JPH05328974A - 脳由来神経栄養因子 - Google Patents

脳由来神経栄養因子

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Abstract

(57)【要約】 電子出願以前の出願であるので 要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、脳由来神経栄養(neurotrophic)因子 (BDNF)をコードする核酸配列、このものから多量 に産生される実質的に純粋なタンパク質、そのペ プチドフラグメントまたは誘導体、並びにBDNFタ ンパク質、そのペプチドフラグメントまたは誘導 体に対する抗体に関する。加えて、本発明は新た に定義されたBDNF/NGF遺伝子ファミリーのメンバ ーである遺伝子およびそれらの遺伝子産物に関す る。本発明はまた、有効量のBDNF遺伝子産物ある いは代わりにBDNF遺伝子産物に対する抗体を含有 する医薬組成物、およびアルツハイマー病および パーキンソン病を含む種々の神経学的疾病および 障害の診断および治療法に関する。特に、本発明 のBDNF遺伝子産物は、感覚性ニューロン障害並び に網膜の変性性障害の診断および治療に価値があ る。
発明の背景 (1) 神経系の発達におけるニューロン細胞死およ び神経栄養因子の役割 脊椎神経系の多くの部分にわたり、成体動物に 見出されるよりも多くのニューロンが初期発達期 間中に存在する。初期発達期間は、自然に生ずる ニューロン細胞死の波によって特徴付けられる (CarrおよびSimpson,1978,J.Comp.Neurol. 182:727-740;Cowanら，1984,Science 225::1258 -1265)。発達中のニューロンの生存、分化および 成熟は、厳密な固有の遺伝子プログラムによると いうよりも環境的なあるいは「後成的」因子によ って調節され得る。例えば、ニワトリ胚の実験的 操作では、ニワトリ発達の初期段階において、肢 芽または目のような抹梢「標的領域」の移植また は摘出により、肥大されたあるいは欠失した標的 領域に隣接した多数の知覚性、交感神経性、副交 感神経性または運動性ニューロンがそれぞれ相当 して増加または減少されうることが示されている (Hamburger,1934,J.Exp.Zool.68:449;Holly ｄａｙおよびHamburger,1976,J.Comp.Neurol., 170:311-321;LandmesserおよびPilar,1976,J. Cell.Biol.,68:357-374)。標的領域は、限定さ れた数のニューロンしかサポートせず、そして発 達過程の正常部分は、標的組織の「神経栄養」能 力に整合するために過剰の数のニューロンを排除 したものでありうる。ここで神経成長因子(NGF) と呼ばれるタンパク質の発見および単離により、 標的が、生存しその組織を神経支配する多数のニ ューロンをいかにして調節しうるかという分子仮 説に達している(Levi-Montalciniら，1968,Phys iol Rev.,48:524-569;ThoenehおよびBarde, 1980 Physiol Rev.,60:1284-1335)。
少なくとも抹梢神経系においては、ニューロン 標的組織が特異的な種類のニューロンの生存にと って決定的に重要である限定された量の種々の神 経栄養分子を合成しそして放出することが今や充 分に確立されている(KorschingおよびThoenen,19 83,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3513-35 16;Heumannら，1984,EMBO J.3:3183-3189; SheltonおよびReichardt,1984,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.81:7051-7955;Korschingお よびThoenen,1985,Neurosci.Lett.54:201- 205)。
(2) 神経成長因子 神経成長因子(NGF)は、これらの神経栄養分子 のうちでは最もはるかに特徴的で、そしてインビ トロおよびインビボの両方でニワトリおよびラッ トの両方の初期発達の際の交感神経および神経稜 −由来感覚性ニューロンの生存に必須であること が示されている(Levi-MontalciniおよびAngeletti, 1963,Develop.Biol.7:653-659;Levi-Montalc iniら，1968,Physiol.Rev.,48:524-569)。発 達中のニワトリ胚への精製NGFの注射により、脊 椎感覚性ニューロンおよび交感神経ニューロンの 大量の過形成および肥大が引き起こされることが 見出されている(Levi-MontalciniおよびBooker, 1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46:373- 384;Hamburgerら，1981,J.Neurosci.1:60-71)。
逆に、新生ラットに抗-NGF抗体を毎日注射するこ とによる内因性NGFの除去または封鎖が交換神経 系の事実上の破壊と関連付けられている(Levi- MontalciniおよびBooker,1960,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.46:384-391;Levi-Montalcini およびAngeletti,1966,Pharmacol.Rev.18: 619-628)。子宮内抗体注射によるかあるいは母性 抗体の受動系胎盤転移のいずれかによる発達中の いっそう初期におけるNGF抗体への曝露は、神経 稜−由来感覚性ニューロン、例えば脊椎および背 中側三叉神経感覚性ニューロンの実質的な損失を 来すことが示されている(Goedertら，1984,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:1580-1584;Gorin およびJohnson,1979,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.76:5382-5386)。近年まで、NGFのほとん ど全ての研究は、末梢神経系におけるその役割に ついて集中していたが、ここでNGFが中枢神経系 におけるニューロンの特定の母集団の発達および 維持にも影響することが明らかとなった(Thoenen ら，1987,Rev.Physiol.Biochem.Parmacol. 109:145-178;WhittemoreおよびSeiger,1987, Brain Res.Rev.12:439-464)。
成体雄マウスの顎下腺における多量のNGFタン パク質の偶然の発見(Cohen,1960,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.46:302-311)および早期の、 ヘビ毒液における高レベルのNGFの発見(Cohenお よびLevi-Montalcini,1956,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.42,571-574)により、NGFの生理学、 タンパク質化学およびより最近の分子生物学（す なわち、NGFおよびそのレセプターの分子クロー ンニング）に関連する研究ができるに十分な量の NGFが幸運にも提供されることになった。成体雄 マウス唾液腺における多量のNGFの機能は未知の ままであるが、この豊富なNGF源は、末梢または 中枢神経系の発達または維持に何の役割も果たさ ないかもしれないと思われる。NGF感受性ニュー ロン（生存に関してはNGFに依存し、高アフィニ ティNGFレセプターを有し、そして高い特異性を 以てNGFを内在化しかつ逆行的に移送することが 示されているニューロン）によって神経支配され る標的組織においては、NGFの定常状態の測定可 能レベルは極端に低く、成体雄マウス唾液腺組織 における1000倍高いレベルと比較して組織１グラ ム当たりピコグラムまたはナノグラムの範囲であ ることが見出されている。NGFは、血清中で何ら 認識しうるレベルで見出されておらず、それゆえ に循環性成長因子またはホルモンであるとは思わ れない（Sudaら，1978,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.75:4042-4046)。
マウス顎下腺におけるNGFタンパク質の主要源 の重要な発見に加えて、感度が高く、信頼できそ して効率的な生物学的アッセイの発展が、NGFの 生物学および生化学的解明に主要な役割を果たし ている。発達中のニワトリ胚の背根神経節(DRG) は、インビトロにおいてNGFに応答することが示 される第１の種類のニューロンの一つである。血 漿凝塊におけるE8-E12ニワトリDRGの外植培養物 およびより最近、ニワトリDRGの解離されたニュ ーロン富化−培養物がNGF活性に関する（例えば 精製の際）およびNGF生物学のインビトロ研究に 関するバイオアッセイにおいて非常に有効である ことが判明している(Levi-Montalciniら，1954, Cancer Res.4:49-57;Levi-Montalciniおよび Angeletti,1963,Develop.Biol.1:653-659; Greene,1977,Develop.Biol.58:96,同58:106)。
40以上のDRGが１個のニワトリ胚から切除できる ことから、多くの研究室においてNGFバイオアッ セイが広く用いられてきている。
多量のNGFタンパク質が入手しうることおよび 効率的なNGFアッセイシステムに加えて、NGFの生 物学に関する本発明者等の理解に多大に寄与して きた第３の主な要因は、NGFに対する抗体がモル モット、ウサギ、ヒツジ等において比較的容易に 生成されうることである。すなわち、マウスNGF は免疫原性が高いと思われる。Cohenは（１９６０， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46:302-311)、 マウス顎下腺から精製したNGFに対する抗体を生 成させ、そしてLevi-MontalciniおよびBookerと ともに(1960,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.4 6:384-391)、これらの抗体が新生ラットに毎日投 与された場合交感神経節の破壊あるいは「免疫交 感神経切除」(Levi-MontalciniおよびAngeletti, 1966,Pharmacol.Rev.18:619-628）を引き起こ すことを示した。
豊富なNGFタンパク質により、比較的慣用のタ ンパク質化学によって主要な配列が決定できた (AngelettiおよびBradshaw,1971,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.68:2417-2420)。NGF遺伝子 は今や、マウス(Scottら，1983,Nature 302:538 -540）、ヒト(Ullrichら，1983,Nature 303:821 -825）、雌ウシおよびニワトリ(Meierら，1986, EMBO J.5:1489-1493)およびラット(Whittemore ら，1988,J.Neurosci.Res.,20:402-410)を含 む多くの種から、好適なオリゴヌクレオチドプロ ーブを設計するためにマウスNGFのタンパク質配 列の利用に基づく本質的に慣用の分子生物学を用 いてクローン化されている。また、豊富なNGFの 入手可能さゆえに、NGFレセプターに関する研究 が大いに促進され、このことがヒトおよびラット からのNGFレセプターの分子クローンニングを最 終的に可能にした(Johnsonら，1986,Cell.47:5 45-554;Redekeら，1987,Nature 325:593-597)。
NGFが遍在する神経栄養因子でないことは充分 に確立されている。末梢神経系内で、NGFはイン ビボおよびインビトロの両方の研究から決定され た通り、副交感神経ニューロン、神経プラコード −由来感覚性ニューロンまたは腸ニューロンに関 する生存因子でないらしい。更に、NGFは発達中 の運動性ニューロンに関する生存因子でないらし い(Oppenheim,1982,J.Comp.Neurol.210:174 -189）。但しこれらのニューロンが発達中にNGF レセプターの少なくとも低アフィニティ形を発現 するとは思わないが(Raivichら，1985,EMBO J. 4:637-644)。これらのニューロン型に対するNGF の効果の欠如により、その他の神経栄養因子、特 に脊髄運動性ニューロンおよび／または毛様神経 節の副交感神経ニューロンの生存を維持する因子 に関する研究が促進されている。
(3) その他の神経栄養因子 ここ10年来、多種多様の組織の抽出物における および多くの異なる種類の細胞の馴化培地におけ る神経栄養活性物の報告が多数存在する。しかし ながらほとんど全ての場合において、これら活性 物が極めて少量、すなわち組織１ｇ当たりピコグ ラムないしナノグラムの範囲でしか存在しないと いう事実によりかかる活性物の精製および特性決 定の進歩が妨げられている。
更に、適当なバイオアッセイが末梢ニューロン については確立されているが、中枢神経系ニュー ロンに関する意図する信頼でき、再現性がありか つ特異的なアッセイは問題があることが判明して いる。個々の種類の末梢神経はばらばらの、容易 に切開可能な神経節として見出されているが、中 枢神経系(CNS)ニューロンはそれらの分布におい て不変に高い異質性を有する。従って、特異的マ ーカーが特定のクラスのCNSニューロンの同定ま たは富化のいずれかに必要とされる。かかるマー カー、例えば細胞表面または細胞骨格成分に対し て生成された抗体の進展、または特異的な組織学 的染色は非常に制限されている。従って、(i)NGF 程豊富でなく、(ii)アッセイが困難であり、そし て(iii)抗体産生を引き出すに十分な量で入手で きない、神経栄養因子の特性決定が甚だ困難な方 法であることは判っている。
(3.1)脳由来神経栄養因子(BDNF)と神経成長因 子との比較 インビトロにおいて胚のニワトリ背根神経節ニ ューロンの生存を維持できる神経栄養活性物は、 ラットC-6神経膠腫細胞を培養した「馴化培地」 中で確認された(Bardeら，1978,Nature 274:818)。
この活性物は、マウスNGFに対する抗体によって 中和されず、馴化培地における他の神経栄養因子 の存在が示唆される。次いで、NGF抗体によって 遮蔽され得なかった同様の活性物が正常成体ラッ ト脳大グリア細胞の培養物中で(Lindsay,1979, Nature 282:80-82;Lindsayら，1982,Brain Res. 243:329-343)、および発達中並びに成体ラット脳 (Bardeら，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 77:1199-1203）および発達中および成熟ニワトリ 脊髄(LindsayおよびPeters,1984,Neurosci,12: 45-51)の抽出物中で報告された。しかしながら、 全ての場合において活性因子は単離も同定もされ ておらず、そして観察された活性が同一因子によ るものかまたは異なる因子によるものかの疑問が 残っている。
ブタ脳を出発物質として使用して、Barde等 (1982,EMBO J.1:549-553）は、今や脳−由来神 経栄養因子(BDNF)と命名され、そしてE10/E11ニ ワトリ胚からの背根神経節ニューロンの生存を促 進するらしい因子を報告した。神経栄養活性は、 ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）ゲル電気泳動にお いて12.3kD分子量のシングルバンドとして移動す る高い塩基性タンパク質（等電点，pI>10.1)にあ ることが見出された。精製ファクターは、1.4× 10６であると概算されたが、収量が非常に低く、 1.5kgのブタ脳から約１μｇのBDNFしか精製され なかった。更に、精製工程の最終段階が調製的ゲ ル電気泳動であるので、BDNFの活性は残留SDSの 存在に派生して完全には復元できなかった(Barde およびThoenen,1985,"Hormones and Cell Regu lation",Vol.9,Dumontら，編、Elsevier Scie nce Publishers,pp.385-390)。BDNFの高度の塩 基性および分子サイズは、NGFモノマーに非常に 類似することが注目された。しかしながら、BDNF は、(a)ニワトリ背根神経節バイオアッセイにおい て、NGFに対する抗体がBDNFの生物学的活性に対 して何ら明らかな作用を及ぼさず、(b)BDNFおよび NGFの効果が付加的であると思われ、そして(c)NGF とは異なり、BDNFがE12ニワトリ胚交感神経ニュ ーロンの生存に対してなんらの作用も有していな いことが判明したという点で、NGFの既知の性質 とは異なる性質を有していることが明らかとなっ た。加えて、脳抽出物を用いる早期の研究の際、 これらの供給源からの神経栄養活性がNGFに関連 するよりも発達のより後期段階で感覚性ニューロ ンに対して作用するらしいことが観察された。ポ リカチオン性基質、例えばポリリジンまたはポリ オルチニン上で培養されたニワトリ胚ニューロン の解離培養物を用いると、BDNFは、E10-11（胚日 数10または11）背根神経節ニューロンの30パーセ ント以上の生存を持続させることが見出されてい るが、E6における同一ニューロンの生存に対する 影響はほとんどないと思われた（Bardeら，1980, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:1199-1203前 出）。同様の条件下に、NGFは、E6 DRGニューロ ンの30〜40パーセントの生存を支えた。興味深い ことに、細胞外マトリックス糖タンパクラミニン で被覆した基質上で培養した場合に、NGFとBDNF の両方がE6-E12令のニワトリ胚からのDRGニュー ロンの約50パーセントの生存を持続させることが 後に見出された(Lindsayら，1985,Develop.Biol. 112:319-328)。後者の研究において、NGFおよび BDNFの効果が、両者が飽和濃度で存在する場合に 付加的であることが見出された。
NGFのニューロン特異性に関するLevi-Montalc ini(1966,The Harvey Lectures 60:217-259)に よる初期の研究では、NGFがニワトリのある種の 頭蓋知覚神経節のニューロン、特に第10脳神経の 結節性神経節に対してなんら作用を有していない ことが明らかになったので、NGFが感覚性ニュー ロンに関しても遍在性神経栄養因子でないこ とが示唆された。後のインビボ研究(Johnsonら， 1980,Science 210:916-918;Pearsonら，1983 Develop.Boil.96:32-36）では、胚形成の際の NGF不在がラットの大部分の頭蓋骨知覚神経節に おけるニューロンの生存に何らの作用も及ぼさず、 一方同様な処置が神経稜由来の知覚神経節におけ るニューロン総数を著しく涸渇させることが示 された。より詳細なインビトロ研究（Lindsay およびRohrer,1985,Develop.Biol.112:30-4 8;DaviesおよびLindsay,1985,Develop.Biol． 111:62-72;Lindsayら，1985,J.Cell.Sci. Suppl.3:115-129）では、NGFが大部分の神経稜 −由来感覚性ニューロンの生存を持続させるが、 神経プラコード由来の頭蓋感覚性ニューロンの生 存に対して何ら明らかな作用を有しないことが明 示されている。
NGFのそれとは異なるBDNFのニューロン特異性 の第１の証拠は、精製BDNFがE6、E9またはE12で のニワトリ胚の神経プラコード由来結節性神経節 から解離された感覚性ニューロンの40〜50％の 生存を持続させるというインビトロ例証である (Lindsayら，1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115- 129)。NGFは、それ自身によってもあるいはBDNF と一緒でもこれらのニューロンに対する明らかな 効果を有していない。後に、外植培養研究におい て、BDNFが錐体、膝状および腹側外側三叉神経神 経節を含む他の神経プラコード由来知覚神経節の 生存および軸索が伸び出るのを支持すると思われ ることが示されたが（Daviesら，1986,J.Neuro sci.6:1897-1904)、これらのいずれもNGFに対 して感受性であるとは判明していない。上記の研 究の全てにおいて、NGFに対する抗体は、BDNFの 観察された活性に何らの作用も及ぼさなかった。
末梢神経節からの培養ニューロンに及ぼすその作 用に加えて、BDNFは、ウズラ神経稜から培養され た細胞の生存およびニューロン分化を刺激するこ とが見出された(KalcheimおよびGendreau,1988, Develop.Brain Res.41:79-86)。
本発明以前には、免疫化にとって十分な量のBD NFを生産できないことが、ニューロン集団に及ぼ すこれらの作用を抗−NGF抗体と比較するための 抗−BDNF抗体の生産を妨げており、そしてBDNF/N GF交差−中和実験を妨げていた。しかしながら、 BDNFを用いる二つの最近の研究では(Kalcheimら， 1987,EMBO J.6:2871-2873;HoferおよびBarde, 1988,Nature 331:261-262）、鳥類PNS発達にお けるBDNFの生理学的役割が示されている。機械的 バリアを卵子内でE3/E4 DRG(胚日数３〜４の背根 神経節）と神経管中のそれらのCNS標的との間に 置いた場合、多くのDRGニューロンが死ぬことが 観察された（kalcheimおよびLe Douarin,1986, Develop.Biol.116:451-466)。このニューロン 死がCNS(神経管）由来神経栄養因子不在によるも のであるかも知れないと仮定された。続いて、ラ ミニン被覆シアラスティック(sialastic）膜に結 合したBDNFがこの細胞死を防止できることが観察 された(Kalcheimら，1987,EMBO J.6:2871-2873)。
BDNFの発達中のウズラ卵への注射は、結節性神経 節における自然に生じる細胞死を減少させること が見出され、この効果はNGFでは見られないもの であった(HoferおよびBarde,1988,Nature 331: 261-262)。神経稜および神経プラコード両起源の 末梢感覚性ニューロンに対するその作用に加えて、 BDNFは、発達中のCNSニューロンの生存を持続さ せることが見出された。Johnson等は(1986,J. Neurosci.6:3031-3938)、BDNFがE17ラット胚 から培養された網膜神経節細胞の生存を持続させ ることを示すデータを提示している。これは、馴 化培地および網膜神経節細胞の標的領域から調製 された脳抽出物がこれらのニューロンの生存を支 えると思われることを示した先の研究に一致して いる(McCafferyら，1982,Ex.Brain Res.48:37 -386;Sarthyら，1983,J.Neurosci.3:2532-25 44;Turnerら，１９８３，Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅ
ｓ．６：７７−８３）。
培養物中における発達中のニューロンの生存に 及ぼすその作用に加えて、BDNFは培養された成体 末梢および中枢神経系ニューロンに作用を及ぼす ことが示されている。成体感覚性ニューロンは３ または４週間にわたるインビトロ維持に神経栄養 因子を必要としないと思われたが、BDNF並びに NGFは、培養中の成体ラットDRGニューロンから の軸索再生を刺激することが示されている（Lind say,1988,J.Neurosci.8:2394-2405)。更に、 成体ラット網膜の培養物において、BDNFは網膜神 経節細胞の生存およびそこからの軸索伸長の両方 を促進することが観察された（Thanosら，1989, Eur.J.Neurosci.1:19-26)。NGFとBDNFの生物 学的作用の比較を第Ｉ表に示す。
(3.2)脳由来神経栄養因子のニューロン標的 末梢神経神経節の感覚性ニューロンは、二つの 異なる一時的な発生学的構造物、すなわち神経稜 および神経プラコードのいずれかから生ずること が見出されている。神経稜は、自律性神経節およ び脊髄神経知覚神経節すなわちDRGのニューロン および付随細胞の両方を生じると思われる。脳神 経知覚神経節の形成への神経稜および神経プラコ ードの寄与は、Le Douarinによって工夫されたウ ズラ／ニワトリキメラ移植系を使用して研究され ている（Le Douarin,1973,Develop.Biol.20: 217-222;Noden,1978,Develop.Biol.67:313- 329;NarayananおよびNarayanan,1980,Anat. Rec.196:71-82;Ayer-Le LievreおよびLe Douarin,1982,Develop.Biol.94:291-310;D' Amico-MaratelおよびNodem,1983,Am.J.Anat. 166:445-468)。Lindsay等(1985,J.Cell.Sci. Supp.3:115-129)に概説されている通り、少なく とも鳥類に関しては、第VII、第IXおよび第Ｘ脳神 経の遠位神経節のニューロン（それぞれ膝状、錐 体および結節性神経節）および第VIII脳神経の前庭 聴覚複合体のニューロンがもっぱら神経プラコー ド起源であると信じられている。第V脳神経の三 叉神経神経節は、稜およびプラコードの両方の起 源のニューロンを含有するが（上下顎骨葉の腹側 外側極に優勢なプラコード−由来ニューロンを有 する）、一方全ての脳神経節の付随細胞は、完全 に神経稜起源であることが見出されている。
脊髄および脳神経感覚性ニューロンの外植のお よび解離されたニューロン富化培養物の両方を使 用したインビトロ実験から、神経稜起源の感覚性 ニューロンがNGFに応答性であることが見出され ており、対照的に神経プラコード由来のニューロ ン（三叉神経節の腹側外側部分のニューロンおよ び前庭、膝状、錐体および結節神経節の全ニュー ロン集団を含む）は、胚発達全体中を通してNGF にほとんど応答性でないことが観察されている。
NGFに対する要求および応答性の相違と対照的に、 プラコードおよび神経稜由来両感覚性ニューロン は、BDNFの生存および軸索−促進活性に応答性で あることが見出されている（第I表）(Lindsayら， 1985,J.Cell.Sci.Supp.3:115-129;Lindsay ら，1985,Develop.Biol.112:319-328;Kalcheim およびGendreau,1988,Develop.Brain Res.41: 79-86)。TebarおよびBarde(1988,J.Neurosci. 8:3337-3342）は、放射性標識されたBDNFのニワ トリ胚背根神経節ニューロンへの結合パラメータ ーを研究した。その結果は、二つのクラスのBDNF レセプター、すなわち一方はBDNFに対して高いア フィニティを有しそして他方は低いアフィニティ を有するレセプターの存在と一致している。高い アフィニティレセプターは、交感神経ニューロン 上には観察されなかった。
BDNFの既知のニューロン標的は、更にBarde等 (1987,Prog.Brain Res.,71:185-189)によって 再検討された。本発明以前には、BDNFを合成する 細胞の同定はBDNFに特異的な核酸または抗体プロ ーブの欠如ゆえに実現に到っていない。BDNFに対 するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を 調製する試みはうまくいっていない。抗体を生成 できなかったことにより、BDNFの分子クローニン グ、発達中のニューロンからインビボBDNFを剥奪 することの生理学的作用の測定、イムノアッセイ を用いる組織中のBDNFの定量および免疫細胞化学 を使用したBDNFの位置決定が妨げられる。
発明の要約 本発明は、脳由来神経栄養因子(BDNF)をコード する核酸配列、このものから多量に産生される実 質的に純粋なタンパク質、そのペプチドフラグメ ントまたは誘導体、並びにBDNFタンパク質、その ペプチドフラグメントまたは誘導体に対して生成 された抗体に関する。本発明は抗−BDNF抗体産生 を可能にし、そしてBDNFの診断および治療用途を 支えるに十分な量のBDNFの入手を初めて可能にす るものである。
本発明の種々の実施態様において、BDNF核酸、 タンパク質、ペプチド、誘導体または本発明の抗 体は、種々の神経学的疾病および障害の診断およ び治療法に、そして特に感覚性ニューロン障害お よび網膜変性の診断および治療に使用できる。更 に、本発明の詳細な実施態様においては、BDNF核 酸またはBDNF遺伝子産物は、神経芽腫、パーキン ソン病およびアルツハイマー病の診断および治療 に使用することができる。本発明の他の詳細な態 様においてはBDNF遺伝子産物は、インプラントの 神経組織への取込みを促進し、若しくは外傷、梗 塞、感染あるいは手術後に続く神経再生を促進す るのにも使用することができる。
本発明はまた、有効量のBDNF遺伝子産物、ある いはまたBDNF遺伝子産物に対して生成された抗体 を含有する医薬組成物に関するものであり、この ものは、種々の神経学的疾病および障害の診断お よび治療に使用できる。
加えて、BDNFの完全なヌクレオチド配列を提供 することによって、本発明はBDNFとNGF遺伝子の 比較を可能にし、もって相同の領域を同定し、そ してBDNF/NGF遺伝子ファミリーを特定できる。従 って、本発明はBDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加 的メンバーを同定する方法に関する。詳細な実施 態様においては、本発明の方法を使用して、BDNF /NGF遺伝子ファミリーの新規な、非−NGF、非− BDNFメンバーが同定される。本発明は更に、記載 された方法およびその遺伝子に従って同定された BDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加的メンバーを提 供する。
(1) 略語および定義 BDNF 脳由来神経栄養因子 CAT コリンアセチルトランスフェラーゼ CNS 中枢神経系 DRG 背根神経節（神経節） EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸 NGF 神経成長因子 PBS 燐酸緩衝食塩水 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 PNS 末梢神経系 SDS ドデシル硫酸ナトリウム Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 図面の説明 第１図．ブタプレプロBDNF cDNAのヌクレオチド 配列および推定アミノ酸配列。二つの重なるcDNA クローンの完全な配列をこの図に示す。マイクロ 整理配列比（第III表）から得られたペプチド配列 に下線を付す。N-グリコシル化に関するコンセン サス配列のみは二重下線を付す。成熟BDNF配列の 出発を二重カラットにより標印する。
第２図．NGFとBDNFの配列比較。同一の位置に見 出される２個以上のアミノ酸を有する領域を示す。
この配列は、成熟タンパク質の第１アミノ酸で出 発し、そして終止コドンの前の最終アミノ酸で終 了する。６個のシステイン残基を含む51のアミノ 酸がBDNFおよび種々のNGFに共通である(Schwarz ら，1989,J.Neurochem.52:1203-1209)。
第３図．32P-標識NGFおよびBDNFプローブとハイ ブリッド形成した、EcoRI切断ヒト、サル、ラッ ト、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよ び酵母ゲノムDNAのサザンブロットのオートラジ オグラフ。
第４図．ノーザンブロットアッセイ。各組織から、 20μｇの全RNAを１レーン当たり塗布しそして32 P-標識cRNAマウスBDNFプローブとハイブリッド 形成させた。脳組織で強いシグナルが約1.45kBで 見出せたが、これは分析した７種の他の組織のい ずれでも見出せなかった。
第５図．ヒトBDNF cDNAの配列および推定アミノ 酸配列、並びにブタ、ラットおよびニワトリから のDNA配列の比較。
第６図．BDNF発現プラスミドpCMVl-pBDNF。
第７図．(a)抗血清の連続希釈物を用いる抗血清の B5ペプチドへの結合のELISA測定結果。(b)種々の 抗血清の1:500希釈物の50ng BDNFへの結合の定 量。
第８図．BDNF−処理（斜線棒）および対照（黒い 棒）腹側中脳培養物におけるチロシンヒドロキシ ラーゼに関する免疫組織化学的染色の結果。
第９図．腹側中脳培養物によるドーパミン取込み。
BDNF補添された培養液は斜線棒により表され、対 照培養物は黒い棒で示す。
第10図．(a)前脳コリン作動性ニューロン培養物に おけるCAT陽性細胞の数に及ぼすBDNFの作用。(b) １ウェル当たり260,000細胞の密度（黒棒）また は１ウェル当たり150,000細胞の密度（斜線棒） において前脳コリン作動性ニューロン培養物を 150ng/mlのNGFで処理した（斜線棒）。NGF-処理 対未処理細胞におけるCAT免疫陽性細胞の数を比 較した。
第11図．前脳コリン作動性ニューロン培養物中に おけるBDNF濃度の関数としての、１分当り触媒さ れた基質のピコモルで示されたCAT酵素活性の量 の変化。
第12図．約60％の集密度の大グリア細胞培養物を、 (a)表皮性成長因子または(b)BDNFのいずれかで42時 間処理し、次いで[3H]メチルチミジンとインキュ ベートした。３Ｈの取込み量をEGFおよびBDNF濃度 に対して測定した。
第13図．BDNF/NGFプローブR1B/2Cにハイブリッド 形成した、EcoRI制限ニワトリ、マウス、ラット のサザンブロット。NGFおよびBDNFゲノムEcoRI フラグメントの位置を、各々ＮおよびＢとして示 す。
第14図．NGFおよびBDNFと、Box3/Box4プライマ ーを用いるマウスDNAからのPCRによって同定さ れたBDNF/NGFファミリーの新規のメンバーとの配 列比較：新規の遺伝子［本明細書においてM3/4と する（コード鎖のみを示す配列、および成熟マウ スNGFおよび成熟ブタ、ラット、マウスまたはヒ トBDNFに対して整列された推定アミノ酸配列を示 す。ダッシュは、NGFにおける１コドンの欠失を 用いてBDNFおよびM3/4に対して配列を最適化した 位置を示す。イタリックは、アミノ酸配列および ／または保存アミノ酸置換における一致を示す。）］ 第15図．BDNFヒトプローブにハイブリッド形成し た種々のヒト腫瘍由来細胞系からのRNAのノーザ ンブロット。
第16図．海馬ニューロンにおけるBDNF-mRNAレベ ルの分極の作用。
(a) 50mM KClの存在下における海馬ニューロン の一次培養物のBDNF-mRNA発現の時間的経過。全 細胞性RNAを0.5×10６の細胞から抽出し、グリ コシル化し、そして1.3％アガロースゲル上の電 気泳動により分析した(Biziere,K.およびCoyle, T.,Neurosci.,1978,Lett.8:303;McGeerら、 1978,Brain.Res.139:381)。ハイボンド(Hybond) Ｎフィルターに移したDNAをマウスBDNFに特異的 でありそしてインビトロランオフ転写により生成 された32P-標識cRNAプローブ（比活性、109cpm/ μｇ）とハイブリッド形成させた。２個の上部バ ンドがBDNF-mRNAに相当する；これら２個のバン ド（４及び1.5KB）はRNアーゼＡ抵抗性であるが 同様の方法で調節されると思われる２個の異なる 転写物を示す。下方のバンド(700bp)はRNAの抽 出前に試料に添加された短いBDNF-mRNA回収標準 物の10pgに相当する。
(b) カルシウム依存性。ニューロンを正常培地 (CM)、カルシウムを含まない改変培地(-Ca)また はニフェシピン(NIF)10μＭを含有する培地(NIF) 中で３時間インキュベートした。指示される場所 (+K)で50mM KClを加えた。
第17図．カリウム及びカイニン酸による海馬ニュ ーロンのNGF-mRNAレベルの増加。ニューロンを対 照培地(c)中、又は50mM KClの存在下(+K)又は25μ Ｍカイニン酸の存在下(KA)に３時間インキュベー トした。RNAを抽出し、そしてNGF-mRNAレベルを 定量的PCRにより測定した。値は平均±SEM(n=6) である。
第18図．カイニン酸作用に関する用量応答曲線。
海馬ニューロンをカイニン酸の種々の濃度の存在 下に３時間インキュベートした。RNAを抽出し、 そして第16図に示されるようにして分析した。値 は３回の実験の平均±SEMを表わす。
第19図．カイニン酸処理によるBDNF-及びNGF-mRNA レベルの増加の時間的経過。カイニン酸(12mg/kg) の腹腔内注射後に指示された時（時間）に海馬(a) または皮質(b)から全細胞性RNAを抽出して第16図 に示すようにして分析した。ジアゼパム(10mg/kg) の１回量をカイニン酸投与90分後に注射した(BDNF （４kb及び1.5kb）の二つのバンドはRNアーゼＡ 抵抗性であるがしかし同様の方法で調節されると 思われる二つの異なった転写物を示す）。1.5kb BDNF-mRNAN(O)及び1.3kb NGF-mRNA(O)に対応する値 が示されている。４kb BDNF-mRNAで同様の増加が 観察された。示されている値は３〜４回の実験の 平均±SEMを示す。
第20図．BDNF-mRNAのカイニン酸により誘導され た発現に及ぼす鎮痙剤の作用。ラットにカイニン 酸(12mg/kg)(+KA)又は食塩水（対照）の注射15分 前にジアゼパム(10mg/kg)(DZ)、MK-801(1mg/kg) (MK)又はケタミン(20mg/kg)(KET)を腹腔内注射し た。３時間後に海馬組織を第16図に示すように全 RNAの調製に用いた。値は３回の実験の平均±SEM を示す。
第21図．中隔細胞培養物。
Ａ−Ｆ．培養物における細胞成長の時間経過の 位相差顕微鏡写真。細胞を1.3×(105)細胞／cm2 の密度で塗布しそして本文に記載したようにして ５HS/NS中で保持した。記録された時点は１(A, B)，２(C,D)及び４(E,F)日目である。細胞の種 類に特異的なマーカーが、細胞の集団、AChE組織 化学的に染色したニューロン(G,H)及びNGF-レセ プター免疫陽性ニューロン（Ｉ）を同定するため に用いられた。スケールバー＝25μｍ 第22図．AChE細胞数に基づくBDNF又はNGF処理に 対する解離された中隔細胞の応答の比較。
Ａ：BDNF(25ng/ml)、NGF(50ng/ml)又は両リ ガンドの結合物に対する塗布密度での応答の比較。
Ｂ：ある範囲のBDNF又はNGFの濃度（０〜５０ｎｇ／ ml)に対するコリン作動性ニューロンの比較。こ れら結果物の細胞を血清含有培地中で11〜12日間 成長させた。データポイントは６−９回測定の平 均±SEMを表わす。
第23図．棒グラフは、解離された中隔培養物に対 するBDNF又はNGFの添加遅延作用を示す。BDNF (50ng/ml)又はNGF(50ng/ml)を５〜６時間(+12)、 ５日間(-5/+7)又は７日間(-7/+5)遅延に続いて 解離細胞培養物に添加した。培養物を12日間保持 した。細胞をAChE陽性組織化学的染色に基づいて 採点した。結果は、４〜５回測定の平均±SEMと して表わす。
第24図．NGF-レセプター免疫陽性細胞の数を調節 するBDNF又はNGFの能力を示す棒グラフ。NGF-レ セプターに関する免疫スレーティング(immunosla ting)を、モノクローナル抗体192-IgGを用い、 希釈度１：1000で行った。解離された中隔細胞を 1.3×(105)細胞／cm2の密度で塗布し、そして 12 日間連続的に処理した。NGFの飽和量とある範囲 の量のＢＤＮＦ（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）その間で比較
した。示 される結果はn=4の平均±SEMである。
第２５図．BDNF(A)及びＮＧＦ（Ｂ）のＣＡＴ誘導活性
に対 する中隔コリン作動性ニューロンの用量応答曲線。
培養物をポルオルニチン及びラミニン被覆した６ mmウェルに塗布し５HS/N3で12日間保持した。細 胞を塗布５〜６時間後BDNF又はNGFにさらした。
因子は、３日毎に培地を交換するときに置換した。
示された結果は、５〜６回測定の平均±SEMを示 す。
第26図．AChE酵素活性に及ぼすBDNF及びNGFの用 量応答効果。ラットの中隔コリン作動性ニューロ ンをホルモン補添した血清含有培地中で12日間成 長させた。細胞をBDNF（白棒）及びNGF（黒棒） で第25図に記載したようにして処理した。結果は６ 〜９回の測定の平均±SEMである。非処理培養物 におけるAChE活性は16.4±2nモル/Hr/ウェルであ った。
第27図．BDNFにより誘導されるCAT酵素活性の増 大の時間的経過をNGFと比較。CAT活性の刺激の 所要時間は２．３×(105)細胞／cm2の密度で塗布さ れ、ホルモン補添物および外因性因子を有する血 清含有培地で種々の長さの時間成長させた細胞に ついて実施された。塗布５〜６時間後細胞を始め のBDNF（白棒）またはNGF（黒棒）に露出させた。
結果は、処理培地で測定された活性の非処理培地 に対するパーセントで表わす（n=6,BDNF=12日 ｎ =3)。
第28図．CAT酵素活性を誘導するBDNFの能力に及 ぼすグリア細胞の作用の比較。中隔細胞を2.3× (105)細胞／cm2の密度で塗布した。５〜６時間の 培養に続き、培地を本文に詳細に記載するように して、１％N3を補添した無血清または血清含有 培地に変えた。シトシンアラビノシド(1μM)を、 星状細胞の数を更に減少させるために24時間加え た。次いで、培養物を12日間維持した。結果は、 ４回測定の平均±S.E.M.を示す。
第29図．棒グラフは、高アフィニティーコリンの 取り込みのレベルに及ぼすBDNF又はNGF処理の作 用を示す。コリン取り込みは、1.3×(105)細胞 ／cm2の密度で塗布したのち11日間保持した細胞に ついて行った。BDNF(50ng/ml)又はNGF(50ng/ml) に全培養期間を通じて存在させた。データはBDNF で５回そしてNGFで10回測定の平均±SEMを示す。
第30図．トリプシン及びエンドプロティナーゼ Arg-Cによるヒト脳由来神経栄養因子の酵素的開 裂からの35S-標識反応生成物のSDS-PAGEによる分 解。
第31図．未処理CHO-hBDNFとエンドプロティナー ゼ開裂CHO-hBDNFとを比較したDRGバイオアッセ イのグラフ表示。神経突起の伸長を０から最大の 生物活性を示す得点５の間で採点した。
第32図．チロシンビトロキシラーゼ(TH)に対する モノクローナル抗体と培養９日後に染色したE14 ラットの腹側中脳細胞の解離培養物位相差顕微鏡 写真(A)及び明視野顕微鏡写真(B,C)。
Ａ及びＢ．同じ視野の位相差及び明視野写真は これら培養物における不十分なＴＨニューロンを示 してる。単一のTH+ニューロン（矢印）のみが、 長い神経突起を有する多くの相ブライトニューロ ンを含む視野において見られる。少数の非ニュー ロン細胞が形態またはGFAPによる染色によって明 らかである（示されず）。
Ｃ．約98のニューロン形態の相ブライト細胞を 含む視野における２個のTH+ニューロン（小さな 矢印）を示す明視野顕微鏡写真。目盛＝100 1M 第33図．TH+ニューロンの種々の形態、いくつか は広い神経突起成長および非常に巧な成長コーン (A,B)を示すE14ラット腹側中脳細胞の６日培 養物の高倍率顕微鏡写真。培養物は樹立され、第 32図の解説に記載のようにして染色した。目盛＝ 25μＭ 第34図．BDNFは用量依存性様式で３日の培養期間 で明らかに培養物中におけるTH+ドーパミン作動 性中脳ニューロンの生存を促進する。
Ａ．BDNFを添加（黒棒）又はBDNFを加えず（白 棒）に保持したE14ラット腹側中脳培養物におけ るTH+ニューロンの数の比較。処理された培養物 では、BDNFを培養第２日目に１回加えた(50ng/ ml)。対照培養物と処理培養物との間では３日目 には差異が観察されなかったが、BDNF処理された 培養物におけるTH+ニューロンの数は８日目で対 照よりも1.8倍高かった。値は二通りの試料の平 均である。
Ｂ．TH+ニューロンの生存増大に及ぼすBDNFの 作用は用量依存性である。
TH+ニューロンの数は、BDNF非存在下での培 養又は第２日目に添加された漸増濃度のBDNFを含 有する培地中で８日培養した後に二通りの試料で 測定した。
Ｃ．NGFはTH+ニューロンの生存には効果がな かった。BDNFの特異性を評価するため、培養物を NGF(50ng/ml)の存在下又は非存在下に８日間成 長させ、TH+細胞を分析した。２日目に加えた NGFは、６日目又は８日目に検査した培養物のい ずれでもTH+ニューロンの生存を増加させなかっ た。結果は二通りの培養皿の平均である。
第35図．BDNFの反復量は２日目にBDNFを１回添加 したものと比較したとき、更にTH+ニューロンの 生存を増加させる。増加物を本文に記載のように して調製した。組換えヒトBDNFはCOS M5細胞の上 清から精製した。培養物は、２日間にBDNF(50ng/ ml)の１回添加(SA：点彩棒）又は１，２，４， ６及び８日目にBDNF(50ng/ml）を反復投与(MA-多 数回添加；黒棒）のいずれかで処理するか或いは BDNF（対照：白棒）なしで成長させた。指示され た時点で、培養物を固定しそしてTH免疫反応性に 関して染色した。複数回添加によるBDNFの補充に より、対照と比較して、11日目でTH+ニューロン の数が2.7倍高くなった。ところが、BDNFの１回 の添加でみられる最大増加量は11日以後で２倍よ りわずかに少ないものであった。結果は、典型的 な数回の実験で、二通りの試料の平均である。
第36図．BDNFを遅れて加えた場合には、２日目に 加えた場合にみられると同程にはTH＋の数を増大 させない。
培養物は、外因性BDNFを添加する時間を除いて、 本文中に示したようにして調整した。全ての培養 物は、２日目に無血清培地と交換し、そしてBDNF (50ng/ml,ブタ脳BDNF)を、２日目、５日目また は７日目(CD2,CD5,CD7)のいずれかで、１回添 加した。培養６日、８日および10日目にTH+ニュ ーロン数を２通りの培養物中において測定した。
この実験において、２日目におけるBDNFの１回添 加で、10日目に添加した場合に比べ３倍高いTH+ ニューロン数が生じた。BDNFを遅れて、すなわち ５日目に添加した場合には、10日目には、対照よ り高いTH+ニューロンが見られたが２倍よりは低 かった。処置培地と対照培地間のTH+細胞数のこ の違いは、培養時間が長くなってもこれ以上増加 しなかった。図において、対照、白棒；２日目で のBDNFの添加、点彩棒；５日目でのBDNF添加、黒 棒；７日目でのBDNF添加、斜線棒、である。
第37図．海馬培養物中における高アフィニティー GABAとり込みに及ぼすBDNFの容量依存性応答。部 分精製nBDNF(COS MG上精からロトフォール(roto pher)精製）を種々の希釈度で培地に添加した。
１×10-2希釈BDNFは、E8ニワトリ背根神経節にお いて最大の神経突起増進活性を有することが分か った。高アフィニティー3H-GABA取り込みをイン ビトロで８日間BDNF処理後に測定した。
第38図．BDNFはMPP+の神経毒作用から培養黒質ド ーパミン作動性ニューロンを保護する。培地は第 １図に示されるようにしてE14ラット胚から調製 した。インビトロで24時間後、培地を無血清調製 物に交換した。培養３日後に、培養物を６個の35 mm皿から成る４群に分けた。１群は対照とし、そ して、他の群には、(I)基本的な繊維芽細胞成長 因子、10ng/ml（ウシ脳bFGF;Boerhinger-Mannh eim);(II)マウスNGF,50ng/ml;または(III)BD NF,50ng/mlをそれぞれ与えた。培養物をさらに 24時間維持した後、各群の皿３枚ずつを１μM MP P+(Research Biochemicals,Inc.,Natick,MA) に48時間暴露した。計６日を要した実験の最後に、 全ての皿についてTH免疫反応に関して処理し、そ してTH+細胞数を各群で測定した。示されるデー タは、MPP+処理後のTH+ニューロン数を、MPP+に 暴露されない同様な培養物中におけるTH+ニュー ロンの数％として計算したものを示す。すべての 値は、３通りの培養物の平均±s.e.m.である。
発明の具体的説明 本発明は、脳由来神経栄養因子(BDNF)をコード する核酸配列並びにこれらの核酸配列を用いて多 量に産生される実質的に純粋なタンパク質、その ペプチドフラグメントまたは誘導体に関する。さ らに、本発明は、臨床的使用に十分な量の実質的 に純粋なBDNFを生成させる手段をはじめて提供し たので、BDNFの薬理学的組成物および治療的使用 にも関する。本発明はまた、十分な免疫原を生成 させる方法を提供したので、BDNFまたはそのフラ グメントに対する抗体にも関する。更に、BDNFと NGFとの間の核酸配列の比較ができることによっ て、本発明は、BDNFとNGFとの間の核酸配列の相 同領域の同定も提供し、それによりBDNF/NGF遺伝 子ファミリーが特定される。本発明はこの遺伝子 ファミリーの付加的メンバーを同定し、そして単 離する方法を提供する。
説明を明確にするために、本発明を以下に項分 けして記載するが、本発明を限定するものではな い。
(I) BDNFの精製 (II) BDNFバイオアッセイ (III) BDNFタンパク質のマイクロ整理配列 (IV) BDNFをコードするDNAのクローニング (V) BDNFの発現 (VI) BDNF遺伝子およびタンパク質 (VII) 抗−BDNF抗体の生成 (VIII) BDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加的メンバ ーの同定 (IX) 本発明の有用性 (Ｘ) 医薬組成物 (1) 脳由来神経栄養因子の精製 BDNFをコードする核酸を同定するために、マイ クログラム量のBDNFタンパク質を組織から得て、 アミノ酸配列を決定し、ついでこれを利用してオ リゴヌクレオチドプローブを設計することができ る。BDNFタンパク質が極めて稀であることは、決 定できるアミノ酸配列の量を実際上制限している。
BDNFは、Barde等(1982,EMBO J.1:549-553）ま たはHoferおよびBarde(1988,Nature 331:261-2 62）に記載される方法によってブタ脳から調製す ることができる。
好ましくは、BDNFは、以下の詳細なプロトコー ル（これは例示のためにであり限定のために示し たのではない）に従って調製される。すなわち、 種々の改良が当業者による使用のために設定でき る。BDNFが稀であるので、好ましくは約６kgの脳 組織が精製操作に使用されよう。脳組織は、1mM EDTAおよび１mMの新たに添加されたフェニルメタ ンスルホニルフロリドを含有し、約0.2M燐酸ナ トリウムの濃度でかつ約ｐＨ６の燐酸ナトリウム緩 衝液中で、脳組織対液体の比率が脳約１kg対緩衝 液２ｌである中でホモジナイズされ得る。次いで、 塩酸を使用して上記混合物のpHを約４に調整でき、 次いで上記混合物を約２時間４℃で攪拌し得る。
次にこの混合物を25分間20,000gで遠心し得る。
遠心分離後、上清を集め、水酸化ナトリウムを用 いてpH約6.0に調整し、次いでpH６の0.1M燐酸 ナトリウムで平衡化した予備膨潤カルボキシメチ ルセルロース約１ｌ(6kgの脳組織当たり）と撹拌 する。全量約20ｌの0.1M燐酸ナトリウム，pH６、 で数回洗浄後、スラリーをカラムに注ぎ、そして 0.13M NaClを含有する同じ緩衝液で、好ましくは 一夜洗浄し得る。次にBDNF感受性バイオアッセイ （下記の(2)節を参照のこと）によって同定される 活性フラクションを、0.5M NaClを含有する燐酸 塩緩衝液で溶離し、引き続いてpH6.8の5mM燐酸 カリウム約５ｌを何回か交換して透析し得る。次 に、透析されたフラクションは、処理された脳組 織１kg当たり約20mlの床容量を有するヒドロキシ アパタイトカラムに適用し得る。上記ヒドロキシ アパタイトカラムは、試料の適用に先立ちpH6.8 の5mM燐酸カリウムを用いて予め平衡化すべきで ある。次いで、上記カラムを、いずれもpH約6.8 の5mM燐酸カリウム500mlおよび700mM燐酸カリ ウム500mlからなる直線状グラジェントにより溶 離し得る。最適にはBDNF活性は、約500mM燐酸カ リウムで溶離されるべきである。次いで、プール された活性フラクションを約700mM燐酸カリウム の最終モル濃度に調整し、そしてpH6.8を有する 700mM燐酸カリウム溶液で平衡化したフェニル− セファロースカラム（脳組織各６kg当たり約５ml 量を有する）に適用し得る。同じ緩衝液約40mlで 洗浄した後、BDNF活性を0.1M燐酸カリウム，pH 6.8、で溶離し、続いてBDNF活性を蒸留水で透析 し、次いで凍結乾燥し得る。この凍結乾燥した物 質を次に0.1% SDSゲルは含有するが好ましくメ ルカプトエタノールを含有しないSDSゲル電気泳 動試料用緩衝液にとり、そして10〜25%アクリル アミドの直線状グラジェントからなるSDSゲルに かける。電気泳動分離完了後このゲルを約10分間 クマシーブルーで染色し、そして約20分間汚れを おとす。チトクロムｃマーカーのレベルで移動す るバンドを切断し、そしてゲルから電気泳動によ り溶離する。SDSはWeberおよびKuter(1971,J. Biol.Chem.246:4504-4509)に記載されるよう して大部分除去する。SDSの除去は一般に不完全 であることに注意すべきである。BDNFをマイクロ 配列決定するための精製法はHoferおよびBarde （1988,Nature331:261〜262）により改変され、 そして精製の最終工程にはゲル電気永動を使用し ない。
(2) 脳由来神経栄養因子バイオアッセイ BDNF活性を定量的にあるいは定性的に示す任意 のシステムが本発明に従って使用できる。かかる バイオアッセイは、天然型または組み換えBDNF活 性を同定および／または測定するのに有用であり 得る。
当業上知られた任意のBDNFバイオアッセイを使 用できる。例えば、ニワトリ胚背根神経節(DRG) ニューロンをBarde等(1980,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.77:1199-1203)に記載されるように してBDNFアッセイに使用できる。
例示すると、６〜14日令ニワトリ胚、好ましく は10〜12日令ニワトリ胚からの背根神経節を当業 上知られた切開法を用いて集め、そして少量の F14培地(GIBCO F-12パウダーから調製、Vogel ら，1972,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69:3 180-3184に記載のごとく補添）に直ちに入れるこ とができ、そしてこの培地は切開の終了時に約 0.1パーセントトリプシンを含有するCa2+および Mg2不含燐酸緩衝食塩水(PBS)で置き換えなけれ ばならない。37℃で約20分のインキュベーション 後、この神経節を遠心し、そして約10パーセント （容量／容量）熱−不活性化ウマ血清を含有する F14培地で２回洗浄し得る。次いで、この神経節 を小さい（約１mm）直径のシリコーン処理パスツ ールピペットを使用して穏やかに摩砕（約10〜15 吸引）することによって解離させ得る。次に組織 の残りの塊は、細胞浮遊液を約40μｍサイズの細 孔を有するナイロンメッシュに通すことによって 除去されるのが好ましい。次にこの細胞浮遊液を 約210分間プラスチック製組織培養皿にプレ塗布 しうる。この期間中に非ニューロン細胞のほとん どがプラスチック表面に付着し、浮遊液中にニュ ーロン富化された細胞集団が残る筈である。細胞 を次に塗布用培地（好ましくは、抗生物質と一緒 に10パーセント（容量／容量）熱−不活性化ウマ 血清を補添したF14培地）の１ミリリットル当た り約５×10３細胞の濃度に希釈し、そしてポリオ ルニチン、あるいは好ましくはポリオルニチン／ ラミニン被覆組織培養皿に入れることができる （下記を参照のこと）。
限定するつもりはないが別法として、NGFに対 して比較的に非感受性のBDNFバイオアッセイは、 ある状況においては、ある条件下にBDNFおよび NGFの両方に応答しうる上記のDRG系のような系 よりも好ましくあり得る。かかる比較的BDNF特異 的システムには、網膜神経節培養物並びに神経プ ラコード由来のニューロンからの培養物が包含さ れる。
周産期の網膜細胞は、Johnson等(1986,J. Neurosci.6:3031-3038)に記載の方法に従って培 養され得る。例えば、網膜を周産期の動物から取 り出し（ラットにおける本明細書での「周産期」 なる用語は胚17日令胚から生後48時間以内の出生 直後のラットを言う）、カルシウムおよびマグネ シウムを含まない燐酸緩衝食塩水(PBS)中で洗浄 し、次いで約0.05〜0.1％トリプシンを含有する PBS中で約15分間約37℃でインキュベートする。
タンパク分解的消化の後、網膜を、10パーセント （容量／容量）熱−不活性化ウマ血清を含有する F14培地(F14-HS)中で洗浄し得る。次に網膜を少 量（約１〜10ml）の新たなF14-HS中で穏やかにピ ペッティングすることによって解離させることが できる。未解離の組織は沈降させ、そして残りの 細胞および培地をピペット分離して培養すること ができる。
あるいはまた、神経プラコード由来細胞からな るBDNFバイオアッセイを本発明に従って用いるこ とができる。例えば、三叉神経節または前庭、膝 状、錐体または結節神経節の腹側外側部分の胚脳 神経外植物を、培地で覆われたコラーゲン−ゲル 中でDavies等(1986,J.Neurosci.6:1897-1904) に記載されるようにして培養するかあるいはBaede 等(1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:11 99-1203)に従って解離させることができる。
BDNFに対する応答性が、増殖基質をポリオルニ チンからポリオルニチン／ラミニンに変えること によって10倍増加させうることが観察されている ので(Bardeら，1987,Prog.Brain Res.71:185- 189)、BDNFアッセイは、ラミニン含有基質上で行 うことが好ましい。培養物表面は、例えば(I)培 養物表面を約８〜10時間ポリオルニチンの滅菌溶 液で被覆し；(II)数回滅菌水で洗浄し；そして (III)PBS中の約25μg/ml濃度のラミニンで約２ 時間培養物表面を被覆することによって調製する ことができる(Johnsonら，1986,J.Neurosci.6: 3031-3038)。
本発明により用いられるいかなるバイオアッセ イシステムにおいても、BDNF用量−応答曲線を当 該技術分野で知られた方法を使用して確立できる。
解離したニワトリ知覚神経節アッセイを用いると、 半−最大生存は、約5ng/ml精製BDNF濃度で観察さ れ、そして最大生存は約10〜20ng/ml精製BDNF濃 度で観察された(Bardeら，1987,Prog.Brain Res. 71:185-189)。
(3) 脳由来神経栄養因子タンパク質のマイクロ配 列決定 脳から調製されたBDNFタンパク質は配列決定す ることができるが、BDNFタンパク質が極めて稀な のでBDNFタンパク質配列の実質的部分を確かに得 ることができなさそうなことを強調しなければな らない。このタンパク質は、直接配列決定するこ とができるし、あるいは例えばそれらに限定され るものではないがスタフィロコッカス・アウレウ ス(Staphylococcus aureus)V8、トリプシンおよ びシアノーゲンブロミドを含む任意のプロテアー ゼまたは当業上知られたその他の化合物で最初に 切断することができる。ペプチドは、Hewick等 (1981,J.Biol.Chem.256:7990-7997)および Hunkapillar等(1983,Methods Enzymol.91:227 -236)の方法に従って気相マイクロシーケンサー での自動化エドマン分解によって配列決定するこ とができる。次いで、フェニルチオヒダントイン アミノ酸の検出を、Lottspeich(1985,Chromato graphy 326:321-327)に従って行うことができる。
アミノ酸配列の重なるフラグメントを決定し、そ して連続配列の長い伸びを推定するのに使用でき る。
(4) 脳由来神経栄養因子コードDNAのクローニン グ BDNFが稀少であることがBDNF遺伝子をクローニ ングするための標準的方法の使用を事実上排除し ている。例えば、入手しうるタンパク質配列を使 用して相補性の標識されたオリゴヌクレオチドプ ローブを生成させ、そしてこのプローブを使用し て、BDNFを合成すると想定される組織から生成さ れたcDNAライブラリーをスクリーニングするなら ば、陽性クローンの数はほとんどないほど小さく なろう。本発明は、好適な量のBDNFタンパク質の 精製、BDNFタンパク質のマイクロ配列決定、オリ ゴヌクレオチドプローブの誘導、cDNAライブラリ ーの作製、誘導されたBDNFアミノ酸配列に基づく 増幅、そして最後にBDNF遺伝子の選択からなる操 作の組合せにより、BDNF遺伝子のクローニングを 提供するものである。本発明のこの方法において、 増幅に関する好ましい操作は、クローニングに利 用可能なBDNF配列の数を増加させるために、ポリ メラーゼ連鎖反応(PCR)による組織核酸配列の増 幅を使用するものである(Saikiら，1985,Science 230:1350-1354)。好ましい方法の詳細な説明は以 下の通りである。
初めに、精製BDNFタンパク質から誘導されたア ミノ酸配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応に使用 するオリゴヌクレオチドプライマーを導き出すこ とができる。数個の核酸トリプレットが同一アミ ノ酸を特定できる遺伝子コードの縮重ゆえに、多 重のあり得るヌクレオチド配列組合せに備えるた めには、数種のオフゴヌクレオチドを所定のアミ ノ酸配列に関して製造しなければならない。得ら れるオリゴヌクレオチドを縮重プライマーと呼ぶ。
ポリメラーゼ連鎖反応(PRC)は、センス鎖並び にアンチセンス鎖プライマーを必要とする。従っ て、BDNFアミノ酸配列に相当する縮重オリゴヌク レオチドプライマーは、一つのDNA鎖のためのプ ラーマーとして使用でき、そして共通に存在する DNA配列に相同な第２のプライマー、例えばmRNA のポリアデノシン末尾の逆転写から生じるチミジ ン残基の伸びを第２のDNA鎖のプライマーとして 使用できる。次にこれらのプライマーを、BDNFコ ード配列例えばゲノムDNAまたは好ましくはBDNF を合成すると想定される組織から回収されたmRNA から調製されたcDNAを含有すると推定される核酸 鋳型とのポリメラーゼ連鎖反応に使用することが できる。次いで、このDNA反応生成物を、DNA反 応生成物がBDNF遺伝子の予想される寸法と同様の 分子寸法を有するかどうか判定するために電気泳 動によっておよび好ましくはヌクレオチド配列分 析によって分析することができる。
しかしながら、PCRにおける２種類の縮重プラ イマーの使用がBDNFをコードしない核酸配列を増 幅させる可能性を高めるので、好ましい方法は一 方のみが縮重プライマーでもう一方のプライマー が正確なBDNF配列に相当する使用を提供するもの である。正確なBDNF配列を同定するためには、精 製BDNFタンパク質を使用して決定されたアミノ酸 配列を用いて、縮重センスおよびアンチセンスオ リゴヌクレオチドプライマーの両方を設計できる。
鋳型としてBDNFコード核酸を用いてPCR反応でこ れらのプライマーの使用から得られるDNA反応生 成物は、そのプライマーを設計するのに使用され たアミノ酸の伸張部分をコードする核酸フラグメ ントである筈であり、そして予測可能な寸法を有 し得る（例えば、最低限、アミノ酸残基の数に３ を乗じた塩基対の長さ）。DNA反応生成物の配列 分析は、増幅された核酸配列が事実BDNFペプチド フラグメントをコードしうることを確証するため に、確認されたアミノ酸配列と比較することがで きる。当業上知られた任意の核酸配列化法を使用 しうるが、ジデオキシヌクレオチドチェインター ミネーター法（Sangerら，1979,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.72:3918-3921)を使用するの が好ましい。配列化は、ゲル精製されたかあるい は好ましくはクローン化されたDNA反応生成物を 用いて達成できる。次にDNA反応生成物の配列を、 正確なBDNFコード配列に相当するオリゴヌクレオ チドプライマーの設計に使用することができる。
次いで、このプライマーを、縮重物でありうる第 ２プライマーと一緒に使用して最初に決定された 正確な配列のフラグメントによって表される範囲 を越えてBDNF-配列の量を拡大することができる。
例えば、それに限定するつもりはないが、センス 鎖プライマーは正確なBDNFヌクレオチド配列に相 当しうるが、アンチセンス鎖プライマーは、配列 されたフラグメントの下流で見出される可能性の ある配列の領域、例えばcDNAにおいて逆転写され たmRNAのポリアデノシン末尾に相同な縮重プライ マーであることができる。次いで、配列されたフ ラグメントの上流の配列を回復するために同様な 方法を使用する必要があろう。例えば、アンチセ ンス鎖プライマーは正確なBDNFヌクレオチド配列 に相当し、そしてセンス鎖プライマーは、配列化 されたフラグメントの上流にあるBDNF配列の領域 と相同な縮重プライマー、例えば末端デオキシヌ クレオチドトランスフェラーゼを用いてcDNAの5' 末端で添加された5'ポリアデノシン末尾であるこ とができる。従って、完全なBDNF遺伝子またはmR NAの配列を組み立てることができる。
DNA反応生成物は、当業上知られた任意の方法 を使用してクローン化し得る。当業上知られた多 数のベクター−宿主系を使用できる。可能なベク ターとして、これらに限定されるものではないが、 コスミド、プラスミドまたは変性ウイルスが挙げ られ、ベクター系は、使用される宿主細胞に適合 性でなければならない。かかるベクターとして、 これらに限定されるものではないが、バクテリオ ファージ例えばラムダ誘導体、またはプラスミド 例えばpBR322、pUCまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ▲Ｒ▼
（Ｓｔｒａｔａｇ ene)プラスミド誘導体が挙げられる。組み換え分 子は形質転換、トランスフェクション、感染、エ レクトロポレーション等を介して宿主に導入でき る。
BDNF遺伝子は、遺伝子配列の数多くのコピーを 生成させるために好適な宿主細胞を形質転換、ト ランスフェクションまたは感染するのに使用でき るクローニングベクターに挿入される。これは、 相補性付着末端を有するクローニングベクターに DNAフラグメントを連結することによって達成で きる。しかしながら、DNAをフラグメント化する のに使用される相補性制限部位がクローニングベ クター中に存在しない場合、DNA分子の末端を酵 素的に修飾することができる。制限エンドヌクレ アーゼ開裂部位を、ポリメラーゼ連鎖反応に使用 されるオリゴヌクレオチドプライマーに取り込ん でベクターへの挿入を促進することが有利である ことが証明されよう。別法として、所望される任 意の部位を、ヌクレオチド配列（リンカー）をDNA 末端に連結することによって生成させることがで きる。これら連結されたリンカーは、制限エンド ヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学 系に合成されたオリゴヌクレオチドからなり得る。
あるいはまた、開裂したベクターおよびBDNF遺伝 子をホモポリマーティリングによって修飾するこ とができる。
詳細な実施態様においては、単離されたBDNF遺 伝子、cDNAまたは合成DNA配列を取り込んだ組み 換えDNA分子による宿主細胞の形質転換により遺 伝子の多コピーを生成させることができる。従っ て、遺伝子は、形質転換体を増殖させ、その形質 転換体から組み換えDNA分子を単離し、そして必 要な場合は単離された組み換えDNAから挿入され た遺伝子を回収することによって多量に得ること ができる。
本発明の好ましい実施態様によれば、一たんBD NFをコードするcDNA由来クローンが生成されると、 BDNFをコードするゲノムクローンを、当業上知ら れた標準的技術を使用して単離できる。例えば、 標識された核酸プローブをBDNFクローンから誘導 することができ、そして例えばバクテリオファー ジライブラリーに関するBentonおよびDavis(1977, Science 196:180)およびプラスミドライブラリー に関するGrunsteinおよびHogness(1975,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961-3965)に記載 される方法を用いて核酸ハイブリッド形成によっ てゲノムDNAライブラリーをスクリーニングする のに使用することができる。次いで、回収された クローンを当業上知られた方法で制限フラグメン トマッピングおよび配列法によって分析すること ができる。
更に、付加的cDNAクローンは本発明に従って得 られた配列を使用してcDNAライブラリーから同定 できる。
(5) 脳由来神経栄養因子遺伝子の発現 BDNFタンパク質をコードするヌクレオチド配列 またはその一部分を好適な発現ベクター、すなわ ち挿入されたタンパク質コード配列の転写および 翻訳に必須なエレメントを含有するベクターに挿 入することができる。また、必要な転写および翻 訳シグナルは、天然型BDNF遺伝子および／または その側部領域によって供給されることもできる。
種々の宿主−ベクター系を使用してタンパク質コ ード配列を発現させことができる。それらには、 限定されるわけではないが、ウイルス［例えば、 ワクシニアウイルス、アデノウイルス等］に感染 した哺乳動物細胞系；ウイルス［例えば、バキュ ロウイルスに感染した昆虫細胞系；微生物、例え ば酵母ベクターを含有する酵母またはバクテリオ ファージDNA、プラスミドDNAあるいはコスミド DNAで形質転換された細菌が包含される。これら のベクターの発現エレメントは、その強さおよび 特異性が異なる。使用される宿主−ベクター系に 応じ、数多くの好適な転写および翻訳エレメント の任意の１つを使用し得る。
DNAフラグメントをベクターに挿入するための 以前に記載された任意の方法を使用して好適な転 写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配 列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクター を作製することができる。これらの方法には、イ ンビトロ組み換えDNAおよび合成技術並びにイン ビボ組み換え（遺伝子組み換え）が包含される。
BDNFタンパク質またはそのペプチドフラグメント をコードする核酸配列の発現は、BDNFタンパク質 またはペプチドが組み換えDNA分子で形質転換さ れた宿主中で発現されるように第２の核酸配列に よって調節されることができる。例えば、BDNFの 発現は当業上知られた任意のプロモーター／エン ハンサーエレメントによって制御されうる。BDNF 発現を制御するのに使用できるプロモーターには、 それらに限定されるものではないが、SV40早期プ ロモーター領域(BernoistおよびChambon,1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの長 い3'末端重複に含有されるプロモーター(Yamamoto ら，1980,Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジン キナーゼプロモーター(Wagnerら，1981,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:144-1445)メタロ チオニン遺伝子の調節配列(Brinsterら，1982, Nature 296:39-42)；原核生物発現ベクター例えば β−ラクタマーゼプロモーター(Villa-Komaroff ら，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3 727-3731)、またはtacプロモーター[DeBoerら， 1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25 (Scientific American,1980,242:74-94における"Useful
proteins from recombinant bac teria" も参照のこと)]；ノパリンシンセターゼプロモー ター領域からなる植物発現ベクター(Herrera-Est rellaら，Nature 303:209-213)またはカリフラ ワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gar dnerら，1981,Nucl.Acids.Res.9:2871)、およ び光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキ シラーゼ(Herrera-Estrellaら，1984,Nature 310:115-1
20)；酵母またはその他の菌類からのプロ モーターエレメント、例えばGal 4プロモーター、 ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、 PGK(ホスフォグリセロールキナーゼ）プロモータ ー、アルカリホスファターゼプロモーター、およ び組織特異性を示し、そしてトランスジェニック 動物で利用されている以下の動物転写制御領域す なわち脾臓房状細胞において活性なエラスターゼ Ｉ遺伝子制御領域(Swiftら，1984,Cell 38:639- 646;Ornitzら，1986,Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.50:399-409;MacDonald,1987, Hepatology 7:425-515)；脾臓ベータ細胞において 活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan,1985, Nature 315:115-122)、リンパ球において活性な 免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら， 1984,Cell 38:647-658;Adamesら，1985,Nature 318:533-538;Alexanderら，1987,Mol.Cell. Biol.7:1436-1444)、睾丸、乳房、リンパ球お よびマスト細胞において活性なマウス乳房腫瘍ウ イルス制御領域(Leder et al.,1986,Cell 45:4 85-495)、肝臓において活性なアルブミン遺伝子 制御領域(Pinkertら，1987,GenesおよびDevel. 1:268-276)、肝臓において活性なアルファ−フェ トプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら，1985, Mol.Cell.Biol,5:1639-1648:Hammerら，1987,

Science 235:53-58)、肝臓において活性な
アルフ ァ−１−アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey ら，1987,GenesおよびDevel.1:161-171)、骨 髄細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制 御領域(Mogramら，1985,Nature 315:338-340; Kolliasら，1986,Cell 46:89-94)；ヌカ中の寡 突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タ ンパク質遺伝子制御領域（Readheadら，1987, Cell 48:703-712)；骨格筋において活性なミオシ ン軽鎖−２遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature 314:283-286)、および視床下部において活性な性 腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら，19 86,Science 234:1372-1378)が包含される。
BDNF遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは、 三種の一般的方法、すなわち、(a)DNA-DNAハイブ リッド形成、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在ま たは不存在および(c)挿入された配列の発現によっ て同定することができる。第１の方法では、発現 ベクターに挿入された外来遺伝子の存在、挿入 されたBDNF遺伝子に相同の配列からなるプローブ を使用するDNA-DNAハイブリッド形成によって検 出することができる。第２の方法においては、組 み換えベクター／宿主系は、外来遺伝子のベクタ ーへの挿入によって惹起されるある種の「マーカ ー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、 抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュ ロウイルスにおける閉塞体形成等）の存在または 不存在に基づいて同定および選択することができ る。例えば、BDNF遺伝子がベクターのマーカー遺 伝子配列内に挿入された場合、BDNF挿入物を含有 する組み換え体はマーカー遺伝子機能の不存在に よって同定することができる。第３の方法におい ては、組み換え発現ベクターは組み換え体によっ て発現された外来遺伝子産物をアッセイすること によって同定することができる。かかるアッセイ は、例えば前述の第(2)節に記載されるバイオアッ セイシステムでBDNF遺伝子産物の物理的または機 能的性質に基づいて行うことができる。
一たん特定の組み換えDNA分子が同定および単 離されると、当業上知られたいくつかの方法を使 用してこれを増殖させることができる。一たん好 適な宿主系および増殖条件が確立されると、組み 換え発現ベクターを増殖させそして多量に調製で きる。先に説明した通り、使用できる発現ベクタ ーには、限定するものではないが、少数例をあげ れば、以下のベクターまたはその誘導耐、すなわ ちヒトまては動物ウイルス例えばワクシニアウイ ルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス例えば バキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオフ ァージベクター（例えばラムダ）、およびプラス ミド並びにコスミドDNAベクターが包含される。
さらに、挿入された配列の発現を調節するかあ るいは所望の特異的様式で遺伝子産物を修飾しプ ロセシングする宿主細胞株を選択することもでき る。ある種のプロモーターからの発現はある種の インデューサーの存在下に高めるることができる。
従って遺伝子工学的に作出されたBDNFタンパク質 の発現を制御することができる。更にまた、異な る宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プ ロセシングおよび修飾にとつて特徴的かつ特異的 メカニズム（例えば、グリコシル化、開裂）を有 している。適当な細胞系または宿主系を選択して、 発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプ ロセシングを確実とすることができる。例えば、 細菌系における発現を用いてグリコシル化されて いないコアタンパク質産物を生成させことができ る。酵母における発現はグリコシル化された産物 を生成しよう。哺乳類細胞における発現を用いて 異種BDNFタンパク質の「天然型」グリコシル化を 確実とすることができる。更にまた、種々のベク ター／宿主発現系は、例えばタンパク分解的開裂 のようなプロセシング反応に種々の程度に影響す ることができる。
本発明の詳細な実施態様においては、プレプロ BDNFをコードするDNAをpCMVプラスミド中にクロ ーン化し、増幅させ、そして次に燐酸カルシウム 法(ChenおよびOkayama,1987,Mol.Cell.Biol. 7:2745-2752)によってCOS細胞をトランスフェク ションするのに使用できる。次にBDNF活性部分を 細胞培地から回収することができる（後述の実施 例第５参照のこと）。
(5.1)発現された遺伝子産生物の同定および精製 一たんBDNF遺伝子を発現する組み換え体が同定 されると、その遺伝子産物を分析しなければなら ない。これは、その産物の物理的または機能的性 質に基づくアッセイによって達成できる。
ひとたびBDNFタンパク質が同定されると、これ をクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ア フィニティおよびサイジングカラムクロマトグラ フィー）、遠心分離、溶解度差を含む標準的方法 によるか、あるいはタンパク質の精製のための任 意の他の標準的方法によって単離および精製し得 る。機能的性質はそれらに限定されないがニワト リ胚背根神経節、周産期のラット網膜細胞または 神経プラコード由来ニューロンを含む任意の知ら れたBDNFアッセイを用いて評価することができる。
重要なことは、脳組織からBDNFを調製するのに 使用される方法は、最終段階として調製的ゲル電 気泳動を含むので、残留SDSの存在ゆえに完全に は活性でないBDNFを生成しようということである (BardeおよびThoenen,1985,"Hormones and Cel I Regulation,"Vol.9,Dumontら編，Elsevier Science Publishers,pp.385-390)。対照的に、 本発明は、組み換え核酸分子から産生されそして SDSを含まず、それゆえに完全な活性を有するBD NFを単離できるものである。例えばこれに限定さ れないが、本発明の抗−BDNF抗体（例えば、後述 の実施例６に記載のブタBDNFのB5-33アミノ酸フ ラグメントに対する抗体）を使用して組換えBDNF 免疫沈降またはアフィニティクロマトグラフィー によって回収し、もって界面活性剤を含まない完 全な活性を有するBDNFを生成させることができる。
本発明のさらに他の実施態様においては、例え ば、エンドプロテイナーゼArg-Cを用いて、プレ プロBDNFを活性成熟BDNFに酵素的に変換すること ができる（下記の実施例12参照）。
(6) 脳由来神経栄養因子遺伝子およびタンパク質 上記および後述の実施例第１および４に詳述の 方法を用いて、以下の核酸配列を決定しそしてこ れらの相当するアミノ酸配列が推定された。ブタ BDNF cDNA配列を決定し、そしてこれを第１図に 示す。ヒトゲノムBDNF cDNA配列が決定し、そし てこれを第５図に示し、そこにはブタ、ラットお よびニワトリからのDNA配列も示される。これら の各配列またはそれらの機能的等価物は本発明に 従って使用することができる。さらに本発明はブ タ、ウシ、ネコ、鳥類、ウマまたはイヌ並びに霊 長類源およびBDNF活性が存在する任意の他の種か ら単離されるBDNF遺伝子およびタンパク質に関す る。本発明は更に、少なくとも10個のヌクレオチ ドを含有するBDNF核酸のサブ配列に関する。かか るサブ配列は例えば核酸ハイブリッド形成アッセ イ、サザンおよびノーザンブロット分析等に使用 されるBDNF配列のハイブリッド形成可能な部分を 含有する。本発明はまた、第１図および第５図に 示されるアミノ酸配列またはこれらの機能的等価 物により、BDNFタンパク質およびそのフラグメン ト並びに誘導体を提供するものである。また、本 発明は、抗原決定基を含有するかあるいは機能的 に活性であるBDNFタンパク質のフラグメントまた は誘導体も提供する。本明細書で使用される機能 的に活性とは、知られたBDNF機能に関するアッセ イ、例えばニワトリ胚DRGアッセイに陽性の活性 を有することを意味する。
例えば、第１図および第５図に示される核酸配 列は、機能的に等価の分子を生ずる置換、付加ま たは欠失によって変更することができる。ヌクレ オチドコード配列の縮重性ゆえに、第１図および 第５図に示されると実質的に同一のアミノ酸配列 をコードするその他のDNA配列を本発明の実施に おいて使用することができる。それらには、限定 されるわけではないが、配列内で機能的に等しい アミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換に より変更され、従ってサイレント変化を生ずる第 １図および第５図に示されるBDNF遺伝子の全部ま たは一部分からなるヌクレオチド配列が包含され る。同様に、本発明のBDNFタンパク質またはその フラグメントあるいは誘導体には、限定するもの ではないが、主要アミノ酸配列として、機能的に 等価のアミノ酸残基が配列内の残基にとって代わ り、サイレント変化を来している変更配列を含む 第１図および第５図に実質的に示されるアミノ酸 配列の全部または一部分を含有するものが包含さ れる。例えば、配列内の１個またはそれ以上のア ミノ酸残基を、機能的等価物として作用してサイ レント変更をもたらす同様な極性の他のアミノ酸 で置換することができる。配列内におけるアミノ 酸の置換は、アミノ酸が属する群の他のメンバー から選択することができる。例えば、非極性（疎 水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イ ソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニ ン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ る。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、 トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギ ンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した （塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン およびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した （酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸および グルタミン酸が挙げられる。また本発明の範囲内 には、翻訳中にまたは翻訳後に、例えばグリコシ ル化、タンパク分解的開裂、抗体分子またはその 他の細胞性リガンドへの連結等によって示差修飾 されたBDNFタンパク質またはそのフラグメントあ るいは誘導体も包含される。
付加的に、所定のBDNFを、インビトロまたはイ ンビボで突然変異させて翻訳、開始および／また は終止配列を創造および／または破壊するか、あ るいはコード領域の変化を創造しおよび／または 新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を創造するか あるいはすでに存在するものを破壊して、更なる インビトロ修飾を促進することができる。当業 上知られたインビトロ特定部位の突然変異誘発 (Hutchinsonら，1987,J.Biol.Chem.253:6651)、 ＴＡＢ▲Ｒ▼リンカー(Pharmacia)の使用等を包含する がそれらに限定されない任意の突然変異誘発法を 用いることができる。
(7) 抗−脳由来神経栄養因子抗体の生成 本発明によれば、BDNFタンパク質またはそのフ ラグメントあるいは誘導体を免疫原として使用し て抗−BDNF抗体を生成させことができる。抗−BDNF 免疫応答を生成させる先の試みは、おそらく少量 の精製BDNFしか入手できなかったことが理由で成 功しなかった。タンパク質合成の組み換え技術 （本発明のBDNF核酸配列に基づく）を用いて比較 的豊富な量のBDNFタンパク質が生産できることに よって、量の不十分という問題点が解決された。
抗−BDNF免疫応答を生ずる公算を更に改良する ためには、免疫原性の増大に関連し得る分子の部 分を同定するために、BDNFのアミノ酸配列を分析 できる。例えば、アミノ酸配列を、Ｂ型肝炎表面 抗原の抗原性ペプチドを同定するのに効果的に使 用されているHoppおよびWoods(1981,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.78:3824-3828)の方法に従っ てコンピュータ分析して表面エピトープを同定す ることができる。別法として、異なる種からのBD NFの推定アミノ酸配列を比較し、そして比較的に 相同でない領域を同定することができた。これら の相同でない領域は、種々の種をこえてより免疫 原性でありそうである。
BDNFに対するモノクローナル抗体を調製するに は、培養中の連続細胞系により抗体分子を生成さ せる任意の技術を使用し得る。例えば、Kohlerお よびMilstein(1975,Nature 256:495-497)によ って最初に開発されたハイブリドーマ技術並びに トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術 (Kozborら，1983,Immnology Today 4:72)およ びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV- ハイブリドーマ技術(Coleら，1985,in"Monocl onal AntibodiesおよびCancer Therapy",Alan R.Liss,Inc,pp.77-96)等は本発明の範囲内で ある。
治療用のモノクローナル抗体は、ヒトモノクロ ーナル抗体またはキメラヒト−マウス（またはそ の他の種の）モノクローナル抗体であることがで きる。ヒトモノクローナル抗体は、当業上知られ た数多くの技術のいずれかによって作製すること ができる（例えば、Tengら，1983,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.80:7308-7312;Kozborら， 19 83,Immunology Today 4:72-79;Olssonら， 1982, Meth.Enzymol.92:3-16)。ヒト定常領域と共に マウス抗原結合ドメインを含有するキメラ抗体分 子を調製することができる(Morrisonら，1984, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851,Takeda ら，1985,Nature 314:452)。
当業上知られた種々の方法をBDNFのエピトープ に対するポリモノクローナル抗体の産生に使用す ることができる。抗体の産生には、ウサギ、マウ ス、ラット等を包含するがそれらに限定されない 種々の宿主動物を、BDNFタンパク質、またはその フラグメントあるいは誘導体の注射により免疫す ることができる。宿主の種の如何に応じて、フロ インド（完全または不完全）、鉱物ゲル例えば水 酸化アルミニウム、界面活性剤例えばリゾレシチ ン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペ プチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペ ットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび有 効な可能生のあるヒトアジュバント例えばBCG (Bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテ リウム・パルブム（Corynebacterium parvum）を 含むがそれらに限定されない種々のアジュバント を使用して免疫学的応答を高めることができる。
BDNFエピトープに対する抗体の分子クローンは、 既知技術によって調製することができる。組み換 えDNA法（例えば、Maniatisら，1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor New York を参照のこと）を使用してモノクローナル抗体分 子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列 を作製することができる。
抗体分子は、既知技術例えば免疫吸着またはイ ムノアフィニティクロマトグラフィー、クロマト グラフィー法例えばHPLC（高性能液体クロマトグ ラフィー）、またはこれらの組合せ等によって精 製できる。
分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメ ントは、既知技術によって生成させることができ る。例えば、かかるフラグメントには、限定する ものではないが、抗体分子のペプシン消化によっ て生成され得るF(ab')2フラグメント；F(ab')2 フラグメントのジスルフィド橋を還元することに よって生成され得るFab'フラグメントおよび抗体 分子をパパインおよび還元剤で処理することによ って生成され得る２FabまたはFabフラグメント が包含される。
実施例６は、BDNFタンパク質のB5-33ペプチド フラグメントに対するポリクローナル抗体の調製 を記載する。
(8) BDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加的なメンバ ーの同定 BDNFをコードする遺伝子の配列分析およびその アミノ酸配列の推定により、このタンパク質が NGFと数多くの構造的な類似性を有していること が判明した（第２図）。成熟BDNFの主要配列並び に一般的構造および前駆体タンパク質からのあり うるプロセシング様式は、NGFおよびBDNF遺伝子 が共通した祖先の遺伝子から進化したかもしれな いことを強く示唆している。成熟ポリペプチドの 領域内で、ただ３個のギャップをNGF配列に取り 込んで整合を最適化する場合、総数51のアミノ酸 同一性が多くの種からの既知のNGFおよびブタ並 びにヒトBDNFに共通である。これらの同一性には 全６個のシステイン残基が含まれており、このこ とはNGFおよびBDNFが非常に類似した二次構造を 共有していることを示唆している。更に、上記に 列挙した全ての種からのNGFおよびブタBDNFから のNGFが同一であるかあるいは１を越えない保存 的アミノ酸置換しか異ならない６またはそれ以上 のアミノ酸からなるセグメントが４個所見出され うる。従って、NGFとBDNFとが密接に関連する遺 伝子ファミリーのメンバーであることが明らかに なったと結論するのが妥当である。
BDNF/NGF遺伝子ファミリーの付加的なメンバー に関する合理的な研究は、NGFとBDNFとの間に強 力な相同性を有する保存セグメントが予想外に存 在することを利用する方法を用いて実施できる。
例えば、BDNF遺伝子ファミリーの付加的なメンバ ーは多様な核酸配列の中からBDNFおよびNGFに相 同である配列を選択し、そして更に選択された配 列の中からNGFおよびBDNFに相同でない核酸配列 をも含有するものを同定することによって同定さ れ得る。用語「相同でない」は、少なくとも約２ 個のヌクレオチドがNGFおよびBDNF配列と異なる 少なくとも約６個の連続したヌクレオチドを含有 する領域を意味すると解釈できる。
本発明の好ましい実施態様では以下の方法が提 供される。上記のそして下記第III表に記載される 各４つの保存のセグメント（「ボックス」）に相 当して、少なくとも18個のヌクレオチドの縮重 (degenerate)オリゴヌクレオチドプローブのセ ットを合成する。これらは６個の連続するコドン にわたってNGFまたはBDNFのいずれかに見出され るアミノ酸に関するありうるコード配列の全てを 表す。成熟ポリペプチドのアミノ末端に基づいて 番号付けすると（従ってプレプロBDNFのHis134が 成熟タンパク質におけるHis1として処理される）、 ４つのボックスが以下の通りに特徴付けされ得る （ヒト成熟タンパク質に基づき番号付け。第１図 に示されるDNA配列）。
第III表に示されるボックスからの配列対から誘 導される合成オリゴヌクレオチドは、該当する可 能性のある源(RNAまたはDNA)からPCR配列によっ て増幅するためのプライマーとして使用し得る。
これには、BDNFまたはNGFに密接に関連するポリ ペプチドを発現できる任意の真核生物種からの mRNAまたはcDNAあるいはゲノムDNAが包含されよ う。６種のPCR反応（すなわち：ボックス２から のプライマーを有するボックス１からのプライマ ー；ボックス３を有するボックス１；ボックス４ を有するボックス１；ボックス３を有するボック ス２；ボックス４を有するボックス２；ボックス ４を有するボックス３）だけを実行することによ って、NGFとBDNFとの間の保存配列の４つの上記 セグメントのうちの任意の２つを共有する遺伝子 または遺伝子産物を検出することができる。各ボ ックス当たり数個の異なる縮重プライマーを合成 することを選択する場合は、無理のない少数の PCR反応を用いた完全な探索を行うことがなおも 可能であろう。また、PCR反応を開始するのに用 いられるハイブリッド形成条件の厳密さを変動さ せて、未知の遺伝子とNGFまたはBDNFとの間のヌ クレオチド配列類似性を大なり小なり許容するこ ともできる。BDNF/NGF遺伝子ファミリーの未知の メンバーのセグメントがうまく増幅される場合、 そのセグメントは、分子的にクローンされ、配列 化され、そしてプローブとして使用されて完全な cDNAまたはゲノムクローンを単離することができ る。それにより次に、未知遺伝子の完全なヌクレ オチド配列の決定、その発現の分析そして機能分 析のためのタンパク質産物の生成が可能となろう。
上記の手段は、BDNFおよびNGFの両方に関連す る新規な遺伝子を同定するのに使用され、そして 後述の実施例８に記載されている。
加えて、本発明は、BDNF/NGF遺伝子ファミリー のメンバーではあるが天然には存在しない新規な 組み換え分子の設計におけるBDNF/NGF配列相同性 の使用を提供するものである。例えば、これに限 定されないがNGFおよびBDNF遺伝子の両方の一部 分を含有する組み換え分子が本発明に従って作製 され得る。かかる分子は、NGFおよびBDNFの両方 に関連する性質を示し、そして作動体並びに拮抗 体を含む生物学的活性の新規なプロフィルを示し 得よう。NGFおよびBDNFの主要配列はまた、コン ピューターシミュレーションを使用して分子の三 次元構造を予想するのにも使用し得る(Hoppおよ びWoods,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:3824-3828)。すなわち、BDNF/NGFキメラ組 み換え遺伝子は、三次元構造と生物学的機能との 相関関係に鑑みて設計できよう。同様に、実施例 ８の新規メンバーを含め、BDNF/NGF遺伝子ファミ リーのいずれか１またはそれ以上のメンバーの一 部分を含有するキメラ遺伝子を作製することがで きる。
(9) 発明の有用性 本発明は、BDNFの核酸配列、およびそれから産 生される実質的に純粋なタンパク質、そのペプチ ドフラグメントまたは誘導体に関する。BDNFが診 断および治療用途に十分な量で生産され得るのは 初めてである。同様に、本発明の結果として、初 めて入手可能となった抗−BDNF抗体、およびBDNF 核酸プローブを診断および治療に使用することが できる。本発明の詳細な実施態様ではBDNFの交雑 種利用も有用であるが、大部分の目的には同一の 種からのBDNF遺伝子または遺伝子産物を診断およ び治療の目的に使用することが好ましい。
(9.1)診断用途 BDNFをコードする核酸および、それから産生さ れたタンパク質、そのペプチドフラグメントまた は誘導体、並びにBDNFタンパク質、ペプチドまた は誘導体に対する抗体に関する本発明は、BDNF発 現パターンの変更に関連し得る神経系の疾患およ び障害の診断に利用できる。
本発明の種々の実施態様においては、BDNF遺伝 子および関連核酸配列並びにサブ配列、例えば相 補性配列は、診断用ハイブリダイゼーションアッ セイに使用できる。BDNF核酸配列または約15個の ヌクレオチドを含有するそのサブ配列は、ハイブ リダイゼーションプローブとして使用できる。ハ イブリダイゼーションアッセイを用いて、特に感 覚性ニューロン損傷および網膜ニューロンの変性 の結果生ずる状態を含むBDNF発現の変化に関連す る状態、障害または疾患状態を検出し、予知し、 診断しあるいは監視し得る。かかる疾患および状 態には、これに限定されないがアルツハイマー病、 ハンチントン舞踏病、パーキンソン病および網膜 の変性性疾患を含むCNS外傷、梗塞、感染、変性 性神経疾患、悪性腫瘍または手術後変化が包含さ れる。例えば、患者からの組織サンプル中の総 RNAを、BDNF mRNAの量の減少がニューロン変性 の指標であるBDNF mRNAの存在に関してアッセイ できる。比較的高いレベルのBDNF mRNAは、神経 芽腫腫瘍細胞において確認されている（詳細につ いては後述の実施例９を参照のこと）。従って、 本発明の詳細な実施態様においては、BDNF核酸プ ローブを用いるmRNAレベル増大の検出を神経芽腫 腫瘍を診断するのに利用できる。大部分の組織か ら合成されるBDNFレベルは極めて低いのでBDNF mRNAは特に有効な腫瘍マーカーである。
本発明の別の実施態様においては、BDNFタンパ ク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体に対す る抗体を使用して神経系の疾患および障害、特に 知覚障害および網膜の変性性疾患並びに上記した 障害および疾患を診断することができる。本発明 の抗体は、例えばかかる評価を必要とする患者か ら得られた組織サンプルを用いる原位置ハイブリ ダイゼーション法に使用することができる。更に 別の例においては、本発明の抗体は組織または液 体サンプルに存在するBDNFの量を検出および／ま たは測定するためのELISA法に使用できる。同様 に、本発明の抗体は組織または液体サンプルに存 在するBDNFを検出および／または測定するための ウエスタンブロット分析に使用できる。ELISAお よびウエスタンブロットにおいてBDNFと結合する 本発明の抗体は、後述の実施例６に記載される。
本発明の更に別の実施態様においては、BDNFタ ンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を 神経系の疾患および障害の診断に使用できる。こ れに限定されるつもりはないが特定の実施態様に おいては、標識化BDNFタンパク質またはペプチド フラグメントは、BDNFレセプター発現の変種およ び従ってBDNFに対する組織または細胞性応答にお けるありうる異常を同定するために、BDNFレセプ ターを発現する組織または細胞の同定に使用でき る。
(9.2)治療用途 BDNFをコードする核酸および、このものから産 生されるタンパク質、そのペプチドフラグメント または誘導体、並びにBDNFタンパク質、ペプチド フラグメントまたは誘導体に対する抗体に関する 本発明は、BDNF発現パターンの変更に関連し得る かあるいはBDNFまたは抗−BDNF抗体への曝露によ って利益を得ることができる神経系の疾患および 障害の治療に用いることができる。
本発明の種々の実施態様においては、BDNFタン パク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体は、 神経系が外傷、外科手術、虚血、感染、代謝疾患、 栄養不全、悪性腫瘍または有毒薬剤によって損傷 された患者に投与することができる。本発明は特 に、損傷が感覚性ニューロンまたは網膜神経節細 胞に生じている状態を、有効治療量のBDNFタンパ ク質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を投与 することによって治療するのに使用することがで きる。本発明の種々の詳細な実施態様においては、 BDNFは、これに限定されないが背根神経節または 以下の組織；すなわち、膝状、錐体および結節神 経節；第VIII脳神経の前庭聴覚複合体；三叉神経神 経節の上下顎骨葉の腹側外側極；および中脳三叉 神経核のいずれかにおけるニューロンを含む切断 された感覚性ニューロンに局所投与することがで きる。BDNF−関連ペプチドまたはBDNFタンパク質 を、切断神経の近傍に移植することができる膜、例 えばシラスティック膜に吸着させることにより投 与するのが望ましい。本発明はまた、例えば糖尿 病性神経障害、例えば多重単発神経障害に罹患し ている患者の回復を早めるのにも使用できる。本 発明の更に別の実施態様においては、BDNFタンパ ク質、またはこれから誘導されるペプチドフラグ メントあるいは誘導体は、先天的状態または神経 変性性障害、例えばこれに限定されないがアルツ ハイマー病、パーキンソン病、「パーキンソン− プラス」症候群（パーキンソン病の症状はドーパ ミン作動性ニューロンの変性から生ずる）、例え ば、進行性Spranuclear麻痺（Steele-Richardso ｎ−Ｏ１ｓｚｅｗｓｋｉ症候群）、オリーブ橋小脳皮質
麻痺 （OPCA）、シャイ−ドレーガー（Shy-Drager）症 候群（Multiple Systems Atrophy）、およびグア ムのパーキンソン症候群痴呆複合体、およびハン チントン舞踏病の治療に使用できる。特に、本発 明は知覚神経機能不全および網膜の変性性疾患に 関連する先天的または神経変性性障害を治療する のに使用できる。例えば少数例をあげれば、本発 明のBDNFタンパク質またはペプチドフラグメント あるいは誘導体は、網膜変性を伴う遺伝性痙攣性 対麻痺［ケリンおよびバーナード−ショルツ症候 群(Kjellinand Barnard-Scholz syndromes)]、色 素性網膜炎、スターガルト(Stargardt)病、ウッ シャー(Usher)症候群（先天性聴覚喪失を伴う色 素性網膜炎）およびレフサム(Refsum)症候群（色 素性網膜炎、先天性聴覚喪失および多発性神経障 害）の治療に使用できる。BDNF合成または応答性 の欠如が網膜変性およびその他の知覚機能不全の 組合せを特徴とする症候群の病因であり得る可能 性がある。
本発明の詳細な実施態様においては、BDNFタン パク質またはこれから誘導されるペプチドフラグ メントあるいは誘導体の投与は、アルツハイマー 病および／またはパーキンソン病の治療において 組織の外科的移植と組み合わせて用いることがで きる。下記実施例７および13において論考したよ うに、BDNFは、ドーパミン作動性の黒質ニューロ ンの生存を用量依存様式で増進させるのに用いる ことができ（第34図）、そのことは、パーキンソ ン病を含むがそれに限らないCNSトーパミン作動 性ニューロンの障害に対する治療にBDNFを使用し うることを示している〔特に、BDNFはパーキンソ ン病様症候群の誘発に関連する毒素であるMPPに 起因する神経毒性を防ぐのに用いるうることを示 している、後掲の実施例16に示したデータから読 み取れる〕。加えて、BDNFはCNSコリン作動性ニ ューロン、特に、基底前脳コリン作動性ニューロ ンの生存を支持することが観察されており（後掲 実施例７および11参照）、このことは、BDNFがア ルツハイマー病を含むがそれに限らないコリン作 動性ニューロンを包含した障害の治療に有効であ りうることを示している。パーキンソン病を有す る患者の約35パーセントがアルツハイマー型痴呆 にかかっていることが示されている。本発明に従 って生成されるBDNFは、この複合疾患に有効な単 一剤療法であることが判明しよう。同様に、本発 明により生成されるBDNFは、ダウン症候群と合併 したアルツハイマー病の治療に使用できる。本発 明に従って生成されるBDNFは、種々の痴呆並びに 先天性学習障害の治療に使用できる。BDNFが大グ リア細胞の増殖を抑制すると思われることも示さ れており、このことはCNSにおける瘢痕（例えば、 手術、外傷、または梗塞の後に生じる）形成の減 少へのBDNFの使用可能性、および大グリア由来 CNS腫瘍の治療におけるBDNFの使用可能性を裏書 きするものである。本発明のさらに他の態様にお いては、BDNFはNGFレセプターの発現のアップレ ギュレートに使用でき、従ってBDNFは治療を必要 とする患者に対してNGFの投与に先立つかあるいは NGFと同時に好都合に投与できる。
下記実施例10に例示するように、カイニン酸の 投与は、海馬ならびに皮質ニューロンを含むニュ ーロン中のBDNFの発現（およびより程度の低い NGFの発現）増大を誘導するのに用いることがで きる。このカイニン酸により仲介されたBDNF発現 の増大は非NMDAレセプターの阻害により遮断され ることが観察されている（下記実施例10）。した がって、本発明のBDNFおよびBDNF関連ペプチドの 発現は、カイニン酸または関連化合物、あるいは インビボまたはインビトロで同様な効果を持つこ とが見出されているカルバコール、ヒスタミンま たはブラジキニン、またはそれらの関連化合物の 投与により、さらには非の−NMDAグルタメートレ セターアゴニストによるかまたはアセチコリン、 ヒスタミンまたはブラジキニンの作用を増強する または模する他の薬剤により、インビボでまたは インビトロで誘導されうる。
本発明の更に別の実施態様においては、BDNFタ ンパク質、フラグメントまたは誘導体は、所望の 神経栄養効果を達成するのに他のサイトカインと 一緒に使用できる。例えば、限定するつもりはな いが、本発明によればBDNFをNGFとあるいは骨格 筋抽出物と一緒に使用して、感覚性ニューロンの 成長に対する相乗的刺激効果を達成することがで きる。ここで相乗効果とはBDNFタンパク質、ペプ チドフラグメントまたは誘導体と第２薬剤との組 合せ物の作用が個々に使用される同量の各物質よ り高い効果を達成することを意味すると解釈され る。BDNFが中枢神経系における広い系列のニュー ロンサブ集団の成長、発達および生存においてい まだ十分に特徴付けられていない他のCNS-由来ペ プチド因子と相乗的に作用しうることが想像され る。
更に、BDNF分子の十分な特徴付けに基づいて、 BDNFのいくつかまたは全ての生物学的機能の拮抗 体として作用しうるBDNFの新規ペプチドフラグメ ント、誘導体または突然変異体が開発され得ると 想定される。かかる拮抗体は、感覚性ニューロン 選択的除去、例えば慢性痛み症候群の治療に有効 であり得る。
本発明の更に別の実施態様においては、BDNFタ ンパク質、またはそのペプチドフラグメントある いは誘導体に対する抗体は、種々の神経学的障害 および疾患にかかっている患者およびかかる治療 を必要とする患者に投与できる。例えば、BDNFの 過剰産生に悩む患者は、かかる治療を必要としよ う。抗−BDNF抗体は、感覚性ニューロンの異常再 生（例えば手術後）の防止に、あるいは上述の通 り慢性痛み症候群の治療に使用できる。神経芽腫 組織に見出される高いレベルのBDNF mRNAに鑑み て、BDNFが神経芽腫に対するオートクリン腫瘍増 殖因子として作用する可能性があり、従って抗− BDNF抗体を治療的に投与して本発明の詳細な実施 態様における腫瘍退化を達成することができる。
(10) 医薬組成物 タンパク質、これから誘導されたペプチドフラグ メントまたは誘導体あるいはBDNFタンパク質、ペ プチドフラグメント若しくは誘導体に対する抗体 （あるいは抗体フラグメント）、あるいはBDNFと 第２薬剤、例えばNGFまたは骨格筋抽出物との組 合せを含むBDNF遺伝子産物の全部または一部分を 含有しうる本発明の活性組成物は、任意の滅菌生 体適合性製剤担体、例えばこれに限定されないが 食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中 で投与され得る。
BDNFタンパク質、ペプチドフラグメントまたは 誘導体は、第１図または第５図に実質的に示され るアミノ酸配列またはそのサブ配列からなること ができる。すなわち特に第１図に示されるアミノ 酸約134から約252までのアミノ酸配列の全部ま たは一部分または機能的に等しい配列を含有する BDNFタンパク質を使用するのが、このサブ配列が BDNF分子の機能的部分を含有すると信じられるの で好ましい。BDNFは、限定するものではないがヒ ト、ブタ、ラット、ニワトリ、ウシ、イヌ、ヒツ ジ、ヤギ、ネコ、ウサギ等を含む任意の適当な種 のBDNF遺伝子に相当する配列から誘導できる。
特定の疾患または状態の治療に有効であろうBD NFタンパク質、ペプチドフラグメント、誘導体ま たは抗体の量は、障害または状態の性質の如何に 依り、そして標準的臨床技術によって決定するこ とができる。可能な場合、用量−応答曲線および 本発明の医薬組成物を先ずインビトロで、例えば 上述のBDNFバイオアッセイ系で測定し、次いでヒ トにおいて試験するに先立ち有効な動物モデル系 で測定するのが望ましい。インビトロデータに基 づいて、本発明の詳細な実施態様においては、感 覚性ニューロンの生存を促進するのに有効な医薬 組成物は、約５〜25ng/mlの局所的BDNFタンパク 質濃度、好ましくは10〜20ng/mlのBDNFを提供で きる。本発明の付加的な詳細な実施態様において は、ドーパミン作動性またはコリン作動性ニュー ロンの成長および生存を促進するのに有効な医薬 組成物は、約10〜100ng/mlの局所的BDNFタンパク 質濃度を提供し得る。
導入方法には、これに限定されないが皮内、筋 肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口および鼻腔内 が挙げられる。加えて、本発明の医薬組成物をこ れに限定されないが心室内および鞘内注射を含む 任意の好適な経路により中枢神経系に導入するの が望ましく、心室内注射は、心室内カテーテル、 例えばOmmaya貯留器のような貯留器に結合された カテーテルによつて促進され得る。
更に、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域 に局所的に投与するのが望ましい。これは、例え ばこれに限定されないが外科手術中の局所的注入 によるか、注射によるか、カテーテルによるかあ るいはインプラントにより達成でき、該インプラ ントはシラスティック膜または繊維のような膜を 含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状物質であ る。
本発明はまた、リポソーム、微粒子またはマイ クロカプセルを介して投与されるBDNFタンパク質、 ペプチドフラグメントまたは誘導体を含有する医 薬組成物も包含する。本発明の種々の実施態様に おいては、かかる組成物を使用してBDNFおよびBD NF−関連産物の持続的放出を達成するのが有用で ありうる。
BDNF、BDNF関連物質、BDNF拮抗体または抗−BD NF抗体を活性に産生する細胞を、高められたまた は低減された濃度のBDNFを必要とする領域に導入 することができると想定される。
実施例１： ブタ脳由来神経栄養因子cDNAの分 子クローニングおよび特性決定 組織中のBDNFタンパク質がきわめてまれであ ることにより、BDNF遺伝子のクローニングに対 する標準的な方策の使用が妨げられていた。そ の代わりに、限られた量のタンパク質配列デー タを、DNA増幅技術を利用して次のように拡大 させた。すなわち、 (i)マイクログラム量のBDNFをキログラム量の ブタの脳から精製した。
(ii)精製BDNFをタンパク質マイクロ配列化技術 で分析し、そして36個のアミノ酸残基長のア ミノ酸配列を決定した。
(iii)前記(ii)で決定されたアミノ酸配列に基 づいてオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、 所定アミノ酸フラグメントをコードするDNA を増幅するために、ブタ上丘cDNAを鋳型とし て用いるポリメラーゼ連鎖反応におけるプラ イマーとして使用した。
(iv)前記(iii)のDNA反応生成物を配列化し、 そして (v)相当するオリゴヌクレオチドプライマーを 合成しそしてブタ上丘cDNAとのポリメラーゼ 連鎖反応に利用してもとの36アミノ酸フラグ メントをコードする配列の上流ならびに下流 のBDNF mRNAであるDNAの重複フラグメント を生成させた。従って、ブタBDNFに関する完 全なコード領域が二つの重複フラグメントに おいて分子的にクローンされた。
これらの工程のそれぞれの詳細は、BDNF遺 伝子のさらなる特性決定とともに、以下に示 される。
(1)材料および方法 (1.1)ブタ脳からBDNFの精製 ブタ脳からのBDNFの精製は、実質的にはHofer およびBarde(1988,Nature 331:261-262)に記 載される方法により行われた。
ブタ脳６kgを、ウルトラ・ツラックス(Ultra -Turrax)ホモジナイザーを用いて、１mM EDTA および新たに添加したフェニルメタンスルホニ ルフルオライド(1mM)を含有するpH6.0の0.2M リン酸ナトリウム緩衝液中で、緩衝液２ｌに対 し脳１kgの割合でホモジナイズした。上清のpH を１N HClでpH4.0にし、４℃で２時間攪拌し た。20,000×ｇで25分間遠心分離後、脳３kgに 相当する合一した上清（１N NaOHでpH6.0に調 整）を、0.1M燐酸ナトリウムpH6.0で平衡化し た予め膨潤させたカルボキシ−メチル−セルロ ースと１ｌと２時間撹拌した。0.1Mリン酸ナトリ ウム、pH6.0、の全量を20ｌで２度洗浄した後、 スラリーをカラムへ注ぎ、そして0.13M NaClを 含有する同じ緩衝液中で一夜洗浄した。活性な フラクションを0.5M NaClを含有するリン酸塩 緩衝液で溶離し、次に、５mMリン酸カリウム、 pH6.8、の２×５ｌで透析した。出発原料２× ３kgの処理から得られる透析フラクションを、 予め５mMリン酸カリウム，pH6.8、で平衡化し た床容量130mlのヒドロキシアパタイトカラム に加えた。次いで、カラムを５mMのリン酸カリ ウム500mlと700mMのリン酸カリウム500ml、 両方ともpH6.8、からなる直線状グラジェント を用いて溶離すると、BDNF活性は、ほぼ500mM リン酸カリウムで溶出された(Bardeら，1982, EMBO,J.1:549-553)。1.0Mリン酸カリウム を添加することにより、プールされた活性フラ クションを最終モル濃度700mMリン酸カリウム に調整し、そして700mMリン酸カリウム，pH6.8、 で平衡化したフェニル−セファロースカラム５ mlに適用した。同じ緩衝液40mlで洗浄後、BDNF 活性を0.1Mリン酸カリウムpH6.8、で溶離し、 蒸留水で透析し、そして凍結乾燥した。凍結乾 燥物質をBarde等(1982,EMBO.J.1:549-553) に記載されるようにして、0.1% SDSを含有しメ ルカプトエタノールを含有しないSDS-ゲル電気 泳動サンプル緩衝液にとり、次に10〜25％アク リルアミドの（指数関数というよりはむしろ） 直線状グラジェントからなるSDS-ゲルに加えた。
電気泳動分離の完了後、このゲルをクーマシー ブルーで簡単に（10分間）染色し、20分間汚れ を落とし、そしてチトクロームＣのレベルで移 動するバンドを切断し、ゲルから電気泳動的に 溶出させた。SDSはBarde等（1982、EMBO.J. 1:549-553）に記載されるようにして除去した。
(1.2)タンパク質の配列決定 BDNFは、直接配列決定される（アミノ酸分析 によって測定して55pモル，アミノ末端ヒスチ ジンに関する当初収量40pモル）かまたは次の ように切断された。すなわちBDNF５〜10μg(5 つの異なる調製物から）を下記操作に従って切 断した。V8:S.Aureus V8(Miles)１μｇを10 ％アセトニトリルを含有する0.2M NH4CO3,pH 8.0（全量：50μｌ）中のBDNF５μｇに加え、 室温で一夜インキュベートした。トリプシン： TPCK処理トリプシン（ウシ膵臓，Sigma Type X III)１μｇを、10mM CaCl2を含有するトリス -HCl(0.1M、pH8.0)(全量：40μｌ）中のBDNF８ μｇに加え、37℃で一夜インキュベートした。
臭化シアン(CNBr)：BDNF 10μｇを70％(v/v) ギ酸（最終濃度）中の10％(w/v)CNBrと室温で ３時間インキュベートした（全量：60μｌ）。
反応終了時にH2O 500μｌを添加後、サンプル は急速真空中50μｌに濃縮した。Tris-HCl 50 μｌ(1.0M,pH8.0)をβ−メルカプトエタノー ル５μｌと一緒に加え、このサンプルを37℃で 一夜インキュベートした。ヨードメタン５μｌ の添加後、サンプルを急速真空下に蒸発乾燥さ せた。CNBr開裂後BDNFの還元およびアルキル化 が必要であることが見出された。HPLCおよびス ワンクームンクレスSDS-ゲル電気泳動で示され るように、還元なしではフラグメントは得られ なかった（SwankおよびMunkres,1971,Anal. Biochem.39:462-477）。このことは、ジスル フィド橋がBDNF中に存在しており、そして開裂 しても遊離ペプチドを生じえない様式で配列さ れていることを示す。全ての開裂後、乾燥サン プルを0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)に再懸濁 し、そして逆相C8マイクロボアー(microbore) HPLCカラム(Applied Biosystems)に加え、そし てペプチドを0.1%TFA中の０〜60％アセトニト リルの60分直線状グラジェントを用いて、0.1 ml/分で溶離した。Waters441 UV検出器で214nm の波長で検出した。このペプチドをHewick(1981, J.Biol.Chem.256:7990-7997)およびHunka pillar(19 83,Methods Enzymol.91:227-236) に従って、気相マイクロシーケンサー（モデル47 OA AppliedBiosystems）での自動エドマン分解 により配列化した。PTHアミノ酸は、Lottspeich (1985,J.Chromatogr.326:321-327)に記載の ようにして検出した。
(1.3) DNA鋳型の調製 ブタゲノムDNAをHerrmannおよびFrischauf (1987,Methods Enzymol.152:180-183)の方 法で単離した。
cDNAを調製するにはブタの脳の上丘の６ｇ試 料から全RNAを得た。この組織標本は他方の畜 殺場において得て、切開し、そして液体窒素中 で冷凍した。標準的な方法(Okayamaら，1987, Methods Enzymol.154:3-28)を利用してRNAを 抽出した。
全RNA80μｇを、末端3'ヌクレオチドとして Ａ、ＣまたはＧを有するプライマ−混合物CGGA TCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTT（オリゴ３、3'ポ リ-A伸張部に整合し、そしてBamHI、EcoRIおよ びPstIの認識部位を含有するよう設計）を用い、 モロネイ(Moloney)マウス白血病ウィルスの逆 トランスクリプターゼを用いて転写した(BRL, RNasin１μｌを加え、そしてアクチノマイシン Dを除いた以外は製造者の指示に従った)。 (1.4)ポリメラーゼ連鎖反応 ポリメラーゼ連鎖反応は(PCR)は、Saiki等 (1985,Scince 230:1350-1354)記載の方法に従 って実施した。
(2)結果および論考 (2.1)タンパク質ミクロ配列化の結果 タンパク質ミクロ配列化の結果を第IV表に示 す。
アミノ酸配列の４つの連続セグメントはエド マン分解により決定し、次にこれを全アミノ酸 配列のほぼ1/3を表す36個のアミノ酸の配列を 推定するのに使用し得る。
(2.2)オリゴヌクレオチドの合成およびアミノ 酸フラグメントをコードするDNAを得る ためのPCRの使用 ２個の完全に縮重した17マーオリゴヌクレオ チドプライマーを、前述の(2.1)節に記載の36 アミノ酸残基フラグメントのそれぞれアミノ末 端およびカルボキシル−末端近傍における６個 のアミノ酸セグメントに関するコード配列に基 づいて化学的に合成した。特に、配列AADKKT （センス）およびKQYFYE(アンチセンス)(第３ 表で下線）に基づく17マーオリゴヌクレオチド （全てのありうるコドンに相当し、そしてオリ ゴ１およびオリゴ２で示される）の２つの別々 の混合物を化学的に合成し、そして150pモルの 各プライマーをブタゲノムDNA鋳型１μｇに加 えた。製造者の指示に従ってポリメラーゼ連鎖 反応(PCR)を用いて35回の増幅操作を実施した (GeneAmpTM,Perkin-Elemer Cetus)。変性は 94 ℃で１分間、プライマーアニーリングは45℃で ２分間そしてプライマー伸張は72℃で２分間行 われた。予想された寸法のDNAバンド(101bp) を３％アガロースゲル（エチジウムブロマイド 染色）から切断し、そしてInnis等(1988,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:9436-9440)に記 載のようにオリゴ１またはオリゴ２の100 倍過剰を用いて非対称的に増幅させた。
(2.3)cDNAフラグメントのヌクレオチド配列 得られるセンスおよびアンチセンスDNAフラ グメントは、プライマーとして32P-末端標識オ リゴヌクレオチド１および２を使用し、ジデオ キシヌクレオチドチェインターミネーター法 (Sangerら，1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U. S.A.72:3918-3921)によって配列化した。観察 されたヌクレオチド配列は、チェインターミネ ーションコドンによって中断されない１個のみ の読み取り枠を含有していた。この読み取り枠 に関する推定アミノ酸配列は、ブタBDNFのこの 領域に関して決定された実際のアミノ酸配列と 完全に一致した。
(2.4)完全なブタBDNFcDNAのクローニング ブタBDNFの完全なコード領域を二つの重複セ グメントにおいて分子クローン化した。BDNF cDNAの3'部分（センス鎖に該当する）を得るた めに前記領域内から21塩基の正しいセンス鎖BD NF配列を含有する30マーオリゴヌクレオチドプ ライマーを合成し「センスプライマー」として 役立てた。このプライマーのヌクレオチド配列 はオリゴ４，(5')AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGT C GGG (3')〔下線部は、その配列が第１図の位置 643から663までの、アミノ酸配列Thr-Ala-Val- Asp-Met-Ser-Gly（Glyコドンの最初の２塩基） をコードするBDNFのセンス鎖に相当する配列を 示す〕であった。このプライマー5'末端におけ る付加的な９個のヌクレオチドは、分子クロー ニングに使用されるSpeIおよびSalI用の好都合 な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を提供する ために包含された。３通りの縮重31マーオリゴ ヌクレオチドプライマーは、cDNAのセンス鎖上 の任意のヌクレオチド(T、GまたはC)が先行す るポリーAの伸張部と相補性であり、かつ制限 エンドヌクレアーゼBamHI,EcoRIおよびPstIの 認識部位を含有するように設計された。この 「アンチセンス」プライマー（オリゴ３）の配 列は、(5')CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTTX (3')（ここで、X=A,CまたはGである）であっ た。合成オリゴヌクレオチドプライマーをPCR により、前記ブタ上丘cDNA調製物からの配列を 増幅するのに利用した。詳細には、3'増幅DNA は、10μｌの逆転写反応物、150pモルのセンス プライマー（オリゴ４）およびPCR反応におけ るアンチセンスプライマーとしての150pモルの オリゴ３を使用して得られた。増幅DNA産物に ついてサザンブロットアッセイを行い、そして３２ P-末端標識オリゴヌクレオチドAAGGATCCTGCA GTTGGCCTTTCGAGACGG（オリゴ５、下記５’反応 においてアンチセンスプライマーとして使用さ れ、そしてBamHIとPstIの認識配列を含有）と ハイブリッド形成シグナルを生ずるバンドを切 断し、グラスミルク法(gene cleanTM)で抽出 し、EcoRIとSalIで消化し、ブルースクリプト SK+プラスミド(Stratagene)中にクローンし、 そして配列化した。
BDNFコード配列残部（上流または5'部分）を 得るためには、cDNAを前記の如く調製し、そし てポリ-A尾部は末端デオキシヌクレオチドトラ ンスフェラーゼを用いて5'末端で加えた。前記 した、各々12個の連続したT残基伸張部を含有 する３種の31マーオリゴヌクレオチドの同じ混 合物をこれらの添加ポリ-A尾部に相補的なプラ イマーを生成させるのに使用した。BDNFコード 配列の相補的な鎖に相当する17塩基を含有し、 かつ制限エンドヌクレアーゼBamHIとPstIの認 識部位を有する特有の30マーオリゴヌクレオチ ドプライマーを合成した。このプライマーの配 列は、(5')AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACG G (3')（前記オリゴ５、下線部は、第１図の709 から693位までのBDNFのコード配列のセンス鎖 と相補的な領域を示す）であった。これは、ア ミノ酸配列Pro（コドンの最終の２塩基）−Val- Ser-Lys-Gly-Glnをコードするセグメントに相 当する。このプライマーをポリA-尾部cDNAに加 え、そしてPCRによる増幅を前記のように行っ た。反応生成物をPstIで切断し、ブルースクリ プトベクター中にクローンし、そしてヌクレオ チド配列をジデオキシヌクレオチドチェーンタ ーミネーター法によって決定した。
(2.5)ブタBDNF cDNAのヌクレオチド配列 重複ブタBDNF cDNAクローンから決定された 合一したヌクレオチド配列を、推定アミノ酸配 列とともに第１図に示す。その配列は、252個 のアミノ酸のポリペプチドに関する読み取り枠 を含んでいる。開始Metコドン(ATG)の確認は、 36塩基対上流から始まる、同一読み取り枠にお ける２個の隣接する鎖終止コドン(TAG-TGA)の 存在に基づいている。精製タンパク質に関する 直接配列分析により決定されたブタBDNFのアミ ノ末端は、このポリペプチドの残基His134に相 当する。従って、配列データにより、成熟BDNF が前駆体ポリペプチポドからのプロセシングに より誘導されることが示される。残基His 134 は、配列Arg-Val-Arg-Argの直後にある。１塩 基性アミノ酸残基に続く中性残基そしてさらに ２個の塩基性残基からなるかかる配列は前駆体 ポリペプチドのタンパク分解的プロセシングの ための標的部位として関与している。成熟BDNF の推定アミノ酸配列により、塩基価(pI=9.99)、 すなわち二次元ゲル電気泳動による分別後の生 物学的活性因子評価によるBDNFの前記特性化と 一致する特性を有する119アミノ酸のタンパク 質（分子量13,511ダルトン）が予測される。
タンパク質マイクロ配列化によって決定された BDNFの一部分のアミノ酸配列（全部で64個のア ミノ酸残基）は、cDNAクローンのヌクレオチド 配列から推定されたアミノ酸配列と完全に一致 する（第１図の下線部）。前駆体ポリペプチド の配列は、少なくとも二段階においてBDNFのプ ロセシングと一致する。すなわち第１に多分18 残基のシグナルペプチドがアミノ末端から開裂 され、次にArg 133とHis 134の間が開裂され て成熟ポリペプチドが放出されよう。もし、こ のモデルが正しければ、この前駆体はプレプロ BDNFと呼ぶことができよう。
実施例２：BDNF遺伝子が多様な脊椎動物種のNGF 遺伝子と異なること (1)材料および方法 (1.1) NGFおよびBDNF DNAプローブの調製 好都合な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を導 入するために数種の保存コドン置換基を有する正 常ヒトNGFコード配列を取り込んだ、成熟ヒトNG Fをコードする合成遺伝子を含有するプラスミド をBritish Biotechnologies Limitedから購入し た。一対の18-マーオリゴヌクレオチドプライマ ーを合成してアミノ酸残基9〜111のコード領域 に相当するこの遺伝子の270塩基対セグメントの PCRによる増幅ができるようにした。標識DNAプ ローブを得るためには、10サイクルのPCR反応を32 P-dCTPを用いて行った。もとの鋳型としてブタ ゲノムDNAを用いて増幅を行い、そして増幅され たセグメントが成熟BDNFのアミノ酸28〜111のコ ード領域に相当する以外は同様の方法でBDNFプロ ーブを得た。アミノ酸106〜111の領域に相当す る相補鎖（「アンチセンス」）プライマーを合成 し、このものは配列[(5')ACATACACAGGAAGTGTC(3')] を有した。センス鎖オリゴヌクレオチドプライマ ーは、アミノ酸残基28〜33[(5')GCAGTGGACATGTCG GGT(3')]の領域に関して調製された。これらの２ つのプローブを用いるサザンブロットハイブリッ ド形成(Southern,1975,J.Mol.Biol.98:503- 517)を２×SSC中で68℃にて厳密な条件下で行っ た。
(1.2)種々の種からのBDNF遺伝子の配列決定 上記の成熟ブタBDNFのアミノ酸28〜111のコー ド領域を含有する同じ２種の18マーオリゴヌクレ オチドをプライマーとして使用して標準PCR条件 下にブタ、ラット、ニワトリおよびヒトのゲノム DNAの252塩基対セグメントを増幅し、そして得 られたDNA反応生成物を、ジデオキシヌクレオチ ドチェインターミネーター法(Sangerら，1979, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3918-3921) により整理配列した。いくつかの場合には、増幅 されたDNAのバンドを切断しそしてアガロースゲ ル電気泳動後に抽出し、そして配列化に先立って 再び増幅した。それ以外の場合は再増幅は必須条 件ではなかった。
(2)結果および論考 本発明以前には、BDNFタンパク質はブタからし か精製されていなかった。BDNFが単にブタ神経成 長因子ベータサブユニット（ベータ-NGFまたは本 明細書において単にNGFと呼ぶ）ではないという ことを明確に示すことは最も重要であり、その精 製および分子クローニングは今日まで報告されて いない。先に報告されたブタBDNFの物理的性質が 種々の種からのβ-NGFモノマーのものと実質的に 同一であるので、これは特に決定的に重要である。
ブタBDNFに対する中和抗体の欠如、およびブタBD NFに関するアミノ酸またはヌクレオチド配列情報 の欠如ゆえに、BDNFとNGFとの間の正確な関係を 決定することが不可能であった。BDNFとNGFとの 間の生物学的活性において観察された相違が、例 えばブタとある種の他の種（例えばマウス）との 間のNGFの相違を単に反映するにすぎないか、あ るいは異なる組織（例えばブタ脳対マウス唾液腺） におけるNGFタンパク質分子の特異的修飾から生 ずるものかあるいはブタ脳からの精製の際のある 段階においてタンパク質に不適切に導入された修 飾から生じうることは想像できた。
BDNFが明らかにNGFと相違することが見出され るなら、BDNF遺伝子が他の種、特にヒトに存在す るか否かを決定するのは非常に重要である。本発 明以前には、BDNFがほんの１種からしか精製され なかったので、何らこの点に関する情報が得られ なかった。種々の粗製抽出物および馴化培地中に おけるNGFと明白に相違する神経栄養活性の存在 は、ブタBDNFと同一または実質的に等しい物質の 存在の意味するものではなかった。
ブタBDNFの予想されるアミノ酸配列を多くの種 （ヒト、ウシ、モルモット、マウス、ニワトリお よびヘビ）からのNGFの既知配列と比較すると、 NGFが相互に関連するよりもBDNFの方が脊椎動物 NGFとの関連性がかなり劣ることが示された（第 ２図）。成熟BDNFの主要構造の際立った特徴は、 NGFとのその類似性である。すなわち、整合性を 最適化するのにほんの３つの相違をNGF配列に導 入するだけで51の同一性が種々のNGF（ヘビからヒ ト）およびBDNFに共通である（第２図）。重要な ことに、これらの同一性には全６個のシステイン 残基が包含される。BDNFのジスルフィド橋の正確 な配列は未だ知られていないが、かかる架橋が存 在することは明らかである（第III表，凡例）。BD NFに見出される３個のトリプトファンおよび２個 のフェニルアラニン残基はNGF中の同一位置で見 出される。本発明者等は、６個のアスパラギン酸 残基（BDNF中の７個のうち）および７個のバリン （９個のうち）が哺乳動物NGF類およびBDNFの同 一位置に存在することにも注目する。これら５種 類のアミノ酸は、２種のタンパク質の間のアミノ 酸同一性の約半分を占める。逆に、BDNFと全ての NGF類との間にはいくつかの際立った相違が存在 する。すなわち、既に述べた３個の相違に加えて、 アミノ酸が全てのNGFにおいて同一であるがBDNF で異なる21個の位置も存在する。
ほとんどのBDNF前駆体配列は、２つの例外を除 いてNGFのものとは関連しない。すなわち、BDNF の推定分泌シグナル配列が５個のアミノ酸同一性 （18個のアミノ酸のうち）を示すこと、および翻 訳開始メチオニンの後の18位に見出されるア ラニン残基の後に開裂が生ずることが示される (Edwardsら，1988,Mol.Cell.Biol.8:2456-24 64)マウスNGFのシグナル配列と全体的に極めて 相関性が高いことである。BDNFの18位にも見出さ れるアラニンがBDNFシグナル配列の除去に関する ありうる開裂部位でありそうである。NGFとのそ の他の類似性は、アスパラギン126に相当する唯 一のN-グリコシル化コンセンサス配列（第１図に おける二重下線）で始まることである。このアス パラギンは、成熟BDNFを生成する開裂部位の８ア ミノ酸前に存在する。同一の配置は、数種のNGF 並びに前駆体の最後の４アミノ酸としての配列 Arg-X-塩基性-Argに見出される（Schwarzら，1989, J.Neurochem.52:1203-1209）。
NGFおよびBDNFが種々の脊椎動物種における異 なる遺伝子によってコードされるという証拠は、 分子クローンされたヒトNGFおよびBDNFから DNAプローブを調製し、そして制限エンドヌクレ アーゼEcoRIで消化したゲノムDNAとのサザンブ ロットハイブリダイゼーションを行うことによっ て得られた。以下の供給源すなわちヒト、サル、 ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ および酵母からのゲノムDNAを分析した。DNAを EcoRIで消化し、そして二通りのフィルター上で 32 P-標識ヒトNGFプローブおよびBDNFプロー ブを用いてサザンブロティングにより分析した。
酵母を除く試験された全ての生物において各プロ ーブで１個のバンドが観察された。ほとんどの場 合において、任意の１つの生物においてNGFおよ びBDNFプローブとハイブリッド形成するバンドは 異なる電気泳動移動度を示したが、数例において （例えばマウス）は、NGFおよびBDNFプローブと ハイブリッド形成するEcoRIフラグメントは略同 一寸法であり、そして用いた電気泳動条件下では 分解できなかった（第３図）。
成熟BDNFをコードする配列の一部分をブタ、ラ ット、ニワトリおよびヒトのゲノムDNAからPCR によって増幅し、そしてヌクレオチド配列を決定 した。ブタゲノムDNAから増幅された領域のDNA 配列分析により、ブタ脳cDNAからの分子クローン により得られた配列結果が正確に確認された。こ の252塩基対セグメントに関するラット、ヒトお よびニワトリBDNFのゲノム配列も決定された（第 ５図）。特に、ラットおよびヒトにおいて、少な くともアミノ酸28から111までの領域に関する推 定アミノ酸配列は、ブタBDNFのそれと同一であっ たが、多くのヌクレオチド相違（例えば、コドン の第３位の保守的変化）が種々の種のうちで観察 された。ニワトリにおいてはこの領域で１個のア ミノ酸置換が観察された。すなわち成熟タンパク 質の残基61が哺乳動物BDNFのメチオニンに比較し てニワトリにおいてはリジンである。上記のサザ ンブロットハイブリダイゼーション実験と共にこ の配列データにより、BDNFがNGFをコードするそ れと異なる非常に保存された遺伝子によつてコー ドされるという明確な証拠が提供された。
実施例３：ニューロン対非−ニューロン組織にお けるBDNF RNAの発現 (1)材料および方法 (1.1)RNAの調製 全RNAを成体雌マウス組織からOkayama等（1987， Methods Enzymol.154:3-28）に従って抽出した。
要約すると、凍結組織を5.5Mグアニジニウムチオ シアネート中でホモジナイズし、そして溶解物を 遠心分離して細胞屑を除去し、そして1.51g/mlの 密度に調整したトリフルオロ酢酸セシウムのクッ ション上に上清を積層させた。125,000×gでSW 27スゥィンギングバケットローター（Beckmann）中 で24時間遠心した後、RNAを再懸濁させ、エタノ ールおよび8M酢酸アンモニウムで再沈澱させ、そ して−70℃で保存した。電気泳動は1.3%アガロ ース−ホルムアルデヒドゲル上でLehrach等（1977， Biochmistry 16:4743-4751）に従い実施した。RNA をナイロン膜（Hybond-N,Amersham）に移し、そし て50％ホルムアミドを含有する２×SSCの１ml中 で32P-標識cRNAマウスBDNFプローブ（107cpm,以下 を参照のこと）と62℃で一夜ハイブリッド形成さ せた。0.1×SSC中で65℃で60分間洗浄した。洗浄 後、ブロットを0.1μg/ml RNアーゼA(Pharmacia) と室温で60分間インキュベートし、そしてフィル ムを−70℃にて（増感スクリーンで）48時間曝し た。
(1.2)cRNAプローブの調製 マウス脳cRNAライブラリーを、２個の独立した BDNFオリゴヌクレオチドでスクリーニングした。
二重陽性クローンを単離し、そしてブルースクリ プトSK+プラスミド(Stratagene)のEcoRI部位中に サブクローンした。ブタ配列のヌクレオチド350 〜829に相当するヌクレオチド配列（第１図）を 決定した。この配列において、総計で４個のみの アミノ酸相違がマウスとブタBDNFとの間で見出さ れ、このことはブタとマウスBDNFとの間のこのド メインの著しい保存度を示している。この鋳型お よびT3ポリメラーゼ（Promega）を用いて一本鎖RNA プローブを調製した。このプローブの特異活性は 108cpm/μgであった。
(2)結果および論考 ノーザンブロット分析を使用してニューロン対 非−ニューロン組織におけるBDNF mRNAの発現を 評価した。ノーザンブロット分析はマウス組織を 使用して行い、RNA抽出がブタ組織より迅速に行 えるようにした。32P-cRNAプローブにより、脳 （第４図）および脊髄（データは示さず）で約 1.46kbのシグナルが検出された。重要なことに、 腎臓、消化管、肺、肝臓、脾臓、心臓および筋肉 を含む他のすべての組織中ではシグナルは検出さ れなかった（第４図）。ブタmRNAの寸法をマウス のものと同様と仮定すると、第２図に示される cDNA配列は、完全なmRNA配列の80％以上を表して いる。
BDNFの生理学的記述における重要な観察は、こ のタンパク質をコードするmRNAが中枢神経系にお いてのみ見出されそして７種の非-CNS組織には見 出されないということである。BDNF mRNAは脳全 体のみならず（第４図）、脊髄および上丘にも見 出された（第１図に示される配列は完全に上丘cD NA鋳型に由来する）。これらのデータは、BDNFが 標的由来神経栄養因子であり、そしてBDNF−応答 性ニューロンがCNSに固有であるかあるいはCNS 構造に直接連結されているという着想を裏書きす るものである。事実、BDNFに応答することが知ら れている全てのニューロンはいままでのところ背 根または頭蓋知覚神経節のようにCNS中に突き出 ているか（Lindsayら，1985,Dev.Biol.112:319 -328;Daviesら，1986,J.Neurosci.6:1897- 1904）、あるいは網膜神経節細胞のようにCNSニ ューロンである（Johnsonら，1986,J.Neurosci. 6:3031-3038）。明らかに、CNSにおけるBDNF合成 部位の正確な分布を検査するには詳細な研究を行 う必要があるが、BDNF mRNAの分布が多くの非− CNS組織に見られるNGF mRNAのそれと非常に相違 することは既に明白である（Heumannら，1984,EM BO J.3:3183-3189;Sheltonら，1984,Proc Natl. Acad.Sci.U.S.A.81:7951-7955）。
実施例４：ヒトおよびラットBDNF遺伝子の分子 クローニングおよび特性決定 (1)材料および方法 (1.1)ゲノムDNAおよびcDNAライブラリー ラムダ-ZAPIIにおける成人ヒト網膜cDNAを Stratageneから得た。EMBL3/SP6/T7におけるヒト 胎盤ゲノムDNAライブラリーはClontechから得た。
λgtllにおけるヒト胎児脳cDNAライブラリーは Clontechから得た。EMBL3/SP6/T7におけるラット ゲノムDNAライブラリーはClontechから得た。両 ゲノムライブラリーは、ゲノムDNAのSau 3A制限 エンドヌクレアーゼによる部分的消化およびベク ターのBamHI部位への連結によって調製した。ラ ムダ-ZAPIIにおけるラット脳cDNAライブラリーは Stratageneから得た。
(1.2)BDNF DNAプローブの調製 32P-標識BDNF DNAプローブは、ヒトBDNFの残基 28〜111のコード領域を増幅するためのヒトゲノ ムDNAを用いるPCR反応において、上述の実施例 ２の(1.1)節に記載されたと同一のオリゴヌクレ オチドプライマーを用いて調製された。平行して、 ラットBDNF−特異的32P-標的プローブを、PCRの 鋳型としてラットゲノムDNAを用いて得た。
(1.3)ライブラリーのスクリーニング ラムダファージライブラリーを標準法（Benton およびDavis,1977,Science 196:180-182;Mani atisら，1878,Cell.15:687-701）に従い、デキ ストラン硫酸を含有する50％ホルムアルデヒドお よびDenhardt溶液中で42℃にてハイブリッド形成 させてスクリーニングした。フイルターは、42℃ で50％ホルムアルデヒド、5XSSCPE、10% Denhardt 溶液、0.5mg/mlサケ精子DNA、0.1% SDSおよび10 ％デキストラン硫酸中で予めハイブリッド形成さ せた。Denhardt溶液が２％であり、サケ精子DNA が0.1mg/mlであり、そしてSDSおよびデキストラ ン硫酸排除した以外は同じ緩衝液中でハイブリッ ド形成を行った。ハイブリッド形成後フィルター を68℃で洗浄した。ヒトBDNFプローブを使用して ヒトゲノムDNAおよび網膜cDNAライブラリーを選 抜した。ラットBDNFプローブを使用してラットゲ ノムDNAおよび脳cDNAライブラリーを選抜した。
また、ライブラリーを上述の実施例２の(1.1)節 で調製したヒトおよびラットNGFプローブを用い ても選抜した。
(2)結果および論考 少なくとも670,000プラークが各ライブラリー から選抜された。陽性ヒトクローン基は、ヒトBD NFプローブとハイブリッド形成したが上記のヒト NGFとはハイブリッド形成しなかったものである と考えられた。BDNFゲノムクローンは、ヒトおよ びラットライブラリーの両方から半数体ゲノム当 たり１コピーの、BDNF遺伝子の提示に一致した頻 度で得られた。ラットおよびヒトゲノムライブラ リーの両方に関して、約1,000,000個のプラーク が選抜された。３個の陽性物がラットゲノムライ ブラリーから得られ、そしてヒトゲノムライブラ リーからは１個が得られた。ヒト網膜およびラッ ト脳cDNAライブラリーからの陽性クローンは、非 常に低いレベルで発現される遺伝子と一致した頻 度で得られた。すなわち、ラット脳cDNAにおいて は670,000中２個の陽性物が同定され、ヒト網膜 cDNAライブラリーにおいては、670,000クローン 中で１つが同定された。ヒト胎児脳から調製され た市販cDNAライブラリーからの670,000のうち陽 性クローンは何ら検出されなかった。ヌクレオチ ド配列化は、ヒトBDNF cDNAおよびゲノムクロー ンについて、上述の実施例２の(1.2)節で決定さ れたようにしてヒトおよびラットBDNFコード領域 内からの正確な配列を表す合成オリゴヌクレオチ ドプライマーを用いて行われた。得られた最長ヒ トcDNAクローンは、約1.6〜1.8kbpの挿入物を有 しており、そして予想されたように、上述の実施 例２．(2)節に記載の、ヒトゲノムDNAからの直 接増幅後に決定されたヒトBDNFの一部分の正確な 配列を含有していた。このcDNA（第５図）クロー ンの詳細な配列分析により、ブタBDNFに対する完 全な長さの前駆体に類似するが同一ではない247 個のアミノ酸のポリペプチドをコードする読み取 り枠が明らかになった。成熟BDNFポリペプチドに 相当する領域内では（例えばHis134のコドンから チェイン終止コドンまで）、推定アミノ酸配列の 相違は見出されなかった。すなわち、ブタとヒト との間の全てのヌクレオチド置換がコード特異性 に関して保存的であった。推定BDNF前駆体ポリペ プチドの残りはヒトとブタとの間のいくつかのア ミノ酸配列相違を示しており、再も注目されるの はブタに見られる６個の連続するSerコドンのう ち５個がヒトBDNF遺伝子中に存在せず、若干短い ポリペプチドを生ずることである（247対252アミ ノ酸）。
ベクターEMBL3において調製されたライブラリ ーは、外来DNAの10〜23kbpの挿入物を有する。
詳細に分析されたヒトゲノムBDNFクローンにおけ る正確な挿入物の寸法は測定されなかった。しか しながら、このクローンはライブラリーを選抜す るのに使用された標識BDNFプローブとハイブリッ ド形成した約4kbpの１個のEcoRI制限エンドヌク レアーゼフラグメントを含有していた。このフラ グメントは、ヒトゲノムDNAの上述のブタBDNFプ ローブとのサザンブロットハイブリダイゼーショ ンに基づいて予測される寸法である。配列分析は バクテリオファージDNA鋳型からのDNA合成を開 始させるためのcDNA配列である合成オリゴヌクレ オチドを用いて、ヒトクローンに対して行われた。
推定ヒトBDNF前駆体のコード配列は、第５図にお けるヌクレオチド785におけるバリン（GTC）に代わ るメチオニン（ATG）へのアミノ酸置換に相当する、 プレプロ領域における１個のヌクレオチド置換を 除けばヒトcDNAクローンにおけるそれと同一であ ることが見出された。この変化は、ヒトゲノムの 多形現象を反映するものであろう。ヒトNGFの場 合におけるように、推定ヒトプレプロBDNFのコー ド配列内には何ら介在配列は検出されなかった。
ラットcDNA配列データも第５図に示される。
実施例５：組み換えBDNFの発現 (1)材料および方法 (1.1)BDNF発現ベクターの調製 ブタプレプロBDNFに相当する配列は、ブタゲノ ム鋳型１μgを用いるPCR反応にオリゴヌクレオ チドプライマー（各150pモル） ATAATCTAGATGACCATCCTTTTCCTT（センス） ATAATCTAGACTATCTTCCCCTCTTAAT（アンチセンス） を使用することによって得られた（各プライマー は添加XbaI部位を有する）。増幅反応は、アニー リング温度が50℃である以外は上記の通りであっ た。Xbalで消化後、増幅されたDNAを、プラスミ ドpCMV1のXbal部位に連結して、pCMV1-pBDNF-1 を生成させ（-1は第６図におけるセンス方向を示 し、そして第Ｖ表におけるCOS+に相当する）、そ してプラスミドをエレクトロポレーションによっ てXL-1細菌中に導入した。
(1.2) COS細胞におけるBDNFの発現 陽性クローンからのpCMV1-pBDNFプラスミドDNA （オリゴ５とのハイブリッド形成により確認，第 ２図）をXbaIおよびPstIの両方で切断した。得ら れた生成物の寸法により挿入物の方向を決定でき、 そして両プラスミドを用いて、燐酸カルシウム法 （Chenら，1987,Mol.Cell Biol.7:2745-2752） によりCOS細胞をトランスフェクションし、そし て増殖培地を24時間後に回収した。BDNF活性は、 上記に詳述したニワトリ胚背根神経節アッセイで 検査した。
(2)結果および論考 E8ニワトリ脊髄感覚性ニューロンを塗布し（１ ウェル当たり6,000）、24時間インキュベートし、 そして24時間後にカウントした（Lindsayら，1985， Develop.Biol.112:319-328）。値は、３回の測 定の平均±標準偏差である。BDNFおよびNGFは最 大生存がどちらの因子でも観察される1ng/ml濃度 で使用された。COS+は、センス方向でBDNF挿入物 を含有するプラスミドでトランスフェクションさ れた細胞を示し、そしてCOS-は、逆方向でBDNF挿 入物を含有するプラスミドでトランスフェクショ ンされた細胞をさす。COSはトランスフェクショ ンされない細胞を指す。1:20以上の希釈度で、対 照以上の生存はCOS-馴化培地でもCOS馴化培地で も見出されなかった。NGFなしの全ての実験にお いて、モノクローナル抗-NGF抗体（Korschingら， 1988,Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3513- 3516）を１μg/mlで使用した。
第Ｖ表に示される通り、センス方向のpCMV1-pB DNFプラスミドを担持するCOS細胞の培養物から 得られた培地だけが対照値以上のニワトリ感覚性 ニューロン生存と関連した。従って、組み換えBD NFは生物学的に活性である。更に、ブタ脳から単 離されたBDNFの添加は組み換えBDNF単独から生ず る生存レベルを有意に越えず感覚性ニューロンの 生存を増大させず、このことは組み換えBDNFがBD NFレセプターを飽和させうることを示している。
また、組み換えBDNFはNGFと一緒に使用された場 合にニワトリ感覚性ニューロン生存を促進するこ とに対し相加的または相乗的効果を有することも 観察された。
実施例６：BDNFに対する抗体の生成 (1)材料および方法 血清４で示されるBDNF特異的ポリクローナル抗 血清は、合成ペプチドでの免疫化によりNZ白ウサ ギ中に生成させた。
(1.1)ペプチド合成および担体への結合 B5で示される34個のアミノ酸残基からなるペプ チドを慣用の方法で合成した。このものは、所望 によりm-マレイミド安息香酸-N-ヒドロキシスク シンイミド（MBS）を用いる担体タンパク質への結 合ができるように、アミノ−末端で付加的なシス テイン残基を有する（イタリックで示す）成熟BD NFの33残基（第１図に示される完全なブタプレプ ロBDNF配列）の残基153〜185までに相当する以 下のアミノ酸配列を有している：すなわち Cys-Val-Thr-Ala-Ala-Asp-Lys-Lys-Thr-Ala-Val- Asp-Met-Ser-Gly-Gly-Thr-Val-Thr-Val-Leu-Glu- Lys-Val-Pro-Val-Ser-Lys-Gly-Gln-Leu-Lys-Gln- Tyrである。
B5ペプチドはビスジアゾベンジジン（BDB）を用 いてウシ血清アルブミン（BSA）に結合させた。新 たなBDBは、ベンジジン-HCl（p-ジアミノジフェ ニル-HCl，Sigma社製）46mgを0.2N HCl 9.0mlに 溶解させることによって調製した。NaNO235mgを H2O 1.0ml中に溶解し、そしてベンジジン溶液に 添加し、４℃で１時間攪拌した。BSA 21mgを0.16 Mボレート、0.13M NaCl,pH9.0，の3.0ml中に 溶解した。B5ペプチド約15mgをボレート−NaCl緩 衝液pH0.0、1.5mlに溶解した。このペプチド溶 液をBSA溶液に添加し、そして水中に置いた。BDB 1.0mlをBSA-ペプチド溶液に添加し、そしてこの 反応混合物を攪拌しながら２時間４℃でインキュ ベートした。pHを監視し、そして必要により少量 の0.5M NaOHの添加により9.0の範囲に保持した。
反応は、1%フェノール−緩衝溶液0.2mlの添加に より停止させた。過剰の試薬は、燐酸緩衝食塩水 （PBS）で透析することによって除去した。
(1.2)免 疫 化 総計６匹のウサギを以下のプロトコールに従っ て免疫した。
ウサギ１および４−BDBを使用し、C-末端でBSA に結合したペプチドB5； ウサギ２および３−MBSを使用し、N-末端でBSA に結合したペプチドB5； ウサギ５および６−粉末ニトロセルロースと混合 したペプチドB5。
全ての場合において、第１回の免疫化にはPBS 0.5mlプラス完全フロインドアジュバント0.5ml 中における免疫原1mg（ウサギ５および６に関して は100μg B5/500μgニトロセルロース）を使用 した。この混合物を背面で多重の部位に皮下注射 した。第２回の免疫化は３週間後に行われ、そし て不完全フロインドアジュバントを完全フロイン ドアジュバントの代わりに使用する以外は第１回 目の免疫化と同じであった。続くブースター投与 は４〜６週間の間隔で行われた。ウサギを免疫化 １週間後採血し、そして抗血清を純粋B5ペプチド への結合に関してエンザイムリンクトイムノソル ベントアッセイ（ELISA）によってルーチンにチェ ックした。
(1.3)BDNFへの抗体結合の検出 H2O中の抗原（B5ペプチド）100μgをマイクロ タイタープレート上のウェルに添加し、そして一 夜乾燥させ、次いでH2Oで簡単に洗浄し、1%ゼラ チン100μgで30分間室温で遮断した。ウェルを 蒸留水で３回洗浄し、次に抗血清100μgを添加 して４℃で一夜インキュベートした。次いでウェ ルをPBS/0.05% Triton X-100で３回洗浄した後、 100μgペルオキシダーゼ標識抗−ウサギイムノ アッセイ（1/1000希釈）をウェルに添加し、そし て室温で３時間インキュベートした。ウェルを２ 回洗浄し、そしてABTS溶液100μg(0.1Mクエン 酸Na1 pH4.0,10mlプラス10μg H2O2中に溶解し たABTS(Sigma)10mg）を添加して発色するまで約 ５分間インキュベートした。この反応は1% NaN3 10μgの添加によって停止させた。サンプルをH2O で1:5に希釈し、そして光学濃度を415nmで測定 した。
(2)結果および論考 ウサギ４からの抗血清（血清４）は最高の力価 を示し（第７ａ図）、そして引き続く実験に使用 された。血清４からの抗体を硫酸アンモニウムに よる沈降によって部分的に精製した。すなわち、 抗血清の一部分に同量の飽和硫酸アンモニウムを 攪拌しながらゆっくりと添加し、そして溶液を更 に15分間攪拌し、次いで2,000×gで遠心した。
ペレットを、50%飽和硫酸アンモニウム中で２回 洗浄し、次いで血清の最初の容量に相当する量の PBS中に再溶解した。硫酸アンモニウムはPBSを 数回交換して透析した。透析した溶液を1.0ml量 ずつに分け、そして高速真空を用いる凍結乾燥に かけた。血清４抗体のサンプルをH2O 0.5mlに再 懸濁し、そしてELISAによってペプチドB5との反 応性について試験したところ、1:4000の希釈度ま で反応することが見出された。
ブタBDNFの33アミノ酸フラグメントに相当する 合成ペプチドに対するポリクローナル抗体は、上 記のようにしてウサギを免疫することによって生 成された。合成ペプチドに対して最高の力価を示 した血清４は、ELISAによればブタ脳からの精製 BDNFとの反応性を示した（第７ｂ図）。イムノブ ロッティング（データは示されず）によっても弱 い反応性が検出された。しかしながら、この抗血 清は、ニワトリ胚背根神経節感覚性ニューロンに 関する生物学的アッセイにおいてBDNFの活性を遮 断することができなかった。
実施例７：BDNFの新規生物学的作用 以下の観察は、BDNFが(i)生存を維持し、そし てCNSドーパミン作動性ニューロンの完全に分化 した状態を誘導し；(ii)CNSコリン作動性ニュー ロンの生存を維持し；そして(iii)大グリア細胞 の増殖を抑制できることを示している。これらの BDNFの生物学的作用は今まで記載されていない。
ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニュ ーロンおよびに大グリア細胞はそれぞれ神経学的 疾患または障害と関連しうるので、BDNFはこれら の細胞集団が関わる神経疾患の治療に有用である ことが判明しよう。
(1)材料および方法 (1.1)ドーパミン作動性黒質ニューロンの培養法 胚日令13から15日までのラット胚の脳から腹側 中脳を切断した。代表的には、２ｌを各実験に用 いた。切開溶液は、以下の組成を有していた。す なわちNaCl,136.8mM,KCl,2.7mM,Na2HPO4・ 7H2O,8.0mM,KH2PO4,1.5mM,グルコース， 6mg/ mlおよびBSA,0.1mg/ml,pH7.4。この溶液を調製 し、続いて0.2μM細孔フィルターを通して滅菌 した。切開は、非−滅菌条件下に行われた。一た ん組織が全ての脳から切断されると、残りの操作 は滅菌条件下に行われた。組織フラグメントを35 mm培養皿に入れ、そして微細なはさみを用いて細 断した。次いで、0.125%トリプシンを含有する F12栄養培地２mlを組織に添加しそして37℃でイ ンキュベートした。このインキュベーション期間 の最後に、DNアーゼＩを最終濃度が80ng/mlとな るようにスラリーに添加した。もう一回同一のイ ンキュベーションを行い、引き続いて組織スラリ ーを２mMグルタミン、6mg/mlグルコース、５単位 /mlペニシリン、5mg/mlストレプトマイシンおよ び7.5%ウシ胎児血清(FCS)を補添した最少必須 培地(MEM)からなる成長培地8.0mlに添加した。
このサンプルを机上遠心機中室温で500rpmで５分 間遠心分離した。培地を吸引し、そして成長培地 ２mlを細胞ペレットに添加した。１mmの開口部を 有する火炎磨きしたピペットを使用して細胞を８ 回粉砕した。残りの組織フラグメントを重力によ り沈降させ、そして少量の上清を取って血球計で カウントすることによって細胞数を評価した。細 胞密度を測定した後、この細胞を50,000/cm2の密 度で組織培養プレートに塗布した。
培養プレートは、切開の一日前に調製した。組 織プレート(24ウェル，２cm2/ウェル）をポリオ ルチニン（分子量30,000〜70,000g/モル），0.5mg /ml、を用い室温にて３時間予め被覆した。この プレートをよく水洗し、続いてマウスラミニン， ５μg/ml、を用いて室温で３時間処理した。次に プレートを上記のごとく水洗し、そして成長培地 の存在下５%CO2,95%空気からなる湿潤雰囲気下 に一夜37℃でインキュベートした。プレート中の 培地をその翌日除去しそして新たな成長培地と交 換した。
一たび細胞を培養プレートに塗布すると、細胞 を37℃および５% CO2/95%空気に設定されたイン キュベーター中に24時間置いた。培地を以下の組 成すなわち、基礎イーグル培地(BEM)と、インス リン(25μg/ml)、トランスフェリン(100μg/ml)、 プトレッシン(60μgM)、プロゲステロン(20nM)、 セレン酸ナトリウム(30nM)、ペニシリン(5U/ml)、 ストレプトマイシン(5mg/ml)およびT3(5nM)を補 添したグルコース(33mM)、グルタミン(2mM)、 NaHCO3(15mM)、HEPES(10mM)を有する栄養混合物 F-12との1:1（容量：容量）混合物を有する無血清 配合物(SFM)に変えた。数例の実験においては、 培養第２日にSFMに培地交換後に精製BDNFを培養 物に添加した。
ドーパミン作動性ニューロンの培養に用いられ る溶液は、Milli-Q試薬水系から取った水を用い て調製した。組織培養培地配合物はウシ胎児血清 （ロット番号43N1086）およびマウスラミニンと 同様にGibco Laboratories(Santa Clara, Cali fornia)から得られた。全てのその他の培地成分 はSigma Chemical(St. Louis, MO)から購入し、 そして細胞培養液試験等級であった。ポリオルチ ニンおよびDNアーゼＩもSigmaから得た。トリプ シンは、Worthington(Freehold,NJ)，ロット番号 3667、から得られた。市販化学薬品は、分析等級 であり、Baker Chemical(Phillipsburg,NJ)から 購入した。これらの実験に使用されたBDNFはブタ 脳からBarde等1982の方法に従ってY.-A Barde博士 により精製された。
(1.2) 腹側中脳培養物の免疫細胞化学的染色法 固定溶液は各実験につき新たに調製した。チロ シンヒドロキシラーゼ(TH)の染色用の固定液は、 Sorensonのリン酸塩緩衝液中の4.0%パラホルムア ルデヒドであった。Sorenson緩衝液は、0.2M KH2PO4溶液を0.2M Na2HPO4の原液にpHが7.3にな るまで添加することによって調製した。次にパラ ホルムアルデヒドをこの溶液に添加し、そして短 時間加熱してこれを溶解させ、そして使用前まで 室温に冷却した。
操作を開始するには、培養皿から穏やかな吸引 によって培地を除去し、そして適切な固定溶液を ゆっくりとこの皿に添加した。20分間室温でイン キュベーションを行った。次にSorenson燐酸塩緩 衝液中で穏やかに回転させながら３回各５分間ず つ洗浄した。次いで細胞を室温で穏やかに回転さ せながらクエンチ溶液中で30分間インキュベート した。THに関して染色すべき培養物用のクエンチ 溶液は２％正常ウマ血清を含有するSorensonリン 酸塩緩衝液から構成された。次に、培養物を透過 緩衝液中室温で30分間穏やかに回転させながらイ ンキュベートした。この溶液は２％サポニンお よび、THに関して染色すべき培養物については 1.5％の正常ウマ血清を含有するSorenson緩衝液 から成っていた。透過段階に続いて、培養物を一 次抗体の存在下に４℃で一夜インキュベートした。
ラットTHに対する抗体は、アイソタイプIgG2aの マウスモノクローナル抗体であった。これは10mM NaPO4、50mM NaCl、0.2%サポニン、pH7.5、か らなる溶液中40μg/mlで使用された。一次抗体イ ンキュベーションに続いて培養物を好適な透過緩 衝液中で各15分間ずつ５回洗浄した。次に、培養 物を、ビオチニル化ウマ抗−マウスIgGであるビ オチン接合二次抗体とインキュベートした。この インキュベーションは、室温で穏やかに回転させ ながら２時間行われた。続いて上述と同様の洗浄 を行い、次に培養物を製造者のプロトコルに従っ て調製されたアビジン−ビオチニル化セイヨウワ サビペルオキシターゼの予め形成された複合体(A BC試薬，Vector Laboratories,Burlingame,CA) の存在下にインキュベートした。穏やかに回転さ せながらの室温での30分インキュベーションの後、 培養物を上述のようにして洗浄した。続いて培養 物を0.5mg/mlジアミノベンジジンおよび0.01％過 酸化水素を含有する55mMトリスHCl pH7.3とイ ンキュベートした。反応生成物の発色を２〜５分 間進行させ、次いで溶液を除去し、そして培養物 を数回氷冷PBSで洗浄した。次いで、１cm2当たり の陽性細胞数を確認した。
パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒ ドはFluka Chemicalから得た。正常血清（遮断剤 として使用）、ビオチニル化された、アフィニテ ィー精製抗−免疫グロブリン、アビジンDHおよび ビオチニル化HRP-Hを含有するベクタステイン (Vectastain)キットはVector Laboratoriesから 購入した。ジアミノベンジジンはBRL(Gaithersberg, MD)から得た。
(1.3)腹側中脳培養物における3H-ドーパミン取 込みの測定に用いられる方法 3H-ドーパミン(3H-DA)取込みは若干の変更を 加えDal Toso等(1988,J. Neurosci.8:733-745) に記載されるようにして実施した。取込み緩衝液 は以下の組成すなわち、NaCl 136.8mM、KCl,2.7 mM、Na2HPO4・7H2O,8.0mM、KH2PO4,1.5mM、グ ルコース，5.0mM、CaCl2,1.0mM、MgSO4,1.0mM、 アスコルビン酸，0.1mM、パルジリン，0.1mM,pH 7.4を有していた。必要な場合は5.0μMベンズ トロピンメシレート(BZT)を上記取込み緩衝液に 添加した。
細胞を予め加温(37℃）した取込み緩衝液で１ 回洗浄しそして0.4ml取込み緩衝液/2cm2ウェルで 置き替えた。培養物を37℃で５分間プレインキュ ベートした。プレインキュベーションの終了時に、 取込み緩衝液中の3H-DA 0.1ml(250nM,40Ci/mモ ル）を緩衝液中の最終3H-DA濃度が50nMとなるよ うに添加した。培養物を37℃で15分間インキュベ ートし、続いて取込み緩衝液0.5mlずつを用いて ４℃で４回洗浄した。氷冷PBS(10mM NaPO4,150 mM NaCl,pH7.6)による２回の洗浄もさらに行っ た。最終の洗浄の完了後、0.5N NaOH 0.2ml/２cm2 ウェルを細胞に添加し、そして室温で２時間放置 した。次にNaOH抽出物を回収し、そして「ultima gold」シンチレーション液を用いてシンチレーシ ョンカウンター(Packard,LS 500TD)でカウント した。特異的取込みは、5μM BZTの存在下にお いては見られない取込みと定義された。代表的に は、これは観察された全取込みの70〜90％であっ た。
3H-DAはNEN(Boston,MA)から得た。アスコル ベート、パルジリン、BZTおよびグルコースは Sigma)St.Louis,MO)から得た。ultimagoldシン チレーション液はPackard(Sterling,VA)から購 入した。
(1.4)基底前脳コリン作動性ニューロンの培養物 の調製法 基底前脳コリン作動性細胞の一次培養物は胚日 令17日のラットから調製した。詳細には、この研 究に使用されるコリン作動性ニューロンは内側中 隔核およびブローカ(Broca)の対角線バンドの核 に由来した。このニューロン集団は主として海馬 に突起している。解離された混合培養物（ニュー ロンおよびグリア）は以下の方法で調製した。中 隔領域を周囲組織を含まないように切り離し、そ して胎児脳からとり出した。次いでこの組織片を プールし、鋏で細断しそして125%トリプシンで37 ℃で20分間処理した。トリプシンを、塗布培地 （1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、5%ウ マ血清および1% N3を含有するダルベッコ改変イ ーグル培地(DMEM)、ホルモン補添）中への希釈に より不活性化した。単離細胞懸濁液は消化された 組織フラグメントを火炎磨きパスツールピペット で粉砕することにより調製した。解離細胞を血球 計でカウントし、そして好適な密度で塗布培地中 に塗布した。試験リガンドを塗布５〜６時間後に 培養物に添加し、次いで３日毎に培地交換を行い ながら細胞を10日間インビトロ成長させた。
(1.5)コリンアセチルトランスフェラーゼアッセイ 処理期間に続いて、細胞をコリンアセチルトラ ンスフェラーゼ(CAT)酵素アッセイに使用するか あるいは下記のプロトコルに従ってCATに関する 免疫組織化学的染色のために処理した。CATに対 するモノクローナル抗体はBoehringer Mannheim Biochemical Co.から購入し、このものは他の場 所で特徴付けされている。実験期間の終了の時に 細胞をDMEMで２回すすいだ。培養物を二段階法に よって固定した。すなわち、４％パラホルムアル デヒド50μｌをDMEM50μｌに加えて10分間イン キュベーションした。この溶液を除去し、そして ４％パラホルムアルデヒド100μｌで置換しそし てインキュベーションを30分間室温で続けた。固 定化に続いて細胞を燐酸緩衝食塩水(PBS)で３回 すすぎそしてサポニン(0.5mg/ml)と30分間インキ ュベーションすることにより透過性化した。界面 活性剤はをPBSによる３回の洗浄により除去し、そ して5%正常ウサギ血清の遮断溶液を30分間添加し た。遮断溶液の除去に続いて１％正常ウサギ血清 中1:3の希釈度で一次抗体を添加し、そして培養 物を４℃で一夜インキュベートした。一次抗体を 含有する溶液をPBS洗浄により除去した。結合さ れた免疫グロブリンはVectastain"ABC"法により 検出した。ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB)を 通常１〜５分間行われるペルオキシダーゼ反応 用の基質として使用した。この反応は培養物を 0.1MトリスHCl pH7.2で２回すすぐことにより停 止させた。培養物は0.15M NaCl,42%グリセロー ルおよび0.15% Zephiran(Pierce Chemical Co., Rockville, IL)を含有する50mMトリス，pH7.6中 で４℃で保存した。
(1.6)精製大グリア細胞培養物を生成させる方法 精製グリア培養物は、基本的にMcCarthyおよび DeVellis(McCarthy K.D.and DeVellis,J.,1980, J.Cell.Biol.85:890-902)の方法により出生１ 〜２日後のラット海馬から調製した。海馬を５匹 の子ラットからとり出しそして鋏で細断した。次 いで組織片を0.125％トリプシン２ml中20分間 37℃で消化した。このプロテアーゼは塗布培地 (10%ウシ胎児血清Gibco,DMEM,0.5% ペニシリ ン(5000mcg/ml)および0.5%グルタミン）で希釈す ることにより不活性化した。単離細胞懸濁液は、 消化された組織フラグメントを狭窄したパスツー ルピペットに通すことによって調製した。この細 胞を900rpmで５分間遠心することによってペレッ ト化し、塗布培地中に再懸濁させ、そして血球計 でカウントした。単離細胞懸濁液を３個の75cm2組 織培養フラスコに分け、そして細胞を集密の約80 ％まで増殖させた。次いで細胞を上記と同様なト リプシン処理プロトコルに従ってサブ培養した。
グリア細胞をカウントし、そして10,000細胞/0.9 cm2の密度で塗布した。
(2)結 果 (2.1)腹側中脳培養物に存在するチロシンヒドロ キシラーゼに及ぼすBDNFの効果 上述の(2.1)節に記載された免疫細胞化学的染 色を用いてチロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性細 胞の数に及ぼすBDNFの効果を測定した（第８図）。
対照の200パーセント以上の最大増加がBDNF刺激 された腹側中脳細胞培養物中で第８日までに観察 された。BDNF刺激培養物においては早くも培養第 ３日目に非常にわずかな増加が観察された。
(2.2)腹側中脳培養物によるドーパミン取込みに 及ぼすBDNFの効果 3H-ドーパミン(3H-DA)取込みを上記の(1.3) 節に記載されるようにして、若干の変更を加えた Dal Taso等(1988,J.Neurosci.8:733-745)の方 法に従って測定した。培養第８日目までにドーパ ミン取込みの若干の増加がBDNF刺激腹側中脳培養 物中において観察された（第９図）。
(2.2)前脳コリン作動性ニューロンによるコリン アセチルトランスフェラーゼ発現に及ぼす BDNFの効果 第10図(a)は、インビトロで12日間の成長期間 に続くCAT陽性細胞の数に及ぼすBDNFの効果を示 す。CAT細胞数の5.9倍の増加がBDNF 100ng/mlの 添加により観察され、一方EC50は10ng/mlと計算 された。陽性対照として、１ウェル当たり260,000 （黒棒）または150,000（斜線棒）細胞における培 養物を、NGF（第10b図）におけると同じ方法で処 理した。１ウェル当たり260,000個の細胞密度は、 BDNF調査に使用されたそれに相当する。このCAT 免疫陽性細胞数増加は先に報告されたものと同様 である。コリン作動性ニューロンに作用するBDNF の動力もCAT酵素活性を測定することにより検べ られた(F.Fonnum;J.Neurochemistry,1975,24 :407-409)。第11図はBDNF処理により生ずるCATの 変化を示す。この場合BDNF100ng/mlで1.8倍の増 加が達成され、そしてEC50は61ng/mlと計算され た。
(2.4)大グリア細胞培養物に及ぼすBDNFまたはEGF の効果 II型星状細胞は種々の神経伝達物質および神経 ペプチドに対する高いアフィニティレセプターを 有することが示されている。従って星状細胞はニ ューロン由来シグナルに応答できる。このため、 そしてII型星状細胞が一次培養物における細胞成 分であるので、グリア細胞に対するBDNFのあり得 る直接的効果を試験した。細胞は４日間インビト ロで保持し、次に成長因子を添加して集密の約60 ％まで到達させ、次いで42時間EGFまたはBDNFで 処理した。インキュベーションの最後の18時間、 [3H]メチルチミジンを培地に存在させた。EGFの 効果を第12図(a)に示す。先に報告されている通り、 EGFは星状細胞に対して分裂促進性であることが 判明した。最大応答はEGF 10ng/mlで観察され、 これは[3H]メチルチミジン取込みの5.2倍増加を もたらした。第12図(b)は、[3H]メチルチミジン取 込みに及ぼすBDNFの効果を示す。BDNFに対する応 答は二相性であると思われる。すなわち、非常に 低い用量(0.1ng/ml)ではチミジン取込みに若干の 増加をもたらし、一方1ng/ml BDNFを越える用量 では[3H]メチルチミジン取込みが阻害された。５ ng/mlの用量ではBDNFは24％の阻害を生じ、この ことは処理期間をこえるグリア細胞増殖速度の減 少を示唆している。
(3)論 考 これらのインビトロ実験は、胚ラット中脳由来 のこれらニューロン培養物におけるチロシンヒド ロキシラーゼ染色およびドーパミン取込みによっ て示される通り、BDNFが生存を維持するかあるい は発達中のラット黒質のドーパミン作動性ニュー ロンの完全な分化状態を誘導することを明らかに 示している。これらはパーキンソン病において変 性するニューロンであるので、BDNFがニューロン の損失を低減させることによるかあるいはチロシ ンヒドロキシラーゼのレベル（ドーパミン合成に おける律速酵素）を高めることによるかあるいは その両方によってパーキンソン病に治療効果を有 する可能性が高い。
更に、神経成長(NGF)と同様に、コリンアセチ ルトランスフェラーゼ(CAT)染色の増大、CAT活 性増大およびラット胚内側中隔核およびブローカ ーの対角線バンド核の培養物におけるアセチルコ リンエステラーゼ染色増大によって示される通り、 BDNFはラット基底前脳のコリン作動性ニューロン の生存に効果を有すると思われる。従って、BDNF は単独であるいはNGFと組み合わせて、基底前脳 のコリン作動性ニューロンに影響する疾患または 障害、例えばアルツハイマー病の治療に有用であ り得る。
実施例８：BDNF/NGF遺伝子ファミリーにおける新 規遺伝子の同定 NGFとBDNFとの間のアミノ酸配列セグメントの 保存に基づく（ボックス１〜４：前記(8)節を参照 のこと）縮重オリゴヌクレオチドとのPCRを用い ることによりBDNF/NGF遺伝子ファミリーの新規メ ンバーを同定する方法は、先ずかかるプライマー 対が数種のゲノムDNAからのNGFおよびBDNF遺伝 子配列の両方を増幅させるのに使用できるか否か 判定することにより試験した。次いで、この方法 を使用して前記全４ボックスの相同性において NGFおよびBDNFと相同性を共有する新規遺伝子を 同定した。
(1)材料および方法 (1.1)ポリメラーゼ連鎖反応 PCRは、実質的に前記実施例１に記載されるよ うにして実施した。
(2)結 果 (2.1)ゲノムDNAからのNGFおよびBDNFの両配列 の増幅 NGFおよびBDNFの間のアミノ酸配列保存のボッ クス１およびボックス２の部分に相当する縮重合 成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し（上述 の(8)節を参照のこと）、そしてラットゲノム遺伝 子とのPCR反応に鋳型として用いた。正確なプラ イマー配列は以下の通りである（オリゴヌクレオ チド合成段階に包含された２個またはそれ以上の 塩基の混合物を用いる縮重の位置を括弧内に示す ；下線つき部分は、続く配列クローニング段階に おけるベクターへの連結を促進するために付与さ れた多重制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有す す末尾を示す；A=アデニン、G=グアニン、C=シ トシン、T=チミジン、N=A,G,C,Tの混合物であ る。）： ボックス1(センス),プライマー1B: 5'-GACTCGAGTCGACTCGGTGTG(C,T)GACAG(C,T)(A,G) T(C,T,A)AG-3' ボックス2(アンチセンス),プライマー2C: 5'-CCAAGCTTCTAGAATTCCA(C,T)TT(N)GT(C,T)TC (A,G)(A,T)A(A,G)AA(A,G)TA(C,T)TG-3' 各縮重プライマー混合物300ngをPCR用の標準 反応混合物１00μｌ中のラットゲノムDNA 500ng に添加した。それぞれ94℃で１分、43℃で２分そ して72℃で２分のインキュベーションからなるサ イクルを35回行った。これらのプライマーを使用 したBDNFまたはNGF遺伝子のいずれかのPCR増幅 の生成物の予測サイズは、引き続くクローニング 段階にとっての便宜上包含される２個の17マー「 末尾」（下線部分）を含め175塩基対であろう。
8%ポリアクリルアミド／5%グリセロールゲル上で の反応混合物の電気泳動により予測されたサイズ ，175bpを有する増幅されたDNAの主要バンドが 得られた。
(2.2)種々の種のゲノムDNAにおけるBDNF/NGFプ ローブに相補性の配列の検出 175bpバンドを、電気泳動による溶離によりア クリルアミドゲルからとり出し、そしてdGTP、dA TPおよびTTPの濃度を各々50μMに低減させ、ア ルファ-32P-dCTPトレーサーを未標識dCTPの代わ りに用いる以外は第１回目と同一反応条件下に７ サイクルの第２回目のPCR反応で更に増幅させた。
放射性標識DNA生成物をサイジングカラムでのク ロマトグラフィーにより反応成分から分離した。
次いで、「RIB/2C」で表示されるこのプローブ（プ ライマー1Bおよび2Cから増幅されたラットDNAに 関する）を第13図に示されるように、EcoRI制限 エンドヌクレアーゼによる消化およびEcoRI-消化 ゲノムDNAに対するサザンハイブリッド形成法に よってニトロセルロースへのブロッティングの後 に、種々の脊椎動物種のゲノムDNAにおける相補 性配列を検出するのに用いた（ラット、マウスお よびニワトリでの結果を第13図に示す）。
NGFおよびBDNF配列を含有するゲノムDNAの EcoRIフラグメントのサイズは、クローン化遺伝 子からのPCRにより調製された放射性標識ヒトNGF およびBDNFプローブを使用して並行ブロットでの 対照中で測定した。NGFおよびBDNFゲノムEcoRI フラグメントの位置をそれぞれNおよびBとして 第13図に示す。同様の分析の結果を、第３図に示 し、そして第３図に示されるブタBDNFプローブを 用いると同じ結果がヒトBDNFプローブを用いても 得られた。上記の通り、NGFおよびBDNFプローブ はそれぞれ種々の脊椎動物ゲノムDNAにおける１ 個のEcoRIフラグメントとハイブリッド形成した。
例えば、ラットDNAにおいては、BDNFプローブは 約8.8kbのバンドを検出し、一方NGFプローブは 約10.4kbのバンドを検出した。
第13図に示される通り、試験された全ての種に おいて（ニワトリ、マウスおよびラットに関して データを示す）R1B/2Cプローブは、NGFプローブ によって同定されたものと識別できないDNAバン ドと、並びにBDNFプローブによって同定されたも のと識別できないバンドとハイブリッド形成した （マウスでは、NGFおよびBDNFゲノムEcoRIフラ グメントは約11.5〜12.0kbに相当する同一電気泳 動移動度を有する）。これは、縮重オリゴヌクレ オチドプライマー1Bおよび2CがNGFおよびBDNF両 遺伝子からの配列を増幅させるのに使用し得るこ とを示したいる。数例においては付加的なバンド が、RIB/2Cプローブとハイブリッド形成したゲノ ムサザンブロットにおいて観察されたことは注目 すべきことである。例えばEcoRI-消化マウスゲノ ムDNAにおいては、NGFおよびBDNFのいずれにも 相当しない少なくとも２個の付加的なバンド（そ れぞれ約19.0kbおよび1.5kbの標識X1およびX2） が観察された。同様にして、少なくとも２個の付 加的なバンドがラットDNAへのハイブリッド形成 において観察され（それぞれ約7.3kbおよび1.2kb のX1およびX2）、そしてニワトリDNAにおいて少 なくとも１個が観察された（約2.6kbのX）。この 図面では明らかに標識されていない付加的なバン ドも数例において観察された。NGFにもBDNFにも 起因しないバンドの存在は、遺伝子ファミリーの 付加的なメンバーの存在の可能性を示唆している。
同様にして、BDNFおよびNGF遺伝子配列を含有す ることが知られているものと明らかに相違するバ ンドがプライマー対およびゲノムDNA鋳型の他の 組合せを用いた場合に見られた（データ示さず）。
(2.3)BDNFおよびNGFに関連する新規遺伝子の同定 BDNFおよびNGFに関連する新規遺伝子が縮重オ リゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRによっ て同定され得るという仮説の詳細な試験を、ボッ クス３およびボックス４に関するプライマー（上 記(8)節を参照のこと）および鋳型としてのマウス ゲノムDNAを使用して実施した。以下の配列を有 する縮重プライマーが合成された。
ボックス3(センス): 5'-GGGGATCCGCGGITG(T,C)(C,A)GIGGIAT(T,C,A)G A-3' ボックス4(アンチセンス): 5'-TCGAATTCTAGATIC(T,G)IAT(AG)AAIC(T,G)LCCA -3' （ここで、G=グアニン、A=アデニン、C=シトシン、 T=チミン、I=イノシンであり；オリゴヌクレオチ ド中の１つの位置における１塩基以上の混合物を 括弧内に示す）。イノシンがコドンの第３（ゆら ぎ）塩基に相当するいくつかの位置で用いられて、 遺伝子コードの縮重ができるようにしてあること に注目されたい。また、イノシンよりむしろ４個 の通常のDNA塩基の混合物を使用することも可能 であり、そして実質的に同一の結果がかかるプラ イマーで得られている。
縮重ボックス３／ボックス４プライマー対では、 マウスDNAのゲノムNGFおよびBDNF配列からのPCR により約90bpのセグメントが増幅されることが予 想された。上記に示されるプライマーを利用して、 PCRをアニーリング温度45℃で４サイクル続いて アニーリング温度49℃で31サイクル実施した。生 成物をゲル電気泳動により分析し、そして予測さ れるサイズの主要バンドが観察された。マウスに おいては、NGF遺伝子はボックス３とボックス４ との間の領域にHindII制限エンドヌクレアーゼ開 裂部位を含有するが一方BDNF遺伝子はこの領域に 酵素Apalの開裂部位を含有する。従って、HindII およびApalによるPCR増幅産物の消化により、主 要生成物バンドからNGFおよびBDNF配列が除去さ れることが予想されよう。しかしながら、PCR生 成物をこの２種類の制限酵素で明確に完全に消化 した場合、消化−耐性バンドが増幅DNAに残存す ることが見出された。このことは、NGFおよびBD NF遺伝子に加えて、少なくとも１種類の新規な遺 伝子が増幅されていることを示唆している。
(2.4)BDNG/NGF遺伝子ファミリーの新規メンバー の特性決定 消化耐性PCR生成物をゲルから溶離し、そして 非対称PCR反応に鋳型として用いた。その際もと の縮重プライマーのいずれか一方が他のプライマ ーより１00倍モル過剰に存在した。この非対称増 幅によりチェイン終止法による配列化に好適な一 本鎖DNA鋳型を生成させることができた。新規遺 伝子（本明細書において「M3/M4」と呼ぶ）の配 列分析は、M.A.Frohman,M.K.DushおよびG.R. Martin(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8998- 9002(1988))に記載される。「cDNA末端の迅速な増 幅(rapid amplification of cDNA ends」(RACE) に関する方法を用いて、ボックス３とボックス４ との間に位置する正確なプライマーと、遺伝子転 写物の3'末端におけるポリＡ配列との間の配列を PCR増幅によって更に拡大させた。DNA配列化の 結果により、NGFおよびBDNFとは異なるが両方の アミノ酸配列に密接に関連するポリペプチドをコ ードし得る読み取り枠を含有する新規遺伝子が増 幅されたことが明らかとなった（第14図）。
この新規の遺伝子が神経栄養因子をコードする という予備的証拠が、ノーザンブロットハイブリ ダイゼーションによりラット組織におけるその発 現パターンを測定することによって得られた。こ の分析では、この新規の遺伝子が検査された任意 の他の組織におけるよりもはるかに強力に脳組織 において発現されることが示された。
(3)論 考 上記の通り（第13図）、ボックス１および２に 関するプライマーを用い鋳型としてのラットゲノ ムDNAを用いてPCR増幅によって得られたDNAプ ローブ(R1B/2C)は、試験された全ての種のEcoRI- 消化DNA中のNGFおよびBDNF遺伝子配列を含有す ることが知られているバンドにハイブリッド形成 するのに加え新規のバンドにもハイブリッド形成 した。同様な分析はマウスゲノムDNAについてボ ックス３および４プライマーを使用して増幅され た新規遺伝子に対する放射性標識プローブを用い ても行われた(M3/4)。それぞれの場合に、M3/4プ ローブはBDNFおよびNGF配列を含有することが知 られているバントと異なるEcoRI-消化ゲノムDNA の１個の主要バンドにハイブリッド形成した。M3 /4プローブによるハイブリッド形成により観察さ れるマウス、ラットおよびニワトリゲノムDNAの EcoRIフラグメントが、全ての場合にR1B/2Cプロ ーブとのハイブリッド形成により得られた新規バ ンドの一つと一致することに注目すべきである。
これらは、マウスDNAの場合19.0kb EcoRIフラグ メントであり（第14図のXl）、ラットDNAの場合 7.3kbフラグメントであり（第14図のXl）そし てニワトリDNAの場合2.6kbバンドである（第14 図のX）。これは、同一遺伝子の一部が1B/2Cプラ イマー対を使用してラットDNAからそして3/4プ ライマー対を使用してマウスDNAから増幅された ことを示唆している。従って、少なくとも１種類 ８新規の遺伝子が上記の全４個の相同性ボックス においてNGFおよびBDNFと相同性を共有している ことは明らかである。
NGF、BDNFおよび遺伝子ファミリーの新規メン バー（例えば「M3/4」）間の相同性ボックスの概 念はここでは主要アミノ酸配列およびファミリー の新規の遺伝子の同定方法に関して主に表されて いる。しかしながら、これらの神経栄養因子の二 次的および三次的構造、それらの特異的レセプタ ーとの相互作用、およびあり得る治療的価値を有 する新規な分子の合理的な設計に関する付加的な かかわり合いが存在しそうなことを注目すること が重要である。
例えば、NGF中に６個のCys残基があり、そし て全てジスルフィド結合に関わっていることが示 されている。最もN-末端から最もC-末端までこれ らをCys1〜Cys6として番号付けすると、ジスルフ ィド橋がCys1〜Cys4、Cys2〜Cys5、Cys3〜Cys6 に存在することが判る。全６個のCys残基の位 置がNGFとBDNFとの間で保存されており、そして 「M3/4」の部分における３個のCys残基の位置は、 現在までにNGFおよびBDNFのCys4、Cys5、Cys6と 正確に整列するように配列された。このことは、 この遺伝子ファミリーの全てのメンバーの二次的 構造が密接に関連しており、そして保存Cys残基 によって大きく決定され得ることを示唆している。
BDNFおよびNGFに関して指摘された相同性ボック スが６個のCys残基のうちの５個（ボックス１に おけるCys1、ボックス２におけるCys2、ボックス ３におけるCys3およびボックス４におけるCys5お よびCys6）を包含することに注目すべきである。
このことは、これらのCys残基およびそれらの直 接の隣接部分がこれらの神経栄養因子の一般的構 造を決定するのに重要な役割を果たしているとい う着想を裏書きするものである。神経栄養因子の それぞれに対する高アフィニティレセプターとの 特異的相互作用に関する構造決定因子は恐らく各 分子の特有の部分中に存在する。
従って、新規のキメラ遺伝子は、既に記載され た４個の相同性ボックスのいずれかで、または分 子内のその他の場所でファミリーメンバー間の組 み換え（例えばインビトロ組み換えによるか、あ るいは直接遺伝子合成による）によって生成され 得る。かかるキメラタンパク質は、Cys残基およ びその他のアミノ酸残基の保存ゆえに同様の二次 構造を有しそうであるが、新規な生物学的性質を 有する可能性があろう。例えば、BDNF/NGFキメラ タンパク質はBDNFおよびNGF両レセプターとの相 互作用ゆえに二官能性であり得る。また、キメラ タンパク質はダイマー化およびその他の物理化学 的性質に関しても母分子と相違し得る。キメラタ ンパク質はまた、両方の親分子の拮抗体としても 機能しうる可能性がある。
BDNF/NGFの活性フラグメントを使用して、好適 な折りたたみにとって決定的に重要な「コア」領 域に関する知見に加えてどの領域がレセプターと の型−特異的相互作用に必要かに関する情報に基 づいて、他のファミリーメンバーを設計すること ができる。
新規ファミリーメンバー（例えば「M3/4」）と 既知ファミリーメンバーとの比較を用いて、BDNF /NGF遺伝子ファミリーの付加的なメンバーに関す る探査の指針となり得る新たな相同性ボックスを 明らかにすることができる。例えば、BDNFと「M3 /4」との比較により、いくつかの有効な相同性ボ ックスが示される。特に興味のあるものの一つに、 先に記載したボックス１〜４にないただ一つの第 ４保存Cys残基がある。実際にこのCys残基を包 含する、BDNFおよび「M3/4」によって共有される 長い相同セグメントまたは保存アミノ酸置換が存 在する、すなわちHis-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys-(Arg またはLys)-Thr-(ThrまたはSer)-Gln-(Serまた はThr)Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thrである。この領 域内で、有用な縮重オリゴヌクレオチドプライマ ーの合成に少なくとも２種類の相同ボックスを選 択できる（例えば、Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｃｙｓは 18マープライマーにとって96通りの縮重、または 17マーにとって48通りの縮重のみしか必要としな い；Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thrも有用なボックス であろう）。
実施例９：神経芽腫細胞におけるBDNFの発現増大 (1)材料および方法 (1.1)細 胞 系 CHP100、CHP126、CHP134、CHP234、LAN1、LAN5、 NB9、SY5Y、Y79、F01、BU2、H01、HL60およ びC0L320は第15図で用いられたノーザンブロット に関するRNAを提供したFred Alt博士の研究室で 保持された細胞系である。全細胞系はヒト腫瘍細 胞系である。CHP100は神経上皮腫細胞系であり、 CHP126、CHP134、CHP234、LAN1、LAN5、NB9およ びSY5Yは神経芽腫細胞系であり、Y79は網膜芽腫 細胞系であり、F01、BU2、H01は黒色腫細胞系 であり、HL60は前骨髄球白血病細胞系であり、そ してC0L320は神経内分泌結腸癌細胞系である。
(1.2)RNAの調製 RNAを調製し、そして完全な長さのヒトcDNAプ ローブを用い、実質的に前記前記実施例３(1.1) 節に記載のようにしてノーザンブロットを行った 。LAN1におけるRNAがあまり重く負荷されず、そ してSY5Yに１マイクログラムのポリ(A)+RNAを 使用した以外は10μgの総RNAがゲルの各レーン で使用された第15図のノーザンブロツトを得た。
(2)結果および論考 第15図は種々のヒト細胞系から得られたRNAサ ンプルのパネルにハイブリット形成したBDNFプロ ーブのノーザンブロツト分析の結果を示す。BDNF プローブにハイブリッド形成した豊富なRNAがCHP 234およびLAN5細胞系で検出されそしてより少量 がCHP126およびCHP134で見出された。全ての陽性 系がヒト神経芽腫腫瘍由来であった。
実施例10：ラット海馬におけるBDNF-およびNGF- mRNAの活性依存性調節は非NMDAグルタ メートレセプターにより仲介される (1)材料および方法 (1.1)カイニン酸でのラットの処理 ラットに、カイニン酸12mg/kgを腹腔内注射90 分後広範な発作活性を抑制するためにジアゼパム (Valium)を投与した。第19図に示されるように、 カイニン酸投与後に与えられたValiumはBDNF-お よびNGF-mRNAレベルがさらに上昇するのを妨害し なかった。Valiumを与えられなかったラットは、 カイニン酸のあとにValiumを与えられた動物と比 較した場合、カイニン酸の３時間後で海馬におい て同様のBDNF-およびNGF-mRNAレベルの増大を示 した。
(1.2)海馬培養物の調製 E17日令ラットの胚からこれを切り出しそして、 カルシウムイオンもマグネシウムイオンも含有し ないが10mMグルコース、１mg/mlアルブミン、６ μg/ml DNアーゼおよび１mg/mlパパインを含有 する燐酸緩衝食塩水(PBS)中で37℃で20分間イン キュベートすることにより海馬を調製した。パパ インを含有しない溶液で洗浄後、海馬細胞を火炎 研磨パスツールピペットを用いて注意深く解離さ せた。細胞を低速で遠心することにより集め、10 ％ウシ胎児血清を補添したDMEM中に再懸濁しそし て、ポリ-DL-オルニチン(0.5mg/ml)およびラミニ ン(5μg/ml)でプレコートしたプラスチック培養 皿(0.5×106細胞／35mm)に塗布した。塗布３時 間後、培地をBrewerおよびCotman(Brain Res. 497:65，1989)記載の補添物を有するグルタメ ートを含有しない無血清培地にとり換えた。ニュ ーロンは３週間培養まで生存能力を保っており、 そして通常塗布７日後に実験に使用された。
(1.3)RNAの増幅 全細胞性RNAはChomcynskiおよびSacci(Anal. Biochem.1987,162:156-159)記載のようにして、 短縮NGF cRNA回転標準物(30fg)の添加後細胞0.5 ×106個から抽出した。NGF mRNAおよびcRNAを、 抽出RNAの1/5、１×RT/PCR緩衝液（10mMトリス -HCl pH 8.3，50mM KCL，1.5mM MgCl2，0.1mg/ml ゼラチン，0.1％Triton X-100）、0.25mM dNTP、 各0.1μMの5'および3'プライマー、5 U RNasin (Promega)、3.2U AMT-逆転写酵素(Life Science) および2UのTaqポリメラーゼ(Genofit)を総容 量で25μｌ中に含有する合体１チューブ逆転写／ ポリメラーゼ連鎖反応(RT/PCR)中で同時に増幅 した。この混合物に鉱油を重層させ、41℃で30分 間インキュベートし、90℃で60秒間加熱し、プラ イマーを55℃で60秒間アニーリングさせそしてプ ライマーエクステンションを72℃で60秒行った。
増幅生成物(NGF mRNAでは203bpそして回収標準 物では153bp)をNuSieve／アガロース３：１ゲル (FMC Bioproducts)で分離し、Hybond Nプラス膜 (Amersham)にアルカリブロットさせそして文献記 載(Heumann,R.およびThoenen,H.,1986,J. Biol.Chem.261:9246;Lindholdら、1988,J. Biol.Chem.263:16348)のようにしてハイブリッ ド形成させた。絶対的な定量を行うには、インビ トロ転写されたNGF mRNAおよび回収標準物の既知 量を平行反応で同時増幅させた。最近、同様の方 法がWangら(PNAS 86:9719-9721,1989)によって 記載されている。
(2)結果および論考 BDNFとNGFは約50％のアミノ酸同一性を有する 遺伝子ファミリーのメンバーである（Ｌｉｅｂｒｏｃｋ
ら、 1989,Nature 341:149)。これら分子は厳密に保 存されたドメインを有する。これらのドメインの 中にはこれら分子の三次元構造の安定化に最も関 与している確率が高い６個のシステイン残基が含 有されており、このことはそれらの生物活性に必 要である。しかしながら、BDNFおよびNGFには可 変ドメインも存在しており、それらがお互いに異 なるニューロン特異性を決定している(Lindsayら、 1985、Dev.Biol 112:319;Johnsonら、1986,J. Neurosci.6:3031;Hofer,M.およびBarde,Y. 1988,Nature 331:261;Rodriguez-Tabarら、 19 89,Dev.Biol.136:296)。その上、これら２種 の神経栄養分子の間の相異はそれらの合成部位に よっても示される。NGFは末梢(Korsching,S.お よびThoenen,H.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.80:3513;Ebendalら、1983,Exp.Cell Res.148;311;Heumannら、1984,EMB0 J.3:31 83;Dhelton,D.L.およびReichardt,L.F.,19 84,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7951) および中枢神経系(CNS)(Korschingら、1985,EM B0 J.4:1389;Shelton,D.L.およびReichardt, L.F.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83:2714;Whttemoreら、1986,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.83:817;Largeら、1986,Science 234:352)の両方で発現される。NGFの応答性ニュ ーロンによる神経支配の密度は相当する標的組織 中におけるNGFのレベルを反映している(Korsching, S.およびThoenen,H.,1983,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.80:3513;Ebendalら、1983,Exp. Cell Res.148:311;Heumannら、1984,EMBO J. 3:3183;Dhelton,D.L.およびReichardt,L.F., 1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7951; Korschingら、1985,EMBO J.4:1389;Shelton, D.L.およびReichardt,L.F.,1986,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.83:2714;Whittemoreら、19 86,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:817; Largeら、1986,Science 234:352)。NGFと対照 的に、BDNFはCNSニューロン中で優勢に発現され、 そしてBDNF-mRNAレベルはNGF-mRNAのレベルより かなり高く、例えば海馬で約50倍である。末梢神 経系においては、NGFは種々のニューロンの非 ニューロン型細胞により合成されるが(Bandtlow ら、1987,EMBO J.6:891)、一方脳においては原 位置ハイブリダイゼーションにより示されるよう に(Rennert,P.D.およびHeinrich,G.,1986, Biochem.Biophys.Res.Commun.183:813;Ayer- LeLievreら、1988,Science 240:1339;Whittemore ら、1988,J.Neurosci.Res.20:403)主にニュ ーロン中に局在する。しかしながら培養された１ 型星状細胞もまたかなりの量のNGFを生成するこ とが知られている(Lindsay,R.M.,1979,Nature 282:80;Furukawaら、1987,Biochem.Biophys. Res.Commun.142:395)。脳で合成されるNGFへ のニューロンおよび星状細胞の相対的な寄与はま だ知られていない。
BDNF-およびNGF-mRNAが中枢神経系ニューロン で優勢に発現される点にかんがみて、これら２種 のmRNAレベルがニューロン活性により影響される か否か調査し、そしてそうである場合はその調節 に伝達体が関与している可能性がある。実験の第 一シリーズにおいて、胚(E17)ラット海馬からニ ューロン培養物を調製した。第16ａ図に示される ように、海馬ニューロンを高濃度(50mM)のカリウ ムで分極させるとBDNF-mRNAが高まった。最大レ ベルにはカリウム濃度増大の３〜６時間後に達し た。カリウムにより仲介されたBDNF-mRNA増大は 培地からカルシウムイオンを排除することにより 阻止でき、そしてカルシウム回路遮断剤ニフェジ ピンによりカルシウム流入を阻害することによっ ても低下された（第16ｂ図）。
用いられた海馬培養物が異なるパターンの伝達 体およびレセプター発現を示す混合ニューロン集 団からなるので、種々の生理学的および合成的レ セプターアゴニストがBDNF-およびNGF-mRNA発現 に及ぼす作用について調べた。第VI表に示される 結果は、検査したすべての物質のうち、カイニン 酸、グルタメートレセプターアゴニスト(Managhan ら、1989,Annu.Rev.Pharnacol.Toxicol.29: 365)は海馬ニューロンにおけるBDNF-mRNAをはる かに高い最大増加させることを示している。対照 的に、カルバコール（ムスカリン様レセプターア ゴニスト）および程度は下るがヒスタミンおよび ブラジキニンのような他の分子はわずかにではあ るがしかし有意にBDNF-mRNAを高めた（第VI表）。
海馬ニューロンにおけるNGF-mRNAレベルが非常に 低いので、NGF-mRNAにおける変化を測定するのに 適する定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を確 立した。この方法を用いて、BDNF-mRNAと同様に NGF-mRNAレベルも海馬ニューロン中のカリウムお よびカイニン酸により高められることを見出した （第17図）。
第18図に示されるように、海馬ニューロンにお けるBDNF-mRNAの最大の増大は約25μMのカイニ ン酸で得られた。カイニン酸濃度をさらに増大さ せると、BDNF-mRNAレベルが低下し、このことは 高濃度のカイニン酸が海馬ニューロンに及ぼす毒 性作用を反映している確率が最も高い。グルタメ ートレセプター仲介神経毒性は興奮性アミノ酸グ ルタメートの類似体の投与に続く種々の中枢ニュ ーロンに関して先に報告されている(Choiら、19 87,J.Neurosci.7:357;Rothman,S.M.および Olney,J.W..1987,Trends Neurosci.10:299; Choi,D.W.,1988,Neuron 1:623)。しかしなが ら、海馬ニューロンにおけるBDNF-およびNGF-mRNA の発現を高めるのに必要なカイニン酸の濃度は神 経毒性を生ずる濃度とははっきりと分離できた。
カイニン酸の作用をより詳しく調査するために、 BDNF-mRNAの増大が既知グルタメートレセプター アゴニスト(Monaghanら、1989,Annu.Rev.Phar macol.Toxicol.29:365)のいずれかにより遮断 されうるか否か調べた。広いスペクトルのグルタ メートレセプターアンタゴニストであるキヌレニ ン酸、のみならず非NMDAレセプターの競合的イン ヒビター(Monaghanら、1989,Annu.Rev.Pharm acol.Toxicol.29:365)であるCHQXは海馬ニュー ロンにおけるBDNF-mRNAの、カイニン酸により仲 介される増大を完全に遮断した（第VII表）。他方、 NMDAレセプターを特異的に遮断するMK801はこれ らニューロンにおけるBDNF-mRNAの上昇を遮断で きなかった。その上、NMDAそれ自体がBDNF-mRNA レベルを変化させなかった（第VI表）。このこと はカイニン酸がそのレセプターを介して直接作用 することおよびその作用が内因性グルタメート （このものはNMDAレセプターにも作用する）の放 出によるものではないことを示している。従って、 カンニン酸はインビトロで非NMDAグルタメートレ セプターを介してBDNF-mRNAレベルを高めると結 論づけることができる。
我々のインビトロ観察の生理学的重要性を評価 するために、インビボでも同様のメカニズムが作 用するか否か調べた。体重180-200gの成体Wistar 系雌雄ラットを12mg/kgのカイニン酸で処理した。
種々の時間をおいて、海馬および皮質におけるBD NF-およびNGF-mRNAの変化をノーザンブロット分 析により測定した。第19図はカイニン酸が脳の両 方の領域でBDNF-およびNGF-mRNAレベルの増大さ せたことを示している。BDNF-mRNAの増加はNGF- mRNAのそれよりかなり高かった。その上、カイニ ン酸の投与後24時間の長さにわたり、mRNAレベル が高まったままだった。BDNF-およびNGF-mRNA変 化の時間的経過では、海馬における最大の増大は カイニン酸投与約３時間後に達していることが 示される（第19図）。海馬におけるBDNF-および NGF-mRNAの増加に先立ちc-fos-mRNAの増加があ ることに注目することは興味がある。この２つの 現象は原因が関連しているかも知れない。なぜな ら、損傷後の坐骨神経の場合がそうであることが 最近示されているからである(Hengererら、1990, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:3899)。そ の上、海馬における増大に比較して脳皮質におい ては、BDNF-およびNGF-mRNAの両方の増大に遅れ が存在し、このことはBDNF及びNGFの発現増強を 招来するシグナルが海馬から他の脳領域に拡がっ ていることを示している。この観察は、痙攣剤メ トラゾーンにより惹起されるc-fosにおける増大 が効めに海馬において起りそして次に皮質におい て起こることを示す先の報告(Morganら、1987, Science 237:192)と一致する。
先の研究で、NMDAレセプターがNGFI-A(Coleら、 1989,Nature 340:474)のような海馬mRNAの調節 に関与しているという証拠が提示されたのち、次 にNMDAレセプターアンタゴニストMK801およびケ タミンがインビボでBDNF-およびNGF-mRNA増大を 遮断しうるか否か調べた。しかしながら、インビ トロで我々の結果を確認すると、MK801はNMDAレ セプター活性化から生ずる発作を効果的に抑制す るが、このものはカイニン酸により仲介された海 馬BDNF-mRNAの増大を阻害しなかった。（第20図）。
最もありそうなのはこのNMDAレセプター活性化が カイニン酸により放出された内因性ゲルタメート から生ずることである(Biziere,K.およびCoyle, T.,Neurosci.,1978,Lett.8:303;McGeerら、 1978,Brain.Res.139:381)。同様に、カイニン 酸処理後の海馬におけるNGF-mRNA増加はMK801に よってもケタミンによっても阻止されなかった。
先の調査(Gall,C.M.およびIsackson,P.J., 1989,Science 245:758)では、四肢発作を惹起す る電解的病変がラットの海馬におけるNGF-mRNAを 高めることが示された。しかしながら、MK801お よびカイニン酸で得られた現在の結果は発作の誘 導とBDNFおよびNGFの発現増大の間の明らかな解 離を示している。ラットをカイニン酸注射に先立 ちジアゲパム(Valium)処置すると、ラット海馬に おけるBDNF-およびNGF-mRNAの増大が完全に遮断 された（第20図）。BDNF-およびNGF-mRNAに及ぼ すジアゼパムの遮断作用は阻害性GABA作動性系を 介するニューロン活性の抑制から生じている可能 性が最も高い。しかしながら、カイニン酸投与90 分後（すなわち、痙攣の開始約30分）、BDNF-お よびNGF-mRNAの増大はジアゼパムによってはもは や遮断できず、このことは２種の神経栄養因子の mRNA発現増大を生ずるカスケード事象の開始にと って、比較的短い活性増大期間で充分であること を示している。
本研究により、非NMDAレセプターが海馬におけ るBDNF-およびNGF-mRNAの調節に関与している可 能性があることが示され、従ってこの調節メカニ ズムは海馬のmRNAをコードする初期遺伝子がグル タメートレセプターのNMDAサブタイプを介して調 節されるように思われると結論する。Coleらの先 の記載(Coleら、1989,Nature 340:474)と区別 される。ニューロンに及ぼすカイニン酸の作用 のいくつかもグルタメートレセプターのキルカ レート型により仲介されうることが報告されてい る(Monaghanら、1989,Annu.Rev.Pharmacol. Toxicol.29:365)。
結論として、本研究では、ニューロン活性がラ ット海馬および皮質における神経栄養因子BDNFお よびNGFをコードするmRNAレベルを調節すること を示している。試験した全ての化合物のうちで、 非NMDAグルタメートレセプターを介して作用する カイニン酸がインビボおよび海馬ニューロン培養 物の両方におけるBDNF-およびNGF-mRNAを高めた。
これと対照的に、末梢においては、ニューロン細 胞におけるNGF合成が神経支配（NGF応答性）ニュ ーロンにより放出される慣用の伝達体物質または ニューロンペプチドにより調節されることを示す 証拠は存在しない(Barthら、1984,J.Cell.Biol. 99:839;Hellwegら、1988,Exp.Cell.Res.179: 18)。BDNFはCNS中に優先的に発現され、そして グルタメートを神経伝達体として用いる中枢経路 と、BDNF-およびNGF-mRNAが比較的多高いことが 示される領域との間で少なくとも部分的重複が存 在する(Hoferら、EMBO J.印刷中；Monaghanら、 1989,Anne.Rev.Pharmacol.Toxicol.29:365)。
特に、原位置ハイブリダイゼーションにより示さ れるNGF-mRNAの分布（Hoferら、EMBO J.印刷中） とオートラジオグラフィーにより可視化された海 馬、大脳皮質および小脳におけるカイニン酸レセ プター(Monaghanら、1989,Annu.Rev.Pharmacol. Toxicol.29:365)との間には強度の類似性がある。
この観察は、グルタメートがCNSにおけるBDNF- およびNGF-mRNAを調節する生理学的伝達体である という解釈と適合する。
実施例11：脳由来神経栄養因子は培養物中のラッ ト中隔コリン作動性ニューロンの生存 および分化した機能を高める (1)材料および方法 (1.1)解離細胞の調製および細胞培養条件 妊娠17日後のラット(Sprague-Dawley)からの中 隔領域を周囲組織を含まないようにして切り出し た。組織フラグメントをプールし、Ham's F-10で ３回洗い、そして次に35mm組織培養皿に移して細 断した。この組織を0.25％トリプシンと37℃で20 分間インキュベートすることにより単離細胞浮遊 液を調製した。50μg/mlのデオキシリボヌクレア ーゼ１型(Sigma)を含有する成長培地（後出）中 室温で５分間インキュベートすることによりトリ プシンを不活化したのち、パスツールピペットの 狭窄した頂部にフラグメントを反復して通すこと により細胞を解離させた。次にこの解離された細 胞を500×ｇで45秒間遠心した。上清を除去しそ して再び遠心した。ゆるい細胞ペレットを再懸濁 させそして成長培地中で合し、そして細胞収率を 血球計を用いて測定した。終りに、ポリオルニチ ン（10μg/ml）およびラミニン（10μg/ml）を予 め被覆した６mmウェルに細胞を塗布した。細胞の 生存能力はその細胞がトリパンブルーを排除する 能力により24時間後に培養物中で検査した。
ニューロンおよびグリアからなる培養物のため の正常な成育培地5HS/N3はダルベッコ改変イー グル培地(DMEM)中に５％(v/v)ウマ血清(Gibco), １％N3添加剤(v/v)(Romijnら、1982,Dev.Brain Res.2:583-589),0.5％(v/v)グルタミン(200mM, Gibco),および0.25％(v/v)ペニシリン−ストレ プトマイシン（それぞれ10,000単位/ml,10,000 mcg/ml Gibco)を含有した。ニューロン富化培養 物は成長培地を塗布５〜６時間後に、１％N3添 加剤、0.5％グルタミン、および0.25％ペニシリ ンおよびストレプトマイシンを含有するDMEMで置 き代えることにより調製した。両方の条件下にお いて、グリア細胞の増殖を限定させるためにシト シンアラビノシド（１μM，24時間）での処理を 用いた。
(1.2)コリンアセチルトランスフェラーゼ活性の アッセイ 細胞をPBS 100μｌで２回洗浄することにより 培養物から成長培地を除去した。細胞は１回の凍 結−解凍サイクル、および200mM NaClおよび0.25 ％(v/v)トリトンX-100を含有するpH6.7の50mM KH2PO4中37℃で15分間インキュベートすることに より溶解させた。細胞培養物の２μｌをとり、そ してミクロ-Fonnum操作(Fonnum,F.,1975,J. Neurochem.24:407-409)に従いCAT活性を分析し た。最終的な基質組成は50mM NaH2PO4(pH7.4)緩 衝液中の0.2mM[14C]アセチル-CoA(NEN,54.4, mCi/mmol),300mM NaCl,8mMコリンブロマイド， 20mMエチレンジアミン四酢酸、および0.1mMネオ スチグミンから成っていた。これらの酵素および 基質濃度において、酵素反応は90〜120分間直線 状であった。コリンアセチルトランスフェラーゼ 誘導の特異性はアッセイ期間中にCAT活性の特異 的インヒビターN-ヒドロキシエチル-4-(1-ナフチ ルビニル）ピリジウム(HNP)を添加することによ り検査した(White,H.L.およびCavallito,C. J.,1970,J.Neurochem.17:1579-1589)。
(1.3)アセチルコリンエステラーゼ(AChE)活性の アッセイ 溶解物中に存在するAChEレベルはPotter(Potter, L.T.,1967,J.Pharmacology and Experimental Therapeutics 156:500-506)およびJohnsonおよ びRussell(Johnson,C.D.およびRussell,R.L., 1975,Anal.Biochem.64:229-238)の方法に幾つ かの改良を加えて測定した。200mM NaClおよび 0.25％(v/v)トリトンX-100を含有するpH6.7の 50mM KH2PO4緩衝液中で調製された溶解物を50mM KH2PO4 pH7.0の中の[3H]アセチルコリンヨーダ イド(NEN,NET-113,73.3mCi/mmol)、エトプロパ ジン(0.1mM)と合した。37℃で15分間インキュベ ーションしたのち、1Mクロロ酢酸、0.5M NaOH および2.0M NaClを含有する停止緩衝溶液100μ ｌの添加により反応を停止させた。AChE比活性は 1.0(10-6)Mネオスチグミンの存在下に測定した。
(1.4)高アフィニティコリンとり込みの測定 高アフィニティ、Na+依存性メタニズムによる コリンとり込みを実質的にVacaおよびPilar,19 79(Vaca,K.およびPilar,G.,1979,J.Gen. Physiol.73:605-628)の操作によりアッセイした。
細胞をHam's F-10の100μｌ、続いてタイロード 溶液100μｌですすいだ。25mMカリウム含有タイ ロード溶液により誘発された10分間の分極に続き、 細胞を正常なNa+またはLi+含有タイロード溶液 中で[3H]コリン(NEN、NET-109、0.11μ M、86.7 Ci/ミリモル）と室温で20分間インキュベートし た。とり込み反応はPBSで細胞を２回すすぐこと により停止させた。累積したコリンは、1Nギ酸 を含有する冷アセトン100μｌと少なくとも20分 間培養物をインキュベートすることにより抽出し た。次に可溶性フラクションをとり出して計測し た。特異的なコリン取込みは全コリン取り込みレ ベルとNa+非依存性コリン取込みとの間の差であ る。
(1.5)アセチルコリンエステラーゼ用の組織化学 的染色 コリン作動性細胞はGeneser-Jensenおよび Biackstadtの染色法(1971,Z.Zellforsch.114: 460-481)を改変したアセチルコリンエステラーゼ に関する組織化学的染色により確認した。４％パ ラホルムアルデヒド中で培養物を固定化したのち、 50mM酢酸塩緩衝液pH5.0中の4mMアセチルチオコ リンヨーダイド、2mM硫酸銅、10mMグリシンおよ び10μg/mlゼラチンからなるAChE基質溶液の存在 下に細胞を４℃で５−６日インキュベートした。
以前に記載(Hartikka,J.およびHefti,F.,19 88,J.Neurosci,8:2967-2985)されたようにし て反応生成物の可視化を行った。
(1.6)NGFレセプターの免疫組織化学的染色 培養物をDMEMで２回洗浄しそして４％パラホル ムアルデヒドを用いて固定した。次に、５％ウシ 血清アルブミン、0.02％トリトンX-100および５ ％スクロースを含有するpH7.4の燐酸ナトリウム 緩衝液(Hartikka,J.およびHefti,F.,1988, J.Neurosci.8:2967-2985)で細胞を３〜４時間 処理した。NGF-Rはモノクローナル抗体192-IgG (Taniuchi,M.およびJohnson,E.,1985,J. Cell Biol.101:1100-1106;Chandlerら、1984, J.Biol.Chem.259:6882-6889)を、５％ウマ血 清を含有する緩衝液中で１：1000の希釈度で用い て検出した。培養物を希釈された抗体と４℃で15 −18時間インキュベーションした。結合されたマ ウス免疫グロブリンはビオチニル化ウマ抗マウス IgG(1:200 Vector)を用いて検出した。免疫反応 性細胞は結合ペルオキシダーゼ酵素用基質として 3',3'-ジアミノベンジジンを用いることにより確 認した。
(1.7)BDNGおよびNGFの精製 ブタ脳からのBDNFの精製および雄マウス顎下腺 からのNGFの精製は以前に刊行されたプロトコル (Bardeら、1982,EMBO J.1:549-553;Lindsayら、 1985,Dev.Biol.112:319-328)に従って行った。
これら研究の一部で用いられた組み換えBDNFは先 に特性決定されている(Maisonpierreら、1990, Science,247:1446-141)。
(2)結 果 中隔細胞の培養物はポリオルニチン−ラミニン 被覆ウェル上で神経突起を骨折って伸ばし、多く の細胞が24時間までに特徴的なニューロン根ブラ イト細胞体を提示する（第21図ＡおよびＢ）。継 続した神経突起伸びはインビトロで第２および４ 日目に細胞−細胞接触の程度の漸進的増大を生じ た（第21図Ｃ，ＤをＥ，Ｆと比較のこと）。平坦 化相−ダーク細胞が存在しないことにより注目さ れるように、４日後ですら培養物中には非ニュー ロン細胞は非常に少数しか存在しなかった。培養 中の中隔コリン作動性ニューロンに及ぼすBDNFの 作用を査定するために、AChEには組織化学的染色 を、そしてNGF-レセプターには免疫組織化学的染 色を用いた。AChE陽性ニューロンの代表的な形態 を第21図Ｇ，Ｈに示す。幾つかめのNGF-レセプタ ー陽性ニューロンを第21図Ｉに示す。
第22図Ａに示されるように、BDNFは胚ラット中 隔細胞の低密度培養物（細胞密度66,700〜133,300 細胞／cm2と定義される）におけるAChE陽性細胞数 を2.4倍高めた。同じ細胞密度で、NGFの作用は わずかに低かった。（1.9倍）。BDNFのみならずNGF が中隔培養物中におけるAChE陽性ニューロン数を 増大させうるという知見により、これら２種の因 子が同じニューロン集団に作用するのかまたは別 のものに作用するのかなる試験が促進された。第 22図Ａの第３番目の図に示されるように、飽和レ ベルのBDNFおよびNGFを同時に添加しても、どち らか一方の因子を単独で添加した場合に見られる それより多数のAChE陽性ニューロンは生じなかっ た。ニューロン生存によって、これらの結果はBD NFおよびNGFに応答するラット中隔培養物中にお けるコリン作動性ニューロンが密接に重複する集 団である筈であることを示唆している。
AChE陽性ニューロンの生存に及ぼすBDNFの作用 は細胞を成長させる密度に依存した（第22Ａ図）。
高密度の塗布(200,000-266,000細胞／cm2)では BDNFだけでも、またはNGFと共用してもAChEを発 現するニューロン数の増大を生じなかった。これ は神経栄養因子の内在レベルが増大したため、あ るいはまた高い細胞密度では細胞−細胞接触が起 こって生存促進作用をするためかもしれない。
低い細胞密度ではAChE陽性細胞の数はBDNF濃度 の関数として増大した。すなわち処理した培養物 中でAChE陽性細胞／ウェルの数が対照値169.2± 12.9から388.0±26.2(2.5倍の増大）に増大し、 最大応答は投与量10ng/mlの時に観察された。こ れとは対照的に、NGFに対する最大応答は50ng/ml の時に観察された。そしてAChE陽性細胞／ウェル が121.0±7.6から231.7±12.9(1.9倍の増大） に増大した。BDNFおよびNGFは両方とも応答曲線 における高原期は安定しているようであった。そ こにおいては投与量100ng/mlの高さではAChE陽性 ニューロンの数は減少しなかった。
低密度培養においては、BDNFおよびNGFは両方 ともAChE組織化学によって検出される細胞の数を 増大させうることは明らかである。この増大は成 長因子の非存在下における培養物中で死んでゆく コリン作動性細胞を救えるため、または前駆体細 胞の漸増加のため、またはコリン作動マーカー、 AChEの誘導のためである可能性がある。これらの 可能性間を区別するために計12日間維持した一連 の培養物中で遅延添加（delayed addition）実験 を行った（第23図）。塗布後５から６時間処理し た一連の培養物をBDNFまたはNGFの存在下で全12 日間維持した。二番目の一組の培養物は成長因子 なしで５日間樹立し、その後最後の７日間はBDNF またはNGFで処理した（-5/+7）。これら２組の培 養物を比較した場合、５日後のNGFまたはBDNF添 加に対する応答は、細胞を因子の存在下で継続的 に成長させた場合に観察されたものとほぼ同じで あった（第23図の連続バーと横縞バーを比較）。
しかしながら、結果は三番目の一組の培養物にお いて驚く程異なった。その培養物においてはBDNF あるいはNGFは最後の５日の培養物にだけ存在し た（-7/+5）。これらの条件下において、NGFもBD NFもAChE陽性細胞の数を増大させることはできな かった。他の実験においては、隔ニューロンをNGF またはBDNFのいずれか一方に３−４日間だけでも さらすことはAChE酵素活性の大きな増大を生じる のに十分であり、したがってAChE染色により細胞 が検出された。したがって、“-7/+5”培養物にお けるAChE陽性ニューロンの数が検出できる程増大 しないのは成長因子にさらした時間がAChE陽性細 胞を誘導をせしめるに十分でなかったという可能 性によるものではなかった。
NGFはmRNAおよびタンパク質レベルの両方で測 定してそれ自体のレセプターのレベルを調節しう ることはインビトロのみならずインビボにおいて も示されている（Montero,C.およびHefti,F., 1988,J.Neurosci.8:2986-2999;Higginsら、 1989,Neuron.3:247-256）。BDNFはコリン作動性 表現型の誘導および中隔培養物中における細胞生 存においてNGFに類似の作用を示すことがわかっ たので、IgG-192免疫陽性細胞の数により定量化 することで、NGFレセプターのレベルをBDNFが調 節しているという可能性を調べた。第24図に示す ように、10ng/mlで、BDNFはNGFレセプター免疫 陽性細胞の数を３倍増大させた。おもしろいこと に、高い濃度（25-100ng/ml）ではBDNFの作用は次 第に顕著でなくなった。したがって、この場合に おける用量応答は、これらの培養物中における他 のパラメーター例えばAChE陽性細胞の数におよぼ すBDNFの作用で観察されるそれとは明白に異なっ た。陽性の対照として、細胞を50ng/mlの濃度の NGFで処理し、それはまた陽性細胞の数を３倍に 増大させた。したがって、IgG-192染色に基づく と、BDNFはNGFレセプターの発現をアップレギュ レイトするのにおよぼすNGFの作用とほぼ同じ作 用を有する。
細胞生存におよぼす作用に加えて、BDNFがコリ ン作動性表現型特性を促進しうる可能性を調査し た。CAT活性における直線的増大は、50ng/mlま でのBDNFの漸増レベル存在下において成長した中 隔培養体物に見られ、第25図で示すようにそこで は対照の値の1.8倍のレベルで応答は飽和した。
NGFで処理した並行培養物におけるCAT活性誘導 は25ng/mlで高原状態に達し、対照の値より3.4 倍の増大を示す。BDNFまたはNGFのいずれか一方 に対する応答は飽和応答を生じるのに十分な濃度 の３倍で有意な減少を示さなかった。BDNFまたはNG Fいずれか一方を用いるCAT活性の誘導は[N-ヒ ドロキシエチル-4-(1-ナフチルビニール）ピリジ アム］HNP-非依存性のトランスフェラーゼ活性の レベルには影響しなかった。
BDNFならびにNGFが中隔培養物におけるCAT活 性の増大を惹起するという発見にかんがみ、両因 子での同時処理に対する応答を研究した（第VIII表）。
これらの実験のために、２種の濃度のBDNF、すな わち５および25ng/mlを使用し、これらCAT活 性をそれぞれ1.4および2.6倍増加させた。NGF （50ng/ml）だけでは酵素活性を2.8倍増加させ、 BDNFと共用した場合は、CAT活性のレベルは少な くとも相加的作用を反映した（第VIII表）。使用し たBDNFの濃度では、NGF作用に純粋に相加的な作 用により、対照の値より4.2および5.4倍それぞ れ増大させたのであろう。観察した値は実際には 相加的よりいくらか上のものであった。
BDNF処理で観察された生物学的応答は内在NGF のBDNF依存性放出によるものであるという可能性 を検査した。この疑問を検べるために、NGFに対 するモノクローナル抗体（抗体27/21,Korsching およびThoenen,1983）をあらゆるNGF関連応答を 阻止するのに使用した。第IX表で示すように、 CAT活性におよぼすNGFの作用は抗体-NGFにより大 いに減少したが、BDNFにより誘導された応答は実 質的には影響されなかった。しかしながら、CAT 活性の基準レベルは、未処理対照と比較すると抗 -NGFで処理した培養物において約20％減少したこ とに注目すべきである。それにもかかわらず、BD NFにより生じた中隔培養物におけるCAT活性増大 が観察されたことは、直接的作用であり内在NGF の増大により仲介されたのではないと思われる。
AChE活性が、CAT活性とともにBDNFあるいはNGF と調和して調節されているという可能性も検査し た（第26図）。CAT活性と対照的に、BDNFまたは NGFに対するAChEの用量応答は、酵素活性が50ng /mlの濃度まで直線的に増大する点で全く同様で あることが明らかとなった。この濃度では、未処 理の対照値と比較すると、NGFおよびBDNFはAChE 活性をそれぞれ274％および234％増加させた。
CAT活性におけるBDNFあるいはNGFにより誘導 された増大の時間的経過を調査した（第27図）。
50ng/mlのBDNFで処理した培養物中のCAT活性は ３日目までに対照値の170％に増大した。この増 大は６日目まで続き、そこでCAT活性は検査した 残りの期間を通して対照の値の2.5倍で高原状態 となった。これと対照的にNGF(50ng/ml)投与に対 するCAT応答は、もっと速やかで、３日目までに 誘導レベルは対照より2.5倍増に達した。CAT活 性の増大は直線的に上昇を続け、12日後には対照 より3.2倍に達した。
一定期間培養物中で成長させた星状細胞はNGF の他に種々の神経栄養活性物を合成することが示 されている(Lindsay,R.M.,1979,Nature 282: 80-82;Lindsayら、1982,Brain Res.243:329- 343;Aldersonら、1989,Dev.Brain.Res.4 8: 229-241)。BDNFに関する我々のこのたびの観察は、 NGFレベルの増加によって仲介されるという可能 性を我々は排除しているが、BDNFは特にグリア細 胞における他の神経栄養因子の発現を調節するこ とによって間接的に作用しうると考えられる。中 隔培養物におけるCAT活性におよぼすBDNFの作用 に非ニューロン細胞が影響を与える可能性につい て評価するために、我々は混合グリア−ニューロ ン培養物およびニューロン濃縮培養物におけるBD NFに対するコリン作動性ニューロンの応答を比較 した（第28図）。ニューロン濃縮培養物において は、BDNFに対するCAT活性応答は鐘形曲線を示し た。すなわち最大の増大は5ng/ml量のBDNFで達 成されそして25ng/ml濃度では酵素活性は有意に 減少した（p＞0.001,15-25ng/mlのBDNFを比較）。
第25図に示す結果と同様に、集密グリア層の存在 下でBDNFに対するCAT応答は25ng/mlまで、すな わち検査した最高用量まで直線状であった。非ニ ューロン細胞の存在下では、同様に処理されたニ ューロン濃縮培養物で見られると同じ値のCAT活 性増大を生じさせるには、より高レベルのBDNFを 要した。それにもかかわらず、中隔コリン作動性 ニューロンにおいてCAT活性を最大に刺激するBD NFの能力はグリア細胞の存在または非存在下にお けると実質的には同じであった。
CATおよびAChE活性に基づくと、BDNFはコリン 作動性表現型マーカーを増強するのにNGFと同様 に作用しうることは明らかである。これをさらに 検査するために、Na+依存性の高アフィニティコ リンとり込みに及ぼすBDNFの作用をNGFのそれと 比較した（第29図）。50ng/mlのBDNFの存在下で12 日間成長した細胞は未処理対照のそれよりも3.8 倍多くコリンを蓄積した。並行した培養物におい て、NGF(25ng/ml)はコリン蓄積を2.3倍誘導した。
(3)論 考 末梢ニューロンにおよぼす確立された作用と比 較して(Bardeら、1982,EMBO J.1:549-553;Lind sayら、1985,Dev.Biol.112:319-328;Davies ら、1986,J.Neurosci.6:1897-1904;Hofer,M., およびBarde,Y.,1988,Nature 331:262-262)、 中枢神経系内のBDNFのニューロン特異性はあまり 特性決定されていない。今日に至るまで、唯一の 知られた応答性CNSニューロンはE17ラット網膜 の培養物中で初めて同定されたThy-1陽性網膜神 経節の小規模のサブ集団である(Johnsonら、1986, J.Neurosci.6:3031-3038)。また他の研究によ り、外植片培養物における成体網膜神経節細胞に およぼすBDNFの作用も確立された（Thanosら、19 89,Eur.J.Neuro.1:19-26）。この研究におい て、我々はAChE組織化学染色により示されるよう にBDNFはラット胚中隔からの培養コリン作動性ニ ューロンの生存を増大させ、そして種々のコリン 作動性表現型のマーカーの発現、すなわちAChEお よびCATの酵素活性および高いアフィニティコリ ン取り込みを増大させることを示した。さらにBD NFは中隔培養物におけるNGFレセプターの発現を 増大させることがわかった。
当初の実験では、我々は、BDNFがE17中隔培養 物中のAChE陽性ニューロンの数を約２倍に増大さ せることを見出した。NGFと同じように(Hartikka, J.およびHefti,F.,1988,J.Neurosci.8:2967- 2985)、この作用は、細胞密度が低い時にもっと も明白であった。おもしろいことに、NGFおよび BDNFを同時添加すると、いずれか一方の成長因子 だけの存在下で観察されるレベルを越えてAChE陽 性細胞の数をさらに増大させるには効果がなかっ た。この観察は、BDNFおよびNGFが中隔コリン作 動性ニューロンの同じ集団に主に作用することを 強く示唆する。
NGFについて当初報告されるように(Heftiら、 1985,Neuroscience 1:55-68)、BDNFは比較的高 い細胞密度で樹立された培養物中のコリン作動性 ニューロンの生存を増大させなかった。塗布した 細胞の割合として、何ら神経栄養因子が存在しな い場合さえもコリン作動性ニューロンの生存は高 細胞密度の時の方が低細胞密度の時より高いこと が見出された。これを説明しうるいくつかのあり うる説明には、細胞−細胞接触の増大、非ニュー ロン細胞数増大の有益な作用または内在性神経栄 養因子活性の割合以上の増大が含まれる。後者の 可能性によっては、我々は内在のNGFのレベルが 実質的に増大することを示すものを全く見出せな かった。なぜなら過剰の抗-NGFを未処理の高密度 培養物に添加しても基礎的CAT活性を20％減少さ せただけだったからである。かかる培養物では、 外部のNGFはCAT活性を3.4倍増大できた。
タンパク質およびmRNAのレベルの両方で観察さ れるように、現在、NGFが培養ニューロンおよび インビボの両方にそれ自体のレセプターの発現を アップレギュレートしうることを示す報告が数多 く存在する。この研究では、我々はNGF-レセプタ ーを検出するのにIgG-192モノクローナル抗体を 使用した。このモノクローナル抗体はラット感覚 性ニューロンおよびラット脳の両方で特性決定さ れている(Taniuchi,M.およびJohnson,E.,19 85,J.Cell Biol.101:1100-1106)。IgG-192免 疫陽性ニューロンの数の増大によって示されるよ うに、NGFが中隔培養物におけるそのレセプター レベルをアップレギュレートできるというHartikka およびHeftiの発見を確認する一方、我々はBDNF がIgG-192免疫陽性細胞の数を３倍まで増大させ ることをさらに見出した。BDNFに対する応答は 25-100ng/mlの範囲の高濃度では10ng/mlで見ら れると同じ陽性細胞数の大きな増大を生じなかっ た点で二相性であった。おもしろいことに、この 種の用量応答はAChE陽性ニューロンの数のBDNFに より誘導される増大に関して見られたそれとは全 く異なっていた。後者においては、BDNFの最大作 用の減少は高濃度においては全く見られなかった。
低アフィニティNGFレセプターもまた同様の親和 性を以ってBDNFに結合することが最近示されてお り、このことはNGFおよびBDNF低アフィニティレ セプターが同一ではないかということを示唆して いることに注目すべきである(Rodriguez-Tebarら、 1990,Binding of Brain-Derived Neurotrophic Factor to the Nerve Growth Factor Receptor Neuron.4,487-492)。
BDNFおよびNGFの作用メカニズムが類似してい る可能性は、BDNFがAChE活性の誘導においてNGF と同等の動力を有するという所見により示唆され た。BDNFはNGFと同じ程度にコリン作動性ニュー ロンの生存を促進することも見出されたが、CAT 酵素活性におよぼすBDNFの作用はNGF程大きくな かった。いくつかの実験の間中ずっと、BDNFによ る最大のCAT誘導は1.8−2.6倍の範囲であり、一 方３倍より大きな値はNGFにより常に見られた。
したがって、BDNFおよびNGFの作用メカニズムに おけるいくつかの類似性はあるかもしれないが、 それらのそれぞれのレセプターの発現および調節 においておよびCAT活性を誘導するのに必要な第 ２のメッセンジャー経路へのこれらレセプターの 結合において微妙な相異が存在することはおおい にありうる。
BDNFあるいはNGFにより生成されるCAT活性誘 導レベルの相異は、異なる調節経路を示すもので はないかという想定は時間的経過研究の結果から、 さらに支持された。培養中隔ニューロンはBDNFに 応答してCAT活性が６日目まで上昇しその時点で 応答は高原状態と思われた。それとは対照的に NGFに応答するCAT活性の誘導は３日目から12日 目まで長引いて直線的上昇を示した。BDNF処理培 養物における６日目のCAT活性誘導上昇の中止は BDNFレセプターあるいは応答経路における必要な 成分のいずれか一方の発現における発達的変化を 示すものであろう。高密度培養物中で12日後に見 られるコリン作動性ニューロン（AChE陽性ニュー ロン）の数は外部のBDNFあるいはNGFとは無関係 と思われるので、異なるニューロン細胞の死はこ れら２種の成長因子によるCAT活性の誘導に見ら れる時間的経過の相異によるものではなさそうで ある。
基部前脳コリン作動性細胞のBDNF処理を含む当 初の実験において、この神経栄養因子に応答する 主要細胞型であるニューロンまたはグリアに関し てなんの仮定もなされなかった。末梢ニューロン の高濃度培養物に関して行われた研究ではBDNFが 直接ニューロンに作用することを強く示唆される が(Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319-328; Lindsay,1988,J.Neurosci.7:2394-2405)、本 研究において見られるBDNFのニューロン作用は大 グリアまたは他の非ニューロン細胞におよぼすBD NFの一次的作用により仲介されていたであろうこ とが考えられる。しかしながら、DNAは優勢な大 グリア細胞の集密単層の存在下において、あるい は分裂インヒビター、シトシンアラビノシドでの 処理によりグリア細胞が激減した培養物中におい て、CAT活性の誘導において同じように有効であ ることが見出された。これらの実験からの興味深 い観察は、BDNFに対する用量応答曲線の形状が２ つの場合において明白に相異することであった。
グリア単層の存在下において、BDNFに対する応答 はBDNFの濃度増大に伴い直線状であった。ニュー ロン富化培養物においては、BDNFに対する用量応 答は左に移動した。これらの結果に関するひとつ のありうる説明は、グリアそれ自体がBDNFレセプ ターを発現し、その結果ニューロン上に局在する レセプターが利用しうるリガンドの有効濃度を低 下させることである。あるいはまた、星状細胞の 抑制作用は、リガンド濃度またはレセプター発現 に及ぼす作用とは関係なく間接的で、そして例え ばBDNF分解がおおきく増大することにより仲介さ れているのであろう。同じような観察がHartikka およびHefti(Hartikka,J.およびHefti,F.,19 88,J.Neurosci.8:2967-2985)およびHonegger およびLenoir(Honegger,P.およびLenoir,D., 1982,Dev.Brain Res.3:229-238)により報告さ れている。異なる脳領域のグリア細胞はそれらに 関連するニューロンの形態に大きく影響しうるこ とが示されている(Prochaintzら、1979,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5387-5391;Prochi antzら、1981,Nature 293:570-572)。したがっ て、中隔グリアは膜あるいは分泌性質のいずれか 一方の内的活性特性を有し、それがコリン作動性表現 型の発現を抑制する可能性がある。同様の検査条 件下で、海馬由来の星状細胞の調節特性は現在調 査中である。
示したデータに基づくと、BDNFおよびNGFは両 方とも中隔コリン作動性ニューロン機能を増大さ せうることが明白である。単一のニューロン集団 に明らかに作用する２つの高度に相同の神経栄養 因子のありうる生理的関係について予測すること は興味がある。BDNFおよびNGFの作用は末梢ニュ ーロンの初期発達期間中は特に背根神経節ニュー ロンのサブ集団またはそれらの前駆体上で当初重 なり合い、そしてその後分離して別個の集団に独 立して作用することを示唆するものが幾つか存在 する(Lindsayら、1985,Dev.Biol.112:319- 328;Ersberger,U.およびRohrer,H.,1988,Dev. Biol.126:420-432);Barde,Y.A.1989,Neuron. 2:1525-1534)。しかしながら、これは感覚性ニュ ーロンのサブ集団を特定する適切なマーカーを使 用して明確に確立されたのではない。本研究は発 達期の単一時点、E17、での培養物中に樹立され た胚中隔ニューロンに焦点を合わせているので、 同じような種類の分離現象が中隔の後期発達段階 でおこるという可能性がある。したがって、BDNF あるいはNGFに対する中隔コリン作動性ニューロ ンの応答性における時間的および空間的相異があ ることは興味深いことが判明しよう。
インビボにおける基底前脳コリン作動性ニュー ロンにおよぼすBDNFの作用を検査することは現在 興味深いことであろう。そこでは、海馬由来の NGFはインビボにおける基底前脳コリン作動性ニ ューロンの正常な発達および維持にかかわってい る可能性がある証拠が現在存在する。BDNFがイン ビボにおいて同様の役割を有しているか否か確立 することは興味あろう。BDNF mRNAが海馬で特に 豊富であるという最近の所見はかかる役割を裏書 きしている。
実施例12：プレプロBDNFから活性な成熟BDNFへの 酵素的変換 (1)材料および方法 商業上入手可能なエンドプロティナーゼArg-C （マウス顎下腺から精製）を使用しhBDNFの大き な前駆体形（プレプロBDNF）から生物学的に活性 な成熟タンパク質に酵素的に変換させた。この酵 素的切断はインビトロ反応で達成した。酵素反応 における基質はCHO-DG44細胞中で合成されたプレ プロhBDNFであり、このものは培養培地に分泌さ れそして収集された。この培地は１％ウシ胎児血 清(FBS)および各１％のペニシリンおよびストレ プトマイシンを補添したHamのF12培地（ヌクレ オサイドなし）から構成された。反応は５単位の 酵素およびプロプロhBDNFを含有する50μｌのCHO -DG44細胞上清を使用し37℃にて５分間行った。
これらの条件下でプレプロhBDNFの成熟hBDNFへ の切断が達成された。
(2)結果および論考 組換えhBDNF(約31,000ダルトン）のプレプロ形 態を、エンドプロティナーゼArg-Cを使用してイ ンビトロにおいて成熟生物活性形態hBDNF(約12,0 00ダルトン）に完全にプロセシングされた。組換 えヒト脳由来の神経栄養因子は哺乳動物細胞(CHO -DG44細胞）中で好首尾に生成された。hBDNF遺 伝子はCHO細胞ゲノムに安定に組み込まれ、そし てそのhBDNF遺伝子はメソトレキレート増幅方法 を使用して増幅した。組換えhBDNFは培地に分泌 され、そして生物学的に活性であることが判明し た。代謝標識に続くSDSポリアクリルアミドゲル 電気泳動（15％ゲル）によると、合成された３５Ｓ 標識hBDNF産物の大部分が培地中に分泌され、見 かけの分子量31,000を有するプレプロ形態として 移動したことが示される（第30図、レーン２）。
野生型CHO-DG44細胞から分泌された３５Ｓ標識タン パク質は第30図レーン１に示される。hBDNF（見 かけの分子量12,000）の成熟形態を優勢に生成さ せるために、我々はプレプロ形態のhBDNFを酵素 切断するインビトロ方法を設計した。
トリプシン消化産物は第30図、レーン３−６に 示す。ウシ膵臓トリプシン(Worthingtonより購入； キモトリプシン不含）をリン酸緩衝食塩水中に溶 解させ、そして３５Ｓ標識CHO細胞hBDNFの50μｌ 量に添加した。用いられたトリプシン濃度は25, 50,75および100μg/mlであった。３５Ｓ標識した 反応産物は、レーン３−６にそれぞれ示す。酵素 切断反応は37℃で５分間行った。31,000のプレプ ロ-hBDNFの標識強度の漸減は、18,500分子量産物 の増大に対応して観察された。これらの条件下に おいてhBDNF（分子量12,000）の成熟形は生成さ れなかった。第30図、レーン７はエンドプロティ ナーゼArg-CでCHO細胞hBDNFを酵素的に消化し た後の３５Ｓ標識反応産物を示す。このArg-Cはマ ウス顎下腺から単離され、Boehringer Mannheim Biochemicals,Inc.より購入。100単位のこの酵 素を100μｌのMilli-Q水を用いて凍結乾燥調製 物から再構成しそして−20℃で貯蔵した。CHO細 胞hBDNFの酵素的消化には、５単位の酵素（５μ ｌ）およびプレプロhBDNFを含有するCHO細胞上 清からの３５S-標識タンパク質50μｌを用いた（第 30図、レーン２）。第30図、レーン７に見られる ように、５単位のエンドプロティナーゼArg-Cで、 37℃で５分間でhBDNFのプレプロ形（分子量31,0 00）をhBDNFの成熟形（分子量12,000）に変換で きた。
hBDNFを発現するCHO細胞上清をエンドプロテ ィナーゼArg-Cで酵素的に処理すると、未処理上 清に比較してBDNF生物活性レベルが増大して、 hBDNFを発現するCHO-DG44細胞からの上清をエン ドプロティナーゼArg-Cで37℃で５分間処理した。
上清200μｌを20単位の酵素で処理しそして処理 および未処理hBDNFの両方をE8ニワトリ背根神経 節の外植片を用いて生物活性についてアッセイし た。hBDNF添加24時間後、神経突起伸びを定性的 に採点した。エンドプロティナーゼ処理BDNF試料 が対照（未処理）BDNF試料より有意に生物活性が 高いことが一貫して観察された。この曲線の濃度 曲線を第31図にプロットする。
結論として、精製エンドプロティナーゼArg-C は不完全にプロセシングされた前駆体分子（すな わち、プロBDNF）から組み換えヒト脳由来神経栄 養因子の成熟した生物活性形を生成されるための インビトロ酵素反応に使用できる。この新規方法 により、哺乳動物細胞培養系から生物活性ヒトBD NFを効率的に大規模に生産することができよう。
例えば、エンドプロティナーゼArg-Cを固形マト リックス上に固定化して効率的なカラムクロマト グラフィー工程を確立することができよう。
実施例13：脳由来神経栄養因子はラット腹側中脳 のドーパミン作動性ニューロンの生存 および成熟を促進する (1)材料および方法 (1.1)細胞培養 解離培養物はE14-E15ラット胚から切開され た腹側中脳組織の酵素的および機械的解離によ って確立された。代表的にはタイム−メイトした Sprague-Dawleyラットからのラット胚の子２匹ま たは３匹からのプールされた組織をF12培地(Gibco) 中で37℃で20分間トリプシン（0.125％；Worthing ton）処理した。成長培地（次の補足物を含有す るMEM：グルタミン２mM、グルコース6mg/ml、ペ ニシニンG 0.5U/ml、ストレプトマイシン５μg/ ml、ウシ胎児血清7.5％）で洗浄したのち、組織 を低速で５分間簡単に遠心分離し、このペレット を磨砕によって解離した。分散されなかった細胞 の塊を沈降させるために１〜２分間放置したのち、 単離細胞懸濁液を成長培地を含有する35mm皿（ポ ルオルニチンおよびラミニンでプレコート；Lind sayら、1985,Dev.Biol.112:319）の上に蒔い て細胞密度を104細胞／cm2にした。細胞を付着せ しめるために成長培地中で１夜インキュベート したのち、BottensteinおよびSotoにより記載 （BottensteinおよびSoto、1979,Proc.Nat l. Acad.Sci.USA.76:514）されるが、ただしイン スリン20ng/mlを含有させた、血清不含の特定の 培地中でBDNFの存在または非存在において細胞を 培養した。ドーパミン作動性細胞を可視化するた めに培養物を４％ポラホルムアルデヒドで固定し、 充分に洗浄し、ウマ血清1.5％を含有するSorens en緩衝液中での0.02％サポニンを用いて透過性と なし、ラットTHに対するマウスモノクロナール抗 体(Boehringer-Mannheim)で染色した。一次抗体 結合はVectastain ABCキット(Vector Labs)を用い て可視化した。
(1.2)ドーパミン取り込みの測定 前記(1.1)に記載のようにして培養物を調製し、 ブタBDNF 50ng/mlの存在または非存在のいずれか において数日間インキュベートして成長させた。
ドーパミン取り込みは３通りの培養物において指 示された時点で測定した。細胞を次の組成の取り 込み緩衝液で予備洗浄した：136.8mM NaCl,2.7m M KCl,8mM Na2HPO4・7H2O, 1.5mM K H2PO4,5mMグ ルコース，1mM CaCl2,1mM MgSO4,0.1mMアスコ ルベートおよび0.1mMパルジリン，pH7.4。非ニ ューロン性３H-ドーパミン取り込みについて測定 しようとするこれらのサンプルは、取り込み緩衝 液中に５μＭの濃度で含有されたベンゾトロピン (BZT)を有していた。洗浄ののち細胞を新鮮な取 り込み緩衝液中で37℃に５分間予熱し、この時点 で３H-ドーパミンNEN、40Ci/mモル）を50nMの最 終濃度になるように添加した。培養物を37℃で15 分間インキュベーションし、取り込み溶液を除去 し、細胞を氷上に置き、氷冷した取り込み緩衝液 で４回洗浄した。培養皿に0.5N NaOHを添加して 細胞を収穫し、NaOH抽出物をUltima Goldシンチ レーション液(Packard Instruments）15mlを有す るベックマンシンチレーションカウンターでカウ ントした。特異的ニューロン性ドーパミン取り込 みはBZT非存在下に観察された取り込み(cpm)か らBZT存在下に観察された値を差引いた値と定義 される。普通は総取り込みの70〜90％をBZTによ り阻害できる。複製培養物において各時点でTH+ ニューロン数は免疫細胞化学的染色により測定し、 その示された結果はTH+１個に基づいて標準化さ れた取り込みを表わす。
(1.3)BDNFのトランジション発現 hBDNFをコードする配列を含有するベクターCDM ８でCOS M5細胞をトランスフェクションした。
トランスフェクションの72時間後に培養物上清液 50mlを集め、６Ｍ尿素に対して透析した。透析上 清液を次いでアンホリン（ampholines)(pH3.5〜 10、BioRad）と4.5時間混合した。フラクション を集め、そして非特異的吸収を防ぐためにBSA （0.5mg/ml)で予備洗浄した透析管を用いて25mM NaH2PO4緩衝液pH7.6に対して透析した。フラク ションをE8ニワトリ背根神経節外植片の培養物中 で神経突起伸長促進活性についてアッセイした。
活性フラクションをプールした。８〜18％ゲル上 のSDS PAGEおよびそれに続く銀染色（Wrayら、19 81,Anal.Biochem.118:197)により活性プールを 分析すると、BSAに対応する68kDにフェイントバ ンド、および先にブタBDNFについて観察されたも の(Bardeら、1982,EMBO J.1:549）（データは示 されない）に対応する約12kDに単一バンドが示さ れた。ニワトリ背根、節状および交感神経節外植 片について行った比較バイオアッセイにおいて、 精製組換えBDNFの特異的活性およびニューロン性 特異性は精製ブタBDNFのそれに類似していた。
(1.4)トランスフェクションされたCHO細胞から のヒトBDNFの産生 CHO-DG44細胞はL.Chasin博士（Columbia Uni vercity,NY)からの厚意により提供された。これ らの細胞はジヒドロ葉酸レダクターゼが欠けて いた(dhfr-)(UrlaubおよびChasin,1980,Proc. Natl.Acad.Sci.USA.77:4216-4220）。CHO-DG 44細胞をウシ胎児血清10％、ペニシリンおよびス トレプトマイシン１％、およびグルタミン2mMを 含有するHamのF12培地中に保持した。細胞を毎 週２回継代し、マイコプラズマ汚染について検査 した。すべてのプラスミドDANをトランスフェク ションする前に二重塩セシウムバンディングによ り精製した。ヒト脳由来神経栄養因子遺伝子を 先に記載されたように(Maisonpierreら、1990, Science 247:1446-1451)、哺乳類発現ベクターpC DM8にサブクローニングしてpC8hBを生成させた。
弱められたジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子p410 はL.Chasin博士の厚意により提供された。これら の二つの遺伝子構築物をエレクトロポレーション (ShigekawaおよびDower,1988,Biotechniques 6:742-751で概説されている）によりCHO-DG44細 胞に同時トランスフェクションした。pC8hB 20μ ｇおよびp410 0.2μｇを用いて約１×10６細胞を トランスフェクションした。トランスフェクション の48時間後に、CHO-DG44細胞をヌクレオシド不含 のHam F12(チミジンおよびヒポキサンチン不含； -HT)プラス透析ウシ胎児血清10％およびペニシリ ンおよびストレプトマイシン１％から成る選択培 地中に分配した。ヌクレオシド不含選択培地中に 細胞を入れてから約10日後に個々のコロニーを単 離した。ヌクレオシド不含のHam F12(-HT)培地中 での成長に対して耐性を有する選択された個々の コロニーを、0.02、0.05または0.1μＭメトトレ キサート(MTX)のいずれかで処理して遺伝子増幅 を誘発させた(Altら、1978,J.Biol.Chem.253: 1357-1370）。MTX-耐性コロニーをプールとして培 養し、さらに1.5、2.0または2.5μM MTXのい ずれかで増幅させた。2.5μM MTXに耐性の一つ のコロニーを単離し、そしてhBDNFのスケールア ップ培養および生成について選択した。このクロ ーン(DGZ1000-B-3-2.5）のサザンブロッティング 分析は野性型CHO-DG44細胞に比して約50倍のBDNF 遺伝子の増幅を示した。胚性(E8)ニワトリ背根神 経節(DRG)の外植片によるバイオアッセイを用い てこのクローンが約9.5μｇのhBDNF/mlを産生す ることを評価した（示されず）。組み換え体hBDNF は480cm2のローラービン中でのDGZ 1000-B-3-2.5 細胞の培養によって大規模に産生された。これら の細胞が集密に達したち約４日後に培地を収穫し た。培養物上清液からのhBDNFの精製はCOS上清 液に関して上記したように行った。
(2)結果および論考 ニューロン生存および標的神経支配の特異性を 制御する分子シグナルの特性決定は、神経系がど のように形成されるのかの解明に役立つばかりで なく、成熟ニューロンを適切なシナプス配置に保 持し修復することに関するメカニズムのより良好 な理解に導くとも思われるので、根本的に重要で ある。ニューロンの生存および保存は特定の標的 細胞由来神経栄養因子次第であることが広く認め られているが（Levi-MontalciniおよびAngeletti, 1968,Physiol.Rev.48:534;Thoenen and Barde, 1980,Physiol.Rev.,60:1284;Purv es,D.,19 88,Body and Brain,Harvard University Press, Cambridge,NA.;Barde,Y.A.,1989, Neuron, 2:1525;Lindsay,R.M.1988,The Making of the Nervous System,Oxford University Press, Oxford,p148）、かかる分子の極めてわずかしか 十分に特性決定されていない。今日、二つの神経 栄養因子、神経成長因子(NGF)および脳由来栄養 因子(BDNF)についてだけ、インビボでの明察なニ ューロン集団の生存を選択的に支持することが示 されている（Levi-MontalciniおよびAngeletti, 1968,Physiol.Rev.48:534;Barde,Y.A.,19 89,Neuron,2:1525;Leibrockら、1989,Nature 341:149）。
ニューロン細胞培養物は細胞および組織抽出物 中での神経栄養活性についてのバイオアッセイを 確立するために(Levi-MontalciniおよびAngeletti, 1968,Physiol.Rev.48:534;Thoenenおよび Barde,1980,Physiol.Rev.,60:1284;Lindsay, R.M.1988,The Making of the Nervous System, OxfordUniversity Press,Oxford,p.148； Varon およびAdler,1981,Adv.Cell.Neurobiol.,2: 118)、そして精神神経栄養因子のニューロン特異 性を決定するために(Ebendal.T.,1989, Nerve Growth Factors, John Wiley,London, p.81; Barbinら、1984,J.Neurochem.43:1468;Barde ら、1982,EMBO J.1:549;Daviesら、1986,J. Neurosci.6:1897;Lindsayら、1985,Dev.Biol. 112:319）広く用いられている。今日、大部分の 研究は末梢神経系(PNS)のニューロンの種々のク ラスの神経栄養的必要条件に集中している。NGF は入手可能であるゆえを断然十分に特性決定され た神経栄養因子として確立されている:NGFはイン ビボおよびインビトロの両方においてPNSおよび CNSの両方のニューロンサブ集団の生存および保 持にとって必須であることが示されている(Levi- MontalciniおよびAngeletti,1968,Rhysiol.Rev. 48:534;ThoenenおよびBarde,1980,Physiol , Rev.,60:1284; WhittemoreおよびSeiger,1987, Brain Res.Rev.12:439;Snider and Johnson, 1989,Ann.Neurol.26:489;Heftiら、1989,Ne urobiology of Aging 10:515;Martinezら、1987, Brain Res.412:295;Tekeiら、1988,J.Neuro chem.51:1118;HartikkaおよびHefti,1988,J. Neurosci.8:2967）。NGF以外の神経栄養因子の 精製調節物の入手可能性が限られており、そして 特定のニューロン集団の均質調節物の調製が困難 であるため、特定のCNSニューロンに関する神経 栄養成長因子の同定が妨げれてきた。最近の二つ の観察により、CNS（黒質）ドーパミン作動性ニュ ーロン生存に及ぼすBDNFの作用の研究を促進させ た。第一に、BDNF遺伝子はCNS中でそしてNGF遺 伝子よりも比較的にまたはより高いレベルで発現 されることが現在明らかである(Leibroekら、19 89,Nature 34:149）。第二に、BDNFの特性と見 掛け上類似する特性を有するウシ線条体から部分 的に精製されたタンパク質（黒異質ドーパミン作 動性ニューロンの標識）は中脳から調製されたド ーパミン作動性ニューロンのインビトロ生存を増 大させうることが報告されている（Dal Tosoら、 1988,J.Neurosci.8:733)。
第３Ａ図は培養９日後の解離された腹側中脳細 胞の代表的に外観を示す。線繊芽細胞形態の２〜 ３の細胞が明らかに示されており、大グリアマー カー、グリア原線維酸性タンパク質に関する抗体 で培養物を染色した場合に(GFAP;Bignamiら、19 72,Brain Res.43:429)、大グリア細胞は検出さ れなかった。これらの培養におけるドーパミン作 動性ニューロンを可視化するために、THに対する モノクロナール抗体を用いて免疫細胞化学的染色 を行った。予想されたように、TH+ニューロン数 は少なく（第32Ｂ、32Ｃ図、矢印）、そして培養 時間に応じて塗布した細胞の0.1〜0.5％の間で 変化した。種々のニューロン形態が第33図に示す ようにTH+細胞中に認められた。
すべての培養物において、インビボで最初の３ 〜４日後にTH+細胞数は一貫して徐々に低下した （第34Ａ図、第35図）。８日の培養までに、例え ば対照培養物中のTH+細胞数は２日目の同様の培 養物中で見出された数の25％にすぎなかった（第 35図）。しかしながら、BDNFで処理した培養物中 ではTH+細胞の損失は対照と比較して大きく減少 した。インビトロで８日後に調べたすべての場合 に、BDNF処理培養物中のTH+細胞数は未処理対照 の場合よりも多く、例えばBDNFの１回添加後に 1.8倍高く（第34Ａ図）、数回添加後は５倍高か った（第35図）。８日間保持した培養物に１回だ け添加した場合でさえも、BDNFの効果は用量に依 存することが見出された（第34Ｂ図）。先の報告 （Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:733;Knusel ら、1990,J.Neuroscii.10:558）と一致して、 NGF(50ng/ml)はTH+細胞数に対して影響を及ぼさ なかった（第34Ｃ図）。
これらの培養物中のドーパミン作動性ニューロ ンに対するBDNFの作用を調べる他の方法として、３ H-ドーパミンを取り込むTH+細胞の能力を研究 した。第Ｘ表に示すように、ドーパミン取り込み 能（TH+ニューロン１個について標準化）は培養 の最初の８日にわたり著しく増大したが、それ以 後は低下した。しかしながら、BDNFはドーパミン を取り込むTH+細胞の能力を変化させないことが 見出された。BDNFの存在または非存在下において 同じ時間的経過および同様の値が得られたからで ある（第Ｘ表）。我々はこの結果から、おそらく BDNFは、生存にBDNFを必ずしも必要としないニュ ーロンにおけるドーパミン作動性表現型の発現を 誘導するのと反対に中脳培養物中のドーパミン作 動性ニューロンの生存を直接に促進するように働 らくという仮設を設けた。このことをさらに調べ るために、BDNF添加を最初に数日間遅れさせた培 養物中におけるTH+ニューロン数を測定する実験 を行った。我々はBDNF添加を５日まで遅れさせ、 次いでTH+細胞数を６日、８日または10日に測定 すると、これらの培養物中ではBDNFを２日目以後 に存在させた平行培養物と比較してより少数のド ーパミン作動性細胞しか認められないことを見出 した（第36図）。BDNFの遅れた添加は対照と比較 してTH+ニューロン数を明らかに増加させるが、 同等の時点で調べた場合でさえも遅れた添加の効 果はBDNFを２日目に添加した場合ほど多くのTH+ ニューロンを救わなかった。
合わせて考えると、これらの結果はBDNFは一定 の細胞数以内でTH-遺伝子発現を増加させるよう にのみ働らくという可能性に反対の議論を提示し、 そしてBDNFは、その効果を、この神経栄養因子が 早期段階で培養物に添加されない場合には失われ るドーパミン作動性ニューロンの生存を増大させ ることによってその作用を発揮することを示唆す る。
いくつかの報告は標的由来の抽出物または種々 の成長因子のいずれかによる中脳ドーパミン作動 性ニューロンのインビボでの成熟および生存の向 上の刺激を詳述している（Dal Tosoら、1988,J. Neurosci.8:733;Knuselら、1990,J.Neurosci. 10:558;Prochiantzら、1979,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 76:5387;Diporzioら、1980,Nature 288:370;Prochiantzら、1981,Nature 293:570; Denis-Doniniら、1983,J.Neurosci.3:2292)。
しかしながら、グリア細胞も高められた細胞分裂 も全く存在しない下でのTH+ニューロンの生存を 直接にかつ選択的に支持する十分に精製された分 子についての報告（例えばIGF-1またはFCFによ り観察されたようなもの、Dal Tosoら、1988,J. Neurosci 8:733)はこれまではない。早期マウス 胎児組織を用いる先の報告(Dal Tosoら、1988,J. Neurosci 8:733)と一致して、血清不含の特定培 地中で培養されたE14ラット腹側中脳細胞は星状 細胞または線維芽細胞を実質的に含有しないこと が見出された。本研究に用いられた500,000細胞 ／cm2なる比較的に低い細胞塗布密度は任意のあり うる内因性神経栄養活性の作用を低下させ、そし てより正確な細胞カウンティングが可能となった。
ここに提示された結果を考慮すると、神経栄養因 子特にDal Tosoらによりウシ線条体から精製され たもの(Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:733) はBDNFであると思われる。これはBDNFが線条体中 で産生され、そして黒質から突起するドーパミン 作動性ニューロンの末端により取り込まれること を示唆する。しかしながら今までのところ、BDNF に関するmRNAまたは他のニューロトロフィンファ ミリーのメンバーに関するmRNAもが線条体組織中 に豊富であることはノーザンブロット分析では見 出されていない。
BDNFの添加は数回添加の場合でさえも、分析さ れた培養期間中に黒質ドーパミン作動性ニューロ ンの完全な生存を生じさせないことが明らかであ る。この現象はDal Tosoらにより我々の条件と極 めて類似する実験条件下ですでに観察されており (Dal Tosoら、1988,J.Neurosci 8:733)、彼ら はこの損失が用いた細胞密度と関連するであろう こと、すなわち細胞密度が高いほど（ここで用い た密度の４倍）より多数のカテコールアミン−蛍 光細胞が見られ、そしてこれらの細胞の自然消失 が減少したことを示した。
さらなる研究特にインビボでの腹側中脳のドー パミン作動性ニューロンの発達および保持に対す るBDNFの効果を調べることに関する研究が、ここ に記載したBDNFの効果の生理学的関連性を決定す るために必要であろう。パーキンソン病において 黒質ドーパミン作動性ニューロンが特異的に損失 されることからみて、これらの細胞に選択的に影 響を及ぼす神経栄養因子を発見することが特に望 まれる。従ってNGF不応性細胞であるこれらのニ ューロンの生存をBDNFが支持するという本発明の 発見は、BDNFが６−ヒドロキシドーパミンまたは NPTP（１−メチル−４−フェニル−1,2,3,6−テ トラヒドロピリジン）のいずれかの神経毒作用か らドーパミン作動性ニューロンを保護できるかど うかを決定する動物実験に関する理論的根拠を提 供するものである。かかる研究はパーキンソン症 候群に対する新規な治療法をもたらすであろう。
実施例14：BDNFはガンマ−アミノ酪酸取り込みの 用量依存性阻害を生じさせる (1)材料および方法 (1.1)海馬細胞培養物 Sprague-DawleyラットのE18-19ラット胚から海 馬を切開し、F10培地中に集めた。この組織を細 切し、F10培地(Gibco）で２回洗浄し、0.25％ト リプシン(Gibco）を用いて37℃で20分間トリプシ ン処理した。トリプシンはウシ胎児血清(FCS、10 ％）、グルタミン(2mM）、ペニシリン(25U/ml)お よびストレプトマイシン25μg/ml）を補足した最 低必須培地(MEM)により不活化した。緩やかに摩 砕して得られた解離細胞を集め、低速(500rpm)で 30秒間遠心分離した。遠心分離を２回繰返し、細 胞ペレットを次いで血清含有培地中に懸濁させた。
次いで細胞をポリオルニチン（10μg/ml）および ラミニン（10μg/ml）で被覆した６mmウエルまた は３５mm皿に塗布した。大部分の実験において、細 胞を約71,000細胞／cm2の低密度で塗布した。細胞 を塗布してから５〜６時間後に、培地を１％Ｎ３ およびペニシリン−ストレプトマイシン（それぞ れ25U/mlおよび25μg/ml）を含有する無血清培地 を交換し、このときにBDNFを添加した。培地は３ 日ないし４日毎に交換し同時にこの因子が再添加 された。
(1.2)ガンマ−アミノ酪酸(GABA）に関する高アフ ィニティ取り込みの測定 高アフィニティGABA取り込みはTomozawaおよび Appel(1986,Brain Res.399:111-124）の改変操 作を用いて測定された。140mM NaCl,2.6mM KCl, 1mM KH2PO4,1mM Na2HPO4,6mg/mlグルコース、 1mM MgCl2,1mM CaCl2,0.1% BSAを含有する GA BA取り込み緩衝液で細胞を洗浄した。洗浄後、細 胞をGABA取り込み緩衝液と共に37℃で５分間イン キュベーションした。次いで３H-GABA(NEN,NET- 191X,111.4Ci/mmol）を最終濃度12nMで添加し、 インキュベーションを37℃で10分間行った。次い で細胞を氷上に置き、取り込み緩衝液で３回洗浄 した。細胞を0.14N NaOHと共に室温で２時間イン キュベーションし、抽出物中の３H-GABAをカウン トした。３H-GABA取り込みは少なくとも30分まで の間直線状であることが見出された。非ニューロ ン細胞中へのGABAの取り込みは2mM B-アラニンの 添加により阻害されたが、ニューロンに特異的な 取り込みはニペコチン酸(nipecotic acid)1mMで の阻害により証明される。
(2)結果および論考 我々は最近、BDNFについての豊富なレベルのメ ッセージが海馬星状細胞中ではなくてニューロン に富んだ海馬培養物中で検出した。これらのデー タはBDNFが海馬ニューロンに局在化することを強 く示唆する。培養海馬ニューロンに対するBDNFの 作用を調べるために、細胞を種々の濃度のBDNF(C OS上清からのロトホール精製したもの）で処理し た。８日間の処理期間の終りに、ニューロンへの 高アフィニティGABA取り込みを測定した。第37図 に示すように、BDNFはGABA取り込みの用量依存性 阻害を生じさせた。従ってBDNFはGABA作動性ニュ ーロンの生存および／または表現型発現に影響を 及ぼしうる。BDNFはグルタメート含有ニューロン （グルタメート取り込み測定によりアッセイ）に 対してもまたニューロフィラメントタンパク質の レベルに対しても作用を及ぼさなかった。従って 海馬培養物に対するBDNFの作用はGABA作動性ニュ ーロンに対して特異的であると思われる。
実施例15：BDNFはMPP+の毒性作用に対して保護作 用を与える (1)材料および方法 (1.1)MPP+処理SH-SY5Y細胞に対する神経栄養因 子の作用の測定 SH-SY5Y細胞を24ウェルプレートに１ウェル当 り１×10５細胞の密度で塗布し、塗布24時間後に 細胞を神経栄養因子で処理した。神経栄養因子処 理の24時間後に細胞をMPP+(10μM)で処理した。
MPP+添加の48時間後にトリパルブルー排除アッセ イにより生存可能な細胞を定量した。用いた神経 栄養因子はmNGF-COS（１：５希釈）、hBDNF-COS(１ ：５希釈）、イー・コリからの精製rCNTF（25ng/ ml）、ウシ脳bFGF(25ng/ml)、rNT3-COS（１：５ 希釈）および精製hEGF(25ng/ml)であった。
(1.2)MPP+で処理した腹側中脳培養物に及ぼす神 経栄養因子の作用の測定 解離した腹側中脳ニューロンの培養物はE14ラ ット胚から確立されたプロトコルに従って樹立し た（上記実施例13参照）。これらの培養物が樹立 されてから48時間後に、指示された適切な神経栄 養剤で処理した。神経栄養因子にはhBDNF(CHO細 胞からのロトホール精製物、＜50ng/ml）、精製 mNGF(50ng/ml）、rNT-3(１：５希釈のCOS上清）、 精製ウシ脳bFGF(10ng/ml)、およびイー・コリか らの精製rCNTF(25ng/ml)が包含される。神経栄養 因子添加の24時間後にこれらの培養物をMPP+(1μ M)で処理した。MPP+処理の48時間後にTH陽性ニュ ーロンを免疫組織化学的方法により同定して定量 した。データは１実験につき３通りのサンプルを 用いて行った３つの独立した実験の平均を表わす。
MPP+処理後のTH陽性ニューロン数は斜線の棒で示 される。白ヌキ棒はMPP+処理をしなかったTH陽性 ニューロン数を示す。
(2)結果および論考 BDNF、CNTF、NT-3、bFGFおよびEGFを別個に、 SH-SY5Y細胞を１−メチル−４−フェニルミリミ ジニウム(MPP+)毒性から保護する能力について試 験した場合に、トリパンブルー排除アッセイによ り測定して、BDNFおよびNFGだけがMPP+毒性に対 して有意な保護活性を示すと思われる（第XI表お よび第XII表）。
腹側中脳培養物において、データはBDNFがMPP+ 毒性に対して有意な保護効果を示したが、bFGFは より低い効果しか生じなかったことを示す（第38 図）。MPP+処理は、チロシンヒドロキシラーゼ陽 性細胞の数を対照培養物において85％減少させた が、MPP+に露す前にBDNFで前処理した培養物にお いては40％だけしか減少させなかったことが判っ た。 MPP+はトキシンMPTPに関する仮定された代 謝産物であって、これはインビボでパーキンソン 病様症候群を誘導することが観察されており、こ の症候群はパーキンソン病について受容されたモ デルシステムである。従って、BDNFおよびNT-3の 保護作用はこれらの化合物がパーキンソン病の治 療において、または毒性曝露に続く神経系損傷の 保護に有用であることを証明できることを示して いる。
微生物の寄託 以下の組み換えバクテリオファージおよび組み 換えプラスミドDNAを1989年８月30日メリーラン ド州ロックビル(Rockville)のアメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクションに寄託した。
ATCC受託番号 phBDNF-C-1 40648 λhBDNF-G-1 40649 本発明は本明細書に記載された詳細な態様によ り範囲を限定されるべきでない。事実本明細書に 記載されているものに加えて、本発明の種々の変 更態様が明細書並びに添付図面から当業者には明 らかであろう。かかる変更態様は本発明の特許請 求の範囲の範囲に包含される。
種々の刊行物が本明細書に引用されており、そ の開示はすべて参考文献として本明細書に取り込 まれる。
【図面の簡単な説明】
第１図はブタプレプロBDNF cDNAのヌクレオチ ド配列および推定アミノ酸配列を示す。 第２図はNGFとBDNFの配列を比較して示す。 第３図は32P-標識NGFおよびBDNFプローブとハ イブリッド形成した、EcoRI切断ヒト、サル、ラ ット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリお よび酵母ゲノムDNAのサザンブロットのオートラ ジオグラフを示す。 第４図は各組織からのRNAに関するノーザンブ ロットアッセイを示す。 第５図はヒトBDNF cDNAの配列および推定アミ ノ酸配列、並びにブタ、ラットおよびニワトリか らのDNA配列を比較して示す。 第６図はBDNF発現プラスミドpCMVl-pBDNFを示 す。 第７図(a)は抗血清の連続希釈物を用いる抗血清 のB5ペプチドへの結合のELISA測定結果を示し、 そして(b)は種々の抗血清の1:500希釈物の50ng BDNFへの結合の定量を示す。 第８図はBDNF処理（斜線棒）および対照（黒い 棒）腹側中脳培養物におけるチロシンヒドロキシ ラーゼに関する免疫組織化学的染色の結果を示す。 第９図は腹側中脳培養物によるドーパミン取込 みを示す。BDNF補添された培養物は斜線棒により 表され、対照培養物は黒い棒で示す。 第10図(a)は前脳コリン作動性ニューロン培養物 におけるCAT陽性細胞の数に及ぼすBDNFの作用を 示し、そして(b)は１ウェル当たり260,000細胞の 密度（黒棒）または１ウェル当たり150,000細胞 の密度（斜線棒）において前脳コリン作動性ニュ ーロン培養物を150ng/mlのNGFで処理した（斜線 棒）。NGF-処理対未処理細胞におけるCAT免疫陽 性細胞の数を比較して示す。 第11図は前脳コリン作動性ニューロン培養物中 におけるBDNF濃度の関数としての、１分当り触媒 された基質のピコモルで示されたCAT酵素活性の 量の変化を示す。 第12図は約60％の集密度の大グリア細胞培養物 を、(a)表皮成長因子または(b)BDNFのいずれかで42 時間処理し、次いで[3H]メチルチミジンとインキ ュベートし、３Hの取込み量をEGFおよびBDNF濃度 に対して測定した結果を示す。 第13図はBDNF/NGFプローブR1B/2Cにハイブリッ ド形成した、EcoRI制限ニワトリ、マウス、ラッ トのサザンブロットを示す。NGFおよびBDNFゲノ ムEcoRIフラグメントの位置を、各々ＮおよびＢ として示す。 第14図はNGFおよびBDNFと、Box3/Box4プライ マーを用いるマウスDNAからのPCRによって同定 されたBDNF/NGFファミリーの新規のメンバーとの 配列を比較して示す。 第15図はBDNFヒトプローブにハイブリッド形成 した種々のヒト腫瘍由来細胞系からのRNAのノー ザンブロットを示す。 第16図は海馬ニューロンにおけるBDNF-mRNA レベルの分極の作用を示す。 第17図はカリウム及びカイニン酸による海馬ニ ューロンのNGF-mRNAレベルの増加を示す。 第18図はカイニン酸作用に関する用量曲線を示 す。 第19図はカイニン酸作用によるBDNF-及びNGF- mRNAレベルの増加の時間的経過を示す。 第20図はBDNF-mRNAのカイニン酸により誘導さ れた発現に及ぼす鎮痙剤の作用を示す。 第21図は培養物における細胞成長の時間経過の 位相差顕微鏡写真を示す。 第22図はAChE細胞数の基づくBDNF又はNGF処理 に対する解離された中隔細胞の応答の比較を示す。 第23図は解離された中隔培養物に対するBDNF又 はNGFの添加遅延作用を示す。 第24図はNGF-レセプター免疫陽性細胞の数を調 節するBDNF又はNGFの能力を示す。 第25図はBDNF(A)及びNGF(B)のCAT誘導性に対 する中隔コリン作動性ニューロンの用量応答曲線 を示す。 第26図はAChE酵素活性に及ぼすBDNF及びNGFの 用量応答効果を示す。 第27図はBDNFにより誘導されるCAT酵素活性の 増大の時間経過をNGFと比較して示す。 第28図はCAT酵素活性を誘導するBDNFの能力に 及ぼすグリア細胞の作用の比較を示す。 第29図は高アフィニティコリンの取り込みのレ ベルに及ぼすBDNF又はNGF処理の作用を示す。 第30図は３５S-標識反応生成物のSDS-PAGEによる 分解を示す。 第31図は未処理CHO-hBDNFとエンドプロティナ ーゼ開裂CHO-hBDNFと比較したDRGバイオアッセ イを示す。 第32図はE14ラットの腹側中脳細胞の解離培養 物の位相差及び明視野顕微鏡写真。 第33図はE14ラット腹側中脳細胞の６日培養物 の高倍率顕微鏡写真を示す。 第34図はBDNFが用量依存性様式でTH+ドーパミ ン作動性中脳ニューロンの生存を促進することを 示す図である。 第36図はBDNFの反復量がTH+ニューロンの生存 を増加させることを示す図である。 第35図はBDNFを遅れて加えた場合はTH+の数を 増大させることを示す図である。 第37図は海馬培養物における高アフィニティー CABAとり込みに及ぼすBDNFの用量依存性応答を示 す。 第38図はBDNFはMPP+の神経毒性作用から培養異質 ドーパミン作動性ニューロンを保護することを示 す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平４．１１．２７ 明細書の図面の簡単な説明の欄を次のように補正す
る。 明細書第２８５頁第２行目「ジオグラフを示す。」を
「ジオグラフを示す電気泳動写真である。」と補正す
る。同第２８５頁第４行目「ロツトアッセイを示す。」
を「ロツトアッセイを示す電気泳動写真である。」と補
正する。同第２８６頁下から２行目「トのサザンプロツ
トを示す。……」を「トのサザンプロツトを示す電気泳
動写真である。……」と補正する。同第２８７頁第１行
目「として示す。」を「として示す電気泳動写真であ
る。」と補正する。同第２８７頁第８行目「ザンプロツ
トを示す。」を「ザンプロツトを示す電気泳動写真であ
る。」と補正する。同第２８７頁第１０行目「レベルの
分極の作用を示す。」を「レベルの分極の作用を示す電
気泳動写真である。」と補正する。同第２８７頁末行
「位相差顕微鏡写真を示す。」を「位相差顕微鏡写真を
示し、これは生物の形態を示す写真である。」と補正す
る。同第２８８頁下から２行目「分解を示す。」を「分
解を示す電気泳動写真である。」と補正する。同第２８
９頁第４行目の「物の位相差及び明視野顕微鏡写真。」
を「物の位相差及び明視野顕微鏡写真であり、生物の形
態を示す写真である。」と補正する。同第２８９頁第６
行目「の高倍率顕微鏡写真を示す。」を「の高倍率顕微
鏡写真を示し、これは生物の形態を示す写真である。」
と補正する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 8314−4Ｃ 39/395 ＡＡＢ Ａ 9284−4Ｃ 49/00 ＡＡＭ Ａ 9164−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 13/00 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/19 7236−4Ｂ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 5/16 15/10 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ Ｖ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 999999999 リジェネロン・ファーマシューティカル ズ・インコーポレーテッド アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10591・タリイタウン・オールド・ソー・ ミル・リヴァー・ロード 777 (72)発明者 キャロリン・ハイマン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10570・プレザントヴィル・ドッグウッ ド・レーン 61 (72)発明者 ラルフ・アルダーソン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10562・オシニング・ストンアベニュー ５ (72)発明者 ジョージ・ヤンコプロス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10510・ブライアークライフマノール・ス リーピーハロウロード 428 (72)発明者 イフェス―アライン・バルデ ドイツ連邦共和国ディー8032 グラフェル フィング・メロウィンジャーシュトラーセ 39 (72)発明者 ハンス・フリードリッヒ・エルヴィン・テ ーネン ドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン40・ク レペリンシュトラーセ ４アー (72)発明者 アンドレアス・ホーン ドイツ連邦共和国 8000ミュンヘン70・ム ルナウエルシュトラーセ 260アー (72)発明者 フリードリッヒ・ロットシュパイヒ ドイツ連邦共和国 8021ノイリート・ドロ ッセルウェーク １ (72)発明者 ロナルド・エム・リンドセイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10510・ニューヨーク・ブライアークリ フ・チャッパクア・ロード 479 (72)発明者 マグダレーナ・ホーファー アメリカ合衆国 コネチカット州 06902・スタンフォード・ウッドクリフス トリート 34 (72)発明者 ヨアヒム・ライブロック ドイツ連邦共和国 ディ6102・フンクスタ ット・ローランドショーシュトラーセ 14 (72)発明者 デイヴィッド・エドガー イギリス国 エル18 １ジェイダブリュ ウ・リヴァプール・モッスリーヒル・クウ ィンズドライブ 158 (72)発明者 バスティアン・ヘンゲラー ドイツ連邦共和国 ディ―7860 スコープ ファイム・スタブハルテル フルリ―シュ トラーセ ９アー (72)発明者 ダン・リンドホルム ドイツ連邦共和国 ディ―8000 ミュンヘ ン 60 オット―ディッヒナーウェグ 13 (72)発明者 フランシスコ・ツァフラ ドイツ連邦共和国 ディ―8000 ミュンヘ ン 70 インプレルシュトラーセ 67ベー

Claims (148)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 脳由来神経栄養因子をコードする核酸配
    列ま たは少なくとも約10ヌクレオチドを包含するそ のサブ配列を含有する組み換えDNA分子。
  2. 【請求項２】 脳由来神経栄養因子をコードする核酸配
    列ま たはサブ配列が実質的に第１図に示されるヌク レオチドおよそ167からおよそ927までである 請求項１に記載の組み換えDNA分子。
  3. 【請求項３】 cDNA配列からなる請求項１または２に記
    載の 組み換えDNA分子。
  4. 【請求項４】 ゲノムDNA配列を含有する請求項１また
    は２ に記載の組み換えDNA分子。
  5. 【請求項５】 実質的に第５図に示されるヒトDNA配列
    また はサブ配列を含有する請求項１に記載の組み換 えDNA分子。
  6. 【請求項６】 実質的に第５図に示される少なくともヌ
    クレ オシドおよそ974とおよそ1440の間のヌクレオ チドの配列の部分を含有する請求項５に記載の 組み換えDNA分子。
  7. 【請求項７】 ブタDNA配列を含有する請求項１または
    ２に 記載の組み換えDNA分子。
  8. 【請求項８】 ATCCに寄託されそして受託番号40648を
    有す るphBDNF-C-1に含有される請求項５に記載の組 み換えDNA分子。
  9. 【請求項９】 ATCCに寄託されそして受託番号40649を
    有す るλhBDNF-G-1に含有される請求項５に記載の 組み換えDNA分子。
  10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載の組み換えDN
    A分子 と相補性の組み換えリボ核酸分子。
  11. 【請求項１１】 第１図に示されるアミノ酸配列と実質
    的に相 同のタンパク質をコードする配列またはその一 部分を含有する核酸配列。
  12. 【請求項１２】 第５図に示されるアミノ酸配列と実質
    的に相 同のタンパク質をコードする配列またはその一 部分を含有する核酸配列。
  13. 【請求項１３】 第１図に示される核酸配列と実質的に
    相同の 配列またはそのハイブリッド形成可能な部分を 含有する核酸配列。
  14. 【請求項１４】 BDNFタンパク質またはそのペプチドフ
    ラグメ ントをコードする核酸配列の発現が、脳由来神 経栄養因子タンパク質またはペプチドが組み換 えDNA分子で形質転換された宿主中で発現され るように第２の核酸配列により調節されるもの である請求項１または２に記載の組み換えDNA 分子。
  15. 【請求項１５】 pCMV-pBDNF-1に含有される請求項14に
    記載の 組み換えDNA分子。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載のDNA分子を含有する
    核酸ベ クター。
  17. 【請求項１７】 請求項１、２または13に記載のDNA分
    子を含 有する組み換え微生物。
  18. 【請求項１８】 細菌である請求項17に記載の組み換え
    微生物。
  19. 【請求項１９】 酵母である請求項18に記載の組み換え
    微生物。
  20. 【請求項２０】 請求項13に記載の組み換えDNA分子を
    含有す る細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項14に記載の組み換えDNA分子を
    含有す る細胞。
  22. 【請求項２２】 実質的に第１図に示されるアミノ酸配
    列をコ ードする配列または抗原決定基を含有するその サブ配列を含有する核酸配列。
  23. 【請求項２３】 実質的に第１図に示されるアミノ酸配
    列また は抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する 精製タンパク質。
  24. 【請求項２４】 実質的に第１図に示されるアミノ酸配
    列また は機能的に活性なペプチドを含有するそのサブ 配列を有する精製タンパク質。
  25. 【請求項２５】 実質的に第５図に示されるアミノ酸配
    列また は抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する 精製タンパク質。
  26. 【請求項２６】 実質的に第５図に示されるヒトBDNFの
    アミノ 酸配列または機能的に活性なペプチドを含有す るそのサブ配列を有する精製タンパク質。
  27. 【請求項２７】 実質的に第１図に示されるアミノ酸配
    列のア ミノ酸およそ134からおよそ252まで、または 抗原決定基を含有するそのサブ配列を有する精 製タンパク質。
  28. 【請求項２８】 実質的に第５図に示されるニワトリBD
    NFに関 する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列 または抗原決定基を含有するそのサブ配列を有 する精製タンパク質。
  29. 【請求項２９】 実質的に第５図に示されるニワトリBD
    NFに関 する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列 または機能的に活性なペプチドを含有するその サブ配列を有する精製タンパク質。
  30. 【請求項３０】 実質的に第５図に示されるラットBDNF
    に関す 核酸配列によりコードされるアミノ酸配列ま たは抗原決定基を含有するそのサブ配列を有す る精製タンパク質。
  31. 【請求項３１】 実質的に第５図に示されるラットBDNF
    に関す る核酸配列によりコードされるアミノ酸配列ま たは機能的に活性なペプチドを含有するそのサ ブ配列を有する精製タンパク質。
  32. 【請求項３２】 請求項１に記載のDNA分子を含有する
    組み換 え微生物を、該DNA分子がその微生物によって 発現されるように増殖させ、そして発現された BDNFタンパク質またはそのフラグメントを単離 することからなる、BDNFタンパク質またはその フラグメントの製法。
  33. 【請求項３３】 請求項２に記載のDNA分子を含有する
    組み換 え微生物を、該DNA分子がその微生物によって 発現されるように増殖させ、そして発現された BDNFタンパク質またはそのフラグメントを単離 することからなる、BDNFタンパク質またはその フラグメントの製法。
  34. 【請求項３４】 (a)請求項14に記載のDNA分子を含有す
    る組み 換え微生物を、該DNA分子がかかる微生物によ って発現されるような条件下に増殖させ、そし て(b)発現されたBDNFタンパク質またはそのフラ グメントを単離することからなる、BDNFタンパ ク質またはそのフラグメントの製法。
  35. 【請求項３５】 (a)請求項15に記載のDNA分子を含有す
    る組み 換え微生物を、該DNA分子がかかる微生物によ って発現されるような条件下に増殖させ、そし て(b)発現されたBDNFタンパク質またはそのフラ グメントを単離することからなるBDNFタンパク 質またはそのフラグメントの製法。
  36. 【請求項３６】 (a)請求項２に記載のDNA分子を含有す
    る組み 換え宿主を、該DNA分子がかかる宿主によって 発現されるような条件下に増殖させ、次いで(b) 発現されたBDNFタンパク質またはそのフラグメ ントを単離することからなる、BDNFタンパク質 またはそのフラグメントの製法。
  37. 【請求項３７】 宿主が真核生物細胞である請求項36に
    記載の 方法。
  38. 【請求項３８】 宿主がヒト以外のトランスジェニック
    動物で ある請求項37に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 請求項32に記載の方法の生成物。
  40. 【請求項４０】 請求項33に記載の方法の生成物。
  41. 【請求項４１】 請求項34に記載の方法の生成物。
  42. 【請求項４２】 請求項35に記載の方法の生成物。
  43. 【請求項４３】 界面活性剤を含まない請求項39に記載
    の生成 物。
  44. 【請求項４４】 界面活性剤を含まない請求項40に記載
    の生成 物。
  45. 【請求項４５】 界面活性剤を含まない請求項41に記載
    の生成 物。
  46. 【請求項４６】 界面活性剤を含まない請求項42に記載
    の生成 物。
  47. 【請求項４７】 グリコシル化されている請求項36、39
    または 40に記載の生成物。
  48. 【請求項４８】 グリコシル化されていない請求項36、
    39また は40に記載の生成物。
  49. 【請求項４９】 BDNFタンパク質、そのペプチドフラグ
    メント または誘導体を認識する抗体、抗体フラグメン トまたは誘導体。
  50. 【請求項５０】 宿主動物をBDNFタンパク質、そのペプ
    チドフ ラグメントまたは誘導体で免疫することによっ て生成され、ここで該BDNFタンパク質、そのペ プチドフラグメントまたは誘導体はBDNFタンパ ク質、フラグメントまたは誘導体をコードする 組み換え核酸ベクターを発現する組み換え微生 物を増殖させることによって産生されるもので ある、請求項49に記載の抗体、抗体フラグメン トまたは誘導体。
  51. 【請求項５１】 核酸ベクターが実質的に第１図に示さ
    れるヌ クレオチドおよそ167からおよそ927までの核 酸配列またはそのサブ配列を含有する請求項49 に記載の抗体、抗体フラグメントまたは誘導体。
  52. 【請求項５２】 宿主動物を請求項23に記載の精製BDNF
    タンパ ク質、またはそのペプチドフラグメントまたは 誘導体で免疫することからなる方法によって生 成される請求項49に記載の抗体、抗体フラグメ ントまたは誘導体。
  53. 【請求項５３】 実質的に第１図に示されるアミノ酸配
    列の残 基153〜185を含有するB5ペプチドフラグメン トを認識する請求項49に記載の抗体、抗体フラ グメントまたは誘導体。
  54. 【請求項５４】 (a)BDNF/NGF遺伝子ファミリーの２つ
    の異なる 既知のメンバーと相同である第１のアミノ酸配 列、および(b)BDNFともNGFとも相同でない第２ のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはペ プチドをコードする組み換えDNA分子。
  55. 【請求項５５】 既知メンバーの一つがBDNFである請求
    項54に 記載の組み換えDNA分子。
  56. 【請求項５６】 既知メンバーの一つがNGFである請求
    項54に 記載の組み換えDNA分子。
  57. 【請求項５７】 (a) 多様な核酸配列の中からBDNFお
    よびNGF の両方に相同である配列を選択し、そして (b) (a)で選択された核酸配列の中からBDNFお よびNGFに相同でない少なくとも約６個の 連続するヌクレオチドの配列を含有する配 列を同定する、 ことからなる方法によって単離される請求項54 に記載の組み換えDNA分子。
  58. 【請求項５８】 工程(a)の方法が、センス鎖プライマ
    ーがBDNF およびNGFの第１の相同DNA配列にハイブリッ ド形成することができ、そしてアンチセンス鎖 オリゴヌクレオチドプライマーがBDNFおよび NGFの第２の相同DNA配列にハイブリッド形成 することができるように、BDNFおよびNGF DNA の両方の相同領域にハイブリッド形成すること ができる一対のオリゴヌクレオチドプライマー が使用されるポリメラーゼ連鎖反応技術を使用 することからなる、請求項57に記載の組み換え DNA分子。
  59. 【請求項５９】 センス鎖オリゴヌクレオチドプライマ
    ーが実 質的に第１図に示される残基約587から約616 まで、残基約713から約739まで、残基約764 から約781まで、残基約863から約898までお よびそのサブ配列からなる群から選択される核 酸配列を含有し、そしてアンチセンス鎖オリゴ ヌクレオチドプライマーが、実質的に第１図に 示される(a)残基約587〜残基約616、残基約713 〜残基約739、残基約764〜残基約781、残基約 863〜残基約898およびそのサブ配列からなる 群から選択され、そして(b)上記センス鎖プライ マーと異なるものである核酸配列を含有する、 請求項58に記載の組み換えDNA分子。
  60. 【請求項６０】 第１図に示される残基約587から残基
    約616 までのBDNFヌクレオチド配列または他の種から のBDNF遺伝子における相当するヌクレオチド配 列と相同である請求項54に記載の組み換えDNA 分子。
  61. 【請求項６１】 第１図に示される残基約713から残基
    約739 までのBDNF核酸配列または他の種からのBDNF遺 伝子における相当するヌクレオチド配列と相同 である請求項54に記載の組み換えDNA分子。
  62. 【請求項６２】 第１図に示される残基約764から残基
    約781 までのBDNF核酸配列または他の種からのBDNF遺 伝子における相当するヌクレオチド配列と相同 である請求項54に記載の組み換えDNA分子。
  63. 【請求項６３】 第１図に示される残基約863から残基
    約898 までのBDNF核酸配列または他の種からのBDNF遺 伝子における相当するヌクレオチド配列と相同 である請求項54に記載の組み換えDNA分子。
  64. 【請求項６４】 製剤上好適な担体中における有効量の
    実質的 に純粋なBDNFタンパク質を含有する医薬組成物。
  65. 【請求項６５】 製剤上好適な担体中における有効量の
    実質的 に純粋な、機能的に活性なBDNFペプチドフラグ メントまたは誘導体を含有する医薬組成物。
  66. 【請求項６６】 製剤上好適な担体中における、抗原決
    定基を 担持する有効量の実質的に純粋なBDNFペプチド フラグメントまたは誘導体を含有する医薬組成 物。
  67. 【請求項６７】 BDNFペプチドフラグメントまたは誘導
    体が実 質的に第１図に示されるアミノ酸配列の少なく とも一部分を含有する請求項65または66に記載 の医薬組成物。
  68. 【請求項６８】 BDNFタンパク質が実質的に第１図に示
    される アミノ酸配列を含有する請求項64に記載の医薬 組成物。
  69. 【請求項６９】 BDNFタンパク質が実質的に第１図に示
    される アミノ酸約134から約252のまでアミノ酸配列 を含有する請求項64に記載の医薬組成物。
  70. 【請求項７０】 製剤上好適な担体中における有効量の
    請求項 36、39または40に記載の生成物を含有する医薬 組成物。
  71. 【請求項７１】 製剤上好適な担体中における有効量の
    請求項 43または44または46に記載の生成物を含有する 医薬組成物。
  72. 【請求項７２】 製剤上好適な担体中における有効量の
    請求項 45に記載の生成物を含有する医薬組成物。
  73. 【請求項７３】 製剤上好適な担体中における有効量の
    請求項 46に記載の生成物を含有する医薬組成物。
  74. 【請求項７４】 製剤上好適な担体中における有効量の
    請求項 47に記載の生成物を含有する医薬組成物。
  75. 【請求項７５】 製剤上好適な担体中における有効量の
    請求項 48に記載の生成物を含有する医薬組成物。
  76. 【請求項７６】 ニューロン生存を高めることができる
    請求項 68または69に記載の医薬組成物。
  77. 【請求項７７】 ニューロン成長を高めることができる
    請求項 68または69に記載の医薬組成物。
  78. 【請求項７８】 分化した細胞機能を支持できる請求項
    68また は69に記載の医薬組成物。
  79. 【請求項７９】 タンパク質、ペプチドまたは誘導体が
    グリコ シル化されている請求項68または69に記載の医 薬組成物。
  80. 【請求項８０】 タンパク質、ペプチドまたは誘導体が
    グリコ シル化されていない請求項68または69に記載の 医薬組成物。
  81. 【請求項８１】 BDNFタンパク質またはそのペプチドフ
    ラグメ ントまたは誘導体を認識する有効量の抗体を含 有する医薬組成物。
  82. 【請求項８２】 実質的に純粋なBDNFタンパク質または
    そのペ プチドフラグメントあるいは誘導体と第２の薬 剤との組合せ物の有効量を含有する医薬組成物。
  83. 【請求項８３】 前記組合せ物がBDNFの機能的活性の相
    乗作用 を示すものである請求項82に記載の医薬組成物。
  84. 【請求項８４】 第２の薬剤が神経成長因子である請求
    項82に 記載の医薬組成物。
  85. 【請求項８５】 第２の薬剤がBDNF/NGFファミリーの他
    のメン バーである請求項82に記載の医薬組成物。
  86. 【請求項８６】 請求項54、55、56、57、58または
    59に記載の 組み換えDNA分子によってコードされるタンパ ク質またはそのペプチドまたは誘導体の有効量 を含有する医薬組成物。
  87. 【請求項８７】 (a) 組織を、ハイブリッド形成を生
    じさせる 条件下に実質的に第５図に示される少なく とも10ヌクレオチドを含有する検出可能に 標識された核酸分子と接触させ、そして (b) 生じたハイブリッド形成を検出する、 ことからなる神経系疾病または障害を診断する 方法。
  88. 【請求項８８】 (a) 組織から回収されたRNAを、ハイ
    ブリッ ド形成を生じさせる条件下に実質的に第１ 図に示される少なくとも10ヌクレオチドを 含有する検出可能に標識された核酸分子と 接触させ、そして (b) 生じたハイブリッド形成を検出する、 ことからなる神経系の疾病または障害を診断す る方法。
  89. 【請求項８９】 (a) 組織から回収されたRANから生成
    された cDNAを、ハイブリッド形成を生じさせる条 件下に実質的に第１図に示される少なくと も10ヌクレオチドを含有する検出可能に標 識された核酸分子と接触させ、そして (b) 生じたハイブリッド形成を検出する、 ことからなる神経系の疾病または障害を診断す る方法。
  90. 【請求項９０】 神経系の疾患または障害が腫瘍、変性
    性疾患、 網膜疾患および感覚性ニューロン疾患からなる 群から選ばれる請求項87、88または89のいずれ かに記載の方法。
  91. 【請求項９１】 腫瘍が神経芽細胞腫である請求項90に
    記載の 方法。
  92. 【請求項９２】 (a) 組織を、結合を生じさせる条件
    下にBDNF タンパク質またはそのペプチドフラグメン トまたは誘導体に結合できる検出可能に標 識された抗体分子に曝露し、そして (b) 生じた結合を検出する、 ことからなる神経系の疾患または障害を診断す る方法。
  93. 【請求項９３】 インビボで行われる請求項92に記載の
    方法。
  94. 【請求項９４】 インビトロで行われる請求項92に記載
    の方法。
  95. 【請求項９５】 神経系の疾患または障害が腫瘍、変性
    性疾患、 網膜疾患および感覚性ニューロン疾患からなる 群から選ばれる請求項92に記載の方法。
  96. 【請求項９６】 腫瘍が神経芽細胞腫である請求項95に
    記載の 方法。
  97. 【請求項９７】 有効量のBDNFタンパク質またはその機
    能的に 活性なペプチドフラグメントまた誘導体を患 者に投与することからなる神経系の疾患または 障害を治療する方法。
  98. 【請求項９８】 神経系の疾患または障害が変性性疾患
    である 請求項97に記載の方法。
  99. 【請求項９９】 変性性疾患が網膜疾患である請求項98
    に記載 の方法。
  100. 【請求項１００】 神経系の疾患または障害が神経系へ
    の損傷で ある請求項97に記載の方法。
  101. 【請求項１０１】 損傷が外傷、手術、梗塞、感染およ
    び悪性腫 瘍からなる群から選ばれる事象によって引き起 こされたものである請求項100に記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 疾患または障害が有毒剤への曝露に
    よって引 き起こされたものである請求項97に記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 疾患または障害が栄養不全によって
    引き起こさ れたものである請求項97に記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 障害が網膜の先天的障害からなる請
    求項94に 記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 BDNFタンパク質またはその機能的に
    活性なペ プチドフラグメントまたは誘導体と第２の薬剤 との組合せ物の有効量を投与することからなる、 神経系の疾患または障害を治療する方法。
  106. 【請求項１０６】 前記組合せ物が患者に対しBDNFの機
    能的活性 における相乗作用を示すものである請求項105 に記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 第２の薬剤が神経成長因子である請
    求項105 に記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 第２の薬剤がBDNF/NGFファミリーの
    他のメン バーである請求項105に記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 神経系の疾患または障害が変性性疾
    患である 請求項107に記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 変性性疾患がアルツハイマー病、ハ
    ンチント ン舞踏病、パーキンソン病および網膜疾患であ る請求項109に記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 疾患または障害が神経系の損傷であ
    る請求項 105に記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 損傷が外傷、手術、梗塞、感染、悪
    性腫瘍お よび有毒薬剤からなる群から選ばれる事象によ って引き起こされたものである請求項105に記 載の方法。
  113. 【請求項１１３】 疾患または障害が感覚性ニューロン
    の疾患ま たは障害からなる請求項105に記載の方法。
  114. 【請求項１１４】 疾患または障害が網膜の先天的障害
    からなる 請求項105に記載の方法。
  115. 【請求項１１５】 (a) 多様な核酸配列の中からBDNF
    およびNGF の両方に相同である配列を選択し、 (b) (a)で選択された核酸配列の中からBDNFお よびNGFに相同でない少なくとも約６個の 連続するヌクレオチドの配列を含有する配 列を同定し、そして (c) (b)で同定された配列を単離する、 ことからなる、脳由来神経栄養因子／神経成長 因子遺伝子ファミリーのメンバーであるが神経 成長因子も脳由来神経栄養因子もコードしない 遺伝子を単離する方法。
  116. 【請求項１１６】 工程(a)の方法が、センス鎖プライ
    マーがBDNF およびNGFの第１の相同DNA配列にハイブリッ ド形成することができ、そしてアンチセンス鎖 オリゴヌクレオチドプイラマーがBDNFおよびNG Fの第２の相同DNA配列にハイブリッド形成す ることがきるように、BDNFおよびNGF DNAの 両方の相同領域にハイブリッド形成することが できる一対のオリゴヌクレオチドプライマーを 使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を用いるこ とからなる請求項115に記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 センス鎖オリゴヌクレオチドプライ
    マーが実 質的に第１図に示される残基約587から約616 まで、残基約713から約739まで、残基約764 から約781まで、残基約863から約898までお よびそのサブ配列からなる群から選択される核酸 配列を含有し、そしてアンチセンス鎖オリゴヌ クレオチドプライマーが、実質的に第１図に 示される(a)残基約587から約616まで、残基約 713から約739まで、残基約764から約781ま で、残基約863から約898までおよびそのサブ 配列からなる群から選択され、そして(b)上記セ ンス鎖プライマーと異なる、核酸配列を含有す るものである請求項116に記載の方法。
  118. 【請求項１１８】 (a) 多様な核酸配列の中からBDNF
    またはNGF のいずれかと、および実質的に第14図に示 されるM3/4と表示されるアミノ酸配列をコ ードする遺伝子と相同である配列を選択し、 (b) (a)で選択された核酸配列の中からBDNFお よびNGFに相同でない少なくとも約６個の 連続するヌクレオチドの配列を含有する配 列を同定し、そして (c) (b)で同定された配列を単離する、 ことからなる脳由来神経栄養因子／神経成長因 子遺伝子ファミリーのメンバーであるが神経成 長因子も脳由来神経栄養因子もコードしない遺 伝子を単離する方法。
  119. 【請求項１１９】 工程(a)の方法が、センス鎖オリゴ
    ヌクレオチ ドプライマーがBDNFまたはNGF、またはM3/4と 表示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の 第１の相同DNA配列にハイブリッド形成するこ とができ、そしてアンチセンス鎖オリゴヌクレ オチドプライマーがBDNFまたはNGFおよびM3/4 をコードする遺伝子の第２の相同DNA配列にハ イブリッド形成することができるように、BDNF またはNGFのいずれかおよびM3/4と表示される 実質的に第14図に示されるアミノ酸配列をコー ドする遺伝子の相同出領域にハイブリッド形成す ることができる一対のオリゴヌクレオチドプラ イマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応技術を 用いることからなる請求項118に記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 神経系細胞をカイニン酸または関連
    化合物に 暴露することからなる、神経系細胞内において 発現されるBDNFのレベルを高める方法。
  121. 【請求項１２１】 神経系細胞を非−NMDAレセプターア
    ゴニスト に暴露することからなる、神経系細胞において 発現されるBDNFのレベルを高める方法。
  122. 【請求項１２２】 神経系細胞をカイニン酸または関連
    化合物に 暴露することからなる、神経系細胞において発 現されるNGFのレベルを高める方法。
  123. 【請求項１２３】 神経系細胞を非−NMDAレセプターア
    ゴニスト に暴露することからなる、神経系細胞において 発現されるNGFのレベルを高める方法。
  124. 【請求項１２４】 ニューロンを有効レベルのBDNFに暴
    露するこ とからなる、ドーパミン作動性ニューロンの生 存を増進する方法。
  125. 【請求項１２５】 ニューロンを有効レベルのBDNFに暴
    露するこ とからなる、コリン作動性ニューロンの生存を 増進する方法。
  126. 【請求項１２６】 コリン作動性ニューロンが基底前脳
    コリン作 動性ニューロンである、請求項125に記載の方 法。
  127. 【請求項１２７】 コリン作動性ニューロンが中隔コリ
    ン作動性 ニューロンである、請求項125に記載の方法。
  128. 【請求項１２８】 大グリア細胞を有効量のBDNFに暴露
    すること からなる、大グリア細胞の増殖を抑制する方法。
  129. 【請求項１２９】 ニューロンを有効量のBDNFに暴露す
    ることか らなる、ニューロンへのガンマアミノ酪酸の取 り込みを阻止する方法。
  130. 【請求項１３０】 細胞を有効量のBDNFに暴露すること
    からなる、 細胞表面上でのNGFレセプターの発現をアップ レギュレートする方法。
  131. 【請求項１３１】 前駆体分子を有効量のエンドプロテ
    ィナーゼ Arg-Cに暴露することからなる、より活性のな い前駆体分子から活性なBDNFを調製する方法。
  132. 【請求項１３２】 有効量のエンドプロティナーゼArg-
    Cがマイ クロリッター当たり0.1単位の濃度のエンドプ ロティナーゼArg-Cである、請求項131に記載 の方法。
  133. 【請求項１３３】 請求項131に記載の方法により生成
    されたBD NFの活性形。
  134. 【請求項１３４】 請求項132に記載の方法により生成
    されたBD NFの活性形。
  135. 【請求項１３５】 変性性疾患がパーキンソン病であ
    る、請求項 98に記載の方法。
  136. 【請求項１３６】 変性性疾患がアルツハイマー病であ
    る、請求 項98に記載の方法。
  137. 【請求項１３７】 障害が有毒薬剤に起因する損傷であ
    る、請求 項105に記載の方法。
  138. 【請求項１３８】 変性性疾患が「パーキンソン−プラ
    ス」症候 群である、請求項98に記載の方法。
  139. 【請求項１３９】 「パーキンソン−プラス」症候群が
    進行 性Spranuclear麻痺(Steele-Richardson-Ol szews ki症候群）、オリーブ橋小脳皮質麻痺、シャイ ードレーガー症候群(Multiple Systems Atrophy)、 およびグアムのパーキンソン症候群痴呆複合体 からなる群から選ばれたものである、請求項138 に記載の方法。
  140. 【請求項１４０】 パーキンソン病の症候が有毒薬剤に
    起因する ものである、請求項135に記載の方法。
  141. 【請求項１４１】 網膜疾患が視神経への損傷に起因す
    るもので ある、請求項99に記載の方法。
  142. 【請求項１４２】 神経系細胞をカルバコールに暴露す
    ることか らなる、神経系細胞において発現されるBDNFの レベルを高める方法。
  143. 【請求項１４３】 神経系細胞をヒスタミンに暴露する
    ことから なる、神経系細胞において発現されるBDNFのレ ベルを高める方法。
  144. 【請求項１４４】 神経系細胞をブラジカイニンに暴露
    すること からなる、神経系細胞において発現されるBDNF のレベルを高める方法。
  145. 【請求項１４５】 神経系細胞をカルバコールに暴露す
    ることか らなる、神経系細胞において発現されるNGFの レベルを高める方法。
  146. 【請求項１４６】 神経系細胞をヒスタミンに暴露する
    ことから なる、神経系細胞において発現されるNGFのレ ベルを高める方法。
  147. 【請求項１４７】 神経系細胞をプラジカイニンに暴露
    すること からなる、神経系細胞において発現されるNGF のレベルを高める方法。
  148. 【請求項１４８】 変性性疾患がハンチントン舞踏病で
    ある、請 求項98に記載の方法。
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