig funksjon av muskel-Nogo C er å drive tilbake motoriske aksoner og begrense dem til det motoriske endeplateområde. Lave nivåer av Afogo-ekspresjon kan også påvises i andre ikke-nervevev. Den observerte inhibering av fibroblast- og astrocyttutbredelse med myelinekstrakt og NI-250 hentyder til nærvær av reseptorer og responsmekanismer for Nogo-proteiner i disse celler. Dette tyder på en mulig generell funksjon av Nogo-proteiner ved kontaktinhibering av cellebevegelse.

Claims

1. Renset humant protein,karakterisert vedat det består av en aminosyresekvens med mer enn 95% identitet over hele lengden til SEQ ID NO: 29 og som er (i) fritt for alt sentralnervesystem-myelinmateriale som det er naturlig forbundet med og (ii) som har en inhibitorisk effekt på nevritt utvekst.

2. Protein ifølge krav 1,karakterisert vedat proteinet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 29, der en eller flere aminosyrerester innenfor sekvensen er konservativt substituert med en annen aminosyre med en tilsvarende polaritet som virker som en funksjonell ekvivalent, hvilket resulterer i en stum endring.

3. Protein ifølge kravene 1 eller 2,karakterisert vedat det kodes for av en første nukleinsyre som er hybridiserbar med en andre nukleinsyre bestående av nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1.

4. Protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat nevnte protein er uglykosylert.

5. Fusjonsprotein eller kimært protein,karakterisert vedat det omfatter proteinet ifølge kravene 1 til 4.

6. Isolert nukleinsyre,karakterisert vedat det koder for proteinet ifølge krav 1.

7. Nukleinsyre ifølge krav 6,karakterisert vedat nevnte nukleinsyre a) er i stand til å hybridisere med en andre nukleinsyre, hvor nevnte andre nukleinsyre består av en nukleotidsekvens komplementær med en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid bestående av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 29 og b) som koder for et naturlig forekommende protein som binder til et protein som består av aminosyresekvensen SEQ ID NO: 29.

8. Isolert nukleinsyre ifølge krav 7,karakterisert vedat den koder for et naturlig forekommende humant protein.

9. Kloningsvektor,karakterisert vedat den omfatter nukleinsyren ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 8 operasjonelt koblet til en ikke-nativ promoter.

10. Vektor ifølge krav 9,karakterisert vedat vektoren er en ekspresjonsvektor.

11. Rekombinant celle,karakterisert vedat den er transformert med nuleinsyren ifølge SEQ ID NO: 1 eller med vektoren ifølge et hvilket som helst av kravene 9 og 10.

12. Rekombinant celle ifølge krav 11,karakterisert vedat den er en prokaryot eller eukaryot rekombinant celle.

13. Fremgangsmåte for å fremstille proteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedat den omfatter: (a) dyrking av cellen ifølge krav 11 eller 12; og (b) gjenvinne nevnte protein.

14. Protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5 for anvendelse som et medikament.

15. Anvendelse av et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor proteinet er aktivt ved å inhibere celleproliferering hos et individ, for fremstilling av et medikament for behandling av en neoplastisk sykdom i sentralnervesystemet, der den neoplastiske sykdommen er gliom, glioblastom, medulloblastom, kraniofaryngiom, ependymom, pineaiom, hemangioblastom, akustisk neurom, oligodendrogliom, menangiom, neuroblastom eller retinoblastom.

16. Anvendelse i følge krav 15, der individet er et menneske.