JP2783450B2 - 脳由来神経栄養因子 - Google Patents
脳由来神経栄養因子Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、脳由来神経栄養（neurotrophic）因子（BD
NF）をコードする核酸配列、このものから多量に産生さ
れる実質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメ
ントまたは誘導体、並びにBDNFタンパク質、そのペプチ
ドフラグメントまたは誘導体に対する抗体に関する。加
えて、本発明は新たに定義されたBDNF/NGF遺伝子ファミ
リーのメンバーである遺伝子およびそれらの遺伝子産物
に関する。本発明はまた、有効量のBDNF遺伝子産物ある
いは代わりにBDNF遺伝子産物に対する抗体を含有する医
薬組成物、およびアルツハイマー病およびパーキンソン
病を含む種々の神経学的疾病および障害の診断および治
療法に関する。特に、本発明のBDNF遺伝子産物は、感覚
性ニューロン障害並びに網膜の変性性障害の診断および
治療に価値がある。
NF）をコードする核酸配列、このものから多量に産生さ
れる実質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメ
ントまたは誘導体、並びにBDNFタンパク質、そのペプチ
ドフラグメントまたは誘導体に対する抗体に関する。加
えて、本発明は新たに定義されたBDNF/NGF遺伝子ファミ
リーのメンバーである遺伝子およびそれらの遺伝子産物
に関する。本発明はまた、有効量のBDNF遺伝子産物ある
いは代わりにBDNF遺伝子産物に対する抗体を含有する医
薬組成物、およびアルツハイマー病およびパーキンソン
病を含む種々の神経学的疾病および障害の診断および治
療法に関する。特に、本発明のBDNF遺伝子産物は、感覚
性ニューロン障害並びに網膜の変性性障害の診断および
治療に価値がある。
発明の背景 （１） 神経系の発達におけるニューロン細胞死および
神経栄養因子の役割 脊椎神経系の多くの部分にわたり、成体動物に見出さ
れるよりも多くのニューロンが初期発達期間中に存在す
る。初期発達期間は、自然に生ずるニューロン細胞死の
波によって特徴付けられる（CarrおよびSimpson,1978,
J.Comp.Neurol.182:727−740;Cowanら,1984,Science 22
5:1258−1265）。発達中のニューロンの生存、分化およ
び成熟は、厳密な固有の遺伝子プログラムによるという
よりも環境的なあるいは「後成的」因子によって調節さ
れ得る。例えば、ニワトリ胚の実験的操作では、ニワト
リ発達の初期段階において、肢芽または目のような末梢
「標的領域」の移植または摘出により、肥大されたある
いは欠失した標的領域に隣接した多数の知覚性、交感神
経性、副交感神経性または運動性ニューロンがそれぞれ
相当して増加または減少されうることが示されている
（Hamburger,1934,J.Exp.Zool.68:449;HollydayおよびH
amburger,1976,J.Comp.Neurol.,170:311−321;Landmess
erおよびPilar,1976,J.Cell.Biol.,68:357−374）。標
的領域は、限定された数のニューロンしかサポートせ
ず、そして発達過程の正常部分は、標的組織の「神経栄
養」能力に整合するために過剰の数のニューロンを排除
したものでありうる。ここで神経成長因子（NGF）と呼
ばれるタンパク質の発見および単離により、標的が、生
存しその組織を神経支配する多数のニューロンをいかに
して調節しうるかという分子仮説に達している（Levi−
Montalciniら,1968,Physiol Rev.,48:524−569;Thoenen
およびBarde,1980 Physiol Rev.,60:1284−1335）。
神経栄養因子の役割 脊椎神経系の多くの部分にわたり、成体動物に見出さ
れるよりも多くのニューロンが初期発達期間中に存在す
る。初期発達期間は、自然に生ずるニューロン細胞死の
波によって特徴付けられる（CarrおよびSimpson,1978,
J.Comp.Neurol.182:727−740;Cowanら,1984,Science 22
5:1258−1265）。発達中のニューロンの生存、分化およ
び成熟は、厳密な固有の遺伝子プログラムによるという
よりも環境的なあるいは「後成的」因子によって調節さ
れ得る。例えば、ニワトリ胚の実験的操作では、ニワト
リ発達の初期段階において、肢芽または目のような末梢
「標的領域」の移植または摘出により、肥大されたある
いは欠失した標的領域に隣接した多数の知覚性、交感神
経性、副交感神経性または運動性ニューロンがそれぞれ
相当して増加または減少されうることが示されている
（Hamburger,1934,J.Exp.Zool.68:449;HollydayおよびH
amburger,1976,J.Comp.Neurol.,170:311−321;Landmess
erおよびPilar,1976,J.Cell.Biol.,68:357−374）。標
的領域は、限定された数のニューロンしかサポートせ
ず、そして発達過程の正常部分は、標的組織の「神経栄
養」能力に整合するために過剰の数のニューロンを排除
したものでありうる。ここで神経成長因子（NGF）と呼
ばれるタンパク質の発見および単離により、標的が、生
存しその組織を神経支配する多数のニューロンをいかに
して調節しうるかという分子仮説に達している（Levi−
Montalciniら,1968,Physiol Rev.,48:524−569;Thoenen
およびBarde,1980 Physiol Rev.,60:1284−1335）。
少なくとも末梢神経系においては、ニューロン標的組
織が特異的な種類のニューロンの生存にとって決定的に
重要である限定された量の種々の神経栄養分子を合成し
そして放出することが今や充分に確立されている（Kors
chingおよびThoenen,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
0:3513−3516;Heumannら,1984,EMBO J.3:3183−3189;Sh
eltonおよびReichardt,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.81:7051−7955;KorschingおよびThoenen,1985,Neuros
ci.Lett.54:201−205）。
織が特異的な種類のニューロンの生存にとって決定的に
重要である限定された量の種々の神経栄養分子を合成し
そして放出することが今や充分に確立されている（Kors
chingおよびThoenen,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
0:3513−3516;Heumannら,1984,EMBO J.3:3183−3189;Sh
eltonおよびReichardt,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.81:7051−7955;KorschingおよびThoenen,1985,Neuros
ci.Lett.54:201−205）。
（２） 神経成長因子 神経成長因子（NGF）は、これらの神経栄養分子のう
ちでは最もはるかに特徴的で、そしてインビトロおよび
インビボの両方でニワトリおよびラットの両方の初期発
達の際の交感神経および神経稜−由来感覚性ニューロン
の生存に必須であることが示されている（Levi−Montal
ciniおよびAngeletti,1963,Develop.Biol.7:653−659;L
evi−Montalciniら,1968,Physiol.Rev.,48:524−56
9）。発達中のニワトリ胚への精製NGFの注射により、脊
椎感覚性ニューロンおよび交感神経ニューロンの大量の
過形成および肥大が引き起こされることが見出されてい
る（Levi−MontalciniおよびBooker,1960,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.46:373−384;Hamburgerら,1981,J.Neuros
ci.1:60−71）。逆に、新生ラットに抗−NGF抗体を毎日
注射することにより内因性NGFの除去または封鎖が交感
神経系の事実上の破壊と関連付けられている（Levi−Mo
ntalciniおよびBooker,1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.46:384−391;Levi−MontalciniおよびAngeletti,196
6,Pharmacol.Rev.18:619−628）。子宮内抗体注射によ
るかあるいは母性抗体の受動経胎盤転移のいずれかによ
る発達中のいっそう初期におけるNGF抗体への曝露は、
神経稜−由来感覚性ニューロン、例えば脊椎および背中
側三叉神経感覚性ニューロンの実質的な損失を来すこと
が示されている（Goederら,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.81:1580−1584;GorinおよびJohnson,1979,Proc.N
atl.Acad,Sci.U.S.A.76:5382−5386）。近年まで、NGF
のほとんど全ての研究は、末梢神経系におけるその役割
について集中していたが、ここでNGFが中枢神経系にお
けるニューロンの特定の母集団の発達および維持にも影
響することが明らかとなった（Thoenenら,1987,Rev.Phy
siol.Biochem.Parmacol.109:145−178;Whittemoreおよ
びSeiger,1987,Brain Res.Rev.12:439−464）。
ちでは最もはるかに特徴的で、そしてインビトロおよび
インビボの両方でニワトリおよびラットの両方の初期発
達の際の交感神経および神経稜−由来感覚性ニューロン
の生存に必須であることが示されている（Levi−Montal
ciniおよびAngeletti,1963,Develop.Biol.7:653−659;L
evi−Montalciniら,1968,Physiol.Rev.,48:524−56
9）。発達中のニワトリ胚への精製NGFの注射により、脊
椎感覚性ニューロンおよび交感神経ニューロンの大量の
過形成および肥大が引き起こされることが見出されてい
る（Levi−MontalciniおよびBooker,1960,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.46:373−384;Hamburgerら,1981,J.Neuros
ci.1:60−71）。逆に、新生ラットに抗−NGF抗体を毎日
注射することにより内因性NGFの除去または封鎖が交感
神経系の事実上の破壊と関連付けられている（Levi−Mo
ntalciniおよびBooker,1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.46:384−391;Levi−MontalciniおよびAngeletti,196
6,Pharmacol.Rev.18:619−628）。子宮内抗体注射によ
るかあるいは母性抗体の受動経胎盤転移のいずれかによ
る発達中のいっそう初期におけるNGF抗体への曝露は、
神経稜−由来感覚性ニューロン、例えば脊椎および背中
側三叉神経感覚性ニューロンの実質的な損失を来すこと
が示されている（Goederら,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.81:1580−1584;GorinおよびJohnson,1979,Proc.N
atl.Acad,Sci.U.S.A.76:5382−5386）。近年まで、NGF
のほとんど全ての研究は、末梢神経系におけるその役割
について集中していたが、ここでNGFが中枢神経系にお
けるニューロンの特定の母集団の発達および維持にも影
響することが明らかとなった（Thoenenら,1987,Rev.Phy
siol.Biochem.Parmacol.109:145−178;Whittemoreおよ
びSeiger,1987,Brain Res.Rev.12:439−464）。
成体雄マウスの顎下腺における多量のNGFタンパク質
の偶然の発見（Cohen,1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
46:302−311）および早期の、ヘビ毒液における高レベ
ルのNGFの発見（CohenおよびLevi−Montalcini,1956,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.42,571−574）により、NGFの
生理学、タンパク質化学およびより最近の分子生物学
（すなわち、NGFおよびそのレセプターの分子クローン
ニング）に関連する研究ができるに十分な量のNGFが幸
運にも提供されることになった。成体雄マウス唾液腺に
おける多量のNGFの機能は未知のままであるが、この豊
富なNGF源は、末梢または中枢神経系の発達または維持
に何の役割も果たさないかもしれないと思われる。NGF
感受性ニューロン（生存に関してはNGFに依存し、高ア
フィニティNGFレセプターを有し、そして高い特異性を
以てNGFを内在化しかつ逆行的に移送することが示され
ているニューロン）によって神経支配される標的組織に
おいては、NGFの定常状態の測定可能レベルは極端に低
く、成体雄マウス唾液腺組織における1000倍高いレベル
と比較して組織１グラム当たりピコグラムまたはナノグ
ラムの範囲であることが見出されている。NGFは、血清
中で何ら認識しうるレベルで見出されておらず、それゆ
えに循環性成長因子またはホルモンであるとは思われな
い（Sudaら,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:4042−
4046）。
の偶然の発見（Cohen,1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
46:302−311）および早期の、ヘビ毒液における高レベ
ルのNGFの発見（CohenおよびLevi−Montalcini,1956,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.42,571−574）により、NGFの
生理学、タンパク質化学およびより最近の分子生物学
（すなわち、NGFおよびそのレセプターの分子クローン
ニング）に関連する研究ができるに十分な量のNGFが幸
運にも提供されることになった。成体雄マウス唾液腺に
おける多量のNGFの機能は未知のままであるが、この豊
富なNGF源は、末梢または中枢神経系の発達または維持
に何の役割も果たさないかもしれないと思われる。NGF
感受性ニューロン（生存に関してはNGFに依存し、高ア
フィニティNGFレセプターを有し、そして高い特異性を
以てNGFを内在化しかつ逆行的に移送することが示され
ているニューロン）によって神経支配される標的組織に
おいては、NGFの定常状態の測定可能レベルは極端に低
く、成体雄マウス唾液腺組織における1000倍高いレベル
と比較して組織１グラム当たりピコグラムまたはナノグ
ラムの範囲であることが見出されている。NGFは、血清
中で何ら認識しうるレベルで見出されておらず、それゆ
えに循環性成長因子またはホルモンであるとは思われな
い（Sudaら,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:4042−
4046）。
マウス顎下腺におけるNGFタンパク質の主要源の重要
な発見に加えて、感度が高く、信頼できそして効率的な
生物学的アッセイの発展が、NGFの生物学および生化学
的解明に主要な役割を果たしている。発達中のニワトリ
胚の背根神経節（DRG）は、インビトロにおいてNGFに応
答することが示される第１の種類のニューロンの一つで
ある。血漿凝塊におけるE8−E12ニワトリDRGの外植培養
物およびより最近、ニワトリDRGの解離されたニューロ
ン富化−培養物がNGF活性に関する（例えば精製の際）
およびNGF生物学のインビトロ研究に関するバイオアッ
セイにおいて非常に有効であることが判明している（Le
vi−Montalciniら,1954,Cancer Res.4:49−57;Levi−Mo
ntalciniおよびAngeletti,1963,Develop.Biol.1:653−6
59;Greene,1977,Develop.Biol.58:96,同58:106）。40以
上のDRGが１個のニワトリ胚から切除できることから、
多くの研究室においてNGFバイオアッセイが広く用いら
れてきている。
な発見に加えて、感度が高く、信頼できそして効率的な
生物学的アッセイの発展が、NGFの生物学および生化学
的解明に主要な役割を果たしている。発達中のニワトリ
胚の背根神経節（DRG）は、インビトロにおいてNGFに応
答することが示される第１の種類のニューロンの一つで
ある。血漿凝塊におけるE8−E12ニワトリDRGの外植培養
物およびより最近、ニワトリDRGの解離されたニューロ
ン富化−培養物がNGF活性に関する（例えば精製の際）
およびNGF生物学のインビトロ研究に関するバイオアッ
セイにおいて非常に有効であることが判明している（Le
vi−Montalciniら,1954,Cancer Res.4:49−57;Levi−Mo
ntalciniおよびAngeletti,1963,Develop.Biol.1:653−6
59;Greene,1977,Develop.Biol.58:96,同58:106）。40以
上のDRGが１個のニワトリ胚から切除できることから、
多くの研究室においてNGFバイオアッセイが広く用いら
れてきている。
多量のNGFタンパク質が入手しうることおよび効率的
なNGFアッセイシステムに加えて、NGFの生物学に関する
本発明者学の理解に多大に寄与してきた第３の主な要因
は、NGFに対する抗体がモルモット、ウサギ、ヒツジ等
において比較的容易に生成されうることである。すなわ
ち、マウスNGFは免疫原性が高いと思われる。Cohenは
（1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46:302−311）、マ
ウス顎下腺から精製したNGFに対する抗体を生成させ、
そしてLevi−MontalciniおよびBookerとともに（1960,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46:384−391）、これらの抗
体が新生ラットに毎日投与された場合交感神経節の破壊
あるいは「免疫交感神経切除」（Levi−Montalciniおよ
びAngeletti,1966,Pharmacol.Rev.18:619−628）を引き
起こすことを示した。
なNGFアッセイシステムに加えて、NGFの生物学に関する
本発明者学の理解に多大に寄与してきた第３の主な要因
は、NGFに対する抗体がモルモット、ウサギ、ヒツジ等
において比較的容易に生成されうることである。すなわ
ち、マウスNGFは免疫原性が高いと思われる。Cohenは
（1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46:302−311）、マ
ウス顎下腺から精製したNGFに対する抗体を生成させ、
そしてLevi−MontalciniおよびBookerとともに（1960,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46:384−391）、これらの抗
体が新生ラットに毎日投与された場合交感神経節の破壊
あるいは「免疫交感神経切除」（Levi−Montalciniおよ
びAngeletti,1966,Pharmacol.Rev.18:619−628）を引き
起こすことを示した。
豊富なNGFタンパク質により、比較的慣用のタンパク
質化学によって主要な配列が決定できた（Angelettiお
よびBradshaw,1971,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.68:2417
−2420）。NGF遺伝子は今や、マウス（Scottら,1983,Na
ture 302:538−540）、ヒト（Ullrichら,1983,Nature 3
03:821−825）、雌ウシおよびニワトリ（Meierら,1986,
EMBO J.5:1489−1493）およびラット（Whittemoreら,19
88,J.Neurosci.Res.,20:402−410）を含む多くの種か
ら、好適なオリゴヌクレオチドプローブを設計するため
にマウスNGFのタンパク質配列の利用に基づく本質的に
慣用の分子生物学を用いてクローン化されている。ま
た、豊富なNGFの入手可能さゆえに、NGFレセプターに関
する研究が大いに促進され、このことがヒトおよびラッ
トからのNGFレセプターの分子クローンニングを最終的
に可能にした（Johnsonら,1986,Cell,47:545−554;Rade
keら,1987,Nature 325:593−597）。
質化学によって主要な配列が決定できた（Angelettiお
よびBradshaw,1971,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.68:2417
−2420）。NGF遺伝子は今や、マウス（Scottら,1983,Na
ture 302:538−540）、ヒト（Ullrichら,1983,Nature 3
03:821−825）、雌ウシおよびニワトリ（Meierら,1986,
EMBO J.5:1489−1493）およびラット（Whittemoreら,19
88,J.Neurosci.Res.,20:402−410）を含む多くの種か
ら、好適なオリゴヌクレオチドプローブを設計するため
にマウスNGFのタンパク質配列の利用に基づく本質的に
慣用の分子生物学を用いてクローン化されている。ま
た、豊富なNGFの入手可能さゆえに、NGFレセプターに関
する研究が大いに促進され、このことがヒトおよびラッ
トからのNGFレセプターの分子クローンニングを最終的
に可能にした（Johnsonら,1986,Cell,47:545−554;Rade
keら,1987,Nature 325:593−597）。
NGFが遍在する神経栄養因子でないことは充分に確立
されている。末梢神経系内で、NGFはインビボおよびイ
ンビトロの両方の研究から決定された通り、副交感神経
ニューロン、神経プラコード−由来感覚性ニューロンま
たは腸ニューロンに関する生存因子でないらしい。更
に、NGFは発達中の運動性ニューロンに関する生存因子
でないらしい（Oppenheim,1982,J.Comp.Neurol.210:174
−189）。但しこれらのニューロンが発達中にNGFレセプ
ターの少なくとも低アフィニティ形を発現するとは思わ
ないが（Raivichら,1985,EMBO J.4:637−644）。これら
のニューロン型に対するNGFの効果の欠如により、その
他の神経栄養因子、特に脊髄運動性ニューロンおよび／
または毛様神経節の副交感神経ニューロンの生存を維持
する因子に関する研究が促進されている。
されている。末梢神経系内で、NGFはインビボおよびイ
ンビトロの両方の研究から決定された通り、副交感神経
ニューロン、神経プラコード−由来感覚性ニューロンま
たは腸ニューロンに関する生存因子でないらしい。更
に、NGFは発達中の運動性ニューロンに関する生存因子
でないらしい（Oppenheim,1982,J.Comp.Neurol.210:174
−189）。但しこれらのニューロンが発達中にNGFレセプ
ターの少なくとも低アフィニティ形を発現するとは思わ
ないが（Raivichら,1985,EMBO J.4:637−644）。これら
のニューロン型に対するNGFの効果の欠如により、その
他の神経栄養因子、特に脊髄運動性ニューロンおよび／
または毛様神経節の副交感神経ニューロンの生存を維持
する因子に関する研究が促進されている。
（３） その他の神経栄養因子 ここ10年来、多種多様の組織の抽出物におけるおよび
多くの異なる種類の細胞の馴化培地における神経栄養活
性物の報告が多数存在する。しかしながらほとんど全て
の場合において、これら活性物が極めて少量、すなわち
組織1g当たりピコグラムないしナノグラムの範囲でしか
存在しないという事実によりかかる活性物の精製および
特性決定の進歩が妨げられている。
多くの異なる種類の細胞の馴化培地における神経栄養活
性物の報告が多数存在する。しかしながらほとんど全て
の場合において、これら活性物が極めて少量、すなわち
組織1g当たりピコグラムないしナノグラムの範囲でしか
存在しないという事実によりかかる活性物の精製および
特性決定の進歩が妨げられている。
更に、適当なバイオアッセイが末梢ニューロンについ
ては確立されているが、中枢神経系ニューロンに関する
意図する信頼でき、再現性がありかつ特異的なアッセイ
は問題があることが判明している。個々の種類の末梢神
経はばらばらの、容易に切開可能な神経節として見出さ
れているが、中枢神経系（CNS）ニューロンはそれらの
分布において不変に高い異質性を有する。従って、特異
的マーカーが特定のクラスのCNSニューロンの同定また
は富化のいずれかに必要とされる。かかるマーカー、例
えば細胞表面または細胞骨格成分に対して生成された抗
体の進展、または特異的な組織学的染色は非常に制限さ
れている。従って、（ｉ）NGF程豊富でなく、（ii）ア
ッセイが困難であり、そして（iii）抗体産生を引き出
すに十分な量で入手できない、神経栄養因子の特性決定
が甚だ困難な方法であることは判っている。
ては確立されているが、中枢神経系ニューロンに関する
意図する信頼でき、再現性がありかつ特異的なアッセイ
は問題があることが判明している。個々の種類の末梢神
経はばらばらの、容易に切開可能な神経節として見出さ
れているが、中枢神経系（CNS）ニューロンはそれらの
分布において不変に高い異質性を有する。従って、特異
的マーカーが特定のクラスのCNSニューロンの同定また
は富化のいずれかに必要とされる。かかるマーカー、例
えば細胞表面または細胞骨格成分に対して生成された抗
体の進展、または特異的な組織学的染色は非常に制限さ
れている。従って、（ｉ）NGF程豊富でなく、（ii）ア
ッセイが困難であり、そして（iii）抗体産生を引き出
すに十分な量で入手できない、神経栄養因子の特性決定
が甚だ困難な方法であることは判っている。
（3.1）脳由来神経栄養因子（BDNF）と神経成長因子と
の比較 インビトロにおいて胚のニワトリ背根神経節ニューロ
ンの生存を維持できる神経栄養活性物は、ラットＣ−６
神経膠腫細胞を培養した「馴化培地」中で確認された
（Bardeら,1978,Nature 274:818）。この活性物は、マ
ウスNGFに対する抗体によって中和されず、馴化培地に
おける他の神経栄養因子の存在が示唆される。次いで、
NGF抗体によって遮蔽され得なかった同様の活性物が定
常成体ラット脳大グリア細胞の培養物中で（Lindsay,19
79,Nature 282:80−82;Lindsayら,1982,Brain Res.243:
329−343）、および発達中並びに成体ラット脳（Barde
ら,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1199−1203）お
よび発達中および成熟ニワトリ脊髄（LindsayおよびPet
ers,1984,Neurosci,12:45−51）の抽出物中で報告され
た。しかしながら、全ての場合において活性因子は単離
も同定もされておらず、そして観察された活性が同一因
子によるものかまたは異なる因子によるものかの疑問が
残っている。
の比較 インビトロにおいて胚のニワトリ背根神経節ニューロ
ンの生存を維持できる神経栄養活性物は、ラットＣ−６
神経膠腫細胞を培養した「馴化培地」中で確認された
（Bardeら,1978,Nature 274:818）。この活性物は、マ
ウスNGFに対する抗体によって中和されず、馴化培地に
おける他の神経栄養因子の存在が示唆される。次いで、
NGF抗体によって遮蔽され得なかった同様の活性物が定
常成体ラット脳大グリア細胞の培養物中で（Lindsay,19
79,Nature 282:80−82;Lindsayら,1982,Brain Res.243:
329−343）、および発達中並びに成体ラット脳（Barde
ら,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1199−1203）お
よび発達中および成熟ニワトリ脊髄（LindsayおよびPet
ers,1984,Neurosci,12:45−51）の抽出物中で報告され
た。しかしながら、全ての場合において活性因子は単離
も同定もされておらず、そして観察された活性が同一因
子によるものかまたは異なる因子によるものかの疑問が
残っている。
ブタ脳を出発物質として使用して、Barde等（1982,EM
BO J.1:549−553）は、今や脳−由来神経栄養因子（BDN
F）と命名され、そしてE10/E11ニワトリ胚からの背根神
経節ニューロンの生存を促進するらしい因子を報告し
た。神経栄養活性は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
ゲル電気泳動において12.3kD分子量のシングルバンドと
して移動する高い塩基性タンパク質（等電点,pI＞10.
1）にあることが見出された。精製ファクターは、1.4×
106であると概算されたが、収量が非常に低く、1.5kgの
ブタ脳から約１μｇのBDNFしか精製されなかった。更
に、精製工程の最終段階が調製的ゲル電気泳動であるの
で、BDNFの活性は残留SDSの存在に派生して完全には復
元できなかった（BardeおよびThoenen,1985,“Hormones
and Cell Regulation",Vol.9,Dumontら，編、Elsevier
Science Publishers,pp.385−390）。BDNFの高度の塩
基性および分子サイズは、NGFモノマーに非常に類似す
ることが注目された。しかしながら、BDNFは、（ａ）ニ
ワトリ背根神経節バイオアッセイにおいて、NGFに対す
る抗体がBDNFの生物学的活性に対して何ら明らかな作用
を及ぼさず、（ｂ）BDNFおよびNGFの効果が付加的であ
ると思われ、そして（ｃ）NGFとは異なり、BDNFがE12ニ
ワトリ胚交感神経ニューロンの生存に対してなんらの作
用も有していないことが判明したという点で、NGFの既
知の性質とは異なる性質を有していることが明らかとな
った。加えて、脳抽出物を用いる早期の研究の際、これ
らの供給源からの神経栄養活性がNGFに関連するよりも
発達のより後期段階で感覚性ニューロンに対して作用す
るらしいことが観察された。ポリカチオン性基質、例え
ばポリリジンまたはポリオルチニン上で培養されたニワ
トリ胚ニューロンの解離培養物を用いると、BDNFは、E1
0−11（胚日数10または11）背根神経節ニューロンの30
パーセント以上の生存を持続させることが見出されてい
るが、E6における同一ニューロンの生存に対する影響は
ほとんどないと思われた（Bardeら,1980,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.77:1199−1203前出）。同様の条件下に、N
GFは、E6 DRGニューロンの30〜40パーセントの生存を支
えた。興味深いことに、細胞外マトリックス糖タンパク
ラミニンで被覆した基質上で培養した場合に、NGFとBDN
Fの両方がE6−E12令のニワトリ胚からのDRGニューロン
の約50パーセントの生存を持続させることが後に見出さ
れた（Lindsayら,1985,Develop.Biol.112:319−328）。
後者の研究において、NGFおよびBDNFの効果が、両者が
飽和濃度で存在する場合に付加的であることが見出され
た。
BO J.1:549−553）は、今や脳−由来神経栄養因子（BDN
F）と命名され、そしてE10/E11ニワトリ胚からの背根神
経節ニューロンの生存を促進するらしい因子を報告し
た。神経栄養活性は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
ゲル電気泳動において12.3kD分子量のシングルバンドと
して移動する高い塩基性タンパク質（等電点,pI＞10.
1）にあることが見出された。精製ファクターは、1.4×
106であると概算されたが、収量が非常に低く、1.5kgの
ブタ脳から約１μｇのBDNFしか精製されなかった。更
に、精製工程の最終段階が調製的ゲル電気泳動であるの
で、BDNFの活性は残留SDSの存在に派生して完全には復
元できなかった（BardeおよびThoenen,1985,“Hormones
and Cell Regulation",Vol.9,Dumontら，編、Elsevier
Science Publishers,pp.385−390）。BDNFの高度の塩
基性および分子サイズは、NGFモノマーに非常に類似す
ることが注目された。しかしながら、BDNFは、（ａ）ニ
ワトリ背根神経節バイオアッセイにおいて、NGFに対す
る抗体がBDNFの生物学的活性に対して何ら明らかな作用
を及ぼさず、（ｂ）BDNFおよびNGFの効果が付加的であ
ると思われ、そして（ｃ）NGFとは異なり、BDNFがE12ニ
ワトリ胚交感神経ニューロンの生存に対してなんらの作
用も有していないことが判明したという点で、NGFの既
知の性質とは異なる性質を有していることが明らかとな
った。加えて、脳抽出物を用いる早期の研究の際、これ
らの供給源からの神経栄養活性がNGFに関連するよりも
発達のより後期段階で感覚性ニューロンに対して作用す
るらしいことが観察された。ポリカチオン性基質、例え
ばポリリジンまたはポリオルチニン上で培養されたニワ
トリ胚ニューロンの解離培養物を用いると、BDNFは、E1
0−11（胚日数10または11）背根神経節ニューロンの30
パーセント以上の生存を持続させることが見出されてい
るが、E6における同一ニューロンの生存に対する影響は
ほとんどないと思われた（Bardeら,1980,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.77:1199−1203前出）。同様の条件下に、N
GFは、E6 DRGニューロンの30〜40パーセントの生存を支
えた。興味深いことに、細胞外マトリックス糖タンパク
ラミニンで被覆した基質上で培養した場合に、NGFとBDN
Fの両方がE6−E12令のニワトリ胚からのDRGニューロン
の約50パーセントの生存を持続させることが後に見出さ
れた（Lindsayら,1985,Develop.Biol.112:319−328）。
後者の研究において、NGFおよびBDNFの効果が、両者が
飽和濃度で存在する場合に付加的であることが見出され
た。
NGFのニューロン特異性に関するLevi−Montalcini（1
966,The Harvey Lectures 60:217−259）による初期の
研究では、NGFがニワトリのある種の頭蓋知覚神経節の
ニューロン、特に第10脳神経の結節性神経節に対してな
んら作用を有していないことが明らかになったので、NG
Fが感覚性ニューロンに関しても遍在性神経栄養因子で
はないことが示唆された。後のインビボ研究（Johnson
ら,1980,Science 210:916−918;Pearsonら,1983 Develo
p.Biol.96:32−36）では、胚形成の際のNGF不在がラッ
トの大部分の頭蓋骨知覚神経節におけるニューロンの生
存に何らの作用も及ぼさず、一方同様な処置が神経稜由
来の知覚神経節におけるニューロン総数を著しく涸渇さ
せることが示された。より詳細なインビトロ研究（Lind
sayおよびRohrer,1985,Develop.Biol.112:30−48;Davie
sおよびLindsay,1985,Develop.Biol.111:62−72;Lindsa
yら,1985,J.Cell.Sci.Suppl.3:115−129）では、NGFが
大部分の神経稜−由来感覚性ニューロンの生存を持続さ
せるが、神経プラコード由来の頭蓋感覚性ニューロンの
生存に対して何ら明らかな作用を有しないことが明示さ
れている。
966,The Harvey Lectures 60:217−259）による初期の
研究では、NGFがニワトリのある種の頭蓋知覚神経節の
ニューロン、特に第10脳神経の結節性神経節に対してな
んら作用を有していないことが明らかになったので、NG
Fが感覚性ニューロンに関しても遍在性神経栄養因子で
はないことが示唆された。後のインビボ研究（Johnson
ら,1980,Science 210:916−918;Pearsonら,1983 Develo
p.Biol.96:32−36）では、胚形成の際のNGF不在がラッ
トの大部分の頭蓋骨知覚神経節におけるニューロンの生
存に何らの作用も及ぼさず、一方同様な処置が神経稜由
来の知覚神経節におけるニューロン総数を著しく涸渇さ
せることが示された。より詳細なインビトロ研究（Lind
sayおよびRohrer,1985,Develop.Biol.112:30−48;Davie
sおよびLindsay,1985,Develop.Biol.111:62−72;Lindsa
yら,1985,J.Cell.Sci.Suppl.3:115−129）では、NGFが
大部分の神経稜−由来感覚性ニューロンの生存を持続さ
せるが、神経プラコード由来の頭蓋感覚性ニューロンの
生存に対して何ら明らかな作用を有しないことが明示さ
れている。
NGFのそれとは異なるBDNFのニューロン特異性の第１
の証拠は、精製BDNFがE6、E9またはE12でのニワトリ胚
の神経プラコード由来結節性神経節から解離された感覚
性ニューロンの40〜50％の生存を持続させるというイン
ビトロ例証である（Lindsayら,1985,J.Cell.Sci.Supp.
3:115−129）。NGFは、それ自身によってもあるいはBDN
Fと一緒でもこれらのニューロンに対する明らかな効果
を有していない。後に、外植培養研究において、BDNFが
錐体、膝状および腹側外側三叉神経神経節を含む他の神
経プラコード由来知覚神経節の生存および軸索が伸び出
るのを支持すると思われることが示されたが（Davies
ら,1986,J.Neurosci.6:1897−1904）、これらのいずれ
もNGFに対して感受性であるとは判明していない。上記
の研究の全てにおいて、NGFに対する抗体は、BDNFの観
察された活性に何らの作用も及ぼさなかった。末梢神経
節からの培養ニューロンに及ぼすその作用に加えて、BD
NFは、ウズラ神経稜から培養された細胞の生存およびニ
ューロン分化を刺激することが見出された（Kalcheimお
よびGendreau,1988,Develop.Brain Res.41:79−86）。
の証拠は、精製BDNFがE6、E9またはE12でのニワトリ胚
の神経プラコード由来結節性神経節から解離された感覚
性ニューロンの40〜50％の生存を持続させるというイン
ビトロ例証である（Lindsayら,1985,J.Cell.Sci.Supp.
3:115−129）。NGFは、それ自身によってもあるいはBDN
Fと一緒でもこれらのニューロンに対する明らかな効果
を有していない。後に、外植培養研究において、BDNFが
錐体、膝状および腹側外側三叉神経神経節を含む他の神
経プラコード由来知覚神経節の生存および軸索が伸び出
るのを支持すると思われることが示されたが（Davies
ら,1986,J.Neurosci.6:1897−1904）、これらのいずれ
もNGFに対して感受性であるとは判明していない。上記
の研究の全てにおいて、NGFに対する抗体は、BDNFの観
察された活性に何らの作用も及ぼさなかった。末梢神経
節からの培養ニューロンに及ぼすその作用に加えて、BD
NFは、ウズラ神経稜から培養された細胞の生存およびニ
ューロン分化を刺激することが見出された（Kalcheimお
よびGendreau,1988,Develop.Brain Res.41:79−86）。
本発明以前には、免疫化にとって十分な量のBDNFを生
産できないことが、ニューロン集団に及ぼすこれらの作
用を抗−NGF抗体と比較するための抗−BDNF抗体の生産
を妨げており、そしてBDNF/NGF交差−中和実験を妨げて
いた。しかしながら、BDNFを用いる二つの最近の研究で
は（Kalcheimら,1987,EMBO J.6:2871−2873;Hoferおよ
びBarde,1988,Nature 331:261−262）、鳥類PNS発達に
おけるBDNFの生理学的役割が示されている。機械的バリ
アを卵子内でE3/E4 DRG（胚日数３〜４の背根神経節）
と神経管中のそれらのCNS標的との間に置いた場合、多
くのDRGニューロンが死ぬことが観察された（Kalcheim
およびLe Douarin,1986,Develop.Biol.116:451−46
6）。このニューロン死がCNS（神経管）由来神経栄養因
子不在によるものであるかも知れないと仮定された。続
いて、ラミニン被覆シアラスティック（sialastic）膜
に結合したBDNFがこの細胞死を防止できることが観察さ
れた（Kalcheimら,1987,EMBO J.6:2871−2873）。BDNF
の発達中のウズラ卵への注射は、結節性神経節における
自然に生じる細胞死を減少させることが見出され、この
効果はNGFでは見られないものであった（HoferおよびBa
rde,1988,Nature 331:261−262）。神経稜および神経プ
ラコード両起源の末梢感覚性ニューロンに対するその作
用に加えて、BDNFは、発達中のCNSニューロンの生存を
持続させることが見出された。Johnson等は（1986,J.Ne
urosci.6:3031−3938）、BDNFがE17ラット胚から培養さ
れた網膜神経節細胞の生存を持続させることを示すデー
タを提示している。これは、馴化培地および網膜神経節
細胞の標的領域から調製された脳抽出物がこれらのニュ
ーロンの生存を支えると思われることを示した先の研究
に一致している（McCafferyら,1982,Ex.Brain Res.48:3
7−386;Sarthyら,1983,J.Neurosci.3:2532−2544;Turne
rら,1983,Dev.Brain Res.6:77−83）。
産できないことが、ニューロン集団に及ぼすこれらの作
用を抗−NGF抗体と比較するための抗−BDNF抗体の生産
を妨げており、そしてBDNF/NGF交差−中和実験を妨げて
いた。しかしながら、BDNFを用いる二つの最近の研究で
は（Kalcheimら,1987,EMBO J.6:2871−2873;Hoferおよ
びBarde,1988,Nature 331:261−262）、鳥類PNS発達に
おけるBDNFの生理学的役割が示されている。機械的バリ
アを卵子内でE3/E4 DRG（胚日数３〜４の背根神経節）
と神経管中のそれらのCNS標的との間に置いた場合、多
くのDRGニューロンが死ぬことが観察された（Kalcheim
およびLe Douarin,1986,Develop.Biol.116:451−46
6）。このニューロン死がCNS（神経管）由来神経栄養因
子不在によるものであるかも知れないと仮定された。続
いて、ラミニン被覆シアラスティック（sialastic）膜
に結合したBDNFがこの細胞死を防止できることが観察さ
れた（Kalcheimら,1987,EMBO J.6:2871−2873）。BDNF
の発達中のウズラ卵への注射は、結節性神経節における
自然に生じる細胞死を減少させることが見出され、この
効果はNGFでは見られないものであった（HoferおよびBa
rde,1988,Nature 331:261−262）。神経稜および神経プ
ラコード両起源の末梢感覚性ニューロンに対するその作
用に加えて、BDNFは、発達中のCNSニューロンの生存を
持続させることが見出された。Johnson等は（1986,J.Ne
urosci.6:3031−3938）、BDNFがE17ラット胚から培養さ
れた網膜神経節細胞の生存を持続させることを示すデー
タを提示している。これは、馴化培地および網膜神経節
細胞の標的領域から調製された脳抽出物がこれらのニュ
ーロンの生存を支えると思われることを示した先の研究
に一致している（McCafferyら,1982,Ex.Brain Res.48:3
7−386;Sarthyら,1983,J.Neurosci.3:2532−2544;Turne
rら,1983,Dev.Brain Res.6:77−83）。
培養物中における発達中のニューロンの生存に及ぼす
その作用に加えて、BDNFは培養された成体末梢および中
枢神経系ニューロンに作用を及ぼすことが示されてい
る。成体感覚性ニューロンは３または４週間にわたるイ
ンビトロ維持に神経栄養因子を必要としないと思われた
が、BDNF並びにNGFは、培養中の成体ラットDRGニューロ
ンからの軸索再生を刺激することが示されている（Lind
say,1988,J.Neurosci.8:2394−2405）。更に、成体ラッ
ト網膜の培養物において、BDNFは網膜神経節細胞の生存
およびそこからの軸索伸長の両方を促進することが観察
された（Thanosら,1989,Eur.J.Neurosci.1:19−26）。N
GFとBDNFの生物学的作用の比較を第Ｉ表に示す。
その作用に加えて、BDNFは培養された成体末梢および中
枢神経系ニューロンに作用を及ぼすことが示されてい
る。成体感覚性ニューロンは３または４週間にわたるイ
ンビトロ維持に神経栄養因子を必要としないと思われた
が、BDNF並びにNGFは、培養中の成体ラットDRGニューロ
ンからの軸索再生を刺激することが示されている（Lind
say,1988,J.Neurosci.8:2394−2405）。更に、成体ラッ
ト網膜の培養物において、BDNFは網膜神経節細胞の生存
およびそこからの軸索伸長の両方を促進することが観察
された（Thanosら,1989,Eur.J.Neurosci.1:19−26）。N
GFとBDNFの生物学的作用の比較を第Ｉ表に示す。
（3.2）脳由来神経栄養因子のニューロン標的 末梢神経神経節の感覚性ニューロンは、二つの異なる
一時的な発生学的構造物、すなわち神経稜および神経プ
ラコードのいずれかから生ずることが見出されている。
神経稜は、自律性神経節および脊髄神経知覚神経節すな
わちDRGのニューロンおよび付随細胞の両方を生じると
思われる。脳神経知覚神経節の形成への神経稜および神
経プラコードの寄与は、Le Douarinによって工夫された
ウズラ／ニワトリキメラ移植系を使用して研究されてい
る（Le Douarin,1973,Develop.Biol.20:217−222;Node
n,1978,Develop.Biol.67:313−329;NarayananおよびNar
ayanan,1980,Anat.Rec.196:71−82;Ayer−Le Lievreお
よびLe Douarin,1982,Develop.Biol.94:291−310;D′Am
ico−MaratelおよびNodem,1983,Am.J.Anat.166:445−46
8）。Lindsay等（1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115−129）
に概説されている通り、少なくとも鳥類に関しては、第
VII、第IXおよび第Ｘ脳神経の遠位神経節のニューロン
（それぞれ膝状、錐体および結節性神経節）および第VI
II脳神経の前庭聴覚複合体のニューロンがもっぱら神経
プラコード起源であると信じられている。第Ｖ脳神経の
三叉神経神経節は、稜およびプラコードの両方の起源の
ニューロンを含有するが（上下顎骨葉の腹側外側極に優
勢なプラコード−由来ニューロンを有する）、一方全て
の脳神経節の付随細胞は、完全に神経稜起源であること
が見出されている。
一時的な発生学的構造物、すなわち神経稜および神経プ
ラコードのいずれかから生ずることが見出されている。
神経稜は、自律性神経節および脊髄神経知覚神経節すな
わちDRGのニューロンおよび付随細胞の両方を生じると
思われる。脳神経知覚神経節の形成への神経稜および神
経プラコードの寄与は、Le Douarinによって工夫された
ウズラ／ニワトリキメラ移植系を使用して研究されてい
る（Le Douarin,1973,Develop.Biol.20:217−222;Node
n,1978,Develop.Biol.67:313−329;NarayananおよびNar
ayanan,1980,Anat.Rec.196:71−82;Ayer−Le Lievreお
よびLe Douarin,1982,Develop.Biol.94:291−310;D′Am
ico−MaratelおよびNodem,1983,Am.J.Anat.166:445−46
8）。Lindsay等（1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115−129）
に概説されている通り、少なくとも鳥類に関しては、第
VII、第IXおよび第Ｘ脳神経の遠位神経節のニューロン
（それぞれ膝状、錐体および結節性神経節）および第VI
II脳神経の前庭聴覚複合体のニューロンがもっぱら神経
プラコード起源であると信じられている。第Ｖ脳神経の
三叉神経神経節は、稜およびプラコードの両方の起源の
ニューロンを含有するが（上下顎骨葉の腹側外側極に優
勢なプラコード−由来ニューロンを有する）、一方全て
の脳神経節の付随細胞は、完全に神経稜起源であること
が見出されている。
脊髄および脳神経感覚性ニューロンの外植のおよび解
離されたニューロン富化培養物の両方を使用したインビ
トロ実験から、神経稜起源の感覚性ニューロンがNGFに
応答性であることが見出されており、対照的に神経プラ
コード由来のニューロン（三叉神経節の腹側外側部分の
ニューロンおよび前庭、膝状、錐体および結節神経節の
全ニューロン集団を含む）は、胚発達全体中を通してNG
Fにほとんど応答性でないことが観察されている。NGFに
対する要求および応答性の相違と対照的に、プラコード
および神経稜由来両感覚性ニューロンは、BDNFの生存お
よび軸索−促進活性に応答性であることが見出されてい
る（第Ｉ表）（Lindsayら,1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115
−129;Lindsayら,1985,Develop.Biol.112:319−328;Kal
cheimおよびGendreau,1988,Develop.Brain Res.41:79−
86）。TebarおよびBarde（1988,J.Neurosci.8:3337−33
42）は、放射性標識されたBDNFのニワトリ胚背根神経節
ニューロンへの結合パラメーターを研究した。その結果
は、二つのクラスのBDNFレセプター、すなわち一方はBD
NFに対して高いアフィニティを有しそして他方は低いア
フィニティを有するレセプターの存在と一致している。
高いアフィニティレセプターは、交感神経ニューロン上
には観察されなかった。
離されたニューロン富化培養物の両方を使用したインビ
トロ実験から、神経稜起源の感覚性ニューロンがNGFに
応答性であることが見出されており、対照的に神経プラ
コード由来のニューロン（三叉神経節の腹側外側部分の
ニューロンおよび前庭、膝状、錐体および結節神経節の
全ニューロン集団を含む）は、胚発達全体中を通してNG
Fにほとんど応答性でないことが観察されている。NGFに
対する要求および応答性の相違と対照的に、プラコード
および神経稜由来両感覚性ニューロンは、BDNFの生存お
よび軸索−促進活性に応答性であることが見出されてい
る（第Ｉ表）（Lindsayら,1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115
−129;Lindsayら,1985,Develop.Biol.112:319−328;Kal
cheimおよびGendreau,1988,Develop.Brain Res.41:79−
86）。TebarおよびBarde（1988,J.Neurosci.8:3337−33
42）は、放射性標識されたBDNFのニワトリ胚背根神経節
ニューロンへの結合パラメーターを研究した。その結果
は、二つのクラスのBDNFレセプター、すなわち一方はBD
NFに対して高いアフィニティを有しそして他方は低いア
フィニティを有するレセプターの存在と一致している。
高いアフィニティレセプターは、交感神経ニューロン上
には観察されなかった。
BDNFの既知のニューロン標的は、更にBarde等（1987,
Prog.Brain Res.,71:185−189）によって再検討され
た。本発明以前には、BDNFを合成する細胞の同定はBDNF
に特異的な核酸または抗体プローブの欠如ゆえに実現に
到っていない。BDNFに対するポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を調製する試みはうまくいっていない。
抗体を生成できなかったことにより、BDNFの分子クロー
ニング、発達中のニューロンからインビボBDNFを剥奪す
ることの生理学的作用の測定、イムノアッセイを用いる
組織中のBDNFの定量および免疫細胞化学を使用したBDNF
の位置決定が妨げられる。
Prog.Brain Res.,71:185−189）によって再検討され
た。本発明以前には、BDNFを合成する細胞の同定はBDNF
に特異的な核酸または抗体プローブの欠如ゆえに実現に
到っていない。BDNFに対するポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を調製する試みはうまくいっていない。
抗体を生成できなかったことにより、BDNFの分子クロー
ニング、発達中のニューロンからインビボBDNFを剥奪す
ることの生理学的作用の測定、イムノアッセイを用いる
組織中のBDNFの定量および免疫細胞化学を使用したBDNF
の位置決定が妨げられる。
発明の要約 本発明は、脳由来神経栄養因子（BDNF）をコードする
核酸配列、このものから多量に産生される実質的に純粋
なタンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導
体、並びにBDNFタンパク質、そのペプチドフラグメント
または誘導体に対して生成された抗体に関する。本発明
は抗−BDNF抗体産生を可能にし、そしてBDNFの診断およ
び治療用途を支えるに十分な量のBDNFの入手を初めて可
能にするものである。
核酸配列、このものから多量に産生される実質的に純粋
なタンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導
体、並びにBDNFタンパク質、そのペプチドフラグメント
または誘導体に対して生成された抗体に関する。本発明
は抗−BDNF抗体産生を可能にし、そしてBDNFの診断およ
び治療用途を支えるに十分な量のBDNFの入手を初めて可
能にするものである。
本発明の種々の実施態様において、BDNF核酸、タンパ
ク質、ペプチド、誘導体または本発明の抗体は、種々の
神経学的疾病および障害の診断および治療法に、そして
特に感覚性ニューロン障害および網膜変性の診断および
治療に使用できる。更に、本発明の詳細な実施態様にお
いては、BDNF核酸またはBDNF遺伝子産物は、神経芽腫、
パーキンソン病およびアルツハイマー病の診断および治
療に使用することができる。本発明の他の詳細な態様に
おいてはBDNF遺伝子産物は、インプラントの神経組織へ
の取込みを促進し、若しくは外傷、梗塞、感染あるいは
手術後に続く神経再生を促進するのにも使用することが
できる。
ク質、ペプチド、誘導体または本発明の抗体は、種々の
神経学的疾病および障害の診断および治療法に、そして
特に感覚性ニューロン障害および網膜変性の診断および
治療に使用できる。更に、本発明の詳細な実施態様にお
いては、BDNF核酸またはBDNF遺伝子産物は、神経芽腫、
パーキンソン病およびアルツハイマー病の診断および治
療に使用することができる。本発明の他の詳細な態様に
おいてはBDNF遺伝子産物は、インプラントの神経組織へ
の取込みを促進し、若しくは外傷、梗塞、感染あるいは
手術後に続く神経再生を促進するのにも使用することが
できる。
本発明はまた、有効量のBDNF遺伝子産物、あるいはま
たBDNF遺伝子産物に対して生成された抗体を含有する医
薬組成物に関するものであり、このものは、種々の神経
学的疾病および障害の診断および治療に使用できる。
たBDNF遺伝子産物に対して生成された抗体を含有する医
薬組成物に関するものであり、このものは、種々の神経
学的疾病および障害の診断および治療に使用できる。
加えて、BDNFの完全なヌクレオチド配列を提供するこ
とによって、本発明はBDNFとNGF遺伝子の比較を可能に
し、もって相同の領域を同定し、そしてBDNF/NGF遺伝子
ファミリーを特定できる。従って、本発明はBDNF/NGF遺
伝子ファミリーの付加的メンバーを同定する方法に関す
る。詳細な実施態様においては、本発明の方法を使用し
て、BDNF/NGF遺伝子ファミリーの新規な、非−NGF、非
−BDNFメンバーが同定される。本発明は更に、記載され
た方法およびその遺伝子に従って同定されたBDNF/NGF遺
伝子ファミリーの付加的メンバーを提供する。
とによって、本発明はBDNFとNGF遺伝子の比較を可能に
し、もって相同の領域を同定し、そしてBDNF/NGF遺伝子
ファミリーを特定できる。従って、本発明はBDNF/NGF遺
伝子ファミリーの付加的メンバーを同定する方法に関す
る。詳細な実施態様においては、本発明の方法を使用し
て、BDNF/NGF遺伝子ファミリーの新規な、非−NGF、非
−BDNFメンバーが同定される。本発明は更に、記載され
た方法およびその遺伝子に従って同定されたBDNF/NGF遺
伝子ファミリーの付加的メンバーを提供する。
（１） 略語および定義 BDNF 脳由来神経栄養因子 CAT コリンアセチルトランスフェラーゼ CNS 中枢神経系 DRG 背根神経節（神経節） EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸 NGF 神経成長因子 PBS 燐酸緩衝食塩水 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 PNS 末梢神経系 SDS ドデシル硫酸ナトリウム Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 図面の説明 第１図．ブタプレプロBDNF cDNAのヌクレオチド配列お
よび推定アミノ酸配列。二つの重なるcDNAクローンの完
全な配列をこの図に示す。マイクロ整理配列化（第III
表）から得られたペプチド配列に下線を示す。Ｎ−グリ
コシル化に関するコンセンサス配列のみは二重下線を付
す。成熟BDNF配列の出発を二重カラットにより標印す
る。
よび推定アミノ酸配列。二つの重なるcDNAクローンの完
全な配列をこの図に示す。マイクロ整理配列化（第III
表）から得られたペプチド配列に下線を示す。Ｎ−グリ
コシル化に関するコンセンサス配列のみは二重下線を付
す。成熟BDNF配列の出発を二重カラットにより標印す
る。
第２図.NGFとBDNFの配列比較。同一の位置に見出される
２個以上のアミノ酸を有する領域を示す。この配列は、
成熟タンパク質の第１アミノ酸で出発し、そして終止コ
ドンの前の最終アミノ酸で終了する。６個のシステイン
残基を含む51のアミノ酸がBDNFおよび種々のNGFに共通
である（Schwarzら,1989,J.Neurochem.52:1203−120
9）。
２個以上のアミノ酸を有する領域を示す。この配列は、
成熟タンパク質の第１アミノ酸で出発し、そして終止コ
ドンの前の最終アミノ酸で終了する。６個のシステイン
残基を含む51のアミノ酸がBDNFおよび種々のNGFに共通
である（Schwarzら,1989,J.Neurochem.52:1203−120
9）。
第３図.32P−標識NGFおよびBDNFプローブとハイブリッ
ド形成した、EcoR I切断ヒト、サル、ラット、マウス、
イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよび酵母ゲノムDNAの
サザンブロットのオートラジオグラフ。
ド形成した、EcoR I切断ヒト、サル、ラット、マウス、
イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよび酵母ゲノムDNAの
サザンブロットのオートラジオグラフ。
第４図．ノーザンブロットアッセイ。各組織から、20μ
ｇの全RNAを１レーン当たり塗布しそして32P−標識cRNA
マウスBDNFプローブとハイブリッド形成させた。脳組織
で強いシグナルが約1.45kBで見出せたが、これは分析し
た７種の他の組織のいずれでも見出せなかった。
ｇの全RNAを１レーン当たり塗布しそして32P−標識cRNA
マウスBDNFプローブとハイブリッド形成させた。脳組織
で強いシグナルが約1.45kBで見出せたが、これは分析し
た７種の他の組織のいずれでも見出せなかった。
第５図．ヒトBDNF cDNAの配列および推定アミノ酸配
列、並びにブタ、ラットおよびニワトリからのDNA配列
の比較。
列、並びにブタ、ラットおよびニワトリからのDNA配列
の比較。
第６図.BDNF発現プラスミドpCMV1−pBDNF。
第７図．（ａ）抗血清の連続希釈物を用いる抗血清のB5
ペプチドの結合のELISA測定結果。（ｂ）種々の抗血清
の1:500希釈物の50ng BDNFへの結合の定量。
ペプチドの結合のELISA測定結果。（ｂ）種々の抗血清
の1:500希釈物の50ng BDNFへの結合の定量。
第８図.BDNF−処理（斜線棒）および対照（黒い棒）腹
側中脳培養物におけるチロシンヒドロキシラーゼに関す
る免疫組織化学的染色の結果。
側中脳培養物におけるチロシンヒドロキシラーゼに関す
る免疫組織化学的染色の結果。
第９図．腹側中脳培養物によるドーパミン取込み。BDNF
補添された培養液は斜線棒により表され、対照培養物は
黒い棒で示す。
補添された培養液は斜線棒により表され、対照培養物は
黒い棒で示す。
第10図．（ａ）前脳コリン作動性ニューロン培養物にお
けるCAT陽性細胞の数に及ぼすBDNFの作用。（ｂ）１ウ
ェル当たり260,000細胞の密度（黒棒）または１ウェル
当たり150,000細胞の密度（斜線棒）において前脳コリ
ン作動性ニューロン培養物を150ng/mlのNGFで処理した
（斜線棒）。NGF−処理対未処理細胞におけるCAT免疫陽
性細胞の数を比較した。
けるCAT陽性細胞の数に及ぼすBDNFの作用。（ｂ）１ウ
ェル当たり260,000細胞の密度（黒棒）または１ウェル
当たり150,000細胞の密度（斜線棒）において前脳コリ
ン作動性ニューロン培養物を150ng/mlのNGFで処理した
（斜線棒）。NGF−処理対未処理細胞におけるCAT免疫陽
性細胞の数を比較した。
第11図．前脳コリン作動性ニューロン培養物中における
BDNF濃度の関数としての、１分当り触媒された基質のピ
コモルで示されたCAT酵素活性の量の変化。
BDNF濃度の関数としての、１分当り触媒された基質のピ
コモルで示されたCAT酵素活性の量の変化。
第12図．約60％の集密度の大グリア細胞培養物を、
（ａ）表皮性成長因子または（ｂ）BDNFのいずれかで42
時間処理し、次いで［3H］メチルチミジンとインキュベ
ートした。3Hの取込み量をEGFおよびBDNF濃度に対して
測定した。
（ａ）表皮性成長因子または（ｂ）BDNFのいずれかで42
時間処理し、次いで［3H］メチルチミジンとインキュベ
ートした。3Hの取込み量をEGFおよびBDNF濃度に対して
測定した。
第13図.BDNF/NGFプローブR1B/2Cにハイブリッド形成し
た、EcoR I制限ニワトリ、マウス、ラットのサザンブロ
ット。NGFおよびBDNFゲノムEcoR Iフラグメントの位置
を、各々ＮおよびＢとして示す。
た、EcoR I制限ニワトリ、マウス、ラットのサザンブロ
ット。NGFおよびBDNFゲノムEcoR Iフラグメントの位置
を、各々ＮおよびＢとして示す。
第14図.NGFおよびBDNFと、Box3/Box4プライマーを用い
るマウスDNAからのPCRによって同定されたBDNF/NGFファ
ミリーの新規のメンバーとの配列比較：新規の遺伝子
［本明細書においてM3/4とする（コード鎖のみを示す配
列、および成熟マウスNGFおよび成熟ブタ、ラット、マ
ウスまたはヒトBDNFに対して整列された推定アミノ酸配
列を示す。ダッシュは、NGFにおける１コドンの欠失を
用いてBDNFおよびM3/4に対して配列を最適化した位置を
示す。イタリックは、アミノ酸配列および／または保存
アミノ酸置換における一致を示す。）］ 第15図.BDNFヒトプローブにハイブリッド形成した種々
のヒト腫瘍由来細胞系からのRNAのノーザンブロット。
るマウスDNAからのPCRによって同定されたBDNF/NGFファ
ミリーの新規のメンバーとの配列比較：新規の遺伝子
［本明細書においてM3/4とする（コード鎖のみを示す配
列、および成熟マウスNGFおよび成熟ブタ、ラット、マ
ウスまたはヒトBDNFに対して整列された推定アミノ酸配
列を示す。ダッシュは、NGFにおける１コドンの欠失を
用いてBDNFおよびM3/4に対して配列を最適化した位置を
示す。イタリックは、アミノ酸配列および／または保存
アミノ酸置換における一致を示す。）］ 第15図.BDNFヒトプローブにハイブリッド形成した種々
のヒト腫瘍由来細胞系からのRNAのノーザンブロット。
第16図．海馬ニューロンにおけるBDNF−mRNAレベルの分
極の作用。
極の作用。
（ａ） 50mM KClの存在下における海馬ニューロンの
一次培養物のBDNF−mRNA発現の時間的経過。全細胞性RN
Aを0.5×106の細胞から抽出し、グリコシル化し、そし
て1.3％アガロースゲル上の電気泳動により分析した（B
iziere,K.およびCoyle,T.,Neurosci.,1978,Lett.8:303;
McGeerら、1978,Brain.Res.139:381）。ハイボンド（Hy
bond）Ｎフィルターに移したDNAをマウスBDNFに特異的
でありそしてインビトロランオフ転写により生成された
32P−標識cRNAプローブ（比活性、109cpm/μｇ）とハイ
ブリッド形成させた。２個の上部バンドがBDNF−mRNAに
相当する；これら２個のバンド（４及び1.5KB）はRNア
ーゼＡ抵抗性であるが同様の方法で調節されると思われ
る２個の異なる転写物を示す。下方のバンド（700bp）
はRNAの抽出前に試料に添加された短いBDNF−mRNA回収
標準物の10pgに相当する。
一次培養物のBDNF−mRNA発現の時間的経過。全細胞性RN
Aを0.5×106の細胞から抽出し、グリコシル化し、そし
て1.3％アガロースゲル上の電気泳動により分析した（B
iziere,K.およびCoyle,T.,Neurosci.,1978,Lett.8:303;
McGeerら、1978,Brain.Res.139:381）。ハイボンド（Hy
bond）Ｎフィルターに移したDNAをマウスBDNFに特異的
でありそしてインビトロランオフ転写により生成された
32P−標識cRNAプローブ（比活性、109cpm/μｇ）とハイ
ブリッド形成させた。２個の上部バンドがBDNF−mRNAに
相当する；これら２個のバンド（４及び1.5KB）はRNア
ーゼＡ抵抗性であるが同様の方法で調節されると思われ
る２個の異なる転写物を示す。下方のバンド（700bp）
はRNAの抽出前に試料に添加された短いBDNF−mRNA回収
標準物の10pgに相当する。
（ｂ） カルシウム依存性。ニューロンを正常培地
（CM）、カルシウムを含まない改変培地（−Ca）または
ニフェシピン（NIF）10μＭを含有する培地（NIF）中で
３時間インキュベートした。指示される場所（＋Ｋ）で
50mM KClを加えた。
（CM）、カルシウムを含まない改変培地（−Ca）または
ニフェシピン（NIF）10μＭを含有する培地（NIF）中で
３時間インキュベートした。指示される場所（＋Ｋ）で
50mM KClを加えた。
第17図．カリウム及びカイニン酸による海馬ニューロン
のNGF−mRNAレベルの増加。ニューロンを対照培地
（ｃ）中、又は50mM KClの存在下（＋Ｋ）又は25μＭカ
イニン酸の存在下（KA）に３時間インキュベートした。
RNAを抽出し、そしてNGF−mRNAレベルを定量的PCRによ
り測定した。値は平均±SEM（ｎ＝６）である。
のNGF−mRNAレベルの増加。ニューロンを対照培地
（ｃ）中、又は50mM KClの存在下（＋Ｋ）又は25μＭカ
イニン酸の存在下（KA）に３時間インキュベートした。
RNAを抽出し、そしてNGF−mRNAレベルを定量的PCRによ
り測定した。値は平均±SEM（ｎ＝６）である。
第18図．カイニン酸作用に関する用量応答曲線。海馬ニ
ューロンをカイニン酸の種々の濃度の存在下に３時間イ
ンキュベートした。RNAを抽出し、そして第16図に示さ
れるようにして分析した。値は３回の実験の平均±SEM
を表わす。
ューロンをカイニン酸の種々の濃度の存在下に３時間イ
ンキュベートした。RNAを抽出し、そして第16図に示さ
れるようにして分析した。値は３回の実験の平均±SEM
を表わす。
第19図．カイニン酸処理によるBDNF−及びNGF−mRNAレ
ベルの増加の時間的経過。カイニン酸（12mg/kg）の腹
腔内注射後に指示された時（時間）に海馬（ａ）または
皮質（ｂ）から全細胞性RNAを抽出して第16図に示すよ
うにして分析した。ジアゼパム（10mg/kg）の１回量を
カイニン酸投与90分後に注射した（BDNF（4kb及び1.5k
b）の二つのバンドはRNアーゼＡ抵抗性であるがしかし
同様の方法で調節されると思われる二つの異なった転写
物を示す）。1.5kb BDNF−mRNA（ｏ）及び1.3kb NGF−m
RNA（ｏ）に対応する値が示されている。4kb BDNF−mRN
Aで同様の増加が観察された。示されている値は３〜４
回の実験の平均±SEMを示す。
ベルの増加の時間的経過。カイニン酸（12mg/kg）の腹
腔内注射後に指示された時（時間）に海馬（ａ）または
皮質（ｂ）から全細胞性RNAを抽出して第16図に示すよ
うにして分析した。ジアゼパム（10mg/kg）の１回量を
カイニン酸投与90分後に注射した（BDNF（4kb及び1.5k
b）の二つのバンドはRNアーゼＡ抵抗性であるがしかし
同様の方法で調節されると思われる二つの異なった転写
物を示す）。1.5kb BDNF−mRNA（ｏ）及び1.3kb NGF−m
RNA（ｏ）に対応する値が示されている。4kb BDNF−mRN
Aで同様の増加が観察された。示されている値は３〜４
回の実験の平均±SEMを示す。
第20図.BDNF−mRNAのカイニン酸により誘導された発現
に及ぼす鎮痙剤の作用。ラットにカイニン酸（12mg/k
g）（＋KA）又は食塩水（対照）の注射15分前にジアゼ
パム（10mg/kg）（DZ）、MK−801（1mg/kg）（MK）又は
ケタミン（20mg/kg）（KET）を腹腔内注射した。３時間
後に海馬組織を第16図に示すように全RNAの調製に用い
た。値は３回の実験の平均±SEMを示す。
に及ぼす鎮痙剤の作用。ラットにカイニン酸（12mg/k
g）（＋KA）又は食塩水（対照）の注射15分前にジアゼ
パム（10mg/kg）（DZ）、MK−801（1mg/kg）（MK）又は
ケタミン（20mg/kg）（KET）を腹腔内注射した。３時間
後に海馬組織を第16図に示すように全RNAの調製に用い
た。値は３回の実験の平均±SEMを示す。
第21図．中隔細胞培養物。
Ａ−F.培養物における細胞成長の時間経過の位相差顕
微鏡写真。細胞を1.3×（105）細胞/cm2の密度で塗布し
そして本文に記載したようにして5HS/NS中で保持した。
記録された時点は１（A,B）,2（C,D）Ｃ及び４（E,F）
日目である。細胞の種類に特異的なマーカーが、細胞の
集団、AChE組織化学的に染色したニューロン（G,H）及
びNGF−レセプター免疫陽性ニューロン（Ｉ）を同定す
るために用いられた。スケールバー＝25μｍ 第22図.AChE細胞数に基づくBDNF又はNGF処理に対する解
離された中隔細胞の応答の比較。
微鏡写真。細胞を1.3×（105）細胞/cm2の密度で塗布し
そして本文に記載したようにして5HS/NS中で保持した。
記録された時点は１（A,B）,2（C,D）Ｃ及び４（E,F）
日目である。細胞の種類に特異的なマーカーが、細胞の
集団、AChE組織化学的に染色したニューロン（G,H）及
びNGF−レセプター免疫陽性ニューロン（Ｉ）を同定す
るために用いられた。スケールバー＝25μｍ 第22図.AChE細胞数に基づくBDNF又はNGF処理に対する解
離された中隔細胞の応答の比較。
A:BDNF（25ng/ml）、NGF（50ng/ml）又は両リガンド
の結合物に対する塗布密度での応答の比較。
の結合物に対する塗布密度での応答の比較。
B:ある範囲のBDNF又はNGFの濃度（０〜50ng/ml）に対
するコリン作動性ニューロンの比較。これら結果物の細
胞を血清含有培地中で11〜12日間成長させた。データポ
イントは６−９回測定の平均±SEMを表わす。
するコリン作動性ニューロンの比較。これら結果物の細
胞を血清含有培地中で11〜12日間成長させた。データポ
イントは６−９回測定の平均±SEMを表わす。
第23図．棒グラフは、解離された中隔培養物に対するBD
NF又はNGFの添加遅延作用を示す。BDNF（50ng/ml）又は
NGF（50ng/ml）を５〜６時間（＋12）、５日間（−5/＋
７）又は７日間（−7/＋５）遅延に続いて解離細胞培養
物に添加した。培養物を12日間保持した。細胞をAChE陽
性組織化学的染色に基づいて採点した。結果は、４〜５
回測定の平均±SEMとして表わす。
NF又はNGFの添加遅延作用を示す。BDNF（50ng/ml）又は
NGF（50ng/ml）を５〜６時間（＋12）、５日間（−5/＋
７）又は７日間（−7/＋５）遅延に続いて解離細胞培養
物に添加した。培養物を12日間保持した。細胞をAChE陽
性組織化学的染色に基づいて採点した。結果は、４〜５
回測定の平均±SEMとして表わす。
第24図.NGF−レセプター免疫陽性細胞の数を調節するBD
NF又はNGFの能力を示す棒グラフ。NGF−レセプターに関
する免疫スレーティング（immunoslating）を、モノク
ローナル抗体192−IgGを用い、希釈度1:1000で行った。
解離された中隔細胞を1.3×（105）細胞/cm2の密度で塗
布し、そして12日間連続的に処理した。NGFの飽和量と
ある範囲の量のBDNF（０〜100ng/ml）その間で比較し
た。示される結果はｎ＝４の平均±SEMである。
NF又はNGFの能力を示す棒グラフ。NGF−レセプターに関
する免疫スレーティング（immunoslating）を、モノク
ローナル抗体192−IgGを用い、希釈度1:1000で行った。
解離された中隔細胞を1.3×（105）細胞/cm2の密度で塗
布し、そして12日間連続的に処理した。NGFの飽和量と
ある範囲の量のBDNF（０〜100ng/ml）その間で比較し
た。示される結果はｎ＝４の平均±SEMである。
第25図.BDNF（Ａ）及びNGF（Ｂ）のCAT誘導活性に対す
る中隔コリン作動性ニューロンの用量応答曲線。培養物
をポルオルニチン及びラミニン被覆した6mmウェルに塗
布し5HS/N3で12日間保持した。細胞を塗布５〜６時間後
BDNF又はNGFにさらした。因子は、３日毎に培地を交換
するときに置換した。示された結果は、５〜６回測定の
平均±SEMを示す。
る中隔コリン作動性ニューロンの用量応答曲線。培養物
をポルオルニチン及びラミニン被覆した6mmウェルに塗
布し5HS/N3で12日間保持した。細胞を塗布５〜６時間後
BDNF又はNGFにさらした。因子は、３日毎に培地を交換
するときに置換した。示された結果は、５〜６回測定の
平均±SEMを示す。
第26図.AChE酵素活性に及ぼすBDNF及びNGFの用量応答効
果。ラットの中隔コリン作動性ニューロンをホルモン補
添した血清含有培地中で12日間成長させた。細胞をBDNF
（白棒）及びNGF（黒棒）で第25図に記載したようにし
て処理した。結果は６〜９回の測定の平均±SEMであ
る。非処理培養物におけるAChE活性は16.4±2nモル/Hr/
ウェルであった。
果。ラットの中隔コリン作動性ニューロンをホルモン補
添した血清含有培地中で12日間成長させた。細胞をBDNF
（白棒）及びNGF（黒棒）で第25図に記載したようにし
て処理した。結果は６〜９回の測定の平均±SEMであ
る。非処理培養物におけるAChE活性は16.4±2nモル/Hr/
ウェルであった。
第27図.BDNFにより誘導されるCAT酵素活性の増大の時間
的経過をNGFと比較。CAT活性の刺激の所要時間は2.3×
（105）細胞/cm2の密度で塗布され、ホルモン補添物お
よび外因性因子を有する血清含有培地で種々の長さの時
間成長させた細胞について実施された。塗布５〜６時間
後細胞を初めのBDNF（白棒）またはNGF（黒棒）に露出
させた。結果は、処理培地で測定された活性の非処理培
地に対するパーセントで表わす（ｎ＝6,BDNF＝12日 ｎ
＝３）。
的経過をNGFと比較。CAT活性の刺激の所要時間は2.3×
（105）細胞/cm2の密度で塗布され、ホルモン補添物お
よび外因性因子を有する血清含有培地で種々の長さの時
間成長させた細胞について実施された。塗布５〜６時間
後細胞を初めのBDNF（白棒）またはNGF（黒棒）に露出
させた。結果は、処理培地で測定された活性の非処理培
地に対するパーセントで表わす（ｎ＝6,BDNF＝12日 ｎ
＝３）。
第28図.CAT酵素活性を誘導するBDNFの能力に及ぼすグリ
ア細胞の作用の比較。中隔細胞を2.3×（105）細胞/cm2
の密度で塗布した。５〜６時間の培養に続き、培地を本
文に詳細に記載するようにして、１％ N3を補添した無
血清または血清含有培地を変えた。シトシンアラビノシ
ド（１μＭ）を、星状細胞の数を更に減少させるために
24時間加えた。次いで、培養物を12日間維持した。結果
は、４回測定の平均±S.E.M.を示す。
ア細胞の作用の比較。中隔細胞を2.3×（105）細胞/cm2
の密度で塗布した。５〜６時間の培養に続き、培地を本
文に詳細に記載するようにして、１％ N3を補添した無
血清または血清含有培地を変えた。シトシンアラビノシ
ド（１μＭ）を、星状細胞の数を更に減少させるために
24時間加えた。次いで、培養物を12日間維持した。結果
は、４回測定の平均±S.E.M.を示す。
第29図．棒グラフは、高アフィニティーコリンの取り込
みのレベルに及ぼすBDNF又はNGF処理の作用を示す。コ
リン取り込みは、1.3×（105）細胞/cm2の密度で塗布し
たのち11日間保持した細胞について行った。BDNF（50ng
/ml）又はNGF（50ng/ml）に全培養期間を通じて存在さ
せた。データはBDNFで５回そしてNGFで10回測定の平均
±SEMを示す。
みのレベルに及ぼすBDNF又はNGF処理の作用を示す。コ
リン取り込みは、1.3×（105）細胞/cm2の密度で塗布し
たのち11日間保持した細胞について行った。BDNF（50ng
/ml）又はNGF（50ng/ml）に全培養期間を通じて存在さ
せた。データはBDNFで５回そしてNGFで10回測定の平均
±SEMを示す。
第30図．トリプシン及びエンドプロティナーゼArg−Ｃ
によるヒト脳由来神経栄養因子の酵素的開裂からの35S
−標識反応生成物のSDS−PAGEによる分解。
によるヒト脳由来神経栄養因子の酵素的開裂からの35S
−標識反応生成物のSDS−PAGEによる分解。
第31図．未処理CHO−hBDNFとエンドプロティナーゼ開裂
CHO−hBDNFとを比較したDRGバイオアッセイのグラフ表
示。神経突起の伸長を０から最大の生物活性を示す得点
５の間で採点した。
CHO−hBDNFとを比較したDRGバイオアッセイのグラフ表
示。神経突起の伸長を０から最大の生物活性を示す得点
５の間で採点した。
第32図．チロシンビトロキシラーゼ（TH）に対するモノ
クローナル抗体と培養９日後に染色したE14ラットの腹
側中脳細胞の解離培養物位相差顕微鏡写真（Ａ）及び明
視野顕微鏡写真（B,C）。
クローナル抗体と培養９日後に染色したE14ラットの腹
側中脳細胞の解離培養物位相差顕微鏡写真（Ａ）及び明
視野顕微鏡写真（B,C）。
Ａ及びB.同じ視野の位相差及び明視野写真はこれら培
養物における不十分なTHニューロンを示している。単一
のTH＋ニューロン（矢印）のみが、長い神経突起を有す
る多くの相ブライトニューロンを含む視野において見ら
れる。少数の非ニューロン細胞が形態またはGFAPによる
染色によって明らかである（示されず）。
養物における不十分なTHニューロンを示している。単一
のTH＋ニューロン（矢印）のみが、長い神経突起を有す
る多くの相ブライトニューロンを含む視野において見ら
れる。少数の非ニューロン細胞が形態またはGFAPによる
染色によって明らかである（示されず）。
C.約98のニューロン形態の相ブライト細胞を含む視野
における２個のTH＋ニューロン（小さな矢印）を示す明
視野顕微鏡写真。目盛＝100 1M 第33図.TH＋ニューロンの種々の形態、いくつかは広い
神経突起成長および非常に巧な成長コーン（A,B）を示
すE14ラット腹側中脳細胞の６日培養物の高倍率顕微鏡
写真。培養物は樹立され、第32図の解説に記載のように
して染色した。目盛＝25μＭ 第34図.BDNFは用量依存性様式で３日の培養期間で明ら
かに培養物中におけるTH＋ドーパミン作動性中脳ニュー
ロンの生存を促進する。
における２個のTH＋ニューロン（小さな矢印）を示す明
視野顕微鏡写真。目盛＝100 1M 第33図.TH＋ニューロンの種々の形態、いくつかは広い
神経突起成長および非常に巧な成長コーン（A,B）を示
すE14ラット腹側中脳細胞の６日培養物の高倍率顕微鏡
写真。培養物は樹立され、第32図の解説に記載のように
して染色した。目盛＝25μＭ 第34図.BDNFは用量依存性様式で３日の培養期間で明ら
かに培養物中におけるTH＋ドーパミン作動性中脳ニュー
ロンの生存を促進する。
A.BDNFを添加（黒棒）又はBDNFを加えず（白棒）に保
持したE14ラット腹側中脳培養物におけるTH＋ニューロ
ンの数の比較。処理された培養物では、BDNFを培養第２
日目に１回加えた（50ng/ml）。対照培養物と処理培養
物との間では３日目には差異が観察されなかったが、BD
NF処理された培養物におけるTH＋ニューロンの数は８日
目で対照よりも1.8倍高かった。値は二通りの試料の平
均である。
持したE14ラット腹側中脳培養物におけるTH＋ニューロ
ンの数の比較。処理された培養物では、BDNFを培養第２
日目に１回加えた（50ng/ml）。対照培養物と処理培養
物との間では３日目には差異が観察されなかったが、BD
NF処理された培養物におけるTH＋ニューロンの数は８日
目で対照よりも1.8倍高かった。値は二通りの試料の平
均である。
B.TH＋ニューロンの生存増大に及ぼすBDNFの作用は用
量依存性である。
量依存性である。
TH＋ニューロンの数は、BDNFの非存在下での培養又は
第２日目に添加された漸増濃度のBDNFを含有する培地中
で８日培養した後に二通りの試料で測定した。
第２日目に添加された漸増濃度のBDNFを含有する培地中
で８日培養した後に二通りの試料で測定した。
C.NGFはTH＋ニューロンの生存には効果がなかった。B
DNFの特異性を評価するため、培養物をNGF（50ng/ml）
の存在下又は非存在下に８日間成長させ、TH＋細胞を分
析した。２日目に加えたNGFは、６日目又は８日目に検
査した培養物のいずれでもTH＋ニューロンの生存を増加
させなかった。結果は二通りの培養皿の平均である。
DNFの特異性を評価するため、培養物をNGF（50ng/ml）
の存在下又は非存在下に８日間成長させ、TH＋細胞を分
析した。２日目に加えたNGFは、６日目又は８日目に検
査した培養物のいずれでもTH＋ニューロンの生存を増加
させなかった。結果は二通りの培養皿の平均である。
第35図.BDNFの反復量は２日目にBDNFを１回添加したも
のと比較したとき、更にTH＋ニューロンの生存を増加さ
せる。増加物を本文に記載のようにして調製した。組換
えヒトBDNFはCOS M5細胞の上清から精製した。培養物
は、２日目にBDNF（50ng/ml）の１回添加（SA:点彩棒）
又は1,2,4,6及び８日目にBDNF（50ng/ml）を反復投与
（MA−多数回添加；黒棒）のいずれかで処理するか或い
はBDNF（対照：白棒）なしで成長させた。指示された時
点で、培養物を固定しそしてTH免疫反応性に関して染色
した。複数回添加によるBDNFの補充により、対照と比較
して、11日目でTH＋ニューロンの数が2.7倍高くなっ
た。ところが、BDNFの１回の添加でみられる最大増加量
は11日以後で２倍よりわずかに少ないものであった。結
果は、典型的な数回の実験で、二通りの試料の平均であ
る。
のと比較したとき、更にTH＋ニューロンの生存を増加さ
せる。増加物を本文に記載のようにして調製した。組換
えヒトBDNFはCOS M5細胞の上清から精製した。培養物
は、２日目にBDNF（50ng/ml）の１回添加（SA:点彩棒）
又は1,2,4,6及び８日目にBDNF（50ng/ml）を反復投与
（MA−多数回添加；黒棒）のいずれかで処理するか或い
はBDNF（対照：白棒）なしで成長させた。指示された時
点で、培養物を固定しそしてTH免疫反応性に関して染色
した。複数回添加によるBDNFの補充により、対照と比較
して、11日目でTH＋ニューロンの数が2.7倍高くなっ
た。ところが、BDNFの１回の添加でみられる最大増加量
は11日以後で２倍よりわずかに少ないものであった。結
果は、典型的な数回の実験で、二通りの試料の平均であ
る。
第36図.BDNFを遅れて加えた場合には、２日目に加えた
場合にみられると同程にはTH＋の数を増大させない。
場合にみられると同程にはTH＋の数を増大させない。
培養物は、外因性BDNFを添加する時間を除いて、本文
中に示したようにして調整した。全ての培養物は、２日
目に無血清培地と交換し、そしてBDNF（50ng/ml,ブタ脳
BDNF）を、２日目、５日目または７日目（CD2,CD5,CD
7）のいずれかで、１回添加した。培養６日、８日およ
び10日目にTH＋ニューロン数を２通りの培養物中におい
て測定した。この実験において、２日目におけるBDNFの
１回添加で、10日目に添加した場合に比べ３倍高いTH＋
ニューロン数が生じた。BDNFを遅れて、すなわち５日目
に添加した場合には、10日目には、対照より高いTH＋ニ
ューロンが見られたが２倍よりは低かった。処置培地と
対照培地間のTH＋細胞数のこの違いは、培養時間が長く
なってもこれ以上増加しなかった。図において、対照、
白棒;2日目でのBDNFの添加、点彩棒;5日目でのBDNF添
加、黒棒;7日目でのBDNF添加、斜線棒、である。
中に示したようにして調整した。全ての培養物は、２日
目に無血清培地と交換し、そしてBDNF（50ng/ml,ブタ脳
BDNF）を、２日目、５日目または７日目（CD2,CD5,CD
7）のいずれかで、１回添加した。培養６日、８日およ
び10日目にTH＋ニューロン数を２通りの培養物中におい
て測定した。この実験において、２日目におけるBDNFの
１回添加で、10日目に添加した場合に比べ３倍高いTH＋
ニューロン数が生じた。BDNFを遅れて、すなわち５日目
に添加した場合には、10日目には、対照より高いTH＋ニ
ューロンが見られたが２倍よりは低かった。処置培地と
対照培地間のTH＋細胞数のこの違いは、培養時間が長く
なってもこれ以上増加しなかった。図において、対照、
白棒;2日目でのBDNFの添加、点彩棒;5日目でのBDNF添
加、黒棒;7日目でのBDNF添加、斜線棒、である。
第37図．海馬培養物中における高アフィニティーGABAと
り込みに及ぼすBDNFの容量依存性応答。部分精製nBDNF
（COS MG上精からロトフォール（rotopher）精製）を種
々の希釈度で培地に添加した。１×10-2希釈BDNFは、E8
ニワトリ背根神経節において最大の神経突起増進活性を
有することが分かった。高アフィニティー3H−GABA取り
込みをインビトロで８日間BDNF処理後に測定した。
り込みに及ぼすBDNFの容量依存性応答。部分精製nBDNF
（COS MG上精からロトフォール（rotopher）精製）を種
々の希釈度で培地に添加した。１×10-2希釈BDNFは、E8
ニワトリ背根神経節において最大の神経突起増進活性を
有することが分かった。高アフィニティー3H−GABA取り
込みをインビトロで８日間BDNF処理後に測定した。
第38図.BDNFはMPP＋の神経毒作用から培養黒質ドーパミ
ン作動性ニューロンを保護する。培地は第１図に示され
るようにしてE14ラット胚から調製した。インビトロで2
4時間後、培地を無血清調製物に交換した。培養３日後
に、培養物を６個の35mm皿から成る４群に分けた。１群
は対照とし、そして、他の群には、（ｉ）基本的な繊維
芽細胞成長因子、10ng/ml（ウシ脳bFGF;Boerhinger−Ma
nnheim）；（ii）マウスNGF,50ng/ml;または（iii）BDN
F,50ng/mlをそれぞれ与えた。培養物をさらに24時間維
持した後、各群の皿３枚ずつを１μM MPP＋（Research
Biochemicals,Inc.,Natick,MA）に48時間暴露した。計
６日を要した実験の最後に、全ての皿についてTH免疫反
応に関して処理し、そしてTH＋細胞数を各群で測定し
た。示されるデータは、MPP＋処理後のTH＋ニューロン
数を、MPP＋に暴露されない同様な培養物中におけるTH
＋ニューロンの数％として計算したものを示す。すべて
の値は、３通りの培養物の平均±s.e.m.である。
ン作動性ニューロンを保護する。培地は第１図に示され
るようにしてE14ラット胚から調製した。インビトロで2
4時間後、培地を無血清調製物に交換した。培養３日後
に、培養物を６個の35mm皿から成る４群に分けた。１群
は対照とし、そして、他の群には、（ｉ）基本的な繊維
芽細胞成長因子、10ng/ml（ウシ脳bFGF;Boerhinger−Ma
nnheim）；（ii）マウスNGF,50ng/ml;または（iii）BDN
F,50ng/mlをそれぞれ与えた。培養物をさらに24時間維
持した後、各群の皿３枚ずつを１μM MPP＋（Research
Biochemicals,Inc.,Natick,MA）に48時間暴露した。計
６日を要した実験の最後に、全ての皿についてTH免疫反
応に関して処理し、そしてTH＋細胞数を各群で測定し
た。示されるデータは、MPP＋処理後のTH＋ニューロン
数を、MPP＋に暴露されない同様な培養物中におけるTH
＋ニューロンの数％として計算したものを示す。すべて
の値は、３通りの培養物の平均±s.e.m.である。
発明の具体的説明 本発明は、脳由来神経栄養因子（BDNF）をコードする
核酸配列並びにこれらの核酸配列を用いて多量に産生さ
れる実質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメ
ントまたは誘導体に関する。さらに、本発明は、臨床的
使用に十分な量の実質的に純粋なBDNFを生成させる手段
をはじめて提供したので、BDNFの薬理学的組成物および
治療的使用にも関する。本発明はまた、十分な免疫原を
生成させる方法を提供したので、BDNFまたはそのフラグ
メントに対する抗体にも関する。更に、BDNFとNGFとの
間の核酸配列の比較ができることによって、本発明は、
BDNFとNGFとの間の核酸配列の相同領域の同定も提供
し、それによりBDNF/NGF遺伝子ファミリーが特定され
る。本発明はこの遺伝子ファミリーの付加的メンバーを
同定し、そして単離する方法を提供する。
核酸配列並びにこれらの核酸配列を用いて多量に産生さ
れる実質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメ
ントまたは誘導体に関する。さらに、本発明は、臨床的
使用に十分な量の実質的に純粋なBDNFを生成させる手段
をはじめて提供したので、BDNFの薬理学的組成物および
治療的使用にも関する。本発明はまた、十分な免疫原を
生成させる方法を提供したので、BDNFまたはそのフラグ
メントに対する抗体にも関する。更に、BDNFとNGFとの
間の核酸配列の比較ができることによって、本発明は、
BDNFとNGFとの間の核酸配列の相同領域の同定も提供
し、それによりBDNF/NGF遺伝子ファミリーが特定され
る。本発明はこの遺伝子ファミリーの付加的メンバーを
同定し、そして単離する方法を提供する。
説明を明確にするために、本発明を以下に項分けして
記載するが、本発明を限定するものではない。
記載するが、本発明を限定するものではない。
（ｉ） BDNFの精製 （ii） BDNFバイオアッセイ （iii） BDNFタンパク質のマイクロ整理配列 （iv） BDNFをコードするDNAのクローニング （ｖ） BDNFの発現 （vi） BDNF遺伝子およびタンパク質 （vii） 抗−BDNF抗体の生成 （viii） BDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加的メンバー
の同定 （ix） 本発明の有用性 （ｘ） 医薬組成物 （１） 脳由来神経栄養因子の精製 BDNFをコードする核酸を同定するために、マイクログ
ラム量のBDNFタンパク質を組織から得て、アミノ酸配列
を決定し、ついでこれを利用してオリゴヌクレオチドプ
ローブを設計することができる。BDNFタンパク質が極め
て稀であることは、決定できるアミノ酸配列の量を実際
上制限している。BDNFは、Barde等（1982,EMBO J.1:549
−553）またはHoferおよびBarde（1988,Nature 331:261
−262）に記載される方法によってブタ脳から調製する
ことができる。
の同定 （ix） 本発明の有用性 （ｘ） 医薬組成物 （１） 脳由来神経栄養因子の精製 BDNFをコードする核酸を同定するために、マイクログ
ラム量のBDNFタンパク質を組織から得て、アミノ酸配列
を決定し、ついでこれを利用してオリゴヌクレオチドプ
ローブを設計することができる。BDNFタンパク質が極め
て稀であることは、決定できるアミノ酸配列の量を実際
上制限している。BDNFは、Barde等（1982,EMBO J.1:549
−553）またはHoferおよびBarde（1988,Nature 331:261
−262）に記載される方法によってブタ脳から調製する
ことができる。
好ましくは、BDNFは、以下の詳細なプロトコール（こ
れは例示のためにであり限定のために示したのではな
い）に従って調製される。すなわち、種々の改良が当業
者による使用のために設定できる。BDNFが稀であるの
で、好ましくは約6kgの脳組織が精製操作に使用されよ
う。脳組織は、1mM EDTAおよび1mMの新たに添加された
フェニルメタンスルホニルフロリドを含有し、約0.2M燐
酸ナトリウムの濃度でかつ約pH6の燐酸ナトリウム緩衝
液中で、脳組織対液体の比率が脳約1kg対緩衝液２で
ある中でホモジナイズされ得る。次いで、塩酸を使用し
て上記混合物のpHを約４に調整でき、次いで上記混合物
を約２時間４℃で撹拌し得る。次にこの混合物を25分間
20,000gで遠心し得る。遠心分離後、上清を集め、水酸
化ナトリウムを用いてpH約6.0に調整し、次いでpH6の0.
1M燐酸ナトリウムで平衡化した予備膨潤カルボキシメチ
ルセルロース約１（6kgの脳組織当たり）と撹拌す
る。全量約20の0.1M燐酸ナトリウム,pH6、で数回洗浄
後、スラリーをカラムに注ぎ、そして0.13M NaClを含有
する同じ緩衝液で、好ましくは一夜洗浄し得る。次にBD
NF感受性バイオアッセイ（下記の（２）節を参照のこ
と）によって同定される活性フラクションを、0.5M NaC
lを含有する燐酸塩緩衝液で溶離し、引き続いてpH6.8の
5mM燐酸カリウム約５を何回か交換して透析し得る。
次に、透析されたフラクションは、処理された脳組織1k
g当たり約20mlの床容量を有するヒドロキシアパタイト
カラムに適用し得る。上記ヒドロキシアパタイトカラム
は、試料の適用に先立ちpH6.8の5mM燐酸カリウムを用い
て予め平衡化すべきである。次いで、上記カラムを、い
ずれもpH約6.8の5mM燐酸カリウム500mlおよび700mM燐酸
カリウム500mlからなる直線状グラジェントにより溶離
し得る。最適にはBDNF活性は、約500mM燐酸カリウムで
溶離されるべきである。次いで、プールされた活性フラ
クションを約700mM燐酸カリウムの最終モル濃度に調整
し、そしてpH6.8を有する700mM燐酸カリウム溶液で平衡
化したフェニル−セファロースカラム（脳組織各6kg当
たり約5ml量を有する）に適用し得る。同じ緩衝疫約40m
lで洗浄した後、BDNF活性を0.1M燐酸カリウム,pH6.8、
で溶離し、続いてBDNF活性を蒸留水で透析し、次いで凍
結乾燥し得る。この凍結乾燥した物質を次に0.1％ SDS
ゲルは含有するが好ましくはメルカプトエタノールを含
有しないSDSゲル電気泳動試料用緩衝疫にとり、そして1
0〜25％アクリルアミドの直線状グラジェントからなるS
DSゲルにかける。電気泳動分離完了後このゲルを約10分
間クマシーブルーで染色し、そして約20分間汚れをおと
す。チトクロムｃマーカーのレベルで移動するバンドを
切断し、そしてゲルから電気泳動により溶離する。SDS
はWeberおよびKuter（1971,J.Biol.Chem.246:4504−450
9）に記載されるようにして大部分除去する。SDSの除去
は一般に不完全であることに注意すべきである。BDNFを
マイクロ配列決定するための精製法はHoferおよびBarde
（1988,Nature331:261〜262）により改変され、そして
精製の最終工程にはゲル電気氷動を使用しない。
れは例示のためにであり限定のために示したのではな
い）に従って調製される。すなわち、種々の改良が当業
者による使用のために設定できる。BDNFが稀であるの
で、好ましくは約6kgの脳組織が精製操作に使用されよ
う。脳組織は、1mM EDTAおよび1mMの新たに添加された
フェニルメタンスルホニルフロリドを含有し、約0.2M燐
酸ナトリウムの濃度でかつ約pH6の燐酸ナトリウム緩衝
液中で、脳組織対液体の比率が脳約1kg対緩衝液２で
ある中でホモジナイズされ得る。次いで、塩酸を使用し
て上記混合物のpHを約４に調整でき、次いで上記混合物
を約２時間４℃で撹拌し得る。次にこの混合物を25分間
20,000gで遠心し得る。遠心分離後、上清を集め、水酸
化ナトリウムを用いてpH約6.0に調整し、次いでpH6の0.
1M燐酸ナトリウムで平衡化した予備膨潤カルボキシメチ
ルセルロース約１（6kgの脳組織当たり）と撹拌す
る。全量約20の0.1M燐酸ナトリウム,pH6、で数回洗浄
後、スラリーをカラムに注ぎ、そして0.13M NaClを含有
する同じ緩衝液で、好ましくは一夜洗浄し得る。次にBD
NF感受性バイオアッセイ（下記の（２）節を参照のこ
と）によって同定される活性フラクションを、0.5M NaC
lを含有する燐酸塩緩衝液で溶離し、引き続いてpH6.8の
5mM燐酸カリウム約５を何回か交換して透析し得る。
次に、透析されたフラクションは、処理された脳組織1k
g当たり約20mlの床容量を有するヒドロキシアパタイト
カラムに適用し得る。上記ヒドロキシアパタイトカラム
は、試料の適用に先立ちpH6.8の5mM燐酸カリウムを用い
て予め平衡化すべきである。次いで、上記カラムを、い
ずれもpH約6.8の5mM燐酸カリウム500mlおよび700mM燐酸
カリウム500mlからなる直線状グラジェントにより溶離
し得る。最適にはBDNF活性は、約500mM燐酸カリウムで
溶離されるべきである。次いで、プールされた活性フラ
クションを約700mM燐酸カリウムの最終モル濃度に調整
し、そしてpH6.8を有する700mM燐酸カリウム溶液で平衡
化したフェニル−セファロースカラム（脳組織各6kg当
たり約5ml量を有する）に適用し得る。同じ緩衝疫約40m
lで洗浄した後、BDNF活性を0.1M燐酸カリウム,pH6.8、
で溶離し、続いてBDNF活性を蒸留水で透析し、次いで凍
結乾燥し得る。この凍結乾燥した物質を次に0.1％ SDS
ゲルは含有するが好ましくはメルカプトエタノールを含
有しないSDSゲル電気泳動試料用緩衝疫にとり、そして1
0〜25％アクリルアミドの直線状グラジェントからなるS
DSゲルにかける。電気泳動分離完了後このゲルを約10分
間クマシーブルーで染色し、そして約20分間汚れをおと
す。チトクロムｃマーカーのレベルで移動するバンドを
切断し、そしてゲルから電気泳動により溶離する。SDS
はWeberおよびKuter（1971,J.Biol.Chem.246:4504−450
9）に記載されるようにして大部分除去する。SDSの除去
は一般に不完全であることに注意すべきである。BDNFを
マイクロ配列決定するための精製法はHoferおよびBarde
（1988,Nature331:261〜262）により改変され、そして
精製の最終工程にはゲル電気氷動を使用しない。
（２） 脳由来神経栄養因子バイオアッセイ BDNF活性を定量的にあるいは定性的に示す任意のシス
テムが本発明に従って使用できる。かかるバイオアッセ
イは、天然型または組み換えBDNF活性を同定および／ま
たは測定するのに有用であり得る。
テムが本発明に従って使用できる。かかるバイオアッセ
イは、天然型または組み換えBDNF活性を同定および／ま
たは測定するのに有用であり得る。
当業上知られた任意のBDNFバイオアッセイを使用でき
る。例えば、ニワトリ胚背根神経節（DRG）ニューロン
をBarde等（1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1199−
1203）に記載されるようにしてBDNFアッセイに使用でき
る。
る。例えば、ニワトリ胚背根神経節（DRG）ニューロン
をBarde等（1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1199−
1203）に記載されるようにしてBDNFアッセイに使用でき
る。
例示すると、６〜14日令ニワトリ胚、好ましくは10〜
12日令ニワトリ胚からの背根神経節を当業上知られた切
開法を用いて集め、そして少量のF14培地（GIBCO F−12
パウダーから調製、Vogelら,1972,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.69:3180−3184に記載のごとく補添）に直ちに入
れることができ、そしてこの培地は切開の終了時に約0.
1パーセントトリプシンを含有するCa2+およびMg2+不含
燐酸緩衝食塩水（PBS）で置き換えなければならない。3
7℃で約20分のインキュベーション後、この神経節を遠
心し、そして約10パーセント（容量／容量）熱−不活性
化ウマ血清を含有するF14培地で２回洗浄し得る。次い
で、この神経節を小さい（約1mm）直径のシリコーン処
理パスツールピペットを使用して穏やかに摩砕（約10〜
15吸引）することによって解離させ得る。次に組織の残
りの塊は、細胞浮遊液を約40μｍサイズの細孔を有する
ナイロンメッシュに通すことによって除去されるのが好
ましい。次にこの細胞浮遊液を約210分間プラスチック
製組織培養皿にプレ塗布しうる。この期間中に非ニュー
ロン細胞のほとんどがプラスチック表面に付着し、浮遊
液中にニューロン富化された細胞集団が残る筈である。
細胞を次に塗布用培地（好ましくは、抗生物質と一緒に
10パーセント（容量／容量）熱−不活性化ウマ血清を補
添したF14培地）の１ミリリットル当たり約５×103細胞
の濃度に希釈し、そしてポリオルニチン、あるいは好ま
しくはポリオルニチン／ラミニン被覆組織培養皿に入れ
ることができる（下記を参照のこと）。
12日令ニワトリ胚からの背根神経節を当業上知られた切
開法を用いて集め、そして少量のF14培地（GIBCO F−12
パウダーから調製、Vogelら,1972,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.69:3180−3184に記載のごとく補添）に直ちに入
れることができ、そしてこの培地は切開の終了時に約0.
1パーセントトリプシンを含有するCa2+およびMg2+不含
燐酸緩衝食塩水（PBS）で置き換えなければならない。3
7℃で約20分のインキュベーション後、この神経節を遠
心し、そして約10パーセント（容量／容量）熱−不活性
化ウマ血清を含有するF14培地で２回洗浄し得る。次い
で、この神経節を小さい（約1mm）直径のシリコーン処
理パスツールピペットを使用して穏やかに摩砕（約10〜
15吸引）することによって解離させ得る。次に組織の残
りの塊は、細胞浮遊液を約40μｍサイズの細孔を有する
ナイロンメッシュに通すことによって除去されるのが好
ましい。次にこの細胞浮遊液を約210分間プラスチック
製組織培養皿にプレ塗布しうる。この期間中に非ニュー
ロン細胞のほとんどがプラスチック表面に付着し、浮遊
液中にニューロン富化された細胞集団が残る筈である。
細胞を次に塗布用培地（好ましくは、抗生物質と一緒に
10パーセント（容量／容量）熱−不活性化ウマ血清を補
添したF14培地）の１ミリリットル当たり約５×103細胞
の濃度に希釈し、そしてポリオルニチン、あるいは好ま
しくはポリオルニチン／ラミニン被覆組織培養皿に入れ
ることができる（下記を参照のこと）。
限定するつもりはないが別法として、NGFに対して比
較的に非感受性のBDNFバイオアッセイは、ある状況にお
いては、ある条件下にBDNFおよびNGFの両方に応答しう
る上記のDRG系のような系よりも好ましくあり得る。か
かる比較的BDNF特異的システムには、網膜神経節培養物
並びに神経プラコード由来のニューロンからの培養物が
包含される。
較的に非感受性のBDNFバイオアッセイは、ある状況にお
いては、ある条件下にBDNFおよびNGFの両方に応答しう
る上記のDRG系のような系よりも好ましくあり得る。か
かる比較的BDNF特異的システムには、網膜神経節培養物
並びに神経プラコード由来のニューロンからの培養物が
包含される。
周産期の網膜細胞は、Johnson等（1986,J.Neurosci.
6:3031−3038）に記載の方法に従って培養され得る。例
えば、網膜を周産期の動物から取り出し（ラットにおけ
る本明細書での「周産期」なる用語は胚17日令胚から生
後48時間以内の出生直後のラットを言う）、カルシウム
およびマグネシウムを含まない燐酸緩衝食塩水（PBS）
中で洗浄し、次いで約0.05〜0.1％トリプシンを含有す
るPBS中で約15分間約37℃でインキュベートする。タン
パク分解的消化の後、網膜を、10パーセント（容量／容
量）熱−不活性化ウマ血清を含有するF14培地（F14−H
S）中で洗浄し得る。次に網膜を少量（約１〜10ml）の
新たなF14−HS中で穏やかにピペッティングすることに
よって解離させることができる。本解離の組織は沈降さ
せ、そして残りの細胞および培地をピペット分離して培
養することができる。
6:3031−3038）に記載の方法に従って培養され得る。例
えば、網膜を周産期の動物から取り出し（ラットにおけ
る本明細書での「周産期」なる用語は胚17日令胚から生
後48時間以内の出生直後のラットを言う）、カルシウム
およびマグネシウムを含まない燐酸緩衝食塩水（PBS）
中で洗浄し、次いで約0.05〜0.1％トリプシンを含有す
るPBS中で約15分間約37℃でインキュベートする。タン
パク分解的消化の後、網膜を、10パーセント（容量／容
量）熱−不活性化ウマ血清を含有するF14培地（F14−H
S）中で洗浄し得る。次に網膜を少量（約１〜10ml）の
新たなF14−HS中で穏やかにピペッティングすることに
よって解離させることができる。本解離の組織は沈降さ
せ、そして残りの細胞および培地をピペット分離して培
養することができる。
あるいはまた、神経プラコード由来細胞からなるBDNF
バイオアッセイを本発明に従って用いることができる。
例えば、三叉神経節または前庭、膝状、錐体または結節
神経節の腹側外側部分の胚脳神経外植物を、培地で覆わ
れたコラーゲン−ゲル中でDavies等（1986,J.Neurosci.
6:1897−1904）に記載されるようにして培養するかある
いはBarde等（1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1199
−1203）に従って解離させることができる。
バイオアッセイを本発明に従って用いることができる。
例えば、三叉神経節または前庭、膝状、錐体または結節
神経節の腹側外側部分の胚脳神経外植物を、培地で覆わ
れたコラーゲン−ゲル中でDavies等（1986,J.Neurosci.
6:1897−1904）に記載されるようにして培養するかある
いはBarde等（1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1199
−1203）に従って解離させることができる。
BDNFに対する応答性が、増殖基質をポリオルニチンか
らポリオルニチン／ラミニンに変えることによって10倍
増加させうることが観察されているので（Bardeら,198
7,Prog.Brain Res.71:185−189）、BDNFアッセイは、ラ
ミニン含有基質上で行うことが好ましい。培養物表面
は、例えば（ｉ）培養物表面を約８〜10時間ポリオルニ
チンの滅菌溶液で被覆し；（ii）数回滅菌水で洗浄し；
そして（iii）PBS中の約25μm/ml濃度のラミニンで約２
時間培養物表面を被覆することによって調製することが
できる（Johnsonら,1986,J.Neurosci.6:3031−3038）。
らポリオルニチン／ラミニンに変えることによって10倍
増加させうることが観察されているので（Bardeら,198
7,Prog.Brain Res.71:185−189）、BDNFアッセイは、ラ
ミニン含有基質上で行うことが好ましい。培養物表面
は、例えば（ｉ）培養物表面を約８〜10時間ポリオルニ
チンの滅菌溶液で被覆し；（ii）数回滅菌水で洗浄し；
そして（iii）PBS中の約25μm/ml濃度のラミニンで約２
時間培養物表面を被覆することによって調製することが
できる（Johnsonら,1986,J.Neurosci.6:3031−3038）。
本発明により用いられるいかなるバイオアッセイシス
テムにおいても、BDNF用量−応答曲線を当該技術分野で
知られた方法を使用して確立できる。解離したニワトリ
知覚神経節アッセイを用いると、半−最大生存は、約5n
g/ml精製BDNF濃度で観察され、そして最大生存は約10〜
20ng/ml精製BDNF濃度で観察された（Bardeら,1987,Pro
g.Brain Res.71:185−189）。
テムにおいても、BDNF用量−応答曲線を当該技術分野で
知られた方法を使用して確立できる。解離したニワトリ
知覚神経節アッセイを用いると、半−最大生存は、約5n
g/ml精製BDNF濃度で観察され、そして最大生存は約10〜
20ng/ml精製BDNF濃度で観察された（Bardeら,1987,Pro
g.Brain Res.71:185−189）。
（３） 脳由来神経栄養因子タンパク質のマイクロ配列
決定 脳から調製されたBDNFタンパク質は配列決定すること
ができるが、BDNFタンパク質が極めて稀なのでBDNFタン
パク質配列の実質的部分を確かに得ることができなさそ
うなことを強調しなければならない。このタンパク質
は、直接配列決定することができるし、あるいは例えば
それらに限定されるものではないがスタフィロコッカス
・アウレウス（StaphyLococcus aureus）V8、トリプシ
ンおよびシアノーゲンブロミドを含む任意のプロテアー
ゼまたは当業上知られたその他の化合物で最初に切断す
ることができる。ペプチドは、Hewick等（1981,J.Biol.
Chem.256:7990−7997）およびHunkapillar等（1983,Met
hods Enzymol.91:227−236）の方法に従って気相マイク
ロシーケンサーでの自動化エドマン分解によって配列決
定することができる。次いで、フェニルチオヒダントイ
ンアミノ酸の検出を、Lottspeich（1985,Chromatograph
y 326:321−327）に従って行うことができる。アミノ酸
配列の重なるフラグメントを決定し、そして連続配列の
長い伸びを推定するのに使用できる。
決定 脳から調製されたBDNFタンパク質は配列決定すること
ができるが、BDNFタンパク質が極めて稀なのでBDNFタン
パク質配列の実質的部分を確かに得ることができなさそ
うなことを強調しなければならない。このタンパク質
は、直接配列決定することができるし、あるいは例えば
それらに限定されるものではないがスタフィロコッカス
・アウレウス（StaphyLococcus aureus）V8、トリプシ
ンおよびシアノーゲンブロミドを含む任意のプロテアー
ゼまたは当業上知られたその他の化合物で最初に切断す
ることができる。ペプチドは、Hewick等（1981,J.Biol.
Chem.256:7990−7997）およびHunkapillar等（1983,Met
hods Enzymol.91:227−236）の方法に従って気相マイク
ロシーケンサーでの自動化エドマン分解によって配列決
定することができる。次いで、フェニルチオヒダントイ
ンアミノ酸の検出を、Lottspeich（1985,Chromatograph
y 326:321−327）に従って行うことができる。アミノ酸
配列の重なるフラグメントを決定し、そして連続配列の
長い伸びを推定するのに使用できる。
（４） 脳由来神経栄養因子コードDNAのクローニング BDNFが稀少であることがBDNF遺伝子をクローニングす
るための標準的方法の使用を事実上排除している。例え
ば、入手しうるタンパク質配列を使用して相補性の標識
されたオリゴヌクレオチドプローブを生成させ、そして
このプローブを使用して、BDNFを合成すると想定される
組織から生成されたcDNAライブラリーをスクリーニング
するならば、陽性クローンの数はほとんどないほど小さ
くなろう。本発明は、好適な量のBDNFタンパク質の精
製、BDNFタンパク質のマイクロ配列決定、オリゴヌクレ
オチドプローブの誘導、cDNAライブラリーの作製、誘導
されたBDNFアミノ酸配列に基づく増幅、そして最後にBD
NF遺伝子の選択からなる操作の組合せにより、BDNF遺伝
子のクローニングを提供するものである。本発明のこの
方法において、増幅に関する好ましい操作は、クローニ
ングに利用可能なBDNF配列の数を増加させるために、ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）による組織核酸配列の増幅
を使用するものである（Saikiら,1985,Science 230:135
0−1354）。好ましい方法の詳細な説明は以下の通りで
ある。
るための標準的方法の使用を事実上排除している。例え
ば、入手しうるタンパク質配列を使用して相補性の標識
されたオリゴヌクレオチドプローブを生成させ、そして
このプローブを使用して、BDNFを合成すると想定される
組織から生成されたcDNAライブラリーをスクリーニング
するならば、陽性クローンの数はほとんどないほど小さ
くなろう。本発明は、好適な量のBDNFタンパク質の精
製、BDNFタンパク質のマイクロ配列決定、オリゴヌクレ
オチドプローブの誘導、cDNAライブラリーの作製、誘導
されたBDNFアミノ酸配列に基づく増幅、そして最後にBD
NF遺伝子の選択からなる操作の組合せにより、BDNF遺伝
子のクローニングを提供するものである。本発明のこの
方法において、増幅に関する好ましい操作は、クローニ
ングに利用可能なBDNF配列の数を増加させるために、ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）による組織核酸配列の増幅
を使用するものである（Saikiら,1985,Science 230:135
0−1354）。好ましい方法の詳細な説明は以下の通りで
ある。
初めに、精製BDNFタンパク質から誘導されたアミノ酸
配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応に使用するオリゴヌ
クレオチドプライマーを導き出すことができる。数個の
核酸トリプレットが同一アミノ酸を特定できる遺伝子コ
ードの縮重ゆえに、多重のあり得るヌクレオチド配列組
合せに備えるためには、数種のオリゴヌクレオチドを所
定のアミノ酸配列に関して製造しなければならない。得
られるオリゴヌクレオチドを縮重プライマーと呼ぶ。
配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応に使用するオリゴヌ
クレオチドプライマーを導き出すことができる。数個の
核酸トリプレットが同一アミノ酸を特定できる遺伝子コ
ードの縮重ゆえに、多重のあり得るヌクレオチド配列組
合せに備えるためには、数種のオリゴヌクレオチドを所
定のアミノ酸配列に関して製造しなければならない。得
られるオリゴヌクレオチドを縮重プライマーと呼ぶ。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、センス鎖並びにア
ンチセンス鎖プライマーを必要とする。従って、BDNFア
ミノ酸配列に相当する縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、一つのDNA鎖のためのプラーマーとして使用で
き、そして共通に存在するDNA配列に相同な第２のプラ
イマー、例えばmRNAのポリアデノシン末尾の逆転写から
生じるチミジン残基の伸びを第２のDNA鎖のプライマー
として使用できる。次にこれらのプライマーを、BDNFコ
ード配列例えばゲノムDNAまたは好ましくはBDNFを合成
すると想定される組織から回収されたmRNAから調製され
たcDNAを含有すると推定される核酸鋳型とのポリメラー
ゼ連鎖反応に使用することができる。次いで、このDNA
反応生成物を、DNA反応生成物がBDNF遺伝子の予想され
る寸法と同様の分子寸法を有するかどうか判定するため
に電気泳動によっておよび好ましくはヌクレオチド配列
分析によって分析することができる。
ンチセンス鎖プライマーを必要とする。従って、BDNFア
ミノ酸配列に相当する縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、一つのDNA鎖のためのプラーマーとして使用で
き、そして共通に存在するDNA配列に相同な第２のプラ
イマー、例えばmRNAのポリアデノシン末尾の逆転写から
生じるチミジン残基の伸びを第２のDNA鎖のプライマー
として使用できる。次にこれらのプライマーを、BDNFコ
ード配列例えばゲノムDNAまたは好ましくはBDNFを合成
すると想定される組織から回収されたmRNAから調製され
たcDNAを含有すると推定される核酸鋳型とのポリメラー
ゼ連鎖反応に使用することができる。次いで、このDNA
反応生成物を、DNA反応生成物がBDNF遺伝子の予想され
る寸法と同様の分子寸法を有するかどうか判定するため
に電気泳動によっておよび好ましくはヌクレオチド配列
分析によって分析することができる。
しかしながら、PCRにおける２種類の縮重プライマー
の使用がBDNFをコードしない核酸配列を増幅させる可能
性を高めるので、好ましい方法は一方のみが縮重プライ
マーでもう一方のプライマーが正確なBDNF配列に相当す
る使用を提供するものである。正確なBDNF配列を同定す
るためには、精製BDNFタンパク質を使用して決定された
アミノ酸配列を用いて、縮重センスおよびアンチセンス
オリゴヌクレオチドプライマーの両方を設計できる。鋳
型としてBDNFコード核酸を用いてPCR反応でこれらのプ
ライマーの使用から得られるDNA反応生成物は、そのプ
ライマーを設計するのに使用されたアミノ酸の伸張部分
をコードする核酸フラグメントである筈であり、そして
予測可能な寸法を有し得る（例えば、最低限、アミノ酸
残基の数に３を乗じた塩基対の長さ）。DNA反応生成物
の配列分析は、増幅された核酸配列が事実BDNFペプチド
フラグメントをコードしうることを確証するために、確
認されたアミノ酸配列と比較することができる。当業上
知られた任意の核酸配列化法を使用しうるが、ジデオキ
シヌクレオチドチェインターミネーター法（Sangerら,1
979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3918−3921）を使用
するのが好ましい。配列化は、ゲル精製されたかあるい
は好ましくはクローン化されたDNA反応生成物を用いて
達成できる。次にDNA反応生成物の配列を、正確なBDNF
コード配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマーの
設計に使用することができる。次いで、このプライマー
を、縮重物でありうる第２プライマーと一緒に使用して
最初に決定された正確な配列のフラグメントによって表
される範囲を越えてBDNF−配列の量を拡大することがで
きる。例えば、それに限定するつもりはないが、センス
鎖プライマーは正確なBDNFヌクレオチド配列に相当しう
るが、アンチセンス鎖プライマーは、配列されたフラグ
メントの下流で見出される可能性のある配列の領域、例
えばcDNAにおいて逆転写されたmRNAのポリアデノシン末
尾に相同な縮重プライマーであることができる。次い
で、配列されたフラグメントの上流の配列を回復するた
めに同様な方法を使用する必要があろう。例えば、アン
チセンス鎖プライマーは正確なBDNFヌクレオチド配列に
相当し、そしてセンス鎖プライマーは、配列化されたフ
ラグメントの上流にあるBDNF配列の領域と相同な縮重プ
ライマー、例えば末端デオキシヌクレオチドトランスフ
ェラーゼを用いてcDNAの５′末端で添加された５′ポリ
アデノシン末尾であることができる。従って、完全なBD
NF遺伝子またはmRNAの配列を組み立てることができる。
の使用がBDNFをコードしない核酸配列を増幅させる可能
性を高めるので、好ましい方法は一方のみが縮重プライ
マーでもう一方のプライマーが正確なBDNF配列に相当す
る使用を提供するものである。正確なBDNF配列を同定す
るためには、精製BDNFタンパク質を使用して決定された
アミノ酸配列を用いて、縮重センスおよびアンチセンス
オリゴヌクレオチドプライマーの両方を設計できる。鋳
型としてBDNFコード核酸を用いてPCR反応でこれらのプ
ライマーの使用から得られるDNA反応生成物は、そのプ
ライマーを設計するのに使用されたアミノ酸の伸張部分
をコードする核酸フラグメントである筈であり、そして
予測可能な寸法を有し得る（例えば、最低限、アミノ酸
残基の数に３を乗じた塩基対の長さ）。DNA反応生成物
の配列分析は、増幅された核酸配列が事実BDNFペプチド
フラグメントをコードしうることを確証するために、確
認されたアミノ酸配列と比較することができる。当業上
知られた任意の核酸配列化法を使用しうるが、ジデオキ
シヌクレオチドチェインターミネーター法（Sangerら,1
979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3918−3921）を使用
するのが好ましい。配列化は、ゲル精製されたかあるい
は好ましくはクローン化されたDNA反応生成物を用いて
達成できる。次にDNA反応生成物の配列を、正確なBDNF
コード配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマーの
設計に使用することができる。次いで、このプライマー
を、縮重物でありうる第２プライマーと一緒に使用して
最初に決定された正確な配列のフラグメントによって表
される範囲を越えてBDNF−配列の量を拡大することがで
きる。例えば、それに限定するつもりはないが、センス
鎖プライマーは正確なBDNFヌクレオチド配列に相当しう
るが、アンチセンス鎖プライマーは、配列されたフラグ
メントの下流で見出される可能性のある配列の領域、例
えばcDNAにおいて逆転写されたmRNAのポリアデノシン末
尾に相同な縮重プライマーであることができる。次い
で、配列されたフラグメントの上流の配列を回復するた
めに同様な方法を使用する必要があろう。例えば、アン
チセンス鎖プライマーは正確なBDNFヌクレオチド配列に
相当し、そしてセンス鎖プライマーは、配列化されたフ
ラグメントの上流にあるBDNF配列の領域と相同な縮重プ
ライマー、例えば末端デオキシヌクレオチドトランスフ
ェラーゼを用いてcDNAの５′末端で添加された５′ポリ
アデノシン末尾であることができる。従って、完全なBD
NF遺伝子またはmRNAの配列を組み立てることができる。
DNA反応生成物は、当業上知られた任意の方法を使用
してクローン化し得る。当業上知られた多数のベクター
−宿主系を使用できる。可能なベクターとして、これら
に限定されるものではないが、コスミド、プラスミドま
たは変性ウイルスが挙げられ、ベクター系は、使用され
る宿主細胞に適合性でなければならない。かかるベクタ
ーとして、これらに限定されるものではないが、バクテ
リオファージ例えばラムダ誘導体、またはプラスミド例
えばpBR322、pUCまたはBluescript （Stratagene）プ
ラスミド誘導体が挙げられる。組み換え分子は形質転
換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーシ
ョン等を介して宿主に導入できる。
してクローン化し得る。当業上知られた多数のベクター
−宿主系を使用できる。可能なベクターとして、これら
に限定されるものではないが、コスミド、プラスミドま
たは変性ウイルスが挙げられ、ベクター系は、使用され
る宿主細胞に適合性でなければならない。かかるベクタ
ーとして、これらに限定されるものではないが、バクテ
リオファージ例えばラムダ誘導体、またはプラスミド例
えばpBR322、pUCまたはBluescript （Stratagene）プ
ラスミド誘導体が挙げられる。組み換え分子は形質転
換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーシ
ョン等を介して宿主に導入できる。
BDNF遺伝子は、遺伝子配列の数多くのコピーを生成さ
せるために好適な宿主細胞を形質転換、トランスフェク
ションまたは感染するのに使用できるクローニングベク
ターに挿入される。これは、相補性付着末端を有するク
ローニングベクターにDNAフラグメントを連結すること
によって達成できる。しかしながら、DNAをフラグメン
ト化するのに使用される相補性制限部位がクローニング
ベクター中に存在しない場合、DNA分子の末端を酵素的
に修飾することができる。制限エンドヌクレアーゼ開裂
部位を、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるオリゴヌク
レオチドプライマーに取り込んでベクターへの挿入を促
進することが有利であることが証明されよう。別法とし
て、所望される任意の部位を、ヌクレオチド配列（リン
カー）をDNA末端に連結することによって生成させるこ
とができる。これら連結されたリンカーは、制限エンド
ヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学的に合
成されたオリゴヌクレオチドからなり得る。あるいはま
た、開裂したベクターおよびBDNF遺伝子をホモポリマー
ティリングによって修飾することができる。
せるために好適な宿主細胞を形質転換、トランスフェク
ションまたは感染するのに使用できるクローニングベク
ターに挿入される。これは、相補性付着末端を有するク
ローニングベクターにDNAフラグメントを連結すること
によって達成できる。しかしながら、DNAをフラグメン
ト化するのに使用される相補性制限部位がクローニング
ベクター中に存在しない場合、DNA分子の末端を酵素的
に修飾することができる。制限エンドヌクレアーゼ開裂
部位を、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるオリゴヌク
レオチドプライマーに取り込んでベクターへの挿入を促
進することが有利であることが証明されよう。別法とし
て、所望される任意の部位を、ヌクレオチド配列（リン
カー）をDNA末端に連結することによって生成させるこ
とができる。これら連結されたリンカーは、制限エンド
ヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学的に合
成されたオリゴヌクレオチドからなり得る。あるいはま
た、開裂したベクターおよびBDNF遺伝子をホモポリマー
ティリングによって修飾することができる。
詳細な実施態様においては、単離されたBDNF遺伝子、
cDNAまたは合成DNA配列を取り込んだ組み換えDNA分子に
よる宿主細胞の形質転換により遺伝子の多コピーを生成
させることができる。従って、遺伝子は、形質転換体を
増殖させ、その形質転換体から組み換えDNA分子を単離
し、そして必要な場合は単離された組み換えDNAから挿
入された遺伝子を回収することによって多量に得ること
ができる。
cDNAまたは合成DNA配列を取り込んだ組み換えDNA分子に
よる宿主細胞の形質転換により遺伝子の多コピーを生成
させることができる。従って、遺伝子は、形質転換体を
増殖させ、その形質転換体から組み換えDNA分子を単離
し、そして必要な場合は単離された組み換えDNAから挿
入された遺伝子を回収することによって多量に得ること
ができる。
本発明の好ましい実施態様によれば、一たんBDNFをコ
ードするcDNA由来クローンが生成されると、BDNFをコー
ドするゲノムクローンを、当業上知られた標準的技術を
使用して単離できる。例えば、標識された核酸プローブ
をBDNFクローンから誘導することができ、そして例えば
バクテリオファージライブラリーに関するBentonおよび
Davis（1977,Scinece 196:180）およびプラスミドライ
ブラリーに関するGrunsteinおよびHogness（1975,Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961−3965）に記載される方
法を用いて核酸ハイブリッド形成によってゲノムDNAラ
イブラリーをスクリーニングするのに使用することがで
きる。次いで、回収されたクローンを当業上知られた方
法で制限フラグメントマッピングおよび配列法によって
分析することができる。
ードするcDNA由来クローンが生成されると、BDNFをコー
ドするゲノムクローンを、当業上知られた標準的技術を
使用して単離できる。例えば、標識された核酸プローブ
をBDNFクローンから誘導することができ、そして例えば
バクテリオファージライブラリーに関するBentonおよび
Davis（1977,Scinece 196:180）およびプラスミドライ
ブラリーに関するGrunsteinおよびHogness（1975,Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961−3965）に記載される方
法を用いて核酸ハイブリッド形成によってゲノムDNAラ
イブラリーをスクリーニングするのに使用することがで
きる。次いで、回収されたクローンを当業上知られた方
法で制限フラグメントマッピングおよび配列法によって
分析することができる。
更に、付加的cDNAクローンは本発明に従って得られた
配列を使用してcDNAライブラリーから同定できる。
配列を使用してcDNAライブラリーから同定できる。
（５） 脳由来神経栄養因子遺伝子の発現 BDNFタンパク質をコードするヌクレオチド配列または
その一部分を好適な発現ベクター、すなわち挿入された
タンパク質コード配列の転写および翻訳に必須なエレメ
ントを含有するベクターに挿入することができる。ま
た、必要な転写および翻訳シグナルは、天然型BDNF遺伝
子および／またはその側部領域によって供給されること
もできる。種々の宿主−ベクター系を使用してタンパク
質コード配列を発現させことができる。それらには、限
定されるわけではないが、ウイルス［例えば、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス等］に感染した哺乳動物細
胞系；ウイルス［例えば、バキュロウイルスに感染した
昆虫細胞系；微生物、例えば酵母ベクターを含有する酵
母またはバクテリオファージDNA、プラスミドDNAあるい
はコスミドDNAで形質転換された細菌が包含される。こ
れらのベクターの発現エレメントは、その強さおよび特
異性が異なる。使用される宿主−ベクター系に応じ、数
多くの好適な転写および翻訳エレメントの任意の１つを
使用し得る。
その一部分を好適な発現ベクター、すなわち挿入された
タンパク質コード配列の転写および翻訳に必須なエレメ
ントを含有するベクターに挿入することができる。ま
た、必要な転写および翻訳シグナルは、天然型BDNF遺伝
子および／またはその側部領域によって供給されること
もできる。種々の宿主−ベクター系を使用してタンパク
質コード配列を発現させことができる。それらには、限
定されるわけではないが、ウイルス［例えば、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス等］に感染した哺乳動物細
胞系；ウイルス［例えば、バキュロウイルスに感染した
昆虫細胞系；微生物、例えば酵母ベクターを含有する酵
母またはバクテリオファージDNA、プラスミドDNAあるい
はコスミドDNAで形質転換された細菌が包含される。こ
れらのベクターの発現エレメントは、その強さおよび特
異性が異なる。使用される宿主−ベクター系に応じ、数
多くの好適な転写および翻訳エレメントの任意の１つを
使用し得る。
DNAフラグメントをベクターに挿入するための以前に
記載された任意の方法を使用して好適な転写／翻訳制御
シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺
伝子を含有する発現ベクターを作製することができる。
これらの方法には、インビトロ組み換えDNAおよび合成
技術並びにインビボ組み換え（遺伝子組み換え）が包含
される。BDNFタンパク質またはそのペプチドフラグメン
トをコードする核酸配列の発現は、BDNFタンパク質また
はペプチドが組み換えDNA分子で形質転換された宿主中
で発現されるように第２の核酸配列によって調節される
ことができる。例えば、BDNFの発現は当業上知られた任
意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制
御されうる。BDNF発現を制御するのに使用できるプロモ
ーターには、それらに限定されるものではないが、SV40
早期プロモーター領域（BernoistおよびChambon,1981,N
ature 290:304−310）、ラウス肉腫ウイルスの長い３′
末端重複に含有されるプロモーター（Yamamotoら,1980,
Cell 22:787−797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモ
ーター（Wagnerら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:
144−1445）、メタロチオニン遺伝子の調節配列（Brins
terら,1982,Nature 296:39−42）；原核生物発現ベクタ
ー例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Villa−Komar
offら,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727−373
1）、またはtacプロモーター［DeBoerら,1983,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.80:21−25（Scientific American,19
80,242:74−94における“Useful proteins from recomb
inant bacteria"も参照のこと）］；ノパリンシンセタ
ーゼプロモーター領域からなる植物発現ベクター（Herr
era−Estrellaら,Nature 303:209−213）またはカリフ
ラワーモザイクウイルス 35S RNAプロモーター（Gardne
rら,1981,Nucl.Acids Res.9:2871）、および光合成酵素
リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ（Herrera
−Estrellaら,1984,Nature 310:115−20）；酵母または
その他の菌類からのプロモーターエレメント、例えばGa
l 4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）
プロモーター、PGK（ホスフォグリセロールキナーゼ）
プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、
および組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動
物で利用されている以下の動物転写制御領域すなわち脾
臓房状細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領
域（Swiftら,1984,Cell 38:639−646;Ornitzら,1986,Co
ld Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399−409;MacDo
nald,1987,Hepatology 7:425−515）；脾臓ベータ細胞
において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan,19
85,Nature 315:115−122）、リンパ球において活性な免
疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら,1984,Cell
38:647−658;Adamesら,1985,Nature 318:533−538;Ale
xanderら,1987,Mol.Cell.Biol.7:1436−1444）、睾丸、
乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性なマウス
乳房腫瘍ウイルス制御領域（Leder et al.,1986,Cell 4
5:485−495）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制
御領域（Pinkertら,1987,GenesおよびDevel.1:268−27
6）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン
遺伝子制御領域（Krumlaufら,1985,Mol.Cell Biol.5:16
39−1648:Hammerら,1987,Science 235:53−58）、肝臓
において活性なアルファ−１−アンチトリプシン遺伝子
制御領域（Kelseyら,1987,GenesおよびDevel.1:161−17
1）、骨髄細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子
制御領域（Mogramら,1985,Nature 315:338−340;Kollia
sら,1986,Cell 46:89−94）；ヌカ中の寡突起神経膠細
胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御
領域（Readheadら,1987,Cell 48:703−712）；骨格筋に
おいて活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani,1
985,Nature 314:283−286）、および視床下部において
活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら,
1986,Science 234:1372−1378）が包含される。
記載された任意の方法を使用して好適な転写／翻訳制御
シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺
伝子を含有する発現ベクターを作製することができる。
これらの方法には、インビトロ組み換えDNAおよび合成
技術並びにインビボ組み換え（遺伝子組み換え）が包含
される。BDNFタンパク質またはそのペプチドフラグメン
トをコードする核酸配列の発現は、BDNFタンパク質また
はペプチドが組み換えDNA分子で形質転換された宿主中
で発現されるように第２の核酸配列によって調節される
ことができる。例えば、BDNFの発現は当業上知られた任
意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制
御されうる。BDNF発現を制御するのに使用できるプロモ
ーターには、それらに限定されるものではないが、SV40
早期プロモーター領域（BernoistおよびChambon,1981,N
ature 290:304−310）、ラウス肉腫ウイルスの長い３′
末端重複に含有されるプロモーター（Yamamotoら,1980,
Cell 22:787−797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモ
ーター（Wagnerら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:
144−1445）、メタロチオニン遺伝子の調節配列（Brins
terら,1982,Nature 296:39−42）；原核生物発現ベクタ
ー例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Villa−Komar
offら,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727−373
1）、またはtacプロモーター［DeBoerら,1983,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.80:21−25（Scientific American,19
80,242:74−94における“Useful proteins from recomb
inant bacteria"も参照のこと）］；ノパリンシンセタ
ーゼプロモーター領域からなる植物発現ベクター（Herr
era−Estrellaら,Nature 303:209−213）またはカリフ
ラワーモザイクウイルス 35S RNAプロモーター（Gardne
rら,1981,Nucl.Acids Res.9:2871）、および光合成酵素
リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ（Herrera
−Estrellaら,1984,Nature 310:115−20）；酵母または
その他の菌類からのプロモーターエレメント、例えばGa
l 4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）
プロモーター、PGK（ホスフォグリセロールキナーゼ）
プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、
および組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動
物で利用されている以下の動物転写制御領域すなわち脾
臓房状細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領
域（Swiftら,1984,Cell 38:639−646;Ornitzら,1986,Co
ld Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399−409;MacDo
nald,1987,Hepatology 7:425−515）；脾臓ベータ細胞
において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan,19
85,Nature 315:115−122）、リンパ球において活性な免
疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら,1984,Cell
38:647−658;Adamesら,1985,Nature 318:533−538;Ale
xanderら,1987,Mol.Cell.Biol.7:1436−1444）、睾丸、
乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性なマウス
乳房腫瘍ウイルス制御領域（Leder et al.,1986,Cell 4
5:485−495）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制
御領域（Pinkertら,1987,GenesおよびDevel.1:268−27
6）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン
遺伝子制御領域（Krumlaufら,1985,Mol.Cell Biol.5:16
39−1648:Hammerら,1987,Science 235:53−58）、肝臓
において活性なアルファ−１−アンチトリプシン遺伝子
制御領域（Kelseyら,1987,GenesおよびDevel.1:161−17
1）、骨髄細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子
制御領域（Mogramら,1985,Nature 315:338−340;Kollia
sら,1986,Cell 46:89−94）；ヌカ中の寡突起神経膠細
胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御
領域（Readheadら,1987,Cell 48:703−712）；骨格筋に
おいて活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani,1
985,Nature 314:283−286）、および視床下部において
活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら,
1986,Science 234:1372−1378）が包含される。
BDNF遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは、三種の
一般的方法、すなわち、（ａ）DNA−DNAハイブリッド形
成、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在
および（ｃ）挿入された配列の発現によって同定するこ
とができる。第１の方法では、発現ベクターに挿入され
た外来遺伝子の存在を、挿入されたBDNF遺伝子に相同の
配列からなるプローブを使用するDNA/DNAハイブリッド
形成によって検出することができる。第２の方法におい
ては、組み換えベクター／宿主系は、外来遺伝子のベク
ターへの挿入によって惹起されるある種の「マーカー」
遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質
に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにお
ける閉塞体形成等）の存在または不存在に基づいて同定
および選択することができる。例えば、BDNF遺伝子がベ
クターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、BDNF
挿入物を含有する組み換え体はマーカー遺伝子機能の不
存在によって同定することができる。第３の方法におい
ては、組み換え発現ベクターは組み換え体によって発現
された外来遺伝子産物をアッセイすることによって同定
することができる。かかるアッセイは、例えば前述の第
（２）節に記載されるバイオアッセイシステムでBDNF遺
伝子産物の物理的または機能的性質に基づいて行うこと
ができる。
一般的方法、すなわち、（ａ）DNA−DNAハイブリッド形
成、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在
および（ｃ）挿入された配列の発現によって同定するこ
とができる。第１の方法では、発現ベクターに挿入され
た外来遺伝子の存在を、挿入されたBDNF遺伝子に相同の
配列からなるプローブを使用するDNA/DNAハイブリッド
形成によって検出することができる。第２の方法におい
ては、組み換えベクター／宿主系は、外来遺伝子のベク
ターへの挿入によって惹起されるある種の「マーカー」
遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質
に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにお
ける閉塞体形成等）の存在または不存在に基づいて同定
および選択することができる。例えば、BDNF遺伝子がベ
クターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、BDNF
挿入物を含有する組み換え体はマーカー遺伝子機能の不
存在によって同定することができる。第３の方法におい
ては、組み換え発現ベクターは組み換え体によって発現
された外来遺伝子産物をアッセイすることによって同定
することができる。かかるアッセイは、例えば前述の第
（２）節に記載されるバイオアッセイシステムでBDNF遺
伝子産物の物理的または機能的性質に基づいて行うこと
ができる。
一たん特定の組み換えDNA分子が同定および単離され
ると、当業上知られたいくつかの方法を使用してこれを
増殖させることができる。一たん好適な宿主系および増
殖条件が確立されると、組み換え発現ベクターを増殖さ
せそして多量に調製できる。先に説明した通り、使用で
きる発現ベクターには、限定するものではないが、少数
例をあげれば、以下のベクターまたはその誘導体、すな
わちヒトまたは動物ウイルス例えばワクシニアウイルス
またはアデノウイルス；昆虫ウイルス例えばバキュロウ
イルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター
（例えばラムダ）、およびプラスミド並びにコスミドDN
Aベクターが包含される。
ると、当業上知られたいくつかの方法を使用してこれを
増殖させることができる。一たん好適な宿主系および増
殖条件が確立されると、組み換え発現ベクターを増殖さ
せそして多量に調製できる。先に説明した通り、使用で
きる発現ベクターには、限定するものではないが、少数
例をあげれば、以下のベクターまたはその誘導体、すな
わちヒトまたは動物ウイルス例えばワクシニアウイルス
またはアデノウイルス；昆虫ウイルス例えばバキュロウ
イルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター
（例えばラムダ）、およびプラスミド並びにコスミドDN
Aベクターが包含される。
さらに、挿入された配列の発現を調節するかあるいは
所望の特異的様式で遺伝子産物を修飾しプロセシングす
る宿主細胞株を選択することもできる。ある種のプロモ
ーターからの発現はある種のインデューサーの存在下に
高めることができる。従って遺伝子工学的に作出された
BDNFタンパク質の発現を制御することができる。更にま
た、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後
プロセシングおよび修飾にとって特徴的かつ特異的メカ
ニズム（例えば、グリコシル化、開裂）を有している。
適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来
タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実とす
ることができる。例えば、細菌系における発現を用いて
グリコシル化されていないコアタンパク質産物を生成さ
せることができる。酵母における発現はグリコシル化さ
れた産物を生成しよう。哺乳類細胞における発現を用い
て異種BDNFタンパク質の「天然型」グリコシル化を確実
とすることができる。更にまた、種々のベクター／宿主
発現系は、例えばタンパク分解的開裂のようなプロセシ
ング反応に種々の程度に影響することができる。
所望の特異的様式で遺伝子産物を修飾しプロセシングす
る宿主細胞株を選択することもできる。ある種のプロモ
ーターからの発現はある種のインデューサーの存在下に
高めることができる。従って遺伝子工学的に作出された
BDNFタンパク質の発現を制御することができる。更にま
た、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後
プロセシングおよび修飾にとって特徴的かつ特異的メカ
ニズム（例えば、グリコシル化、開裂）を有している。
適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来
タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実とす
ることができる。例えば、細菌系における発現を用いて
グリコシル化されていないコアタンパク質産物を生成さ
せることができる。酵母における発現はグリコシル化さ
れた産物を生成しよう。哺乳類細胞における発現を用い
て異種BDNFタンパク質の「天然型」グリコシル化を確実
とすることができる。更にまた、種々のベクター／宿主
発現系は、例えばタンパク分解的開裂のようなプロセシ
ング反応に種々の程度に影響することができる。
本発明の詳細な実施態様においては、プレプロBDNFを
コードするDNAをpCMVプラスミド中にクローン化し、増
幅させ、そして次に燐酸カルシウム法（ChenおよびOkay
ama,1987,Mol.Cell.Biol.7:2745−2752）によってCOS細
胞をトランスフェクションするのに使用できる。次にBD
NF活性部分を細胞培地から回収することができる（後述
の実施例５参照のこと）。
コードするDNAをpCMVプラスミド中にクローン化し、増
幅させ、そして次に燐酸カルシウム法（ChenおよびOkay
ama,1987,Mol.Cell.Biol.7:2745−2752）によってCOS細
胞をトランスフェクションするのに使用できる。次にBD
NF活性部分を細胞培地から回収することができる（後述
の実施例５参照のこと）。
（5.1）発現された遺伝子産生物の同定および精製一た
んBDNF遺伝子を発現する組み換え体が同定されると、そ
の遺伝子産物を分析しなければならない。これは、その
産物の物理的または機能的性質に基づくアッセイによっ
て達成できる。
んBDNF遺伝子を発現する組み換え体が同定されると、そ
の遺伝子産物を分析しなければならない。これは、その
産物の物理的または機能的性質に基づくアッセイによっ
て達成できる。
ひとたびBDNFタンパク質が同定されると、これをクロ
マトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティお
よびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分
離、溶解度差を含む標準的方法によるか、あるいはタン
パク質の精製のための任意の他の標準的方法によって単
離および精製し得る。機能的性質はそれらに限定されな
いがニワトリ胚背根神経節、周産期のラット網膜細胞ま
たは神経プラコード由来ニューロンを含む任意の知られ
たBDNFアッセイを用いて評価することができる。
マトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティお
よびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分
離、溶解度差を含む標準的方法によるか、あるいはタン
パク質の精製のための任意の他の標準的方法によって単
離および精製し得る。機能的性質はそれらに限定されな
いがニワトリ胚背根神経節、周産期のラット網膜細胞ま
たは神経プラコード由来ニューロンを含む任意の知られ
たBDNFアッセイを用いて評価することができる。
重要なことは、脳組織からBDNFを調製するのに使用さ
れる方法は、最終段階として調製的ゲル電気泳動を含む
ので、残留SDSの存在ゆえに完全には活性でないBDNFを
生成しようということである（BardeおよびThoenen,198
5,“Hormones and Cell Regulation,"Vol.9,Dumontら
編,Elsevier Science Publishers,pp.385−390）。対照
的に、本発明は、組み換え核酸分子から産生されそして
SDSを含まず、それゆえに完全な活性を有するBDNFを単
離できるものである。例えばこれに限定されないが、本
発明の抗−BDNF抗体（例えば、後述の実施例６に記載の
ブタBDNFのB5−33アミノ酸フラグメントに対する抗体）
を使用して組換えBDNF免疫沈降またはアフィニティクロ
マトグラフィーによって回収し、もって界面活性剤を含
まない完全な活性を有するBDNFを生成させることができ
る。
れる方法は、最終段階として調製的ゲル電気泳動を含む
ので、残留SDSの存在ゆえに完全には活性でないBDNFを
生成しようということである（BardeおよびThoenen,198
5,“Hormones and Cell Regulation,"Vol.9,Dumontら
編,Elsevier Science Publishers,pp.385−390）。対照
的に、本発明は、組み換え核酸分子から産生されそして
SDSを含まず、それゆえに完全な活性を有するBDNFを単
離できるものである。例えばこれに限定されないが、本
発明の抗−BDNF抗体（例えば、後述の実施例６に記載の
ブタBDNFのB5−33アミノ酸フラグメントに対する抗体）
を使用して組換えBDNF免疫沈降またはアフィニティクロ
マトグラフィーによって回収し、もって界面活性剤を含
まない完全な活性を有するBDNFを生成させることができ
る。
本発明のさらに他の実施態様においては、例えば、エ
ンドプロテイナーゼ Arg−Ｃを用いて、プレプロBDNFを
活性成熟BDNFに酵素的に変換することができる（下記の
実施例12参照）。
ンドプロテイナーゼ Arg−Ｃを用いて、プレプロBDNFを
活性成熟BDNFに酵素的に変換することができる（下記の
実施例12参照）。
（６） 脳由来神経栄養因子遺伝子およびタンパク質上
記および後述の実施例第１および第４に詳述の方法を用
いて、以下の核酸配列を決定しそしてこれらの相当する
アミノ酸配列が推定された。ブタBDNF cDNA配列を決定
し、そしてこれを第１図に示す。ヒトゲノムBDNF cDNA
配列が決定し、そしてこれを第５図に示し、そこにはブ
タ、ラットおよびニワトリからのDNA配列も示される。
これらの各配列またはそれらの機能的等価物は本発明に
従って使用することができる。さらに本発明はブタ、ウ
シ、ネコ、鳥類、ウマまたはイヌ並びに霊長類源および
BDNF活性が存在する任意の他の種から単離されるBDNF遺
伝子およびタンパク質に関する。本発明は更に、少なく
とも10個のヌクレオチドを含有するBDNF核酸のサブ配列
に関する。かかるサブ配列は例えば核酸ハイブリッド形
成アッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析等に使
用されるBDNF配列のハイブリッド形成可能な部分を含有
する。本発明はまた、第１図および第５図に示されるア
ミノ酸配列またはこれらの機能的等価物により、BDNFタ
ンパク質およびそのフラグメント並びに誘導体を提供す
るものである。また、本発明は、抗原決定基を含有する
かあるいは機能的に活性であるBDNFタンパク質のフラグ
メントまたは誘導体も提供する。本明細書で使用される
機能的に活性とは、知られたBDNF機能に関するアッセ
イ、例えばニワトリ胚DRGアッセイに陽性の活性を有す
ることを意味する。
記および後述の実施例第１および第４に詳述の方法を用
いて、以下の核酸配列を決定しそしてこれらの相当する
アミノ酸配列が推定された。ブタBDNF cDNA配列を決定
し、そしてこれを第１図に示す。ヒトゲノムBDNF cDNA
配列が決定し、そしてこれを第５図に示し、そこにはブ
タ、ラットおよびニワトリからのDNA配列も示される。
これらの各配列またはそれらの機能的等価物は本発明に
従って使用することができる。さらに本発明はブタ、ウ
シ、ネコ、鳥類、ウマまたはイヌ並びに霊長類源および
BDNF活性が存在する任意の他の種から単離されるBDNF遺
伝子およびタンパク質に関する。本発明は更に、少なく
とも10個のヌクレオチドを含有するBDNF核酸のサブ配列
に関する。かかるサブ配列は例えば核酸ハイブリッド形
成アッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析等に使
用されるBDNF配列のハイブリッド形成可能な部分を含有
する。本発明はまた、第１図および第５図に示されるア
ミノ酸配列またはこれらの機能的等価物により、BDNFタ
ンパク質およびそのフラグメント並びに誘導体を提供す
るものである。また、本発明は、抗原決定基を含有する
かあるいは機能的に活性であるBDNFタンパク質のフラグ
メントまたは誘導体も提供する。本明細書で使用される
機能的に活性とは、知られたBDNF機能に関するアッセ
イ、例えばニワトリ胚DRGアッセイに陽性の活性を有す
ることを意味する。
例えば、第１図および第５図に示される核酸配列は、
機能的に等価の分子を生ずる置換、付加または欠失によ
って変更することができる。ヌクレオチドコード配列の
縮重性ゆえに、第１図および第５図に示されると実質的
に同一のアミノ酸配列をコードするその他のDNA配列を
本発明の実施において使用することができる。それらに
は、限定されるわけではないが、配列内で機能的に等し
いアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により
変更され、従ってサイレント変化を生ずる第１図および
第５図に示されるBDNF遺伝子の全部または一部分からな
るヌクレオチド配列が包含される。同様に、本発明のBD
NFタンパク質またはそのフラグメントあるいは誘導体に
は、限定するものではないが、主要アミノ酸配列とし
て、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基にとっ
て代わり、サイレント変化を来している変更配列を含む
第１図および第５図に実質的に示されるアミノ酸配列の
全部または一部分を含有するものが包含される。例え
ば、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を、機
能的等価物として作用してサイレント変更をもたらす同
様な極性の他のアミノ酸で置換することができる。配列
内におけるアミノ酸の置換は、アミノ酸が属する群の他
のメンバーから選択することができる。例えば、非極性
（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリ
プトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性ア
ミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システ
イン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げ
られる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸として、アル
ギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷
電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸および
グルタミン酸が挙げられる。また本発明の範囲内には、
翻訳中にまたは翻訳後に、例えばグリコシル化、タンパ
ク分解的開裂、抗体分子またはその他の細胞性リガンド
への連結等によって示差修飾されたBDNFタンパク質また
はそのフラグメントあるいは誘導体も包含される。
機能的に等価の分子を生ずる置換、付加または欠失によ
って変更することができる。ヌクレオチドコード配列の
縮重性ゆえに、第１図および第５図に示されると実質的
に同一のアミノ酸配列をコードするその他のDNA配列を
本発明の実施において使用することができる。それらに
は、限定されるわけではないが、配列内で機能的に等し
いアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により
変更され、従ってサイレント変化を生ずる第１図および
第５図に示されるBDNF遺伝子の全部または一部分からな
るヌクレオチド配列が包含される。同様に、本発明のBD
NFタンパク質またはそのフラグメントあるいは誘導体に
は、限定するものではないが、主要アミノ酸配列とし
て、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基にとっ
て代わり、サイレント変化を来している変更配列を含む
第１図および第５図に実質的に示されるアミノ酸配列の
全部または一部分を含有するものが包含される。例え
ば、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を、機
能的等価物として作用してサイレント変更をもたらす同
様な極性の他のアミノ酸で置換することができる。配列
内におけるアミノ酸の置換は、アミノ酸が属する群の他
のメンバーから選択することができる。例えば、非極性
（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリ
プトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性ア
ミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システ
イン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げ
られる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸として、アル
ギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷
電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸および
グルタミン酸が挙げられる。また本発明の範囲内には、
翻訳中にまたは翻訳後に、例えばグリコシル化、タンパ
ク分解的開裂、抗体分子またはその他の細胞性リガンド
への連結等によって示差修飾されたBDNFタンパク質また
はそのフラグメントあるいは誘導体も包含される。
付加的に、所定のBDNFを、インビトロまたはインビボ
で突然変異させて翻訳、開始および／または終止配列を
創造および／または破壊するか、あるいはコード領域の
変化を創造しおよび／または新たな制限エンドヌクレア
ーゼ部位を創造するかあるいはすでに存在するものを破
壊して、更なるインビトロ修飾を促進することができ
る。当業上知られたインビトロ特定部位の突然変異誘発
（Hutchinsonら,1978,J.Biol.Chem.253:6651）、TAB
リンカー（Pharmacia）の使用等を包含するがそれらに
限定されない任意の突然変異誘発法を用いることができ
る。
で突然変異させて翻訳、開始および／または終止配列を
創造および／または破壊するか、あるいはコード領域の
変化を創造しおよび／または新たな制限エンドヌクレア
ーゼ部位を創造するかあるいはすでに存在するものを破
壊して、更なるインビトロ修飾を促進することができ
る。当業上知られたインビトロ特定部位の突然変異誘発
（Hutchinsonら,1978,J.Biol.Chem.253:6651）、TAB
リンカー（Pharmacia）の使用等を包含するがそれらに
限定されない任意の突然変異誘発法を用いることができ
る。
（７） 抗−脳由来神経栄養因子抗体の生成 本発明によれば、BDNFタンパク質またはそのフラグメ
ントあるいは誘導体を免疫原として使用して抗−BDNF抗
体を生成させことができる。抗−BDNF免疫応答を生成さ
せる先の試みは、おそらく少量の精製BDNFしか入手でき
なかったことが理由で成功しなかった。タンパク質合成
の組み換え技術（本発明のBDNF核酸配列に基づく）を用
いて比較的豊富な量のBDNFタンパク質が生産できること
によって、量の不十分という問題点が解決された。
ントあるいは誘導体を免疫原として使用して抗−BDNF抗
体を生成させことができる。抗−BDNF免疫応答を生成さ
せる先の試みは、おそらく少量の精製BDNFしか入手でき
なかったことが理由で成功しなかった。タンパク質合成
の組み換え技術（本発明のBDNF核酸配列に基づく）を用
いて比較的豊富な量のBDNFタンパク質が生産できること
によって、量の不十分という問題点が解決された。
抗−BDNF免疫応答を生ずる公算を更に改良するために
は、免疫原性のの増大に関連し得る分子の部分を同定す
るために、BDNFのアミノ酸配列を分析できる。例えば、
アミノ酸配列を、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原性ペプチドを
同定するのに効果的に使用されているHoppおよびWoods
（1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824−3828）の
方法に従ってコンピュータ分析して表面エピトープを同
定することができる。別法として、異なる種からのBDNF
の推定アミノ酸配列を比較し、そして比較的に相同でな
い領域を同定することができた。これらの相同でない領
域は、種々の種をこえてより免疫原性でありそうであ
る。
は、免疫原性のの増大に関連し得る分子の部分を同定す
るために、BDNFのアミノ酸配列を分析できる。例えば、
アミノ酸配列を、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原性ペプチドを
同定するのに効果的に使用されているHoppおよびWoods
（1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824−3828）の
方法に従ってコンピュータ分析して表面エピトープを同
定することができる。別法として、異なる種からのBDNF
の推定アミノ酸配列を比較し、そして比較的に相同でな
い領域を同定することができた。これらの相同でない領
域は、種々の種をこえてより免疫原性でありそうであ
る。
BDNFに対するモノクローナル抗体を調製するには、培
養中の連続細胞系により抗体分子を生成させる任意の技
術を使用し得る。例えば、KohlerおよびMilstein（197
5,Nature 256:495−497）によって最初に開発されたハ
イブリドーマ技術並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ技術（Kozborら,1983,Immnology Today 4:
72）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEB
V−ハイブリドーマ技術（Coleら,1985,in“Monoclonal
AntibodiesおよびCancer Therapy",Alan R.Liss.Inc,p
p.77−96）等は本発明の範囲内である。
養中の連続細胞系により抗体分子を生成させる任意の技
術を使用し得る。例えば、KohlerおよびMilstein（197
5,Nature 256:495−497）によって最初に開発されたハ
イブリドーマ技術並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ技術（Kozborら,1983,Immnology Today 4:
72）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEB
V−ハイブリドーマ技術（Coleら,1985,in“Monoclonal
AntibodiesおよびCancer Therapy",Alan R.Liss.Inc,p
p.77−96）等は本発明の範囲内である。
治療用のモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル
抗体またはキメラヒト−マウス（またはその他の種の）
モノクローナル抗体であることができる。ヒトモノクロ
ーナル抗体は、当業上知られた数多くの技術のいずれか
によって作製することができる（例えば、Tengら,1983,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:7308−7312;Kozborら,19
83,Immunology Today 4:72−79;Olssonら,1982,Meth.En
zymol.92:3−16）。ヒト定常領域と共にマウス抗原結合
ドメインを含有するキメラ抗体分子を調製することがで
きる（Morrisonら,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:
6851,Takedaら,1985,Nature 314:452）。
抗体またはキメラヒト−マウス（またはその他の種の）
モノクローナル抗体であることができる。ヒトモノクロ
ーナル抗体は、当業上知られた数多くの技術のいずれか
によって作製することができる（例えば、Tengら,1983,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:7308−7312;Kozborら,19
83,Immunology Today 4:72−79;Olssonら,1982,Meth.En
zymol.92:3−16）。ヒト定常領域と共にマウス抗原結合
ドメインを含有するキメラ抗体分子を調製することがで
きる（Morrisonら,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:
6851,Takedaら,1985,Nature 314:452）。
当業上知られた種々の方法をBDNFのエピトープに対す
るポリモノクローナル抗体の産生に使用することができ
る。抗体の産生には、ウサギ、マウス、ラット等を包含
するがそれらに限定されない種々の宿主動物を、BDNFタ
ンパク質、またはそのフラグメントあるいは誘導体の注
射により免疫することができる。宿主の種の如何に応じ
て、フロインド（完全または不完全）、鉱物ゲル例えば
水酸化アルミニウム、界面活性剤例えばリゾレシチン、
プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オ
イルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、ジニトロフェノールおよび有効な可能性のあるヒト
アジュバント例えばBCG（Bacille Calmette−Guerin）
およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacteriu
m parvum）を含むがそれらに限定されない種々のアジュ
バントを使用して免疫学的応答を高めることができる。
るポリモノクローナル抗体の産生に使用することができ
る。抗体の産生には、ウサギ、マウス、ラット等を包含
するがそれらに限定されない種々の宿主動物を、BDNFタ
ンパク質、またはそのフラグメントあるいは誘導体の注
射により免疫することができる。宿主の種の如何に応じ
て、フロインド（完全または不完全）、鉱物ゲル例えば
水酸化アルミニウム、界面活性剤例えばリゾレシチン、
プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オ
イルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、ジニトロフェノールおよび有効な可能性のあるヒト
アジュバント例えばBCG（Bacille Calmette−Guerin）
およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacteriu
m parvum）を含むがそれらに限定されない種々のアジュ
バントを使用して免疫学的応答を高めることができる。
BDNFエピトープに対する抗体の分子クローンは、既知
技術によって調製することができる。組み換えDNA法
（例えば、Maniatisら,1982,Molecular Cloning,A Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Cold S
pring Harbor New Yorkを参照のこと）を使用してモノ
クローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードす
る核酸配列を作製することができる。
技術によって調製することができる。組み換えDNA法
（例えば、Maniatisら,1982,Molecular Cloning,A Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Cold S
pring Harbor New Yorkを参照のこと）を使用してモノ
クローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードす
る核酸配列を作製することができる。
抗体分子は、既知技術例えば免疫吸着またはイムノア
フィニティクロマトグラフィー、クロマトグラフィー法
例えばHPLC（高性能液体クロマトグラフィー）、または
これらの組合せ等によって精製できる。
フィニティクロマトグラフィー、クロマトグラフィー法
例えばHPLC（高性能液体クロマトグラフィー）、または
これらの組合せ等によって精製できる。
分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメント
は、既知技術によって生成させることができる。例え
ば、かかるフラグメントには、限定するものではない
が、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ
（ab′）２フラグメント;F（ab′）２フラグメントのジ
スルフィド橋を還元することによって生成され得るFa
b′フラグメントおよび抗体分子をパパインおよび還元
剤で処理することによって生成され得る2FabまたはFab
フラグメントが包含される。
は、既知技術によって生成させることができる。例え
ば、かかるフラグメントには、限定するものではない
が、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ
（ab′）２フラグメント;F（ab′）２フラグメントのジ
スルフィド橋を還元することによって生成され得るFa
b′フラグメントおよび抗体分子をパパインおよび還元
剤で処理することによって生成され得る2FabまたはFab
フラグメントが包含される。
実施例６は、BDNFタンパク質のB5−33ペプチドフラグ
メントに対するポリクローナル抗体の調製を記載する。
メントに対するポリクローナル抗体の調製を記載する。
（８） BDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加的なメンバー
の同定 BDNFをコードする遺伝子の配列分析およびそのアミノ
酸配列の推定により、このタンパク質がNGFと数多くの
構造的な類似性を有していることが判明した（第２
図）。成熟BDNFの主要配列並びに一般的構造および前駆
体タンパク質からのありうるプロセシング様式は、NGF
およびBDNF遺伝子が共通した祖先の遺伝子から進化した
かもしれないことを強く示唆している。成熟ポリペプチ
ドの領域内で、ただ３個のギャップをNGF配列に取り込
んで整合を最適化する場合、総数51のアミノ酸同一性が
多くの種からの既知のNGFおよびブタ並びにヒトBDNFに
共通である。これらの同一性には全６個のシステイン残
基が含まれており、このことはNGFおよびBDNFが非常に
類似した二次構造を共有していることを示唆している。
更に、上記に列挙した全ての種からのNGFおよびブタBDN
FからのNGFが同一であるかあるいは１を越えない保存的
アミノ酸置換しか異ならない６またはそれ以上のアミノ
酸からなるセグメントが４個所見出されうる。従って、
NGFとBDNFとが密接に関連する遺伝子ファミリーのメン
バーであることが明らかになったと結論するのが妥当で
ある。
の同定 BDNFをコードする遺伝子の配列分析およびそのアミノ
酸配列の推定により、このタンパク質がNGFと数多くの
構造的な類似性を有していることが判明した（第２
図）。成熟BDNFの主要配列並びに一般的構造および前駆
体タンパク質からのありうるプロセシング様式は、NGF
およびBDNF遺伝子が共通した祖先の遺伝子から進化した
かもしれないことを強く示唆している。成熟ポリペプチ
ドの領域内で、ただ３個のギャップをNGF配列に取り込
んで整合を最適化する場合、総数51のアミノ酸同一性が
多くの種からの既知のNGFおよびブタ並びにヒトBDNFに
共通である。これらの同一性には全６個のシステイン残
基が含まれており、このことはNGFおよびBDNFが非常に
類似した二次構造を共有していることを示唆している。
更に、上記に列挙した全ての種からのNGFおよびブタBDN
FからのNGFが同一であるかあるいは１を越えない保存的
アミノ酸置換しか異ならない６またはそれ以上のアミノ
酸からなるセグメントが４個所見出されうる。従って、
NGFとBDNFとが密接に関連する遺伝子ファミリーのメン
バーであることが明らかになったと結論するのが妥当で
ある。
BDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加的なメンバーに関す
る合理的な研究は、NGFとBDNFとの間に強力な相同性を
有する保存セグメントが予想外に存在することを利用す
る方法を用いて実施できる。例えば、BDNF遺伝子ファミ
リーの付加的なメンバーは多様な核酸配列の中からBDNF
およびNGFに相同である配列を選択し、そして更に選択
された配列の中からNGFおよびBDNFに相同でない核酸配
列をも含有するものを同定することによって同定され得
る。用語「相同でない」は、少なくとも約２個のヌクレ
オチドがNGFおよびBDNF配列と異なる少なくとも約６個
の連続したヌクレオチドを含有する領域を意味すると解
釈できる。
る合理的な研究は、NGFとBDNFとの間に強力な相同性を
有する保存セグメントが予想外に存在することを利用す
る方法を用いて実施できる。例えば、BDNF遺伝子ファミ
リーの付加的なメンバーは多様な核酸配列の中からBDNF
およびNGFに相同である配列を選択し、そして更に選択
された配列の中からNGFおよびBDNFに相同でない核酸配
列をも含有するものを同定することによって同定され得
る。用語「相同でない」は、少なくとも約２個のヌクレ
オチドがNGFおよびBDNF配列と異なる少なくとも約６個
の連続したヌクレオチドを含有する領域を意味すると解
釈できる。
本発明の好ましい実施態様では以下の方法が提供され
る。上記のそして下記第III表に記載される各４つの保
存のセグメント（「ボックス」）に相当して、少なくと
も18個のヌクレオチドの縮重（degenerate）オリゴヌク
レオチドプローブのセットを合成する。これらは６個の
連続するコドンにわたってNGFまたはBDNFのいずれかに
見出されるアミノ酸に関するありうるコード配列の全て
を表す。成熟ポリペプチドのアミノ末端に基づいて番号
付けすると（従ってプレプロBDNFのHis134が成熟タンパ
ク質におけるHis1として処理される）、４つのボックス
が以下の通りに特徴付けされ得る（ヒト成熟タンパク質
に基づき番号付け。第１図に示されるDNA配列）。
る。上記のそして下記第III表に記載される各４つの保
存のセグメント（「ボックス」）に相当して、少なくと
も18個のヌクレオチドの縮重（degenerate）オリゴヌク
レオチドプローブのセットを合成する。これらは６個の
連続するコドンにわたってNGFまたはBDNFのいずれかに
見出されるアミノ酸に関するありうるコード配列の全て
を表す。成熟ポリペプチドのアミノ末端に基づいて番号
付けすると（従ってプレプロBDNFのHis134が成熟タンパ
ク質におけるHis1として処理される）、４つのボックス
が以下の通りに特徴付けされ得る（ヒト成熟タンパク質
に基づき番号付け。第１図に示されるDNA配列）。
第III表に示されるボックスからの配列対から誘導さ
れる合成オリゴヌクレオチドは、該当する可能性のある
源（RNAまたはDNA）からPCR配列によって増幅するため
のプライマーとして使用し得る。これには、BDNFまたは
NGFに密接に関連するポリペプチドを発現できる任意の
真核生物種からのmRNAまたはcDNAあるいはゲノムDNAが
包含されよう。６種のPCR反応（すなわち：ボックス２
からのプライマーを有するボックス１からのプライマ
ー；ボックス３を有するボックス1;ボックス４を有する
ボックス1;ボックス３を有するボックス2;ボックス４を
有するボックス2;ボックス４を有するボックス３）だけ
を実行することによって、NGFとBDNFとの間の保存配列
の４つの上記セグメントのうちの任意の２つを共有する
遺伝子または遺伝子産物を検出することができる。各ボ
ックス当たり数個の異なる縮重プライマーを合成するこ
とを選択する場合は、無理のない少数のPCR反応を用い
た完全な探索を行うことがなおも可能であろう。また、
PCR反応を開始するのに用いられるハイブリッド形成条
件の厳密さを変動させて、未知の遺伝子とNGFまたはBDN
Fとの間のヌクレオチド配列類似性を大なり小なり許容
することもできる。BDNF/NGF遺伝子ファミリーの未知の
メンバーのセグメントがうまく増幅される場合、そのセ
グメントは、分子的にクローンされ、配列化され、そし
てプローブとして使用されて完全なcDNAまたはゲノムク
ローンを単離することができる。それにより次に、未知
遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分
析そして機能分析のためのタンパク質産物の生成が可能
となろう。
れる合成オリゴヌクレオチドは、該当する可能性のある
源（RNAまたはDNA）からPCR配列によって増幅するため
のプライマーとして使用し得る。これには、BDNFまたは
NGFに密接に関連するポリペプチドを発現できる任意の
真核生物種からのmRNAまたはcDNAあるいはゲノムDNAが
包含されよう。６種のPCR反応（すなわち：ボックス２
からのプライマーを有するボックス１からのプライマ
ー；ボックス３を有するボックス1;ボックス４を有する
ボックス1;ボックス３を有するボックス2;ボックス４を
有するボックス2;ボックス４を有するボックス３）だけ
を実行することによって、NGFとBDNFとの間の保存配列
の４つの上記セグメントのうちの任意の２つを共有する
遺伝子または遺伝子産物を検出することができる。各ボ
ックス当たり数個の異なる縮重プライマーを合成するこ
とを選択する場合は、無理のない少数のPCR反応を用い
た完全な探索を行うことがなおも可能であろう。また、
PCR反応を開始するのに用いられるハイブリッド形成条
件の厳密さを変動させて、未知の遺伝子とNGFまたはBDN
Fとの間のヌクレオチド配列類似性を大なり小なり許容
することもできる。BDNF/NGF遺伝子ファミリーの未知の
メンバーのセグメントがうまく増幅される場合、そのセ
グメントは、分子的にクローンされ、配列化され、そし
てプローブとして使用されて完全なcDNAまたはゲノムク
ローンを単離することができる。それにより次に、未知
遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分
析そして機能分析のためのタンパク質産物の生成が可能
となろう。
上記の手段は、BDNFおよびNGFの両方に関連する新規
な遺伝子を同定するのに使用され、そして後述の実施例
８に記載されている。
な遺伝子を同定するのに使用され、そして後述の実施例
８に記載されている。
加えて、本発明は、BDNF/NGF遺伝子ファミリーのメン
バーではあるが天然には存在しない新規な組み換え分子
の設計におけるBDNF/NGF配列相同性の使用を提供するも
のである。例えば、これに限定されないがNGFおよびBDN
F遺伝子の両方の一部分を含有する組み換え分子が本発
明に従って作製され得る。かかる分子は、NGFおよびBDN
Fの両方に関連する性質を示し、そして作動体並びに拮
抗体を含む生物学的活性の新規なプロフィルを示し得よ
う。NGFおよびBDNFの主要配列はまた、コンピューター
シミュレーションを使用して分子の三次元構造を予想す
るのにも使用し得る（HoppおよびWoods,1981,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.78:3824−3828）。すなわち、BDNF/N
GFキメラ組み換え遺伝子は、三次元構造と生物学的機能
との相関関係に鑑みて設計できよう。同様に、実施例８
の新規メンバーを含め、BDNF/NGF遺伝子ファミリーのい
ずれか１またはそれ以上のメンバーの一部分を含有する
キメラ遺伝子を作製することができる。
バーではあるが天然には存在しない新規な組み換え分子
の設計におけるBDNF/NGF配列相同性の使用を提供するも
のである。例えば、これに限定されないがNGFおよびBDN
F遺伝子の両方の一部分を含有する組み換え分子が本発
明に従って作製され得る。かかる分子は、NGFおよびBDN
Fの両方に関連する性質を示し、そして作動体並びに拮
抗体を含む生物学的活性の新規なプロフィルを示し得よ
う。NGFおよびBDNFの主要配列はまた、コンピューター
シミュレーションを使用して分子の三次元構造を予想す
るのにも使用し得る（HoppおよびWoods,1981,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.78:3824−3828）。すなわち、BDNF/N
GFキメラ組み換え遺伝子は、三次元構造と生物学的機能
との相関関係に鑑みて設計できよう。同様に、実施例８
の新規メンバーを含め、BDNF/NGF遺伝子ファミリーのい
ずれか１またはそれ以上のメンバーの一部分を含有する
キメラ遺伝子を作製することができる。
（９） 発明の有用性 本発明は、BDNFの核酸配列、およびそれから産生され
る実質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメン
トまたは誘導体に関する。BDNFが診断および治療用途に
十分な量で生産され得るのは初めてである。同様に、本
発明の結果として、初めて入手可能となった抗−BDNF抗
体、およびBDNF核酸プローブを診断および治療に使用す
ることができる。本発明の詳細な実施態様ではBDNFの交
雑種利用も有用であるが、大部分の目的には同一の種か
らのBDNF遺伝子または遺伝子産物を診断および治療の目
的に使用することが好ましい。
る実質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメン
トまたは誘導体に関する。BDNFが診断および治療用途に
十分な量で生産され得るのは初めてである。同様に、本
発明の結果として、初めて入手可能となった抗−BDNF抗
体、およびBDNF核酸プローブを診断および治療に使用す
ることができる。本発明の詳細な実施態様ではBDNFの交
雑種利用も有用であるが、大部分の目的には同一の種か
らのBDNF遺伝子または遺伝子産物を診断および治療の目
的に使用することが好ましい。
（9.1）診断用途 BDNFをコードする核酸および、それから産生されたタ
ンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導体、並
びにBDNFタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗
体に関する本発明は、BDNF発現パターンの変更に関連し
得る神経系の疾患および障害の診断に利用できる。
ンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導体、並
びにBDNFタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗
体に関する本発明は、BDNF発現パターンの変更に関連し
得る神経系の疾患および障害の診断に利用できる。
本発明の種々の実施態様においては、BDNF遺伝子およ
び関連核酸配列並びにサブ配列、例えば相補性配列は、
診断用ハイブリダイゼーションアッセイに使用できる。
BDNF核酸配列または約15個のヌクレオチドを含有するそ
のサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして
使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイを用い
て、特に感覚性ニューロン損傷および網膜ニューロンの
変性の結果生ずる状態を含むBDNF発現の変化に関連する
状態、障害または疾患状態を検出し、予知し、診断しあ
るいは監視し得る。かかる疾患および状態には、これに
限定されないがアルツハイマー病、ハンチントン舞踏
病、パーキンソン病および網膜の変性性疾患を含むCNS
外傷、梗塞、感染、変性性神経疾患、悪性腫瘍または手
術後変化が包含される。例えば、患者からの組織サンプ
ル中の総RNAを、BDNF mRNAの量の減少がニューロン変性
の指標であるBDNF mRNAの存在に関してアッセイでき
る。比較的高いレベルのBDNF mRNAは、神経芽腫腫瘍細
胞において確認されている（詳細については後述の実施
例９を参照のこと）。従って、本発明の詳細な実施態様
においては、BDNF核酸プローブを用いるmRNAレベル増大
の検出を神経芽腫腫瘍を診断するのに利用できる。大部
分の組織から合成されるBDNFレベルは極めて低いのでBD
NF mRNAは特に有効な腫瘍マーカーである。
び関連核酸配列並びにサブ配列、例えば相補性配列は、
診断用ハイブリダイゼーションアッセイに使用できる。
BDNF核酸配列または約15個のヌクレオチドを含有するそ
のサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして
使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイを用い
て、特に感覚性ニューロン損傷および網膜ニューロンの
変性の結果生ずる状態を含むBDNF発現の変化に関連する
状態、障害または疾患状態を検出し、予知し、診断しあ
るいは監視し得る。かかる疾患および状態には、これに
限定されないがアルツハイマー病、ハンチントン舞踏
病、パーキンソン病および網膜の変性性疾患を含むCNS
外傷、梗塞、感染、変性性神経疾患、悪性腫瘍または手
術後変化が包含される。例えば、患者からの組織サンプ
ル中の総RNAを、BDNF mRNAの量の減少がニューロン変性
の指標であるBDNF mRNAの存在に関してアッセイでき
る。比較的高いレベルのBDNF mRNAは、神経芽腫腫瘍細
胞において確認されている（詳細については後述の実施
例９を参照のこと）。従って、本発明の詳細な実施態様
においては、BDNF核酸プローブを用いるmRNAレベル増大
の検出を神経芽腫腫瘍を診断するのに利用できる。大部
分の組織から合成されるBDNFレベルは極めて低いのでBD
NF mRNAは特に有効な腫瘍マーカーである。
本発明の別の実施態様においては、BDNFタンパク質、
ペプチドフラグメントまたは誘導体に対する抗体を使用
して神経系の疾患および障害、特に知覚障害および網膜
の変性性疾患並びに上記した障害および疾患を診断する
ことができる。本発明の抗体は、例えばかかる評価を必
要とする患者から得られた組織サンプルを用いる原位置
ハイブリダイゼーション法に使用することができる。更
に別の例においては、本発明の抗体は組織または液体サ
ンプルに存在するBDNFの量を検出および／または測定す
るためのELISA法に使用できる。同様に、本発明の抗体
は組織または液体サンプルに存在するBDNFを検出および
／または測定するためのウエスタンブロット分析に使用
できる。ELISAおよびウエスタンブロットにおいてBDNF
と結合する本発明の抗体は、後述の実施例６に記載され
る。
ペプチドフラグメントまたは誘導体に対する抗体を使用
して神経系の疾患および障害、特に知覚障害および網膜
の変性性疾患並びに上記した障害および疾患を診断する
ことができる。本発明の抗体は、例えばかかる評価を必
要とする患者から得られた組織サンプルを用いる原位置
ハイブリダイゼーション法に使用することができる。更
に別の例においては、本発明の抗体は組織または液体サ
ンプルに存在するBDNFの量を検出および／または測定す
るためのELISA法に使用できる。同様に、本発明の抗体
は組織または液体サンプルに存在するBDNFを検出および
／または測定するためのウエスタンブロット分析に使用
できる。ELISAおよびウエスタンブロットにおいてBDNF
と結合する本発明の抗体は、後述の実施例６に記載され
る。
本発明の更に別の実施態様においては、BDNFタンパク
質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を神経系の疾患
および障害の診断に使用できる。これに限定されるつも
りはないが特定の実施態様においては、標識化BDNFタン
パク質またはペプチドフラグメントは、BDNFレセプター
発現の変種および従ってBDNFに対する組織または細胞性
応答におけるありうる異常を同定するために、BDNFレセ
プターを発現する組織または細胞の同定に使用できる。
質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を神経系の疾患
および障害の診断に使用できる。これに限定されるつも
りはないが特定の実施態様においては、標識化BDNFタン
パク質またはペプチドフラグメントは、BDNFレセプター
発現の変種および従ってBDNFに対する組織または細胞性
応答におけるありうる異常を同定するために、BDNFレセ
プターを発現する組織または細胞の同定に使用できる。
（9.2）治療用途 BDNFをコードする核酸および、このものから産生され
るタンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導
体、並びにBDNFタンパク質、ペプチドフラグメントまた
は誘導体に対する抗体に関する本発明は、BDNF発現パタ
ーンの変更に関連し得るかあるいはBDNFまたは抗−BDNF
抗体への曝露によって利益を得ることができる神経系の
疾患および障害の治療に用いることができる。
るタンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導
体、並びにBDNFタンパク質、ペプチドフラグメントまた
は誘導体に対する抗体に関する本発明は、BDNF発現パタ
ーンの変更に関連し得るかあるいはBDNFまたは抗−BDNF
抗体への曝露によって利益を得ることができる神経系の
疾患および障害の治療に用いることができる。
本発明の種々の実施態様においては、BDNFタンパク
質、ペプチドフラグメントまたは誘導体は、神経系が外
傷、外科手術、虚血、感染、代謝疾患、栄養不全、悪性
腫瘍または有毒薬剤によって損傷された患者に投与する
ことができる。本発明は特に、損傷が感覚性ニューロン
または網膜神経節細胞に生じている状態を、有効治療量
のBDNFタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体
を投与することによって治療するのに使用することがで
きる。本発明の種々の詳細な実施態様においては、BDNF
は、これに限定されないが背根神経節または以下の組
織；すなわち、膝状、錐体および結節神経節；第VIII脳
神経の前庭聴覚複合体；三叉神経神経節の上下顎骨葉の
腹側外側極；および中脳三叉神経核のいずれかにおける
ニューロンを含む切断された感覚性ニューロンに局所投
与することができる。BDNF−関連ペプチドまたはBDNFタ
ンパク質を、切断神経の近傍に移植することができる
膜、例えばシラスティック膜に吸着させることにより投
与するのが望ましい。本発明はまた、例えば糖尿病性神
経障害、例えば多重単発神経障害に罹患している患者の
回復を早めるのにも使用できる。本発明の更に別の実施
態様においては、BDNFタンパク質、またはこれから誘導
されるペプチドフラグメントあるいは誘導体は、先天的
状態または神経変性性障害、例えばこれに限定されない
がアルツハイマー病、パーキンソン病、「パーキンソン
−プラス」症候群（パーキンソン病の症状はドーパミン
作動性ニューロンの変性から生ずる）、例えば、進行性
Spranuclear麻痺（Steele−Richardson−Olszewski症候
群）、オリー橋小脳皮質麻痺（OPCA）、シャイ−ドレー
ガー（Shy−Drager）症候群（Multiple Systems Atroph
y）、およびグアムのパーキンソン症候群痴呆複合体、
およびハンチントン舞踏病の治療に使用できる。特に、
本発明は知覚神経機能不全および網膜の変性性疾患に関
連する先天的または神経変性性障害を治療するのに使用
できる。例えば少数例をあげれば、本発明のBDNFタンパ
ク質またはペプチドフラグメントあるいは誘導体は、網
膜変性を伴う遺伝性痙攣性対麻痺［ケリンおよびバーナ
ード−ショルツ症候群（Kjellinand Barnard−Scholz s
yndromes）］、色素性網膜炎、スターガルト（Stargard
t）病、ウッシャー（Usher）症候群（先天性聴覚喪失を
伴う色素性網膜炎）およびレフサム（Refsum）症候群
（色素性網膜炎、先天性聴覚喪失および多発性神経障
害）の治療に使用できる。BDNF合成または応答性の欠如
が網膜変性およびその他の知覚機能不全の組合せを特徴
とする症候群の病院であり得る可能性がある。
質、ペプチドフラグメントまたは誘導体は、神経系が外
傷、外科手術、虚血、感染、代謝疾患、栄養不全、悪性
腫瘍または有毒薬剤によって損傷された患者に投与する
ことができる。本発明は特に、損傷が感覚性ニューロン
または網膜神経節細胞に生じている状態を、有効治療量
のBDNFタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体
を投与することによって治療するのに使用することがで
きる。本発明の種々の詳細な実施態様においては、BDNF
は、これに限定されないが背根神経節または以下の組
織；すなわち、膝状、錐体および結節神経節；第VIII脳
神経の前庭聴覚複合体；三叉神経神経節の上下顎骨葉の
腹側外側極；および中脳三叉神経核のいずれかにおける
ニューロンを含む切断された感覚性ニューロンに局所投
与することができる。BDNF−関連ペプチドまたはBDNFタ
ンパク質を、切断神経の近傍に移植することができる
膜、例えばシラスティック膜に吸着させることにより投
与するのが望ましい。本発明はまた、例えば糖尿病性神
経障害、例えば多重単発神経障害に罹患している患者の
回復を早めるのにも使用できる。本発明の更に別の実施
態様においては、BDNFタンパク質、またはこれから誘導
されるペプチドフラグメントあるいは誘導体は、先天的
状態または神経変性性障害、例えばこれに限定されない
がアルツハイマー病、パーキンソン病、「パーキンソン
−プラス」症候群（パーキンソン病の症状はドーパミン
作動性ニューロンの変性から生ずる）、例えば、進行性
Spranuclear麻痺（Steele−Richardson−Olszewski症候
群）、オリー橋小脳皮質麻痺（OPCA）、シャイ−ドレー
ガー（Shy−Drager）症候群（Multiple Systems Atroph
y）、およびグアムのパーキンソン症候群痴呆複合体、
およびハンチントン舞踏病の治療に使用できる。特に、
本発明は知覚神経機能不全および網膜の変性性疾患に関
連する先天的または神経変性性障害を治療するのに使用
できる。例えば少数例をあげれば、本発明のBDNFタンパ
ク質またはペプチドフラグメントあるいは誘導体は、網
膜変性を伴う遺伝性痙攣性対麻痺［ケリンおよびバーナ
ード−ショルツ症候群（Kjellinand Barnard−Scholz s
yndromes）］、色素性網膜炎、スターガルト（Stargard
t）病、ウッシャー（Usher）症候群（先天性聴覚喪失を
伴う色素性網膜炎）およびレフサム（Refsum）症候群
（色素性網膜炎、先天性聴覚喪失および多発性神経障
害）の治療に使用できる。BDNF合成または応答性の欠如
が網膜変性およびその他の知覚機能不全の組合せを特徴
とする症候群の病院であり得る可能性がある。
本発明の詳細な実施態様においては、BDNFタンパク質
またはこれから誘導されるペプチドフラグメントあるい
は誘導体の投与は、アルツハイマー病および／またはパ
ーキンソン病の治療において組織の外科的移植と組み合
わせて用いることができる。下記実施例７および13にお
いて論考したように、BDNFは、ドーパミン作動性の黒質
ニューロンの生存を用量依存様式で増進させるのに用い
ることができ（第34図）、そのことは、パーキンソン病
を含むがそれに限らないCNSトーパミン作動性ニューロ
ンの障害に対する治療にBDNFを使用しうることを示して
いる。〔特に、BDNFはパーキンソン病様症候群の誘発に
関連する毒素であるMPPに起因する神経毒性を防ぐのに
用いるうることを示している、後掲の実施例16に示した
データから読み取れる〕。加えて、BDNFはCNSコリン作
動性ニューロン、特に、基底前脳コリン作動性ニューロ
ンの生存を支持することが観察されており（後掲実施例
７および11参照）、このことは、BDNFがアルツハイマー
病を含むがそれに限らないコリン作動性ニューロンを包
含した障害の治療に有効でありうることを示している。
パーキンソン病を有する患者の約35パーセントがアルツ
ハイマー型痴呆にかかっていることが示されている。本
発明に従って生成されるBDNFは、この複合疾患に有効な
単一剤療法であることが判明しよう。同様に、本発明に
より生成されるBDNFは、ダウン症候群と合併したアルツ
ハイマー病の治療に使用できる。本発明に従って生成さ
れるBDNFは、種々の痴呆並びに先天性学習障害の治療に
使用できる。BDNFが大グリア細胞の増殖を抑制すると思
われることも示されており、このことはCNSにおける瘢
痕（例えば、手術、外傷、または梗塞の後に生じる）形
成の減少へのBDNFの使用可能性、および大グリア由来CN
S腫瘍の治療におけるBDNFの使用可能性を裏書きするも
のである。本発明のさらに他の態様においては、BDNFは
NGFレセプターの発現のアップレギュレートに使用で
き、従ってBDNFは治療を必要とする患者に対してNGFの
投与に先立つあるいはNGFと同時に好都合に投与でき
る。
またはこれから誘導されるペプチドフラグメントあるい
は誘導体の投与は、アルツハイマー病および／またはパ
ーキンソン病の治療において組織の外科的移植と組み合
わせて用いることができる。下記実施例７および13にお
いて論考したように、BDNFは、ドーパミン作動性の黒質
ニューロンの生存を用量依存様式で増進させるのに用い
ることができ（第34図）、そのことは、パーキンソン病
を含むがそれに限らないCNSトーパミン作動性ニューロ
ンの障害に対する治療にBDNFを使用しうることを示して
いる。〔特に、BDNFはパーキンソン病様症候群の誘発に
関連する毒素であるMPPに起因する神経毒性を防ぐのに
用いるうることを示している、後掲の実施例16に示した
データから読み取れる〕。加えて、BDNFはCNSコリン作
動性ニューロン、特に、基底前脳コリン作動性ニューロ
ンの生存を支持することが観察されており（後掲実施例
７および11参照）、このことは、BDNFがアルツハイマー
病を含むがそれに限らないコリン作動性ニューロンを包
含した障害の治療に有効でありうることを示している。
パーキンソン病を有する患者の約35パーセントがアルツ
ハイマー型痴呆にかかっていることが示されている。本
発明に従って生成されるBDNFは、この複合疾患に有効な
単一剤療法であることが判明しよう。同様に、本発明に
より生成されるBDNFは、ダウン症候群と合併したアルツ
ハイマー病の治療に使用できる。本発明に従って生成さ
れるBDNFは、種々の痴呆並びに先天性学習障害の治療に
使用できる。BDNFが大グリア細胞の増殖を抑制すると思
われることも示されており、このことはCNSにおける瘢
痕（例えば、手術、外傷、または梗塞の後に生じる）形
成の減少へのBDNFの使用可能性、および大グリア由来CN
S腫瘍の治療におけるBDNFの使用可能性を裏書きするも
のである。本発明のさらに他の態様においては、BDNFは
NGFレセプターの発現のアップレギュレートに使用で
き、従ってBDNFは治療を必要とする患者に対してNGFの
投与に先立つあるいはNGFと同時に好都合に投与でき
る。
下記実施例10に例示するように、カイニン酸の投与
は、海馬ならびに皮質ニューロンを含むニューロン中の
BDNFの発現（およびより程度の低いNGFの発現）増大を
誘導するのに用いることができる。このカイニン酸によ
り仲介されたBDNF発現の増大は非NMDAレセプターの阻害
により遮断されることが観察されている（下記実施例1
0）。したがって、本発明のBDNFおよびBDNF関連ペプチ
ドの発現は、カイニン酸または関連化合物、あるいはイ
ンビボまたはインビトロで同様な効果を持つことが見出
されているカルバコール、ヒスタミンまたはブラジキニ
ン、またはそれらの関連化合物の投与により、さらには
非の−NMDAグルタメートレセターアゴニストによるかま
たはアセチコリン、ヒスタミンまたはブラジキニンの作
用を増強するまたは模する他の薬剤により、インビボで
またはインビトロで誘導されうる。
は、海馬ならびに皮質ニューロンを含むニューロン中の
BDNFの発現（およびより程度の低いNGFの発現）増大を
誘導するのに用いることができる。このカイニン酸によ
り仲介されたBDNF発現の増大は非NMDAレセプターの阻害
により遮断されることが観察されている（下記実施例1
0）。したがって、本発明のBDNFおよびBDNF関連ペプチ
ドの発現は、カイニン酸または関連化合物、あるいはイ
ンビボまたはインビトロで同様な効果を持つことが見出
されているカルバコール、ヒスタミンまたはブラジキニ
ン、またはそれらの関連化合物の投与により、さらには
非の−NMDAグルタメートレセターアゴニストによるかま
たはアセチコリン、ヒスタミンまたはブラジキニンの作
用を増強するまたは模する他の薬剤により、インビボで
またはインビトロで誘導されうる。
本発明の更に別の実施態様においては、BDNFタンパク
質、フラグメントまたは誘導体は、所望の神経栄養効果
を達成するのに他のサイトカインと一緒に使用できる。
例えば、限定するつもりはないが、本発明によればBDNF
をNGFとあるいは骨格筋抽出物と一緒に使用して、感覚
性ニューロンの成長に対する相乗的刺激効果を達成する
ことができる。ここで相乗効果とはBDNFタンパク質、ペ
プチドフラグメントまたは誘導体と第２薬剤との組合せ
物の作用が個々に使用される同量の各物質より高い効果
を達成することを意味すると解釈される。BDNFが中枢神
経系における広い系列のニューロンサブ集団の成長、発
達および生存においていまだ十分に特徴付けられていな
い他のCNS−由来ペプチド因子と相乗的に作用しうるこ
とが想像される。
質、フラグメントまたは誘導体は、所望の神経栄養効果
を達成するのに他のサイトカインと一緒に使用できる。
例えば、限定するつもりはないが、本発明によればBDNF
をNGFとあるいは骨格筋抽出物と一緒に使用して、感覚
性ニューロンの成長に対する相乗的刺激効果を達成する
ことができる。ここで相乗効果とはBDNFタンパク質、ペ
プチドフラグメントまたは誘導体と第２薬剤との組合せ
物の作用が個々に使用される同量の各物質より高い効果
を達成することを意味すると解釈される。BDNFが中枢神
経系における広い系列のニューロンサブ集団の成長、発
達および生存においていまだ十分に特徴付けられていな
い他のCNS−由来ペプチド因子と相乗的に作用しうるこ
とが想像される。
更に、BDNF分子の十分な特徴付けに基づいて、BDNFの
いくつかまたは全ての生物学的機能の拮抗体として作用
しうるBDNFの新規ペプチドフラグメント、誘導体または
突然変異体が開発され得ると想定される。かかる拮抗体
は、感覚性ニューロン選択的除去、例えば慢性痛み症候
群の治療に有効であり得る。
いくつかまたは全ての生物学的機能の拮抗体として作用
しうるBDNFの新規ペプチドフラグメント、誘導体または
突然変異体が開発され得ると想定される。かかる拮抗体
は、感覚性ニューロン選択的除去、例えば慢性痛み症候
群の治療に有効であり得る。
本発明の更に別の実施態様においては、BDNFタンパク
質、またはそのペプチドフラグメントあるいは誘導体に
対する抗体は、種々の神経学的障害および疾患にかかっ
ている患者およびかかる治療を必要とする患者に投与で
きる。例えば、BDNFの過剰産生に悩む患者は、かかる治
療を必要としよう。抗−BDNF抗体は、感覚性ニューロン
の異常再生（例えば手術後）の防止に、あるいは上述の
通り慢性痛み症候群の治療に使用できる。神経芽腫組織
に見出される高いレベルのBDNF mRNAに鑑みて、BDNFが
神経芽腫に対するオートクリン腫瘍増殖因子として作用
する可能性があり、従って抗−BDNF抗体を治療的に投与
して本発明の詳細な実施態様における腫瘍退化を達成す
ることができる。
質、またはそのペプチドフラグメントあるいは誘導体に
対する抗体は、種々の神経学的障害および疾患にかかっ
ている患者およびかかる治療を必要とする患者に投与で
きる。例えば、BDNFの過剰産生に悩む患者は、かかる治
療を必要としよう。抗−BDNF抗体は、感覚性ニューロン
の異常再生（例えば手術後）の防止に、あるいは上述の
通り慢性痛み症候群の治療に使用できる。神経芽腫組織
に見出される高いレベルのBDNF mRNAに鑑みて、BDNFが
神経芽腫に対するオートクリン腫瘍増殖因子として作用
する可能性があり、従って抗−BDNF抗体を治療的に投与
して本発明の詳細な実施態様における腫瘍退化を達成す
ることができる。
（10） 医薬組成物 タンパク質、これから誘導されたペプチドフラグメン
トまたは誘導体あるいはBDNFタンパク質、ペプチドフラ
グメント若しくは誘導体に対する抗体（あるいは抗体フ
ラグメント）、あるいはBDNFと第２薬剤、例えばNGFま
たは骨格筋抽出物との組合せを含むBDNF遺伝子産物の全
部または一部分を含有しうる本発明の活性組成物は、任
意の滅菌生体適合性製剤担体、例えばこれに限定されな
いが食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中で
投与され得る。
トまたは誘導体あるいはBDNFタンパク質、ペプチドフラ
グメント若しくは誘導体に対する抗体（あるいは抗体フ
ラグメント）、あるいはBDNFと第２薬剤、例えばNGFま
たは骨格筋抽出物との組合せを含むBDNF遺伝子産物の全
部または一部分を含有しうる本発明の活性組成物は、任
意の滅菌生体適合性製剤担体、例えばこれに限定されな
いが食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中で
投与され得る。
BDNFタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体
は、第１図または第５図に実質的に示されるアミノ酸配
列またはそのサブ配列からなることができる。すなわち
特に第１図に示されるアミノ酸約134から約252までのア
ミノ酸配列の全部または一部分または機能的に等しい配
列を含有するBDNFタンパク質を使用するのが、このサブ
配列がBDNF分子の機能的部分を含有すると信じられるの
で好ましい。BDNFは、限定するものではないがヒト、ブ
タ、ラット、ニワトリ、ウシ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ネ
コ、ウサギ等を含む任意の適当な種のBDNF遺伝子に相当
する配列から誘導できる。
は、第１図または第５図に実質的に示されるアミノ酸配
列またはそのサブ配列からなることができる。すなわち
特に第１図に示されるアミノ酸約134から約252までのア
ミノ酸配列の全部または一部分または機能的に等しい配
列を含有するBDNFタンパク質を使用するのが、このサブ
配列がBDNF分子の機能的部分を含有すると信じられるの
で好ましい。BDNFは、限定するものではないがヒト、ブ
タ、ラット、ニワトリ、ウシ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ネ
コ、ウサギ等を含む任意の適当な種のBDNF遺伝子に相当
する配列から誘導できる。
特定の疾患または状態の治療に有効であろうBDNFタン
パク質、ペプチドフラグメント、誘導体または抗体の量
は、障害または状態の性質の如何に依り、そして標準的
臨床技術によって決定することができる。可能な場合、
用量−応答曲線および本発明の医薬組成物を先ずインビ
トロで、例えば上述のBDNFバイオアッセイ系で測定し、
次いでヒトにおいて試験するに先立ち有効な動物モデル
系で測定するのが望ましい。インビトロデータに基づい
て、本発明の詳細な実施態様においては、感覚性ニュー
ロンの生存を促進するのに有効な医薬組成物は、約５〜
25mg/mlの局所的BDNFタンパク質濃度、好ましくは10〜2
0ng/mlのBDNFを提供できる。本発明の付加的な詳細な実
施態様においては、ドーパミン作動性またはコリン作動
性ニューロンの成長および生存を促進するのに有効な医
薬組成物は、約10〜100ng/mlの局所的BDNFタンパク質濃
度を提供し得る。
パク質、ペプチドフラグメント、誘導体または抗体の量
は、障害または状態の性質の如何に依り、そして標準的
臨床技術によって決定することができる。可能な場合、
用量−応答曲線および本発明の医薬組成物を先ずインビ
トロで、例えば上述のBDNFバイオアッセイ系で測定し、
次いでヒトにおいて試験するに先立ち有効な動物モデル
系で測定するのが望ましい。インビトロデータに基づい
て、本発明の詳細な実施態様においては、感覚性ニュー
ロンの生存を促進するのに有効な医薬組成物は、約５〜
25mg/mlの局所的BDNFタンパク質濃度、好ましくは10〜2
0ng/mlのBDNFを提供できる。本発明の付加的な詳細な実
施態様においては、ドーパミン作動性またはコリン作動
性ニューロンの成長および生存を促進するのに有効な医
薬組成物は、約10〜100ng/mlの局所的BDNFタンパク質濃
度を提供し得る。
導入方法には、これに限定されないが皮内、筋肉内、
腹腔内、静脈内、皮下、経口および鼻腔内が挙げられ
る。加えて、本発明の医薬組成物をこれに限定されない
が心室内および鞘内注射を含む任意の好適な経路により
中枢神経系に導入するのが望ましく、心室内注射は、心
室内カテーテル、例えばOmmaya貯留器のような貯留器に
結合されたカテーテルによって促進され得る。
腹腔内、静脈内、皮下、経口および鼻腔内が挙げられ
る。加えて、本発明の医薬組成物をこれに限定されない
が心室内および鞘内注射を含む任意の好適な経路により
中枢神経系に導入するのが望ましく、心室内注射は、心
室内カテーテル、例えばOmmaya貯留器のような貯留器に
結合されたカテーテルによって促進され得る。
更に、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域に局所
的に投与するのが望ましい。これは、例えばこれに限定
されないが外科手術中の局所的注入によるか、注射によ
るか、カテーテルによるかあるいはインプラントにより
達成でき、該インプラントはシラスティック膜または繊
維のような膜を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状
物質である。
的に投与するのが望ましい。これは、例えばこれに限定
されないが外科手術中の局所的注入によるか、注射によ
るか、カテーテルによるかあるいはインプラントにより
達成でき、該インプラントはシラスティック膜または繊
維のような膜を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状
物質である。
本発明はまた、リポソーム、微粒子またはマイクロカ
プセルを介して投与されるBDNFタンパク質、ペプチドフ
ラグメントまたは誘導体を含有する医薬組成物も包含す
る。本発明の種々の実施態様においては、かかる組成物
を使用してBDNFおよびBDNF−関連産物の持続的放出を達
成するのが有用でありうる。
プセルを介して投与されるBDNFタンパク質、ペプチドフ
ラグメントまたは誘導体を含有する医薬組成物も包含す
る。本発明の種々の実施態様においては、かかる組成物
を使用してBDNFおよびBDNF−関連産物の持続的放出を達
成するのが有用でありうる。
BDNF、BDNF関連物質、BDNF拮抗体または抗−BDNF抗体
を活性に産生する細胞を、高められたまたは低減された
濃度のBDNFを必要とする領域に導入することができると
想定される。
を活性に産生する細胞を、高められたまたは低減された
濃度のBDNFを必要とする領域に導入することができると
想定される。
実施例1: ブタ脳由来神経栄養因子cDNAの分子クローニ
ングおよび特性決定 組織中のBDNFタンパク質がきわめてまれであることに
より、BDNF遺伝子のクローニングに対する標準的な方策
の使用が妨げられていた。その代わりに、限られた量の
タンパク質配列データを、DNA増幅技術を利用して次の
ように拡大させた。すなわち、 （ｉ）マイクログラム量のBDNFをキログラム量のブタの
脳から精製した。
ングおよび特性決定 組織中のBDNFタンパク質がきわめてまれであることに
より、BDNF遺伝子のクローニングに対する標準的な方策
の使用が妨げられていた。その代わりに、限られた量の
タンパク質配列データを、DNA増幅技術を利用して次の
ように拡大させた。すなわち、 （ｉ）マイクログラム量のBDNFをキログラム量のブタの
脳から精製した。
（ii）精製BDNFをタンパク質マイクロ配列化技術で分析
し、そして36個のアミノ酸残基長のアミノ酸配列を決定
した。
し、そして36個のアミノ酸残基長のアミノ酸配列を決定
した。
（iii）前記（ii）で決定されたアミノ酸配列に基づい
てオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、所定アミノ酸
フラグメントをコードするDNAを増幅するために、ブタ
上丘cDNAを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応にお
けるプライマーとして使用した。
てオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、所定アミノ酸
フラグメントをコードするDNAを増幅するために、ブタ
上丘cDNAを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応にお
けるプライマーとして使用した。
（iv）前記（iii）のDNA反応生成物を配列化し、そして （ｖ）相当するオリゴヌクレオチドプライマーを合成し
そしてブタ上丘cDNAとのポリメラーゼ連鎖反応に利用し
てもとの36アミノ酸フラグメントをコードする配列の上
流ならびに下流のBDNF mRNAであるDNAの重複フラグメン
トを生成させた。従って、ブタBDNFに関する完全なコー
ド領域が二つの重複フラグメントにおいて分子的にクロ
ーンされた。
そしてブタ上丘cDNAとのポリメラーゼ連鎖反応に利用し
てもとの36アミノ酸フラグメントをコードする配列の上
流ならびに下流のBDNF mRNAであるDNAの重複フラグメン
トを生成させた。従って、ブタBDNFに関する完全なコー
ド領域が二つの重複フラグメントにおいて分子的にクロ
ーンされた。
これらの工程のそれぞれの詳細は、BDNF遺伝子のさら
なる特性決定とともに、以下に示される。
なる特性決定とともに、以下に示される。
（１）材料および方法 （1.1）ブタ脳からBDNFの精製 ブタ脳からのBDNFの精製は、実質的にHoferおよびBar
de（1988,Nature 331:261−262）に記載される方法によ
り行われた。
de（1988,Nature 331:261−262）に記載される方法によ
り行われた。
ブタ脳6kgを、ウルトラ・ツラックス（Ultra−Turra
x）ホモジナイザーを用いて、1mM EDTAおよび新たに添
加したフェニルメタンスルホニルフルオライド（1mM）
を含有するpH6.0の0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液中で、
緩衝液２に対し脳1kgの割合でホモジナイズした。上
清のpHを1N HClでpH4.0にし、４℃で２時間撹拌した。2
0,000×ｇで25分間遠心分離後、脳3kgに相当する合一し
た上清（1N NaOHでpH6.0に調整）を、0.1M燐酸ナトリウ
ムpH6.0で平衡化した予め膨潤させたカルボキシ−メチ
ル−セルロース１と２時間撹拌した。0.1Mリン酸ナト
リウム、pH6.0、の全量20で２度洗浄した後、スラリ
ーをカラムへ注ぎ、そして0.13M NaClを含有する同じ緩
衝液鋳で一夜洗浄した。活性なフラクションを0.5M NaC
lを含有するリン酸塩緩衝液で溶離し、次に、5mMリン酸
カリウム、pH6.8、の２×５で透析した。出発原料２
×3kgの処理から得られる透析フラクションを、予め5mM
リン酸カリウム,pH6.8、で平衡化した床容量130mlのヒ
ドロキシアパタイトカラムに加えた。次いで、カラムを
5mMのリン酸カリウム500mlと700mMのリン酸カリウム500
ml、両方ともpH6.8、からなる直線状グラジェントを用
いて溶離すると、BDNF活性は、ほぼ500mMリン酸カリウ
ムで溶出された（Bardeら,1982,EMBO,J.1:549−553）。
1.0Mリン酸カリウムを添加することにより、プールされ
た活性フラクションを最終モル濃度700mMリン酸カリウ
ムに調整し、そして700mMリン酸カリウム,pH6.8、で平
衡化したフェニル−セファロースカラム5mlに適用し
た。同じ緩衝液40mlで洗浄後、BDNF活性を0.1Mリン酸カ
リウムpH6.8、で溶離し、蒸留水で透析し、そして凍結
乾燥した。凍結乾燥物質をBarde等（1982,EMBO.J. 1:54
9−553）に記載されるようにして、0.1％ SDSを含有し
メルカプトエタノールを含有しないSDS−ゲル電気泳動
サンプル緩衝液にとり、次に10〜25％アクリルアミドの
（指数関数というよりはむしろ）直線状グラジェントか
らなるSDS−ゲルに加えた。電気泳動分離の完了後、こ
のゲルをクーマシーブルーで簡単に（10分間）染色し、
20分間汚れを落とし、そしてチトクロームＣのレベルで
移動するバンドを切断し、ゲルから電気泳動的に溶出さ
せた。SDSはBarde等（1982、EMBO.J.1:549−553）に記
載されるようにして除去した。
x）ホモジナイザーを用いて、1mM EDTAおよび新たに添
加したフェニルメタンスルホニルフルオライド（1mM）
を含有するpH6.0の0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液中で、
緩衝液２に対し脳1kgの割合でホモジナイズした。上
清のpHを1N HClでpH4.0にし、４℃で２時間撹拌した。2
0,000×ｇで25分間遠心分離後、脳3kgに相当する合一し
た上清（1N NaOHでpH6.0に調整）を、0.1M燐酸ナトリウ
ムpH6.0で平衡化した予め膨潤させたカルボキシ−メチ
ル−セルロース１と２時間撹拌した。0.1Mリン酸ナト
リウム、pH6.0、の全量20で２度洗浄した後、スラリ
ーをカラムへ注ぎ、そして0.13M NaClを含有する同じ緩
衝液鋳で一夜洗浄した。活性なフラクションを0.5M NaC
lを含有するリン酸塩緩衝液で溶離し、次に、5mMリン酸
カリウム、pH6.8、の２×５で透析した。出発原料２
×3kgの処理から得られる透析フラクションを、予め5mM
リン酸カリウム,pH6.8、で平衡化した床容量130mlのヒ
ドロキシアパタイトカラムに加えた。次いで、カラムを
5mMのリン酸カリウム500mlと700mMのリン酸カリウム500
ml、両方ともpH6.8、からなる直線状グラジェントを用
いて溶離すると、BDNF活性は、ほぼ500mMリン酸カリウ
ムで溶出された（Bardeら,1982,EMBO,J.1:549−553）。
1.0Mリン酸カリウムを添加することにより、プールされ
た活性フラクションを最終モル濃度700mMリン酸カリウ
ムに調整し、そして700mMリン酸カリウム,pH6.8、で平
衡化したフェニル−セファロースカラム5mlに適用し
た。同じ緩衝液40mlで洗浄後、BDNF活性を0.1Mリン酸カ
リウムpH6.8、で溶離し、蒸留水で透析し、そして凍結
乾燥した。凍結乾燥物質をBarde等（1982,EMBO.J. 1:54
9−553）に記載されるようにして、0.1％ SDSを含有し
メルカプトエタノールを含有しないSDS−ゲル電気泳動
サンプル緩衝液にとり、次に10〜25％アクリルアミドの
（指数関数というよりはむしろ）直線状グラジェントか
らなるSDS−ゲルに加えた。電気泳動分離の完了後、こ
のゲルをクーマシーブルーで簡単に（10分間）染色し、
20分間汚れを落とし、そしてチトクロームＣのレベルで
移動するバンドを切断し、ゲルから電気泳動的に溶出さ
せた。SDSはBarde等（1982、EMBO.J.1:549−553）に記
載されるようにして除去した。
（1.2）タンパク質の配列決定 BDNFは、直接配列決定される（アミノ酸分析によって
測定して55pモル，アミノ末端ヒスチジンに関する当初
収量40pモル）かまたは次のように切断された。すなわ
ちBDNF5〜10μｇ（５つの異なる調製物から）を下記操
作に従って切断した。V8:S.Aureus V8（Miles）１μｇ
を10％アセトニトリルを含有する0.2M NH4CO3,pH8.0
（全量:50μ）中のBDNF5μｇに加え、室温で一夜イン
キュベートした。トリプシン:TPCK処理トリプシン（ウ
シ膵臓,Sigma Type XIII）１μｇを、10mM CaCl2を含有
するトリス−HCl（0.1M、pH8.0）（全量:40μ）中のB
DNF8μｇに加え、37℃で一夜インキュベートした。臭化
シアン（CNBr）:BDNF 10μｇを70％（v/v）ギ酸（最終
濃度）中の10％（w/v）CNBrと室温で３時間インキュベ
ートした（全量:60μ）。反応終了時にH2O 500μを
添加後、サンプルは急速真空中50μに濃縮した。Tris
−HCl 50μ（1.0M,pH8.0）をβ−メルカプトエタノー
ル５μと一緒に加え、このサンプルを37℃で一夜イン
キュベートした。ヨードメタン５μの添加後、サンプ
ルを急速真空下に蒸発乾燥させた。CNBr開裂後BDNFの還
元およびアルキル化が必要であることが見出された。HP
LCおよびスワンクームンクレスSDS−ゲル電気泳動で示
されるように、還元なしではフラグメントは得られなか
った（SwankおよびMunkres,1971,Anal.Biochem.39:462
−477）。このことは、ジスルフィド橋がBDNF中に存在
しており、そして開裂しても遊離ペプチドを生じえない
様式で配列されていることを示す。全ての開裂後、乾燥
サンプルを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）に再懸濁し、
そして逆相C8マイクロボアー（microbore）HPLCカラム
（Applied Biosystems）に加え、そしてペプチドを0.1
％ TFA中の０〜60％アセトニトリルの60分直線状グラジ
ェントを用いて、0.1ml/分で溶離した。Waters441 UV検
出器で214nmの波長で検出した。このペプチドをHewick
（1981,J.Biol.Chem.256:7990−7997）およびHunkapill
ar（19 83,Methods Enzymol.91:227−236）に従って、
気相マイクロシーケンサー（モデル47 OA AppliedBiosy
stems）での自動エドマン分解により配列化した。PTHア
ミノ酸は、Lottspeich（1985,J.Chromatogr.326:321−3
27）に記載のようにして検出した。
測定して55pモル，アミノ末端ヒスチジンに関する当初
収量40pモル）かまたは次のように切断された。すなわ
ちBDNF5〜10μｇ（５つの異なる調製物から）を下記操
作に従って切断した。V8:S.Aureus V8（Miles）１μｇ
を10％アセトニトリルを含有する0.2M NH4CO3,pH8.0
（全量:50μ）中のBDNF5μｇに加え、室温で一夜イン
キュベートした。トリプシン:TPCK処理トリプシン（ウ
シ膵臓,Sigma Type XIII）１μｇを、10mM CaCl2を含有
するトリス−HCl（0.1M、pH8.0）（全量:40μ）中のB
DNF8μｇに加え、37℃で一夜インキュベートした。臭化
シアン（CNBr）:BDNF 10μｇを70％（v/v）ギ酸（最終
濃度）中の10％（w/v）CNBrと室温で３時間インキュベ
ートした（全量:60μ）。反応終了時にH2O 500μを
添加後、サンプルは急速真空中50μに濃縮した。Tris
−HCl 50μ（1.0M,pH8.0）をβ−メルカプトエタノー
ル５μと一緒に加え、このサンプルを37℃で一夜イン
キュベートした。ヨードメタン５μの添加後、サンプ
ルを急速真空下に蒸発乾燥させた。CNBr開裂後BDNFの還
元およびアルキル化が必要であることが見出された。HP
LCおよびスワンクームンクレスSDS−ゲル電気泳動で示
されるように、還元なしではフラグメントは得られなか
った（SwankおよびMunkres,1971,Anal.Biochem.39:462
−477）。このことは、ジスルフィド橋がBDNF中に存在
しており、そして開裂しても遊離ペプチドを生じえない
様式で配列されていることを示す。全ての開裂後、乾燥
サンプルを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）に再懸濁し、
そして逆相C8マイクロボアー（microbore）HPLCカラム
（Applied Biosystems）に加え、そしてペプチドを0.1
％ TFA中の０〜60％アセトニトリルの60分直線状グラジ
ェントを用いて、0.1ml/分で溶離した。Waters441 UV検
出器で214nmの波長で検出した。このペプチドをHewick
（1981,J.Biol.Chem.256:7990−7997）およびHunkapill
ar（19 83,Methods Enzymol.91:227−236）に従って、
気相マイクロシーケンサー（モデル47 OA AppliedBiosy
stems）での自動エドマン分解により配列化した。PTHア
ミノ酸は、Lottspeich（1985,J.Chromatogr.326:321−3
27）に記載のようにして検出した。
（1.3）DNA鋳型の調製 ブタゲノムDNAをHerrmannおよびFrischauf（1987,Met
hods Enzymol.152:180−183）の方法で単離した。
hods Enzymol.152:180−183）の方法で単離した。
cDNAを調製するにはブタの脳の上丘の6g試料から全RN
Aを得た。この組織標本は地方の畜殺場において得て、
切開し、そして液体窒素中で冷凍した。標準的な方法
（Okayamaら,1987,Methods Enzymol.154:3−28）を利用
してRNAを抽出した。
Aを得た。この組織標本は地方の畜殺場において得て、
切開し、そして液体窒素中で冷凍した。標準的な方法
（Okayamaら,1987,Methods Enzymol.154:3−28）を利用
してRNAを抽出した。
全RNA 80μｇを、末端３′ヌクレオチドとしてＡ、Ｃ
またはＧを有するプライマー混合物CGGATCCGAATTCTGCAG
TTTTTTTTTTTT（オリゴ３、３′ポリ−Ａ伸張部に整合
し、そしてBamH I、EcoR IおよびPst Iの認識部位を含
有するよう設計）を用い、モロネイ（Moloney）マウス
白血病ウィルスの逆トランスクリプターゼを用いて転写
した（BRL,RNasin 1μを加え、そしてアクチノマイシ
ンＤを除いた以外は製造者の指示に従った）。
またはＧを有するプライマー混合物CGGATCCGAATTCTGCAG
TTTTTTTTTTTT（オリゴ３、３′ポリ−Ａ伸張部に整合
し、そしてBamH I、EcoR IおよびPst Iの認識部位を含
有するよう設計）を用い、モロネイ（Moloney）マウス
白血病ウィルスの逆トランスクリプターゼを用いて転写
した（BRL,RNasin 1μを加え、そしてアクチノマイシ
ンＤを除いた以外は製造者の指示に従った）。
（1.4）ポリメラーゼ連鎖反応 ポリメラーゼ連鎖反応は（PCR）は、Saiki等（1985,S
cince 230:1350−1354）記載の方法に従って実施した。
cince 230:1350−1354）記載の方法に従って実施した。
（２）結果および論考 （2.1）タンパク質ミクロ配列化の結果 タンパク質ミクロ配列化の結果を第IV表に示す。
アミノ酸配列の４つの連続セグメントはエドマン分解
により決定し、次にこれを全アミノ酸配列のほぼ1/3を
表す36個のアミノ酸の配列を推定するのに使用し得る。
により決定し、次にこれを全アミノ酸配列のほぼ1/3を
表す36個のアミノ酸の配列を推定するのに使用し得る。
（2.2）オリゴヌクレオチドの合成およびアミノ酸フラ
グメントをコードするDNAを得るためのPCRの使用 ２個の完全に縮重した17マーオリゴヌクレオチドプラ
イマーを、前述の（2.1）節に記載の36アミノ酸残基フ
ラグメントのそれぞれアミノ末端およびカルボキシル−
末端近傍における６個のアミノ酸セグメントに関するコ
ード配列に基づいて化学的に合成した。特に、配列AADK
KT（センス）およびKQYFYE（アンチセンス）（第３表で
下線）に基づく17マーオリゴヌクレオチド（全てのあり
うるコドンに相当し、そしてオリゴ１およびオリゴ２で
示される）の２つの別々の混合物を化学的に合成し、そ
して150pモルの各プライマーをブタゲノムDNA鋳型１μ
ｇに加えた。製造者の指示に従ってポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）を用いて35回の増幅操作を実施した（GeneAmp
TM,Perkin−Elemer Cetus）。変性は94℃で１分間、プ
ライマーアニーリングは45℃で２分間そしてプライマー
伸張は72℃で２分間行われた。予想された寸法のDNAバ
ンド（101bp）を３％アガロースゲル（エチジウムブロ
マイド染色）から切断し、そしてInnis等（1988,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.85:9436−9440）に記載のようにし
てオリゴ１またはオリゴ２の100倍過剰を用いて非対称
的に増幅させた。
グメントをコードするDNAを得るためのPCRの使用 ２個の完全に縮重した17マーオリゴヌクレオチドプラ
イマーを、前述の（2.1）節に記載の36アミノ酸残基フ
ラグメントのそれぞれアミノ末端およびカルボキシル−
末端近傍における６個のアミノ酸セグメントに関するコ
ード配列に基づいて化学的に合成した。特に、配列AADK
KT（センス）およびKQYFYE（アンチセンス）（第３表で
下線）に基づく17マーオリゴヌクレオチド（全てのあり
うるコドンに相当し、そしてオリゴ１およびオリゴ２で
示される）の２つの別々の混合物を化学的に合成し、そ
して150pモルの各プライマーをブタゲノムDNA鋳型１μ
ｇに加えた。製造者の指示に従ってポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）を用いて35回の増幅操作を実施した（GeneAmp
TM,Perkin−Elemer Cetus）。変性は94℃で１分間、プ
ライマーアニーリングは45℃で２分間そしてプライマー
伸張は72℃で２分間行われた。予想された寸法のDNAバ
ンド（101bp）を３％アガロースゲル（エチジウムブロ
マイド染色）から切断し、そしてInnis等（1988,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.85:9436−9440）に記載のようにし
てオリゴ１またはオリゴ２の100倍過剰を用いて非対称
的に増幅させた。
（2.3）cDNAフラグメントのヌクレオチド配列 得られるセンスおよびアンチセンスDNAフラグメント
は、プライマーとして32P−末端標識オリゴヌクレオチ
ド１および２を使用し、ジデオキシヌクレオチドチェイ
ンターミネーター法（Sangerら,1979,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.72:3918−3921）によって配列化した。観察さ
れたヌクレオチド配列は、チェインターミネーションコ
ドンによって中断されない１個のみの読み取り枠を含有
していた。この読み取り枠に関する推定アミノ酸配列
は、ブタBDNFのこの領域に関して決定された実際のアミ
ノ酸配列と完全に一致した。
は、プライマーとして32P−末端標識オリゴヌクレオチ
ド１および２を使用し、ジデオキシヌクレオチドチェイ
ンターミネーター法（Sangerら,1979,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.72:3918−3921）によって配列化した。観察さ
れたヌクレオチド配列は、チェインターミネーションコ
ドンによって中断されない１個のみの読み取り枠を含有
していた。この読み取り枠に関する推定アミノ酸配列
は、ブタBDNFのこの領域に関して決定された実際のアミ
ノ酸配列と完全に一致した。
（2.4）完全なブタBDNFcDNAのクローニング ブタBDNFの完全なコード領域を二つの重複セグメント
において分子クローン化した。BDNFcDNAの３′部分（セ
ンス鎖に該当する）を得るために前記領域内から21塩基
の正しいセンス鎖BDNF配列を含有する30マーオリゴヌク
レオチドプライマーを合成し「センスプライマー」とし
て役立てた。このプライマーのヌクレオチド配列はオリ
ゴ4,（５′）AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGTCGGG（３′）
〔下線部は、その配列が第１図の位置643から663まで
の、アミノ酸配列Thr−Ala−Val−Asp−Met−Ser−Gly
（Glyコドンの最初の２塩基）をコードするBDNFのセン
ス鎖に相当する配列を示す〕であった。このプライマー
５′末端における付加的な９個のヌクレオチドは、分子
クローニングに使用されるSpe IおよびSal I用の好都合
な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を提供するために包
含された。３通りの縮重31マーオリゴヌクレオチドプラ
イマーは、cDNAのセンス鎖上の任意のヌクレオチド
（Ｔ、ＧまたはＣ）が先行するポリーＡの伸張部と相補
性であり、かつ制限エンドヌクレアーゼBamH I,EcoR I
およびPst Iの認識部位を含有するように設計された。
この「アンチセンス」プライマー（オリゴ３）の配列
は、（５′）CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTTX
（３′）（ここで、Ｘ＝A,CまたはＧである）であっ
た。合成オリゴヌクレオチドプライマーをPCRにより、
前記ブタ上丘cDNA調製物からの配列を増幅するのに利用
した。詳細には、３′増幅DNAは、10μの逆転写反応
物、150pモルのセンスプライマー（オリゴ４）およびPC
R反応におけるアンチセンスプライマーとしての150pモ
ルのオリゴ３を使用して得られた。増幅DNA産物につい
てサザンプロットアッセイを行い、そして32P−末端標
識オリゴヌクレオチドAAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG
（オリゴ５、下記５′反応においてアンチセンスプライ
マーとして使用され、そしてBamH IとPst Iの認識配列
を含有）とハイブリッド形成シグナルを生ずるバンドを
切断し、グラスミルク法（gene cleanTM）で抽出し、Ec
oR IとSal Iで消化し、ブルースクリプトSK+プラスミド
（Stratagene）中にクローンし、そして配列化した。
において分子クローン化した。BDNFcDNAの３′部分（セ
ンス鎖に該当する）を得るために前記領域内から21塩基
の正しいセンス鎖BDNF配列を含有する30マーオリゴヌク
レオチドプライマーを合成し「センスプライマー」とし
て役立てた。このプライマーのヌクレオチド配列はオリ
ゴ4,（５′）AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGTCGGG（３′）
〔下線部は、その配列が第１図の位置643から663まで
の、アミノ酸配列Thr−Ala−Val−Asp−Met−Ser−Gly
（Glyコドンの最初の２塩基）をコードするBDNFのセン
ス鎖に相当する配列を示す〕であった。このプライマー
５′末端における付加的な９個のヌクレオチドは、分子
クローニングに使用されるSpe IおよびSal I用の好都合
な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を提供するために包
含された。３通りの縮重31マーオリゴヌクレオチドプラ
イマーは、cDNAのセンス鎖上の任意のヌクレオチド
（Ｔ、ＧまたはＣ）が先行するポリーＡの伸張部と相補
性であり、かつ制限エンドヌクレアーゼBamH I,EcoR I
およびPst Iの認識部位を含有するように設計された。
この「アンチセンス」プライマー（オリゴ３）の配列
は、（５′）CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTTX
（３′）（ここで、Ｘ＝A,CまたはＧである）であっ
た。合成オリゴヌクレオチドプライマーをPCRにより、
前記ブタ上丘cDNA調製物からの配列を増幅するのに利用
した。詳細には、３′増幅DNAは、10μの逆転写反応
物、150pモルのセンスプライマー（オリゴ４）およびPC
R反応におけるアンチセンスプライマーとしての150pモ
ルのオリゴ３を使用して得られた。増幅DNA産物につい
てサザンプロットアッセイを行い、そして32P−末端標
識オリゴヌクレオチドAAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG
（オリゴ５、下記５′反応においてアンチセンスプライ
マーとして使用され、そしてBamH IとPst Iの認識配列
を含有）とハイブリッド形成シグナルを生ずるバンドを
切断し、グラスミルク法（gene cleanTM）で抽出し、Ec
oR IとSal Iで消化し、ブルースクリプトSK+プラスミド
（Stratagene）中にクローンし、そして配列化した。
BDNFコード配列残部（上流または５′部分）を得るた
めには、cDNAを前記の如く調製し、そしてポリ−Ａ尾部
は末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用い
て５′末端で加えた。前記した、各々12個の連続したＴ
残基伸張部を含有する３種の31マーオリゴヌクレオチド
の同じ混合物をこれらの添加ポリ−Ａ尾部に相補的なプ
ライマーを生成させるのに使用した。BDNFコード配列の
相補的な鎖に相当する17塩基を含有し、かつ制限エンド
ヌクレアーゼBamH IとPst Iの認識部位を有する特有の3
0マーオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。この
プライマーの配列は、（５′）AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTT
CGAGACGG（３′）（前記オリゴ５、下線部は、第１図の
709から693位までのBDNFのコード配列のセンス鎖と相補
的な領域を示す）であった。これは、アミノ酸配列Pro
（コドンの最終の２塩基）−Val−Ser−Lys−Gly−Gln
をコードするセグメントに相当する。このプライマーを
ポリＡ−尾部cDNAに加え、そしてPCRによる増幅を前記
のように行った。反応生成物をPst Iで切断し、ブルー
スクリプトベクター中にクローンし、そしてヌクレオチ
ド配列をジデオキシヌクレオチドチェーンターミネータ
ー法によって決定した。
めには、cDNAを前記の如く調製し、そしてポリ−Ａ尾部
は末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用い
て５′末端で加えた。前記した、各々12個の連続したＴ
残基伸張部を含有する３種の31マーオリゴヌクレオチド
の同じ混合物をこれらの添加ポリ−Ａ尾部に相補的なプ
ライマーを生成させるのに使用した。BDNFコード配列の
相補的な鎖に相当する17塩基を含有し、かつ制限エンド
ヌクレアーゼBamH IとPst Iの認識部位を有する特有の3
0マーオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。この
プライマーの配列は、（５′）AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTT
CGAGACGG（３′）（前記オリゴ５、下線部は、第１図の
709から693位までのBDNFのコード配列のセンス鎖と相補
的な領域を示す）であった。これは、アミノ酸配列Pro
（コドンの最終の２塩基）−Val−Ser−Lys−Gly−Gln
をコードするセグメントに相当する。このプライマーを
ポリＡ−尾部cDNAに加え、そしてPCRによる増幅を前記
のように行った。反応生成物をPst Iで切断し、ブルー
スクリプトベクター中にクローンし、そしてヌクレオチ
ド配列をジデオキシヌクレオチドチェーンターミネータ
ー法によって決定した。
（2.5）ブタBDNF cDNAのヌクレオチド配列 重複ブタBDNF cDNAクローンから決定された合一した
ヌクレオチド配列を、推定アミノ酸配列とともに第１図
に示す。その配列は、252個のアミノ酸のポリペプチド
に関する読み取り枠を含んでいる。開始Metコドン（AT
G）の確認は、36塩基対上流から始まる、同一読み取り
枠における２個の隣接する鎖終止コドン（TAG−TGA）の
存在に基づいている。精製タンパク質に関する直接配列
分析により決定されたブタBDNFのアミノ末端は、このポ
リペプチドの残基His134に相当する。従って、配列デー
タにより、成熟BDNFが前駆体ポリペプチポドからのプロ
セシングにより誘導されることが示される。残基His 13
4は、配列Arg−Val−Arg−Argの直後にある。１塩基性
アミノ酸残基に続く中性残基そしてさらに２個の塩基性
残基からなるかかる配列は前駆体ポリペプチドのタンパ
ク分解的プロセシングのための標的部位として関与して
いる。成熟BDNFの推定アミノ酸配列により、塩基価（pI
＝9.99）、すなわち二次元ゲル電気泳動による分別後の
生物学的活性因子評価によるBDNFの前記特性化と一致す
る特性を有する119アミノ酸のタンパク質（分子量13,51
1ダルトン）が予測される。タンパク質マイクロ配列化
によって決定されたBDNFの一部分のアミノ酸配列（全部
で64個のアミノ酸残基）は、cDNAクローンのヌクレオチ
ド配列から推定されたアミノ酸配列と完全に一致する
（第１図の下線部）。前駆体ポリペプチドの配列は、少
なくとも二段階においてBDNFのプロセシングと一致す
る。すなわち第１に多分18残基のシウナルペプチドがア
ミノ末端から開裂され、次にArg 133とHis 134の間が開
裂されて成熟ポリペプチドが放出されよう。もし、この
モデルが正しければ、この前駆体はプレプロBDNFと呼ぶ
ことができよう。
ヌクレオチド配列を、推定アミノ酸配列とともに第１図
に示す。その配列は、252個のアミノ酸のポリペプチド
に関する読み取り枠を含んでいる。開始Metコドン（AT
G）の確認は、36塩基対上流から始まる、同一読み取り
枠における２個の隣接する鎖終止コドン（TAG−TGA）の
存在に基づいている。精製タンパク質に関する直接配列
分析により決定されたブタBDNFのアミノ末端は、このポ
リペプチドの残基His134に相当する。従って、配列デー
タにより、成熟BDNFが前駆体ポリペプチポドからのプロ
セシングにより誘導されることが示される。残基His 13
4は、配列Arg−Val−Arg−Argの直後にある。１塩基性
アミノ酸残基に続く中性残基そしてさらに２個の塩基性
残基からなるかかる配列は前駆体ポリペプチドのタンパ
ク分解的プロセシングのための標的部位として関与して
いる。成熟BDNFの推定アミノ酸配列により、塩基価（pI
＝9.99）、すなわち二次元ゲル電気泳動による分別後の
生物学的活性因子評価によるBDNFの前記特性化と一致す
る特性を有する119アミノ酸のタンパク質（分子量13,51
1ダルトン）が予測される。タンパク質マイクロ配列化
によって決定されたBDNFの一部分のアミノ酸配列（全部
で64個のアミノ酸残基）は、cDNAクローンのヌクレオチ
ド配列から推定されたアミノ酸配列と完全に一致する
（第１図の下線部）。前駆体ポリペプチドの配列は、少
なくとも二段階においてBDNFのプロセシングと一致す
る。すなわち第１に多分18残基のシウナルペプチドがア
ミノ末端から開裂され、次にArg 133とHis 134の間が開
裂されて成熟ポリペプチドが放出されよう。もし、この
モデルが正しければ、この前駆体はプレプロBDNFと呼ぶ
ことができよう。
実施例2:BDNF遺伝子が多様な脊椎動物種のNGF遺伝子と
異なること （１）材料および方法 （1.1）NGFおよびBDNF DNAプローブの調製 好都合な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を導入する
ために数種の保存コドン置換基を有する正常ヒトNGFコ
ード配列を取り込んだ、成熟ヒトNGFをコードする合成
遺伝子を含有するプラスミドをBritish Biotechnologie
s Limitedから購入した。一対の18−マーオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成してアミノ酸残基９〜111のコ
ード領域に相当するこの遺伝子の270塩基対セグメント
のPCRによる増幅ができるようにした。標識DNAプローブ
を得るためには、10サイクルのPCR反応を32P−dCTPを用
いて行った。もとの鋳型としてブタゲノムDNAを用いて
増幅を行い、そして増幅されたセグメントが成熟BDNFの
アミノ酸28〜111のコード領域に相当する以外は同様の
方法でBDNFプローブを得た。アミノ酸106〜111の領域に
相当する相補鎖（「アンチセンス」）プライマーを合成
し、このものは配列［（５′）ACATACACAGGAAGTGTC
（３′）］を有した。センス鎖オリゴヌクレオチドプラ
イマーは、アミノ酸残基28〜33［（５′）GCAGTGGACATG
TCGGGT（３′）］の領域に関して調製された。これらの
２つのプローブを用いるサザンブロットハイブリッド形
成（Southern,1975,J.Mol.Biol.98:503−517）を２×SS
C中で68℃にて厳密な条件下で行った。
異なること （１）材料および方法 （1.1）NGFおよびBDNF DNAプローブの調製 好都合な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を導入する
ために数種の保存コドン置換基を有する正常ヒトNGFコ
ード配列を取り込んだ、成熟ヒトNGFをコードする合成
遺伝子を含有するプラスミドをBritish Biotechnologie
s Limitedから購入した。一対の18−マーオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成してアミノ酸残基９〜111のコ
ード領域に相当するこの遺伝子の270塩基対セグメント
のPCRによる増幅ができるようにした。標識DNAプローブ
を得るためには、10サイクルのPCR反応を32P−dCTPを用
いて行った。もとの鋳型としてブタゲノムDNAを用いて
増幅を行い、そして増幅されたセグメントが成熟BDNFの
アミノ酸28〜111のコード領域に相当する以外は同様の
方法でBDNFプローブを得た。アミノ酸106〜111の領域に
相当する相補鎖（「アンチセンス」）プライマーを合成
し、このものは配列［（５′）ACATACACAGGAAGTGTC
（３′）］を有した。センス鎖オリゴヌクレオチドプラ
イマーは、アミノ酸残基28〜33［（５′）GCAGTGGACATG
TCGGGT（３′）］の領域に関して調製された。これらの
２つのプローブを用いるサザンブロットハイブリッド形
成（Southern,1975,J.Mol.Biol.98:503−517）を２×SS
C中で68℃にて厳密な条件下で行った。
（1.2）種々の種からのBDNF遺伝子の配列決定 上記の成熟ブタBDNFのアミノ酸28〜111のコード領域
を含有する同じ２種の18マーオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして使用して標準PCR条件下にブタ、ラット、
ニワトリおよびヒトのゲノムDNAの252塩基対セグメント
を増幅し、そして得られたDNA反応生成物を、ジデオキ
シヌクレオチドチェインターミネーター法（Sangerら,1
979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3918−3921）により
整理配列した。いくつかの場合には、増幅されたDNAの
バンドを切断しそしてアガロースゲル電気泳動後に抽出
し、そして配列化に先立って再び増幅した。それ以外の
場合は再増幅は必須条件ではなかった。
を含有する同じ２種の18マーオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして使用して標準PCR条件下にブタ、ラット、
ニワトリおよびヒトのゲノムDNAの252塩基対セグメント
を増幅し、そして得られたDNA反応生成物を、ジデオキ
シヌクレオチドチェインターミネーター法（Sangerら,1
979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3918−3921）により
整理配列した。いくつかの場合には、増幅されたDNAの
バンドを切断しそしてアガロースゲル電気泳動後に抽出
し、そして配列化に先立って再び増幅した。それ以外の
場合は再増幅は必須条件ではなかった。
（２）結果および論考 本発明以前には、BDNFタンパク質はブタからしか精製
されていなかった。BDNFが単にブタ神経成長因子ベータ
サブユニット（ベータNGFまたは本明細書において単にN
GFと呼ぶ）ではないということを明確に示すことは最も
重要であり、その精製および分子クローニングは今日ま
で報告されていない。先に報告されたブタBDNFの物理的
性質が種々の種からのβ−NGFモノマーのものと実質的
に同一であるので、これは特に決定的に重要である。ブ
タBDNFに対する中和抗体の欠如、およびブタBDNFに関す
るアミノ酸またはヌクレオチド配列情報の欠如ゆえに、
BDNFとNGFとの間の正確な関係を決定することが不可能
であった。BDNFとNGFとの間の生物学的活性において観
察された相違が、例えばブタとある種の他の種（例えば
マウス）との間のNGFの相違を単に反映するにすぎない
か、あるいは異なる組織（例えばブタ脳対マウス唾液
腺）におけるNGFタンパク質分子の特異的修飾から生ず
るものかあるいはブタ脳からの精製の際のある段階にお
いてタンパク質に不適切に導入された修飾から生じうる
ことは想像できた。
されていなかった。BDNFが単にブタ神経成長因子ベータ
サブユニット（ベータNGFまたは本明細書において単にN
GFと呼ぶ）ではないということを明確に示すことは最も
重要であり、その精製および分子クローニングは今日ま
で報告されていない。先に報告されたブタBDNFの物理的
性質が種々の種からのβ−NGFモノマーのものと実質的
に同一であるので、これは特に決定的に重要である。ブ
タBDNFに対する中和抗体の欠如、およびブタBDNFに関す
るアミノ酸またはヌクレオチド配列情報の欠如ゆえに、
BDNFとNGFとの間の正確な関係を決定することが不可能
であった。BDNFとNGFとの間の生物学的活性において観
察された相違が、例えばブタとある種の他の種（例えば
マウス）との間のNGFの相違を単に反映するにすぎない
か、あるいは異なる組織（例えばブタ脳対マウス唾液
腺）におけるNGFタンパク質分子の特異的修飾から生ず
るものかあるいはブタ脳からの精製の際のある段階にお
いてタンパク質に不適切に導入された修飾から生じうる
ことは想像できた。
BDNFが明らかにNGFと相違することが見出されるな
ら、BDNF遺伝子が他の種、特にヒトに存在するか否かを
決定するのは非常に重要である。本発明以前には、BDNF
がほんの１種からしか精製されなかったので、何らこの
点に関する情報が得られなかった。種々の粗製抽出物お
よび馴化培地中におけるNGFと明白に相違する神経栄養
活性の存在は、ブタBDNFと同一または実質的に等しい物
質の存在の意味するものではなかった。
ら、BDNF遺伝子が他の種、特にヒトに存在するか否かを
決定するのは非常に重要である。本発明以前には、BDNF
がほんの１種からしか精製されなかったので、何らこの
点に関する情報が得られなかった。種々の粗製抽出物お
よび馴化培地中におけるNGFと明白に相違する神経栄養
活性の存在は、ブタBDNFと同一または実質的に等しい物
質の存在の意味するものではなかった。
ブタBDNFの予想されるアミノ酸配列を多くの種（ヒ
ト、ウシ、モルモット、マウス、ニワトリおよびヘビ）
からのNGFの既知配列と比較すると、NGFが相互に関連す
るよりもBDNFの方が脊椎動物NGFとの関連性がかなり劣
ることが示された（第２図）。成熟BDNFの主要構造の際
立った特徴は、NGFとその類似性である。すなわち、整
合性を最適化するのにほんの３つの相違をNGF配列に導
入するだけで51の同一性が種々のNGF（ヘビからヒト）
およびBDNFに共通である（第２図）。重要なことに、こ
れらの同一性には全６個のシステイン残基が包含され
る。BDNFのジスルフィド橋の正確な配列は未だ知られて
いないが、かかる架橋が存在することは明らかである
（第III表，凡例）。BDNFに見出される３個のトリプト
ファンおよび２個のフェニルアラニン残基はNGF中の同
一位置で見出される。本発明者等は、６個のアスパラギ
ン酸残基（BDNF中の７個のうち）および７個のバリン
（９個のうち）が哺乳動物NGF類およびBDNFの同一位置
に存在することにも注目する。これら５種類のアミノ酸
は、２種のタンパク質の間のアミノ酸同一性の約半分を
占める。逆に、BDNFと全てのNGF類との間にはいくつか
の際立った相違が存在する。すなわち、既に述べた３個
の相違に加えて、アミノ酸が全てのNGFにおいて同一で
あるがBDNFで異なる21個の位置も存在する。
ト、ウシ、モルモット、マウス、ニワトリおよびヘビ）
からのNGFの既知配列と比較すると、NGFが相互に関連す
るよりもBDNFの方が脊椎動物NGFとの関連性がかなり劣
ることが示された（第２図）。成熟BDNFの主要構造の際
立った特徴は、NGFとその類似性である。すなわち、整
合性を最適化するのにほんの３つの相違をNGF配列に導
入するだけで51の同一性が種々のNGF（ヘビからヒト）
およびBDNFに共通である（第２図）。重要なことに、こ
れらの同一性には全６個のシステイン残基が包含され
る。BDNFのジスルフィド橋の正確な配列は未だ知られて
いないが、かかる架橋が存在することは明らかである
（第III表，凡例）。BDNFに見出される３個のトリプト
ファンおよび２個のフェニルアラニン残基はNGF中の同
一位置で見出される。本発明者等は、６個のアスパラギ
ン酸残基（BDNF中の７個のうち）および７個のバリン
（９個のうち）が哺乳動物NGF類およびBDNFの同一位置
に存在することにも注目する。これら５種類のアミノ酸
は、２種のタンパク質の間のアミノ酸同一性の約半分を
占める。逆に、BDNFと全てのNGF類との間にはいくつか
の際立った相違が存在する。すなわち、既に述べた３個
の相違に加えて、アミノ酸が全てのNGFにおいて同一で
あるがBDNFで異なる21個の位置も存在する。
ほとんどのBDNF前駆体配列は、２つの例外を除いてNG
Fのものとは関連しない。すなわち、BDNFの推定分泌シ
グナル配列が５個のアミノ酸同一性（18個のアミノ酸の
うち）を示すこと、および翻訳開始メチオニンの後の18
位に見出されるアラニン残基の後に開裂が生ずることが
示される（Edwardsら,1988,Mol.Cell.Biol.8:2456−246
4）マウスNGFのシグナル配列と全体的に極めて相関性が
高いことである。BDNFの18位にも見出されるアラニンが
BDNFシグナル配列の除去に関するありうる開裂部位であ
りそうである。NGFとのその他の類似性は、アスパラギ
ン126に相当する唯一のＮ−グリコシル化コンセンサス
配列（第１図における二重下線）で始まることである。
このアスパラギンは、成熟BDNFを生成する開裂部位の８
アミノ酸前に存在する。同一の配置は、数種のNGF並び
に前駆体の最後の４アミノ酸としての配列Arg−Ｘ−塩
基性−Argに見出される（Schmarzら,1989,J.Neurochem.
52:1203−1209）。
Fのものとは関連しない。すなわち、BDNFの推定分泌シ
グナル配列が５個のアミノ酸同一性（18個のアミノ酸の
うち）を示すこと、および翻訳開始メチオニンの後の18
位に見出されるアラニン残基の後に開裂が生ずることが
示される（Edwardsら,1988,Mol.Cell.Biol.8:2456−246
4）マウスNGFのシグナル配列と全体的に極めて相関性が
高いことである。BDNFの18位にも見出されるアラニンが
BDNFシグナル配列の除去に関するありうる開裂部位であ
りそうである。NGFとのその他の類似性は、アスパラギ
ン126に相当する唯一のＮ−グリコシル化コンセンサス
配列（第１図における二重下線）で始まることである。
このアスパラギンは、成熟BDNFを生成する開裂部位の８
アミノ酸前に存在する。同一の配置は、数種のNGF並び
に前駆体の最後の４アミノ酸としての配列Arg−Ｘ−塩
基性−Argに見出される（Schmarzら,1989,J.Neurochem.
52:1203−1209）。
NGFおよびBDNFが種々の脊椎動物種における異なる遺
伝子によってコードされるという証拠は、分子クローン
されたヒトNGFおよびブタBDNFからDNAプローブを調製
し、そして制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで消化したゲ
ノムDNAとのサザンブロットハイブリダイゼーションを
行うことによって得られた。以下の供給源すなわちヒ
ト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワ
トリおよび酵母からのゲノムDNAを分析した。DNAをEcoR
Iで消化し、そして二通りのフィルター上で32P−標識
ヒトNGFプローブおよびブタBDNFプローブを用いてサザ
ンブロティングにより分析した。酵母を除く試験された
全ての生物において各プローブで１個のバンドが観察さ
れた。ほとんどの場合において、任意の１つの生物にお
いてNGFおよびBDNFプローブとハイブリッド形成するバ
ンドは異なる電気泳動移動度を示したが、数例において
（例えばマウス）は、NGFおよびBDNFプローブとハイブ
リッド形成するEcoR Iフラグメントは略同一寸法であ
り、そして用いた電気泳動条件下では分解できなかった
（第３図）。
伝子によってコードされるという証拠は、分子クローン
されたヒトNGFおよびブタBDNFからDNAプローブを調製
し、そして制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで消化したゲ
ノムDNAとのサザンブロットハイブリダイゼーションを
行うことによって得られた。以下の供給源すなわちヒ
ト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワ
トリおよび酵母からのゲノムDNAを分析した。DNAをEcoR
Iで消化し、そして二通りのフィルター上で32P−標識
ヒトNGFプローブおよびブタBDNFプローブを用いてサザ
ンブロティングにより分析した。酵母を除く試験された
全ての生物において各プローブで１個のバンドが観察さ
れた。ほとんどの場合において、任意の１つの生物にお
いてNGFおよびBDNFプローブとハイブリッド形成するバ
ンドは異なる電気泳動移動度を示したが、数例において
（例えばマウス）は、NGFおよびBDNFプローブとハイブ
リッド形成するEcoR Iフラグメントは略同一寸法であ
り、そして用いた電気泳動条件下では分解できなかった
（第３図）。
成熟BDNFをコードする配列の一部分をブタ、ラット、
ニワトリおよびヒトのゲノムDNAからPCRによって増幅
し、そしてヌクレオチド配列を決定した。ブタゲノムDN
Aから増幅された領域のDNA配列分析により、ブタ脳cDNA
からの分子クローンにより得られた配列結果が正確に確
認された。この252塩基対セグメントに関するラット、
ヒトおよびニワトリBDNFのゲノム配列も決定された（第
５図）。特に、ラットおよびヒトにおいて、少なくとも
アミノ酸28から111までの領域に関する推定アミノ酸配
列は、ブタBDNFのそれと同一であったが、多くのヌクレ
オチド相違（例えば、コドンの第３位の保守的変化）が
種々の種のうちで観察された。ニワトリにおいてはこの
領域で１個のアミノ酸置換が観察された。すなわち成熟
タンパク質の残基61が哺乳動物BDNFのメチオニンに比較
してニワトリにおいてはリジンである。上記のサザンブ
ロットハイブリダイゼーション実験と共にこの配列デー
タにより、BDNFがNGFをコードするそれと異なる非常に
保存された遺伝子によってコードされるという明確な証
拠が提供された。
ニワトリおよびヒトのゲノムDNAからPCRによって増幅
し、そしてヌクレオチド配列を決定した。ブタゲノムDN
Aから増幅された領域のDNA配列分析により、ブタ脳cDNA
からの分子クローンにより得られた配列結果が正確に確
認された。この252塩基対セグメントに関するラット、
ヒトおよびニワトリBDNFのゲノム配列も決定された（第
５図）。特に、ラットおよびヒトにおいて、少なくとも
アミノ酸28から111までの領域に関する推定アミノ酸配
列は、ブタBDNFのそれと同一であったが、多くのヌクレ
オチド相違（例えば、コドンの第３位の保守的変化）が
種々の種のうちで観察された。ニワトリにおいてはこの
領域で１個のアミノ酸置換が観察された。すなわち成熟
タンパク質の残基61が哺乳動物BDNFのメチオニンに比較
してニワトリにおいてはリジンである。上記のサザンブ
ロットハイブリダイゼーション実験と共にこの配列デー
タにより、BDNFがNGFをコードするそれと異なる非常に
保存された遺伝子によってコードされるという明確な証
拠が提供された。
実施例3:ニューロン対非−ニューロン組織におけるBDNF
RNAの発現 （１）材料および方法 （1.1）RANの調製 全RNAを成体雌マウス組織からOkayama等（1987,Metho
ds Enzymol.154:3−28）に従って抽出した。要約する
と、凍結組織を5.5Mグアニジニウムチオシアネート中で
ホモジナイズし、そして溶解物を遠心分離して細胞屑を
除去し、そして1.51g/mlの密度に調整したトリフルオロ
酢酸セシウムのクッション上に上清を積層させた。125,
000×ｇでSW27スゥィンギングバケットローター（Beckm
ann）中で24時間遠心した後、RNAを再懸濁させ、エタノ
ールおよび8M酢酸アンモニウムで再沈澱させ、そして−
70℃で保存した。電気泳動は1.3％アガロース−ホルム
アルデヒドゲル上でLehrach等（1977,Biochmistry 16:4
743−4751）に従い実施した。RNAをナイロン膜（Hybond
−N,Amersham）に移し、そして50％ホルムアミドを含有
する２×SSCの1ml中で32P−標識cRNAマウスBDNFプロー
ブ（107cpm,以下を参照のこと）と62℃で一夜ハイブリ
ッド形成させた。0.1×SSC中で65℃で60分間洗浄した。
洗浄後、ブロットを0.1μg/ml RNアーゼＡ（Pharmaci
a）と室温で60分間インキュベートし、そしてフィルム
を−70℃にて（増感スクリーンで）48時間曝した。
RNAの発現 （１）材料および方法 （1.1）RANの調製 全RNAを成体雌マウス組織からOkayama等（1987,Metho
ds Enzymol.154:3−28）に従って抽出した。要約する
と、凍結組織を5.5Mグアニジニウムチオシアネート中で
ホモジナイズし、そして溶解物を遠心分離して細胞屑を
除去し、そして1.51g/mlの密度に調整したトリフルオロ
酢酸セシウムのクッション上に上清を積層させた。125,
000×ｇでSW27スゥィンギングバケットローター（Beckm
ann）中で24時間遠心した後、RNAを再懸濁させ、エタノ
ールおよび8M酢酸アンモニウムで再沈澱させ、そして−
70℃で保存した。電気泳動は1.3％アガロース−ホルム
アルデヒドゲル上でLehrach等（1977,Biochmistry 16:4
743−4751）に従い実施した。RNAをナイロン膜（Hybond
−N,Amersham）に移し、そして50％ホルムアミドを含有
する２×SSCの1ml中で32P−標識cRNAマウスBDNFプロー
ブ（107cpm,以下を参照のこと）と62℃で一夜ハイブリ
ッド形成させた。0.1×SSC中で65℃で60分間洗浄した。
洗浄後、ブロットを0.1μg/ml RNアーゼＡ（Pharmaci
a）と室温で60分間インキュベートし、そしてフィルム
を−70℃にて（増感スクリーンで）48時間曝した。
（1.2）cRNAプローブの調製 マウス脳cDNAライブラリーを、２個の独立したBDNFオ
リゴヌクレオチドでスクリーニングした。二重陽性クロ
ーンを単離し、そしてブルースクリプトSK+プラスミド
（Stratagene）のEcoR I部位中にサブクローンした。ブ
タ配列のヌクレオチド350〜829に相当するヌクレオチド
配列（第１図）を決定した。この配列において、総計で
４個のみのアミノ酸相違がマウスとブタBDNFとの間で見
出され、このことはブタとマウスBDNFとの間のこのドメ
インの著しい保存度を示している。この鋳型およびT3ポ
リメラーゼ（Promega）を用いて一本鎖RNAプローブを調
製した。このプローブの特異活性は108cpm/μｇであっ
た。
リゴヌクレオチドでスクリーニングした。二重陽性クロ
ーンを単離し、そしてブルースクリプトSK+プラスミド
（Stratagene）のEcoR I部位中にサブクローンした。ブ
タ配列のヌクレオチド350〜829に相当するヌクレオチド
配列（第１図）を決定した。この配列において、総計で
４個のみのアミノ酸相違がマウスとブタBDNFとの間で見
出され、このことはブタとマウスBDNFとの間のこのドメ
インの著しい保存度を示している。この鋳型およびT3ポ
リメラーゼ（Promega）を用いて一本鎖RNAプローブを調
製した。このプローブの特異活性は108cpm/μｇであっ
た。
（２）結果および論考 ノーザンブロット分析を使用してニューロン対非−ニ
ューロン組織におけるBDNF mRNAの発現を評価した。ノ
ーザンブロット分析はマウス組織を使用して行い、RNA
抽出がブタ組織より迅速に行えるようにした。32P−cRN
Aプローブにより、脳（第４図）および脊髄（データは
示されず）で約1.46kbのシグナルが検出された。重要な
ことに、腎臓、消化管、肺、肝臓、脾臓、心臓および筋
肉を含む他のすべての組織中ではシグナルは検出されな
かった（第４図）。ブタmRNAの寸法をマウスのものと同
様と仮定すると、第２図に示されるcDNA配列は、完全な
mRNA配列の80％以上を表している。
ューロン組織におけるBDNF mRNAの発現を評価した。ノ
ーザンブロット分析はマウス組織を使用して行い、RNA
抽出がブタ組織より迅速に行えるようにした。32P−cRN
Aプローブにより、脳（第４図）および脊髄（データは
示されず）で約1.46kbのシグナルが検出された。重要な
ことに、腎臓、消化管、肺、肝臓、脾臓、心臓および筋
肉を含む他のすべての組織中ではシグナルは検出されな
かった（第４図）。ブタmRNAの寸法をマウスのものと同
様と仮定すると、第２図に示されるcDNA配列は、完全な
mRNA配列の80％以上を表している。
BDNFの生理学的記述における重要な観察は、このタン
パク質をコードするmRNAが中枢神経系においてのみ見出
されそして７種の非−CNS組織には見出されないという
ことである。BDNF mRNAは脳全体のみならず（第４
図）、脊髄および上丘にも見出された（第１図に示され
る配列は完全に上丘cDNA鋳型に由来する）。これらのデ
ータは、BDNFが標的由来神経栄養因子であり、そしてBD
NF−応答性ニューロンがCNSに固有であるかあるいはCNS
構造に直接連結されているという着想を裏書きするもの
である。事実、BDNFに応答することが知られている全て
のニューロンはいままでのところ背根または頭蓋知覚神
経節のようにCNS中に突き出しているか（Lindsayら,198
5,Dev.Biol.112:319−328;Daviesら,1986,J.Neurosci.
6:1897−1904）、あるいは網膜神経節細胞のようにCNS
ニューロンである（Johnsonら,1986,J.Neurosci.6:3031
−3038）。明らかに、CNSにおけるBDNF合成部位の正確
な分布を検査するには詳細な研究を行う必要があるが、
BDNF mRNAの分布が多くの非−CNS組織に見られるNGF mR
NAのそれと非常に相違することは既に明白である（Heum
annら,1984,EMBO J.3:3183−3189;Sheltonら,1984,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7951−7955）。
パク質をコードするmRNAが中枢神経系においてのみ見出
されそして７種の非−CNS組織には見出されないという
ことである。BDNF mRNAは脳全体のみならず（第４
図）、脊髄および上丘にも見出された（第１図に示され
る配列は完全に上丘cDNA鋳型に由来する）。これらのデ
ータは、BDNFが標的由来神経栄養因子であり、そしてBD
NF−応答性ニューロンがCNSに固有であるかあるいはCNS
構造に直接連結されているという着想を裏書きするもの
である。事実、BDNFに応答することが知られている全て
のニューロンはいままでのところ背根または頭蓋知覚神
経節のようにCNS中に突き出しているか（Lindsayら,198
5,Dev.Biol.112:319−328;Daviesら,1986,J.Neurosci.
6:1897−1904）、あるいは網膜神経節細胞のようにCNS
ニューロンである（Johnsonら,1986,J.Neurosci.6:3031
−3038）。明らかに、CNSにおけるBDNF合成部位の正確
な分布を検査するには詳細な研究を行う必要があるが、
BDNF mRNAの分布が多くの非−CNS組織に見られるNGF mR
NAのそれと非常に相違することは既に明白である（Heum
annら,1984,EMBO J.3:3183−3189;Sheltonら,1984,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7951−7955）。
実施例4:ヒトおよびラットBDNF遺伝子の分子クローニン
グおよび特性決定 （１）材料および方法 （1.1）ゲノムDNAおよびcDNAライブラリー ラムダ−ZAP IIにおける成人ヒト網膜cDNAをStratage
neから得た。EMBL3/SP6/T7におけるヒト胎盤ゲノムDNA
ライブラリーはClontechから得た。λgtllにおけるヒト
胎児脳cDNAライブラリーはClontechから得た。EMBL3/SP
6/T7におけるラットゲノムDNAライブラリーはClontech
から得た。両ゲノムライブラリーは、ゲノムDNAのSau 3
A制限エンドヌクレアーゼによる部分的消化およびベク
ターのBamH I部位への連結によって調製した。ラムダ−
ZAP IIにおけるラット脳cDNAライブラリーはStratagene
から得た。
グおよび特性決定 （１）材料および方法 （1.1）ゲノムDNAおよびcDNAライブラリー ラムダ−ZAP IIにおける成人ヒト網膜cDNAをStratage
neから得た。EMBL3/SP6/T7におけるヒト胎盤ゲノムDNA
ライブラリーはClontechから得た。λgtllにおけるヒト
胎児脳cDNAライブラリーはClontechから得た。EMBL3/SP
6/T7におけるラットゲノムDNAライブラリーはClontech
から得た。両ゲノムライブラリーは、ゲノムDNAのSau 3
A制限エンドヌクレアーゼによる部分的消化およびベク
ターのBamH I部位への連結によって調製した。ラムダ−
ZAP IIにおけるラット脳cDNAライブラリーはStratagene
から得た。
（1.2）BDNF DNAプローブの調製 32P−標識BDNF DNAプローブは、ヒトBDNFの残基28〜1
11のコード領域を増幅するためのヒトゲノムDNAを用い
るPCR反応において、上述の実施例２の（1.1）節に記載
されたと同一のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
調製された。並行して、ラットBDNF−特異的32P−標的
プローブを、PCRの鋳型としてラットゲノムDNAを用いて
得た。
11のコード領域を増幅するためのヒトゲノムDNAを用い
るPCR反応において、上述の実施例２の（1.1）節に記載
されたと同一のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
調製された。並行して、ラットBDNF−特異的32P−標的
プローブを、PCRの鋳型としてラットゲノムDNAを用いて
得た。
（1.3）ライブラリーのスクリーニング ラムダファージライブラリーを標準法（Bentonおよび
Davis,1977,Science 196:180−182;Maniatisら,1878,Ce
ll.15:687−701）に従い、デキストラン硫酸を含有する
50％ホルムアルデヒドおよびDenhardt溶液中で42℃にて
ハイブリッド形成させてスクリーニングした。フィルタ
ーは、42℃で50％ホルムアルデヒド、5XSSCPE、10％ De
nhardt溶液、0.5mg/mlサケ精子DNA、0.1％ SDSおよび10
％デキストラン硫酸中で予めハイブリッド形成させた。
Denhardt溶液が２％であり、サケ精子DNAが0.1mg/mlで
あり、そしてSDSおよびデキストラン硫酸排除した以外
は同じ緩衝液中でハイブリッド形成を行った。ハイブリ
ッド形成後フィルターを68℃で洗浄した。ヒトBDNFプロ
ーブを使用してヒトゲノムDNAおよび網 膜cDNAライブ
ラリーを選択した。ラットBDNFプローブを使用してラッ
トゲノムDNAおよび脳cDNAライブラリーを選抜した。ま
た、ライブラリーを上述の実施例２の（1.1）節で調製
したヒトおよびラットNGFプローブを用いても選抜し
た。
Davis,1977,Science 196:180−182;Maniatisら,1878,Ce
ll.15:687−701）に従い、デキストラン硫酸を含有する
50％ホルムアルデヒドおよびDenhardt溶液中で42℃にて
ハイブリッド形成させてスクリーニングした。フィルタ
ーは、42℃で50％ホルムアルデヒド、5XSSCPE、10％ De
nhardt溶液、0.5mg/mlサケ精子DNA、0.1％ SDSおよび10
％デキストラン硫酸中で予めハイブリッド形成させた。
Denhardt溶液が２％であり、サケ精子DNAが0.1mg/mlで
あり、そしてSDSおよびデキストラン硫酸排除した以外
は同じ緩衝液中でハイブリッド形成を行った。ハイブリ
ッド形成後フィルターを68℃で洗浄した。ヒトBDNFプロ
ーブを使用してヒトゲノムDNAおよび網 膜cDNAライブ
ラリーを選択した。ラットBDNFプローブを使用してラッ
トゲノムDNAおよび脳cDNAライブラリーを選抜した。ま
た、ライブラリーを上述の実施例２の（1.1）節で調製
したヒトおよびラットNGFプローブを用いても選抜し
た。
（２）結果および論考 少なくとも670,000プラークが各ライブラリーから選
抜された。陽性ヒトクローン基は、ヒトBDNFプローブと
ハイブリッド形成したが上記のヒトNGFとはハイブリッ
ド形成しなかったものであると考えられた。BDNFゲノム
クローンは、ヒトおよびラットライブラリーの両方から
半数体ゲノム当たり１コピーの、BDNF遺伝子の提示に一
致した頻度で得られた。ラットおよびヒトゲノムライブ
ラリーの両方に関して、約1,000,000個のプラークが選
抜された。３個の陽性物がラットゲノムライブラリーか
ら得られ、そしてヒトゲノムライブラリーからは１個が
得られた。ヒト網膜およびラット脳cDNAライブラリーか
らの陽性クローンは、非常に低いレベルで発現される遺
伝子と一致した頻度で得られた。すなわち、ラット脳cD
NAにおいては670,000中２個の陽性物が同定され、ヒト
網膜cDNAライブラリーにおいては、670,000クローン中
で１つが同定された。ヒト胎児脳から調製された市販cD
NAライブラリーからの670,000のうち陽性クローンは何
ら検出されなかった。ヌクレオチド配列化は、ヒトBDNF
cDNAおよびゲノムクローンについて、上述の実施例２
の（1.2）節で決定されたようにしてヒトおよびラットB
DNFコード領域内からの正確な配列を表す合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて行われた。得られた最長
ヒトcDNAクローンは、約1.6〜1.8kbpの挿入物を有して
おり、そして予想されたように、上述の実施例2.（２）
節に記載の、ヒトゲノムDNAからの直接増幅後に決定さ
れたヒトBDNFの一部分の正確な配列を含有していた。こ
のcDNA（第５図）クローンの詳細な配列分析により、ブ
タBDNFに対する完全な長さの前駆体に類似するが同一で
はない247個のアミノ酸のポリペプチドをコードする読
み取り枠が明らかになった。成熟BDNFポリペプチドに相
当する領域内では（例えばHis134のコドンからチェイン
終止コドンまで）、推定アミノ酸配列の相違は見出され
なかった。すなわち、ブタとヒトとの間の全てのヌクレ
オチド置換がコード特異性に関して保存的であった。推
定BDNF前駆体ポリペプチドの残りはヒトとブタとの間の
いくつかのアミノ酸配列相違を示しており、最も注目さ
れるのはブタに見られる６個の連続するSerコドンのう
ち５個がヒトBDNF遺伝子中に存在せず、若干短いポリペ
プチドを生ずることである（247対252アミノ酸）。
抜された。陽性ヒトクローン基は、ヒトBDNFプローブと
ハイブリッド形成したが上記のヒトNGFとはハイブリッ
ド形成しなかったものであると考えられた。BDNFゲノム
クローンは、ヒトおよびラットライブラリーの両方から
半数体ゲノム当たり１コピーの、BDNF遺伝子の提示に一
致した頻度で得られた。ラットおよびヒトゲノムライブ
ラリーの両方に関して、約1,000,000個のプラークが選
抜された。３個の陽性物がラットゲノムライブラリーか
ら得られ、そしてヒトゲノムライブラリーからは１個が
得られた。ヒト網膜およびラット脳cDNAライブラリーか
らの陽性クローンは、非常に低いレベルで発現される遺
伝子と一致した頻度で得られた。すなわち、ラット脳cD
NAにおいては670,000中２個の陽性物が同定され、ヒト
網膜cDNAライブラリーにおいては、670,000クローン中
で１つが同定された。ヒト胎児脳から調製された市販cD
NAライブラリーからの670,000のうち陽性クローンは何
ら検出されなかった。ヌクレオチド配列化は、ヒトBDNF
cDNAおよびゲノムクローンについて、上述の実施例２
の（1.2）節で決定されたようにしてヒトおよびラットB
DNFコード領域内からの正確な配列を表す合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて行われた。得られた最長
ヒトcDNAクローンは、約1.6〜1.8kbpの挿入物を有して
おり、そして予想されたように、上述の実施例2.（２）
節に記載の、ヒトゲノムDNAからの直接増幅後に決定さ
れたヒトBDNFの一部分の正確な配列を含有していた。こ
のcDNA（第５図）クローンの詳細な配列分析により、ブ
タBDNFに対する完全な長さの前駆体に類似するが同一で
はない247個のアミノ酸のポリペプチドをコードする読
み取り枠が明らかになった。成熟BDNFポリペプチドに相
当する領域内では（例えばHis134のコドンからチェイン
終止コドンまで）、推定アミノ酸配列の相違は見出され
なかった。すなわち、ブタとヒトとの間の全てのヌクレ
オチド置換がコード特異性に関して保存的であった。推
定BDNF前駆体ポリペプチドの残りはヒトとブタとの間の
いくつかのアミノ酸配列相違を示しており、最も注目さ
れるのはブタに見られる６個の連続するSerコドンのう
ち５個がヒトBDNF遺伝子中に存在せず、若干短いポリペ
プチドを生ずることである（247対252アミノ酸）。
ベクターEMBL3において調製されたライブラリーは、
外来DNAの10〜23kbpの挿入物を有する。詳細に分析され
たヒトゲノムBDNFクローンにおける正確な挿入物の寸法
は測定されなかった。しかしながら、このクローンはラ
イブラリーを選抜するのに使用された標識BDNFプローブ
とハイブリッド形成した約4kbpの１個のEcoR I制限エン
ドヌクレアーゼフラグメントを含有していた。このフラ
グメントは、ヒトゲノムDNAの上述のブタBDNFプローブ
とのサザンプロットハイブリダイゼーションに基づいて
予測される寸法である。配列分析はバクテリオファージ
DNA鋳型からのDNA合成を開始させるためのcDNA配列であ
る合成オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトクローンに対
して行われた。推定ヒトBDNF前駆体のコード配列は、第
５図におけるヌクレオチド785におけるバリン（GTC）に
代わるメチオニン（ATG）へのアミノ酸置換に相当す
る、プレプロ領域における１個のヌクレオチド置換を除
けばヒトcDNAクローンにおけるそれと同一であることが
見出された。この変化は、ヒトゲノムの多形現象を反映
するものであろう。ヒトNGFの場合におけるように、推
定ヒトプレプロBDNFのコード配列内には何ら介在配列は
検出されなかった。ラットcDNA配列データも第５図に示
される。
外来DNAの10〜23kbpの挿入物を有する。詳細に分析され
たヒトゲノムBDNFクローンにおける正確な挿入物の寸法
は測定されなかった。しかしながら、このクローンはラ
イブラリーを選抜するのに使用された標識BDNFプローブ
とハイブリッド形成した約4kbpの１個のEcoR I制限エン
ドヌクレアーゼフラグメントを含有していた。このフラ
グメントは、ヒトゲノムDNAの上述のブタBDNFプローブ
とのサザンプロットハイブリダイゼーションに基づいて
予測される寸法である。配列分析はバクテリオファージ
DNA鋳型からのDNA合成を開始させるためのcDNA配列であ
る合成オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトクローンに対
して行われた。推定ヒトBDNF前駆体のコード配列は、第
５図におけるヌクレオチド785におけるバリン（GTC）に
代わるメチオニン（ATG）へのアミノ酸置換に相当す
る、プレプロ領域における１個のヌクレオチド置換を除
けばヒトcDNAクローンにおけるそれと同一であることが
見出された。この変化は、ヒトゲノムの多形現象を反映
するものであろう。ヒトNGFの場合におけるように、推
定ヒトプレプロBDNFのコード配列内には何ら介在配列は
検出されなかった。ラットcDNA配列データも第５図に示
される。
実施例5:組み換えBDNFの発現 （１）材料および方法 （1.1）BDNF発現ベクターの調製 ブタプレプロBDNFに相当する配列は、ブタゲノム鋳型
１μｇを用いるPCR反応にオリゴヌクレオチドプライマ
ー（各150pモル） を使用することによって得られた（各プライマーは添加
Xba I部位を有する）。増幅反応は、アニーリング温度
が50℃である以外は上記の通りであった。Xbalで消化
後、増幅されたDNAを、プラスミドpCMV1のXbal部位に連
結して、pCMV1−pBDNF-1を生成させ（−１は第６図にお
けるセンス方向を示し、そして第Ｖ表におけるCOS＋に
相当する）、そしてプラスミドをエレクトロポレーショ
ンによってXL−１細菌中に導入した。
１μｇを用いるPCR反応にオリゴヌクレオチドプライマ
ー（各150pモル） を使用することによって得られた（各プライマーは添加
Xba I部位を有する）。増幅反応は、アニーリング温度
が50℃である以外は上記の通りであった。Xbalで消化
後、増幅されたDNAを、プラスミドpCMV1のXbal部位に連
結して、pCMV1−pBDNF-1を生成させ（−１は第６図にお
けるセンス方向を示し、そして第Ｖ表におけるCOS＋に
相当する）、そしてプラスミドをエレクトロポレーショ
ンによってXL−１細菌中に導入した。
（1.2）COS細胞におけるBDNFの発現 陽性クローンからのpCMV1−pBDNFプラスミドDNA（オ
リゴ５とのハイブリッド形成により確認，第２図）をXb
a IおよびPst Iの両方で切断した。得られた生成物の寸
法により挿入物の方向を決定でき、そして両プラスミド
を用いて、燐酸カルシウム法（Chenら,1987,Mol.Cell B
iol.7:2745−2752）によりCOS細胞をトランスフェクシ
ョンし、そして増殖培地を24時間後に回収した。BDNF活
性は、上記に詳述したニワトリ胚背根神経節アッセイで
検査した。
リゴ５とのハイブリッド形成により確認，第２図）をXb
a IおよびPst Iの両方で切断した。得られた生成物の寸
法により挿入物の方向を決定でき、そして両プラスミド
を用いて、燐酸カルシウム法（Chenら,1987,Mol.Cell B
iol.7:2745−2752）によりCOS細胞をトランスフェクシ
ョンし、そして増殖培地を24時間後に回収した。BDNF活
性は、上記に詳述したニワトリ胚背根神経節アッセイで
検査した。
（２）結果および論考 E8ニワトリ脊髄感覚性ニューロンを塗布し（１ウェル
当たり6,000）、24時間インキュベートし、そして24時
間後にカウントした（Lindsayら,1985,Develop.Biol.11
2:319−328）。値は、三回の測定の平均±標準偏差であ
る。BDNFおよびNGFは最大生存がどちらの因子でも観察
される1ng/ml濃度で使用された。COS＋は、センス方向
でBDNF挿入物を含有するプラスミドでトランスフェクシ
ョンされた細胞を示し、そしてCOS−は、逆方向でBDNF
挿入物を含有するプラスミドでトランスフェクションさ
れた細胞をさす。COSはトランスフェクションされない
細胞を指す。1:20以上の希釈度で、対照以上の生存はCO
S−馴化培地でもCOS馴化培地でも見出されなかった。NG
Fなしの全ての実験において、モノクローナル抗−NGF抗
体（Korschingら,1988,Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3
513−3616）を１μg/mlで使用した。
当たり6,000）、24時間インキュベートし、そして24時
間後にカウントした（Lindsayら,1985,Develop.Biol.11
2:319−328）。値は、三回の測定の平均±標準偏差であ
る。BDNFおよびNGFは最大生存がどちらの因子でも観察
される1ng/ml濃度で使用された。COS＋は、センス方向
でBDNF挿入物を含有するプラスミドでトランスフェクシ
ョンされた細胞を示し、そしてCOS−は、逆方向でBDNF
挿入物を含有するプラスミドでトランスフェクションさ
れた細胞をさす。COSはトランスフェクションされない
細胞を指す。1:20以上の希釈度で、対照以上の生存はCO
S−馴化培地でもCOS馴化培地でも見出されなかった。NG
Fなしの全ての実験において、モノクローナル抗−NGF抗
体（Korschingら,1988,Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3
513−3616）を１μg/mlで使用した。
第Ｖ表に示される通り、センス方向のpCMV1−pBDNFプ
ラスミドを担持するCOS細胞の培養物から得られた培地
だけが対照値以上のニワトリ感覚性ニューロン生存と関
連した。従って、組み換えBDNFは生物学的に活性であ
る。更に、ブタ脳から単離されたBDNFの添加は組み換え
BDNF単独から生ずる生存レベルを有意に越えず感覚性ニ
ューロンの生存を増大させず、このことは組み換えBDNF
がBDNFレセプターを飽和させうることを示している。ま
た、組み換えBDNFはNGFと一緒に使用された場合にニワ
トリ感覚性ニューロン生存を促進することに対し相加的
または相乗的効果を有することも観察された。
ラスミドを担持するCOS細胞の培養物から得られた培地
だけが対照値以上のニワトリ感覚性ニューロン生存と関
連した。従って、組み換えBDNFは生物学的に活性であ
る。更に、ブタ脳から単離されたBDNFの添加は組み換え
BDNF単独から生ずる生存レベルを有意に越えず感覚性ニ
ューロンの生存を増大させず、このことは組み換えBDNF
がBDNFレセプターを飽和させうることを示している。ま
た、組み換えBDNFはNGFと一緒に使用された場合にニワ
トリ感覚性ニューロン生存を促進することに対し相加的
または相乗的効果を有することも観察された。
実施例6:BDNFに対する抗体の生成 （１）材料および方法 血清４で示されるBDNF特異的ポリクローナル抗血清
は、合成ペプチドでの免疫化によりNZ白ウサギ中に生成
させた。
は、合成ペプチドでの免疫化によりNZ白ウサギ中に生成
させた。
（1.1）ペプチド合成および担体への結合 B5で示される34個のアミノ酸残基からなるペプチドを
慣用の方法で合成した。このものは、所望によりｍ−マ
レイミド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（MB
S）を用いる担体タンパク質への結合ができるように、
アミノ−末端で付加的なシステイン残基を有する（イタ
リックで示す）成熟BDNFの33残基（第１図に示される完
全なブタプレプロBDNF配列）の残基153〜185までに相当
する以下のアミノ酸配列を有している：すなわち B5ペプチドはビスジアゾベンジジン（BDB）を用いて
ウシ血清アルブミン（BSA）に結合させた。新たなBDB
は、ベンジジン−HCl（ｐ−ジアミノジフェニル−HCl,S
igma社製）46mgを0.2N HCl 9.0mlに溶解させることによ
って調製した。NaNO235mgをH2O 1.0ml中に溶解し、そし
てベンジジン溶液に添加し、４℃で１時間撹拌した。BS
A 21mgを0.16M ボレート、0.13M NaCl,pH9.0,の3.0ml中
に溶解した。B5ペプチド約15mgをボレート−NaCl緩衝液
pH0.0、1.5mlに溶解した。このペプチド溶液をBSA溶液
に添加し、そして水中に置いた。BDB1.0mlをBSA−ペプ
チド溶液に添加し、そしてこの反応混合物を撹拌しなが
ら２時間４℃インキュベートした。pHを監視し、そして
必要により少量の0.5M NaOHの添加により9.0の範囲に保
持した。反応は、１％フェノール−緩衝溶液0.2mlの添
加により停止させた。過剰の試薬は、燐酸緩衝食塩水
（PBS）で透析することによって除去した。
慣用の方法で合成した。このものは、所望によりｍ−マ
レイミド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（MB
S）を用いる担体タンパク質への結合ができるように、
アミノ−末端で付加的なシステイン残基を有する（イタ
リックで示す）成熟BDNFの33残基（第１図に示される完
全なブタプレプロBDNF配列）の残基153〜185までに相当
する以下のアミノ酸配列を有している：すなわち B5ペプチドはビスジアゾベンジジン（BDB）を用いて
ウシ血清アルブミン（BSA）に結合させた。新たなBDB
は、ベンジジン−HCl（ｐ−ジアミノジフェニル−HCl,S
igma社製）46mgを0.2N HCl 9.0mlに溶解させることによ
って調製した。NaNO235mgをH2O 1.0ml中に溶解し、そし
てベンジジン溶液に添加し、４℃で１時間撹拌した。BS
A 21mgを0.16M ボレート、0.13M NaCl,pH9.0,の3.0ml中
に溶解した。B5ペプチド約15mgをボレート−NaCl緩衝液
pH0.0、1.5mlに溶解した。このペプチド溶液をBSA溶液
に添加し、そして水中に置いた。BDB1.0mlをBSA−ペプ
チド溶液に添加し、そしてこの反応混合物を撹拌しなが
ら２時間４℃インキュベートした。pHを監視し、そして
必要により少量の0.5M NaOHの添加により9.0の範囲に保
持した。反応は、１％フェノール−緩衝溶液0.2mlの添
加により停止させた。過剰の試薬は、燐酸緩衝食塩水
（PBS）で透析することによって除去した。
（1.2）免 疫 化 総計６匹のウサギを以下のプロトコールに従って免疫
した。
した。
ウサギ１および４−BDBを使用し、Ｃ−末端でBSAに結合
したペプチドB5; ウサギ２および３−MBSを使用し、Ｎ−末端でBSAに結合
したペプチドB5; ウサギ５および６−粉末ニトロセルロースと混合したペ
プチドB5。
したペプチドB5; ウサギ２および３−MBSを使用し、Ｎ−末端でBSAに結合
したペプチドB5; ウサギ５および６−粉末ニトロセルロースと混合したペ
プチドB5。
全ての場合においで、第１回の免疫化にはPBS 0.5ml
プラス完全フロインドアジュバント0.5ml中における免
疫原1mg（ウサギ５および６に関しては100μg B5/500μ
ｇニトロセルロース）を使用した。この混合物を背面で
多重の部位に皮下注射した。第２回の免疫化は３週間後
に行われ、そして不完全フロインドアジュバントを完全
フロインドアジュバントの代わりに使用する以外は第１
回目の免疫化と同じであった。続くブースター投与は４
〜６週間の間隔で行われた。ウサギを免疫化１週間後採
血し、そして抗血清を純粋B5ペプチドへの結合に関して
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ELIS
A）によってルーチンにチェックした。
プラス完全フロインドアジュバント0.5ml中における免
疫原1mg（ウサギ５および６に関しては100μg B5/500μ
ｇニトロセルロース）を使用した。この混合物を背面で
多重の部位に皮下注射した。第２回の免疫化は３週間後
に行われ、そして不完全フロインドアジュバントを完全
フロインドアジュバントの代わりに使用する以外は第１
回目の免疫化と同じであった。続くブースター投与は４
〜６週間の間隔で行われた。ウサギを免疫化１週間後採
血し、そして抗血清を純粋B5ペプチドへの結合に関して
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ELIS
A）によってルーチンにチェックした。
（1.3）BDNFへの抗体結合の検出 H2O中の抗原（B5ペプチド）100μｇをマイクロタイタ
ープレート上のウェルに添加し、そして一夜乾燥させ、
次いでH2Oで簡単に洗浄し、１％ゼラチン100μｇで30分
間室温で遮断した。ウェルを蒸留水で３回洗浄し、次に
抗血清100μｇを添加して４℃で一夜インキュベートし
た。次いでウェルをPBS/0.05％ Triton X−100で３回洗
浄した後、100μｇペルオキシダーゼ標識抗−ウサギイ
ムノアッセイ（1/1000希釈）をウェルに添加し、そして
室温で３時間インキュベートした。ウェルを２回洗浄
し、そしてABTS溶液100μｇ（0.1Mクエン酸Na1pH4.0,10
mlプラス10μg H2O2中に溶解したABTS（Sigma）10mg）
を添加して発色するまで約５分間インキュベートした。
この反応は１％ NaN310μｇの添加によって停止させ
た。サンプルをH2Oで1:5に希釈し、そして光学濃度を41
5nmで測定した。
ープレート上のウェルに添加し、そして一夜乾燥させ、
次いでH2Oで簡単に洗浄し、１％ゼラチン100μｇで30分
間室温で遮断した。ウェルを蒸留水で３回洗浄し、次に
抗血清100μｇを添加して４℃で一夜インキュベートし
た。次いでウェルをPBS/0.05％ Triton X−100で３回洗
浄した後、100μｇペルオキシダーゼ標識抗−ウサギイ
ムノアッセイ（1/1000希釈）をウェルに添加し、そして
室温で３時間インキュベートした。ウェルを２回洗浄
し、そしてABTS溶液100μｇ（0.1Mクエン酸Na1pH4.0,10
mlプラス10μg H2O2中に溶解したABTS（Sigma）10mg）
を添加して発色するまで約５分間インキュベートした。
この反応は１％ NaN310μｇの添加によって停止させ
た。サンプルをH2Oで1:5に希釈し、そして光学濃度を41
5nmで測定した。
（２）結果および論考 ウサギ４からの抗血清（血清４）は最高の力価を示し
（第7a図）、そして引き続く実験に使用された。血清４
からの抗体を硫酸アンモニウムによる沈降によって部分
的に精製した。すなわち、抗血清の一部分に同量の飽和
硫酸アンモニウムを撹拌しながらゆっくりと添加し、そ
して溶液を更に15分間撹拌し、次いで2,000×ｇで遠心
した。ペレットを、50％飽和硫酸アンモニウム中で２回
洗浄し、次いで血清の最初の容量に相当する量のPBS中
に再溶解した。硫酸アンモニウムはPBSを数回交換して
透析した。透析した溶液を1.0ml量ずつに分け、そして
高速真空を用いる凍結乾燥にかけた。血清４抗体のサン
プルをH2O 0.5mlに再懸濁し、そしてELISAによってペプ
チドB5との反応製について試験したところ、1:4000の希
釈度まで反応することが見出された。
（第7a図）、そして引き続く実験に使用された。血清４
からの抗体を硫酸アンモニウムによる沈降によって部分
的に精製した。すなわち、抗血清の一部分に同量の飽和
硫酸アンモニウムを撹拌しながらゆっくりと添加し、そ
して溶液を更に15分間撹拌し、次いで2,000×ｇで遠心
した。ペレットを、50％飽和硫酸アンモニウム中で２回
洗浄し、次いで血清の最初の容量に相当する量のPBS中
に再溶解した。硫酸アンモニウムはPBSを数回交換して
透析した。透析した溶液を1.0ml量ずつに分け、そして
高速真空を用いる凍結乾燥にかけた。血清４抗体のサン
プルをH2O 0.5mlに再懸濁し、そしてELISAによってペプ
チドB5との反応製について試験したところ、1:4000の希
釈度まで反応することが見出された。
ブタBDNFの33アミノ酸フラグメントに相当する合成ペ
プチドに対するポリクローナル抗体は、上記のようにし
てウサギを免疫することによって生成された。合成ペプ
チドに対して最高の力価を示した血清４は、ELISAによ
ればブタ脳からの精製BDNFとの反応性を示した（第7b
図）。イムノブロッティング（データは示されず）によ
っても弱い反応性が検出された。しかしながら、この抗
血清は、ニワトリ胚背根神経節感覚性ニューロンに関す
る生物学的アッセイにおいてBDNFの活性を遮断すること
ができなかった。
プチドに対するポリクローナル抗体は、上記のようにし
てウサギを免疫することによって生成された。合成ペプ
チドに対して最高の力価を示した血清４は、ELISAによ
ればブタ脳からの精製BDNFとの反応性を示した（第7b
図）。イムノブロッティング（データは示されず）によ
っても弱い反応性が検出された。しかしながら、この抗
血清は、ニワトリ胚背根神経節感覚性ニューロンに関す
る生物学的アッセイにおいてBDNFの活性を遮断すること
ができなかった。
実施例7:BDNFの新規生物学的作用 以下の観察は、BDNFが（ｉ）生存を維持し、そしてCN
Sドーパミン作動性ニューロンの完全に分化した状態を
誘導し；（ii）CNSコリン作動性ニューロンの生存を維
持し；そして（iii）大グリア細胞の増殖を抑制できる
ことを示している。これらのBDNFの生物学的作用は今ま
で記載されていない。ドーパミン作動性ニューロン、コ
リン作動性ニューロンおよびに大グリア細胞をそれぞれ
神経学的疾患または障害と関連しうるので、BDNFはこれ
らの細胞集団が関わる神経疾患の治療に有用であること
が判明しよう。
Sドーパミン作動性ニューロンの完全に分化した状態を
誘導し；（ii）CNSコリン作動性ニューロンの生存を維
持し；そして（iii）大グリア細胞の増殖を抑制できる
ことを示している。これらのBDNFの生物学的作用は今ま
で記載されていない。ドーパミン作動性ニューロン、コ
リン作動性ニューロンおよびに大グリア細胞をそれぞれ
神経学的疾患または障害と関連しうるので、BDNFはこれ
らの細胞集団が関わる神経疾患の治療に有用であること
が判明しよう。
（１）材料および方法 （1.1）ドーパミン作動性黒質ニューロンの培養法 胚日令13から15日までのラット胚の脳から腹側中脳を
切断した。代表的には、２を各実験に用いた。切開溶
液を、以下の組成を有していた。すなわちNaCl,136.8m
M,KCl,2.7mM,Na2HPO4・7H2O,8mM,KH2PO4,1.5mM,グルコ
ース,6mg/mlおよびBSA,0.1mg/ml,pH7.4。この溶液を調
製し、続いて0.2μＭ細孔フィルターを通して滅菌し
た。切開は、非−滅菌条件下に行われた。一たん組織が
全ての脳から切断されると、残りの操作は滅菌条件下に
行われた。組織フラグメントを35mm培養皿に入れ、そし
て微細なはさみを用いて細断した。次いで、0.125％ト
リプシンを含有するF12栄養培地2mlを組織に添加しそし
て37℃でインキュベートした。このインキュベーション
期間の最後に、DNアーゼＩを最終濃度が80ng/mlとなる
ようにスラリーに添加した。もう一回同一のインキュベ
ーションを行い、引き続いて組織スラリーを2mMグルタ
ミン、6mg/mlグルコース、５単位/mlペニシリン、5mg/m
lストレプトマイシンおよび7.5％ウシ胎児血清（FCS）
を補添した最少必須培地（MEM）からなる成長培地8.0ml
に添加した。このサンブルを机上遠心機中室温で500rpm
で５分間遠心分離した。培地を吸引し、そして成長培地
2mlを細胞ペレットに添加した。1mmの開口部を有する火
炎磨きしたピペットを使用して細胞を８回粉砕した。残
りの組織フラグメントを重力により沈降させ、そして少
量の上清を取って血球計でカウントすることによって細
胞数を評価した。細胞密度を測定した後、この細胞を5
0,000/cm2の密度で組織培養プレートに塗布した。
切断した。代表的には、２を各実験に用いた。切開溶
液を、以下の組成を有していた。すなわちNaCl,136.8m
M,KCl,2.7mM,Na2HPO4・7H2O,8mM,KH2PO4,1.5mM,グルコ
ース,6mg/mlおよびBSA,0.1mg/ml,pH7.4。この溶液を調
製し、続いて0.2μＭ細孔フィルターを通して滅菌し
た。切開は、非−滅菌条件下に行われた。一たん組織が
全ての脳から切断されると、残りの操作は滅菌条件下に
行われた。組織フラグメントを35mm培養皿に入れ、そし
て微細なはさみを用いて細断した。次いで、0.125％ト
リプシンを含有するF12栄養培地2mlを組織に添加しそし
て37℃でインキュベートした。このインキュベーション
期間の最後に、DNアーゼＩを最終濃度が80ng/mlとなる
ようにスラリーに添加した。もう一回同一のインキュベ
ーションを行い、引き続いて組織スラリーを2mMグルタ
ミン、6mg/mlグルコース、５単位/mlペニシリン、5mg/m
lストレプトマイシンおよび7.5％ウシ胎児血清（FCS）
を補添した最少必須培地（MEM）からなる成長培地8.0ml
に添加した。このサンブルを机上遠心機中室温で500rpm
で５分間遠心分離した。培地を吸引し、そして成長培地
2mlを細胞ペレットに添加した。1mmの開口部を有する火
炎磨きしたピペットを使用して細胞を８回粉砕した。残
りの組織フラグメントを重力により沈降させ、そして少
量の上清を取って血球計でカウントすることによって細
胞数を評価した。細胞密度を測定した後、この細胞を5
0,000/cm2の密度で組織培養プレートに塗布した。
培養プレートは、切開の一日前に調製した。組織プレ
ート（24ウェル,2cm2/ウェル）をポリオルチニン（分子
量30,000〜70,000g/モル）,0.5mg/ml、を用い室温にて
３時間予め被覆した。このプレートをよく水洗し、続い
てマウスラミニン,5μg/ml、を用いて室温で３時間処理
した。次にプレートを上記のごとく水洗し、そして成長
培地の存在下５％ CO2,95％空気からなる湿潤雰囲気下
に一夜37℃でインキュベートした。プレート中の培地を
その翌日除去しそして新たな成長培地と交換した。
ート（24ウェル,2cm2/ウェル）をポリオルチニン（分子
量30,000〜70,000g/モル）,0.5mg/ml、を用い室温にて
３時間予め被覆した。このプレートをよく水洗し、続い
てマウスラミニン,5μg/ml、を用いて室温で３時間処理
した。次にプレートを上記のごとく水洗し、そして成長
培地の存在下５％ CO2,95％空気からなる湿潤雰囲気下
に一夜37℃でインキュベートした。プレート中の培地を
その翌日除去しそして新たな成長培地と交換した。
一たび細胞を培養プレートに塗布すると、細胞を37℃
および５％ CO2/95％空気に設定されたインキュベータ
ー中に24時間置いた。培地を以下の組成すなわち、基礎
イーグル培地（BEM）と、インスリン（25μg/ml）、ト
ランスフェリン（100μg/ml）、プトレッシン（60μg
M）、プロゲステロン（20nM）、セレン酸ナトリウム（3
0nM）、ペニシリン（5U/ml）、ストレプトマイシン（5m
g/ml）およびT3（5nM）を補添したグルコース（33m
M）、グルタミン（2mM）、NaHCO3（15mM）、HEPES（10m
M）を有する栄養混合物Ｆ−12との1:1（容量：容量）混
合物を有する無血清配合物（SFM）に変えた。数例の実
験においては、培養第２日にSFMに培地交換後に精製BDN
Fを培養物に添加した。
および５％ CO2/95％空気に設定されたインキュベータ
ー中に24時間置いた。培地を以下の組成すなわち、基礎
イーグル培地（BEM）と、インスリン（25μg/ml）、ト
ランスフェリン（100μg/ml）、プトレッシン（60μg
M）、プロゲステロン（20nM）、セレン酸ナトリウム（3
0nM）、ペニシリン（5U/ml）、ストレプトマイシン（5m
g/ml）およびT3（5nM）を補添したグルコース（33m
M）、グルタミン（2mM）、NaHCO3（15mM）、HEPES（10m
M）を有する栄養混合物Ｆ−12との1:1（容量：容量）混
合物を有する無血清配合物（SFM）に変えた。数例の実
験においては、培養第２日にSFMに培地交換後に精製BDN
Fを培養物に添加した。
ドーパミン作動性ニューロンの培養に用いられる溶液
は、Milli−Ｑ試薬水系から取った水を用いて調製し
た。組織培養培地配合物はウシ胎児血清（ロット番号43
N1086）およびマウスラミニンと同様にGibco Laborator
ies（Santa Clara,California）から得られた。全ての
その他の培地成分はSigma Chemical（St.Louis,MO）か
ら購入し、そして栽培培養液試験等級であった。ポリオ
ルチニンおよびDNアーゼＩもSigmaから得た。トリプシ
ンは、Worthington（Freehold.NJ），ロット番号3667、
から得られた。市販化学薬品は、分析等級であり、Bake
r Chemical（Phillipsburg,NJ）から購入した。これら
の実験に使用されたBDNFはブタ脳からBarde等1982の方
法に従って、Y.−A Barde博士により精製された。
は、Milli−Ｑ試薬水系から取った水を用いて調製し
た。組織培養培地配合物はウシ胎児血清（ロット番号43
N1086）およびマウスラミニンと同様にGibco Laborator
ies（Santa Clara,California）から得られた。全ての
その他の培地成分はSigma Chemical（St.Louis,MO）か
ら購入し、そして栽培培養液試験等級であった。ポリオ
ルチニンおよびDNアーゼＩもSigmaから得た。トリプシ
ンは、Worthington（Freehold.NJ），ロット番号3667、
から得られた。市販化学薬品は、分析等級であり、Bake
r Chemical（Phillipsburg,NJ）から購入した。これら
の実験に使用されたBDNFはブタ脳からBarde等1982の方
法に従って、Y.−A Barde博士により精製された。
（1.2） 腹側中脳培養物の免疫細胞化学的染色法 固定溶液は各実験につき新たに調製した。チロシンヒ
ドロキシラーゼ（TH）の染色用の固定液は、Sorensonの
リン酸塩緩衝液中の4.0％パラホルムアルデヒドであっ
た。Sorenson緩衝液は、0.2M KH2PO4溶液を0.2M Na2HPO
4の原液にpHが7.3になるまで添加することによって調製
した。次にパラホルムアルデヒドをこの溶液に添加し、
そして短時間加熱してこれを溶解させ、そして使用前ま
で室温に冷却した。
ドロキシラーゼ（TH）の染色用の固定液は、Sorensonの
リン酸塩緩衝液中の4.0％パラホルムアルデヒドであっ
た。Sorenson緩衝液は、0.2M KH2PO4溶液を0.2M Na2HPO
4の原液にpHが7.3になるまで添加することによって調製
した。次にパラホルムアルデヒドをこの溶液に添加し、
そして短時間加熱してこれを溶解させ、そして使用前ま
で室温に冷却した。
操作を開始するには、培養皿から穏やかな吸引によっ
て培地を除去し、そして適切な固定溶液をゆっくりとこ
の皿に添加した。20分間室温でインキュベーションを行
った。次にSorenson燐酸塩緩衝液中で穏やかに回転させ
ながら３回各５分間ずつ洗浄した。次いで細胞を室温で
穏やかに回転させながらクエンチ溶液中で30分間インキ
ュベートした。THに関して染色すべき培養物用のクエン
チ溶液は２％正常ウマ血清を含有するSorensonリン酸塩
緩衝液から構成された。次に、培養物を透過緩衝液中室
温で30分間穏やかに回転させながらインキュベートし
た。この溶液は２％サポニンおよび、THに関して染色す
べき培養物については1.5％の正常ウマ血清を含有するS
orenson緩衝液から成っていた。透過段階に続いて、培
養物を一次抗体の存在下に４℃で一夜インキュベートし
た。ラットTHに対する抗体は、アイソタイプIgG2aのマ
ウスモノクローナル抗体であった。これは10mM NaPO4、
50mM NaCl、0.2％サポニン,pH7.5、からなら溶液中40μ
g/mlで使用された。一次抗体インキュベーションに続い
て培養物を好適な透過緩衝液中で各15分間ずつ５回洗浄
した。次に、培養物を、ビオチニル化ウマ抗−マススIg
Gであるビオチン接合二次抗体とインキュベートした。
このインキュベーションは、室温で穏やかに回転させな
がら２時間行われた。続いて上述と同様の洗浄を行い、
次に培養物を製造者のプロトコルに従って調製されたア
ビジン−ビオチニル化セイヨウワサビペルオキシターゼ
の予め形成された複合体（ABC試薬,Vector Laboratorie
s,Burlingame,CA）の存在下にインキュベートした。穏
やかに回転させながらの室温での30分インキュベーショ
ンの後、培養物を上述のようにして洗浄した。続いて培
養物を0.5mg/mlジアミノベンジジンおよび0.01％過酸化
水素を含有する55mM トリスHCl pH7.3とインキュベー
トした。反応生成物の発色を２〜５分間進行させ、次い
で溶液を除去し、そして培養物を数回氷冷PBSで洗浄し
た。次いで、1cm2当たりの陽性細胞数を確認した。
て培地を除去し、そして適切な固定溶液をゆっくりとこ
の皿に添加した。20分間室温でインキュベーションを行
った。次にSorenson燐酸塩緩衝液中で穏やかに回転させ
ながら３回各５分間ずつ洗浄した。次いで細胞を室温で
穏やかに回転させながらクエンチ溶液中で30分間インキ
ュベートした。THに関して染色すべき培養物用のクエン
チ溶液は２％正常ウマ血清を含有するSorensonリン酸塩
緩衝液から構成された。次に、培養物を透過緩衝液中室
温で30分間穏やかに回転させながらインキュベートし
た。この溶液は２％サポニンおよび、THに関して染色す
べき培養物については1.5％の正常ウマ血清を含有するS
orenson緩衝液から成っていた。透過段階に続いて、培
養物を一次抗体の存在下に４℃で一夜インキュベートし
た。ラットTHに対する抗体は、アイソタイプIgG2aのマ
ウスモノクローナル抗体であった。これは10mM NaPO4、
50mM NaCl、0.2％サポニン,pH7.5、からなら溶液中40μ
g/mlで使用された。一次抗体インキュベーションに続い
て培養物を好適な透過緩衝液中で各15分間ずつ５回洗浄
した。次に、培養物を、ビオチニル化ウマ抗−マススIg
Gであるビオチン接合二次抗体とインキュベートした。
このインキュベーションは、室温で穏やかに回転させな
がら２時間行われた。続いて上述と同様の洗浄を行い、
次に培養物を製造者のプロトコルに従って調製されたア
ビジン−ビオチニル化セイヨウワサビペルオキシターゼ
の予め形成された複合体（ABC試薬,Vector Laboratorie
s,Burlingame,CA）の存在下にインキュベートした。穏
やかに回転させながらの室温での30分インキュベーショ
ンの後、培養物を上述のようにして洗浄した。続いて培
養物を0.5mg/mlジアミノベンジジンおよび0.01％過酸化
水素を含有する55mM トリスHCl pH7.3とインキュベー
トした。反応生成物の発色を２〜５分間進行させ、次い
で溶液を除去し、そして培養物を数回氷冷PBSで洗浄し
た。次いで、1cm2当たりの陽性細胞数を確認した。
パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドはFl
uka Chemicalから得た。正常血清（遮断剤として使
用）、ビオチニル化された、アフィニティー精製抗−免
疫グロブリン、アビジンDHおよびビオチニル化HRP−Ｈ
を含有するベクタステイン（Vectastain）キットはVect
or Laboratoriesから購入した。ジアミノベンジジンはB
RL（Gaithersberg,MD）から得た。
uka Chemicalから得た。正常血清（遮断剤として使
用）、ビオチニル化された、アフィニティー精製抗−免
疫グロブリン、アビジンDHおよびビオチニル化HRP−Ｈ
を含有するベクタステイン（Vectastain）キットはVect
or Laboratoriesから購入した。ジアミノベンジジンはB
RL（Gaithersberg,MD）から得た。
（1.3）腹側中脳培養物における3H−ドーパミン取込み
の測定に用いられる方法 3H−ドーパミン（3H−DA）取込みは若干の変更を加え
Dal Toso等（1988,J.Neurosci.8:733−745）に記載され
るようにして実施した。取込み緩衝液は以下の組成すな
わち、NaCl 136.8mM、KCl,2.7mM、Na2HPO4・7H2O,0.8m
M、KH2PO4,1.5mM、グルコース,5.0mM、CaCl2,1.0mM、Mg
SO4,1.0mM、アスコルビン酸,0.1mM、パルジリン,0.1mM,
pH7.4を有していた。必要な場合は5.0μＭベンズトロピ
ンメシレート（BZT）を上記取込み緩衝液に添加した。
の測定に用いられる方法 3H−ドーパミン（3H−DA）取込みは若干の変更を加え
Dal Toso等（1988,J.Neurosci.8:733−745）に記載され
るようにして実施した。取込み緩衝液は以下の組成すな
わち、NaCl 136.8mM、KCl,2.7mM、Na2HPO4・7H2O,0.8m
M、KH2PO4,1.5mM、グルコース,5.0mM、CaCl2,1.0mM、Mg
SO4,1.0mM、アスコルビン酸,0.1mM、パルジリン,0.1mM,
pH7.4を有していた。必要な場合は5.0μＭベンズトロピ
ンメシレート（BZT）を上記取込み緩衝液に添加した。
細胞を予め加温（37℃）した取込み緩衝液で１回洗浄
しそして0.4ml取込み緩衝液/2cm2ウェルで置き替えた。
培養物を37℃で５分間プレインキュベートした。プレイ
ンキュベーションの終了時に、取込み緩衝液中の3H−DA
0.1ml（250nM,40Ci/mモル）を緩衝液中の最終3H−DA濃
度が50nMとなるように添加した。培養物を37℃で15分間
インキュベートし、続いて取込み緩衝液0.5mlずつを用
いて４℃で４回洗浄した。氷冷PBS（10mM NaPO4,150mM
NaCl,pH7.6）による２回の洗浄もさらに行った。最終の
洗浄の完了後、0.5N NaOH 0.21ml/2cm2ウェルを細胞に
添加し、そして室温で２時間放置した。次にNaOH抽出物
を回収し、そして「ultimagold」シンチレーション液を
用いてシンチレーションカウンター（Packard,LS 500T
D）でカウントした。特異的取込みは、５μM BZTの存在
下においては見られない取込みと定義された。代表的に
は、これは観察された全取込みの70〜90％であった。
しそして0.4ml取込み緩衝液/2cm2ウェルで置き替えた。
培養物を37℃で５分間プレインキュベートした。プレイ
ンキュベーションの終了時に、取込み緩衝液中の3H−DA
0.1ml（250nM,40Ci/mモル）を緩衝液中の最終3H−DA濃
度が50nMとなるように添加した。培養物を37℃で15分間
インキュベートし、続いて取込み緩衝液0.5mlずつを用
いて４℃で４回洗浄した。氷冷PBS（10mM NaPO4,150mM
NaCl,pH7.6）による２回の洗浄もさらに行った。最終の
洗浄の完了後、0.5N NaOH 0.21ml/2cm2ウェルを細胞に
添加し、そして室温で２時間放置した。次にNaOH抽出物
を回収し、そして「ultimagold」シンチレーション液を
用いてシンチレーションカウンター（Packard,LS 500T
D）でカウントした。特異的取込みは、５μM BZTの存在
下においては見られない取込みと定義された。代表的に
は、これは観察された全取込みの70〜90％であった。
3H−DAはNEN（Boston,MA）から得た。アスコルベー
ト、パルジリン、BZTおよびグルコースはSigma（St.Lou
is,MO）から得た。ultimagoldシンチレーション液はPac
kard（Sterling,VA）から購入した。
ト、パルジリン、BZTおよびグルコースはSigma（St.Lou
is,MO）から得た。ultimagoldシンチレーション液はPac
kard（Sterling,VA）から購入した。
（1.4）基底前脳コリン作動性ニューロンの培養物の調
製法 基底前脳コリン作動性細胞の一次培養物は胚日令17日
のラットから調製した。詳細には、この研究に使用され
るコリン作動性ニューロンは内側中隔核およびブローカ
（Broca）の対角線バンドの核に由来した。このニュー
ロン集団は主として海馬に突起している。解離された混
合培養物（ニューロンおよびグリア）は以下の方法で調
製した。中隔領域を周囲組織を含まないように切り離
し、そして胎児脳からとり出した。次いでこの組織片を
プールし、鋏で細断しそして125％トリプシンで37℃で2
0分間処理した。トリプシンを、塗布培地（１％ペニシ
リンおよびストレプトマイシン、５％ウマ血清および１
％ N3を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DME
M）、ホルモン補添）中への希釈により不活性化した。
単離細胞懸濁液は消化された組織フラグメントを火炎磨
きパスツールピペットで粉砕することにより調製した。
解離細胞を血球計でカウントし、そして好適な密度で塗
布培地中に塗布した。試験リガンドを塗布５〜６時間後
に培養物に添加し、次いで３日毎に培地交換を行いなが
ら細胞を10日間インビトロ成長させた。
製法 基底前脳コリン作動性細胞の一次培養物は胚日令17日
のラットから調製した。詳細には、この研究に使用され
るコリン作動性ニューロンは内側中隔核およびブローカ
（Broca）の対角線バンドの核に由来した。このニュー
ロン集団は主として海馬に突起している。解離された混
合培養物（ニューロンおよびグリア）は以下の方法で調
製した。中隔領域を周囲組織を含まないように切り離
し、そして胎児脳からとり出した。次いでこの組織片を
プールし、鋏で細断しそして125％トリプシンで37℃で2
0分間処理した。トリプシンを、塗布培地（１％ペニシ
リンおよびストレプトマイシン、５％ウマ血清および１
％ N3を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DME
M）、ホルモン補添）中への希釈により不活性化した。
単離細胞懸濁液は消化された組織フラグメントを火炎磨
きパスツールピペットで粉砕することにより調製した。
解離細胞を血球計でカウントし、そして好適な密度で塗
布培地中に塗布した。試験リガンドを塗布５〜６時間後
に培養物に添加し、次いで３日毎に培地交換を行いなが
ら細胞を10日間インビトロ成長させた。
（1.5）コリンアセチルトランスフェラーゼアッセイ 処理期間に続いて、細胞をコリンアセチルトランスフ
ェラーゼ（CAT）酵素アッセイに使用するかあるいは下
記のプロトコルに従ってCATに関する免疫組織化学的染
色のために処理した。CATに対するモノクローナル抗体
はBoehringer Mannheim Biochemical Co.から購入し、
このものは他の場所で特徴付けされている。実験期間の
終了の時に細胞をDMEMで２回すすいだ。培養物を二段階
法によって固定した。すなわち、４％パラホルムアルデ
ヒド50μをDMEM 50μに加えて10分間インキュベー
ションした。この溶液を除去し、そして４％パラホルム
アルデヒド100μで置換しそしてインキュベーション
を30分間室温で続けた。固定化に続いて細胞を燐酸緩衝
食塩水（PBS）で３回すすぎそしてサポニン（0.5mg/m
l）と30分間インキュベーションすることにより透過性
化した。界面活性剤はをPBSによる３回の洗浄により除
去し、そして５％正常ウサギ血清の遮断溶液を30分間添
加した。遮断溶液の除去に続いて１％正常ウサギ血清中
1:3の希釈度で一次抗体を添加し、そして培養物を４℃
で一夜インキュベートした。一次抗体を含有する溶液を
PBS洗浄により除去した。結合された免疫グロブリンはV
ectastain“ABC"法により検出した。ジアミノベンジジ
ン四塩酸塩（DAB）を通常１〜５分間行われるペルオキ
シダーゼ反応用の基質として使用した。この反応は培養
物を0.1MトリスHCl pH7.2で２回すすぐことにより停止
させた。培養物は0.15M NaCl,42％グリセロールおよび
0.15％ Zephiran（Pierce Chemical Co.,Rockville,I
L）を含有する50mMトリス,pH7.6中で４℃で保存した。
ェラーゼ（CAT）酵素アッセイに使用するかあるいは下
記のプロトコルに従ってCATに関する免疫組織化学的染
色のために処理した。CATに対するモノクローナル抗体
はBoehringer Mannheim Biochemical Co.から購入し、
このものは他の場所で特徴付けされている。実験期間の
終了の時に細胞をDMEMで２回すすいだ。培養物を二段階
法によって固定した。すなわち、４％パラホルムアルデ
ヒド50μをDMEM 50μに加えて10分間インキュベー
ションした。この溶液を除去し、そして４％パラホルム
アルデヒド100μで置換しそしてインキュベーション
を30分間室温で続けた。固定化に続いて細胞を燐酸緩衝
食塩水（PBS）で３回すすぎそしてサポニン（0.5mg/m
l）と30分間インキュベーションすることにより透過性
化した。界面活性剤はをPBSによる３回の洗浄により除
去し、そして５％正常ウサギ血清の遮断溶液を30分間添
加した。遮断溶液の除去に続いて１％正常ウサギ血清中
1:3の希釈度で一次抗体を添加し、そして培養物を４℃
で一夜インキュベートした。一次抗体を含有する溶液を
PBS洗浄により除去した。結合された免疫グロブリンはV
ectastain“ABC"法により検出した。ジアミノベンジジ
ン四塩酸塩（DAB）を通常１〜５分間行われるペルオキ
シダーゼ反応用の基質として使用した。この反応は培養
物を0.1MトリスHCl pH7.2で２回すすぐことにより停止
させた。培養物は0.15M NaCl,42％グリセロールおよび
0.15％ Zephiran（Pierce Chemical Co.,Rockville,I
L）を含有する50mMトリス,pH7.6中で４℃で保存した。
（1.6）精製大グリア細胞培養物を生成させる方法 精製グリア培養物は、基本的にMcCarthyおよびDeVell
is（McCarthy K.D.and DeVellis,J.,1980,J.Cell.Biol.
85:890−902）の方法により出生１〜２日後のラット海
馬から調製した。海馬を５匹の子ラットからとり出しそ
して鋏で細断した。次いで組織片を0.125％トリプシン2
ml中20分間37℃で消化した。このプロテアーゼは塗布培
地（10％ウシ胎児血清 Gibco,DMEM,0.5％ ペニシリン
（5000mcg/ml）および0.5％グルタミン）で希釈するこ
とにより不活性化した。単離細胞懸濁液は、消化された
組織フラグメントを狭窄したパスツールピペットに通す
ことによって調製した。この細胞を900rpmで５分間遠心
することによってペレット化し、塗布培地中に再懸濁さ
せ、そして血球計でカウントした。単離細胞懸濁液を３
個の75cm2組織培養フラスコに分け、そいて細胞を集密
の約80％まで増殖させた。次いで細胞を上記と同様なト
リプシン処理プロトコルに従ってサブ培養した。グリア
細胞をカウントし、そして10,000細胞/0.9cm2の密度で
塗布した。
is（McCarthy K.D.and DeVellis,J.,1980,J.Cell.Biol.
85:890−902）の方法により出生１〜２日後のラット海
馬から調製した。海馬を５匹の子ラットからとり出しそ
して鋏で細断した。次いで組織片を0.125％トリプシン2
ml中20分間37℃で消化した。このプロテアーゼは塗布培
地（10％ウシ胎児血清 Gibco,DMEM,0.5％ ペニシリン
（5000mcg/ml）および0.5％グルタミン）で希釈するこ
とにより不活性化した。単離細胞懸濁液は、消化された
組織フラグメントを狭窄したパスツールピペットに通す
ことによって調製した。この細胞を900rpmで５分間遠心
することによってペレット化し、塗布培地中に再懸濁さ
せ、そして血球計でカウントした。単離細胞懸濁液を３
個の75cm2組織培養フラスコに分け、そいて細胞を集密
の約80％まで増殖させた。次いで細胞を上記と同様なト
リプシン処理プロトコルに従ってサブ培養した。グリア
細胞をカウントし、そして10,000細胞/0.9cm2の密度で
塗布した。
（２）結果 （2.1）腹側中脳培養物に存在するチロシンヒドロキシ
ラーゼに及ぼすBDNFの効果 上述の（2.1）節に記載された免疫細胞化学的染色を
用いてチロシンヒドロキシラーゼ（TH）陽性細胞の数に
及ぼすBDNFの効果を測定した（第８図）。対照の200パ
ーセント以上の最大増加がBDNF刺激された腹側中脳細胞
培養物中で第８日までに観察された。BDNF刺激培養物に
おいては早くも培養第３日目に非常にわずかな増加が観
察された。
ラーゼに及ぼすBDNFの効果 上述の（2.1）節に記載された免疫細胞化学的染色を
用いてチロシンヒドロキシラーゼ（TH）陽性細胞の数に
及ぼすBDNFの効果を測定した（第８図）。対照の200パ
ーセント以上の最大増加がBDNF刺激された腹側中脳細胞
培養物中で第８日までに観察された。BDNF刺激培養物に
おいては早くも培養第３日目に非常にわずかな増加が観
察された。
（2.2）腹側中脳培養物によるドーパミン取込みに及ぼ
すBDNFの効果 3H−ドーパミン（3H−DA）取込みを上記の（1.3）節
に記載されるようにして、若干の変更を加えたDal Taso
等（1988,J.Neurosci.8:733−745）の方法に従って測定
した。培養第８日目までにドーパミン取込みの若干の増
加がBDNF刺激腹側中脳培養物中において観察された（第
９図）。
すBDNFの効果 3H−ドーパミン（3H−DA）取込みを上記の（1.3）節
に記載されるようにして、若干の変更を加えたDal Taso
等（1988,J.Neurosci.8:733−745）の方法に従って測定
した。培養第８日目までにドーパミン取込みの若干の増
加がBDNF刺激腹側中脳培養物中において観察された（第
９図）。
（2.3）前脳コリン作動性ニューロンによるコリンアセ
チルトランスフェラーゼ発現に及ぼすBDNFの効果 第10図（ａ）は、インビトロで12日間の成長期間に続
くCAT陽性細胞の数に及ぼすBDNFの効果を示す。CAT細胞
数の5.9倍の増加がBDNF 100ng/mlの添加により観察さ
れ、一方EC50は10ng/mlと計算された。陽性対照とし
て、１ウェル当たり260,000（黒棒）または150,000（斜
線棒）細胞における培養物を、NGF（第10b図）における
と同じ方法で処理した。１ウェル当たり260,000個の細
胞密度は、BDNF調査に使用されたそれに相当する。この
CAT免疫陽性細胞数増加は先に報告されたものと同様で
ある。コリン作動性ニューロンに作用するBDNFの動力も
CAT酵素活性を測定することにより検べられた（F.Fonnu
m;J.Neurochemistry,1975,24:407−409）。第11図はBDN
F処理により生ずるCATの変化を示す。この場合BDNF100n
g/mlで1.8倍の増加が達成され、そしてEC50は61ng/mlと
計算された。
チルトランスフェラーゼ発現に及ぼすBDNFの効果 第10図（ａ）は、インビトロで12日間の成長期間に続
くCAT陽性細胞の数に及ぼすBDNFの効果を示す。CAT細胞
数の5.9倍の増加がBDNF 100ng/mlの添加により観察さ
れ、一方EC50は10ng/mlと計算された。陽性対照とし
て、１ウェル当たり260,000（黒棒）または150,000（斜
線棒）細胞における培養物を、NGF（第10b図）における
と同じ方法で処理した。１ウェル当たり260,000個の細
胞密度は、BDNF調査に使用されたそれに相当する。この
CAT免疫陽性細胞数増加は先に報告されたものと同様で
ある。コリン作動性ニューロンに作用するBDNFの動力も
CAT酵素活性を測定することにより検べられた（F.Fonnu
m;J.Neurochemistry,1975,24:407−409）。第11図はBDN
F処理により生ずるCATの変化を示す。この場合BDNF100n
g/mlで1.8倍の増加が達成され、そしてEC50は61ng/mlと
計算された。
（2.4）大グリア細胞培養物に及ぼすBDNFまたはEGFの効
果 II型星状細胞は種々の神経伝達物質および神経ペプチ
ドに対する高いアフィニティレセプターを有することが
示されている。従って星状細胞はニューロン由来シグナ
ルに応答できる。このため、そしてII型星状細胞が一次
培養物における細胞成分であるので、グリア細胞に対す
るBDNFのあり得る直接的効果を試験した。細胞は４日間
インビトロで保持し、次に成長因子を添加して集密の約
60％まで到達させ、次いで42時間EGFまたはBDNFで処理
した。インキュベーションの最後の18時間、［3H］メチ
ルチミジンを培地に存在させた。EGFの効果を第12図
（ａ）に示す。先に報告されている通り、EGFは星状細
胞に対して分裂促進性であることが判明した。最大応答
はEGF 10ng/mlで観察され、これは［3H］メチルチミジ
ン取込みの5.2倍増加をもたらした。第12図（ｂ）は、
［3H］メチルチミジン取込みに及ぼすBDNFの効果を示
す。BDNFに対する応答は二相性であると思われる。すな
わち、非常に低い用量（0.1ng/ml）ではチミジン取込み
に若干の増加をもたらし、一方1ng/ml BDNFを越える用
量では［3H］メチルチミジン取込みが阻害された。5ng/
mlの用量ではBDNFは24％の阻害を生じ、このことは処理
期間をこえるグリア細胞増殖速度の減少を示唆してい
る。
果 II型星状細胞は種々の神経伝達物質および神経ペプチ
ドに対する高いアフィニティレセプターを有することが
示されている。従って星状細胞はニューロン由来シグナ
ルに応答できる。このため、そしてII型星状細胞が一次
培養物における細胞成分であるので、グリア細胞に対す
るBDNFのあり得る直接的効果を試験した。細胞は４日間
インビトロで保持し、次に成長因子を添加して集密の約
60％まで到達させ、次いで42時間EGFまたはBDNFで処理
した。インキュベーションの最後の18時間、［3H］メチ
ルチミジンを培地に存在させた。EGFの効果を第12図
（ａ）に示す。先に報告されている通り、EGFは星状細
胞に対して分裂促進性であることが判明した。最大応答
はEGF 10ng/mlで観察され、これは［3H］メチルチミジ
ン取込みの5.2倍増加をもたらした。第12図（ｂ）は、
［3H］メチルチミジン取込みに及ぼすBDNFの効果を示
す。BDNFに対する応答は二相性であると思われる。すな
わち、非常に低い用量（0.1ng/ml）ではチミジン取込み
に若干の増加をもたらし、一方1ng/ml BDNFを越える用
量では［3H］メチルチミジン取込みが阻害された。5ng/
mlの用量ではBDNFは24％の阻害を生じ、このことは処理
期間をこえるグリア細胞増殖速度の減少を示唆してい
る。
（３）論考 これらのインビトロ実験は、胚ラット中脳由来のこれ
らニューロン培養物におけるチロシンヒドロキシラーゼ
染色およびドーパミン取込みによって示される通り、BD
NFが生存を維持するかあるいは発達中のラット黒質のド
ーパミン作動性ニューロンの完全な分化状態を誘導する
ことを明らかに示している。これらはパーキンソン病に
おいて変性するニューロンであるので、BDNFがニューロ
ンの損失を低減させることによるかあるいはチロシンヒ
ドロキシラーゼのレベル（ドーパミン合成における律速
酵素）を高めることによるかあるいはその両方によって
パーキンソン病に治療効果を有する可能性が高い。
らニューロン培養物におけるチロシンヒドロキシラーゼ
染色およびドーパミン取込みによって示される通り、BD
NFが生存を維持するかあるいは発達中のラット黒質のド
ーパミン作動性ニューロンの完全な分化状態を誘導する
ことを明らかに示している。これらはパーキンソン病に
おいて変性するニューロンであるので、BDNFがニューロ
ンの損失を低減させることによるかあるいはチロシンヒ
ドロキシラーゼのレベル（ドーパミン合成における律速
酵素）を高めることによるかあるいはその両方によって
パーキンソン病に治療効果を有する可能性が高い。
更に、神経成長（NGF）と同様に、コリンアセチルト
ランスフェラーゼ（CAT）染色の増大、CAT活性増大およ
びラット胚内側中隔核およびブローカーの対角線バンド
核の培養物におけるアセチルコリンエステラーゼ染色増
大によって示される通り、BDNFはラット基底前脳のコリ
ン作動性ニューロンの生存に効果を有すると思われる。
従って、BDNFは単独であるいはNGFと組み合わせて、基
底前脳のコリン作動性ニューロンに影響する疾患または
障害、例えばアルツハイマー病の治療に有用であり得
る。
ランスフェラーゼ（CAT）染色の増大、CAT活性増大およ
びラット胚内側中隔核およびブローカーの対角線バンド
核の培養物におけるアセチルコリンエステラーゼ染色増
大によって示される通り、BDNFはラット基底前脳のコリ
ン作動性ニューロンの生存に効果を有すると思われる。
従って、BDNFは単独であるいはNGFと組み合わせて、基
底前脳のコリン作動性ニューロンに影響する疾患または
障害、例えばアルツハイマー病の治療に有用であり得
る。
実施例8:BDNF/NGF遺伝子ファミリーにおける新規遺伝子
の同定 NGFとBDNFとの間のアミノ酸配列セグメントの保存に
基づく（ボックス１〜4:前記（８）節を参照のこと）縮
重オリゴヌクレオチドとのPCRを用いることによりBDNF/
NGF遺伝子ファミリーの新規メンバーを同定する方法
は、先ずかかるプライマー対が数種のゲノムDNAからのN
GFおよびBDNF遺伝子配列の両方を増幅させるのに使用で
きるか否か判定することにより試験した。次いで、この
方法を使用して前記全４ボックスの相同性においてNGF
およびBDNFと相同性を共有する新規遺伝子を同定した。
の同定 NGFとBDNFとの間のアミノ酸配列セグメントの保存に
基づく（ボックス１〜4:前記（８）節を参照のこと）縮
重オリゴヌクレオチドとのPCRを用いることによりBDNF/
NGF遺伝子ファミリーの新規メンバーを同定する方法
は、先ずかかるプライマー対が数種のゲノムDNAからのN
GFおよびBDNF遺伝子配列の両方を増幅させるのに使用で
きるか否か判定することにより試験した。次いで、この
方法を使用して前記全４ボックスの相同性においてNGF
およびBDNFと相同性を共有する新規遺伝子を同定した。
（１）材料および方法 （1.1）ポリメラーゼ連鎖反応 PCRは、実質的に前記実施例１に記載されるようにし
て実施した。
て実施した。
（２）結果 （2.1）ゲノムDNAからのNGFおよびBDNFの両配列の増幅 NGFおよびBDNFの間のアミノ酸配列保存のボックス１
およびボックス２の部分に相当する縮重合成オリゴヌク
レオチドプライマーを合成し（上述の（８）節を参照の
こと）、そしてラットゲノム遺伝子とのPCR反応に鋳型
として用いた。正確なプライマー配列は以下の通りであ
る（オリゴヌクレオチド合成段階に包含された２個また
はそれ以上の塩基の混合物を用いる縮重の位置を括弧内
に示す；下線つき部分は、続く配列クローニング段階に
おけるベクターへの連結を促進するために付与された多
重制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有する末尾を示
す;A＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チ
ミイン、Ｎ＝A,G,C,Tの混合物である。）： 各縮重プライマー混合物300ngをPCR用の標準反応混合
物100μ中のラットゲノムDNA 500ngに添加した。それ
ぞれ94℃で１分、43℃で２分そして72℃で２分のインキ
ュベーションからなるサイクルを35回行った。これらの
プライマーを使用したBDNFまたはNGF遺伝子のいずれか
のPCR増幅の生成物の予測サイズは、引き続くクローニ
ング段階にとっての便宜上包含される２個の17マー「末
尾」（下線部分）を含め175塩基対であろう。８％ポリ
アクリルアミド/5％グリセロールゲル上での反応混合物
の電気泳動により予測されたサイズ,175bpを有する増幅
されたDNAの主要バンドが得られた。
およびボックス２の部分に相当する縮重合成オリゴヌク
レオチドプライマーを合成し（上述の（８）節を参照の
こと）、そしてラットゲノム遺伝子とのPCR反応に鋳型
として用いた。正確なプライマー配列は以下の通りであ
る（オリゴヌクレオチド合成段階に包含された２個また
はそれ以上の塩基の混合物を用いる縮重の位置を括弧内
に示す；下線つき部分は、続く配列クローニング段階に
おけるベクターへの連結を促進するために付与された多
重制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有する末尾を示
す;A＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チ
ミイン、Ｎ＝A,G,C,Tの混合物である。）： 各縮重プライマー混合物300ngをPCR用の標準反応混合
物100μ中のラットゲノムDNA 500ngに添加した。それ
ぞれ94℃で１分、43℃で２分そして72℃で２分のインキ
ュベーションからなるサイクルを35回行った。これらの
プライマーを使用したBDNFまたはNGF遺伝子のいずれか
のPCR増幅の生成物の予測サイズは、引き続くクローニ
ング段階にとっての便宜上包含される２個の17マー「末
尾」（下線部分）を含め175塩基対であろう。８％ポリ
アクリルアミド/5％グリセロールゲル上での反応混合物
の電気泳動により予測されたサイズ,175bpを有する増幅
されたDNAの主要バンドが得られた。
（2.2）種々の種のゲノムDNAにおけるBDNF/NGFプローブ
に相補性の配列の検出 175bpバンドを、電気泳動による溶離によりアクリル
アミドゲルからとり出し、そしてdGTP、dATPおよびTTP
の濃度を各々50μＭに低減させ、アルファー32P−dCTP
トレーサーを未標識dCTPの代わりに用いる以外は第１
回目と同一反応条件下に７サイクルの第２回目のPCR反
応で更に増幅させた。放射性標識DNA生成物をサイジン
グカラムでのクロマトグラフィーにより反応成分から分
離した。次いで、「R1B/2C」で表示されるこのプローブ
（プライマー1Bおよび2Cから増幅されたラットDNAに関
する）を第13図に示されるように、EcoR I制限エンドヌ
クレアーゼによる消化およびEcoR I−消化ゲノムDNAに
対するサザンハイブリッド形成法によってニトロセルロ
ースへのブロッティングの後に、種々の脊椎動物種のゲ
ノムDNAにおける相補性配列を検出するのに用いた（ラ
ット、マウスおよびニワトリでの結果を第13図に示
す）。
に相補性の配列の検出 175bpバンドを、電気泳動による溶離によりアクリル
アミドゲルからとり出し、そしてdGTP、dATPおよびTTP
の濃度を各々50μＭに低減させ、アルファー32P−dCTP
トレーサーを未標識dCTPの代わりに用いる以外は第１
回目と同一反応条件下に７サイクルの第２回目のPCR反
応で更に増幅させた。放射性標識DNA生成物をサイジン
グカラムでのクロマトグラフィーにより反応成分から分
離した。次いで、「R1B/2C」で表示されるこのプローブ
（プライマー1Bおよび2Cから増幅されたラットDNAに関
する）を第13図に示されるように、EcoR I制限エンドヌ
クレアーゼによる消化およびEcoR I−消化ゲノムDNAに
対するサザンハイブリッド形成法によってニトロセルロ
ースへのブロッティングの後に、種々の脊椎動物種のゲ
ノムDNAにおける相補性配列を検出するのに用いた（ラ
ット、マウスおよびニワトリでの結果を第13図に示
す）。
NGFおよびBDNF配列を含有するゲノムDNAのEcoR I フ
ラグメントのサイズは、クローン化遺伝子からのPCRに
より調製された放射性標識ヒトNGFおよびBDNFプローブ
を使用して並行プロットでの対照中で測定した。NGFお
よびBDNFゲノムEcoR Iフラグメントの位置をそれぞれＮ
およびＢとして第13図に示す。同様の分析の結果を、第
３図に示し、そして第３図に示されるブタBDNFプローブ
を用いるのと同じ結果がヒトBDNFプローブを用いても得
られた。上記の通り、NGFおよびBDNFプローブはそれぞ
れ種々の脊椎動物ゲノムDNAにおける１個のEcoR Iフラ
グメントとハイブリッド形成した。例えば、ラットDNA
においては、BDNFプローブは約8.8kbのバンドを検出
し、一方NGFプローブは約10.4kbのバンドを検出した。
ラグメントのサイズは、クローン化遺伝子からのPCRに
より調製された放射性標識ヒトNGFおよびBDNFプローブ
を使用して並行プロットでの対照中で測定した。NGFお
よびBDNFゲノムEcoR Iフラグメントの位置をそれぞれＮ
およびＢとして第13図に示す。同様の分析の結果を、第
３図に示し、そして第３図に示されるブタBDNFプローブ
を用いるのと同じ結果がヒトBDNFプローブを用いても得
られた。上記の通り、NGFおよびBDNFプローブはそれぞ
れ種々の脊椎動物ゲノムDNAにおける１個のEcoR Iフラ
グメントとハイブリッド形成した。例えば、ラットDNA
においては、BDNFプローブは約8.8kbのバンドを検出
し、一方NGFプローブは約10.4kbのバンドを検出した。
第13図に示される通り、試験された全ての種において
（ニワトリ、マウスおよびラットに関してデータを示
す）R1B/2Cプローブは、NGFプローブによって同定され
たものと識別できないDNAバンドと、並びにBDNFプロー
ブによって同定されたものと識別できないバンドとハイ
ブリッド形成した（マウスでは、NGFおよびゲノムEcoR
Iフラグメントは約11.5〜12.0kbに相当する同一電気泳
動移動度を有する）。これは、縮重オリゴヌクレオチド
プライマー1Bおよび2CがNGFおよびBDNF両遺伝子からの
配列を増幅させるのに使用し得ることを示している。数
例においては付加的なバンドが、R1B/2Cプローブとハイ
ブリッド形成したゲノムサザンプロットにおいて観察さ
れたことは注目すべきことである。例えばEcoR I−消化
マウスゲノムDNAにおいては、NGFおよびBDNFのいずれに
も相当しない少なくとも２個の付加的なバンド（それぞ
れ約19.0kbおよび1.5kbの標識X1およびX2）が観察され
た。同様にして、少なくとも２個の付加的なバンドがラ
ットDNAへのハイブリッド形成において観察され（それ
ぞれ約7.3kbおよび1.2kbのX1およびX2）、そしてニワト
リDNAにおいて少なくとも１個が観察された（約2.6kbの
Ｘ）。この図面では明らかに標識されていない付加的な
バンドも数例において観察された。NGFにもBDNFにも起
因しないバンドの存在は、遺伝子ファミリーの付加的な
メンバーの存在の可能性を示唆している。同様にして、
BDNFおよびNGF遺伝子配列を含有することが知られてい
るものと明らかに相違するバンドがプライマー対および
ゲノムDNA鋳型の他の組合せを用いた場合に見られた
（データ示さず）。
（ニワトリ、マウスおよびラットに関してデータを示
す）R1B/2Cプローブは、NGFプローブによって同定され
たものと識別できないDNAバンドと、並びにBDNFプロー
ブによって同定されたものと識別できないバンドとハイ
ブリッド形成した（マウスでは、NGFおよびゲノムEcoR
Iフラグメントは約11.5〜12.0kbに相当する同一電気泳
動移動度を有する）。これは、縮重オリゴヌクレオチド
プライマー1Bおよび2CがNGFおよびBDNF両遺伝子からの
配列を増幅させるのに使用し得ることを示している。数
例においては付加的なバンドが、R1B/2Cプローブとハイ
ブリッド形成したゲノムサザンプロットにおいて観察さ
れたことは注目すべきことである。例えばEcoR I−消化
マウスゲノムDNAにおいては、NGFおよびBDNFのいずれに
も相当しない少なくとも２個の付加的なバンド（それぞ
れ約19.0kbおよび1.5kbの標識X1およびX2）が観察され
た。同様にして、少なくとも２個の付加的なバンドがラ
ットDNAへのハイブリッド形成において観察され（それ
ぞれ約7.3kbおよび1.2kbのX1およびX2）、そしてニワト
リDNAにおいて少なくとも１個が観察された（約2.6kbの
Ｘ）。この図面では明らかに標識されていない付加的な
バンドも数例において観察された。NGFにもBDNFにも起
因しないバンドの存在は、遺伝子ファミリーの付加的な
メンバーの存在の可能性を示唆している。同様にして、
BDNFおよびNGF遺伝子配列を含有することが知られてい
るものと明らかに相違するバンドがプライマー対および
ゲノムDNA鋳型の他の組合せを用いた場合に見られた
（データ示さず）。
（2.3）BDNFおよびNGFに関連する新規遺伝子の同定 BDNFおよびNGFに関連する新規遺伝子が縮重オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いるPCRによって同定され得
るという仮説の詳細な試験を、ボックス３およびボック
ス４に関するプライマー（上記（８）節を参照のこと）
および鋳型としてのマウスゲノムDNAを使用して実施し
た。以下の配列を有する縮重プライマーが合成された。
クレオチドプライマーを用いるPCRによって同定され得
るという仮説の詳細な試験を、ボックス３およびボック
ス４に関するプライマー（上記（８）節を参照のこと）
および鋳型としてのマウスゲノムDNAを使用して実施し
た。以下の配列を有する縮重プライマーが合成された。
（ここで、Ｇ＝グアニン、Ａ＝アデニン、Ｃ＝シトシ
ン、Ｔ＝チミン、Ｉ＝イノシンであり；オリゴヌクレオ
チド中の１つの位置における１塩基以上の混合物を括弧
内に示す）。イノシンがコドンの第３（ゆらぎ）塩基に
相当するいくつかの位置で用いられて、遺伝子コードの
縮重ができるようにしてあることに注目されたい。ま
た、イノシンよりむしろ４個の通常のDNA塩基の混合物
を使用することも可能であり、そして実質的に同一の結
果がかかるプライマーで得られている。
ン、Ｔ＝チミン、Ｉ＝イノシンであり；オリゴヌクレオ
チド中の１つの位置における１塩基以上の混合物を括弧
内に示す）。イノシンがコドンの第３（ゆらぎ）塩基に
相当するいくつかの位置で用いられて、遺伝子コードの
縮重ができるようにしてあることに注目されたい。ま
た、イノシンよりむしろ４個の通常のDNA塩基の混合物
を使用することも可能であり、そして実質的に同一の結
果がかかるプライマーで得られている。
縮重ボックス3/ボックス４プライマー対では、マウス
DNAのゲノムNGFおよびBDNF配列からのPCRにより約90bp
のセグメントが増幅されることが予想された。上記に示
されるプライマーを利用して、PCRをアニーリング温度4
5℃で４サイクル続いてアニーリング温度49℃で31サイ
クル実施した。生成物をゲル電気泳動により分析し、そ
して予測されるサイズの主要バンドが観察された。マウ
スにおいては、NGF遺伝子はボックス３とボックス４と
の間の領域にHind II制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
を含有するが一方BDNF遺伝子はこの領域に酵素Apalの開
裂部位を含有する。従って、Hind IIおよびApalによるP
CR増幅産物の消化により、主要生成物バンドからNGFお
よびBDNF配列が除去されることが予想されよう。しかし
ながら、PCR生成物をこの２種類の制限酵素で明確に完
全に消化した場合、消化−耐性バンドが増幅DNAに残存
することが見出された。このことは、NGFおよびBDNF遺
伝子に加えて、少なくとも１種類の新規な遺伝子が増幅
されていることを示唆している。
DNAのゲノムNGFおよびBDNF配列からのPCRにより約90bp
のセグメントが増幅されることが予想された。上記に示
されるプライマーを利用して、PCRをアニーリング温度4
5℃で４サイクル続いてアニーリング温度49℃で31サイ
クル実施した。生成物をゲル電気泳動により分析し、そ
して予測されるサイズの主要バンドが観察された。マウ
スにおいては、NGF遺伝子はボックス３とボックス４と
の間の領域にHind II制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
を含有するが一方BDNF遺伝子はこの領域に酵素Apalの開
裂部位を含有する。従って、Hind IIおよびApalによるP
CR増幅産物の消化により、主要生成物バンドからNGFお
よびBDNF配列が除去されることが予想されよう。しかし
ながら、PCR生成物をこの２種類の制限酵素で明確に完
全に消化した場合、消化−耐性バンドが増幅DNAに残存
することが見出された。このことは、NGFおよびBDNF遺
伝子に加えて、少なくとも１種類の新規な遺伝子が増幅
されていることを示唆している。
（2.4）BDNF/NGF遺伝子ファミリーの新規メンバーの特
性決定 消化耐性PCR生成物をゲルから溶離し、そして非対照P
CR反応に鋳型として用いた。その際もとの縮重プライマ
ーのいずれか一方が他のプライマーより100倍モル過剰
に存在した。この非対称増幅によりチェイン終止法によ
る配列化に好適な一本鎖DNA鋳型を生成させることがで
きた。新規遺伝子（本明細書において「M3/M4」と呼
ぶ）の配列分析は、M.A.Frohman,M.K.DushおよびG.R.Ma
rtin（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8998−9002（198
8））に記載される「cDNA末端の迅速な増幅（rapid amp
lification of cDNA ends」（RACE）に関する方法を用
いて、ボックス３とボックス４との間に位置する正確な
プライマーと、遺伝子転写物の３′末端におけるポリＡ
配列との間の配列をPCR増幅によって更に拡大させた。D
NA配列化の結果により、NGFおよびBDNFとは異なるが両
方のアミノ酸配列に密接に関連するポリペプチドをコー
ドし得る読み取り枠を含有する新規遺伝子が増幅された
ことが明らかとなった（第14図）。
性決定 消化耐性PCR生成物をゲルから溶離し、そして非対照P
CR反応に鋳型として用いた。その際もとの縮重プライマ
ーのいずれか一方が他のプライマーより100倍モル過剰
に存在した。この非対称増幅によりチェイン終止法によ
る配列化に好適な一本鎖DNA鋳型を生成させることがで
きた。新規遺伝子（本明細書において「M3/M4」と呼
ぶ）の配列分析は、M.A.Frohman,M.K.DushおよびG.R.Ma
rtin（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8998−9002（198
8））に記載される「cDNA末端の迅速な増幅（rapid amp
lification of cDNA ends」（RACE）に関する方法を用
いて、ボックス３とボックス４との間に位置する正確な
プライマーと、遺伝子転写物の３′末端におけるポリＡ
配列との間の配列をPCR増幅によって更に拡大させた。D
NA配列化の結果により、NGFおよびBDNFとは異なるが両
方のアミノ酸配列に密接に関連するポリペプチドをコー
ドし得る読み取り枠を含有する新規遺伝子が増幅された
ことが明らかとなった（第14図）。
この新規の遺伝子が神経栄養因子をコードするという
予備的証拠が、ノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ンによりラット組織におけるその発現パターンを測定す
ることによって得られた。この分析では、この新規の遺
伝子が検査された任意の他の組織におけるよりもはるか
に強力に脳組織において発現されることが示された。
予備的証拠が、ノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ンによりラット組織におけるその発現パターンを測定す
ることによって得られた。この分析では、この新規の遺
伝子が検査された任意の他の組織におけるよりもはるか
に強力に脳組織において発現されることが示された。
（３）論考 上記の通り（第13図）、ボックス１および２に関する
プライマーを用い鋳型としてのラットゲノムDNAを用い
てPCR増幅によって得られたDNAプローブ（R1B/2C）は、
試験された全ての種のEcoR I−消化DNA中のNGFおよびBD
NF遺伝子配列を含有することが知られているバンドにハ
イブリッド形成するのに加え新規のバンドにもハイブリ
ッド形成した。同様な分析はマウスゲノムDNAについて
ボックス３および４プライマーを使用して増幅された新
規遺伝子に対する放射性標識プローブを用いても行われ
た（M3/4）。それぞれの場合に、M3/4プローブはBDNFお
よびNGF配列を含有することが知られているバントと異
なるEcoR I−消化ゲノムDNAの１個の主要バンドにハイ
ブリッド形成した。M3/4プローブによるハイブリッド形
成により観察されるマウス、ラットおよびニワトリゲノ
ムDNAのEcoR Iフラグメントが、全ての場合にR1B/2Cプ
ローブとのハイブリッド形成により得られた新規バンド
の一つと一致することに注目すべきである。これらは、
マウスDNAの場合19.0kb EcoR Iフラグメントであり（第
14図のX1）、ラットDNAの場合7.3kbフラグメントであり
（第14図のX1）、そしてニワトリDNAの場合2.6kbバンド
である（第14図のＸ）。これは、同一遺伝子の一部が1B
/2Cプライマー対を使用してラットDNAからそして3/4プ
ライマー対を使用してマウスDNAから増幅されたことを
示唆している。従って、少なくとも１種類の新規の遺伝
子が上記の全４個の相同性ボックスにおいてNGFおよびB
DNFと相同性を共有していることは明らかである。
プライマーを用い鋳型としてのラットゲノムDNAを用い
てPCR増幅によって得られたDNAプローブ（R1B/2C）は、
試験された全ての種のEcoR I−消化DNA中のNGFおよびBD
NF遺伝子配列を含有することが知られているバンドにハ
イブリッド形成するのに加え新規のバンドにもハイブリ
ッド形成した。同様な分析はマウスゲノムDNAについて
ボックス３および４プライマーを使用して増幅された新
規遺伝子に対する放射性標識プローブを用いても行われ
た（M3/4）。それぞれの場合に、M3/4プローブはBDNFお
よびNGF配列を含有することが知られているバントと異
なるEcoR I−消化ゲノムDNAの１個の主要バンドにハイ
ブリッド形成した。M3/4プローブによるハイブリッド形
成により観察されるマウス、ラットおよびニワトリゲノ
ムDNAのEcoR Iフラグメントが、全ての場合にR1B/2Cプ
ローブとのハイブリッド形成により得られた新規バンド
の一つと一致することに注目すべきである。これらは、
マウスDNAの場合19.0kb EcoR Iフラグメントであり（第
14図のX1）、ラットDNAの場合7.3kbフラグメントであり
（第14図のX1）、そしてニワトリDNAの場合2.6kbバンド
である（第14図のＸ）。これは、同一遺伝子の一部が1B
/2Cプライマー対を使用してラットDNAからそして3/4プ
ライマー対を使用してマウスDNAから増幅されたことを
示唆している。従って、少なくとも１種類の新規の遺伝
子が上記の全４個の相同性ボックスにおいてNGFおよびB
DNFと相同性を共有していることは明らかである。
NGF、BDNFおよび遺伝子ファミリーの新規メンバー
（例えば「M3/4」）間の相同性ボックスの概念はここで
は主要アミノ酸配列およびファミリーの新規の遺伝子の
同定方法に関して主に表されている。しかしながら、こ
れらの神経栄養因子の二次的および三次的構造、それら
の特異的レセプターとの相互作用、およびあり得る治療
的価値を有する新規な分子の合理的な設計に関する付加
的なかかわり合いが存在しそうなことに注目することが
重要である。
（例えば「M3/4」）間の相同性ボックスの概念はここで
は主要アミノ酸配列およびファミリーの新規の遺伝子の
同定方法に関して主に表されている。しかしながら、こ
れらの神経栄養因子の二次的および三次的構造、それら
の特異的レセプターとの相互作用、およびあり得る治療
的価値を有する新規な分子の合理的な設計に関する付加
的なかかわり合いが存在しそうなことに注目することが
重要である。
例えば、NGF中に６個のCys残基があり、そして全てジ
スルフィド結合に関わっていることが示されている。最
もＮ−末端から最もＣ−末端までこれらをCys1〜Cys6と
して番号付けすると、ジスルフィド橋がCys1〜Cys4、Cy
s2〜Cys5、Cys3〜Cys6に存在することが判る。全６個の
Cys残基の位置がNGFとBDNFとの間で保存されており、そ
して「M3/4」の部分における３個のCys残基の位置は、
現在までにNGFおよびBDNFのCys4、Cys5、Cys6と正確に
整列するように配列された。このことは、この遺伝子フ
ァミリーの全てのメンバーの二次的構造が密接に関連し
ており、そして保存Cys残基によって大きく決定され得
ることを示唆している。BDNFおよびNGFに関して指摘さ
れた相同性ボックスが６個のCys残基のうちの５個（ボ
ックス１におけるCys1、ボックス２におけるCys2、ボッ
クス３におけるCys3およびボックス４におけるCys5およ
びCys6）を包含することに注目すべきである。このこと
は、これらのCys残基およびそれらの直接の隣接部分が
これらの神経栄養因子の一般的構造を決定するのに重要
な役割を果たしているという着想を裏書きするものであ
る。神経栄養因子のそれぞれに対する高アフィニティレ
セプターとの特異的相互作用に関する構造決定因子は恐
らく各分子の特有の部分中に存在する。
スルフィド結合に関わっていることが示されている。最
もＮ−末端から最もＣ−末端までこれらをCys1〜Cys6と
して番号付けすると、ジスルフィド橋がCys1〜Cys4、Cy
s2〜Cys5、Cys3〜Cys6に存在することが判る。全６個の
Cys残基の位置がNGFとBDNFとの間で保存されており、そ
して「M3/4」の部分における３個のCys残基の位置は、
現在までにNGFおよびBDNFのCys4、Cys5、Cys6と正確に
整列するように配列された。このことは、この遺伝子フ
ァミリーの全てのメンバーの二次的構造が密接に関連し
ており、そして保存Cys残基によって大きく決定され得
ることを示唆している。BDNFおよびNGFに関して指摘さ
れた相同性ボックスが６個のCys残基のうちの５個（ボ
ックス１におけるCys1、ボックス２におけるCys2、ボッ
クス３におけるCys3およびボックス４におけるCys5およ
びCys6）を包含することに注目すべきである。このこと
は、これらのCys残基およびそれらの直接の隣接部分が
これらの神経栄養因子の一般的構造を決定するのに重要
な役割を果たしているという着想を裏書きするものであ
る。神経栄養因子のそれぞれに対する高アフィニティレ
セプターとの特異的相互作用に関する構造決定因子は恐
らく各分子の特有の部分中に存在する。
従って、新規のキメラ遺伝子は、既に記載された４個
の相同性ボックスのいずれかで、または分子内のその他
の場所でファミリーメンバー間の組み換え（例えばイン
ビトロ組み換えによるか、あるいは直接遺伝子合成によ
る）によって生成され得る。かかるキメラタンパク質
は、Cys残基およびその他のアミノ酸残基の保存ゆえに
同様の二次構造を有しそうであるが、新規な生物学的性
質を有する可能性があろう。例えば、BDNF/NGFキメラタ
ンパク質はBDNFおよびNGF両レセプターとの相互作用ゆ
えに二官能性であり得る。また、キメラタンパク質はダ
イマー化およびその他の物理化学的性質に関しても母分
子と相違し得る。キメラタンパク質はまた、両方の親分
子の拮抗体としても機能しうる可能性がある。
の相同性ボックスのいずれかで、または分子内のその他
の場所でファミリーメンバー間の組み換え（例えばイン
ビトロ組み換えによるか、あるいは直接遺伝子合成によ
る）によって生成され得る。かかるキメラタンパク質
は、Cys残基およびその他のアミノ酸残基の保存ゆえに
同様の二次構造を有しそうであるが、新規な生物学的性
質を有する可能性があろう。例えば、BDNF/NGFキメラタ
ンパク質はBDNFおよびNGF両レセプターとの相互作用ゆ
えに二官能性であり得る。また、キメラタンパク質はダ
イマー化およびその他の物理化学的性質に関しても母分
子と相違し得る。キメラタンパク質はまた、両方の親分
子の拮抗体としても機能しうる可能性がある。
BDNF/NGFの活性フラグメントを使用して、好適な折り
たたみにとって決定的に重要な「コア」領域に関する知
見に加えてどの領域がレセプターとの型−特異的相互作
用に必要かに関する情報に基づいて、他のファミリーメ
ンバーを設計することができる。
たたみにとって決定的に重要な「コア」領域に関する知
見に加えてどの領域がレセプターとの型−特異的相互作
用に必要かに関する情報に基づいて、他のファミリーメ
ンバーを設計することができる。
新規ファミリーメンバー（例えば「M3/4」）と既知フ
ァミリーメンバーとの比較を用いて、BDNF/NGF遺伝子フ
ァミリーの付加的なメンバーに関する探査の指針となり
得る新たな相同性ボックスを明らかにすることができ
る。例えば、BDNFと「M3/4」との比較により、いくつか
の有効な相同性ボックスが示される。特に興味のあるも
のの一つに、先に記載したボックス１〜４にないただ一
つの第４保存Cys残基がある。実際にこのCys残基を包含
する、BDNFおよび「M3/4」によって共有される長い相同
セグメントまたは保存アミノ酸置換が存在する、すなわ
ちHis−Trp−Asn−Ser−Gln−Cys−（ArgまたはLys）−
Thr−（ThrまたはSer）−Gln−（SerまたはThr）−Tyr
−Val−Arg−Ala−Leu−Thrである。この領域内で、有
用な縮重オリゴヌクレオチドプライマーの合成に少なく
とも２種類の相同ボックスを選択できる（例えば、His
−Trp−Asn−Ser−Gln−Cysは18マープライマーにとっ
て96通りの縮重、または17マーにとって48通りの縮重の
みしか必要としない;Tyr−Val−Arg−Ala−Leu−Thrも
有用なボックスであろう）。
ァミリーメンバーとの比較を用いて、BDNF/NGF遺伝子フ
ァミリーの付加的なメンバーに関する探査の指針となり
得る新たな相同性ボックスを明らかにすることができ
る。例えば、BDNFと「M3/4」との比較により、いくつか
の有効な相同性ボックスが示される。特に興味のあるも
のの一つに、先に記載したボックス１〜４にないただ一
つの第４保存Cys残基がある。実際にこのCys残基を包含
する、BDNFおよび「M3/4」によって共有される長い相同
セグメントまたは保存アミノ酸置換が存在する、すなわ
ちHis−Trp−Asn−Ser−Gln−Cys−（ArgまたはLys）−
Thr−（ThrまたはSer）−Gln−（SerまたはThr）−Tyr
−Val−Arg−Ala−Leu−Thrである。この領域内で、有
用な縮重オリゴヌクレオチドプライマーの合成に少なく
とも２種類の相同ボックスを選択できる（例えば、His
−Trp−Asn−Ser−Gln−Cysは18マープライマーにとっ
て96通りの縮重、または17マーにとって48通りの縮重の
みしか必要としない;Tyr−Val−Arg−Ala−Leu−Thrも
有用なボックスであろう）。
実施例9:神経芽腫細胞におけるBDNFの発現増大 （１）材料および方法 （1.1）細 胞 系 CHP100、CHP126、CHP134、CHP234、LAN1、LAN5、NB
9、SY5Y、Y79、F01、BU2、HO1、HL60およびCOL320は第1
5図で用いられたノーザンブロットに関するRNAを提供し
たFred Alt博士の研究室で保持された細胞系である。全
細胞系はヒト腫瘍細胞系である。CHP100は神経上皮腫細
胞系であり、CHP126、CHP134、CHP234、LAN1、LAN5、NB
9およびSY5Yは神経芽腫細胞系であり、Y79は網膜芽腫細
胞系であり、F01、BU2、H01は黒色腫細胞系であり、HL6
0は前骨髄球白血病細胞系であり、そしてCOL320は神経
内分泌結腸癌細胞系である。
9、SY5Y、Y79、F01、BU2、HO1、HL60およびCOL320は第1
5図で用いられたノーザンブロットに関するRNAを提供し
たFred Alt博士の研究室で保持された細胞系である。全
細胞系はヒト腫瘍細胞系である。CHP100は神経上皮腫細
胞系であり、CHP126、CHP134、CHP234、LAN1、LAN5、NB
9およびSY5Yは神経芽腫細胞系であり、Y79は網膜芽腫細
胞系であり、F01、BU2、H01は黒色腫細胞系であり、HL6
0は前骨髄球白血病細胞系であり、そしてCOL320は神経
内分泌結腸癌細胞系である。
（1.2）RNAの調製 RNAを調製し、そして完全な長さのヒトcDNAプローブ
を用い、実質的に前記前記実施例３（1.1）節に記載の
ようにしてノーザンブロットを行った。LAN1におけるRN
Aがあまり重く負荷されず、そしてSY5Yに１マイクログ
ラムのポリ（Ａ）+RNAを使用した以外は10μｇの総RNA
がゲルの各レーンで使用され第15図のノーザンブロット
を得た。
を用い、実質的に前記前記実施例３（1.1）節に記載の
ようにしてノーザンブロットを行った。LAN1におけるRN
Aがあまり重く負荷されず、そしてSY5Yに１マイクログ
ラムのポリ（Ａ）+RNAを使用した以外は10μｇの総RNA
がゲルの各レーンで使用され第15図のノーザンブロット
を得た。
（２）結果および論考 第15図は種々のヒト細胞系から得られたRNAサンプル
のパネルにハイブリッド形成したBDNFプローブのノーザ
ンブロット分析の結果を示す。BDNFプローブにハイブリ
ッド形成した豊富なRNAがCHP234およびLAN5細胞系で検
出されそしてより少量がCHP126およびCHP134で見出され
た。全ての陽性系がヒト神経芽腫腫瘍由来であった。
のパネルにハイブリッド形成したBDNFプローブのノーザ
ンブロット分析の結果を示す。BDNFプローブにハイブリ
ッド形成した豊富なRNAがCHP234およびLAN5細胞系で検
出されそしてより少量がCHP126およびCHP134で見出され
た。全ての陽性系がヒト神経芽腫腫瘍由来であった。
実施例10:ラット海馬におけるBDNF−およびNGF−mRNAの
活性依存性調節は非NMDAグルタメートレセプターにより
仲介される （１）材料および方法 （1.1）カイニン酸でのラットの処理 ラットに、カイニン酸12mg/kgを腹腔内注射90分後広
範な発作活性を抑制するためにジアゼパム（Valium）を
投与した。第19図に示されるように、カイニン酸投与後
に与えられたValiumはBDNF−およびNGF−mRNAレベルが
さらに上昇するのを妨害しなかった。Valiumを与えられ
なかったラットは、カイニン酸のあとにValiumを与えら
れた動物と比較した場合、カイニン酸の３時間後で海馬
において同様のBDNF−およびNGF−mRNAレベルの増大を
示した。
活性依存性調節は非NMDAグルタメートレセプターにより
仲介される （１）材料および方法 （1.1）カイニン酸でのラットの処理 ラットに、カイニン酸12mg/kgを腹腔内注射90分後広
範な発作活性を抑制するためにジアゼパム（Valium）を
投与した。第19図に示されるように、カイニン酸投与後
に与えられたValiumはBDNF−およびNGF−mRNAレベルが
さらに上昇するのを妨害しなかった。Valiumを与えられ
なかったラットは、カイニン酸のあとにValiumを与えら
れた動物と比較した場合、カイニン酸の３時間後で海馬
において同様のBDNF−およびNGF−mRNAレベルの増大を
示した。
（1.2）海馬培養物の調製 E17日令ラットの胚からこれを切り出しそして、カル
シウムイオンもマグネシウムイオンも含有しないが10mM
グルコース、1mg/mlアルブミン、６μg/ml DNアーゼお
よび1mg/mlパパインを含有する燐酸緩衝食塩水（PBS）
中で37℃で20分間インキュベートすることにより海馬を
調製した。パパインを含有しない溶液で洗浄後、海馬細
胞を火炎研磨パスツールピペットを用いて注意深く解離
させた。細胞を低速で遠心することにより集め、10％ウ
シ胎児血清を補添したDMEM中に再懸濁しそして、ポリ−
DL−オルニチン（0.5mg/ml）およびラミニン（５μg/m
l）でプレコートしたプラスチック培養皿（0.5×106細
胞/35mm）に塗布した。塗布３時間後、培地をBrewerお
よびCotman（Brain Res.497:65,1989）記載の補添物を
有するグルタメートを含有しない無血清培地にとり換え
た。ニューロンは３週間培養まで生存能力を保ってお
り、そして通常塗布７日後に実験に使用された。
シウムイオンもマグネシウムイオンも含有しないが10mM
グルコース、1mg/mlアルブミン、６μg/ml DNアーゼお
よび1mg/mlパパインを含有する燐酸緩衝食塩水（PBS）
中で37℃で20分間インキュベートすることにより海馬を
調製した。パパインを含有しない溶液で洗浄後、海馬細
胞を火炎研磨パスツールピペットを用いて注意深く解離
させた。細胞を低速で遠心することにより集め、10％ウ
シ胎児血清を補添したDMEM中に再懸濁しそして、ポリ−
DL−オルニチン（0.5mg/ml）およびラミニン（５μg/m
l）でプレコートしたプラスチック培養皿（0.5×106細
胞/35mm）に塗布した。塗布３時間後、培地をBrewerお
よびCotman（Brain Res.497:65,1989）記載の補添物を
有するグルタメートを含有しない無血清培地にとり換え
た。ニューロンは３週間培養まで生存能力を保ってお
り、そして通常塗布７日後に実験に使用された。
（1.3）RNAの増幅 全細胞性RNAはChomcynskiおよびSacci（Anal.Bioche
m.1987,162:156−159）記載のようにして、短縮NGF cRN
A回転標準物（30fg）の添加後細胞0.5×106個から抽出
した。NGF mRNAおよびcRNAを、抽出RNAの1/5、１×RT/P
CR緩衝液（10mMトリス−HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgC
l2,0.1mg/mlゼラチン,0.1％ Triton X−100）、0.25mM
dNTP、各0.1μＭの５′および３′プライマー、5U RNas
in（Promega）、3.2U AMT−逆転写酵素（Life Scienc
e）および2UのTaqポリメラーゼ（Genofit）を総容量で2
5μ中に含有する合体１チューブ逆転写／ポリメラー
ゼ連鎖反応（RT/PCR）中で同時に増幅した。この混合物
に鉱油を重層させ、41℃で30分間インキュベートし、90
℃で60秒間加熱し、プライマーを55℃で60秒間アニーリ
ングさせそしてプライマーエクステンションを72℃で60
秒行った。増幅生成物（NGF mRNAでは203bpそして回収
標準物では153bp）をNuSieve/アガロース3:1ゲル（FMC
Bioproducts）で分離し、Hybond Nプラス膜（Amersha
m）にアルカリプロットさせそして文献記載（Heumann,
R.およびThoenen,H.,1986,J.Biol.Chem.261:9246;Lindh
oldら、1988,J.Biol.Chem.263:16348）のようにしてハ
イブリッド形成させた。絶対的な定量を行うには、イン
ビトロ転写されたNGF mRNAおよび回収標準物の既知量を
平行反応で同時増幅させた。最近、同様の方法がWangら
（PNAS 86:9719−9721,1989）によって記載されてい
る。
m.1987,162:156−159）記載のようにして、短縮NGF cRN
A回転標準物（30fg）の添加後細胞0.5×106個から抽出
した。NGF mRNAおよびcRNAを、抽出RNAの1/5、１×RT/P
CR緩衝液（10mMトリス−HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgC
l2,0.1mg/mlゼラチン,0.1％ Triton X−100）、0.25mM
dNTP、各0.1μＭの５′および３′プライマー、5U RNas
in（Promega）、3.2U AMT−逆転写酵素（Life Scienc
e）および2UのTaqポリメラーゼ（Genofit）を総容量で2
5μ中に含有する合体１チューブ逆転写／ポリメラー
ゼ連鎖反応（RT/PCR）中で同時に増幅した。この混合物
に鉱油を重層させ、41℃で30分間インキュベートし、90
℃で60秒間加熱し、プライマーを55℃で60秒間アニーリ
ングさせそしてプライマーエクステンションを72℃で60
秒行った。増幅生成物（NGF mRNAでは203bpそして回収
標準物では153bp）をNuSieve/アガロース3:1ゲル（FMC
Bioproducts）で分離し、Hybond Nプラス膜（Amersha
m）にアルカリプロットさせそして文献記載（Heumann,
R.およびThoenen,H.,1986,J.Biol.Chem.261:9246;Lindh
oldら、1988,J.Biol.Chem.263:16348）のようにしてハ
イブリッド形成させた。絶対的な定量を行うには、イン
ビトロ転写されたNGF mRNAおよび回収標準物の既知量を
平行反応で同時増幅させた。最近、同様の方法がWangら
（PNAS 86:9719−9721,1989）によって記載されてい
る。
（２）結果および論考 BDNFとNGFは約50％のアミノ酸同一性を有する遺伝子
ファミリーのメンバーである（Liebrockら、1989,Natur
e 341:149）。これら分子は厳密に保存されたドメイン
を有する。これらのドメインの中にはこれら分子の三次
元構造の安定化に最も関与している確率が高い６個のシ
ステイン残基が含有されており、このことはそれらの生
物活性に必要である。しかしながら、BDNFおよびNGFに
は可変ドメインも存在しており、それらがお互いに異な
るニューロン特異性を決定している（Lindsayら、1985,
Dev.Biol 112:319;Johnsonら、1986,J.Neurosci.6:303
1;Hofer,M.およびBarde,Y.1988,Nature 331:261;Rodrig
uez−Tabarら、1989,Dev.Biol.136:296）。その上、こ
れら２種の神経栄養分子の間の相異はそれらの合成部位
によっても示される。NGFは末梢（Korsching,S.およびT
hoenen,H.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3513;Eb
endalら、1983,Exp.Cell Res.148:311;Heumannら、198
4,EMBO J.3:3183;Dhelton,D.L.およびReichardt,L.F.,1
984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7951）および中枢神
経系（CNS）（Korschingら、1985,EMBO J.4:1389;Shelt
on,D.L.およびReichardt,L.F.,1986,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.83:2714;Whttemoreら、1986,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.83:817;Largeら、1986,Science 234:352）の
両方で発現される。NGFの応答性ニューロンによる神経
支配の密度は相当する標的組織中におけるNGFのレベル
を反映している（Korsching,S.およびThoenen,H.,1983,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3513;Ebendalら、1983,E
xp.Cell Res.148:311;Heumannら、1984,EMBO J.3:3183;
Dhelton,D.L.およびReichardt,L.F.,1984,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.81:7951;Korschingら、1985,EMBO J.4:13
89;Shelton,D.L.およびReichardt,L.F.,1986,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.83:2714;Whittemoreら、1986,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.83:817;Largeら、1986,Science 23
4:352）。NGFと対照的に、BDNFはCNSニューロン中で優
勢に発現され、そしてBDNF−mRNAレベルはNGF−mRNAの
レベルよりかなり高く、例えば海馬で約50倍である。末
梢神経系においては、NGFは種々のニューロンの非ニュ
ーロン型細胞により合成されるが（Bandtlowら、1987,E
MBO J.6:891）、一方脳においては原位置ハイブリダイ
ゼーションにより示されるように（Rennert,P.D.および
Heinrich,G.,1986,Biochem.Biophys.Res.Commun.183:81
3;Ayer−LeLievreら、1988,Science 240:1339;Whittemo
reら、1988,J.Neurosci.Res.20:403）主にニューロン中
に局在する。しかしながら培養された１型星状細胞もま
たかなりの量のNGFを生成することが知られている（Lin
dsay,R.M.,1979,Nature 282:80;Furukawaら、1987,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.142:395）。脳で合成されるNG
Fへのニューロンおよび星状細胞の相対的な寄与はまだ
知られていない。
ファミリーのメンバーである（Liebrockら、1989,Natur
e 341:149）。これら分子は厳密に保存されたドメイン
を有する。これらのドメインの中にはこれら分子の三次
元構造の安定化に最も関与している確率が高い６個のシ
ステイン残基が含有されており、このことはそれらの生
物活性に必要である。しかしながら、BDNFおよびNGFに
は可変ドメインも存在しており、それらがお互いに異な
るニューロン特異性を決定している（Lindsayら、1985,
Dev.Biol 112:319;Johnsonら、1986,J.Neurosci.6:303
1;Hofer,M.およびBarde,Y.1988,Nature 331:261;Rodrig
uez−Tabarら、1989,Dev.Biol.136:296）。その上、こ
れら２種の神経栄養分子の間の相異はそれらの合成部位
によっても示される。NGFは末梢（Korsching,S.およびT
hoenen,H.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3513;Eb
endalら、1983,Exp.Cell Res.148:311;Heumannら、198
4,EMBO J.3:3183;Dhelton,D.L.およびReichardt,L.F.,1
984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7951）および中枢神
経系（CNS）（Korschingら、1985,EMBO J.4:1389;Shelt
on,D.L.およびReichardt,L.F.,1986,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.83:2714;Whttemoreら、1986,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.83:817;Largeら、1986,Science 234:352）の
両方で発現される。NGFの応答性ニューロンによる神経
支配の密度は相当する標的組織中におけるNGFのレベル
を反映している（Korsching,S.およびThoenen,H.,1983,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3513;Ebendalら、1983,E
xp.Cell Res.148:311;Heumannら、1984,EMBO J.3:3183;
Dhelton,D.L.およびReichardt,L.F.,1984,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.81:7951;Korschingら、1985,EMBO J.4:13
89;Shelton,D.L.およびReichardt,L.F.,1986,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.83:2714;Whittemoreら、1986,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.83:817;Largeら、1986,Science 23
4:352）。NGFと対照的に、BDNFはCNSニューロン中で優
勢に発現され、そしてBDNF−mRNAレベルはNGF−mRNAの
レベルよりかなり高く、例えば海馬で約50倍である。末
梢神経系においては、NGFは種々のニューロンの非ニュ
ーロン型細胞により合成されるが（Bandtlowら、1987,E
MBO J.6:891）、一方脳においては原位置ハイブリダイ
ゼーションにより示されるように（Rennert,P.D.および
Heinrich,G.,1986,Biochem.Biophys.Res.Commun.183:81
3;Ayer−LeLievreら、1988,Science 240:1339;Whittemo
reら、1988,J.Neurosci.Res.20:403）主にニューロン中
に局在する。しかしながら培養された１型星状細胞もま
たかなりの量のNGFを生成することが知られている（Lin
dsay,R.M.,1979,Nature 282:80;Furukawaら、1987,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.142:395）。脳で合成されるNG
Fへのニューロンおよび星状細胞の相対的な寄与はまだ
知られていない。
BDNF−およびNGF−mRNAが中枢神経系ニューロンで優
勢に発現される点にかんがみて、これら２種のmRNAレベ
ルがニューロン活性により影響されるか否か調査し、そ
うしてそうである場合はその調節に伝達体が関与してい
る可能性がある。実験の第一シリーズにおいて、胚（E1
7）ラット海馬からニューロン培養物を調製した。第16a
図に示されるように、海馬ニューロンを高濃度（50mM）
のカリウムで分極させるとBDNF−mRNAが高まった。最大
レベルにはカリウム濃度増大の３〜６時間後に達した。
カリウムにより仲介されたBDNF−mRNA増大は培地からカ
ルシウムイオンを排除することにより阻止でき、そして
カルシウム回路遮断剤ニフェジピンによりカルシウム流
入を阻害することによっても低下された（第16b図）。
勢に発現される点にかんがみて、これら２種のmRNAレベ
ルがニューロン活性により影響されるか否か調査し、そ
うしてそうである場合はその調節に伝達体が関与してい
る可能性がある。実験の第一シリーズにおいて、胚（E1
7）ラット海馬からニューロン培養物を調製した。第16a
図に示されるように、海馬ニューロンを高濃度（50mM）
のカリウムで分極させるとBDNF−mRNAが高まった。最大
レベルにはカリウム濃度増大の３〜６時間後に達した。
カリウムにより仲介されたBDNF−mRNA増大は培地からカ
ルシウムイオンを排除することにより阻止でき、そして
カルシウム回路遮断剤ニフェジピンによりカルシウム流
入を阻害することによっても低下された（第16b図）。
用いられた海馬培養物が異なるパターンの伝達体およ
びレセプター発現を示す混合ニューロン集団からなるの
で、種々の生理学的および合成的レセプターアゴニスト
がBDNF−およびNGF−mRNA発現に及ぼす作用について調
べた。第VI表に示される結果は、検査したすべての物質
のうち、カイニン酸、グルタメートレセプターアゴニス
ト（Managhanら、1989,Annu.Rev.Pharnacol.Toxicol.2
9:365）は海馬ニューロンにおけるBDNF−mRNAをはるか
に高い最大増加させることを示している。対照的に、カ
ルバコール（ムスカリン様レセプターアゴニスト）およ
び程度は下るがヒスタミンおよびブラジキニンのような
他の分子はわずかにではあるがしかし有意にBDNF−mRNA
を高めた（第VI表）。海馬ニューロンにおけるNGF−mRN
Aレベルが非常に低いので、NGF−mRNAにおける変化を測
定するのに適する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
法を確立した。この方法を用いて、BDNF−mRNAと同様に
NGF−mRNAレベルも海馬ニューロン中のカリウムおよび
カイニン酸により高められることを見出した（第17
図）。
びレセプター発現を示す混合ニューロン集団からなるの
で、種々の生理学的および合成的レセプターアゴニスト
がBDNF−およびNGF−mRNA発現に及ぼす作用について調
べた。第VI表に示される結果は、検査したすべての物質
のうち、カイニン酸、グルタメートレセプターアゴニス
ト（Managhanら、1989,Annu.Rev.Pharnacol.Toxicol.2
9:365）は海馬ニューロンにおけるBDNF−mRNAをはるか
に高い最大増加させることを示している。対照的に、カ
ルバコール（ムスカリン様レセプターアゴニスト）およ
び程度は下るがヒスタミンおよびブラジキニンのような
他の分子はわずかにではあるがしかし有意にBDNF−mRNA
を高めた（第VI表）。海馬ニューロンにおけるNGF−mRN
Aレベルが非常に低いので、NGF−mRNAにおける変化を測
定するのに適する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
法を確立した。この方法を用いて、BDNF−mRNAと同様に
NGF−mRNAレベルも海馬ニューロン中のカリウムおよび
カイニン酸により高められることを見出した（第17
図）。
第18図に示されるように、海馬ニューロンにおけるBD
NF−mRNAの最大の増大は約25μＭのカイニン酸で得られ
た。カイニン酸濃度をさらに増大させると、BDNF−mRNA
レベルが低下し、このことは高濃度のカイニン酸が海馬
ニューロンに及ぼす毒性作用を反映している確率が最も
高い。グルタレートレセプター仲介神経毒性は興奮性ア
ミノ酸グルタメートの類似体の投与に続く種々の中枢ニ
ューロンに関して先に報告されている（Choiら、1987,
J.Neurosci.7:357;Rothman,S.M.およびOlney,J.W..198
7,Trends Neurosci.10:299;Choi,D.W.,1988,Neuron 1:6
23）。しかしながら、海馬ニューロンにおけるBDNF−お
よびNGF−mRNAの発現を高めるのに必要なカイニン酸の
濃度は神経毒性を生ずる濃度とははっきりと分離でき
た。
NF−mRNAの最大の増大は約25μＭのカイニン酸で得られ
た。カイニン酸濃度をさらに増大させると、BDNF−mRNA
レベルが低下し、このことは高濃度のカイニン酸が海馬
ニューロンに及ぼす毒性作用を反映している確率が最も
高い。グルタレートレセプター仲介神経毒性は興奮性ア
ミノ酸グルタメートの類似体の投与に続く種々の中枢ニ
ューロンに関して先に報告されている（Choiら、1987,
J.Neurosci.7:357;Rothman,S.M.およびOlney,J.W..198
7,Trends Neurosci.10:299;Choi,D.W.,1988,Neuron 1:6
23）。しかしながら、海馬ニューロンにおけるBDNF−お
よびNGF−mRNAの発現を高めるのに必要なカイニン酸の
濃度は神経毒性を生ずる濃度とははっきりと分離でき
た。
カイニン酸の作用をより詳しく調査するために、BDNF
−mRNAの増大が既知グルタメートレセプターアゴニスト
（Monaghanら、1989,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:3
65）のいずれかにより遮断されうるか否か調べた。広い
スペクトルのグルタメートレセプターアンタゴニストで
あるキヌレニン酸、のみならず非NMDAレセプターの競合
的インヒビター（Monaghanら、1989,Annu.Rev.Pharmaco
l.Toxicol.29:365）であるCHQXは海馬ニューロンにおけ
るBDNF−mRNAの、カイニン酸により仲介される増大を完
全に遮断した（第VII表）。他方、NMDAレセプターを特
異的に遮断するMK801はこれらニューロンにおけるBDNF
−mRNAの上昇を遮断できなかった。その上、NMDAそれ自
体がBDNF−mRNAレベルを変化させなかった（第VI表）。
このことはカイニン酸がそのレセプターを介して直接作
用することおよびその作用が内因性グルタメート（この
ものはNMDAレセプターにも作用する）の放出によるもの
ではないことを示している。従って、カンニン酸はイン
ビトロで非NMDAグルタメートレセプターを介してBDNF−
mRNAレベルを高めると結論づけることができる。
−mRNAの増大が既知グルタメートレセプターアゴニスト
（Monaghanら、1989,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:3
65）のいずれかにより遮断されうるか否か調べた。広い
スペクトルのグルタメートレセプターアンタゴニストで
あるキヌレニン酸、のみならず非NMDAレセプターの競合
的インヒビター（Monaghanら、1989,Annu.Rev.Pharmaco
l.Toxicol.29:365）であるCHQXは海馬ニューロンにおけ
るBDNF−mRNAの、カイニン酸により仲介される増大を完
全に遮断した（第VII表）。他方、NMDAレセプターを特
異的に遮断するMK801はこれらニューロンにおけるBDNF
−mRNAの上昇を遮断できなかった。その上、NMDAそれ自
体がBDNF−mRNAレベルを変化させなかった（第VI表）。
このことはカイニン酸がそのレセプターを介して直接作
用することおよびその作用が内因性グルタメート（この
ものはNMDAレセプターにも作用する）の放出によるもの
ではないことを示している。従って、カンニン酸はイン
ビトロで非NMDAグルタメートレセプターを介してBDNF−
mRNAレベルを高めると結論づけることができる。
我々のインビトロ観察の生理学的重要性を評価するた
めに、インビボでも同様のメカニズムが作用するか否か
調べた。体重180−200gの成体Wistar系雌雄ラットを12m
g/kgのカイニン酸で処理した。種々の時間をおいて、海
馬および皮質におけるBDNF−およびNGF−mRNAの変化を
ノーザンブロット分析により測定した。第19図はカイニ
ン酸が脳の両方の領域でBDNF−およびNGF−mRNAレベル
の増大させたことを示している。BDNF−mRNAの増加はNG
F−mRNAのそれよりかなり高かった。その上、カイニン
酸の投与後24時間の長さにわたり、mRNAレベルが高まっ
たままだった。BDNF−およびNGF−mRNA変化の時間的経
過では、海馬における最大の増大はカイニン酸投与約３
時間後に達していることが示される（第19図）。海馬に
おけるBDNF−およびNGF−mRNAの増加に先立ちｃ−fos−
mRNAの増加があることに注目することは興味がある。こ
の２つの現象は原因が関連しているかも知れない。なぜ
なら、損傷後の坐骨神経の場合がそうであることが最近
示されているからである（Hengererら、1990,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.87:3899）。その上、海馬における増
大に比較して脳皮質においては、BDNF−およびNGF−mRN
Aの両方の増大に遅れが存在し、このことはBDNF及びNGF
の発現増強を招来するシグナルが海馬から他の脳領域に
拡がっていることを示している。この観察は、痙攣剤メ
トラゾーンにより惹起されるｃ−fosにおける増大が効
めに海馬において起りそして次に皮質において起こるこ
とを示す先の報告（Morganら、1987,Science 237:192）
と一致する。
めに、インビボでも同様のメカニズムが作用するか否か
調べた。体重180−200gの成体Wistar系雌雄ラットを12m
g/kgのカイニン酸で処理した。種々の時間をおいて、海
馬および皮質におけるBDNF−およびNGF−mRNAの変化を
ノーザンブロット分析により測定した。第19図はカイニ
ン酸が脳の両方の領域でBDNF−およびNGF−mRNAレベル
の増大させたことを示している。BDNF−mRNAの増加はNG
F−mRNAのそれよりかなり高かった。その上、カイニン
酸の投与後24時間の長さにわたり、mRNAレベルが高まっ
たままだった。BDNF−およびNGF−mRNA変化の時間的経
過では、海馬における最大の増大はカイニン酸投与約３
時間後に達していることが示される（第19図）。海馬に
おけるBDNF−およびNGF−mRNAの増加に先立ちｃ−fos−
mRNAの増加があることに注目することは興味がある。こ
の２つの現象は原因が関連しているかも知れない。なぜ
なら、損傷後の坐骨神経の場合がそうであることが最近
示されているからである（Hengererら、1990,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.87:3899）。その上、海馬における増
大に比較して脳皮質においては、BDNF−およびNGF−mRN
Aの両方の増大に遅れが存在し、このことはBDNF及びNGF
の発現増強を招来するシグナルが海馬から他の脳領域に
拡がっていることを示している。この観察は、痙攣剤メ
トラゾーンにより惹起されるｃ−fosにおける増大が効
めに海馬において起りそして次に皮質において起こるこ
とを示す先の報告（Morganら、1987,Science 237:192）
と一致する。
先の研究で、NMDAレセプターがNGFI−Ａ（Coleら、19
89,Nature 340:474）のような海馬mRNAの調節に関与し
ているという証拠が提示されたのち、次にNMDAレセプタ
ーアンタゴニストMK801およびケタミンがインビボでBDN
F−およびNGF−mRNA増大を遮断しうるか否か調べた。し
かしながら、インビトロで我々の結果を確認すると、MK
801はNMDAレセプター活性化から生ずる発作を効果的に
抑制するが、このものはカイニン酸により仲介された海
馬BDNF−mRNAの増大を阻害しなかった（第20図）。最も
ありそうなのはこのNMDAレセプター活性化がカイニン酸
により放出された内因性ゲルタメートから生ずることで
ある（Biziere,K.およびCoyle,T.,Neurosci.,1978,Let
t,8:303;McGeerら、1978,Brain.Res.139:381）。同様
に、カイニン酸処置後の海馬におけるNGF−mRNA増加はM
K801によってもケタミンによっても阻止されなかった。
先の調査（Gall,C.M.およびIsackson,P.J.,1989,Scienc
e 245:758）では、四肢発作を惹起する電解的病変がラ
ットの海馬におけるNGF−mRNAを高めることが示され
た。しかしながら、MK801およびカイニン酸で得られた
現在の結果は発作の誘導とBDNFおよびNGFの発現増大の
間の明らかな解離を示している。ラットをカイニン酸注
射に先立ちジアゲパム（Valium）処置すると、ラット海
馬におけるBDNF−およびNGF−mRNAの増大が完全に遮断
された（第20図）。BDNF−およびNGF−mRNAに及ぼすジ
アゼパムの遮断作用は阻害性GABA作動性系を介するニュ
ーロン活性の抑制から生じている可能性が最も高い。し
かしながら、カイニン酸投与90分後（すなわち、痙攣の
開始約30分）、BDNF−およびNGF−mRNAの増大はジアゼ
パムによってはもはや遮断できず、このことは２種の神
経栄養因子のmRNA発現増大を生ずるカスケード事象の開
始にとって、比較的短い活性増大期間で充分であること
を示している。
89,Nature 340:474）のような海馬mRNAの調節に関与し
ているという証拠が提示されたのち、次にNMDAレセプタ
ーアンタゴニストMK801およびケタミンがインビボでBDN
F−およびNGF−mRNA増大を遮断しうるか否か調べた。し
かしながら、インビトロで我々の結果を確認すると、MK
801はNMDAレセプター活性化から生ずる発作を効果的に
抑制するが、このものはカイニン酸により仲介された海
馬BDNF−mRNAの増大を阻害しなかった（第20図）。最も
ありそうなのはこのNMDAレセプター活性化がカイニン酸
により放出された内因性ゲルタメートから生ずることで
ある（Biziere,K.およびCoyle,T.,Neurosci.,1978,Let
t,8:303;McGeerら、1978,Brain.Res.139:381）。同様
に、カイニン酸処置後の海馬におけるNGF−mRNA増加はM
K801によってもケタミンによっても阻止されなかった。
先の調査（Gall,C.M.およびIsackson,P.J.,1989,Scienc
e 245:758）では、四肢発作を惹起する電解的病変がラ
ットの海馬におけるNGF−mRNAを高めることが示され
た。しかしながら、MK801およびカイニン酸で得られた
現在の結果は発作の誘導とBDNFおよびNGFの発現増大の
間の明らかな解離を示している。ラットをカイニン酸注
射に先立ちジアゲパム（Valium）処置すると、ラット海
馬におけるBDNF−およびNGF−mRNAの増大が完全に遮断
された（第20図）。BDNF−およびNGF−mRNAに及ぼすジ
アゼパムの遮断作用は阻害性GABA作動性系を介するニュ
ーロン活性の抑制から生じている可能性が最も高い。し
かしながら、カイニン酸投与90分後（すなわち、痙攣の
開始約30分）、BDNF−およびNGF−mRNAの増大はジアゼ
パムによってはもはや遮断できず、このことは２種の神
経栄養因子のmRNA発現増大を生ずるカスケード事象の開
始にとって、比較的短い活性増大期間で充分であること
を示している。
本研究により、非NMDAレセプターが海馬におけるBDNF
−およびNGF−mRNAの調節に関与している可能性がある
ことが示され、従ってこの調節メカニズムは海馬のmRNA
をコードする初期遺伝子がグルタメートレセプターのNM
DAサブタイプを介して調節されるように思われると結論
する。Coleらの先の記載（Coleら、1989,Nature 340:47
4）と区別される。ニューロンに及ぼすカイニン酸の作
用のいくつかもグルタメートレセプターのキルカレート
型により仲介されうることが報告されている（Monaghan
ら、1989,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:365）。
−およびNGF−mRNAの調節に関与している可能性がある
ことが示され、従ってこの調節メカニズムは海馬のmRNA
をコードする初期遺伝子がグルタメートレセプターのNM
DAサブタイプを介して調節されるように思われると結論
する。Coleらの先の記載（Coleら、1989,Nature 340:47
4）と区別される。ニューロンに及ぼすカイニン酸の作
用のいくつかもグルタメートレセプターのキルカレート
型により仲介されうることが報告されている（Monaghan
ら、1989,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:365）。
結論として、本研究では、ニューロン活性がラット海
馬および皮質における神経栄養因子BDNFおよびNGFをコ
ードするmRNAレベルを調節することを示している。試験
した全ての化合物のうちで、非NMDAグルタメートレセプ
ターを介して作用するカイニン酸がインビボおよび海馬
ニューロン培養物の両方におけるBDNF−およびNGF−mRN
Aを高めた。これと対照的に、末梢においては、ニュー
ロン細胞におけるNGF合成が神経支配（NGF応答性）ニュ
ーロンにより放出される慣用の伝達体物質またはニュー
ロンペプチドにより調節されることを示す証拠は存在し
ない（Barthら、1984,J.Cell.Biol.99:839;Hellwegら、
1988,Exp.Cell.Res.179:18）。BDNFはCNS中に優先的に
発現され、そしてグルタメートを神経伝達体として用い
る中枢経路と、BDNF−およびNGF−mRNAが比較的多高い
ことが示される領域との間で少なくとも部分的重複が存
在する（Hoferら、EMBO J.印刷中;Monaghanら、1989,An
nu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:365）。特に、原位置ハ
イブリダイゼーションにより示されるNGF−mRNAの分布
（Hoferら、EMBO J.印刷中）とオートラジオグラフィー
により可視化された海馬、大脳皮質および小脳における
カイニン酸レセプター（Monaghanら、1989,Annu.Rev.Ph
armacol.Toxicol.29:365）との間には強度の類似性があ
る。この観察は、グルタメートがCNSにおけるBDNF−お
よびNGF−mRNAを調節する生理学的伝達体であるという
解釈と適合する。
馬および皮質における神経栄養因子BDNFおよびNGFをコ
ードするmRNAレベルを調節することを示している。試験
した全ての化合物のうちで、非NMDAグルタメートレセプ
ターを介して作用するカイニン酸がインビボおよび海馬
ニューロン培養物の両方におけるBDNF−およびNGF−mRN
Aを高めた。これと対照的に、末梢においては、ニュー
ロン細胞におけるNGF合成が神経支配（NGF応答性）ニュ
ーロンにより放出される慣用の伝達体物質またはニュー
ロンペプチドにより調節されることを示す証拠は存在し
ない（Barthら、1984,J.Cell.Biol.99:839;Hellwegら、
1988,Exp.Cell.Res.179:18）。BDNFはCNS中に優先的に
発現され、そしてグルタメートを神経伝達体として用い
る中枢経路と、BDNF−およびNGF−mRNAが比較的多高い
ことが示される領域との間で少なくとも部分的重複が存
在する（Hoferら、EMBO J.印刷中;Monaghanら、1989,An
nu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:365）。特に、原位置ハ
イブリダイゼーションにより示されるNGF−mRNAの分布
（Hoferら、EMBO J.印刷中）とオートラジオグラフィー
により可視化された海馬、大脳皮質および小脳における
カイニン酸レセプター（Monaghanら、1989,Annu.Rev.Ph
armacol.Toxicol.29:365）との間には強度の類似性があ
る。この観察は、グルタメートがCNSにおけるBDNF−お
よびNGF−mRNAを調節する生理学的伝達体であるという
解釈と適合する。
実施例11:脳由来神経栄養因子は培養物中のラット中隔
コリン作動性ニューロンの生存および分化した機能を高
める （１）材料および方法 （1.1）解離細胞の調製および細胞培養条件 妊娠17日後のラット（Sprague−Dawley）からの中隔
領域を周囲組織を含まないようにして切り出した。組織
フラグメントをプールし、Ham's F−10で３回洗い、そ
して次に35mm組織培養皿に移して細断した。この組織を
0.25％トリプシンと37℃で20分間インキュベートするこ
とにより単離細胞浮遊液を調製した。50μg/mlのデオキ
シリボヌクレアーゼ１型（Sigma）を含有する成長培地
（後出）中室温で５分間インキュベートすることにより
トリプシンを不活化したのち、パスツールピペットの狭
窄した頂部にフラグメントを反復して通すことにより細
胞を解離させた。次にこの解離された細胞を500×ｇで4
5秒間遠心した。上清を除去しそして再び遠心した。ゆ
るい細胞ペレットを再懸濁させそして成長培地中で合
し、そして細胞収率を血球計を用いて測定した。終り
に、ポリオルニチン（10μg/ml）およびラミニン（10μ
g/ml）を予め被覆した6mmウェルに細胞を塗布した。細
胞の生存能力はその細胞がトリパンブルーを排除する能
力により24時間後に培養物中で検査した。
コリン作動性ニューロンの生存および分化した機能を高
める （１）材料および方法 （1.1）解離細胞の調製および細胞培養条件 妊娠17日後のラット（Sprague−Dawley）からの中隔
領域を周囲組織を含まないようにして切り出した。組織
フラグメントをプールし、Ham's F−10で３回洗い、そ
して次に35mm組織培養皿に移して細断した。この組織を
0.25％トリプシンと37℃で20分間インキュベートするこ
とにより単離細胞浮遊液を調製した。50μg/mlのデオキ
シリボヌクレアーゼ１型（Sigma）を含有する成長培地
（後出）中室温で５分間インキュベートすることにより
トリプシンを不活化したのち、パスツールピペットの狭
窄した頂部にフラグメントを反復して通すことにより細
胞を解離させた。次にこの解離された細胞を500×ｇで4
5秒間遠心した。上清を除去しそして再び遠心した。ゆ
るい細胞ペレットを再懸濁させそして成長培地中で合
し、そして細胞収率を血球計を用いて測定した。終り
に、ポリオルニチン（10μg/ml）およびラミニン（10μ
g/ml）を予め被覆した6mmウェルに細胞を塗布した。細
胞の生存能力はその細胞がトリパンブルーを排除する能
力により24時間後に培養物中で検査した。
ニューロンおよびグリアからなる培養物のための正常
な成育培地5HS/N3はダルベッコ改変イーグル培地（DME
M）中に５％（v/v）ウマ血清（Gibco）,1％ N3 添加剤
（v/v）（Romijnら、1982,Dev.Brain Res.2:583−58
9）,0.5％（v/v）グルタミン（200mM,Gibco），および
0.25％（v/v）ペニシリン−ストレプトマイシン（それ
ぞれ10,000単位/ml,10,000mcg/ml Gibco）を含有した。
ニューロン富化培養物は成長培地を塗布５〜６時間後
に、１％ N3 添加剤、0.5％グルタミン、および0.25％
ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するDMEMで
置き代えることにより調製した。両方の条件下におい
て、グリア細胞の増殖を限定させるためにシトシンアラ
ビノシド（１μM,245時間）での処理を用いた。
な成育培地5HS/N3はダルベッコ改変イーグル培地（DME
M）中に５％（v/v）ウマ血清（Gibco）,1％ N3 添加剤
（v/v）（Romijnら、1982,Dev.Brain Res.2:583−58
9）,0.5％（v/v）グルタミン（200mM,Gibco），および
0.25％（v/v）ペニシリン−ストレプトマイシン（それ
ぞれ10,000単位/ml,10,000mcg/ml Gibco）を含有した。
ニューロン富化培養物は成長培地を塗布５〜６時間後
に、１％ N3 添加剤、0.5％グルタミン、および0.25％
ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するDMEMで
置き代えることにより調製した。両方の条件下におい
て、グリア細胞の増殖を限定させるためにシトシンアラ
ビノシド（１μM,245時間）での処理を用いた。
（1.2）コリンアセチルトランスフェラーゼ活性のアッ
セイ 細胞をPBS 100μで２回洗浄することにより培養物
から成長培地を除去した。細胞は１回の凍結−解凍サイ
クル、および200mM NaClおよび0.25％（v/v）トリトン
Ｘ−100を含有するpH6.7の50mM KH2PO4中37℃で15分間
インキュベートすることにより溶解させた。細胞培養物
の２μをとり、そしてミクロ−Fonnum操作（Fonnum,
F.,1975,J.Neurochem.24:407−409）に従いCAT活性を分
析した。最終的な基質組成は50mM NaH2PO4（pH7.4）緩
衝液中の0.2mM［14C］アセチル−CoA（NEN,54.4,mCi/mm
ol）,300mM NaCl,8mMコリンブロマイド,20mMエチレンジ
アミン四酢酸、および0.1mMネオスチグミンから成って
いた。これらの酵素および基質濃度において、酵素反応
は90〜120分間直線状であった。コリンアセチルトラン
スフェラーゼ誘導の特異性はアッセイ期間中にCAT活性
の特異的インヒビターＮ−ヒドロキシエチル−４−（１
−ナフチルビニル）ピリジウム（HNP）を添加すること
により検査した（White,H.L.およびCavallito,C.J.,197
0,J.Neurochem.17:1579−1589）。
セイ 細胞をPBS 100μで２回洗浄することにより培養物
から成長培地を除去した。細胞は１回の凍結−解凍サイ
クル、および200mM NaClおよび0.25％（v/v）トリトン
Ｘ−100を含有するpH6.7の50mM KH2PO4中37℃で15分間
インキュベートすることにより溶解させた。細胞培養物
の２μをとり、そしてミクロ−Fonnum操作（Fonnum,
F.,1975,J.Neurochem.24:407−409）に従いCAT活性を分
析した。最終的な基質組成は50mM NaH2PO4（pH7.4）緩
衝液中の0.2mM［14C］アセチル−CoA（NEN,54.4,mCi/mm
ol）,300mM NaCl,8mMコリンブロマイド,20mMエチレンジ
アミン四酢酸、および0.1mMネオスチグミンから成って
いた。これらの酵素および基質濃度において、酵素反応
は90〜120分間直線状であった。コリンアセチルトラン
スフェラーゼ誘導の特異性はアッセイ期間中にCAT活性
の特異的インヒビターＮ−ヒドロキシエチル−４−（１
−ナフチルビニル）ピリジウム（HNP）を添加すること
により検査した（White,H.L.およびCavallito,C.J.,197
0,J.Neurochem.17:1579−1589）。
（1.3）アセチルコリンエステラーゼ（AChE）活性のア
ッセイ 溶解物中に存在するAChEレベルはPotter（Potter,L.
T.,1967,J.Pharmacology and Experimental Therapeuti
cs 156:500−506）およびJohnsonおよびRussell（Johns
on,C.D.およびRusell,R.L.,1975,Anal.Biochem.64:229
−238）の方法に幾つかの改良を加えて測定した。200mM
NaClおよび0.25％（v/v）トリトンＸ−100を含有するp
H6.7の50mM KH2PO4緩衝液中で調製された溶解物を50mM
KH2PO4 pH7.0の中の［3H］アセチルコリンヨーダイド
（NEN,NET−113,73.3mCi/mmol）、エトプロパジン（0.1
mM）と合した。37℃で15分間インキュベーションしたの
ち、1Mクロロ酢酸、0.5M NaOHおよび2.0M NaClを含有す
る停止緩衝溶液100μの添加により反応を停止させ
た。AChE比活性は1.0（10-6）Ｍネオスチグミンの存在
下に測定した。
ッセイ 溶解物中に存在するAChEレベルはPotter（Potter,L.
T.,1967,J.Pharmacology and Experimental Therapeuti
cs 156:500−506）およびJohnsonおよびRussell（Johns
on,C.D.およびRusell,R.L.,1975,Anal.Biochem.64:229
−238）の方法に幾つかの改良を加えて測定した。200mM
NaClおよび0.25％（v/v）トリトンＸ−100を含有するp
H6.7の50mM KH2PO4緩衝液中で調製された溶解物を50mM
KH2PO4 pH7.0の中の［3H］アセチルコリンヨーダイド
（NEN,NET−113,73.3mCi/mmol）、エトプロパジン（0.1
mM）と合した。37℃で15分間インキュベーションしたの
ち、1Mクロロ酢酸、0.5M NaOHおよび2.0M NaClを含有す
る停止緩衝溶液100μの添加により反応を停止させ
た。AChE比活性は1.0（10-6）Ｍネオスチグミンの存在
下に測定した。
（1.4）高アフィニティコリンとり込みの測定 高アフィニティ、Na+依存性メタニズムによるコリン
とり込みを実質的にVacaおよびPilar,1979（Vaca,K.お
よびPilar,G.,1979,J.Gen.Physiol.73:605−628）の操
作によりアッセイした。細胞をHam's F−10の100μ、
続いてタイロード溶液100μですすいだ。25mMカリウ
ム含有タイロード溶液により誘発された10分間の分極に
続き、細胞を正常なNa+またはLi+含有タイロード溶液中
で［3H］コリン（NEN、NET−109、0.11μＭ、86.7 Ci/
ミリモル）と室温で20分間インキュベートした。とり込
み反応はPBSで細胞を２回すすぐことにより停止させ
た。累積したコリンは、1N ギ酸を含有する冷アセトン1
00μと少なくとも20分間培養物をインキュベートする
ことにより抽出した。次に可溶性フラクションをとり出
して計測した。特異的なコリン取込みは全コリン取り込
みレベルとNa+非依存性コリン取込みとの間の差であ
る。
とり込みを実質的にVacaおよびPilar,1979（Vaca,K.お
よびPilar,G.,1979,J.Gen.Physiol.73:605−628）の操
作によりアッセイした。細胞をHam's F−10の100μ、
続いてタイロード溶液100μですすいだ。25mMカリウ
ム含有タイロード溶液により誘発された10分間の分極に
続き、細胞を正常なNa+またはLi+含有タイロード溶液中
で［3H］コリン（NEN、NET−109、0.11μＭ、86.7 Ci/
ミリモル）と室温で20分間インキュベートした。とり込
み反応はPBSで細胞を２回すすぐことにより停止させ
た。累積したコリンは、1N ギ酸を含有する冷アセトン1
00μと少なくとも20分間培養物をインキュベートする
ことにより抽出した。次に可溶性フラクションをとり出
して計測した。特異的なコリン取込みは全コリン取り込
みレベルとNa+非依存性コリン取込みとの間の差であ
る。
（1.5）アセチルコリンエステラーゼ用の組織化学的染
色 コリン作動性細胞はGeneser−JensenおよびBiackstad
tの染色法（1971,Z.Zellforsch.114:460−481）を改変
したアセチルコリンエステラーゼに関する組織化学的染
色により確認した。４％パラホルムアルデヒド中で培養
物を固定化したのち、50mM酢酸緩衝液pH5.0中の4mMアセ
チルチオコリンヨーダイド、2mM硫酸銅、10mMグリシン
および10μg/mlゼラチンからなるAChE基質溶液の存在下
に細胞を４℃で５−６日インキュベートした。以前に記
載（Hartikka,J.およびHefti,F.,1988,J.Neurosci,8:29
67−2985）されたようにして反応生成物の可視化を行っ
た。
色 コリン作動性細胞はGeneser−JensenおよびBiackstad
tの染色法（1971,Z.Zellforsch.114:460−481）を改変
したアセチルコリンエステラーゼに関する組織化学的染
色により確認した。４％パラホルムアルデヒド中で培養
物を固定化したのち、50mM酢酸緩衝液pH5.0中の4mMアセ
チルチオコリンヨーダイド、2mM硫酸銅、10mMグリシン
および10μg/mlゼラチンからなるAChE基質溶液の存在下
に細胞を４℃で５−６日インキュベートした。以前に記
載（Hartikka,J.およびHefti,F.,1988,J.Neurosci,8:29
67−2985）されたようにして反応生成物の可視化を行っ
た。
（1.6）NGFレセプターの免疫組織化学的染色 培養物をDMEMで２回洗浄しそして４％パラホルムアル
デヒドを用いて固定した。次に、５％ウシ血清アルブミ
ン、0.02％トリトンＸ−100および５％スクロースを含
有するpH7.4の燐酸ナトリウム緩衝液（Hartikka,J.およ
びHefti,F.,1988,J.Neurosci.8:2967−2985）で細胞を
３〜４時間処理した。NGF−Ｒはモノクローナル抗体192
−IgG（Taniuchi,M.およびJohnson,E.,1985,J.Cell Bio
l.101:1100−1106;Chandlerら、1984,J.Biol.Chem.259:
6882−6889）を、５％ウマ血清を含有する緩衝液中で1:
1000の希釈度で用いて検出した。培養物を希釈された抗
体と４℃で15−18時間インキュベーションした。結合さ
れたマウス免疫グロブリンはビオチニル化ウマ抗マウス
IgG（1:200 Vector）を用いて検出した。免疫反応性細
胞は結合ペルオキシダーゼ酵素用基質として３′,3′−
ジアミノベンジジンを用いることにより確認した。
デヒドを用いて固定した。次に、５％ウシ血清アルブミ
ン、0.02％トリトンＸ−100および５％スクロースを含
有するpH7.4の燐酸ナトリウム緩衝液（Hartikka,J.およ
びHefti,F.,1988,J.Neurosci.8:2967−2985）で細胞を
３〜４時間処理した。NGF−Ｒはモノクローナル抗体192
−IgG（Taniuchi,M.およびJohnson,E.,1985,J.Cell Bio
l.101:1100−1106;Chandlerら、1984,J.Biol.Chem.259:
6882−6889）を、５％ウマ血清を含有する緩衝液中で1:
1000の希釈度で用いて検出した。培養物を希釈された抗
体と４℃で15−18時間インキュベーションした。結合さ
れたマウス免疫グロブリンはビオチニル化ウマ抗マウス
IgG（1:200 Vector）を用いて検出した。免疫反応性細
胞は結合ペルオキシダーゼ酵素用基質として３′,3′−
ジアミノベンジジンを用いることにより確認した。
（1.7）BDNFおよびNGFの精製 ブタ脳からのBDNFの精製および雄マウス顎下腺からの
NGFの精製は以前に刊行されたプロトコル（Bardeら、19
82,EMBO J.1:549−553;Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:
319−328）に従って行った。これら研究の一部で用いら
れた組み換えBDNFは先に特性決定されている（Maisonpi
erreら、1990,Science,247:1446−141）。
NGFの精製は以前に刊行されたプロトコル（Bardeら、19
82,EMBO J.1:549−553;Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:
319−328）に従って行った。これら研究の一部で用いら
れた組み換えBDNFは先に特性決定されている（Maisonpi
erreら、1990,Science,247:1446−141）。
（２）結果 中隔細胞の培養物はポリオルニチン−ラミニン被覆ウ
ェル上で神経突起を骨折って伸ばし、多くの細胞が24時
間までに特徴的なニューロン根ブライト細胞体を提示す
る（第21図ＡおよびＢ）。継続した神経突起伸びはイン
ビトロで第２および４日目に細胞−細胞接触の程度の漸
進的増大を生じた（第21図C,DをE,Fと比較のこと）。平
坦化相−ダーク細胞が存在しないことにより注目される
ように、４日後ですら培養物中には非ニューロン細胞は
非常に少数しか存在しなかった。培養中の中隔コリン作
動性ニューロンに及ぼすBDNFの作用を査定するために、
AChEには組織化学的染色を、そしてNGF−レセプターに
は免疫組織化学的染色を用いた。AChE陽性ニューロンの
代表的な形態を第21図G,Hに示す。幾つかめのNGF−レセ
プター陽性ニューロンを第21図Ｉに示す。
ェル上で神経突起を骨折って伸ばし、多くの細胞が24時
間までに特徴的なニューロン根ブライト細胞体を提示す
る（第21図ＡおよびＢ）。継続した神経突起伸びはイン
ビトロで第２および４日目に細胞−細胞接触の程度の漸
進的増大を生じた（第21図C,DをE,Fと比較のこと）。平
坦化相−ダーク細胞が存在しないことにより注目される
ように、４日後ですら培養物中には非ニューロン細胞は
非常に少数しか存在しなかった。培養中の中隔コリン作
動性ニューロンに及ぼすBDNFの作用を査定するために、
AChEには組織化学的染色を、そしてNGF−レセプターに
は免疫組織化学的染色を用いた。AChE陽性ニューロンの
代表的な形態を第21図G,Hに示す。幾つかめのNGF−レセ
プター陽性ニューロンを第21図Ｉに示す。
第22図Ａに示されるように、BDNFは胚ラット中隔細胞
の低密度培養物（細胞密度66,700〜133,300細胞/cm2と
定義される）におけるAChE陽性細胞数を2.4倍高めた。
同じ細胞密度で、NGFの作用はわずかに低かった（1.0
倍）。BDNFのみならずNGFが中隔培養物中におけるAChE
陽性ニューロン数を増大させうるという知見により、こ
れら２種の因子が同じニューロン集団に作用するのかま
たは別のものに作用するのかなる試験が促進された。第
22図Ａの第３番目の図に示されるように、飽和レベルの
BDNFおよびNGFを同時に添加しても、どちらか一方の因
子を単独で添加した場合に見られるそれより多数のAChE
陽性ニューロンは生じなかった。ニューロン生存によっ
て、これらの結果はBDNFおよびNGFに応答するラット中
隔培養物中におけるコリン作動性ニューロンが密接に重
複する集団である筈であることを示唆している。
の低密度培養物（細胞密度66,700〜133,300細胞/cm2と
定義される）におけるAChE陽性細胞数を2.4倍高めた。
同じ細胞密度で、NGFの作用はわずかに低かった（1.0
倍）。BDNFのみならずNGFが中隔培養物中におけるAChE
陽性ニューロン数を増大させうるという知見により、こ
れら２種の因子が同じニューロン集団に作用するのかま
たは別のものに作用するのかなる試験が促進された。第
22図Ａの第３番目の図に示されるように、飽和レベルの
BDNFおよびNGFを同時に添加しても、どちらか一方の因
子を単独で添加した場合に見られるそれより多数のAChE
陽性ニューロンは生じなかった。ニューロン生存によっ
て、これらの結果はBDNFおよびNGFに応答するラット中
隔培養物中におけるコリン作動性ニューロンが密接に重
複する集団である筈であることを示唆している。
AChE陽性ニューロンの生存に及ぼすBDNFの作用は細胞
を成長させる密度に依存した（第22A図）。高密度の塗
布（200,000−266,000細胞/cm2）ではBDNFだけでも、ま
たはNGFと共用してもAChEを発現するニューロン数の増
大を生じなかった。これは神経栄養因子の内在レベルが
増大したため、あるいはまた高い細胞密度では細胞−細
胞接触が起こって生存促進作用をするためかもしれな
い。
を成長させる密度に依存した（第22A図）。高密度の塗
布（200,000−266,000細胞/cm2）ではBDNFだけでも、ま
たはNGFと共用してもAChEを発現するニューロン数の増
大を生じなかった。これは神経栄養因子の内在レベルが
増大したため、あるいはまた高い細胞密度では細胞−細
胞接触が起こって生存促進作用をするためかもしれな
い。
低い細胞密度ではAChE陽性細胞の数はBDNF濃度の関数
として増大した。すなわち処理した培養物中でAChE陽性
細胞／ウェルの数が対照値169.2±12.9から388.0±26.2
（2.5倍の増大）に増大し、最大応答は投与量10ng/mlの
時に観察された。これとは対照的に、NGFに対する最大
応答は50ng/mlの時に観察された。そしてAChE陽性細胞
／ウェルが121.0±7.6から231.7±12.9（1.9倍の増大）
に増大した。BDNFおよびNGFは両方とも応答曲線におけ
る高原期は安定しているようであった。そこにおいては
投与量100ng/mlの高さではAChE陽性ニューロンの数は減
少しなかった。
として増大した。すなわち処理した培養物中でAChE陽性
細胞／ウェルの数が対照値169.2±12.9から388.0±26.2
（2.5倍の増大）に増大し、最大応答は投与量10ng/mlの
時に観察された。これとは対照的に、NGFに対する最大
応答は50ng/mlの時に観察された。そしてAChE陽性細胞
／ウェルが121.0±7.6から231.7±12.9（1.9倍の増大）
に増大した。BDNFおよびNGFは両方とも応答曲線におけ
る高原期は安定しているようであった。そこにおいては
投与量100ng/mlの高さではAChE陽性ニューロンの数は減
少しなかった。
低密度培養においては、BDNFおよびNGFは両方ともACh
E組織化学によって検出される細胞の数を増大させうる
ことは明らかである。この増大は成長因子の非存在下に
おける培養物中で死んでゆくコリン作動性細胞を救える
ため、または前駆体細胞の漸増加のため、またはコリン
作動マーカー、AChEの誘導のためである可能性がある。
これらの可能性間を区別するために計12日間維持した一
連の培養物中で遅延添加（delayed addition）実験を行
った（第23図）。塗布後５から６時間処理した一連の培
養物をBDNFまたはNGFの存在下で全12日間維持した。二
番目の一組の培養物は成長因子なしで５日間樹立し、そ
の後最後の７日間はBDNFまたはNGFで処理した（−5/＋
７）。これら２組の培養物を比較した場合、５日後のNG
FまたはBDNF添加に対する応答は、細胞を因子の存在下
で継続的に成長させた場合に観察されたものとほぼ同じ
であった（第23図の連続バーと横縞バーを比較）。しか
しながら、結果は三番目の一組の培養物において驚く程
異なった。その培養物においてはBDNFあるいはNGFは最
後の５日の培養物にだけ存在した（−7/＋５）。これら
の条件下において、NGFもBDNFもAChE陽性細胞の数を増
大させることはできなかった。他の実験においては、隔
ニューロンをNGFまたはBDNFのいずれか一方に３−４日
間だけでもさらすことはAChE酵素活性の大きな増大を生
じるのに十分であり、したがってAChE染色により細胞が
検出された。したがって“−7/＋5"培養物におけるAChE
陽性ニューロンの数が検出できる程増大しないのは成長
因子にさらした時間がAChE陽性細胞を誘導をせしめるに
十分でなかったという可能性によるものではなかった。
E組織化学によって検出される細胞の数を増大させうる
ことは明らかである。この増大は成長因子の非存在下に
おける培養物中で死んでゆくコリン作動性細胞を救える
ため、または前駆体細胞の漸増加のため、またはコリン
作動マーカー、AChEの誘導のためである可能性がある。
これらの可能性間を区別するために計12日間維持した一
連の培養物中で遅延添加（delayed addition）実験を行
った（第23図）。塗布後５から６時間処理した一連の培
養物をBDNFまたはNGFの存在下で全12日間維持した。二
番目の一組の培養物は成長因子なしで５日間樹立し、そ
の後最後の７日間はBDNFまたはNGFで処理した（−5/＋
７）。これら２組の培養物を比較した場合、５日後のNG
FまたはBDNF添加に対する応答は、細胞を因子の存在下
で継続的に成長させた場合に観察されたものとほぼ同じ
であった（第23図の連続バーと横縞バーを比較）。しか
しながら、結果は三番目の一組の培養物において驚く程
異なった。その培養物においてはBDNFあるいはNGFは最
後の５日の培養物にだけ存在した（−7/＋５）。これら
の条件下において、NGFもBDNFもAChE陽性細胞の数を増
大させることはできなかった。他の実験においては、隔
ニューロンをNGFまたはBDNFのいずれか一方に３−４日
間だけでもさらすことはAChE酵素活性の大きな増大を生
じるのに十分であり、したがってAChE染色により細胞が
検出された。したがって“−7/＋5"培養物におけるAChE
陽性ニューロンの数が検出できる程増大しないのは成長
因子にさらした時間がAChE陽性細胞を誘導をせしめるに
十分でなかったという可能性によるものではなかった。
NGFはmRNAおよびタンパク質レベルの両方で測定して
それ自体のレセプターのレベルを調節しうることはイン
ビトロのみならずインビボにおいても示されている（Mo
ntero,C.およびHefti,F.,1988,J.Neurosci.8:2986−299
9;Higginsら、1989,Neuron.3:247−256）。BDNFはコリ
ン作動性表現型の誘導および中隔培養物中における細胞
生存においてNGFに類似の作用を示すことがわかったの
で、IgG−192免疫陽性細胞の数により定量化すること
で、NGFレセプターのレベルをBDNFが調節しているとい
う可能性を調べた。第24図に示すように、10ng/mlで、B
DNFはNGFレセプター免疫陽性細胞の数を３倍増大させ
た。おもしろいことに、高い濃度（25−100ng/ml）では
BDNFの作用は次第に顕著でなくなった。したがって、こ
の場合における用量応答は、これらの培養物中における
他のパラメーター例えばAChE陽性細胞の数におよぼすBD
NFの作用で観察されるそれとは明白に異なった。陽性の
対照として、細胞を50ng/mlの濃度のNGFで処理し、それ
はまた陽性細胞の数を３倍に増大させた。したがって、
IgG−192染色に基づくと、BDNFはNGFレセプターの発現
をアップレギュレイトするのにおよぼすNGFの作用とほ
ぼ同じ作用を有する。
それ自体のレセプターのレベルを調節しうることはイン
ビトロのみならずインビボにおいても示されている（Mo
ntero,C.およびHefti,F.,1988,J.Neurosci.8:2986−299
9;Higginsら、1989,Neuron.3:247−256）。BDNFはコリ
ン作動性表現型の誘導および中隔培養物中における細胞
生存においてNGFに類似の作用を示すことがわかったの
で、IgG−192免疫陽性細胞の数により定量化すること
で、NGFレセプターのレベルをBDNFが調節しているとい
う可能性を調べた。第24図に示すように、10ng/mlで、B
DNFはNGFレセプター免疫陽性細胞の数を３倍増大させ
た。おもしろいことに、高い濃度（25−100ng/ml）では
BDNFの作用は次第に顕著でなくなった。したがって、こ
の場合における用量応答は、これらの培養物中における
他のパラメーター例えばAChE陽性細胞の数におよぼすBD
NFの作用で観察されるそれとは明白に異なった。陽性の
対照として、細胞を50ng/mlの濃度のNGFで処理し、それ
はまた陽性細胞の数を３倍に増大させた。したがって、
IgG−192染色に基づくと、BDNFはNGFレセプターの発現
をアップレギュレイトするのにおよぼすNGFの作用とほ
ぼ同じ作用を有する。
細胞生存におよぼす作用に加えて、BDNFがコリン作動
性表現型特性を促進しうる可能性を調査した。CAT活性
における直線的増大は、50ng/mlまでのBDNFの漸増レベ
ル存在下において成長した中隔培養体物に見られ、第25
図で示すようにそこでは対照の値の1.8倍のレベルで応
答は飽和した。NGFで処理した並行培養物におけるCAT活
性誘導は25ng/mlで高原状態に達し、対照の値より3.4倍
の増大を示す。BDNFまたはNGFのいずれか一方に対する
応答は飽和応答を生じるのに十分な濃度の３倍で有意な
減少を示さなかった。BDNFまたはNGFいずれか一方を用
いるCAT活性の誘導は［Ｎ−ヒドロキシエチル−４−
（１−ナフチルビニール）ピリジアム］HNP−非依存性
のトランスフェラーゼ活性のレベルには影響しなかっ
た。
性表現型特性を促進しうる可能性を調査した。CAT活性
における直線的増大は、50ng/mlまでのBDNFの漸増レベ
ル存在下において成長した中隔培養体物に見られ、第25
図で示すようにそこでは対照の値の1.8倍のレベルで応
答は飽和した。NGFで処理した並行培養物におけるCAT活
性誘導は25ng/mlで高原状態に達し、対照の値より3.4倍
の増大を示す。BDNFまたはNGFのいずれか一方に対する
応答は飽和応答を生じるのに十分な濃度の３倍で有意な
減少を示さなかった。BDNFまたはNGFいずれか一方を用
いるCAT活性の誘導は［Ｎ−ヒドロキシエチル−４−
（１−ナフチルビニール）ピリジアム］HNP−非依存性
のトランスフェラーゼ活性のレベルには影響しなかっ
た。
BDNFならびにNGFが中隔培養物におけるCAT活性の増大
を惹起するという発見にかんがみ、両因子での同時処理
に対する応答を研究した（第VIII表）。これらの実験の
ために、２種の濃度のBDNF、すなわち５および25ng/ml
を使用し、これらはCAT活性をそれぞれ1.4および2.6倍
増加させた。NGF（50ng/ml）だけでは酵素活性を2.8倍
増加させ、BDNFと共用した場合は、CAT活性のレベルは
少なくとも相加的作用を反映した（第VIII表）。使用し
たBDNFの濃度では、NGF作用に純粋に相加的な作用によ
り、対照の値より4.2および5.4倍それぞれ増加させたの
であろう。観察した値は実際には相加的よりいくらか上
のものであった。
を惹起するという発見にかんがみ、両因子での同時処理
に対する応答を研究した（第VIII表）。これらの実験の
ために、２種の濃度のBDNF、すなわち５および25ng/ml
を使用し、これらはCAT活性をそれぞれ1.4および2.6倍
増加させた。NGF（50ng/ml）だけでは酵素活性を2.8倍
増加させ、BDNFと共用した場合は、CAT活性のレベルは
少なくとも相加的作用を反映した（第VIII表）。使用し
たBDNFの濃度では、NGF作用に純粋に相加的な作用によ
り、対照の値より4.2および5.4倍それぞれ増加させたの
であろう。観察した値は実際には相加的よりいくらか上
のものであった。
BDNF処理で観察された生物学的応答は内在NGFのBDNF
依存性放出によるものであるという可能性を検査した。
この疑問を検べるために、NGFに対するモノクローナル
抗体（抗体27/21,KorschingおよびThoenen,1983）あら
ゆるNGF関連応答を阻止するのに使用した。第IX表で示
すように、CAT活性におよぼすNGFの作用は抗−NGFによ
り大いに減少したが、BDNFにより誘導された応答は実質
的には影響されなかった。しかしながら、CAT活性の基
準レベルは、未処理対照と比較すると抗−NGFで処理し
た培養物において約20％減少したことに注目すべきであ
る。それにもかかわらず、BDNFにより生じた中隔培養物
におけるCAT活性増大が観察されたことは、直接的作用
であり内在NGFの増大により仲介されたのではないと思
われる。
依存性放出によるものであるという可能性を検査した。
この疑問を検べるために、NGFに対するモノクローナル
抗体（抗体27/21,KorschingおよびThoenen,1983）あら
ゆるNGF関連応答を阻止するのに使用した。第IX表で示
すように、CAT活性におよぼすNGFの作用は抗−NGFによ
り大いに減少したが、BDNFにより誘導された応答は実質
的には影響されなかった。しかしながら、CAT活性の基
準レベルは、未処理対照と比較すると抗−NGFで処理し
た培養物において約20％減少したことに注目すべきであ
る。それにもかかわらず、BDNFにより生じた中隔培養物
におけるCAT活性増大が観察されたことは、直接的作用
であり内在NGFの増大により仲介されたのではないと思
われる。
AChE活性がCAT活性とともにBDNFあるいはNGFと調和し
て調節されているという可能性も検査した（第26図）。
CAT活性と対照的に、BDNFまたはNGFに対するAChEの用量
応答は、酵素活性が50ng/mlの濃度まで直線的に増大す
る点で全く同様であることが明らかとなった。この濃度
では、未処理の対照値と比較すると、NGFおよびBDNFはA
ChE活性をそれぞれ274％および234％増加させた。
て調節されているという可能性も検査した（第26図）。
CAT活性と対照的に、BDNFまたはNGFに対するAChEの用量
応答は、酵素活性が50ng/mlの濃度まで直線的に増大す
る点で全く同様であることが明らかとなった。この濃度
では、未処理の対照値と比較すると、NGFおよびBDNFはA
ChE活性をそれぞれ274％および234％増加させた。
CAT活性におけるBDNFあるいはNGFにより誘導された増
大の時間的経過を調査した（第27図）。50ng/mlのBDNF
で処理した培養物中のCAT活性は３日目までに対照値の1
70％に増大した。この増大は６日目まで続き、そこでCA
T活性は検査した残りの期間を通して対照の値の2.5倍で
高原状態となった。これと対照的にNGF（50ng/ml）投与
に対するCAT応答は、もっと速やかで、３日目までに誘
導レベルは対照より2.5倍増に達した。CAT活性の増大は
直線的に上昇を続け、12日後には対照より3.2倍に達し
た。
大の時間的経過を調査した（第27図）。50ng/mlのBDNF
で処理した培養物中のCAT活性は３日目までに対照値の1
70％に増大した。この増大は６日目まで続き、そこでCA
T活性は検査した残りの期間を通して対照の値の2.5倍で
高原状態となった。これと対照的にNGF（50ng/ml）投与
に対するCAT応答は、もっと速やかで、３日目までに誘
導レベルは対照より2.5倍増に達した。CAT活性の増大は
直線的に上昇を続け、12日後には対照より3.2倍に達し
た。
一定期間培養中で成長させた星状細胞はNGFの他に種
々の神経栄養活性物を合成することが示されている（Li
ndsay,R.M.,1979,Nature 282:80−82;Lindsayら、1982,
Brain Res.243:329−343;Aldersonら、1989,Dev.Brain.
Res.48:229−241）。BDNFに関する我々のこのたびの観
察は、NGFレベルの増加によって仲介されるという可能
性を我々は排除しているが、BDNFは特にグリア細胞にお
ける他の神経栄養因子の発現を調節することによって間
接的に作用しうると考えられる。中隔培養物におけるCA
T活性におよぼすBDNFの作用に非ニューロン細胞が影響
を与える可能性について評価するために、我々は混合グ
リアーニューロン培養物およびニューロン濃縮培養物に
おけるBDNFに対するコリン作動性ニューロンの応答を比
較した（第28図）。ニューロン濃縮培養物においては、
BDNFに対するCAT活性応答は鐘形曲線を示した。すなわ
ち最大の増大は5ng/ml量のBDNFで達成されそして25ng/m
l濃度では酵素活性は有意に減少した（ｐ＞0.001,15−2
5ng/mlのBDNFを比較）。第25図に示す結果と同様に、集
密グリア層の存在下でBDNFに対するCAT応答は25ng/mlま
で、すなわち検査した最高用量まで直線状であった。非
ニューロン細胞の存在下では、同様に処理されたニュー
ロン濃縮培養物で見られると同じ値のCAT活性増大を生
じさせるには、より高レベルのBDNFを要した。それにも
かかわらず、中隔コリン作動性ニューロンにおいてCAT
活性を最大に刺激するBDNFの能力はグリア細胞の存在ま
たは非存在下におけると実質的には同じであった。
々の神経栄養活性物を合成することが示されている（Li
ndsay,R.M.,1979,Nature 282:80−82;Lindsayら、1982,
Brain Res.243:329−343;Aldersonら、1989,Dev.Brain.
Res.48:229−241）。BDNFに関する我々のこのたびの観
察は、NGFレベルの増加によって仲介されるという可能
性を我々は排除しているが、BDNFは特にグリア細胞にお
ける他の神経栄養因子の発現を調節することによって間
接的に作用しうると考えられる。中隔培養物におけるCA
T活性におよぼすBDNFの作用に非ニューロン細胞が影響
を与える可能性について評価するために、我々は混合グ
リアーニューロン培養物およびニューロン濃縮培養物に
おけるBDNFに対するコリン作動性ニューロンの応答を比
較した（第28図）。ニューロン濃縮培養物においては、
BDNFに対するCAT活性応答は鐘形曲線を示した。すなわ
ち最大の増大は5ng/ml量のBDNFで達成されそして25ng/m
l濃度では酵素活性は有意に減少した（ｐ＞0.001,15−2
5ng/mlのBDNFを比較）。第25図に示す結果と同様に、集
密グリア層の存在下でBDNFに対するCAT応答は25ng/mlま
で、すなわち検査した最高用量まで直線状であった。非
ニューロン細胞の存在下では、同様に処理されたニュー
ロン濃縮培養物で見られると同じ値のCAT活性増大を生
じさせるには、より高レベルのBDNFを要した。それにも
かかわらず、中隔コリン作動性ニューロンにおいてCAT
活性を最大に刺激するBDNFの能力はグリア細胞の存在ま
たは非存在下におけると実質的には同じであった。
CATおよびAChE活性に基づくと、BDNFはコリン作動性
表現型マーカーを増強するのにNGFと同様に作用しうる
ことは明らかである。これをさらに検査するために、Na
+依存性の高アフィニティコリンとり込みに及ぼすBDNF
の作用をNGFのそれと比較した（第29図）。50ng/mlのBD
NFの存在下で12日間成長した細胞は未処理対照のそれよ
りも3.8倍多くコリンを蓄積した。並行した培養物にお
いて、NGF（25ng/ml）はコリン蓄積を2.3倍誘導した。
表現型マーカーを増強するのにNGFと同様に作用しうる
ことは明らかである。これをさらに検査するために、Na
+依存性の高アフィニティコリンとり込みに及ぼすBDNF
の作用をNGFのそれと比較した（第29図）。50ng/mlのBD
NFの存在下で12日間成長した細胞は未処理対照のそれよ
りも3.8倍多くコリンを蓄積した。並行した培養物にお
いて、NGF（25ng/ml）はコリン蓄積を2.3倍誘導した。
（３）論考 末梢ニューロンにおよぼす確立された作用と比較して
（Bardeら、1982,EMBO J.１:549−553;Lindsayら、198
5,Dev.Biol.112:319−328;Daviesら、1986,J.Neurosci.
６:1897−1904;Hofer,M.,およびBarde,Y.,1988,Nature
331:262−262）、中枢神経系内のBDNFのニューロン特異
性はあまり特性決定されていない。今日に至るまで、唯
一の知られた応答性 CNSニューロンはE17ラット網膜の
培養物中で初めて同定されたThy−１陽性網膜神経節の
小規模のサブ集団である（Johnsonら、1986,J.Neurosc
i.６:3031−3038）。また他の研究により、外植片培養
物における成体網膜神経節細胞におよぼすBDNFの作用も
確立された（Thanosら、1989,Eur.J.Neuro.１:19−2
6）。この研究において、我々はAChE組織化学染色によ
り示されるようにBDNFはラット胚中隔からの培養コリン
作動性ニューロンの生存を増大させ、そして種々のコリ
ン作動性表現型のマーカーの発現、すなわちAChEおよび
CATの酵素活性および高いアフィニティコリン取り込み
を増大させることを示した。さらにBDNFは中隔培養物に
おけるNGFレセプターの発現を増大させることがわかっ
た。
（Bardeら、1982,EMBO J.１:549−553;Lindsayら、198
5,Dev.Biol.112:319−328;Daviesら、1986,J.Neurosci.
６:1897−1904;Hofer,M.,およびBarde,Y.,1988,Nature
331:262−262）、中枢神経系内のBDNFのニューロン特異
性はあまり特性決定されていない。今日に至るまで、唯
一の知られた応答性 CNSニューロンはE17ラット網膜の
培養物中で初めて同定されたThy−１陽性網膜神経節の
小規模のサブ集団である（Johnsonら、1986,J.Neurosc
i.６:3031−3038）。また他の研究により、外植片培養
物における成体網膜神経節細胞におよぼすBDNFの作用も
確立された（Thanosら、1989,Eur.J.Neuro.１:19−2
6）。この研究において、我々はAChE組織化学染色によ
り示されるようにBDNFはラット胚中隔からの培養コリン
作動性ニューロンの生存を増大させ、そして種々のコリ
ン作動性表現型のマーカーの発現、すなわちAChEおよび
CATの酵素活性および高いアフィニティコリン取り込み
を増大させることを示した。さらにBDNFは中隔培養物に
おけるNGFレセプターの発現を増大させることがわかっ
た。
当初の実験では、我々は、BDNFがE17中隔培養物中のA
ChE陽性ニューロンの数を約２倍に増大させることを見
出した。NGFと同じように（Hartikka,J.およびHefti,
F.,1988,J.Neurosci.８:2967−2985）、この作用は、細
胞密度が低い時にもっとも明白であった。おもしろいこ
とに、NGFおよびBDNFを同時添加すると、いずれか一方
の成長因子だけの存在下で観察されるレベルを越えてAC
hE陽性細胞の数をさらに増大させるには効果がなかっ
た。この観察は、BDNFおよびNGFが中隔コリン作動性ニ
ューロンの同じ集団に主に作用することを強く示唆す
る。
ChE陽性ニューロンの数を約２倍に増大させることを見
出した。NGFと同じように（Hartikka,J.およびHefti,
F.,1988,J.Neurosci.８:2967−2985）、この作用は、細
胞密度が低い時にもっとも明白であった。おもしろいこ
とに、NGFおよびBDNFを同時添加すると、いずれか一方
の成長因子だけの存在下で観察されるレベルを越えてAC
hE陽性細胞の数をさらに増大させるには効果がなかっ
た。この観察は、BDNFおよびNGFが中隔コリン作動性ニ
ューロンの同じ集団に主に作用することを強く示唆す
る。
NGFについて当初報告されるように（Heftiら、1985,N
eurocscience １:55−68）、BDNFは比較的高い細胞密度
で樹立された培養物中のコリン作動性ニューロンの生存
を増大させなかった。塗布した細胞の割合として、何ら
神経栄養因子が存在しない場合さえもコリン作動性ニュ
ーロンの生存は高細胞密度の時の方が低細胞密度の時よ
り高いことが見出された。これを説明しうるいくつかの
ありうる説明には、細胞−細胞接触の増大、非ニューロ
ン細胞数増大の有益な作用または内在性神経栄養因子活
性の割合以上の増大が含まれる。後者の可能性によって
は、我々は内在のNGFのレベルが実質的に増大すること
を示すものを全く見出せなかった。なぜなら過剰の抗−
NGFを未処理の高密度培養物に添加しても基礎的CAT活性
を20％減少させただけだったからである。かかる培養物
では、外部のNGFはCAT活性を3.4倍増大できた。
eurocscience １:55−68）、BDNFは比較的高い細胞密度
で樹立された培養物中のコリン作動性ニューロンの生存
を増大させなかった。塗布した細胞の割合として、何ら
神経栄養因子が存在しない場合さえもコリン作動性ニュ
ーロンの生存は高細胞密度の時の方が低細胞密度の時よ
り高いことが見出された。これを説明しうるいくつかの
ありうる説明には、細胞−細胞接触の増大、非ニューロ
ン細胞数増大の有益な作用または内在性神経栄養因子活
性の割合以上の増大が含まれる。後者の可能性によって
は、我々は内在のNGFのレベルが実質的に増大すること
を示すものを全く見出せなかった。なぜなら過剰の抗−
NGFを未処理の高密度培養物に添加しても基礎的CAT活性
を20％減少させただけだったからである。かかる培養物
では、外部のNGFはCAT活性を3.4倍増大できた。
タンパク質およびmRNAのレベルの両方で観察されるよ
うに、現在、NGFが培養ニューロンおよびインビボの両
方にそれ自体のレセプターの発現をアップレギュレート
しうることを示す報告が数多く存在する。この研究で
は、我々はNGF−レセプターを検出するのにIgG−192モ
ノクローナル抗体を使用した。このモノクローナル抗体
はラット感覚性ニューロンおよびラット脳の両方で特性
決定されている（Taniuchi,M.およびJohnson,E.,1985,
J.Cell Biol.101:1100−1106）。IgG−192免疫陽性ニュ
ーロンの数の増大によって示されるように、NGFが中隔
培養物におけるそのレセプターレベルをアップレギュレ
ートできるというHartikkaおよびHeftiの発見を確認す
る一方、我々はBDNFがIgG−192免疫陽性細胞の数を３倍
まで増大させることをさらに見出した。BDNFに対する応
答は25−100ng/mlの範囲の高濃度では10ng/mlで見られ
ると同じ陽性細胞数の大きな増大を生じなかった点で二
相性であった。おもしろいことに、この種の用量応答は
AChE陽性ニューロンの数のBDNFにより誘導される増大に
関して見られたそれとは全く異なっていた。後者におい
ては、BDNFの最大作用の減少は高濃度においては全く見
られなかった。低アフィニティNGFレセプターもまた同
様の親和性を以ってBDNFに結合することが最近示されて
おり、このことはNGFおよびBDNF低アフィニティレセプ
ターが同一ではないかということを示唆していることに
注目すべきである（Rodriguez−Tebarら、1990,Binding
of Brain−Derived Neurotrophic Factor to the Nerv
e Growth Factor Receptor Neuron.4,487−492）。
うに、現在、NGFが培養ニューロンおよびインビボの両
方にそれ自体のレセプターの発現をアップレギュレート
しうることを示す報告が数多く存在する。この研究で
は、我々はNGF−レセプターを検出するのにIgG−192モ
ノクローナル抗体を使用した。このモノクローナル抗体
はラット感覚性ニューロンおよびラット脳の両方で特性
決定されている（Taniuchi,M.およびJohnson,E.,1985,
J.Cell Biol.101:1100−1106）。IgG−192免疫陽性ニュ
ーロンの数の増大によって示されるように、NGFが中隔
培養物におけるそのレセプターレベルをアップレギュレ
ートできるというHartikkaおよびHeftiの発見を確認す
る一方、我々はBDNFがIgG−192免疫陽性細胞の数を３倍
まで増大させることをさらに見出した。BDNFに対する応
答は25−100ng/mlの範囲の高濃度では10ng/mlで見られ
ると同じ陽性細胞数の大きな増大を生じなかった点で二
相性であった。おもしろいことに、この種の用量応答は
AChE陽性ニューロンの数のBDNFにより誘導される増大に
関して見られたそれとは全く異なっていた。後者におい
ては、BDNFの最大作用の減少は高濃度においては全く見
られなかった。低アフィニティNGFレセプターもまた同
様の親和性を以ってBDNFに結合することが最近示されて
おり、このことはNGFおよびBDNF低アフィニティレセプ
ターが同一ではないかということを示唆していることに
注目すべきである（Rodriguez−Tebarら、1990,Binding
of Brain−Derived Neurotrophic Factor to the Nerv
e Growth Factor Receptor Neuron.4,487−492）。
BDNFおよびNGFの作用メカニズムが類似している可能
性は、BDNFがAChE活性の誘導においてNGFと同等の動力
を有するという所見により示唆された。BDNFはNGFと同
じ程度にコリン作動性ニューロンの生存を促進すること
も見出されたが、CAT酵素活性におよぼすBDNFの作用はN
GF程大きくなかった。いくつかの実験の間中ずっと、BD
NFによる最大のCAT誘導は1.8−2.6倍の範囲であり、一
方３倍より大きな値はNGFにより常に見られた。したが
って、BDNFおよびNGFの作用メカニズムにおけるいくつ
かの類似性はあるかもしれないが、それらのそれぞれの
レセプターの発現および調節においておよびCAT活性を
誘導するのに必要な第２のメッセンジャー経路へのこれ
らレセプターの結合において微妙な相異が存在すること
はおおいにありうる。
性は、BDNFがAChE活性の誘導においてNGFと同等の動力
を有するという所見により示唆された。BDNFはNGFと同
じ程度にコリン作動性ニューロンの生存を促進すること
も見出されたが、CAT酵素活性におよぼすBDNFの作用はN
GF程大きくなかった。いくつかの実験の間中ずっと、BD
NFによる最大のCAT誘導は1.8−2.6倍の範囲であり、一
方３倍より大きな値はNGFにより常に見られた。したが
って、BDNFおよびNGFの作用メカニズムにおけるいくつ
かの類似性はあるかもしれないが、それらのそれぞれの
レセプターの発現および調節においておよびCAT活性を
誘導するのに必要な第２のメッセンジャー経路へのこれ
らレセプターの結合において微妙な相異が存在すること
はおおいにありうる。
BDNFあるいはNGFにより生成されるCAT活性誘導レベル
の相異は、異なる調節経路を示すものではないかという
想定は時間的経過研究の結果から、さらに支持された。
培養中隔ニューロンはBDNFに応答してCAT活性が６日目
まで上昇しその時点で応答は高原状態と思われた。それ
とは対照的にNGFに応答するCAT活性の誘導は３日目から
12日目まで長引いて直線的上昇を示した。BDNF処理培養
物における６日目のCAT活性誘導上昇の中止はBDNFレセ
プターあるいは応答経路における必要な成分のいずれか
一方の発現における発達的変化を示すものであろう。高
密度培養物中で12日後に見られるコリン作動性ニューロ
ン（AChE陽性ニューロン）の数は外部のBDNFあるいはNG
Fとは無関係と思われるので、異なるニューロン細胞の
死はこれら２種の成長因子によるCAT活性の誘導に見ら
れる時間的経過の相異によるものではなさそうである。
の相異は、異なる調節経路を示すものではないかという
想定は時間的経過研究の結果から、さらに支持された。
培養中隔ニューロンはBDNFに応答してCAT活性が６日目
まで上昇しその時点で応答は高原状態と思われた。それ
とは対照的にNGFに応答するCAT活性の誘導は３日目から
12日目まで長引いて直線的上昇を示した。BDNF処理培養
物における６日目のCAT活性誘導上昇の中止はBDNFレセ
プターあるいは応答経路における必要な成分のいずれか
一方の発現における発達的変化を示すものであろう。高
密度培養物中で12日後に見られるコリン作動性ニューロ
ン（AChE陽性ニューロン）の数は外部のBDNFあるいはNG
Fとは無関係と思われるので、異なるニューロン細胞の
死はこれら２種の成長因子によるCAT活性の誘導に見ら
れる時間的経過の相異によるものではなさそうである。
基部前脳コリン作動性細胞のBDNF処理を含む当初の実
験において、この神経栄養因子に応答する主要細胞型で
あるニューロンまたはグリアに関してなんの仮定もなさ
れなかった。末梢ニューロンの高濃度培養物に関して行
われた研究ではBDNFが直接ニューロンに作用することを
強く示唆されるが（Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319
−328;Lindsay,1988,J.Neurosci.７:2394−2405）、本
研究において見られるBDNFのニューロン作用は大グリア
または他の非ニューロン細胞におよぼすBDNFの一次的作
用により仲介されていたであろうことが考えられる。し
かしながら、BDNFは優勢な大グリア細胞の集密単層の存
在下において、あるいは分裂インヒビター、シトシンア
ラビノシドでの処理によりグリア細胞が激減した培養物
中において、CAT活性の誘導において同じように有効で
あることが見出された。これらの実験からの興味深い観
察は、BDNFに対する用量応答曲線の形状が２つの場合に
おいて明白に相異することであった。グリア単層の存在
下において、BDNFに対する応答はBDNFの濃度増大に伴い
直線状であった。ニューロン富化培養物においては、BD
NFに対する用量応答は左に移動した。これらの結果に関
するひとつのありうる説明は、グリアをそれ自体がBDNF
レセプターを発現し、その結果ニューロン上に局在する
レセプターが利用しうるリガンドの有効濃度を低下させ
ることである。あるいはまた、星状細胞の抑制作用は、
リガンド濃度またはレセプター発現に及ぼす作用とは関
係なく間接的で、そして例えばBDNF分解がおおきく増大
することにより仲介されているのであろう。同じような
観察がHartikkaおよびHefti（Hartikka,J.およびHefti,
F.,1988,J.Neurosci:8:2967−2985）およびHoneggerお
よびLenoir（Honegger,P.およびLenoir,D.,1982,Dev.Br
ain Res.3:229−238）により報告されている。異なる脳
領域のグリア細胞はそれらに関連するニューロンの形態
に大きく影響しうることが示されている（Prochiantz
ら、1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5387−5391;Pr
ochiantzら、1981,Nature 293:570−572）。したがっ
て、中隔グリアは膜あるいは分泌性質のいずれか一方の
内的特性を有し、それがコリン作動性表現型の発現を抑
制する可能性がある。同様の検査条件下で、海馬由来の
星状細胞の調節特性は現在調査中である。
験において、この神経栄養因子に応答する主要細胞型で
あるニューロンまたはグリアに関してなんの仮定もなさ
れなかった。末梢ニューロンの高濃度培養物に関して行
われた研究ではBDNFが直接ニューロンに作用することを
強く示唆されるが（Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319
−328;Lindsay,1988,J.Neurosci.７:2394−2405）、本
研究において見られるBDNFのニューロン作用は大グリア
または他の非ニューロン細胞におよぼすBDNFの一次的作
用により仲介されていたであろうことが考えられる。し
かしながら、BDNFは優勢な大グリア細胞の集密単層の存
在下において、あるいは分裂インヒビター、シトシンア
ラビノシドでの処理によりグリア細胞が激減した培養物
中において、CAT活性の誘導において同じように有効で
あることが見出された。これらの実験からの興味深い観
察は、BDNFに対する用量応答曲線の形状が２つの場合に
おいて明白に相異することであった。グリア単層の存在
下において、BDNFに対する応答はBDNFの濃度増大に伴い
直線状であった。ニューロン富化培養物においては、BD
NFに対する用量応答は左に移動した。これらの結果に関
するひとつのありうる説明は、グリアをそれ自体がBDNF
レセプターを発現し、その結果ニューロン上に局在する
レセプターが利用しうるリガンドの有効濃度を低下させ
ることである。あるいはまた、星状細胞の抑制作用は、
リガンド濃度またはレセプター発現に及ぼす作用とは関
係なく間接的で、そして例えばBDNF分解がおおきく増大
することにより仲介されているのであろう。同じような
観察がHartikkaおよびHefti（Hartikka,J.およびHefti,
F.,1988,J.Neurosci:8:2967−2985）およびHoneggerお
よびLenoir（Honegger,P.およびLenoir,D.,1982,Dev.Br
ain Res.3:229−238）により報告されている。異なる脳
領域のグリア細胞はそれらに関連するニューロンの形態
に大きく影響しうることが示されている（Prochiantz
ら、1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5387−5391;Pr
ochiantzら、1981,Nature 293:570−572）。したがっ
て、中隔グリアは膜あるいは分泌性質のいずれか一方の
内的特性を有し、それがコリン作動性表現型の発現を抑
制する可能性がある。同様の検査条件下で、海馬由来の
星状細胞の調節特性は現在調査中である。
示したデータに基づくと、BDNFおよびNGFは両方とも
中隔コリン作動性ニューロン機能を増大させうることが
明白である。単一のニューロン集団に明らかに作用する
２つの高度に相同の神経栄養因子のありうる生理的関係
について予測することは興味がある。BDNFおよびNGFの
作用は末梢ニューロンの初期発達期間中は特に背根神経
節ニューロンのサブ集団またはそれらの前駆体上で当初
重なり合い、そしてその後分離して別個の集団に独立し
て作用することを示唆するものが幾つか存在する（Lind
sayら、1985,Dev.Biol.112:319−328;Ersberger,U.およ
びRohrer,H.,1988,Dev.Biol.126:420−432）;Barde,Y.
A.1989,Neuron.2:1525−1534）。しかしながら、これは
感覚性ニューロンのサブ集団を特定する適切なマーカー
を使用して明確に確立されたのではない。本研究は発達
期の単一時点、E17、での培養物中に樹立された胚中隔
ニューロンに焦点を合わせているので、同じような種類
の分離現象が中隔の後期発達段階でおこるという可能性
がある。したがって、BDNFあるいはNGFに対する中隔コ
リン作動性ニューロンの応答性における時間的および空
間的相異があることは興味深いことが判明しよう。
中隔コリン作動性ニューロン機能を増大させうることが
明白である。単一のニューロン集団に明らかに作用する
２つの高度に相同の神経栄養因子のありうる生理的関係
について予測することは興味がある。BDNFおよびNGFの
作用は末梢ニューロンの初期発達期間中は特に背根神経
節ニューロンのサブ集団またはそれらの前駆体上で当初
重なり合い、そしてその後分離して別個の集団に独立し
て作用することを示唆するものが幾つか存在する（Lind
sayら、1985,Dev.Biol.112:319−328;Ersberger,U.およ
びRohrer,H.,1988,Dev.Biol.126:420−432）;Barde,Y.
A.1989,Neuron.2:1525−1534）。しかしながら、これは
感覚性ニューロンのサブ集団を特定する適切なマーカー
を使用して明確に確立されたのではない。本研究は発達
期の単一時点、E17、での培養物中に樹立された胚中隔
ニューロンに焦点を合わせているので、同じような種類
の分離現象が中隔の後期発達段階でおこるという可能性
がある。したがって、BDNFあるいはNGFに対する中隔コ
リン作動性ニューロンの応答性における時間的および空
間的相異があることは興味深いことが判明しよう。
インビボにおける基底前脳コリン作動性ニューロンに
およぼすBDNFの作用を検査することは現在興味深いこと
であろう。そこでは、海馬由来のNGFはインビボにおけ
る基底前脳コリン作動性ニューロンの正常な発達および
維持にかかわっている可能性がある証拠が現在存在す
る。BDNFがインビボにおいて同様の役割を有しているか
否か確立することは興味あろう。BDNF mRNAが海馬で特
に豊富であるという最近の所見はかかる役割を裏書きし
ている。
およぼすBDNFの作用を検査することは現在興味深いこと
であろう。そこでは、海馬由来のNGFはインビボにおけ
る基底前脳コリン作動性ニューロンの正常な発達および
維持にかかわっている可能性がある証拠が現在存在す
る。BDNFがインビボにおいて同様の役割を有しているか
否か確立することは興味あろう。BDNF mRNAが海馬で特
に豊富であるという最近の所見はかかる役割を裏書きし
ている。
実施例12:プレプロBDNFから活性な成熟BDNFへの酵素的
変換 （１）材料および方法 商業上入手可能なエンドプロティナーゼArg−Ｃ（マ
ウス顎下腺から精製）を使用しhBDNFの大きな前駆体形
（プレプロBDNF）から生物学的に活性な成熟タンパク質
に酵素的に変換させた。この酵素的切断はインビトロ反
応で達成した。酵素反応における基質はCHO−DG44細胞
中で合成されたプレプロ hBDNFであり、このものは培養
培地に分泌されそして収集された。この培地は１％ウシ
胎児血清（FBS）および各１％のペニシリンおよびスト
レプトマイシンを補添したHamのF12培地（ヌクレオサイ
ドなし）から構成された。反応は５単位の酵素およびプ
ロプロhBDNFを含有する50μのCHO−DG44細胞上清を使
用し37℃にて５分間行った。これらの条件下でプレプロ
hBDNFの成熟hBDNFへの切断が達成された。
変換 （１）材料および方法 商業上入手可能なエンドプロティナーゼArg−Ｃ（マ
ウス顎下腺から精製）を使用しhBDNFの大きな前駆体形
（プレプロBDNF）から生物学的に活性な成熟タンパク質
に酵素的に変換させた。この酵素的切断はインビトロ反
応で達成した。酵素反応における基質はCHO−DG44細胞
中で合成されたプレプロ hBDNFであり、このものは培養
培地に分泌されそして収集された。この培地は１％ウシ
胎児血清（FBS）および各１％のペニシリンおよびスト
レプトマイシンを補添したHamのF12培地（ヌクレオサイ
ドなし）から構成された。反応は５単位の酵素およびプ
ロプロhBDNFを含有する50μのCHO−DG44細胞上清を使
用し37℃にて５分間行った。これらの条件下でプレプロ
hBDNFの成熟hBDNFへの切断が達成された。
（２）結果および論考 組換えhBDNF（約31,000ダルトン）のプレプロ形態
を、エンドプロティナーゼArg−Ｃを使用してインビト
ロにおいて成熟生物活性形態hBDNF（約12,000ダルト
ン）に完全にプロセシングされた。組換えヒト脳由来の
神経栄養因子は哺乳動物細胞（CHO−DG44細胞）中で好
首尾に生成された。hBDNF遺伝子はCHO細胞ゲノムに安定
に組み込まれ、そしてそのhBDNF遺伝子はメソトレキレ
ート増幅方法を使用して増幅した。組換えhBDNFは培地
に分泌され、そして生物学的に活性であることが判明し
た。代謝標識に続くSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動（15％ゲル）によると、合成された35S標識hBDNF産物
の大部分が培地中に分泌され、見かけの分子量31,000を
有するプレプロ形態として移動したことが示される（第
30図、レーン２）。野生型CHO−DG44細胞から分泌され
た35S標識タンパク質は第30図レーン１に示される。hBD
NF（見かけの分子量12,000）の成熟形態を優勢に生成さ
せるために、我々はプレプロ形態のhBDNFを酵素切断す
るインビトロ方法を設計した。
を、エンドプロティナーゼArg−Ｃを使用してインビト
ロにおいて成熟生物活性形態hBDNF（約12,000ダルト
ン）に完全にプロセシングされた。組換えヒト脳由来の
神経栄養因子は哺乳動物細胞（CHO−DG44細胞）中で好
首尾に生成された。hBDNF遺伝子はCHO細胞ゲノムに安定
に組み込まれ、そしてそのhBDNF遺伝子はメソトレキレ
ート増幅方法を使用して増幅した。組換えhBDNFは培地
に分泌され、そして生物学的に活性であることが判明し
た。代謝標識に続くSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動（15％ゲル）によると、合成された35S標識hBDNF産物
の大部分が培地中に分泌され、見かけの分子量31,000を
有するプレプロ形態として移動したことが示される（第
30図、レーン２）。野生型CHO−DG44細胞から分泌され
た35S標識タンパク質は第30図レーン１に示される。hBD
NF（見かけの分子量12,000）の成熟形態を優勢に生成さ
せるために、我々はプレプロ形態のhBDNFを酵素切断す
るインビトロ方法を設計した。
トリプシン消化産物は第30図、レーン３−６に示す。
ウシ膵臓トリプシン（Worthingtonより購入；キモトリ
プシン不含）をリン酸緩衝食塩水中に溶解させ、そして
35S標識CHO細胞hBDNFの50μ量に添加した。用いられ
たトリプシン濃度は25,50,75および100μg/mlであっ
た。35S標識した反応産物は、レーン３−６にそれぞれ
示す。酵素切断反応は37℃で５分間行った。31,000のプ
レプロ−hBDNFの標識強度の漸減は、18,500分子量産物
の増大に対応して観察された。これらの条件下において
hBDNF（分子量12,000）の成熟形は生成されなかった。
第30図、レーン７はエンドプロティナーゼArg−ＣでCHO
細胞hBDNFを酵素的に消化した後の35S標識反応産物を示
す。このArg−Ｃはマウス顎下腺から単離され、Boehrin
ger Mannheim Biochemicals,Inc.より購入。100単位の
この酵素を100μのMilli−Ｑ水を用いて凍結乾燥調製
物から再構成しそして−20℃で貯蔵した。CHO細胞hBDNF
の酵素的消化には、５単位の酵素（５μ）およびプレ
プロhBDNFを含有するCHO細胞上清からの35S−標識タン
パク質50μを用いた（第30図、レーン２）。第30図、
レーン７に見られるように、５単位のエンドプロティナ
ーゼArg−Ｃで、37℃で５分間でhBDNFのプレプロ形（分
子量31,000）をhBDNFの成熟形（分子量12,000）に変換
できた。
ウシ膵臓トリプシン（Worthingtonより購入；キモトリ
プシン不含）をリン酸緩衝食塩水中に溶解させ、そして
35S標識CHO細胞hBDNFの50μ量に添加した。用いられ
たトリプシン濃度は25,50,75および100μg/mlであっ
た。35S標識した反応産物は、レーン３−６にそれぞれ
示す。酵素切断反応は37℃で５分間行った。31,000のプ
レプロ−hBDNFの標識強度の漸減は、18,500分子量産物
の増大に対応して観察された。これらの条件下において
hBDNF（分子量12,000）の成熟形は生成されなかった。
第30図、レーン７はエンドプロティナーゼArg−ＣでCHO
細胞hBDNFを酵素的に消化した後の35S標識反応産物を示
す。このArg−Ｃはマウス顎下腺から単離され、Boehrin
ger Mannheim Biochemicals,Inc.より購入。100単位の
この酵素を100μのMilli−Ｑ水を用いて凍結乾燥調製
物から再構成しそして−20℃で貯蔵した。CHO細胞hBDNF
の酵素的消化には、５単位の酵素（５μ）およびプレ
プロhBDNFを含有するCHO細胞上清からの35S−標識タン
パク質50μを用いた（第30図、レーン２）。第30図、
レーン７に見られるように、５単位のエンドプロティナ
ーゼArg−Ｃで、37℃で５分間でhBDNFのプレプロ形（分
子量31,000）をhBDNFの成熟形（分子量12,000）に変換
できた。
hBDNFを発現するCHO細胞上清をエンドプロティナーゼ
Arg−Ｃで酵素的に処理すると、未処理上清に比較してB
DNF生物活性レベルが増大して、hBDNFを発現するCHO−D
G44細胞からの上清をエンドプロティナーゼArg−Ｃで37
℃で５分間処理した。上清200μを20単位の酵素で処
理しそして処理および未処理hBDNFの両方をE8ニワトリ
背根神経節の外植片を用いて生物活性についてアッセイ
した。hBDNF添加24時間後、神経突起伸びを定性的に採
点した。エンドプロティナーゼ処理BDNF試料が対照（未
処理）BDNF試料より有意に生物活性が高いことが一貫し
て観察された。この曲線の濃度曲線を第31図にプロット
する。
Arg−Ｃで酵素的に処理すると、未処理上清に比較してB
DNF生物活性レベルが増大して、hBDNFを発現するCHO−D
G44細胞からの上清をエンドプロティナーゼArg−Ｃで37
℃で５分間処理した。上清200μを20単位の酵素で処
理しそして処理および未処理hBDNFの両方をE8ニワトリ
背根神経節の外植片を用いて生物活性についてアッセイ
した。hBDNF添加24時間後、神経突起伸びを定性的に採
点した。エンドプロティナーゼ処理BDNF試料が対照（未
処理）BDNF試料より有意に生物活性が高いことが一貫し
て観察された。この曲線の濃度曲線を第31図にプロット
する。
結論として、精製エンドプロティナーゼArg−Ｃは不
完全にプロセシングされた前駆体分子（すなわち、プロ
BDNF）から繰み換えヒト脳由来神経栄養因子の成熟した
生物活性形を生成されるためのインビトロ酵素反応に使
用できる。この新規方法により、哺乳動物細胞培養系か
ら生物活性ヒトBDNFを効率的に大規模に生産することが
できよう。例えば、エンドプロティナーゼArg−Ｃを固
形マトリックス上に固定化して効率的なカラムクロマト
グラフィー工程を確立することができよう。
完全にプロセシングされた前駆体分子（すなわち、プロ
BDNF）から繰み換えヒト脳由来神経栄養因子の成熟した
生物活性形を生成されるためのインビトロ酵素反応に使
用できる。この新規方法により、哺乳動物細胞培養系か
ら生物活性ヒトBDNFを効率的に大規模に生産することが
できよう。例えば、エンドプロティナーゼArg−Ｃを固
形マトリックス上に固定化して効率的なカラムクロマト
グラフィー工程を確立することができよう。
実施例13:脳由来神経栄養因子はラット腹側中脳のドー
パミン作動性ニューロンの生存および成熟を促進する （１）材料および方法 （1.1）細胞培養 解離培養物はE14−E15ラット胚から切開された腹側中
脳組織の酵素的および機械的解離によって確立された。
代表的にはタイム−メイトしたSprague−Dawleyラット
からのラット胚の子２匹または３匹からのプールされた
組織をF12培地（Gibco）中で37℃で20分間トリプシン
（0.125％;Worthington）処理した。成長培地（次の補
足物を含有するMEM:グルタミン2mM、グルコース6mg/m
l、ペニシニンG 0.5U/ml、ストレプトマイシン５μg/m
l、ウシ胎児血清7.5％）で洗浄したのち、組織を低速で
５分間簡単に遠心分離し、このペレットを磨砕によって
解離した。分散されなかった細胞の塊を沈降させるため
に１〜２分間放置したのち、単離細胞懸濁液を成長培地
を含有する35mm皿（ポルオルニチンおよびラミニンでプ
レコート;Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319）の上に
蒔いて細胞密度を104細胞/cm2にした。細胞を付着せし
めるために成長培地中で１夜インキュベートしたのち、
BottensteinおよびSotoにより記載（Bottensteinおよび
Soto、1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76:514）される
が、ただしインスリン20ng/mlを含有させた、血清不含
の特定の培地中でBDNFの存在または非存在において細胞
を培養した。ドーパミン作動性細胞を可視化するために
培養物を４％ポラホルムアルデヒドで固定し、充分に洗
浄し、ウマ血清1.5％を含有するSorensen緩衝液中での
0.02％サポニンを用いて透過性となし、ラットTHに対す
るマウスモノクローナル抗体（Boehringer−Mannheim）
で染色した。一次抗体結合はVectastain ABCキット（Ve
ctor Labs）を用いて可視化した。
パミン作動性ニューロンの生存および成熟を促進する （１）材料および方法 （1.1）細胞培養 解離培養物はE14−E15ラット胚から切開された腹側中
脳組織の酵素的および機械的解離によって確立された。
代表的にはタイム−メイトしたSprague−Dawleyラット
からのラット胚の子２匹または３匹からのプールされた
組織をF12培地（Gibco）中で37℃で20分間トリプシン
（0.125％;Worthington）処理した。成長培地（次の補
足物を含有するMEM:グルタミン2mM、グルコース6mg/m
l、ペニシニンG 0.5U/ml、ストレプトマイシン５μg/m
l、ウシ胎児血清7.5％）で洗浄したのち、組織を低速で
５分間簡単に遠心分離し、このペレットを磨砕によって
解離した。分散されなかった細胞の塊を沈降させるため
に１〜２分間放置したのち、単離細胞懸濁液を成長培地
を含有する35mm皿（ポルオルニチンおよびラミニンでプ
レコート;Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319）の上に
蒔いて細胞密度を104細胞/cm2にした。細胞を付着せし
めるために成長培地中で１夜インキュベートしたのち、
BottensteinおよびSotoにより記載（Bottensteinおよび
Soto、1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76:514）される
が、ただしインスリン20ng/mlを含有させた、血清不含
の特定の培地中でBDNFの存在または非存在において細胞
を培養した。ドーパミン作動性細胞を可視化するために
培養物を４％ポラホルムアルデヒドで固定し、充分に洗
浄し、ウマ血清1.5％を含有するSorensen緩衝液中での
0.02％サポニンを用いて透過性となし、ラットTHに対す
るマウスモノクローナル抗体（Boehringer−Mannheim）
で染色した。一次抗体結合はVectastain ABCキット（Ve
ctor Labs）を用いて可視化した。
（1.2）ドーパミン取り込みの測定 前記（1.1）に記載のようにして培養物を調製し、ブ
タBDNF 50ng/mlの存在または非存在のいずれかにおいて
数日間インキュベートして成長させた。ドーパミン取り
込みは３通りの培養物において指示された時点で測定し
た。細胞を次の組成の取り込み緩衝液で予備洗浄した:1
36.8mM NaCl,2.7mM KCl,8mM Na2HPO4・7H2O,1.5mM KH2P
O4,5mMグルコース,1mM CaCl2,1mM MgSO4,0.1mMアスコル
ベートおよび0.1mMパルジリン,pH7.4。非ニューロン性3
H−ドーパミン取り込みについて測定しようとするこれ
らのサンプルは、取り込み緩衝液中に５μＭの濃度で含
有されたベンゾトロピン（BZT）を有していた。洗浄の
のち細胞を新鮮な取り込み緩衝液中で37℃に５分間予熱
し、この時点で3H−ドーパミン（NEN、40Ci/mモル）を5
0nMの最終濃度になるように添加した。培養物を37℃で1
5分間インキュベーションし、取り込み溶液を除去し、
細胞を氷上に置き、氷冷した取り込み緩衝液で４回洗浄
した。培養皿に0.5N NaOHを添加して細胞を収穫し、NaO
H抽出物をUltima Goldシンチレーション液（Packard In
struments）15mlを有するベックマンシンチレーション
カウンターでカウントした。特異的ニューロン性ドーパ
ミン取り込みはBZT非存在下に観察された取り込み（cp
m）からBZT存在下に観察された値を差引いた値と定義さ
れる。普通は総取り込みの70〜90％をBZTにより阻害で
きる。複製培養物において各時点でTH＋ニューロン数は
免疫細胞化学的染色により測定し、その示された結果は
TH＋１個に基づいて標準化された取り込みを表わす。
タBDNF 50ng/mlの存在または非存在のいずれかにおいて
数日間インキュベートして成長させた。ドーパミン取り
込みは３通りの培養物において指示された時点で測定し
た。細胞を次の組成の取り込み緩衝液で予備洗浄した:1
36.8mM NaCl,2.7mM KCl,8mM Na2HPO4・7H2O,1.5mM KH2P
O4,5mMグルコース,1mM CaCl2,1mM MgSO4,0.1mMアスコル
ベートおよび0.1mMパルジリン,pH7.4。非ニューロン性3
H−ドーパミン取り込みについて測定しようとするこれ
らのサンプルは、取り込み緩衝液中に５μＭの濃度で含
有されたベンゾトロピン（BZT）を有していた。洗浄の
のち細胞を新鮮な取り込み緩衝液中で37℃に５分間予熱
し、この時点で3H−ドーパミン（NEN、40Ci/mモル）を5
0nMの最終濃度になるように添加した。培養物を37℃で1
5分間インキュベーションし、取り込み溶液を除去し、
細胞を氷上に置き、氷冷した取り込み緩衝液で４回洗浄
した。培養皿に0.5N NaOHを添加して細胞を収穫し、NaO
H抽出物をUltima Goldシンチレーション液（Packard In
struments）15mlを有するベックマンシンチレーション
カウンターでカウントした。特異的ニューロン性ドーパ
ミン取り込みはBZT非存在下に観察された取り込み（cp
m）からBZT存在下に観察された値を差引いた値と定義さ
れる。普通は総取り込みの70〜90％をBZTにより阻害で
きる。複製培養物において各時点でTH＋ニューロン数は
免疫細胞化学的染色により測定し、その示された結果は
TH＋１個に基づいて標準化された取り込みを表わす。
（1.3）BDNFのトランジション発現 hBDNFをコードする配列を含有するベクターCDM8でCOS
M5細胞をトランスフェクションした。トランスフェク
ションの72時間後に培養物上清液50mlを集め、6M尿素に
対して透析した。透析上清液を次いでアンホリン（amph
olines）（pH3.5〜10、BioRad）と4.5時間混合した。フ
ラクションを集め、そして非特異的吸収を防ぐためにBS
A（0.5mg/ml）で予備洗浄した透析管を用いて25mM NaH2
PO4緩衝液pH7.6に対して透析した。フラクションをE8ニ
ワトリ背根神経節外植片の培養物中で神経突起伸長促進
活性についてアッセイした。活性フラクションをプール
した。８〜18％ゲル上のSDS PAGEおよびそれに続く銀染
色（Wrayら、1981,Anal.Biochem.118:197）により活性
プールを分析すると、BSAに対応する68kDにフェイント
バンド、および先にブタBDNFについて観察されたもの
（Bardeら、1982,EMBO J.1:549）（データは示されな
い）に対応する約12kDに単一バンドが示された。ナワト
リ背根、節状および交感神経節外植片について行った比
較バイオアッセイにおいて、精製組換えBDNFの特異的活
性およびニューロン性特異性は精製ブタBDNFのそれに類
似していた。
M5細胞をトランスフェクションした。トランスフェク
ションの72時間後に培養物上清液50mlを集め、6M尿素に
対して透析した。透析上清液を次いでアンホリン（amph
olines）（pH3.5〜10、BioRad）と4.5時間混合した。フ
ラクションを集め、そして非特異的吸収を防ぐためにBS
A（0.5mg/ml）で予備洗浄した透析管を用いて25mM NaH2
PO4緩衝液pH7.6に対して透析した。フラクションをE8ニ
ワトリ背根神経節外植片の培養物中で神経突起伸長促進
活性についてアッセイした。活性フラクションをプール
した。８〜18％ゲル上のSDS PAGEおよびそれに続く銀染
色（Wrayら、1981,Anal.Biochem.118:197）により活性
プールを分析すると、BSAに対応する68kDにフェイント
バンド、および先にブタBDNFについて観察されたもの
（Bardeら、1982,EMBO J.1:549）（データは示されな
い）に対応する約12kDに単一バンドが示された。ナワト
リ背根、節状および交感神経節外植片について行った比
較バイオアッセイにおいて、精製組換えBDNFの特異的活
性およびニューロン性特異性は精製ブタBDNFのそれに類
似していた。
（1.4）トランスフェクションされたCHO細胞からのヒト
BDNFの産生 CHO−DG44細胞はL.Chasin博士（Columbia Univercit
y,NY）からの厚意により提供された。これらの細胞はジ
ヒドロ葉酸レダクターゼが欠けていた（dhrf−）（Urla
ubおよびChasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77:4216
−4220）。CHO−DG44細胞をウシ胎児血清10％、ペニシ
リンおよびストレプトマイシン１％、およびグルタミン
2mMを含有するHamのF12培地中に保持した。細胞を毎週
２回継代し、マイコプラズマ汚染について検査した。す
べてのプラスミドDNAをトランスフェクションする前に
二重塩セシウムバンディングにより精製した。ヒト脳由
来神経栄養因子遺伝子を先に記載されたように（Maison
pierreら、1990,Science 247:1446−1451）、哺乳類発
現ベクターpCDM8にサブクローニングしてpC8hBを生成さ
せた。弱められたジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子p410
はL.Chasin博士の厚意により提供された。これらの二つ
の遺伝子構築物をエレクトロポレーション（Shigekawa
およびDower,1988,Biotechniques 6:742−751で概説さ
れている）によりCHO−DG44細胞に同時トランスフェク
ションした。pC8hB20μｇおよびp410 0.2μｇを用いて
約１×106細胞をトランスフェションした。トランスフ
ェクションの48時間後に、CHO−DG44細胞をヌクレオチ
ド不含のHam F12（チミジンおよびヒポキサンチン不
含；−HT）プラス透析ウシ胎児血清10％およびペニリシ
ンおよびストレプトマイシン１％から成る選択培地中に
分配した。ヌクレオチド不含選択培地中に細胞を入れて
から約10日後に個々のコロニーを単離した。ヌクレオシ
ド不含のHam F12（−HT）培地中での成長に対して耐性
を有する選択された個々のコロニーを、0.02、0.05また
は0.1μＭメトトレキサート（MTX）のいずれかで処理し
て遺伝子増幅を誘発させた（Altら、1978,J.Biol.Chem.
253:1357−1370）。MTX−耐性コロニーをプールとして
培養し、さらに1.5、2.0または2.5μM MTXのいずれかで
増幅させた。2.5μM MTXに耐性の一つのコロニーを単離
し、そしてhBDNFのスケールアップ培養および生成につ
いて選択した。このクローン（DGZ1000−Ｂ−３−2.5）
のサザンプロッティング分析は野性型CHO−DG44細胞に
比して約50倍のBDNF遺伝子の増幅を示した。胚性（E8）
ニワトリ背根神経節（DRG）の外植片によるバイオアッ
セイを用いてこのクローンが約9.5μｇのhBDNF/mlを産
生することを評価した（示されず）。組み換え体hBDNF
は480cm2のローラービン中でのDGZ 1000−Ｂ−３−2.5
細胞の培養によって大規模に産生された。これらの細胞
が集密に達したち約４日後に培地を収穫した。培養物上
清液からのhBDNFの精製はCOS上清液に関して上記したよ
うに行った。
BDNFの産生 CHO−DG44細胞はL.Chasin博士（Columbia Univercit
y,NY）からの厚意により提供された。これらの細胞はジ
ヒドロ葉酸レダクターゼが欠けていた（dhrf−）（Urla
ubおよびChasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77:4216
−4220）。CHO−DG44細胞をウシ胎児血清10％、ペニシ
リンおよびストレプトマイシン１％、およびグルタミン
2mMを含有するHamのF12培地中に保持した。細胞を毎週
２回継代し、マイコプラズマ汚染について検査した。す
べてのプラスミドDNAをトランスフェクションする前に
二重塩セシウムバンディングにより精製した。ヒト脳由
来神経栄養因子遺伝子を先に記載されたように（Maison
pierreら、1990,Science 247:1446−1451）、哺乳類発
現ベクターpCDM8にサブクローニングしてpC8hBを生成さ
せた。弱められたジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子p410
はL.Chasin博士の厚意により提供された。これらの二つ
の遺伝子構築物をエレクトロポレーション（Shigekawa
およびDower,1988,Biotechniques 6:742−751で概説さ
れている）によりCHO−DG44細胞に同時トランスフェク
ションした。pC8hB20μｇおよびp410 0.2μｇを用いて
約１×106細胞をトランスフェションした。トランスフ
ェクションの48時間後に、CHO−DG44細胞をヌクレオチ
ド不含のHam F12（チミジンおよびヒポキサンチン不
含；−HT）プラス透析ウシ胎児血清10％およびペニリシ
ンおよびストレプトマイシン１％から成る選択培地中に
分配した。ヌクレオチド不含選択培地中に細胞を入れて
から約10日後に個々のコロニーを単離した。ヌクレオシ
ド不含のHam F12（−HT）培地中での成長に対して耐性
を有する選択された個々のコロニーを、0.02、0.05また
は0.1μＭメトトレキサート（MTX）のいずれかで処理し
て遺伝子増幅を誘発させた（Altら、1978,J.Biol.Chem.
253:1357−1370）。MTX−耐性コロニーをプールとして
培養し、さらに1.5、2.0または2.5μM MTXのいずれかで
増幅させた。2.5μM MTXに耐性の一つのコロニーを単離
し、そしてhBDNFのスケールアップ培養および生成につ
いて選択した。このクローン（DGZ1000−Ｂ−３−2.5）
のサザンプロッティング分析は野性型CHO−DG44細胞に
比して約50倍のBDNF遺伝子の増幅を示した。胚性（E8）
ニワトリ背根神経節（DRG）の外植片によるバイオアッ
セイを用いてこのクローンが約9.5μｇのhBDNF/mlを産
生することを評価した（示されず）。組み換え体hBDNF
は480cm2のローラービン中でのDGZ 1000−Ｂ−３−2.5
細胞の培養によって大規模に産生された。これらの細胞
が集密に達したち約４日後に培地を収穫した。培養物上
清液からのhBDNFの精製はCOS上清液に関して上記したよ
うに行った。
（２）結果および論考 ニューロン生存および標的神経支配の特異性を制御す
る分子シグナルの特性決定は、神経系がどのように形成
されるのかの解明に役立つばかりでなく、成熟ニューロ
ンを適切なシナプス配置に保持し修復することに関する
メカニズムのより良好な理解に導くとも思われるので、
根本的に重要である。ニューロンの生存および保存は特
定の標的細胞由来神経栄養因子次第であることが広く認
められているが（Levi−MontalciniおよびAngeletti,19
68,Physiol.Rev.48:534;Thoenen and Barde,1980,Physi
ol.Rev.,60:1284;Purv es,D.,1988,Body and Brain,Har
vard University Press,Cambridge,MA.;Barde,Y.A.,198
9,Neuron,2:1525;Lindsay,R.M.1988,The Making of the
Nervous System,Oxford University Press,Oxford,p14
8）、かかる分子の極めてわずかしか十分に特性決定さ
れていない。今日、二つの神経栄養因子、神経成長因子
（NGF）および脳由来栄養因子（BDNF）についてだけ、
インビボでの明察なニューロン集団の生存を選択的に支
持することが示されている（Levi−MontalciniおよびAn
geletti,1968,Physiol.Rev.48:534;Barde,Y.A.,1989,Ne
uron,2:1525;Leibrockら、1989,Nature 341:149）。
る分子シグナルの特性決定は、神経系がどのように形成
されるのかの解明に役立つばかりでなく、成熟ニューロ
ンを適切なシナプス配置に保持し修復することに関する
メカニズムのより良好な理解に導くとも思われるので、
根本的に重要である。ニューロンの生存および保存は特
定の標的細胞由来神経栄養因子次第であることが広く認
められているが（Levi−MontalciniおよびAngeletti,19
68,Physiol.Rev.48:534;Thoenen and Barde,1980,Physi
ol.Rev.,60:1284;Purv es,D.,1988,Body and Brain,Har
vard University Press,Cambridge,MA.;Barde,Y.A.,198
9,Neuron,2:1525;Lindsay,R.M.1988,The Making of the
Nervous System,Oxford University Press,Oxford,p14
8）、かかる分子の極めてわずかしか十分に特性決定さ
れていない。今日、二つの神経栄養因子、神経成長因子
（NGF）および脳由来栄養因子（BDNF）についてだけ、
インビボでの明察なニューロン集団の生存を選択的に支
持することが示されている（Levi−MontalciniおよびAn
geletti,1968,Physiol.Rev.48:534;Barde,Y.A.,1989,Ne
uron,2:1525;Leibrockら、1989,Nature 341:149）。
ニューロン細胞培養物は細胞および組織抽出物中での
神経栄養活性についてのバイオアッセイを確立するため
に（Levi−MontalciniおよびAngeletti,1968,Physiol.R
ev.48:534;ThoenenおよびBarde,1980,Physiol,Rev.,60:
1284;Lindsay,R.M.1988,The Making of the Nervous Sy
stem,OxfordUniversity Press,Oxford,p.148;Varonおよ
びAdler,1981,Adv.Cell.Neurobiol.,2:118）、そして精
神神経栄養因子のニューロン特異性を決定するために
（Ebendal,T.,1989,Nerve Growth Factors,John Wiley,
London,p.81;Barbinら、1984,J.Neurochem.43:1468;Bar
deら、1982,EMBO J.1:549;Daviesら、1986,J.Neurosci.
6:1897;Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319）広く用い
られている。今日、大部分の研究は末梢神経系（PNS）
のニューロンの種々のクラスの神経栄養的必要条件に集
中している。NGFは入手可能であるゆえを断然十分に特
性決定された神経栄養因子として確立されている:NGFは
インビボおよびインビトロの両方においてPNSおよびCNS
の両方のニューロンサブ集団の生存および保持にとって
必須であることが示されてる（Levi−Montalciniおよび
Angeletti,1968,Physiol.Rev.48:534;ThoenenおよびBar
de,1980,Physiol,Rev.,60:1284;WhittemoreおよびSeige
r,1987,Brain Res.Rev.12:439;Snider and Johnson,198
9,Ann.Neurol.26:489;Heftiら、1989,Neurobiology of
Aging 10:515;Martinezら、1987,Brain Res.412:295;Te
keiら、1988,J.Neurochem.51:1118;HartikkaおよびHeft
i,1988,J.Neurosci.8:2967）。NGF以外の神経栄養因子
の精製調節物の入手可能性が限られており、そして特定
のニューロン集団の均質調節物の調製が困難であるた
め、特定のCNSニューロンに関する神経栄養成長因子の
同定が妨げれてきた。最近の二つの観察により、CNS
（黒質）ドーパミン作動性ニューロン生存に及ぼすBDNF
の作用の研究を促進させた。第一に、BDNF遺伝子はCNS
中でそしてNGF遺伝子よりも比較的にまたはより高いレ
ベルで発現されることが現在明らかである（Leibroek
ら、1989,Nature 34:149）。第二に、BDNFの特性と見掛
け上類似する特性を有するウシ線条体から部分的に精製
されたタンパク質（黒異質ドーパミン作動性ニューロン
の標識）は中脳から調製されたドーパミン作動性ニュー
ロンのインビトロ生存を増大させうることが報告されて
いる（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci,8:733）。
神経栄養活性についてのバイオアッセイを確立するため
に（Levi−MontalciniおよびAngeletti,1968,Physiol.R
ev.48:534;ThoenenおよびBarde,1980,Physiol,Rev.,60:
1284;Lindsay,R.M.1988,The Making of the Nervous Sy
stem,OxfordUniversity Press,Oxford,p.148;Varonおよ
びAdler,1981,Adv.Cell.Neurobiol.,2:118）、そして精
神神経栄養因子のニューロン特異性を決定するために
（Ebendal,T.,1989,Nerve Growth Factors,John Wiley,
London,p.81;Barbinら、1984,J.Neurochem.43:1468;Bar
deら、1982,EMBO J.1:549;Daviesら、1986,J.Neurosci.
6:1897;Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319）広く用い
られている。今日、大部分の研究は末梢神経系（PNS）
のニューロンの種々のクラスの神経栄養的必要条件に集
中している。NGFは入手可能であるゆえを断然十分に特
性決定された神経栄養因子として確立されている:NGFは
インビボおよびインビトロの両方においてPNSおよびCNS
の両方のニューロンサブ集団の生存および保持にとって
必須であることが示されてる（Levi−Montalciniおよび
Angeletti,1968,Physiol.Rev.48:534;ThoenenおよびBar
de,1980,Physiol,Rev.,60:1284;WhittemoreおよびSeige
r,1987,Brain Res.Rev.12:439;Snider and Johnson,198
9,Ann.Neurol.26:489;Heftiら、1989,Neurobiology of
Aging 10:515;Martinezら、1987,Brain Res.412:295;Te
keiら、1988,J.Neurochem.51:1118;HartikkaおよびHeft
i,1988,J.Neurosci.8:2967）。NGF以外の神経栄養因子
の精製調節物の入手可能性が限られており、そして特定
のニューロン集団の均質調節物の調製が困難であるた
め、特定のCNSニューロンに関する神経栄養成長因子の
同定が妨げれてきた。最近の二つの観察により、CNS
（黒質）ドーパミン作動性ニューロン生存に及ぼすBDNF
の作用の研究を促進させた。第一に、BDNF遺伝子はCNS
中でそしてNGF遺伝子よりも比較的にまたはより高いレ
ベルで発現されることが現在明らかである（Leibroek
ら、1989,Nature 34:149）。第二に、BDNFの特性と見掛
け上類似する特性を有するウシ線条体から部分的に精製
されたタンパク質（黒異質ドーパミン作動性ニューロン
の標識）は中脳から調製されたドーパミン作動性ニュー
ロンのインビトロ生存を増大させうることが報告されて
いる（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci,8:733）。
第3A図は培養９日後の解離された腹側中脳細胞の代表
的に外観を示す。線繊芽細胞形態の２〜３の細胞が明ら
かに示されており、大グリアマーカー、グリア原線維酸
性タンパク質に関する抗体で培養物を染色した場合に
（GFAP;Bignamiら、1972,Brain Res.43:429）、大グリ
ア細胞は検出されなかった。これらの培養におけるドー
パミン作動性ニューロンを可視化するために、THに対す
るモノクローナル抗体を用いて免疫細胞化学的染色を行
った。予想されたように、TH＋ニューロン数は少なく
（第32B、32C図、矢印）、そして培養時間に応じて塗布
した細胞の0.1〜0.5％の間で変化した。種々のニューロ
ン形態が第33図に示すようにTH＋細胞中に認められた。
的に外観を示す。線繊芽細胞形態の２〜３の細胞が明ら
かに示されており、大グリアマーカー、グリア原線維酸
性タンパク質に関する抗体で培養物を染色した場合に
（GFAP;Bignamiら、1972,Brain Res.43:429）、大グリ
ア細胞は検出されなかった。これらの培養におけるドー
パミン作動性ニューロンを可視化するために、THに対す
るモノクローナル抗体を用いて免疫細胞化学的染色を行
った。予想されたように、TH＋ニューロン数は少なく
（第32B、32C図、矢印）、そして培養時間に応じて塗布
した細胞の0.1〜0.5％の間で変化した。種々のニューロ
ン形態が第33図に示すようにTH＋細胞中に認められた。
すべての培養物において、インビボで最初の３〜４日
後にTH＋細胞数は一貫して徐々に低下した（第34A図、
第35図）。８日の培養までに、例えば対照培養物中のTH
＋細胞数は２日目の同様の培養物で見出された数の25％
にすぎなかった（第35図）。しかしながら、BDNFで処理
した培養物中ではTH＋細胞の損失は対照と比較して大き
く減少した。インビトロで８日後に調べたすべての場合
に、BDNF処理培養物中のTH＋細胞数は未処理対照の場合
よりも多く、例えばBDNFの１回添加後に1.8倍高く（第3
4A図）、数回添加後は５倍高かった（第35図）。８日間
保持した培養物に１回だけ添加した場合でさえも、BDNF
の効果は用量に依存することが見出された（第34B
図）。先の報告（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:733;
Knuselら、1990、J.Neuroscii,10:558）と一致して、NG
F（50ng/ml）はTH＋細胞数に対して影響を及ぼさなかっ
た（第34C図）。
後にTH＋細胞数は一貫して徐々に低下した（第34A図、
第35図）。８日の培養までに、例えば対照培養物中のTH
＋細胞数は２日目の同様の培養物で見出された数の25％
にすぎなかった（第35図）。しかしながら、BDNFで処理
した培養物中ではTH＋細胞の損失は対照と比較して大き
く減少した。インビトロで８日後に調べたすべての場合
に、BDNF処理培養物中のTH＋細胞数は未処理対照の場合
よりも多く、例えばBDNFの１回添加後に1.8倍高く（第3
4A図）、数回添加後は５倍高かった（第35図）。８日間
保持した培養物に１回だけ添加した場合でさえも、BDNF
の効果は用量に依存することが見出された（第34B
図）。先の報告（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:733;
Knuselら、1990、J.Neuroscii,10:558）と一致して、NG
F（50ng/ml）はTH＋細胞数に対して影響を及ぼさなかっ
た（第34C図）。
これらの培養物中のドーパミン作動性ニューロンに対
するBDNFの作用を調べる他の方法として、3H−ドーパミ
ンを取り込むTH＋細胞の能力を研究した。第Ｘ表に示す
ように、ドーパミン取り込み能（TH＋ニューロン１個に
ついて標準化）は培養の最初の８日にわたり著しく増大
したが、それ以後は低下した。しかしながら、BDNFはド
ーパミンを取り込むTH＋細胞の能力を変化させないこと
が見出させた。BDNFの存在または非存在下において同じ
時間的経過および同様の値が得られたからである（第Ｘ
表）。我々はこの結果から、おそらくBDNFは、生存にBD
NFを必ずしも必要としないニューロンにおけるドーパミ
ン作動性表現型の発現を誘導するのと反対に中能培養物
中のドーパミン作動性ニューロンの生存を直接に促進す
るように働らくという仮説を設けた。このことをさらに
調べるために、BDNF添加を最初に数日間遅れさせた培養
物中におけるTH＋ニューロン数を測定する実験を行っ
た。我々はBDNF添加を５日まで遅れさせ、次いでTH＋細
胞数を６日、８日または10日に測定すると、これらの培
養物中ではBDNFを２日目以後に存在させた平行培養物と
比較してより少数のドーパミン作動性細胞しか認められ
ないことを見出した（第36図）。BDNFの遅れた添加は対
照と比較してTH＋ニューロン数を明らかに増加させる
が、同等の時点で調べた場合でさえも遅れた添加の効果
はBDNFを２日目に添加した場合ほど多くのTH＋ニューロ
ンを救わなかった。
するBDNFの作用を調べる他の方法として、3H−ドーパミ
ンを取り込むTH＋細胞の能力を研究した。第Ｘ表に示す
ように、ドーパミン取り込み能（TH＋ニューロン１個に
ついて標準化）は培養の最初の８日にわたり著しく増大
したが、それ以後は低下した。しかしながら、BDNFはド
ーパミンを取り込むTH＋細胞の能力を変化させないこと
が見出させた。BDNFの存在または非存在下において同じ
時間的経過および同様の値が得られたからである（第Ｘ
表）。我々はこの結果から、おそらくBDNFは、生存にBD
NFを必ずしも必要としないニューロンにおけるドーパミ
ン作動性表現型の発現を誘導するのと反対に中能培養物
中のドーパミン作動性ニューロンの生存を直接に促進す
るように働らくという仮説を設けた。このことをさらに
調べるために、BDNF添加を最初に数日間遅れさせた培養
物中におけるTH＋ニューロン数を測定する実験を行っ
た。我々はBDNF添加を５日まで遅れさせ、次いでTH＋細
胞数を６日、８日または10日に測定すると、これらの培
養物中ではBDNFを２日目以後に存在させた平行培養物と
比較してより少数のドーパミン作動性細胞しか認められ
ないことを見出した（第36図）。BDNFの遅れた添加は対
照と比較してTH＋ニューロン数を明らかに増加させる
が、同等の時点で調べた場合でさえも遅れた添加の効果
はBDNFを２日目に添加した場合ほど多くのTH＋ニューロ
ンを救わなかった。
合わせて考えると、これらの結果はBDNFは一定の細胞
数以内でTH−遺伝子発現を増加させるようにのみ働らく
という可能性に反対の議論を指示し、そしてBDNFは、そ
の効果を、この神経栄養因子が早期段階で培養物に添加
されない場合には失われるドーパミン作動性ニューロン
の生存を増大させることによってその作用を発揮するこ
とを示唆する。
数以内でTH−遺伝子発現を増加させるようにのみ働らく
という可能性に反対の議論を指示し、そしてBDNFは、そ
の効果を、この神経栄養因子が早期段階で培養物に添加
されない場合には失われるドーパミン作動性ニューロン
の生存を増大させることによってその作用を発揮するこ
とを示唆する。
いくつかの報告は標的由来の抽出物または種々の成長
因子のいずれかによる中脳ドーパミン作動性ニューロン
のインビボでの成熟および生存の向上の刺激を詳述して
いる（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci,8:733;Knuselら、
1990,J.Neurosci.10:558;Prochiantzら、1979,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 76:5387;Diporzioら、1980,Nature 28
8:370;Prochiantzら、1981,Nature 293;570;Denis−Don
iniら、1983,J.Neurosci.3:2292）。しかしながら、グ
リア細胞も高められた細胞分裂も全く存在しない下での
TH＋ニューロンの生存を直接にかつ選択的に支持する十
分に精製された分子についての報告（例えばIGF−１ま
たはFCFにより観察されたようなもの、Dal Tosoら、198
8,J.Neurosci 8:733）はこれまではない。早期マウス胎
児組織を用いる先の報告（Dal Tosoら、1988,J.Neurosc
i 8:733）と一致して、血清不含の特定培地中で培養さ
れたE14ラット腹側中能細胞は星状細胞または線維芽細
胞を実質的に含有しないことが見出された。本研究に用
いられた500,000細胞/cm2なる比較的に低い細胞塗布密
度は任意のありうる内因性神経栄養活性の作用を低下さ
せ、そしてより正確な細胞カウンティングが可能となっ
た。ここに提示された結果を考慮すると、神経栄養因子
特にDal Tosoらによりウシ線条体から精製されたもの
（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:733）はBDNFである
と思われる。これはBDNFが線条体中で産生され、そして
黒質から突起するドーパミン作動性ニューロンの末端に
より取り込まれることを示唆する。しかしながら今まで
のところ、BDNFに関するmRNAまたは他のニューロトロフ
ィンファミリーのメンバーに関するmRNAもが線条体組織
中に豊富であることはノーザンプロット分析では見出さ
れていない。
因子のいずれかによる中脳ドーパミン作動性ニューロン
のインビボでの成熟および生存の向上の刺激を詳述して
いる（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci,8:733;Knuselら、
1990,J.Neurosci.10:558;Prochiantzら、1979,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 76:5387;Diporzioら、1980,Nature 28
8:370;Prochiantzら、1981,Nature 293;570;Denis−Don
iniら、1983,J.Neurosci.3:2292）。しかしながら、グ
リア細胞も高められた細胞分裂も全く存在しない下での
TH＋ニューロンの生存を直接にかつ選択的に支持する十
分に精製された分子についての報告（例えばIGF−１ま
たはFCFにより観察されたようなもの、Dal Tosoら、198
8,J.Neurosci 8:733）はこれまではない。早期マウス胎
児組織を用いる先の報告（Dal Tosoら、1988,J.Neurosc
i 8:733）と一致して、血清不含の特定培地中で培養さ
れたE14ラット腹側中能細胞は星状細胞または線維芽細
胞を実質的に含有しないことが見出された。本研究に用
いられた500,000細胞/cm2なる比較的に低い細胞塗布密
度は任意のありうる内因性神経栄養活性の作用を低下さ
せ、そしてより正確な細胞カウンティングが可能となっ
た。ここに提示された結果を考慮すると、神経栄養因子
特にDal Tosoらによりウシ線条体から精製されたもの
（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:733）はBDNFである
と思われる。これはBDNFが線条体中で産生され、そして
黒質から突起するドーパミン作動性ニューロンの末端に
より取り込まれることを示唆する。しかしながら今まで
のところ、BDNFに関するmRNAまたは他のニューロトロフ
ィンファミリーのメンバーに関するmRNAもが線条体組織
中に豊富であることはノーザンプロット分析では見出さ
れていない。
BDNFの添加は数回添加の場合でさえも、分析された培
養期間中に黒質ドーパミン作動性ニューロンの完全な生
存を生じさせないことが明らかである。この現象はDal
Tosoらにより我々の条件と極めて類似する実験条件です
でに観察されており（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:
733）、彼らはこの損失が用いた細胞密度と関連するで
あろうこと、すなわち細胞密度が高いほど（ここで用い
た密度の４倍）より多数のカテコールアミン−蛍光細胞
が見られ、そしてこれらの細胞の自然消失が減少したこ
とを示した。
養期間中に黒質ドーパミン作動性ニューロンの完全な生
存を生じさせないことが明らかである。この現象はDal
Tosoらにより我々の条件と極めて類似する実験条件です
でに観察されており（Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:
733）、彼らはこの損失が用いた細胞密度と関連するで
あろうこと、すなわち細胞密度が高いほど（ここで用い
た密度の４倍）より多数のカテコールアミン−蛍光細胞
が見られ、そしてこれらの細胞の自然消失が減少したこ
とを示した。
さらなる研究特にインビボでの腹側中脳のドーパミン
作動性ニューロンの発達および保持に対するBDNFの効果
を調べることに関する研究が、ここに記載したBDNFの効
果の生理学的関連性を決定するために必要であろう。パ
ーキンソン病において黒質ドーパミン作動性ニューロン
が特異的に損失されることからみて、これらの細胞に選
択的に影響を及ぼす神経栄養因子を発見することが特に
望まれる。従ってNGF不応性細胞であるこれらのニュー
ロンの生存をBDNFが支持するという本発明の発見は、BD
NFが６−ヒドロキシドーパミンまたはMPTP（１−メチル
−４−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン）の
いずれかの神経毒作用からドーパミン作動性ニューロン
を保護できるかどうかを決定する動物実験に関する理論
的根拠を提供するものである。かかる研究はパーキンソ
ン症候群に対する新規な治療法をもたらすであろう。
作動性ニューロンの発達および保持に対するBDNFの効果
を調べることに関する研究が、ここに記載したBDNFの効
果の生理学的関連性を決定するために必要であろう。パ
ーキンソン病において黒質ドーパミン作動性ニューロン
が特異的に損失されることからみて、これらの細胞に選
択的に影響を及ぼす神経栄養因子を発見することが特に
望まれる。従ってNGF不応性細胞であるこれらのニュー
ロンの生存をBDNFが支持するという本発明の発見は、BD
NFが６−ヒドロキシドーパミンまたはMPTP（１−メチル
−４−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン）の
いずれかの神経毒作用からドーパミン作動性ニューロン
を保護できるかどうかを決定する動物実験に関する理論
的根拠を提供するものである。かかる研究はパーキンソ
ン症候群に対する新規な治療法をもたらすであろう。
実施例14:BDNFはガンマーアミノ酪酸取り込みの用量依
存性阻害を生じさせる （１）材料および方法 （1.1）海馬細胞培養物 Sprague−DawleyラットのE18−19ラット胚から海馬を
切開し、F10培地中に集めた。この組織を細切し、F10培
地（Gibco）で２回洗浄し、0.25％トリプシン（Gibco）
を用いて37℃で20分間トリプシン処理した。トリプシン
はウシ胎児血清（FCS、10％）、グルタミン（2mM）、ペ
ニシリン（25U/ml）およびストレプトマイシン25μg/m
l）を補足した最低必須培地（MEM）により不活化した。
緩やかに摩砕して得られた解離細胞を集め、低速（500r
pm）で30秒間遠心分離した。遠心分離を２回繰返し、細
胞ペレットを次いで血清含有培地中に懸濁させた。次い
で細胞をポリオルニチン（10μg/ml）およびラミニン
（10μg/ml）で被覆した6mmウェルまたは35mm皿に塗布
した。大部分の実験において、細胞を約71,000細胞/cm2
の低密度で塗布した。細胞を塗布してから５〜６時間後
に、培地を１％ N3およびペニシリン−ストレプトマイ
シン（それぞれ25U/mlおよび25μg/ml）を含有する無血
清培地を交換し、このときにBDNFを添加した。培地は３
日ないし４日毎に交換し同時にこの因子が再添加され
た。
存性阻害を生じさせる （１）材料および方法 （1.1）海馬細胞培養物 Sprague−DawleyラットのE18−19ラット胚から海馬を
切開し、F10培地中に集めた。この組織を細切し、F10培
地（Gibco）で２回洗浄し、0.25％トリプシン（Gibco）
を用いて37℃で20分間トリプシン処理した。トリプシン
はウシ胎児血清（FCS、10％）、グルタミン（2mM）、ペ
ニシリン（25U/ml）およびストレプトマイシン25μg/m
l）を補足した最低必須培地（MEM）により不活化した。
緩やかに摩砕して得られた解離細胞を集め、低速（500r
pm）で30秒間遠心分離した。遠心分離を２回繰返し、細
胞ペレットを次いで血清含有培地中に懸濁させた。次い
で細胞をポリオルニチン（10μg/ml）およびラミニン
（10μg/ml）で被覆した6mmウェルまたは35mm皿に塗布
した。大部分の実験において、細胞を約71,000細胞/cm2
の低密度で塗布した。細胞を塗布してから５〜６時間後
に、培地を１％ N3およびペニシリン−ストレプトマイ
シン（それぞれ25U/mlおよび25μg/ml）を含有する無血
清培地を交換し、このときにBDNFを添加した。培地は３
日ないし４日毎に交換し同時にこの因子が再添加され
た。
（1.2）ガンマーアミノ酪酸（GABA）に関する高アフィ
ニティ取り込みの測定 高アフィニティGABA取り込みはTomozawaおよびAppel
（1986,Brain Res.399:111−124）の改変操作を用いて
測定された。140mM NaCl,26mM KCl,1mM KH2PO4,1mM Na2
HPO4,6mg/mlグルコース、1mM MgCl2,1mM CaCl2,0.1％ B
SAを含有するGABA取り込み緩衝液で細胞を洗浄した。洗
浄後、細胞をGABA取り込み緩衝液と共に37℃で５分間イ
ンキュベーションした。次いで3H−GABA（NEN,NET−191
X,111.4Ci/mmol）を最終濃度12nMで添加し、インキュベ
ーションを37℃で10分間行った。次いで細胞を氷上に置
き、取り込み緩衝液で３回洗浄した。細胞を0.14N NaOH
と共に室温で２時間インキュベーションし、抽出物中の
3H−GABAをカウントした。3H−GABA取り込みは少なくと
も30分までの間直線状であることが見出された。非ニュ
ーロン細胞中へのGABAの取り込みは2mM B−アラニンの
添加により阻害されたが、ニューロンに特異的な取り込
みはニペコチン酸（nipecotic acid）1mMでの阻害によ
り証明される。
ニティ取り込みの測定 高アフィニティGABA取り込みはTomozawaおよびAppel
（1986,Brain Res.399:111−124）の改変操作を用いて
測定された。140mM NaCl,26mM KCl,1mM KH2PO4,1mM Na2
HPO4,6mg/mlグルコース、1mM MgCl2,1mM CaCl2,0.1％ B
SAを含有するGABA取り込み緩衝液で細胞を洗浄した。洗
浄後、細胞をGABA取り込み緩衝液と共に37℃で５分間イ
ンキュベーションした。次いで3H−GABA（NEN,NET−191
X,111.4Ci/mmol）を最終濃度12nMで添加し、インキュベ
ーションを37℃で10分間行った。次いで細胞を氷上に置
き、取り込み緩衝液で３回洗浄した。細胞を0.14N NaOH
と共に室温で２時間インキュベーションし、抽出物中の
3H−GABAをカウントした。3H−GABA取り込みは少なくと
も30分までの間直線状であることが見出された。非ニュ
ーロン細胞中へのGABAの取り込みは2mM B−アラニンの
添加により阻害されたが、ニューロンに特異的な取り込
みはニペコチン酸（nipecotic acid）1mMでの阻害によ
り証明される。
（２）結果および論考 我々は最近、BDNFについての豊富なレベルのメッセー
ジが海馬星状細胞中ではなくてニューロンに富んだ海馬
培養中で検出した。これらのデータはBDNFが海馬ニュー
ロンに局在化することを強く示唆する。培養海馬ニュー
ロンに対するBDNFの作用を調べるために、細胞を種々の
濃度のBDNF（COS上清からのロトホール精製したもの）
で処理した。８日間の処理期間の終りに、ニューロンへ
の高アフィニティGABA取り込みを測定した。第37図に示
すように、BDNFはGABA取り込みの用量依存性阻害を生じ
させた。従ってBDNFはGABA作動性ニューロンの生存およ
び／または表現型発現に影響を及ぼしうる。BDNFはグル
タメート含有ニューロン（グルタメート取り込み測定に
よりアッセイ）に対してもまたニューロフィラメントタ
ンパク質のレベルに対しても作用を及ぼさなかった。従
って海馬培養物に対するBDNFの作用はGABA作動性ニュー
ロンに対して特異的であると思われる。
ジが海馬星状細胞中ではなくてニューロンに富んだ海馬
培養中で検出した。これらのデータはBDNFが海馬ニュー
ロンに局在化することを強く示唆する。培養海馬ニュー
ロンに対するBDNFの作用を調べるために、細胞を種々の
濃度のBDNF（COS上清からのロトホール精製したもの）
で処理した。８日間の処理期間の終りに、ニューロンへ
の高アフィニティGABA取り込みを測定した。第37図に示
すように、BDNFはGABA取り込みの用量依存性阻害を生じ
させた。従ってBDNFはGABA作動性ニューロンの生存およ
び／または表現型発現に影響を及ぼしうる。BDNFはグル
タメート含有ニューロン（グルタメート取り込み測定に
よりアッセイ）に対してもまたニューロフィラメントタ
ンパク質のレベルに対しても作用を及ぼさなかった。従
って海馬培養物に対するBDNFの作用はGABA作動性ニュー
ロンに対して特異的であると思われる。
実施例15:BDNFはMPP＋の毒性作用に対して保護作用を与
える （１）材料および方法 （1.1）MPP＋処理SH−SY5Y細胞に対する神経栄養因子の
作用の測定 SH−SY5Y細胞を24ウェルプレートに１ウェル当り１×
105細胞の密度で塗布し、塗布24時間後に細胞を神経栄
養因子で処理した。神経栄養因子処理の24時間後に細胞
をMPP＋（10μＭ）で処理した。MPP＋添加の48時間後に
トリパルプルー排除アッセイにより生存可能な細胞を定
量した。用いた神経栄養因子はmNGF−COS（1:5希釈）、
hBDNF−COS（1:5希釈）、イー・コリからの精製rCNTF
（25ng/ml）、ウシ脳bFGF（25ng/ml）、rNT3−COS（1:5
希釈）および精製hEGF（25ng/ml）であった。
える （１）材料および方法 （1.1）MPP＋処理SH−SY5Y細胞に対する神経栄養因子の
作用の測定 SH−SY5Y細胞を24ウェルプレートに１ウェル当り１×
105細胞の密度で塗布し、塗布24時間後に細胞を神経栄
養因子で処理した。神経栄養因子処理の24時間後に細胞
をMPP＋（10μＭ）で処理した。MPP＋添加の48時間後に
トリパルプルー排除アッセイにより生存可能な細胞を定
量した。用いた神経栄養因子はmNGF−COS（1:5希釈）、
hBDNF−COS（1:5希釈）、イー・コリからの精製rCNTF
（25ng/ml）、ウシ脳bFGF（25ng/ml）、rNT3−COS（1:5
希釈）および精製hEGF（25ng/ml）であった。
（1.2）MPP＋で処理した腹側中脳培養物に及ぼす神経栄
養因子の作用の測定 解離した腹側中脳ニューロンの培養物はE14ラット胚
から確立されたプロトコルに従って樹立した（上記実施
例13参照）。これらの培養物が樹立されてから48時間後
に、指示された適切な神経栄養剤で処理した。神経栄養
因子にはhBDNF（CHO細胞からのロトホール精製物、50
ng/ml）、精製mNGF（50ng/ml）、rNT−３（1:50希釈のC
OS上清）、精製ウシ脳bFGF（10ng/ml）、およびイー・
コリからの精製rCNTF（25ng/ml）が包含される。神経栄
養因子添加の24時間後にこれらの培養物をMPP＋（１μ
Ｍ）で処理した。MPP＋処理の48時間後にTH陽性ニュー
ロンを免疫組織化学的方法により同定して定量した。デ
ータは１実験につき３通りのサンプルを用いて行った３
つの独立した実験の平均を表わす。MPP＋処理後のTH陽
性ニューロン数は斜線の棒で示される。白ヌキ棒はMPP
＋処理をしなかったTH陽性ニューロン数を示す。
養因子の作用の測定 解離した腹側中脳ニューロンの培養物はE14ラット胚
から確立されたプロトコルに従って樹立した（上記実施
例13参照）。これらの培養物が樹立されてから48時間後
に、指示された適切な神経栄養剤で処理した。神経栄養
因子にはhBDNF（CHO細胞からのロトホール精製物、50
ng/ml）、精製mNGF（50ng/ml）、rNT−３（1:50希釈のC
OS上清）、精製ウシ脳bFGF（10ng/ml）、およびイー・
コリからの精製rCNTF（25ng/ml）が包含される。神経栄
養因子添加の24時間後にこれらの培養物をMPP＋（１μ
Ｍ）で処理した。MPP＋処理の48時間後にTH陽性ニュー
ロンを免疫組織化学的方法により同定して定量した。デ
ータは１実験につき３通りのサンプルを用いて行った３
つの独立した実験の平均を表わす。MPP＋処理後のTH陽
性ニューロン数は斜線の棒で示される。白ヌキ棒はMPP
＋処理をしなかったTH陽性ニューロン数を示す。
（２）結果および論考 BDNF、CNTF、NT−３、bFGFおよびEGFを別個に、SH−S
Y5Y細胞を１−メチル−４−フェニルミリミジニウム（M
PP＋）毒性から保護する能力について試験した場合に、
トリパンブルー排除アッセイにより測定して、BDNFおよ
びNGFだけがMPP＋毒性に対して有意な保護活性を示すと
思われる（第XI表および第XII表）。
Y5Y細胞を１−メチル−４−フェニルミリミジニウム（M
PP＋）毒性から保護する能力について試験した場合に、
トリパンブルー排除アッセイにより測定して、BDNFおよ
びNGFだけがMPP＋毒性に対して有意な保護活性を示すと
思われる（第XI表および第XII表）。
腹側中脳培養物において、データはBDNFがMPP＋毒性
に対して有意な保護効果を示したが、bFGFはより低い効
果しか生じなかったことを示す（第38図）。MPP＋処理
は、チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞の数を対照培養
物において85％減少させたが、MPP＋に露す前にBDNFで
前処理した培養物においては40％だけしか減少させなか
ったことが判った。MPP＋はトキシンMPTPに関する仮定
された代謝産物であって、これはインビボでパーキンソ
ン病様症候群を誘導することが観察されており、この症
候群はパーキンソン病について受容されたモデルシステ
ムである。従って、BDNFおよびNT−３の保護作用はこれ
らの化合物がパーキンソン病の治療において、または毒
性曝露に続く神経系損傷の保護に有用であることを証明
できることを示している。
に対して有意な保護効果を示したが、bFGFはより低い効
果しか生じなかったことを示す（第38図）。MPP＋処理
は、チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞の数を対照培養
物において85％減少させたが、MPP＋に露す前にBDNFで
前処理した培養物においては40％だけしか減少させなか
ったことが判った。MPP＋はトキシンMPTPに関する仮定
された代謝産物であって、これはインビボでパーキンソ
ン病様症候群を誘導することが観察されており、この症
候群はパーキンソン病について受容されたモデルシステ
ムである。従って、BDNFおよびNT−３の保護作用はこれ
らの化合物がパーキンソン病の治療において、または毒
性曝露に続く神経系損傷の保護に有用であることを証明
できることを示している。
微生物の寄託 以下の組み換えバクテリオファージおよび組み換えプ
ラスミドDNAを1989年８月30日メリーランド州ロックビ
ル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託した。
ラスミドDNAを1989年８月30日メリーランド州ロックビ
ル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託した。
ATCC受託番号 phBDNF−Ｃ−１ 40648 λhBDNF−Ｇ−１ 40649 本発明は本明細書に記載された詳細な態様により範囲
を限定されるべきでない。事実本明細書に記載されてい
るものに加えて、本発明の種々の変更態様が明細書並び
に添付図面から当業者には明らかであろう。かかる変更
態様は本発明の特許請求の範囲の範囲に包含される。
を限定されるべきでない。事実本明細書に記載されてい
るものに加えて、本発明の種々の変更態様が明細書並び
に添付図面から当業者には明らかであろう。かかる変更
態様は本発明の特許請求の範囲の範囲に包含される。
種々の刊行物が本明細書に引用されており、その開示
はすべて参考文献として本明細書に取り込まれる。
はすべて参考文献として本明細書に取り込まれる。
第１図はブタプレプロBDNF cDNAのヌクレオチド配列お
よび推定アミノ酸配列を示す。 第２図はNGFとBDNFの配列を比較して示す。 第３図は32P−標識NGFおよびBDNFプローブとハイブリッ
ド形成した、EcoR I切断ヒト、サル、ラット、マウス、
イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよび酵母ゲノムDNAの
サザンブロットのオートラジオグラフを示す。 第４図は各組織からのRNAに関するノーザンブロットア
ッセイを示す。 第５図はヒトBDNF cDNAの配列および推定アミノ酸配
列、並びにブタ、ラットおよびニワトリからのDNA配列
を比較して示す。 第６図はBDNF発現プラスミドpCMV1−pBDNFを示す。 第７図（ａ）は抗血清の連続希釈物を用いる抗血清のB5
ペプチドへの結合のELISA測定結果を示し、そして
（ｂ）は種々の抗血清の1:500希釈物の50ng BDNFへの結
合の定量を示す。 第８図はBDNF処理（斜線棒）および対照（黒い棒）腹側
中脳培養物におけるチロシンヒドロキシラーゼに関する
免疫組織化学的染色の結果を示す。 第９図は腹側中脳培養物によるドーパミン取込みを示
す。BDNF補添された培養物は斜線棒により表され、対照
培養物は黒い棒で示す。 第10図（ａ）は前脳コリン作動性ニューロン培養物にお
けるCAT陽性培養の数に及ぼすBDNFの作用を示し、そし
て（ｂ）は１ウェル当たり260,000細胞の密度（黒棒）
または１ウェル当たり150,000細胞の密度（斜線棒）に
おいて前脳コリン作動性ニューロン培養物を150ng/mlの
NGFで処理した（斜線棒）。NGF−処理対未処理細胞にお
けるCAT免疫陽性細胞の数を比較して示す。 第11図は前脳コリン作動性ニューロン培養物中における
BDNF濃度の関数としての、１分当り触媒された基質のピ
コモルで示されたCAT酵素活性の量の変化を示す。 第12図は約60％の集密度の大グリア細胞培養物を、
（ａ）表皮成長因子または（ｂ）BDNFのいずれかで42時
間処理し、次いで［3H］メチルチミジンとインキュベー
トし、3Hの取込み量をEGFおよびBDNF濃度に対して測定
した結果を示す。 第13図はBDNF/NGFプローブR1B/2Cにハイブリッド形成し
た、EcoR I制限ニワトリ、マウス、ラットのサザンブロ
ットを示す。NGFおよびBDNFゲノムEcoR Iフラグメント
の位置を、各々ＮおよびＢとして示す。 第14図はNGFおよびBDNFと、Box3/Box4プライマーを用い
るマウスDNAからのPCRによって同定されたBDNF/NGFファ
ミリーの新規のメンバーとの配列を比較して示す。 第15図はBDNFヒトプローブにハイブリッド形成した種々
のヒト腫瘍由来細胞系からのRNAのノーザンブロットを
示す。 第16図は海馬ニューロンにおけるBDNF−mRNAレベルの分
極の作用を示す。 第17図はカリウム及びカイニン酸による海馬ニューロン
のNGF−mRNAレベルの増加を示す。 第18図はカイニン酸作用に関する用量曲線を示す。 第19図はカイニン酸処理によるBDNF−及びNGF−mRNAレ
ベルの増加の時間的経過を示す。 第20図はBDNF−mRNAのカイニン酸により誘導された発現
に及ぼす鎮痙剤の作用を示す。 第21図は培養物における細胞成長の時間経過の位相差顕
微鏡写真を示す。 第22図はAChE細胞数の基づくBDNF又はNGF処理に対する
解離された中隔細胞の応答の比較を示す。 第23図は解離された中隔培養物に対するBDNF又はNGFの
添加遅延作用を示す。 第24図はNGF−レセプター免疫陽性細胞の数を調節するB
DNF又はNGFの能力を示す。 第25図はBDNF（Ａ）及びNGF（Ｂ）のCAT誘導性に対する
中隔コリン作動性ニューロンの用量応答曲線を示す。 第26図はAChE酵素活性に及ぼすBDNF及びNGFの用量応答
効果を示す。 第27図はBDNFにより誘導されるCAT酵素活性の増大の時
間経過をNGFと比較して示す。 第28図はCAT酵素活性を誘導するBDNFの能力に及ぼすグ
リア細胞の作用の比較を示す。 第29図は高アフィニティコリンの取り込みのレベルに及
ぼすBDNF又はNGF処理の作用を示す。 第30図は35S−標識反応生成物のSDS−PAGEによる分解を
示す。 第31図は未処理CHO−hBDNFとエンドプロティナーゼ開裂
CHO−hBDNFと比較したDRGバイオアッセイを示す。 第32図はE14ラットの腹側中脳細胞の解離培養物の位相
差及び明視野顕微鏡写真。 第33図はE14ラット腹側中脳細胞の６日培養物の高倍率
顕微鏡写真を示す。 第34図はBDNFが用量依存性様式でTH＋ドーパミン作動性
中脳ニューロンの生存を促進することを示す図である。 第35図はBDNFの反復量がTH＋ニューロンの生存を増加さ
せることを示す図である。 第36図はBDNFを遅れて加えた場合はTH＋の数を増大させ
ることを示す図である。 第37図は海馬培養物における高アフィニティーCABAとり
込みに及ぼすBDNFの用量依存性応答を示す。 第38図はBDNFはMPP＋の神経毒作用から培養異質ドーパ
ミン作動性ニューロンを保護することを示す図である。
よび推定アミノ酸配列を示す。 第２図はNGFとBDNFの配列を比較して示す。 第３図は32P−標識NGFおよびBDNFプローブとハイブリッ
ド形成した、EcoR I切断ヒト、サル、ラット、マウス、
イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよび酵母ゲノムDNAの
サザンブロットのオートラジオグラフを示す。 第４図は各組織からのRNAに関するノーザンブロットア
ッセイを示す。 第５図はヒトBDNF cDNAの配列および推定アミノ酸配
列、並びにブタ、ラットおよびニワトリからのDNA配列
を比較して示す。 第６図はBDNF発現プラスミドpCMV1−pBDNFを示す。 第７図（ａ）は抗血清の連続希釈物を用いる抗血清のB5
ペプチドへの結合のELISA測定結果を示し、そして
（ｂ）は種々の抗血清の1:500希釈物の50ng BDNFへの結
合の定量を示す。 第８図はBDNF処理（斜線棒）および対照（黒い棒）腹側
中脳培養物におけるチロシンヒドロキシラーゼに関する
免疫組織化学的染色の結果を示す。 第９図は腹側中脳培養物によるドーパミン取込みを示
す。BDNF補添された培養物は斜線棒により表され、対照
培養物は黒い棒で示す。 第10図（ａ）は前脳コリン作動性ニューロン培養物にお
けるCAT陽性培養の数に及ぼすBDNFの作用を示し、そし
て（ｂ）は１ウェル当たり260,000細胞の密度（黒棒）
または１ウェル当たり150,000細胞の密度（斜線棒）に
おいて前脳コリン作動性ニューロン培養物を150ng/mlの
NGFで処理した（斜線棒）。NGF−処理対未処理細胞にお
けるCAT免疫陽性細胞の数を比較して示す。 第11図は前脳コリン作動性ニューロン培養物中における
BDNF濃度の関数としての、１分当り触媒された基質のピ
コモルで示されたCAT酵素活性の量の変化を示す。 第12図は約60％の集密度の大グリア細胞培養物を、
（ａ）表皮成長因子または（ｂ）BDNFのいずれかで42時
間処理し、次いで［3H］メチルチミジンとインキュベー
トし、3Hの取込み量をEGFおよびBDNF濃度に対して測定
した結果を示す。 第13図はBDNF/NGFプローブR1B/2Cにハイブリッド形成し
た、EcoR I制限ニワトリ、マウス、ラットのサザンブロ
ットを示す。NGFおよびBDNFゲノムEcoR Iフラグメント
の位置を、各々ＮおよびＢとして示す。 第14図はNGFおよびBDNFと、Box3/Box4プライマーを用い
るマウスDNAからのPCRによって同定されたBDNF/NGFファ
ミリーの新規のメンバーとの配列を比較して示す。 第15図はBDNFヒトプローブにハイブリッド形成した種々
のヒト腫瘍由来細胞系からのRNAのノーザンブロットを
示す。 第16図は海馬ニューロンにおけるBDNF−mRNAレベルの分
極の作用を示す。 第17図はカリウム及びカイニン酸による海馬ニューロン
のNGF−mRNAレベルの増加を示す。 第18図はカイニン酸作用に関する用量曲線を示す。 第19図はカイニン酸処理によるBDNF−及びNGF−mRNAレ
ベルの増加の時間的経過を示す。 第20図はBDNF−mRNAのカイニン酸により誘導された発現
に及ぼす鎮痙剤の作用を示す。 第21図は培養物における細胞成長の時間経過の位相差顕
微鏡写真を示す。 第22図はAChE細胞数の基づくBDNF又はNGF処理に対する
解離された中隔細胞の応答の比較を示す。 第23図は解離された中隔培養物に対するBDNF又はNGFの
添加遅延作用を示す。 第24図はNGF−レセプター免疫陽性細胞の数を調節するB
DNF又はNGFの能力を示す。 第25図はBDNF（Ａ）及びNGF（Ｂ）のCAT誘導性に対する
中隔コリン作動性ニューロンの用量応答曲線を示す。 第26図はAChE酵素活性に及ぼすBDNF及びNGFの用量応答
効果を示す。 第27図はBDNFにより誘導されるCAT酵素活性の増大の時
間経過をNGFと比較して示す。 第28図はCAT酵素活性を誘導するBDNFの能力に及ぼすグ
リア細胞の作用の比較を示す。 第29図は高アフィニティコリンの取り込みのレベルに及
ぼすBDNF又はNGF処理の作用を示す。 第30図は35S−標識反応生成物のSDS−PAGEによる分解を
示す。 第31図は未処理CHO−hBDNFとエンドプロティナーゼ開裂
CHO−hBDNFと比較したDRGバイオアッセイを示す。 第32図はE14ラットの腹側中脳細胞の解離培養物の位相
差及び明視野顕微鏡写真。 第33図はE14ラット腹側中脳細胞の６日培養物の高倍率
顕微鏡写真を示す。 第34図はBDNFが用量依存性様式でTH＋ドーパミン作動性
中脳ニューロンの生存を促進することを示す図である。 第35図はBDNFの反復量がTH＋ニューロンの生存を増加さ
せることを示す図である。 第36図はBDNFを遅れて加えた場合はTH＋の数を増大させ
ることを示す図である。 第37図は海馬培養物における高アフィニティーCABAとり
込みに及ぼすBDNFの用量依存性応答を示す。 第38図はBDNFはMPP＋の神経毒作用から培養異質ドーパ
ミン作動性ニューロンを保護することを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/48 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＡＱ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 キャロリン・ハイマン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10570・プレザントヴィル・ドッグウッ ド・レーン 61 (72)発明者 ラルフ・アルダーソン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10562・オシニング・ストンアベニュー ５ (72)発明者 ジョージ・ヤンコプロス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10510・ブライアークライフマノール・ スリーピーハロウロード 428 (72)発明者 イフェス―アライン・バルデ ドイツ連邦共和国ディー8032 グラフェ ルフィング・メロウィンジャーシュトラ ーセ39 (72)発明者 ハンス・フリードリッヒ・エルヴィン・ テーネン ドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン40・ クレペリンシュトラーセ ４アー (72)発明者 アンドレアス・ホーン ドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン70・ ムルナウエルシュトラーセ 260アー (72)発明者 フリードリッヒ・ロットシュパイヒ ドイツ連邦共和国 8021ノイリート・ド ロッセルウェーク １ (72)発明者 ロナルド・エム・リンドセイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10510・ニューヨーク・ブライアークリ フ・チャッパクア・ロード 479 (72)発明者 マグダレーナ・ホーファー アメリカ合衆国 コネチカット州 06902・スタンフォード・ウッドクリフ ストリート 34 (72)発明者 ヨアヒム・ライブロック ドイツ連邦共和国 ディ6102・フンクス タット・ローランドショーシュトラーセ 14 (72)発明者 デイヴィッド・エドガー イギリス国 エル18 １ジェイダブリュ ウ・リヴァプール・モッスリーヒル・ク ウィンズドライブ 158 (72)発明者 バスティアン・ヘンゲラー ドイツ連邦共和国 ディ―7860 スコー プファイム・スタブハルテル フルリ― シュトラーセ ９アー (72)発明者 ダン・リンドホルム ドイツ連邦共和国 ディ―8000 ミュン ヘン 60 オット―ディッヒナーウェグ 13 (72)発明者 フランシスコ・ツァフラ ドイツ連邦共和国 ディ―8000 ミュン ヘン 70 インプレルシュトラーセ 67 ベー
Claims (41)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する成熟ヒト脳由
来神経栄養因子（BDNF）をコードする配列を含む実質的
に精製されたDNA分子。 - 【請求項２】BDNF活性を有するポリペプチドをコードす
る、第５図に示される請求項１記載のDNA分子またはそ
のサブ配列。 - 【請求項３】下記のアミノ酸配列において１またはそれ
以上のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸
配列を含み、BDNF活性を有するタンパク質またはポリペ
プチドをコードする配列を含む実質的に精製された核酸
分子、それに相補的な核酸分子、またはBDNF活性を有す
るポリペプチドをコードするそのサブ配列。 - 【請求項４】ヒトBDNFについての第５図の974番目のヌ
クレオチドから約1330番目のヌクレオチドに示される配
列を有するDNA分子である請求項３記載の核酸分子。 - 【請求項５】ATCCに寄託され、受託番号40648を有するp
hBDNF−Ｃ−１に含まれているか、あるいは、ATCCに寄
託され、受託番号40649を有するλBDNF−Ｇ−１に含ま
れているような請求項２記載のDNA分子。 - 【請求項６】宿主細胞においてBDNFまたはそのペプチド
フラグメントを発現することができ、その核酸が調節核
酸配列の制御下にある請求項３または４記載の核酸。 - 【請求項７】宿主細胞においてBDNFまたはそのペプチド
フラグメントを発現することができ、そのDNA分子が調
節DNA配列の制御下にある請求項１、２または５のいず
れかに記載のDNA分子。 - 【請求項８】請求項３、４または６に記載の核酸分子を
含むベクター。 - 【請求項９】請求項１、２、５または７に記載のDNA分
子を含むベクター。 - 【請求項１０】ATCCに寄託され、受託番号40648を有す
るphBDNF−Ｃ−１およびATCCに寄託され、受託番号4064
9を有するλBDNF−Ｇ−１から選択される請求項９記載
のベクター。 - 【請求項１１】請求項３、４または６に記載の核酸分子
を含有する細胞。 - 【請求項１２】請求項１、２、５または７に記載のDNA
分子を含有する細胞。 - 【請求項１３】請求項８記載のベクターを含有する細
胞。 - 【請求項１４】請求項９記載のベクターを含有する細
胞。 - 【請求項１５】組換え微生物である請求項11、12、13ま
たは14記載の細胞。 - 【請求項１６】細菌または酵母である請求項15記載の組
換え微生物。 - 【請求項１７】請求項11〜16のいずれかに記載の細胞を
培養して、核酸またはDNA分子を宿主細胞中で発現さ
せ、そして発現したBDNFタンパク質を単離することを含
むBDNFタンパク質の生産方法。 - 【請求項１８】細胞が真核細胞または原核細胞である請
求項17記載の方法。 - 【請求項１９】原核細胞が細菌である請求項18記載の方
法。 - 【請求項２０】神経栄養活性と下記のアミノ酸配列を有
する、本質的に精製され、単離された、変性していない
タンパク質。 - 【請求項２１】神経栄養活性と下記のアミノ酸配列を有
する、本質的に精製され、単離された、変性していない
タンパク質。 - 【請求項２２】神経栄養活性と下記のアミノ酸配列を有
する、本質的に精製され、単離された、変性していない
タンパク質。 - 【請求項２３】チャイニーズハムスター卵巣細胞により
生産され、該細胞から精製された請求項20記載の本質的
に精製され、単離された、変性していないタンパク質。 - 【請求項２４】請求項16記載の細菌細胞により生産さ
れ、該細胞から精製された、本質的に精製され、単離さ
れた、変性していないBDNFタンパク質またはBDNF活性を
有するポリペプチド。 - 【請求項２５】請求項22記載のタンパク質である請求項
24記載のBDNFタンパク質。 - 【請求項２６】請求項20〜25のいずれかに記載されてい
るか、あるいは、請求項17〜19のいずれかに記載の方法
により得られる本質的に精製され、単離された、変性し
ていないタンパク質および製剤上許容される担体を含
む、神経系の疾患または障害のヒトまたは動物の身体を
治療する方法に使用するための医薬組成物。 - 【請求項２７】担体が徐放性担体である請求項26記載の
医薬組成物。 - 【請求項２８】第２の薬剤を含有する請求項26または27
記載の医薬組成物。 - 【請求項２９】第２の薬剤が神経成長因子またはBDNF/N
GF（脳由来神経栄養因子／神経成長因子）ファミリーの
他のメンバーである請求項28記載の組成物。 - 【請求項３０】請求項24または25記載のBDNFタンパク質
またはポリペプチドを特異的に認識する抗体、抗体フラ
グメント、またはその誘導体。 - 【請求項３１】神経系の疾患または障害を診断する方法
に使用するための、請求項24または25記載のBDNFタンパ
ク質またはポリペプチドに結合できる検出可能に標識さ
れた抗体分子。 - 【請求項３２】神経系の疾患または障害のヒトまたは動
物の身体を治療する方法に使用するための、請求項20〜
25のいずれかに記載されているか、あるいは、請求項17
〜19のいずれかに記載の方法により得られるBDNFタンパ
ク質。 - 【請求項３３】疾患または障害が感覚性ニューロンの疾
患または障害である請求項32記載のBDNF。 - 【請求項３４】感覚性ニューロンの疾患または障害が糖
尿病性神経疾患または障害である請求項33記載のBDNF。 - 【請求項３５】神経系の疾患または障害がコリン作動性
ニューロンの疾患または障害である請求項32記載のBDN
F。 - 【請求項３６】コリン作動性ニューロンが基底前脳コリ
ン作動性ニューロンまたは中隔コリン作動性ニューロン
である請求項35記載のBDNF。 - 【請求項３７】疾患または障害がアルツハイマー病、ハ
ンチントン舞踏病、レチナール病、パーキンソン病、パ
ーキンソン−プラス症候群または糖尿病性神経疾患もし
くは障害である請求項32記載のBDNF。 - 【請求項３８】神経系の疾患または障害がドーパミン作
動性ニューロンの疾患または障害である請求項32記載の
BDNF。 - 【請求項３９】疾患または障害がパーキンソン病である
請求項38記載のBDNF。 - 【請求項４０】神経系の疾患または障害が神経系の損傷
を含む請求項32記載のBDNF。 - 【請求項４１】損傷が、外傷、手術、梗塞、感染、悪性
疾患、毒性薬剤への暴露、栄養欠乏症または糖尿病性神
経疾患もしくは障害により引き起こされる請求項40記載
のBDNF。
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