FI105343B - Neurotrofiini-3 (NT-3) -proteiinia koodaava nukleiinihapposekvenssi ja sen käyttö - Google Patents

Description

9 , 105343

Neurotrofiini-3 (NT-3) -proteiinia koodaava nukleiinihappo-sekvenssi ja sen käyttö 1. iTnhriantn 5 Tämä keksintö koskee neurotrofiini-3:a (NT-3), joka on äskettäin keksitty neurotrofinen tekijä, joka on BDNF/NGF-geeniperheen jäsen. Geeni, joka koodaa NT-3:a, on kloonattu ja sekvenssoitu ja rekombinantti NT-3 on ilmentynyt nisä-10 kässoluissa. Rekombinantti NT-3:11a on osoitettu olevan biologisen aktiivisuuden spektri, joka eroaa BDNF:n ja NGF:n biologisesta aktiivisuuden spektristä. Tästä keksinnöstä saadaan NT-3:a koodaavat nukleiinihapposekvenssit, pääpiirteittäin puhdasta NT-3-proteiinia, peptidifragmentit 15 tai johdannaiset, joita siitä tuotetaan suuria määriä ja vasta-aineita, jotka ovat NT-3-proteiinia tai peptidejä vastaan. Keksinnön NT-3-geenituotteita voidaan käyttää suuren määrän neurologisten sairauksien diagnoosissa ja terapiassa, erityisesti perifeeriset hermosairaudet, Alzheime-20 rin tauti ja Parkinsonin tauti mukaanluettuina.

2__Keksinnön taustaa 2.1. Neurotrofisten tekijöiden osuus hermostossa :· 25 Hermoston kehittyminen ja ylläpitäminen riippuu proteii neista, jotka tunnetaan neurotrofisinä tekijöinä. Laajalle levinnyt hermosolukuolema seuraa normaalia keskus- ja ääreishermoston kehittymistä ja ilmeisesti sillä on ratkaiseva osa lukuisten neuronien, jotka projisoivat annettuun 30 kohdekenttään, säätelyssä (Berg, D. K., 1982, Neuronal _ '· Development 297-331; Cowan et ai., 1984, 225:1258-65). Ää- v t reiskohdekudosten ablaatio- ja kudossiirrostutkimukset kehityksen aikana ovat osoittaneet, että hermosolukuolema johtuu neuronien kilpailusta rajoitetuista määristä eloon- 105343

jäämistekijöitä ("neurotrofiset tekijät"), joita tuotetaan niiden projisointikentillä. Nämä havainnot johtivat hermoston kasvutekijän (NGF) tunnistamiseen, joka jää tähän mennessä parhaiten tunnistetuksi neutrofiseksi molekyyliksi J

5 (Levi-Montalcini ja Angletti, P. U., 1968, Physiol. Rev.

48:534-69; Thoenen, H. ja Barde, Y.-A., 1980, Rev. 60:1284-335). NGF:n osuuden ja mekanismin ymmärtämistä on suuresti auttanut tämän proteiinin runsaan lähteen arvokas havainto uroshiiren submaksillaarisissa rauhasissa, mikä salli NGF:n 10 puhdistamisen ja kloonauksen (Ullrich et ai., 1983, Nature 303:821-5; Scott et ai., 1983, Nature 302:538-40), samoin kuin neutraloivien vasta-aineiden tuottamisen. Koska NGF tukee vain rajoitettua hermosoluun liittyvää populaatiosar-jaa, muiden neurotrofisten tekijöiden olemassaoloa on kauan 15 oiettu (Varon, S. ja Adler, R. 1981, Adv. Cellular Neuro-biol. 2:115-63; Barde et ai., 1987, Prog Brain Res 71:185-9; Snider, W.D. ja Johnson, E.M., 1989, Ann. Neurol. 26: 489-506). Koska nyt on selvää, että sellaisia tekijöitä on olemassa, on niiden äärettömän alhainen runsaus ollut es-20 teenä niiden molekyyliselle luonnehtimiselle. Siitä huolimatta kahden sellaisen proteiinin pienten määrien puhdistaminen, nimittäin aivoista johdettu neurotrofinen tekijä (BDNF) ja silmän neurotrofinen tekijä (CNTF), ovat äskettäin sallineet osittaisen nukleiinihapposekvenssoinnin 25 (Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149-52; Stockli et ai-, 1989, Nature 342:21-28 ja Lin et ai., 1989, Science 246: 1023-25). Huolimatta erityisyyksistä erilaisille hermostollisille populaatioille, on BDNF:llä ja NGF:llä (mutta ei CNTF:llä) riittävää rakenteellista homologiaa, jotta ne 30 voidaan katsoa geeniperheen jäseniksi (Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149-52).

2.2. Muita neurotrofisia tekijöitä 35 Viime vuosikymmenenä on ollut lukuisia raportteja neurotro-fisesta aktiivisuudesta hyvin erilaisten kudosten uutteissa ja monien eri solutyyppien "konditoidussa" kasvualustassa 3 105343 (conditioned culture medium: vanhaa elatusainetta lisätty 0,5:0,5). Melkein kaikissa tapauksissa on kuitenkin esteenä ollut näiden aktiviteettien puhdistamisen ja luonnehtimisen » edistymisessä tosiasia, että sellaisia aktiviteettejä on 5 äärettömän pieninä määrinä pikogramma-nanogramma/gramma kudosta rajoissa.

Lisäksi kun taas sopivia biomäärityksiä on saatu ääreisneu-roneille, niin luotettavien, toistettavien ja spesifisten 10 määritysten suunnittelu keskushermoston neuroneille on osottautunut ongelmalliseksi. Kun yksittäisiä ääreisneu-ronityyppejä on löydetty erillisinä, helposti leikeltävänä gangliana, niin keskushermoston (CNS) neuronit ovat muuttu-mattomasti erittäin heterogeenisiä jakaumassaan. Täten 15 spesifisiä markkereita vaaditaan joko erityisen VNS-luokan neuronien luokkien tunnistamiseen tai rikastamiseen. Edistys sellaisten markkereiden tuotossa, esimerkiksi vasta-aineet, jotka on kohdistettu solupintaa kohti tai solun tukiverkostollisia komponentteja kohti, tai spesifisten 20 histologisten väriaineiden tuotossa, on ollut hyvin rajoitettua. Sen mukaisesti neurotrofisten tekijöiden luonnehtiminen, jotka ovat (i) ei yhtä runsaita kuin NGF, (ii) vaikeat määrittää ja (iii) ei saatavilla riittävinä määrinä vasta-ainetuoton esille saamiseksi, on osottautunut olevan 25 erittäin vaikea prosessi.

2.2.1. Aivoista johdetun kasvutekijän ja hermoston kasvutekijän vertailu , 30 Neurotrofinen aktiivisuus, joka kykenee ylläpitämään kanan pojan alkion selkäytimen takajuuren ganglioneuroneja in - : vitro tunnistettiin "konditioidussa alustassa", jossa oli kasvatettu rotan C-6 hermon tukisolukasvainsoluja (Barde et ai., 1978, Nature 274:818). Aktiivisuus ei neutraloitunut 35 hiiren NGF:ää vastaan olevilla vasta-aineilla, antaen olettaa, että läsnä on toinen neurotrofinen tekijä "konditioidussa" alustassa. Samanlaisia aktiivisuuksia, joita NGF- 4 105343 vasta-aineet eivät kyenneet sulkemaan, on myöhemmin raportoitu normaalin aikuisrotan aivojen tähtitukikudossoluvil-jelmissä (Lindsay, 1979, Nature 282:80-82; Lindsay et ai., 1982, Brain res. 243:329-343) ja kehittyvän ja aikuisen * 5 rotan aivojen uutteissa (Barde et ai., 1980, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 77:1199-1203) ja kehittyvän ja valmiin kananpojan selkäytimen uutteissa (lindsay ja Petrs, 1984,

Neurosci. 12:45-51). Kuitenkaan missään tapauksessa aktiivista (aktiivisia) tekijää (tekijöitä) ei eristetty tai 10 tunnistettu ja jää kyseenalaiseksi, johtuivatko havaitut aktiviteetit samasta (samoista) tai erilaisesta (erilaisista) tekijästä (tekijöistä).

Käyttämällä sian aivoja lähtömateriaalina raportoivat Barde 15 et ai. (1982, EMBO J. 1:549-553) tekijästä, nyt nimitetty aivoista johdetuksi neurotrofiseksi tekijäksi (BDNF), joka näytti edistävän E10/E11 kananpojan alkioiden selkäytimen takajuuren ganglioneuronien selviytymistä. Neurotrofisen aktiivisuuden havaittiin olevan erittäin emäksisessä prote-20 iinissa (isoelektrinen piste, pl > 10,1), joka kulki natri-umdodekyylisulfaatti (SDS) geelielektroforeesissa yksittäisenä 12,3 kD:n molekyylipainon vyöhykkeenä. Puhdistusteki-jän arvioitiin olevan 1,4 x 10‘, mutta saanto oli hyvin alhainen, vain noin lug BDNF:ää 1,5 kg:sta sian aivoja. Li-25 säksi, koska puhdistusprosessin viimeinen vaihe oli prepa-ratiivinen geelielektroforeesi, ei BDNF:n aktiivisuutta voitu täydellisesti renaturoida sekundääriseksi johtuen jäännös-SDS:stä (Barde ja Thoenen, 1985, teoksessa "Hormones and Cell Regulation", voi. 9, Dumont et ai., toim. El-30 sevier Science Publishers, ss. 385-390). Havaittiin, että BDNF:n erittäin emäksinen luonne ja molekyylikoko olivat hyvin samanlaisia kuin NGF-monomeeri. BDNF:llä näyttää kuitenkin olevan ominaisuuksia, jotka eroavat NGF:n ominaisuuksista siinä, että (a) kananpojan selkäytimen takajuuren 35 ganglion biomäärityksessä NGF:ää vastaan olevilla vasta- aineilla ei ollut selvää vaikutusta BDNF:n biologiseen aktiivisuuteen; (b) samassa määrityksessä BDNF:n ja NGF:n 105343 vaikutukset näyttivät olevan additiivisia; ja (c) toisin kuin NGF, BDNF:llä ei havaittu olevan vaikutusta E12 kananpojan sympaattisiin neuroneihin. Lisäksi havaittiin aikais-• ten aivouutetutkimusten yhteydessä, että neurotrofinen ak- 5 tiivisuus näissä lähteissä näytti vaikuttavan sensorineuro-neihin myöhemmissä kehitysvaiheissa kuin NGF:n yhteydessä. Käyttämällä kananpojan alkion neuronien jaettuja viljelmiä, jotka oli kasvatettu polykationisella substraatilla, kuten polylysiini tai polyornitiini, BDNF:n havaittiin tukevan e-10 nemmän kuin 30 %:n E10-ll:n selkäytimen takajuuren ganglio-neuronien selviytymistä (alkiopäivä 10 tai 11), mutta olevan vähän vaikutusta samojen neuronien selviämiseen E6:ssa (Barde et ai., 1980, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 77:1199-1203 supra). Samanlaisissa olosuhteissa NGF tuki 30-40 % E6 DRG-15 neuronien selviytymistä. Kiinnostavaa kylläkin, sillä myöhemmin havaittiin, että kun kasvatettiin substraatilla, joka oli peitetty ekstrasellulaarisella matriksiglykoprote-iinilaminiinilla, sekä NGF että BDNF tukivat noin 50 % DRG-neuroneita iältään E6-E12 kananpoikien alkioista (Lindsay 20 et ai., 1985, Develop. Biol. 112:319-328). Jälkimmäisessä tutkimuksessa havaittiin NGF:n ja BDNF:n vaikutusten olevan addittiivisia, kun molempia oli kyllästävät konsentraatiot.

Levi-Montalcinin aikaisemmat tutkimukset (1966, The Harvey 25 Lectures 60:217-259) NGF:n neuronaalispesifisyydestä antoivat olettaa, että NGF ei ollut kaikkialla läsnäoleva neuro-trofinen tekijä edes sensorineuroneille, sillä NGF:llä ei näyttänyt olevan vaikutusta kananpojan tiettyjen aivotunto-hermosolujen neuroneihin, etenkin kymmenennen aivohermon ¢. 30 kyhmyiseen hermosoluun. Myöhemmät in vivo tutkimukset (Johnson et ai., 1980, Science 210:916-918; Pearson et ai., , 1983 Develop. Biol. 96:32-36) osoittivat, että NGF:n mene tyksellä sikiönkehityksen aikana ei ollut vaikutusta neuronien selviämiseen useimmissa rotan aivotuntohermoissa, kun 35 taas samanlainen käsittely suuresti kulutti neuronaalilukua tuntohermossa, joka oli johdettu hermostopienasta. Yksityiskohtaisemmat in vitro tutkimukset (Lindsay ja Rohrer, 105343 1985, Develop. Biol. 112:30-48; Davies ja Lindsay, 1985,

Develop. Biol. 111:62-72; Lindsay et al., 1985, J. Cell.

Sci. Suppl. 3:115-129) osoittivat selvästi, että NGF tukee useampien hermostopienasta johdettujen tuntoneuronien sel- 5 viämistä, mutta ei ole mitään selvää vaikutusta aivotunto-hermojen, jotka on johdettu paksuntumasta, josta hermo kehittyy, selviämiseen.

Ensimmäinen osoitus BDNF:n neuronaalisesta spesifisyydestä, 10 joka on selvästi erilainen kuin NGF:n, oli in vitro osoitus, että puhdistettu BDNF tukee 40-50 % tuntohermojen, jotka ovat erossa kananpojan alkion E6, E9 tai E12 kyhmyi-sestä hermosta, joka on johdettu paksuntumasta, josta hermo kehittyy, selviämistä (Lindsay et ai., 1985, J. Cell. Sci.

15 Supp. 3:115-129). NGF:llä ei ollut selvää vaikutusta näihin neuroneihin yksinään tai yhdessä BDNF:n kanssa. Myöhemmin osoitettiin soluviljelmätutkimuksissa, että BDNF näytti tukevan muista paksuntumista, joista hermo kehittyy, johdettujen tuntohermojen selviämistä ja hermon viejähaarakkeen 20 kasvainta, kallioluun, polvekkeisen ja vatsanpuolella sivulla oleva kolmoishermo mukaanluettuina (Davies et ai., 1986, J. Neurosci. 6:1897-1904), joista minkään ei ole havaittu olevan sensitiivinen NGF:lle. Kaikissa edellä olleissa tutkimuksissa NGF:ää vastaan olevilla neutraloi- 25 villa vasta-aineilla ei ollut vaikutusta BDNF:n havaittua aktiivisuutta vastaan. Sen lisäksi, että BDNF:llä oli vaikutusta viljeltyihin neuroneihin ääreishermostosta, sen havaittiin stimuloivan solujen, jotka olivat kasvatettu viiriäisen hermostopienasta, selviämistä ja hermostollista 30 erilaistumista (Kalcheim ja Gendreau, 1988, Develop. Brain ?

Res. 41:79-86).

Ennen tätä keksintöä kyvyttömyys tuottaa riittäviä määriä BDNF:ää immunisaatiota varten esti anti-BDNF-vasta-aineiden 35 tuottamisen vertailuksi anti-NGF-vasta-aineille niiden vaikutuksista hermostopopulaatioihin ja esti BDNF/NGF- ristiin neutraloimiskokeet. Kaksi äskettäistä tutkimusta BDNF:llä 7 105343 (Kalcheim et ai., 1987, EMBO J, 6:2871-2873; Hofer ja Bar-de, 1988, Nature 331:261-262) ovat kuitenkin osoittaneet, että BDNF:llä on fysiologinen osuus lintujen PNS-kehityk-T sessä. Jos laitettiin mekaaninen este in ovo E3/E4 DRG:n 5 (alkionkehityspäivä 3 tai 4 selkäydinhermon takajuuren * hermo) ja niiden CNS-kohteen välille hermoputkessa, niin monien DRG-neuronien havaittiin kuolevan (Kalcheim ja Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116:451-466). Oletettiin, että tämä hermostokuolema saattoi johtua CNS:stä (alkion 10 hermostoputki) johdetun neurotrofisen tekijän puutteesta. Myöhemmin havaittiin, että BDNF, joka oli kiinnittynyt laminiinilla peitettyyn sialastiseen membraaniin, pystyi estämään tämän solukuoleman (Kalcheim et ai., 1987, EMBO J. 6:2871-2873). BDNF-injektioiden kehittyviin viiriäisen 15 muniin on havaittu vähentävän luonnollisesti tapahtuvaa solukuolemaa kyhmyisessä hermossa, vaikutus, jota ei nähdä NGF:llä (Hofer ja Barde, 1988, Nature 331:261-262). Sen lisäksi, että BDNF:llä on vaikutusta sekä hermostopienan että paksuntuman alkukohdan, josta hermo kehittyy, ääreis-20 tuntohermoihin, havaittiin BDNF:n tukevan kehittyvien CNS-hermojen selviytymistä. Johnson et ai. (1986, J. Neurosci. 6:3031-3938) esittivät tietoja, että BDNF tukee verkkokalvon hermosolujen, jotka on kasvatettu E17 rotan alkioista, selviämistä. Tämä laajensi aikaisempia tutkimuksia, jotka 25 osoittivat, että "konditioidut" alustat ja aivouutteet, jotka oli valmistettu verkkokalvon hermosolujen kohdealu eista, näyttivät tukevan näiden hermojen selviämistä (Mc-Caffery et ai., 1982, Ex. Brain Res. 48:37-386; Sarthy et ai., 1983, J. Neurosci. 3:2532-2544; Turner et ai., 1983, ^ 30 Dev. Brain Res. 6:77-83).

ς ’ Sen lisäksi, että BDNF:llä on vaikutusta kehittyvien hermo jen selviämiseen viljelmässä, on sillä osoitettu olevan myös vaikutusta viljeltyihin aikuisen ääreis- ja keskussys-35 teemin neuroneihin. BDNF:n samoin kuin NGF:n on osoitettu stimuloivan keskusviivaregeneraatiota aikuisen rotan DRG-neuroneissa viljelmässä (Lindsay, 1988, J. Neurosci. 8:23- 8 105343 94-2405), vaikkei aikuisen sensorineuronit näyttäneet vaativan neurotrofisiä tekijöitä ylläpitämiseen in vitro yli 3 tai 4 viikkoa. Lisäksi aikuisen rotan verkkokalvon viljelmissä havaittiin BDNF:n edistävän sekä selviämistä että ' 5 keskusviivan pidentymistä verkkokalvon hermosoluista (Tha-nos et al.f 1989, Eur. J. Neurosci. 1:19-26). NOF:n ja BDNF:n biologisten vaikutusten vertailu on esitetty taulukossa 1.

10 Taulukko 1 BDNF:n ja NGF:n biologisten aktiviteettien vertailu*

Selviäminen**

15 Ääreishermosto BDNF NGF

(i) E6 kananpoika DRG - ++ E10 kananpoika DRG + ++ E12 kananpoika Symp - ++ 20 {Barde et ai., 1980, supra) (ii) E6 - E12 kananpoika DRG ++ ++ E6 - E12 kananpoika kyhmyinen ++ E12 - kananpoika sympaattinen - ++ 25 E12 - kananpoika kiliaari (Lindsay et ai., 1985, supra) (iii) E3 - E14 kananpoika: kaulaan liittyvä +/++ ++ 30 DM-kolmoishermoon liitt. +/++ ++ ohimoluun kallioluuhun liittyvä +/++ polvekkeinen +/++ VL-kolmoishermoon liitt. ++ 35 vestibulääri keskiaivoon liittyvä ++ (Davies et ai., 1986, supra) (Barde et ai., 1987, Prog. Brain Res., 71:185-189) 40

Keskushermosto (i) E17 rotan verkkokalvon hermosolut ++ (Johnson et ai., 1986, J. Neurosci 63031-3038) 45__ * kronologisessa järjestyksessä julkaisupäivämäärän mukaisesti; vaikutukset testattu in vitro 50 ** ei selviämistä: (-); kohtalainen selviäminen (+); hyvä selviäminen (++) 9 105343 2.2.2. Aivoista johdetun neurotrofisen tekijän neuronaalit kohteet » 5 Ääreishermon hermosolun tuntohermosolujen on havaittu syntyvän joko kahdesta erillisestä, ohimenevästä aikakautisesta rakenteesta, nimittäin hermostopienasta ja paksun-tumasta, josta hermosolu kehittyy. Hermostopiena näyttää synnyttävän sekä hermosoluja että autonomisen hermosolun ja 10 selkäydinhermon tuntohermosolun sateliittisoluja, s.o. DRG. Hermostopienan ja paksuntuman, josta hermosolu kehitty, myötävaikutusta aivohermon tuntohermosolun muodostukseen on tutkittu käyttämällä viiriäinen/kanapoika sekaepäsikiö transplantaatiosysteemiä, jonka on keksinyt Le Douarin (Le 15 Douarin, 1973, Develop. Biol. 20:217-222; Noden, 1978,

Develop. Biol. 67:313-329; Narayanan ja Narayanan, 1980,

Anat. Rec. 196:71-82; Ayer-Le Lievre ja Le Douarin, 1982, Develop. Biol. 94:291-310; D'Amico-Martel ja Noden, 1983,

Am. J. Anat. 166:445-468). Kuten Lindsay et al. (1985, J.

20 Cell. Sci. Supp. 3:115-129) ovat tehneet katsauksen, nyt uskotaan, ainakin linnuille, että VII, IX ja X aivohermojen etäisemmän hermosolun neuronit (polvekkeinen, ohimoluun kallioluuhun liityvä ja kyhmyinen hermosolu, vastaavasti) ja VIII aivohermon kuulokompleksin neuronit ovat yksinomaan 25 lähtöisin paksuntumasta, josta hermosto kehittyy. V aivo-: hermon kolmoishermo sisältää neuroneja, jotka ovat sekä aivo- että paksuntuma-alkuperää (paksuntumasta johdetut neuronit ovat vallitsevia maksillo-mandibulaarin lohkon ventrolateraalisessa kohdassa), kun taas kaikkien aivoher-, 30 mosolujen sateliittisolujen on havaittu olevan kokonaan hermostopiena-alkuperää.

In vitro kokeista, joissa on käytetty sekä kudosviljelmä että erillisiä selkäytimen ja aivohermon tuntohermosolujen 35 neuroni-rikastettuja viljelmiä, on havaittu, että aivohermo-alkuperää olevat tuntohermosolut ovat herkkiä NGF:lle; päinvastoin, neuronien, jotka on johdettu paksuntumasta.

10 105343 josta kehittyy hermosto (kolmoishermon ventrolateraalisen osan neuronit ja sisäkorvan luusokkelon eteisen, polvekkei-sen, ohimoluun kallioluun ja kyhmyisen hermosolun koko hermosolupopulaatio mukaanluettuina), on havaittu olevan - 5 suuresti ei-herkkiä NGFrlle koko alkionkehityksen ajan.

Vastakohtana eroille niiden vaatimuksissa ja herkkyydessä NGF:lle on sekä paksuntumasta että hermostopienasta johdettujen tuntohermosolujen olevan herkkiä BDNFrn selviämis- ja hermon viejähaaraketta tukevalle aktiivisuudelle (taulukko 10 1) (Lindsay et ai., 1985, J. Cell. Sei. Supp. 3:115-129;

Lindsay et ai., 1985, Develop. Biol. 112:319-328 Kalcheim ja Gandreau, 1988, Develop. Brain res. 41:79-86). Tebar ja Barde (1988, J.Neurosci. 8:3337-3342) tutkivat radioaktii-visesti leimatun BDNF:n sitoutumisparametrejä kananpojan 15 alkion selkäydinjuuren takahermon hermosolun neuroneihin; heidän tuloksensa ovat yhtäpitäviä kahden BDNF-reseptorien luokan olemassaolon kanssa, yhdellä suuri BDNF-affiniteet-ti, toisella alhainen affiniteetti. Sympaattisille neuroneille ei havaittu suuren affiniteetin reseptoreja.

20

Barde et ai. (1987, Prog. Brain Res. 71:185-189) ovat tehneet lisäkatsauksen tunnetuista BDNF:n neuronaalisista kohteista. Ennen tätä keksintöä ei solujen, jotka syntetisoivat BDNF:ää, tunnistaminen ole ollut mahdollista johtuen 25 nukleiinihappo- tai vasta-ainekoettimien, jotka ovat spesi-ί fisiä BDNF:lle, puutteesta. Yritykset valmistaa joko poly- klonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita BDNF:ää vastaan ovat olleet epäonnistuneita. Tämä epäonnistuminen saada vasta-aineita on estänyt BDNF:n molekylaarisen kloonaa-30 ir.isen, BDNF: n kehittyvien neuronien menettämisen fysiologisen vaikutuksen määrittämisen in vivo, BDNF:n määrittäminen kudoksissa käyttämällä immunomääritystä ja BDNF:n paikallistamisen käyttämällä immunosytokemiaa.

u 105343

Taulukko 2

Yhteenveto BDNF:ään vastaavista .ia ei-vastaavista neuro-5 neista* A. Vastaavat neuronit 1. Hermostopiena-alkuperää olevat kananpojan tuntohermoneu-ronit: 10 (a) selkäydinhermon takajuuren ganglio (b) kaulaganglio (c) dorsomediaalinen trigeminaalinen ganglio (d) keskiaivojen trigeminaalinen tumake** 15 2. Kananpojan ulkoalkiolehden paksuntuman tuntohermoneuro- ni-alkuperää olevat: (a) kyhmyinen ganglio (b) vestibulääri ganglio (c) ohimoluun kallioluun ganglio 20 (d) polvekkeinen ganglio (e) ventrolateraalinen trigeminaalinen ganglio 3. Rotan verkkokalvon gangliosolut 25 4. Kananpojan verkkokalvon gangliosolut*** B. Ei-vastaavat neuronit 1. Kananpojan ja rotan sympaattiset neuronit 2. Kanapojan parasympaattiset kiliaarineuronit 30 * Barde et ai., 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189 ** Katso Davies et ai., 1986, Nature319:497-499 *** Rodriquez - Tebar et ai., 1989, Dev. Biol. 136:296-303 35 2.2.3. Aivoista johdetun neurotrofisen tekiiägeenin kloo- - . naaminen • · " ------- . · BDNF-geenin kloonaaminen tehtiin ensin, kuten U.S. patenttihakemuksessa, sarjanumero 07/4000591, jätetty 30. elokuu-40 ta 1989, on kuvattu, ja mikä on liitetty tähän viitteeksi kokonaisuutenaan. Lyhyesti, pienen pienet määrät BDNF-pro-teiinia puhdistettiin sian aivoista, mistä saatiin määritetyksi aminohapposekvenssin fragmentit, mitä voitiin puolestaan käyttää suunniteltaessa vastaavia oligonukleotidejä.

45 Näitä synteettisiä oligonukleotidejä käytettiin sitten a-lukkeina polymeraasiketjureaktiossa (PCR) cDNA-templaatin kanssa, joka oli valmistettu BDNF:ää tuottavista soluista. PCR:n tuotteita käytettiin koettimina, jolloin sallittiin 12 105343 täydellisen cDNA:n ja/tai genomisten BDNF-geenien kloonaaminen eri lajeista, ihminen, sika, rotta ja hiiri mukaanluettuina ja näiden geenien sekvenssit määritettiin. Rekombi-nantti-BDNF:n ilmeneminen saatiin COS-soluissa.

5 3. Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee neurotrofiini-3:a (NT-3), äskettäin keksittyä BDNF-geeniperheen jäsentä. Se perustuu osittain 10 nukleiinihapposekvenssihomologia-alueiden, jotka ovat samat BDNFillä ja NGF:llä, tunnistamiseen (U.S. patenttihakemus, sarjanumero 07/4000591, jätetty 30. elokuuta 1989, liitetty tähän viitteeksi). Tämän keksinnön mukaisesti näitä homolo-gia-alueita voidaan käyttää tunnistamaan uusia BDNF/NGF-15 geeniperheen jäseniä; sellaista metodologiaa käytettiin tunnistamaan NT-3. Tässä keksinnössä saadaan geenit ja geenituotteet uusien BDNF/NGF:n kaltaisille neurotrofisille tekijöille, jotka on tunnistettu näillä menetelmillä.

20 Tämä keksintö koskee osittain rekombinantti-DNA-molekyyle-jä, jotka koodaavat NT-3:a. Tämän keksinnön erityisen spesifiset suoritusmuodot, NT-3:a koodaava DNA on johdettu ihmisen DNArsta, hiiren DNA:sta tai rotan DNA:sta. Tästä keksinnöstä saadaan myös rekombinantti-DNA-molekyylit, 25 joissa on ainakin osa nukleiinihapposekvensseistä, jotka • ovat pääpiirteittäin kuin kuviossa 2 on kuvattu (hiiren NT- 3), kuvio 7 (rotan NT-3) tai kuvio 11 (ihmisen NT-3). Tästä keksinnöstä saadaan myös rekombinantti-DNA ekspressiovekto-rit, joita voidaan käyttää tuottamaan rekombinantti NT-3-30 proteiinia ja sen kaltaisia peptidejä.

Vaihtoehtoisissa suoritusmuodoissa tästä keksinnöstä saadaan NT-3-proteiineja ja sen kaltaisia peptidejä ja menetelmät sellaisten peptidien ja proteiinien tuottamiseksi ja 35 valmistamiseksi. Tämä keksintö koskee myös vasta-aineita, jotka ovat NT-3 proteiineja ja peptidejä vastaan.

13 105343

Keksinnön mukaisesti NT-3:a voidaan käyttää neurologisten sairauksien diagnoosissa ja/tai käsittelyssä, ääreishermo-sairaudet, kuten diabetishermosairaudet, toksiset ja ravit-» semukselliset hermosairaudet, perinnölliset hermosairaudet ja 5 AIDS:iin liittyvät hermosairaudet ja rappeuttavat sairaudet, kuten Alzheimerin tauti, mukaanluettuina, mutta ei näihin rajoittuen. On osoitettu, että NT-3 tukee dopaminergisiä neuroneja; sen mukaisesti keksinnön edullisessa suoritusmuodossa NT-3:a voidaan käyttää Parkinsonin taudin hoitoon. Koska NT-10 3:11a on osoitettu olevan aktiivisuusspektri, joka eroaa BDNF- tai NGF-erityisyyksistä, antaa NT-3 uusia ja arvokkaita vaihtoehtoja indusoimaan uudelleenkasvua ja korjausta keskushermostossa.

'15 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

4.Kuvioiden kuvaus 20 Kuvio 1. Eri lajien BDNF- ja NGF-sekvenssien vertailu.

BDNF:ää koodaavan geenin sekvenssianalyysi ja sen aminohapposekvenssin johtaminen paljasti, että tällä proteiinilla on monia rakenteellisia samankaltaisuuksia NGF:n kanssa. Valmiin BDNF:n primäärinen sekvenssi, samoin kuin yleinen rakenne ja 25 todennäköinen tapa prosessoida prekursoriproteiinista, antavat vahvasti olettaa, että NGF- ja BDNF-geenit saattavat kehittyä yhteisestä kantageenistä. Valmiiden polypeptidien alueella, jos viedään vain 3 väliä NGF-sekvensseihin sopivuuden optimoimiseksi, niin yhteensä 51 aminohappoyksikön samaisuut-30 ta on yhteiset aikaisemmin tunnettujen NGF:n kanssa monista lajeista ja sian ja ihmisen BDNF:n kanssa. Näihin samankaltaisuuksiin kuuluvat kaikki 6 kysteiinijäännöstä, antaen olettaa, että NGF:llä ja BDNF:llä on hyvin samankaltainen sekundäärinen rakenne. Lisäksi voidaan nähdä kuuden tai useam-35 man aminohapon 4 segmenttiä, joissa NGF:t kaikista edellä luetelluista lajeista ja sian BDNF:stä ovat joko identtiset eivätkä eroa useammassa kuin noin yhdessä säilyneessä amino-happosubstituutiossa. Täten on ymmärrettävää päätellä, että NGF ja BDNF ovat läheisesti sukua olevia geeniperheen jäse-40 niä.

14 105343

Kuvio 2. Hiiren NT-3:n genominen sekvenssi ja johdettu a-minohapposekvenssi. Aminohapposekvenssi alkaa ensimmäisellä ATG-kodonilla, joka löydetään kolmen raamissa olevan 5 stop-kodonin jälkeen. Alleviivatut sekvenssit osoittavat ensimmäisellä PCR-kierroksella käytettyjen alukkeiden sijainnin. Ainoa N-glykosylaatio-konsensussekvenssi on kaksinkertaisesti alleviivattu ja nuoli tarkoittaa prosessoidun, valmiin NT-3:n mahdollista alkua.

10

Kuvio 3. Hiiren valmiin NT-3:n NGF:n (Scott et ai., 1983, Nature 302:538-540) ja BDNF:n (Leibrock et ai., 1989,

Nature 341:149-152) aminohapposekvenssin välinen vertailu. Hiiren valmis BDNF-sekvenssi, joka on osoitettu tässä, on 15 100 % identtinen sian BDNF:n kanssa. Puolilihavat kirjaimet ja varjostus tarkoittavat aminohappoja, jotka on löydetty samoista kohdista kaikissa 3 proteiineissa ja nuolet osoittavat kaikkia kysteiinijäännöksiä. Tähdet tarkoittavat välejä, jotka on tuotu optimoimaan yhteensopivuutta. V1-V4 20 tarkoittaa 4 vaihtelevaa domeenia, jotka koostuvat useammasta kuin 3 viereisestä aminohaposta.

Kuvio 5. Hiiren NT-3 mRNA:n kudosjakaantuminen. Jokaiseen linjaan laitettiin yhteensä 20 ug RNA:ta ja hybridisoitiin 25 ”p-leimatun kaksijuosteisen DIJA-koettimen kanssa. (A) yk- sittäinen vyöhyke, joka vastaa noin 1,4 kiloemästä, voidaan nähdä kaikissa kudoksissa, heikoin signaali havaitaan keuhkossa ja voimakkain sydämessä. Luurankolihas otettiin reisistä. (B) Aivoissa saadaan voimakkain signaali aivoturscl-30 la ja pikkuaivoilla.

Kuvio 5. 8 päivän ikäisestä kanapojan alkion solmukkeisesta ganglista eristettyjen tuntoneuronien selviäminen. Maljat-tiin 5000 solua polyornitiinilamiinisubstraatille ja sel-35 vinneet neuronit laskettiin 24 h kuluttua. Tässä käytetty BDNF-konsentraatio oli 3 kertaa minimaalikonsentraatio, joka vaaditaan, jotta saadaan maksimaalinen selviäminen.

15 105343

Neuronien ei havaittu selviävän ilman "konditioidun" alustan lisäystä tai sen käyttöä laimennuksella 1:50 ei-trans-fektoitujen COS-solujen kanssa tai solujen kanssa, jotka * oli transfektoitu kontrolli-DNA:lla.

5

Kuvio 6. (A) PCR-tuote, joka on saatu käyttämällä degene roitunutta IB- ja 2C-alukkeita (merkitty R1B/2C), ilmaisee uuden geenin, NT-3, samoin kuin NGF- ja BDNF-geenit rotan genomisessa DNA:ssa. (B) Rotan NT-3 genomisen kloonin rest-10 riktiokartta. Eristettiin 2 itsenäistä bakteriofaagiklooni-a, jotka hybridisoituvat spesifisesti RlB/2C-koettimeen, rotan genomisesta kirjastosta. Kuvataan kaavamainen esitys yhden näiden kloonien restriktiokartasta, jossa on 19,5 kb insertti. Paksunnettu viiva tarkoittaa NT-3:n avointa luku-15 raamia (ORF) (katso kuvio 7A). RlB/2C-asema on osoitettu.

Kuvio 7. Rotan NT-3 ja sen homologia rotan NGF:n ja rotan BDNF:n kanssa. (A) NT-3:n nukleotidi- ja aminohapposekvenssi. DNA-sekvenssi, joka ylettyy NT-3-geenin koodaaman ORF:n 20 yli, aminohappotranslaatio, joka on osoitettu DNA-sekvens-sin yläpuolella; tähtimerkki aloittaa ja lopettaa avoimen lukuraamin. Aminohappojen asemat on numeroitu antamalla +1 valmiin NT-3:n ensimmäiselle jäännökselle (119 aminohappc-a). Pilkottu kohta, jota on käytetty vapauttamaan valmis 25 NT-3, on laatikoitu, kuten on säilynyt glykosylaatiokohta : juuri vastavirtaan tästä pilkkomiskohdasta; toinen mahdol linen pilkkomiskohta, joka sijaitsee samalla lailla ehdotettuun välissä olevaan prosessointikohtaan nähden NGF:ssä (Darling et ai., 1987, Cold Spring Harb Symp Quant Biol , 30 1:427-34) (mutta joka ei ollut säilynyt BDNF:ssä) on laati koitu ja merkitty "?pilko". NT-3:ssa olevat 6 valmista kys-. teiiniä on alleviivattu. NT-3:n lyhyen prekursorimuodon (asemassa -139) metioniini-aloituskodoni, joka merkkaa a-loituskohtaa "B", kuten tekstissä on keskusteltu, on myös 35 alleviivattu. Ehdotettu liitos akseptorikohta/intron raja "B" aloituskohdasta vastavirtaan on osoitettu kuviossa. (B) Rotan NT-3:n sekvenssirivit rotan NGF:n ja rotan BDNF:n 16 105343 kanssa. Käytettiin MacVector sekvenssianalyysiohjelmistoa (ostettu International Biotechnologies, Inc:ltä) luomaan rotan NT-3:n ORF:n matriksirivi NGF- ja BDNF-geenien ORF:n kanssa (käyttämällä ikkunakokoa 20 ja minimisopivuutta 20 5 %) . Merkittävät yhteensopivuudet, joita nähdään pitkin tämän matriksin diagonaalia, on esitetty NT-3-proteiini-tuotteen kaaviomaisen esityksen alapuolella; kaksi homolo-gialuetta, jotka nähdään verrattuna sekä NGFrään että BDNF:ään, vastavirtaan valmista NT-3:a, on merkitty I ja 10 II. Kuten kuviossa nähdään, alue I ulottuu vastavirtaan "B" aloituskohdan yli, jota on käytetty tuottamaan NT-3:n lyhyttä prekursorimuotoa, kannattaen väitettä, että pidempi prekursori on olemassa. (C) Sekvenssivertailut NT-3:n, NGF:n ja BDNF:n välillä homologia-alueilla I ja II. Tämän 15 alueen sekvenssit on asetettu suoraan riviin homologian maksimoimiseksi, tyhjät välit on insertoitu riviin, merkitty Joko BDNF:n tai NGF:n identtisyydet NT-3:n kanssa on merkitty kun taas NGF:n identtisyydet BDNF:n kanssa on merkitty NGF-sekvenssissä. "+" sekvenssin yläpuolel-20 la tarkoittaa jäännöksiä, jotka ovat täysin säilyneet rotan NT-3:n ja kaikkien tutkittujen lajien NGF- ja BDNF-sekvens-sien välillä. Seuraavat kohdat, jotka on kuvattu NGF:lie, aikaisemmin ennustettu BDNFtlle ja tässä ehdotettu NT-3:lle, on merkitty: "B" aloituskohta metioniinialoituskodo-25 ni; signaalisekvenssipilkkomiskohta (Edwards et ai., 1988, • Mol Cell Biol 8:2456-64); ehdotettu NGF välissä oleva pilk- komiskohta, joka puuttuu BDNF:stä, mutta on läsnä NT-3:ssa; .glykosylaatioakseptorikohta; proteolyyttinen pilkkomiskoh-ta, joka vapauttaa valmiit tekijät. (D) NT-3:n, BDNF:n ja 30 NGF:n valmiiden muotojen sekvenssivertailuja. Säilyneet kysteiinit on korostettu puolilihavin vinoneliöin.

ja kuten paneelissa C. C-terminaalinen pilkkomiskohta, ; joka on vain NGF-sekvenssissä, on osoitettu.

35 Kuvio 8. NGF-, BDNF- ja NT-3-aktiivisuuksien, kuten on määritetty soluviljelmässä kasvatetussa kananpojan alkion (päivä 8) gangliassa, vertailu. Mikrovalokuvat selkäydin- 17 105343 hermon takajuuren gangliasta (DRG) (panelit A-D), solmuk-keisesta gangliasta (NG) (panelit E-H) ja sympaattisesta ketjugangliasta (SG) (panelit I-L), joita on kasvatettu 24 * h (DRG ja NG) tai 48 h (SG) joko kaikkien neurotrofisten 5 tekijöiden puuttuessa (kontrolli; A, E, I) tai COS-solusu-- pernatanttien, joissa oli NGF:ää (B, F, J) tai BDNF:ää (Cr G, K) tai NT-3:a (D, H, L) , läsnäollessa. Kontrolliviljel-missä ei ole melkein yhtään neuriittikasvannaista (500 μΐ COS-solususpernatanttia valetransfektoiduista soluista).

10 NGF (10 μΐ COS-solusupernatanttia) tuotti runsaan säiekas-vannaisen DRG:stä ja SG:stä, mutta ei NG:stä. Kun lisättiin NGF COS-solusupernatanttia 20:stä 50 plraan, ei sillä ollut vaikutusta NG:hen. BDNF (10 μΐ COS-solusupernatanttia) tuotti säiekasvannaisen DRG:stä ja NG:stä mutta ei SG:stä; 15 suuremmilla määrillä (20-500 μΐ) ei ollut vaikutusta SG:hen. NT-3 (20 μΐ COS-solusupernatanttia DRGrhen ja NG:hen, 200 μΐ SG:hen) tuotti säiekasvannaisen kaikista kolmen tyyppisistä gangliasta, vaikka kasvun aloitus oli hitaampaa eikä niin runsasta kuin SG:stä. Ganglia kasvatet-20 tiin kuten kudosviljelmät kollageenigeelissä (Lindsay R. M. ja Rohrer, H., 1985, Dev. Biol. 112:30-48) F14-alustassa, johon oli lisätty 5 % hevosen seerumia, kuten edellä on kuvattu (Lindsay et ai., 1985, Dev Biol 112:319-28). As-teikkoviivain = 200 pm.

25 • Kuvio 9. NT-3 edistää selviämistä ja neuriittien kasvannai sia erittäin rikastetuissa DRG-neuronien viljelmissä. Mik-rovalokuvat neuronirikastetuista 095 % neuroneja) hajonneista kanapojan alkion (päivä 8) DRG-viljelmistä, joita on , 30 käsitelty 48 h joko: (A) supernatantilla (500 μΐ) vale transf ektoiduista COS-soluista tai (B) supernatantilla (50 μΐ) NT-3-transfektoiduista soluista. A ja B ovat tummataus-tamikrokuvia; A:ssa (kontrolliviljelmä) selvisi vähemmän kuin 5 % maljatuista neuroneista; B:ssä prosessin kestä-35 neiden neuronien lukumäärä oli noin 60 % maljatuista neuroneista. Annosvastekäyrastä tämän havaittiin olevan NT-3:n maksimaalinen vaikutus kananpojan E8 DRG-neuroneihin.

18 105343 (C) Saman viljelmän, kuten B:ssä on näytetty, suuren erotuskyvyn faasikontrastimikrokuva. Huomaa faasi-kirkkaiden neuronaalisolukappaleiden suuri lukumäärä ja kaikkien ei-neuronaalisien solujen tosiasiallinen puuttuminen. Viljel-5 mät tehtiin kuten aikaisemmin on kuvattu (Lindsay et ai., 1985, Dev Biol 112:319-28). Asteikkomitta = 150 μΐ (C).

Kuvio 10. NT-3:n, NGF:n ja BDNF:n jyrsijän kudoksissa ilmenemisen Northern blot-vertailut. RNA valmistettiin 10 (Auffray, C. ja Rougeon, F., 1980, Eur J. Biochem 107:303-14) rotan (vasemmat panelit) tai hiiren osoitetuista kudoksista (oikeat panelit). 10 pg RNA:ta osoitetuista lähteistä fraktioitiin sitten 1 %:ssa formaldehydiagaroosigeeleissä ja siirrettiin nailonmembraaneille 10X SSC:ssä; kolmena 15 kappaleen olevat Northern blotit hybridisoitiin (Mahmoudi, M. ja Lin, V.K. 1989, Biotechnigues 7:331-3) 68'C:ssa KP-leimatun (Feinberg, A.P. ja Vogelstein, B., 1984, Anal Bio-cheir. 137:226-7) rotan NT-3:n, rotan BDNF:n ja rotan NGF:n DNA-fragmenttien kanssa ja sitten pestiin 68'C:ssa 2XSSC: 20 ssä, 0,1 % SDS:ssä. DNA-fragmentit NT-3:lle, NGF:lle ja BDNF:11e johdettiin ekspressiorakenteista, joissa oli näitä geenejä pCDM8:ssa; näissä rakenteissa olevat noin 775 bp Xhol-insertit geelipuhdistettiin ennen radioleimausta. Mukana on kuva etidiumbromidivärjätystä geelistä, joka sallii 25 kokonais RNA-määrän vertailun näytettä kohti.

Kuvio 11. Rotan ja ihmisen NT-3-geenien rivissä olevat DNA-sekvenssit. Ennustettu translaation aloituskohta on merkitty "PREPRO—" ja ennustettu valmiin NT-3:n aloitus on mer-30 kitty "MATURE--". Rotan ja ihmisen valmiilla NT-3-proteii-neilla on identtiset aminohapposekvenssit, kun taas niiden prepro-alueet eroavat 11 asemassa, jotka ovat alleviivatut.

Kuvio 12. Ihmisen NT-3-polypeptidin ilmeneminen, havaittu 35 metabolisella leimauksella. 5 x 10: COS-M5-solua maljaa kohti ympättiin 60 mm petrimaljoihin ja kasvatettiin yön yli 37!C:ssa täydellisessä DMEM-alustassa, jossa oli 10 % 19 105343 kokonais naudanseerumia (FBS). Solut transfektoitiin (käyttämällä CaPO,-menetelmää, kuten Chen ja Okayana oavt kuvanneet, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2745-52) 20 pg:lla pC8hN3-(Pl)-plasmidia, jossa oli ihmisen NT-3-geeni sytomegalo-5 viruspromoottorin alla tai valetransfektoitiin (ei plasmi-di-DNA:ta). 48 h myöhemmin solut pestiin ja inkuboitiin 1 h 1 ml:ssa ilman metioniinia ja kysteiiniä DMEM:ssä, jossa oli 1 % FBSrää. Jokaiseen viljelmään lisättiin [I!S]metio-niinin ja [I!S] kysteiinin seosta (100 pCi jokaista, New 10 England Nucler:sta), soluja inkuboitiin vielä 4 h 37:C:ssa ja alusta kuten koottu. 50 μΐ näytteet sekoitettiin 25 μΐ kaksoisvahvuiseen näytepuskuriin, jossa oli Na-dodekyyli-sulfaattia (SDS), jota oli keitetty 5 min ja tehtiin elektroforeesi 15 %:ssa polyakryyliamidigeelissä SDS:n läsnäol-15 lessa (Laemmli, 1970,Nature 227:680-685). Proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti (3 h, 100 mA) nailonmembraa-nille (immobilon, Milliporelta), käyttämällä Towbin et ai. kuvaamia puskureita, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:4350-4354. Suodattimet kuivattiin ilmassa ja leimatut 20 proteiinit havaittiin autoradiografisesti (16 h ympäröivässä lämpötilassa käyttämällä Kodak X-AR-filmiä, jossa oli suurentava suodatin - Cronex, DuPont).

Kuvio 13. Pylväsdiagrammi osoittaa selvinneiden tyrosiini-25 hydroksylaasisolujen lukumäärän viljelmää kohti ilman NT- < * ϊ 3-supernatanttia (0) tai laimennukset 1:300, 1:100, 1:50 tai 1:25 NT-3:a sisältävää supernatanttia.

Kuvio 14. Pylväsdiagrammi, kuten kuvion 13 kuvatekstissä „ 30 (supra) on selitetty, paitsi että soluja oli 900000 solua maljaa kohti tiheydellä.

Kuvio 15. NT-3-, BDNF- ja NGF-synteettisten transkriptien vertailu. Dot-blot-hybridisaatio, jossa käytetään radiolei-35 mattua oligcnukleotidiä, joka on homologinen yhteiselle alueelle kaikkien kolmen transkriptin 5'-päässä, varmistaa että käytetään samat määrät (2 ng) synteettistä NT-3-, 105343 BDNF- ja NGF-transkripteja, alunperin määritetty spektrofo-tometrisesti, kuvattuina standardeina. B. NT-3, BDNF ja NGF mRNA-tasojen määritys kokonais-RNA-ssa, joka on valmistettu aikuisen rotan aivoista vertaamalla kuvattuihin synteetti-5 siin RNA-standardeihin. 10 pg kokonais-RNA:ta, joka oli e-ristetty aikuisen rotan aivoista ja 4, 10 ja 20 pg synteettisiä transkriptejä, jotka vastasivat jokaista neuro-trofiinia, Northern-blotattiin ja hybridisoitiin radiolei-mattuihin koettimiin, jotka olivat spesifisiä jokaiselle 10 neurotrofiinille.

Kuvio 16. NT-3-, BDNF-, NGF- ja NGFR-geeni-ilmeneminen kokonais-RNA:ssa (10 pg/linja), joka oli valmsitettu rotan alkioista (A), kehittyvän rotan aivoista (B) ja valikoi-15 duista syntymähetken ja aikuisen kudoksista (C). Kudokset: A.BR: aikuisen aivonäyte, joka on standardisoitu kuviossa IB; PLAC: istukka; EMB: koko alkio; SP.C: selkäydin; TKY: kateenkorva; LIV: maksa; HRT: sydän. BR: aivot. Transkrip-tiokoot ilmaistu (kiloemäksinä (kb)) oikealla.

20

Kuvio 17. NT-3-, BDNF-, NGF- ja NGFR-geeni-ilmeneminen kokonais-RNA:ssa (10 pg/linja), joka oli valmistettu erillisistä alueista vastasyntyneiden (A) ja aikuisen (B) hermostoista. Alueet: A.BR: aikuisen aivonäyte, joka on 25 standardisoitu kuviossa IB; CBL: pikkuaivot; HBR: taka- aivot; MBR: keskiaivot; DIEN: väliaivot; STR: aivojuovien HIP: aivoturso; CTX: myöhäisaivokuori; OLF: hajukäämi; E?.: koko aivot ilman pikkuaivoja; ADR: lisämunuainen; RET: verkkokalvo; SC.N. lonkkahermo; SP.C: selkäydin.

30

Kuvio 18. NT-3-, BDNF- ja NGF-transkriptiotasojen määritys vastasyntyneen ja aikuisen CNS-alueilla ja ääreiskudoksis-sa. Tiedon saamiseksi käytettiin densitometristä pyyhkäisyä Northern blottien lukuisista säteilytyksistä, mukaanluet-35 tuina kuvioissa 16, 17, 19 ja Kaisenpierre et ai., (1990, Science 247:1446-1451) kuvatut. Kaikki tasot on standardisoitu suhteessa neurotrofiinitasoihin aikuisen aivoissa; • · » 21 105343 aikuisen aivoissa olevat tasot, jotka ovat samanlaiset kolmelle neurotrofiinille (katso teksti), asetetaan l:ksi jokaiselle neurotrofiinille. Nolla-asteikkoarvot ovat mu-»' kana rikotuissa pystypylväissä. Neuraali- ja ei-neuraali- 5 näytteet on osoitettu kuvioissa. Näytteet: BRN: aivot, ; pikkuaivot eivät kuulu; CBL: pikkuaivot; HBR: taka-aivot; MBR: keskiaivot; DIE: väliaivot; STR: aivojuovio: HIP: aivoturso; CTX: myöhäisaivokuori; OLF: hajukäämi; SC.N. lonkkahermo; SP.C: selkäydin; RET: verkkokalvo; ADR: lisä-10 munuainen; HRT: sydän; LIV: maksa; THY: kateenkorva, SK”: iho; MUS: luurankolihas; LNG: keuhkot; INT: suoli; KID: munuainen; SPL: perna.

Kuvio 19. NT-3-, BDNF-, NGF- ja NGFR-geenin ilmeneminen 15 selkäytimen (A,E), pikkuaivojen (B,F) ja aivoturson (C,G) kehityksen aikana. Verrattiin 10 yg kokonais RNA:n, joka oli valmistettu osoitetuista kehityksellisistä ajankohdista, erilaisten transkriptien ilmenemistä. Neurotrofiini-transkriptiotasojen, jotka kuvattu E:ssä, F:ssä, G:ssä, 20 densitometrinen määritys.

5. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö koskee neurotrof iini-3: a, neurotroof istc-n 25 molekyylien BDNF/NGF-perheen uusi jäsen, samoin kuin muitr. BDNF/NGF-perheen jäseniä, jotka voidaan tunnistaa käyttämällä samanlaista metodologiaa. Esityksen selvyydeksi, mutta ei rajoituksen takia, keksinnön yksityiskohtainen kuvaus jaetaan seuraaviin ala-kappaleisiin.

30 (i) BDNF/NGF-perheen lisäjäsenten tunnistaminen; r . (ii) neurotrofiini-3:n kloonaaminen; (iii) neurotrofiini-3:n ilmeneminen; (iv) neurotrofiini-3:n biologisen aktiivisuuden määritys; 35 (v) neurotrofiini-3-geenit ja -proteiini; (vi) anti-neurotrofiini-3-vasta-aineiden tuottaminen; ja (vii) keksinnön käyttökelpoisuus.

22 1 0 5 3 4 3 5.1. BDNF/NGF-perheen lisäjäsenten tunnistaminen NGF ja BDNF ovat emäksisiä proteiineja, joissa on noin 120 5 aminohappoa, joilla on noin 50 % aminohapposekvenssi-identtisyyttä, mukaanluettuina ehdottoman säilyneet 6 kysteiini-jäännöstä, joiden on osoitettu aktiivisessa NGF:ssä muodostavan 3 disulfidisiltaa (Bradshaw, A., 1978, Ann. Rev. Biochem. 47:191-216; Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149-10 52). Kun verrataan NGF-sekvenssejä evolutionaarisesti eri laisilta lajeilta, on paljastunut että aminohapot, jotka reunustavat näitä kysteiinijäännöksiä, sisältävät molekyylin parhaiten säilyneet alueet (Meier et ai., 1986, EMBO J. 5:1489-93; Salby et ai., 1987, J. Neurosci. Res. 18:293-15 8). Silmäänpistävästi nämä ovat myös alueet, jotka ovat eniten samankaltaiset BDNF:n ja NGF:n välillä (Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149-52).

Järkiperäinen BDNF/NGF-geeniperheen uusien jäsenten etsimi-20 nen voidaan suorittaa käyttämällä lähestymistapaa, jossa käytetään hyväksi säilyneiden segmenttien, joilla on vahva homologia NGF:n ja BDNF:n välillä, olemassaoloa. Esimerkiksi BDNF/NGF-geeniperheen uusia jäseniä voidaan tunnistaa valikoimalla, erilaisten nukleiinihapposekvenssien joukos-25 ta, ne sekvenssit, jotka ovat homologisia BDNF:lie ja NGF:lle ja lisäksi tunnistamalla valikoiduista sekvensseistä ne, joissa myös on nukleiinihapposekvenssit, jotka ovat ei-homologisia NGF:n ja BDNF:n kanssa. Termin "ei-homologi-nen" voidaan selittää tarkoittavan aluetta, jossa on aina-30 kin 6 viereistä nukleotidiä, joissa ainakin noin 2 nukleo-. tidiä eroaa NGF- ja BDNF-sekvenssistä.

Tämä keksintö koskee myös rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka ovat homologisia 3DNF:n ja NT-3:n kanssa tai vaihto-35 ehtoisesti NGF:n ja NT-3:n kanssa, mutta joissa myös on alueita, jotka eivät ele homologisia BDNF:n ja NT-3:n kanssa tai NGF:n ja NT-3:n kanssa, vastaavasti. Nämä BDNF/ « * 23 105343 NGF/NT-3-geeniperheen lisäjäsenet voidaan tunnistaa käyttämällä molekulaarisia koettimia, jotka vastaavat homologia-alueita. Lisäanalyysin jälkeen BDNF/NGF/NT-3-geeniperheen näillä jäsenillä havaitaan olevan sekvenssejä, jotka eroa-5 vat tunnettujen BDNF/NGF/NT-3-geeniperheen jäsenten sek- - vensseistä.

Esimerkiksi keksinnön edullinen spesifinen suoritusmuoto antaa seuraavan menetelmän. Vastaten jokaista 4 säilynyttä 10 segmenttiä ("laatikot"), jotka esitetään taulukossa 3, infra, voidaan syntetisoida noin 10-20 nukleotidin degeneroituneen oligonukleotidikoettimen sarjoja, jotka edustavat kaikkia mahdollisia koodaussekvenssejä aminohapoille, joita on joko NGF:ssä tai BDNFrssä, noin 3-7 vierekkäistä kodoni-15 a. Kun numeroidaan huomioon ottaen valmiiden polypeptidien aminoterminukset (niin, että preproBDNF:n Hisl34:ää käsitellään kuten Hisl valmiissa proteiinissa), voidaan 4 laatikkoa luonnehtia seuraavasti (numeroitu suhteessa ihmisen valmiisiin proteiineihin).

20

Taulukko 3

Laatikko 1: NGF GlylO -Serl9 BDNF Gly8 -Serl7 25 Laatikko 2: NGF Lys50 -Cys58 BDNF Lys50 -Cys58

Laatikko 3: NGF Gly67 -Asp72 BDNF Gly67 -Asp72

Laatikko 4: NGF 7rp99 -CysllO

30 BDNF TrplOO -Cyslll

Synteettisiä oligonukleotidejä, jotka on johdettu laatikkojen sekvenssipareista, jotka on esitetty taulukossa 3, voidaan käyttää alukkeina amplifioimaan FCR-sekvensseillä 35 mahdollisesta kiinnostavasta lähteestä (P.NA tai DNA) . Tähän saattaisi kuulua mRNA tai cDNA tai genominen DNA mistä tahansa eukaryoottisesta lajista, joka kykenisi ilmentämään 24 105343 polypeptidiä, joka on läheistä sukua BDNF:lle tai NGF:lle. Suorittamalla niin vähän kuin 6 PCR-reaktiota (nimittäin: aluke Laatikosta 1 alukkeen kanssa Laatikosta 2; Laatikko 1

Laatikon 3 kanssa; Laatikko 1 Laatikon 4 kanssa; Laatikko 2 5 Laatikon 3 kanssa; Laatikko 2 Laatikon 4 kanssa; Laatikko 3

Laatikon 4 kanssa) voi olla mahdollista havaita geeni tai geenituote, jolla on mitkä tahansa kaksi samaa edellä olleista säilyneen sekvenssin neljästä segmentistä NGF:n ja BDNF:n välillä. Jos valitaan syntetisoida useita erilaisia 10 degeneroituneita alukkeita jokaiselle laatikolle, voi silti olla mahdollista suorittaa täydellinen etsintä suhteellisen pienellä PCR-reaktioiden lukumäärällä. On myös mahdollista vaihdella hybridisaation ankaria olosuhteita, joita on käytetty PCR-reaktioiden alulle saamiseksi, jolloin sallitaan 15 tuntemattoman geenin ja NGF:n tai BDNF:n välillä nuklecti-disekvenssille suuremman tai pienemmän asteinen samankaltaisuus. Jos aikaisemmin tuntemattoman BDNF/MGF-geeniper-heen jäsenen segmentti amplifioidaan onnistuneesti, voidaan tämä segmentti kloonata molekulaarisesti ja sekvenssoida ja 20 käyttää koettimena eristämään täydellistä cDNA:ta tai geno-mista kloonia. Tämä puolestaan sallii tumtemattoman geer.ir. täydellisen nukleotidisekvenssin määrityksen, sen ilmenemisen analyysin ja sen proteiinituotteen tuottamisen toiminnallista analyysiä varten.

25

Lisäksi tämä keksintö antaa käyttöön BDNF/NGF-sekvenssiho-mologiat uusien rekombinanttimolekyylien, jotka ovat BDNF/ NGF-geeniperheen jäseniä, mutta eivät voi esiintyä luonnossa, suunnittelussa. Esimerkiksi, mutta ei rajoitukseksi, 30 voidaan rekcmbinanttimolekyyli rakentaa keksinnön mukaisesti, jossa on sekä NGF- että BDNF-geenien osat. Sellaiselle molekyylillä voisi olla ominaisuudet, jotka liittyvät sekä BDNF:ään että NGF:ään ja esittää uuden biologisten aktiivisuuksien profiilin, vaikuttajat samoin kuin vastaar.vaikut-35 tajat mukaanluettuina. BDNF:n ja ITGF:n primääristä sekvenssiä voidaan myös käyttää ennustamaan molekyylien tertiääristä rakennetta käyttämällä tietokonesimulaatiota (Kopp ja 25 105343

Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824-3828); BDNF/NGF-kimeeriset rekombinanttigeenit voitaisiin suunnitella tertiäärisen rakenteen ja biologisen toiminnan korrelaation valossa. Samalla lailla voidaan rakentaa kimeeriset 5 geenit, joissa on osat minkä tahansa tai useampien BDNF/ * NGF-geeniperheen jäsenistä.

5.2. Neurotrofiini-3:n kloonaaminen 10 NT-3-geeni mistä tahansa organismista voidaan tunnistaa käyttämällä homologia-alueita, jotka ovat yhteiset BDNF:lie ja NGF:lle, käyttämällä edellä esitettyjä menetelmiä. Keksinnön kahdessa, edullisessa spesifisessä suoritusmuodossa voidaan geeni tunnistaa ja kloonata seuraavasti.

15

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa sense- (tai 5') alu-ketta, jossa on nukleotidisekvenssi (käyttämällä IUPAC-nimistöä) GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GA (aluke 1, jossa on Bam HI ja Sac II endonukleaasipilkkomiskohdat) ja anti-20 sense- (tai 3') aluke, jossa on nukleotidisekvenssi TCGAA7-TCTAG AT ICK IÄT RAA ICK CCA (aluke 2, jossa on Eco P.I- ja Xba I-kohdat) voidaan käyttää polymeraasiketjureaktiossa (Saiki et ai., 1985, Science 230:1350-1354) kaupallisen termisen renkaaksi tekijän (esim. Perkin-Elmer Cetus ther-25 mal cycler) ja lämpöstabiilin DNA-pclymeraasin kanssa thermal s aquaticus (Taq-polymeraasi) polymeraasista. Noin 4 kierroksen jälkeen hybridisoitumislampötilan ollessa 45C voidaan jäljelle jääneet 36 kierrosta suorittaa hybridisci-malla 49 C:ssa. Amplifikaaticsta saadut DNA-tuotteet voidaan 30 sitten erottaa polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja tuote, joka vastaa odotettua kokoa (noin 137 emäsparia) voidaan elucida, hybridisoida uudelleen ja sitten pilkkoa kahdella restriktioendonukleaasilla, joista toinen pilkkoo organismin NGF-geenisekvenssin amplifioidun segmentin a-35 lueella, ja joista teinen pilkkoo organismin BDNF-geenisek-ver.ssin amplifioidun segmentin alueella. Pilkkomaton DMA (joka oletettavasti ei keodaa NGF:ää eikä BDNF:ää, jossa ti 26 105343 ole tapahtunut restriktioendonukleaasipilkkomista) voidaan sitten erottaa pilkotusta DNA:sta polyakryyliamidigeelie-lektroforeesissa, eluoida ja amplifioida asymmetrisesti (Innis et ai.r 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:9436-5 9440) ja sekvenssoida (Sanger et ai., 1979, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 72:3918-3921) käyttämällä esimerkiksi alukkeita 1 ja 2. Perustuen siten saatuun sekvenssiin voidaan suunnitella lisää sense- ja antisensealukkeita, jotka heijastavat tarkemmin uuden geenin sekvenssiä. Esi-10 merkiksi uusia sense-alukkeita, kuten GGGATTGATGAC AAA

(aluke 3) ja ACTCTCAGTGCAAAACTTCGC (aluke 4) ja antisense (5') aluke CGGATCCGAATTCTGCAG (T),-V (aluke 5) voidaan käyttää. RITA, joka on valmistettu kudoksesta, joka todennäköisesti tuottaa neurotrofiiniaktiivisuutta, kuten aivot 15 (käyttämällä mitä tahansa standardimenetelmää, kuten sellaista, jonka Okayama et ai. ovat esittäneet, 1987, Meth. Enzymol. 154:3-28), voi olla käänteistranskriptoitu käyttä- . mällä, esimerkiksi aluketta 5, joka on suunniteltu sopivan yhteen 3' poly (A)-häntien kanssa, ja jossa on Bam HI, Eco 20 Rl ja PstI restriktioendonukleaasipilkkomiskohdat (Leibrock et ai., 1989 341:149-152). Saatu cDNA voidaan sitten PCR-amplifioida käyttämällä alukkeita 3 ja 5 ja sitten amplifi-oida uudestaan käyttämällä alukkeita 4 ja 5. Southern blct voidaan saada tuotetuksi käyttämällä viimeisen reaktion 25 tuotteita ja hybridisoida !'P-pää-leimattuun oligonukleoti-dikoettimeen, joka vastaa sekvenssiä, joka on myötävirtaan alukkeen 3 ja 4 sekvenssejä. Täten tunnistetut DNA-fragmen-,tit voidaan sitten kloonata sopivaan vektoriin ja pisintä saatua inserttiä voidaan käyttää seulomaan genomista kir-10 jastoa, joka on tuotettu kiinnostuksen kohteena olevasta organismista. Positiiviset kloonit, jotka on tunnistettu tällä tavoin, voidaan sitten analysoida standardirestrik-- tiokartoitus- ja nukleotidisekvenssointitekniikoilla.

35 Eräässä toisessa keksinnön edullisessa suoritusmuodossa voidaan syntetisoida degeneroituneita cligonukleotidejä, jotka vastaavat segmenttejä neljän proteiinin sekvensseis- 27 105343 ta, jotka ovat erittäin säilyneitä NGF:n ja BDNF:n välillä. Nämä aminohapposekvenssit voivat olla esimerkiksi (esitetty kuviossa 7D) (1) Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Val-Cys-Asp-Ser; (2) * Lys-Gen-Tyr-Phe-(Tyr/Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys; (3) Gly-Cys- 5 Arg-Ile-Asp; ja (4) Trp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-Thr-(Ser/- * Ala)-Cys-Val-Cys. PCR-reaktioissa voidaan käyttää degeneroituneiden sense- ja anti-sense oligonukleotidejä (joissa degeneroitunut osa on 15-26 nukleotidiä pitkä, vastaten 5-9 edellä mainittujen proteiinisekvenssien aminohappoa joko 10 sense- tai anti-sense-suunnassa, samoin kuin ei-degeneroi-tunut "häntä", joka koodaa restriktioentsyymin tunnistamis-kohtia). Amplifikaatioreaktiot vastavirtaan sense ja myötävirtaan anti-sense alukeparien välillä voidaan suorittaa standardiolosuhteissa tai edullisesti optimaaliset olo-15 suhteet jokaiselle alukkeelle voidaan määrittää kokeellisesti. Esimerkiksi sense-aluketta (vastaa aminohapposekvenssiä (1), supra) 5’GACTCGAGTCGACATCG-GTN-TGY-GAY-WSN-RTN-WS-3' ja anti-sense-aluketta (vastaa aminohapposekvenssiä (2), supra), 51-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-20 RAA-RTA-YTG-3' voidaan käyttää amplifikaatioreaktiossa käyttämällä genomista DNA:ta tai cDNArta, joka on johdettu sopivasta templaattilähteestä. Tuotteita amplifikaatioreak-tioista, joissa käytetään vastavirtaan sense- ja myötävirtaan anti-sense-alukepareja, voidaan käyttää hybridisaatie-25 koettimina genomisen DNA:n Southern blotissa tunnistamaan PCR-tuotteet, jotka hybridisoituvat genomiseen DNA-sekvens-siin, jossa on koettimen kanssa homologiset alueet samoin kuin alueet, jotka eivät ole homologisia koettimen kanssa (esimerkiksi, ei-NGF, ei-BDNF-sekvenssi). PCR-tuotetta, jo-30 ka tunnistaa uuden genomisen DNA-sekvenssin, voidaan käyttää seulomaan genomista tai cDNA-kirjastoja ja siten selek-„ toim.aan klooneja, jotka koodaavat uusia BPNF/NGF-geeniper- heen jäseniä.

28 105343 5.3.Neurotrofiini-3:n ilmeneminen

Nukleotidisekvenssi, joka koodaa NT-3-proteiinia tai sen 5 osaa, voidaan insertoida sopivaan ekspressiovektoriin, s.o. vektoriin, jossa on tarvittavat elementit insertoidun proteiinia koodaavan sekvenssin transkriptiolle ja translaatiolle. Tarvittavat transkriptionaaliset ja translaatio-naaliset signaalit voidaan hankkia luonnollisesta NT-3-10 geenistä ja/tai sitä reunustavilta alueilta. Erilaisia isäntä-vektorisysteemejä voidaan käyttää ilmentämään proteiinia koodaavaa sekvenssiä. Näihin kuuluvat, mutta ei rajoitu, nisäkkään solusysteemit, jotka on infektoitu viruksella (esim. vaccinia-virus, adenovirus, jne); hyönteisen 15 solusysteemit, jotka on infektoitu viruksella (esim. bacu-lovirus); mikro-organismit, kuten hiiva, jossa on hiivavek-torit tai bakteerit, jotka on transformoitu bakteriofaagi-PNA:lla, plasmidi-DNA:11a tai kosmidi-DNA:11a. Keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa ekspressiovektorissa saattaa nii3 CKV-promccttori (Stephens ja Cockett, 198S, Nuci.

20 σΑ-

Aoi^s P'es· 17:7710) ja SV40 replikaatioalku. Näiden vektoreiden ekspressieelementit vaihtelevät voimakkuudessaan ja spesifisyydessään. Riippuen käytetystä isäntä-vektorisys-teemistä voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista sopivista +. v-pr-iskript i o- ja translaatioelementeistä .

tä tahansa edellä kuvattua menetelmää DNA-fragmenttier.

.,· toimiseksi vektoriin voidaan käyttää ekspressiovekto- reiden, joissa on kimeerinen geeni, jossa on sopivat trans--»t tonaaliset/ translaationasi iset kontrollisianaalit ja ,^v-rteiinia kocdaavat sekvenssit, rakentamiseen. Näihin me-nfetelm;iin voi kuulua in vitro rekombinantti-DNA- ja synteettiset tekniikat ja in vivo rekomfcinaatiot (geneettinen reKom.binaatio) . Nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa NT- i--v-ti.iir.ia tai peptidi fragmenttia, ilmeneminen voidaan 35 -> t“- ~ « « ^5 ώ T T o t O i S t X X ?· Π li K 2. *5: ~L * Γ* * hi clppO S K V £' Γ* £ s i 2.1 cl Γ. iL Il , tr t tl N7- 3-prcteiini tai peptidi ilmenee isännässä, joka on trans- 29 105343 formoitu rekombinantti-DNA-molekyylillä. Esimerkiksi NT-3:n ilmenemistä voidaan kontrolloida millä tahansa alalla tunnetulla promoottori/enhancer-elementillä. Promoottorei-hin, joita voidaan käyttää kontrolloimaan NT-3-ilmenemistä, 5 kuuluu mutta ei rajoitu, SV40 aikainen promoottorialue {Bernois ja Chair.bon, 1981, Nature 290:304-310), promoottori, joka oli Rous sarcoma-viruksen 3' pitkässä terminaalisessa toistumassa (Yamamoto, et ai., 19S0, Cell 22:787-797), herpes tymidiinikinaasipromoottori (Wagner et ai., 10 1981, Proc. Natl. Acad. sei. U.S.A. 78:144-1445), metallo- tioniinigeenin säädeltävät sekvenssit (Brinster et ai.,19-82, Nature 296:39-42); prokaryoottiset ekspressiovektorit, kuten β-laktamaasipromoottori (Villa-Kamaroff, et ai., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75:3727-3731) tai tac-15 promoottori (DeBoer, et ai., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 80:21-25), katso myös "Useful proteins from recombinant bacteria". Scientific American, 1980, 242:74-94; kasvin ekspressiovektorit, joissa on nopaliinisyntetaasipro-moottorialue (Herrera-Astrella et al., Nature 303:209-213) 20 tai kukkakaalin mosaiikkivirus 35S RNA promoottori (Gadr.er, et ai., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), ja fotosynteettisen entsyymin ribuloosibifosfaattikarboksylaasin promoottori (Herrera-Astrella et ai., Nature 310:115-120); hiivan tai muun homeen promcottorielementit, kuten Gal 4-promoottori, 25 ADC (alkoholidehydrogenaasi) promoottori, PGK (fosfoglyse-rolikinaasi) promoottori, alkaalinen fosfataasipromoottori ja seuraavat eläimen transkriptionaaliset kontrollialueet, jotka osoittavat kudosspesifisyyttä, ja joita en käytetty transgeenisissä eläimissä: elastaasi I c;eenikontrollialue , . 30 joka on aktiivinen haiman rakkulasoluissa (Swift et ai., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et ai., 1986, Cold Spring ; Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1937,

Hepatology ^:425-515),- insuliinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen haiman beta-scluissa (Hanahan, 1985, Nature 35 315:115-122), inmunoglobuliinigeenikontrcllialue, joka on aktiivinen imusoluissa (Grcsschedl et ai., 1924, Coll 38:647-658: Adam.es et ai., 1985, Nature 318:533-538; Alex- 105343 ander et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), hiiren nisän tumoriviruskontrollialue, joka on aktiivinen kiveksen, rinnan, imu- ja syöttösoluissa (Leder et ai., 1986, Cell 45:485-495), albumiinigeenin kontrollialue, joka on 5 aktiivinen maksassa (Pinkert et ai., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), alfa-fetoproteiinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen maksassa (Krumlauf et ai., 1985, Mol. Cell, biol. 5:1639-1648; Hammer et ai., 1987, Science 235:53-58); alfa-l-antitrypsiinigeenin kontrollialue, joka on ak-10 tiivinen maksassa (Kelsey, et ai., 1987, Genes and Devel.

1:161-171), beta-globiinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen ydinsoluissa (Mogram et ai., 1985, Nature 315:338-340; Kolias et ai., 1986, Cell 46:89-94; myeliinin emäksisen proteiinigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen cli-15 godendrosyyttisoluissa aivoissa (Readhead et ai., 1987,

Cell 48:703-712); myosiinin kevyen ketju-2-geenin kontrollialue, joka on aktiivinen luurankolihaksessa (Sani, 1985, Nature 314:283-286) ja gonadotrcfiinia vapauttavan hcrmc-nigeenin kontrollialue, joka on aktiivinen alanäkökukkulas-20 sa (Mason et ai., 1986, Science 234:1372-1378).

Ekspressiovektorit, joissa on NT-3-geeni-insertit, voidaan tunnistaa kolmella yleisellä tavalla: (a) DNA-DNA-hybrid:- saatio, (b) "markkeri"-geenitoim.intojen läsnäolo tai puut-25 tuminen ja (c) insertoituneiden sekvenssien ilmeneminen.

.. _ Ensimmäisessä lähestymistavassa voidaan vieraan geenin, joka on insertoitu ekspressiovektoriin, havaita DNA-DNA-hybridisaatiolla käyttämällä koettimia, joissa on sekvenssit, jotka ovat homologisia insertottuneen NT-3-geenin 30 kanssa. Toisessa lähestymistavassa voidaan rekombinar.t11 vektori/isäntä-systeemi tunnistaa ja selektcida perustuen tiettyjen "markkeri"-geenitoimintojen läsnäoloon tai puuttumiseen (esim. tymidiinikir.aasiaktiivisuus , antibioctti-resistenssiys, transformaatiofenotyyppi, tukkeumak.appalei-35 den muodostuminen baculovirukseen, jne), joita aiheuttaa vieraiden geenien insertio vektoriin. Esimerkiksi jos NT- 3-geeni insertoidaan vektoriin markkerigeer.isekvenssialu- 31 105343 eelle, voidaan rekombinantit, joissa on NT-3-insertti, tunnistaa markkerigeenitoiminnan puuttumisesta. Kolmannessa lähestymistavassa voidaan rekombinantti-ekspressiovektorit tunnistaa määrittämällä vieraan geenin tuote, jota rekombi-5 nantti ilmentää. Sellaiset määritykset voivat perustua, e-simerkiksi KTT-3-geenituotteen fysikaalisiin tai toiminnallisiin ominaisuuksiin biomäärityssysteemeissä.

Kun tietty rekombinantti-DNA-molekyyli en tunnistettu ja 10 eristetty, voidaan käyttää useita ällällä tunnettuja menetelmiä lisätä sitä. Kun kerran on löydetty sopiva isäntä-systeemi ja kasvuolosuhteet, voidaan rekombinantti-ekspres-sievektoreita lisätä ja valmistaa runsaasti. Kuten edellä selitettiin, ekspressiovektoreihin, joita voidaan käyttää, 15 mutta ei rajoitu, kuuluu seuraavat vektorit tai niiden johdannaiset: ihmisen tai eläimen virukset, kuten vaccinia virus tai adenovirus; hyönteisen virukset, kuten baculovi-rns; hiivavektorit; bakteriof aagivektorit (esim;, lambda) ja plasmidi- ja kosmidi-vektorit, muutamia mainitaksemme.

20

Lisaksi voidaan valita sellainen isäntäselukanta, joka mukauttaa insertoituneiden sekvenssien ilmenemistä tai modifioi 3a prosessoi geenituotetta toivotulla spesifisellä tavalla. Tiettyjen promoottorien ilmeneminen voidaan saada . ““ tiettyjen induserien läsnäollessa; täten geneettisesti muo katun NT-3-proteiinin ilmeneminen voidaan kontrolloida. Lisaksi eri isäntäsoluilla on luonteenomainen ja spesifinen mekanismi proteiinien translaationaaliselle ja translaation jälkeiselle prosessoinnille ja modifikaatiolle (esi;:;, gly— 30 kosylaatio, pilkkominen). Sopivat solulinjat ja isäntäsys-t&emit voidaan valita vieraan ilmennetyn proteiinin halutun modifikaation ja prosessoinnin varmistamiseksi. Esimerkiksi ilmenemistä bakteerisysteemissä voidaan käyttää tuottamaan ei-glykosyloitunut ta ydinproteiinituot että. Ilmeneminen 7 ς i . ......

Hiivassa tuettaa alykcsyloidun tuotteen, Ilirienerr.ista msa-kassoluissa voidaan, käyttää varmistamaan heterclocjisen NT-^-proteiinin luonnollinen" cjiykcsylaat io. Lisäksi eriiai- 32 105343 set vektori/isäntä-ilmenemissysteemit voivat vaikuttaa prosessointireaktichin, kuten proteolyyttiset pilkkomiset erilaisiksi alueiksi.

5 Keksinnön spesifisessä suoritusmuodossa voidaan DNA, joka koodaa preproNT-3:a, kloonata pCMV-plasmidiin, amplifioida ja sitten käyttää transfektoimaan COS-scluja kalsiumfcs-faattimenetelmällä (Chen ja Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752); NT-3-aktiivisuus voidaan sitten kerätä sclu-10 viljelmäalustasta (katso esimerkki kappaleet 6 ja 7, infra) .

On ymmärrettävää, että NGF syntetisoidaan kahdessa erilaisessa prekursorimuodossa, pitkä muoto ja lyhyt muoto (Dar-15 ling et ai., 1983, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.

48:427-483). Lyhyempi muoto on pääpiirteittäin analoginen BDNF:n ja NT-3:n prepro-muotojen kanssa. Keksinnön mukaisesti voi olla toivottavaa käyttää ekspressiosysteemejä, joissa on DNA:ta koodaava, BDNF:n tai NT-3:n analoginen 20 pitkä muoto. DNA, joka koodaa näitä pitkiä prekursorimuoto-ja, voidaan tunnistaa sekvenssoimalla cDNA tai genomiset DNA-alueet vastavirtaan valmiin BDNF:n tai NT-3:n peptidiä koodaavia alueita ja sijoittamalla avoimet translaaticnaa-liset lukuraamit. NT-3-geenisekvenssin riviin asettuminen 25 NGF- ja BDNF-sekvenssien kanssa en sallinut NT-3-proteiinin * » - pitkien ja lyhyiden prekursorien ennustamisen (kuvio 7B). Valmiin EDNF:n tai NT-3:n ekspression tehokkuus pitkistä tai lyhyistä prekursorimuedoista saattaa riippua käytetystä ekspressiosysteemistä ja vei vaihdella yhden tyyppisistä 30 solulinjasi a toiseen.

5.3.1. Ilmentyneen geenituetteen tunnistam;iner. ja puhdista.— it. i r* θ n 35 Fveiri j o ]/o oi ITT — 3 — 0 0 i"i i t oi* tettu, voidaan geeni tuote analysoida. Tämä voidaan saavuttaa määrityksillä, jotka perustuvat tuotteen fysikaalisiin 33 1 0 5 3 4 3 tai toiminnallisiin ominaisuuksiin, tuotteen radioaktiivinen leimaus mukaanluettuna, jonka jälkeen seuraa geelie-lektroforeesianalyysi.

5 Kun NT-3-proteiini kerran on tunnistettu, se voidaan eristää ja puhdistaa standardimenetelmin, kromatografia (esim. ioninvaihto, affiniteetti ja koon määrittämispylväskromato-grafia), sentrifugaatio, differentiaaliliukoisuus mukaanluettuina tai millä tahansa proteiinien puhdistamista varten 10 olevalla standarditekniikalla. Toiminnalliset ominaisuudet voidaan arvioida käyttämällä mitä tahansa sopivaa määritystä, kananpojan alkion selkäydinhermon takajuuren ganglia, neuraalipaksuntumasta johdetut tai sympaattiset ganglia-neuronit.

15 5.4. Neurotrofiini-3:n biologisen aktiivisuuden määritys

Mitä tahansa systeemiä, joka osoittaa NT-3-aktiivisuuden laadullisesti tai kvantitatiivisesti, voidaan käyttää tämän 20 keksinnön mukaisesti. Koska NT-3, päinvastoin kuin BDNF ja NGF, edistää neuriittikasvainta sekä neuraali-paksuntumasta johdetusta solmukkeisesta gangliosta että sympaattisesta gangliasta, niin jompaakumpaa näistä systeemeistä, selkäydinhermon takahermon ganglion (DRG) kasvatussysteemin li-25 säksi, voidaan käyttää NT-3-biomäärityksenä. DRG-määritys voidaan suorittaa kuten Barde et ai. (1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:1199-1203) ovat kuvanneet. Solmukkei-nen gangliomäärityssysteemi voidaan suorittaa kuten Lindsay et ai. ovat kuvanneet (1985, Dev. Biol. 112:319-328). Sym-30 paattinen gangliomäärityssysteemi voidaan suorittaa kuten Barde et ai. (1982, EMBO J., 1:549-553) ovat kuvanneet.

5.5. Neurotrofiini-3-geenit ja -proteiinit 35 Käyttämällä menetelmiä, jotka on esitetty yksityiskohtaisesti supra ja esimerkkikappaleissa 6 ja 7, infra, määritettiin seuraavat nukleiinihapposekvenssit ja niiden vas- 34 105343 taavat aminohapposekvenssit johdettiin. Määritettiin hiiren genominen NT-3-sekvenssi ja sen on kuvattu kuviossa 2. Rotan NT-3:n sekvenssi on esitetty kuviossa 7. Määritettiin ihmisen DNA NT-3-sekvenssi ja se on kuvattu kuviossa 11, 5 mikä myös esittää rotan DNA-sekvenssejä. Jokaista näistä sekvensseistä tai niiden toiminnallisista ekvivalenteista voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti. Lisäksi keksintö koskee NT-3-geenejä ja -proteiineja, jotka on eristetty porsaista, naudasta, kissasta, linnusta, hevosesta tai koi-10 rasta, samoin kuin kädellisten lähteistä ja mistä muusta tahansa lajista, jossa on NT-3-aktiivisuutta. Keksintö on lisäksi suunnattu NT-3-nukleiinihappojen myöhäisempiin vaiheisiin, jossa on ainakin 10 nukleotidiä, sellaisissa myöhäisemmissä vaiheissa on NT-3-sekvenssin hydrautuvat osat, 15 joilla on käyttöä esim. nukleiinihappohybridisaatiomääri- tyksissä, Southern ja Northern blot-analyyseissä, jne. Keksinnöstä saadaan myös NT-3-proteiini ja sen fragmentit ja johdannaiset aminohapposekvenssien mukaan, jotka on esitetty kuvioissa 2, 7 ja 11 tai niiden toiminnalliset ekviva-20 lentit. Keksinnöstä saadaan myös NT-3-proteiinien fragmentit tai johdannaiset, mihin kuuluu antigeeninen (antigeeniset) determinantti (determinantit) tai sellaiset, jotka o-vat toiminnallisesti aktiivisia. Kuten tässä on käytetty, toiminnallisesti aktiivinen tarkoittaa, että on positiivi-25 nen aktiivisuus tunnetun NT-3-toiminnan määrityksissä, e-sim. kananpojan alkion DRG-, solmukkeiset ganglio- ja sympaattiset gangliomääritykset.

Esimerkiksi kuvioissa 2, 7 ja 11 kuvatut nukleiinihapposek-30 venssit voidaan muuttaa substituutioilla, lisäyksillä tai deleetioilla, jolloin saadaan toiminnallisesti ekvivalentit molekyylit. Johtuen nukleotidin koodaavien sekvenssien degeneraatiosta voidaan muita DNA-sekvenssejä, jotka koodaa-vat pääpiirteittäin samaa aminohapposekvenssiä kuin kuvi-35 oissa 2, 7 ja 11 on kuvattu, käyttää toteutettaessa tätä keksintöä käytännössä. Näihin kuuluvat, mutta ei rajoitu nukleotidisekvenssit, joissa on kaikki tai osa kuvioissa 2, 35 105343 7 ja 11 kuvatuista NT-3-geeneistä, jotka on muutettu erilaisten kodonien, jotka koodaavat toiminnallisesti ekvivalenttia aminohappojäännöstä sekvenssin sisällä, substituutiolla, täten tuottaen hiljaisen muutoksen. Samalla lailla 5 keksinnön NT-3-proteiineihin tai sen fragmentteihin tai • johdannaisiin kuuluu, mutta ei rajoitu, sellaiset joissa on primäärinen aminohapposekvenssi, koko aminohapposekvenssi tai osa siitä pääasiallisesti kuin kuvioissa 2, 7 ja 11 on kuvattu, muutetut sekvenssit mukaanluettuina, joissa toi-10 minnallisesti ekvivalentit aminohappojäännökset susbstitu-oidaan jäännösten sijaan sekvenssin alueella johtaen hiljaiseen muutokseen. Esimerkiksi sekvenssin alueella voidaan yksi tai useampia aminohappojäännöksiä substituoida toisella aminohapolla, jolla on samanlainen polaarisuus, joka 15 toimii toiminnallisena ekvivalenttina, johtaen hiljaiseen muutokseen. Substituutiot aminohapolle sekvenssissä voidaan valita sen luokan, johon aminohappo kuuluu, muista jäsenistä. Esimerkiksi ei-polaarisiin (hydrofobinen) aminohappoihin kuuluu alaniini, leusiini, isoleusiini, väliini, pro-20 liini, fenyylialaniini, tryptofaani ja metioniini. Polaarisiin neutraaleihin aminohappoihin kuuluu glysiini, seriini, treoniini, kysteiini, tyrosiini, asparagiini ja glutamiini. Positiivisesti varattuihin (emäksisiin) aminohappoihin kuuluu arginiini, lysiini ja histidiini. Negatiivisesti varat-25 tuihin (happamiin) aminohappoihin kuuluu aspartiinihappo ja glutamiinihappo. Lisäksi keksinnön piiriin kuuluvat NT-3-proteiinit ja sen fragmentit tai johdannaiset, joita modi-.fioidaan erilailla translaation aikana tai sen jälkeen, e-sim. glykosylaatiolla, proteolyyttisellä pilkkomisella, si-30 doksella vasta-ainemolekyyliin tai muuhun solun ligandiin, jne.

Lisäksi annettu NT-3 voidaan mutatoida in vitro tai in vivo translaatio-, aloitus- ja/tai terminaatiosekvenssien luomi-35 seksi ja/tai tuhoamiseksi tai muunnelmien luomiseksi kooda-usalueille ja/tai muodostamaan uusia restriktioendonukleaa-sikohtia tai tuhoamaan jo olevia kohtia, helpottamaan lisä- 36 105343 modifigaatioita in vitro. Mitä tahansa alalla tunnettua mu-tageneesitekniikkaa voidaan käyttää, in vitro kohdennettu mutageneesi (Hutchinson, et ai., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551) mukaanluettuna mutta ei siihen rajoittuen, TAB-link-5 kereiden käyttäminen (Pharmacia), jne.

5.6. Anti-neurotrofiini-3-vasta-aineiden luominen

Keksinnön mukaisesti voidaan NT-3-proteiinia tai sen frag-10 mentteja tai johdannaisia käyttää immunogeeneinä luomaan anti-NT-3-vasta-aineita.

Jotta vielä parannettaisiin todennäköisyyttä tuottaa anti-NT-3 immuunivaste, voidaan NT-3:n aminohapposekvenssi ana-15 lysoida, jotta tunnistetaan molekyylin osat, joilla voi olla yhteyttä kasvaneen immunogeenisyyden kanssa. Esimerkiksi aminohapposekvenssille voidaan tehdä tietokoneanalyysi, jotta tunnistetaan pinnan epitoopit Hopp ja Woods menetelmän mukaan (1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824-20 3828), jota on menestyksekkäästi käytetty tunnistamaan He patitis B-pinta-antigeenin antigeenisiä peptidejä. Vaihtoehtoisesti voitaisiin erilaisista lajeista olevia johdettuja NT-3 aminohapposekvenssejä verrata ja suhteellisesti ei-homologiset alueet tunnistaa; nämä ei-homologiset alueet 25 voisivat todennäköisesti olla immunogeenisiä yli erilaisten « lajien.

Valmistettaessa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu NT-3:a vastaan, voidaan käyttää mitä tahansa tek-30 nilkkaa vasta-ainemolekyylien tuottamiseksi jatkuvilla solulinjoilla viljelmissä. Esimerkiksi, hybridoma-tekniik-ka, jonka alunperin kehittivät Kohler ja Milstein (1975, Nature 256:495-497), samoin kuin trioma-tekniikka, ihmisen B-soluhybridoma-tekniikka (Kozbor et ai., 1983, Immunology 35 Today 4:72) ja EBV-hybridoma-tekniikka ihmisen monoklonaa-listen vasta-aineiden tuottamiseksi (Cole et ai., 1985 teoksessa "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan 37 105343 R. Liss, Inc. ss. 77-96) ja sen kaltaiset kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

Terapeuttista käyttöä varten olevat monoklonaaliset vasta-5 aineet voivat olla ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita • tai kimeerisiä ihminen-hiiri (tai muut lajit) monoklonaali sia vasta-aineita. Ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tehdä millä tahansa lukuisista alalla tunnetuista tekniikoista (esim. Teng et ai.r 1983, Proc. Natl. Acad.

10 Sei. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et ai., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et ai., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Kimeerisiä vasta-ainemolekyylejä voidaan valmistaa niin, että niissä on hiiren antigeeniä sitova domeeni ihmisen vakioalueiden kanssa (Morrison et ai., 1984, Proc.

15 Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:6851, Takeda et ai., 1985,

Nature 314:452).

Erilaisia alalla tunnettuja menetelmiä voidaan käyttää polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi NT-3:n epi-20 toopeille. Vasta-aineen tuottamiseksi voidaan erilaisia isäntäeläimiä immunisoida Nt-3-proteiini-injektiolla tai sen fragmentilla tai johdannaisella, kanit, hiiret, rotat, jne. mukaanluettuina, mutta ei niihin rajoittuen. Erilaisia adjuvantteja voidaan käyttää nostamaan immunologista 25 vastetta riippuen isäntälajeista ja niihin kuuluvat, mutta ei rajoitu, Freudin (täydellinen ja ei-täydellinen), mine-raaligeelit, kuten alumiinihydroksidi, pinta-aktiiviset aineet, kuten lysolesitiini, pluroniset polyolit, polyanio-nit, peptidit, öljyemulsiot, avaimenreikä maljakotilo he-30 mosyaanit, dinitrofenoli ja mahdollisesti hyödylliset ih- .. , misen adjuvantit, kuten BcG (Bacille Calmette-Guerin) ja . Corynebacterium parvum.

Vasta-aineen molekylaarinen klooni NT-3-epitooppiin voidaan 35 valmistaa tunnetuilla tekniikoilla. Rekombinantti-DNA-me- todologiaa voidaan käyttää (katso esim. Maniatis et ai., 1982, Molecular Clning, A Laboratory Manual, Cold Spring 38 105343

Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) rakennettaessa nukleiinihapposekvenssejä, jotka koodaavat monoklonaa-lista vasta-ainemolekyyliä tai sen antigeeniä sitovaa aluetta.

5

Vasta-ainemolekyylit voidaan puhdistaa tunnetuilla tekniikoilla, esim. immunoabsorptio- tai immunoaffiniteettikroma-tografia, kromatografiset menetelmät kuten HPLC (high performance liquid chromatoraphy) tai niiden yhdistelmiä, jne.

10

Vasta-ainefragmentit, joissa on molekyylin idiotyyppi, voidaan luoda tunnetuin tekniikoin. Sellaisiin fragmentteihin kuuluvat esimerkiksi, mutta ei rajoitu: F (ab ' ) 2-fragmentti, joka voidaan tuottaa vasta-ainemolekyylin pepsiinipilkkomi-15 sella; Fab'-fragment!t, jotka voidaan tuottaa pelkistämällä F (ab') .-fragmentin disulfidisiltoja ja 2 Fab- tai Fab-fragmentit, jotka voidaan tuottaa käsittelemällä vasta-ainemolekyyliä papaiinilla ja pelkistävällä aineella.

20 5.7. Keksinnön hyödyllisyys Tämä keksintö koskee NT-3:n nukleiinihapposekvenssiä ja pääpiirteittäin puhdasta proteiinia, peptidifragmentteja tai siitä tuotettuja johdannaisia. NT-3:a voidaan tuottaa 25 riittävinä määrinä diagnostisiin ja terapeuttisiin sovellutuksiin. Samoin anti-NT-3-vasta-aineita ja NT-3 nukleiini-happokoettimia voidaan käyttää diagnostisissa ja terapeuttisissa sovellutuksissa. Useimpia tarkoituksia varten on edullista käyttää NT-3-geenejä tai geenituotteita samoista 30 lajeista diagnostisiin tai terapeuttisiin tarkoituksiin, vaikka NT-3:n ristilaji-käyttäminen voi olla hyödyllistä keksinnön spesifisissä suoritusmuodoissa. - 5.7.1. Diagnostiset sovellutukset 35 Tätä keksintöä, joka koskee nukleiinihappoja, jotka koodaavat NT-3:a ja siitä tuotettuja proteiineja, peptidifrag- 39 105343 mentteja tai johdannaisia, samoin kuin vasta-aineita, jotka on suunnattu NT-3-proteiinia, peptidejä tai johdannaisia vastaan, voidaan käyttää diagnosoimaan hermoston sairauksia ja häiriöitä, jotka saattavat liittyä NT-3-ilmenemisen mal-5 Iin muutoksiin.

Keksinnön erilaisissa suoritusmuodoissa voidaan NT-3-geene-jä ja sen kaltaisia nukleiinihapposekvenssejä ja alasek-venssejä, komplementaariset sekvenssit mukaanluettuina, 10 käyttää diagnostisissa hybridisaatiomäärityksissä. NT-3-nukleiinihapposekvenssejä tai alasekvenssejä, joissa on noin 15 nukleotidiä, voidaan käyttää hybridisaatiokoettimi-na. Hybridisaatiomäärityksiä voidaan käyttää havaitsemaan, ennustamaan, diagnosoimaan tai tarkkailemaan olosuhteita, 15 häiriöitä tai sairaustiloja, jotka liittyvät muutoksiin KT- 3-ilmenemisessä, mukaanluettuina erityisesti olosuhteet, jotka johtavat tuntohermon tuhoamiseen. Sellaisiin sairauksiin ja olosuhteisiin kuuluu, mutta ei rajoitu, CNS-trauma, infarkti, infektio, degeneratiivinen hermosairaus, pahan-20 laatuisuus tai leikkauksen jälkeiset muutokset, joihin kuuluu, mutta ei rajoitu Alzheimerin tauti, Parkinsonin tauti ja Huntington's Chroea. Kokonais-RNA:sta potilaan kudosnäytteestä voidaan esimerkiksi määrittää NT-3 m.RKA:n läsnäolo, jolloin NT-3 mRNA-määrän muutos osoittaa neuronaalista 25 degeneraatiota.

4

Keksinnön vaihtoehtoisissa suoritusmuodoissa voidaan vasta-aineita, jotka on kohdistettu NT-3-proteiinia, peptidifrag-mentteja tai -johdannaisia vastaan, käyttää diagnosoimaan . 30 hermoston sairauksia ja häiriöitä, erityisesti sensoriset häiriöt ja verkkokalvon degeneratiiviset sairaudet, samoin kuin supra luetellut häiriöt ja sairaudet. Keksinnön vasta-aineita voidaan käyttää, esimerkiksi, in situ hybridisaa-tiotekniikoissa käyttämällä kudosnäytteitä, jotka on saatu 35 potilaasta, joka on sellaisen arvioinnin tarpeessa. Lisäesimerkissä keksinnön vasta-aineita voidaan käyttää ELISA-menetelmissä havaitsemaan ja/tai mittaamaan NT-3-määriä, 40 105343 jotka on läsnä kudos- tai nestenäytteissä? samalla lailla voidaan keksinnön vasta-aineita käyttää Western blct-ana-lyysissä havaitsemaan ja/tai mittaamaan NT-3-määriä, jotka on läsnä kudos- tai nestenäytteissä.

5

Keksinnön lisäsuoritusmuodoissa voidaan NT-3-proteiinia, peptidifragmentteja tai johdannaisia käyttää diagnosoimaan hermoston sairauksia ja häiriöitä. Erityisessä suoritusmuodossa, eikä millään muotoa rajoittavasti, voidaan käyttää 10 leimattua NT-3-prcteiinia tai peptidi-fragmentteja tunnistamaan kudokset tai solut, jotka ilmentävät NT-3-reseptori-a, jotta tunnistetaan NT-3-reseptori-ilmenemisen poikkeamisia ja siis potentiaalisia epätavallisuuksia kudoksessa tai NT-3:n soluvasteessa.

15 5.7.2. Terapeuttiset sovellutukset Tätä keksintöä, joka koskee nukleiinihappoja, jotka koodaa-vat NT-3:a ja siitä tuotettuja proteiineja, peptidifrag-20 mentteja tai johdannaisia, samoin kuin vasta-aineita, jotka on suunnattu NT-3-proteiinia, peptidejä tai johdannaisia vastaan, voidaan käyttää diagnosoimaan hermoston sairauksia ' ja häiriöitä, jotka saattavat liittyä NT-3-ilmenemisen mal lin muutoksiin tai jotka voivat hyötyä NT-3:lle tai anti-25 NT-3-vasta-aineille altistamisesta.

Keksinnön erilaisissa suoritusmuodoissa voidaan NT-3-prote-iinejä, peptidifragmentteja tai johdannaisia antaa potilaille, joissa hermoston on tuhonnut trauma, kirurgia, ve-30 rettömyys, infektio, metabclinen sairaus, ravinnollinen va- * javaisuus, pahanlaatuisuus tai myrkylliset aineet. Keksin-. nön erilaisissa spesifisissä suoritusmuodoissa voidaan NT- 3 antaa paikallisesti tuntohermoille, jotka on rikottu, neuronit selkäydinhermon takajuuressa tai missä tahansa 35 seuraavista kudoksista mukaanluettuina, lautta ei rajoittuen: pclvekkeinen, chimcluun kallioluuhun liittyvä ja sol-mukkeinen ganglia; VIII:nner. aivohermon vestibuloacusticus 41 105343 kompleksi; trigeminaalisen ganglion ventrolateraalisen kohdan maksillaaris-mandibulaarinen lohko, keksiaivojen trigeminaalinen tumake ja sympaattinen ganglia. Saattaa olla toivottavaa antaa NT-3:n kaltaisia peptidejä tai NT-5 3-proteiinia adsorpoimalla membraanille, esim. silastinen ' membraani, joka voitaisiin istuttaa rikkoutuneen hermon läheisyyteen. Tätä keksintöä voidaan myös käyttää esimerkiksi jouduttamaan diabeettisestä hermosairaudesta kärsivien potilaiden selviytymistä, esim. mononeuropathy multiplex 10 ja diabeettinen perifeerinen hermosairaus.

Diabeettisen hermosairauden lisäksi voidaan NT-3:a ja NT-3:n kaltaisia peptidejä käyttää myös käsittelemään muita ääreishermosairauksia seuraavat mukaanluettuina, mutta ei 15 niihin rajoittuen: viruksiin luiittyvät hermosairauöet, immuunikadon (AIDS) kaltaiset mukaanluettuina, mononukleoosi moniherm.otulehduksen kanssa, viruksen aiheuttama maksatulehdus monihermotulehduksen kanssa; Guillian-Barre-synd-rooma; lihamyrkytyksen (botulismus) kaltainen hermosairaus; 20 toksinen monihermosairaus, johon kuuluvat lyijyyn ja alkoholiin liittyvät hermosairaudet; ravinnolliset hermcsairau-det, johon kuuluvat puoliäkillinen yhdistynyt degeneraatio; verisuonihermostosairaus, johon kuuluu hermostosairaus, joka liittyy systeemiseen punahukkaan; lihakseen liittyvä 25 hermostosairaus; syöpäinen hermostosairaus; puristushermos-' tosairaus (esim. käden puutuminen) ja perinnölliset hermos- tosairaudet. Perinnöllisiin hermostosairauksiin, joita voidaan käsitellä käyttämällä NT-3- tai NT-3:n kaltaisia proteiineja, kuuluu pohjeluun lihaksen surkastuminen, perhee-* 30 seen liittyvä perinnöllinen autonomisen hermoston sairaus ja etenevä liikasvun hermostosairaus.

Keksinnön muissa suoritusmuodoissa voidaan NT-3-proteiinia tai peptidifragm.entteja tai niistä johdettuja johdannaisia 35 käyttää käsittelemään synnynnäisiä olotiloja tai hsrmodege-neroituneita häiriöitä, Alzheimerin tauti, Parkinsonin tauti, multippeliskleroosi, amyotrofinen lateraaliskleroosi ja 42 105343

Huntington's chroe mukaanluettuina, mutta ei näihin rajoittuen.

Keksinnön spesifisessä suoritusmuodossa NT-3-proteiinin, 5 tai peptidifragmenttien tai niistä johdettujen johdannaisten antamista voidaan käyttää kudoksen kirurgisen istuttamisen yhteydessä Alzheimerin taudin ja/tai Parkinsonin taudin käsittelyssä. Kuten kappaleessa 11 on näytetty, infra, NT-3 edistää dopaminergisten neuronien selviämistä; koska 10 dopaminergiset neuronit tuhotaan Parkinsonin taudissa, voidaan NT-3:a käyttää Parkinsonin taudin käsittelymenetelmissä, mihin sisältyy että annetaan tehokas määrä NT-3:a potilaalle, joka on sellaisen käsittelyn tarpeessa. On osoitettu, että noin 35 % Parkinsonin taudin potilaista kärsii 15 Alzheimerin tyyppisestä dementiasta; keksinnön mukaisesti tuetettu NT-3 vei esottautua hyödylliseksi yhden aineen terapiaksi tähän sairauskompleksiin. Samalla lailla, keksinnön mukaisesti tuotettua NT-3:a voidaan käyttää terapeuttisesti käsittelemään Alzheimerin tautia Downin synd-20 rooman yhteydessä. Lisäksi, kuten kappaleessa 12, infra, on osoitettu, NT-3:a ilmennetetään korkeina tasoina hermoston kehittymisen ja erilaistumisen aikana; siispä NT-3:a voidaan käyttää hermoston kehityshäiriön käsittelyssä, kuten Downin syndrooma ja myös käsiteltäessä sairauksia, jotka 25 liittyvät erikoistuneen solun muuttumiseksi erikoistumattomaksi, kuten pahanlaatuisuudet tai häiriöissä, jotka voivat hyötyä hermoston uudistumisesta. Keksinnön mukaisest tuotettua NT-3:a voidaan käyttää erilaisten dementioiden samoin kuin synnynnäisten oppimishäiriöiden käsittelyssä.

30

Keksinnön muissa suoritusmuodoissa voidaan MT-3-prcteiinia, ' fragmentteja tai johdannaisia käyttää yhdessä muiden syto- kinien kanssa, jolloin saadaan toivottu neurotrofinen vaikutus. Keksinnön mukaisesti NT-3:a voidaan esimerkiksi, 35 mutta ei millään muotoa rajoituksena, käyttää yhdessä toisen aineen kanssa, esimerkiksi NGF tai BDNF, jotta saavutetaan synergistinen stimuloiva vaikutus neuronien kasvuun 43 105343 ja/tai ylläpitämään selviämistä ja/tai palauttamaan tai lisäämään toimintoja siellä, missä yhteisvaikutus tulkitaan tarkoittamaan, että NT-3-proteiini, peptidifragmentin tai johdannaisen ja toisen aineen yhdistelmän vaikutus saavut-5 taa vaikutuksen, joka on suurempi kuin sama määrä jompaa-* kumpaa ainetta käytettynä yksittäin. On muodostunut kuva, että NT-3 voi toimia synergisesti muiden CNS-johdettujen peptiditekijoiden kanssa, joiden kasvu, kehitys, erilaistuneiden toimintojen ylläpitäminen ja suuren joukon neuronaa-10 listen alapopulaatioiden selviäminen keskushermostossa täytyy vielä luonnehtia täydellisesti. Vaihtoehtoisesti NT-3:n vaikutukset ja toinen neurotrofinen aine voivat olla additiivisia.

15 Lisäksi om muodostunut kuva, perustuen NT-3-molekyylin täydelliseen luonnehtimiseen, että voidaan kehittää NT-3:n uudet peptidifragmentit, johdannaiset tai mutant it, jotka kykenevät toimimaan joidenkin tai kaikkien NT-3:n biologisten toimintojen antagonistina. Sellaiset antagonistit vci-20 vat olla hyödyllisiä tuntohermojen selektiivisessä poista-misesa, esimerkiksi kroonisten kipusyndroomien käsittelyssä .

Vielä eräässä keksinnön suoritusmuodossa NT-3-proteiinia 25 tai peptidifragmentteja tai niiden johdannaisia vastaan f : suunnattuja vasta-aineita voidaan antaa potilaille, jotka kärsivät erilaisista neurologisista häiriöistä ja sairauksista ja jotka ovat sellaisen käsittelyn tarpeessa. Esi-'.orkiksi potilaat, jotka kärsivät NT-3:n ylimääräisestä tuo-30 testa, saattavat olla sellaisen käsittelyn tarpeessa. Anti" NT-3-vasta-aineita voidaan käyttää estämään tuntohermojen poikkeuksellista regeneraatiota (esim. leikkauksen jälkeen.) tai kuten supra keskusteltiin, kroonisten kipusyndroomien käsittelyssä.

NT-3:n kudosjakaantuminen, kuten kuvattiin kappaleissa 6 Ja 7 infra, osoittavat, että aivoissa, munuaisissa, sydämessä 35 44 105343 ja pernassa ilmennetään korkeammat tasot NT-3 mRNA:ta muiden kudosten kesken· NT-3, jota tuotetaan ei-neuraaleissa kudoksissa saatta olla tai ei saata olla identtinen NT-3:n kanssa, jota ilmennetään aivoissa. Yksittäinen NT-3-laji 5 voi toimia sekä neuraaleissa että ei-neuraaleissa kudoksissa; häiriöt NT-3:n ilmenemisessä saattavat olla sellaisten sairauksien takana, jotka vaikuttavat hermostoon yhtä hyvin kuin muihin elinsysteemeihin. Vaihtoehtoisesti läheisesti sukua olevat NT-3-perheen molekyylit saattavat edistää eri-10 laisia toimintoja neuraali- ja ei-neuraalikudcksissa. Keksinnön NT-3-molekyylit voivat siksi olla hyödyllisiä sellaisten sairauksein käsittelyssä, jotka vaikuttavat neuraa-liin samoin kuin ei-neuraalien kudosten neuraaliin säätelyyn, sydän, veren muodostumiseen liittyvät, munuaiseen 15 liittyvät ja retikuloendoteelijärjestelmään liittyvät systeemit erityisesti mukaanluettuina.

Lisäksi, kuten kappaleessa 6, infra, on valaistu, NT-3-ilmeneminen kasvaa kypsymättömissä eläimissä verrattuna 20 aikuisiin eläimiin. Keksinnön mukaisesti NT-3-voi olla erityisen hyödyllinen kehityshäiriöitä käsiteltäessä tai vaihtoehtoisesti indusoitaessa hermoston uudistusta CNS-vauricn jälkeen.

25 5.8. Farmaseuttiset koostumukset

Keksinnön aktiiviset koostumukset, jotka voivat sisältää ,ΝΤ-3-geenin kaikki tai osan tuotteista, proteiini, peptidi-fragmentit tai niistä tuotetut johdannaiset tai vasta-ai-30 neeet (tai vasta-aine-fragmentit), jotka on suunnattu NT- »

3-prcteiinia, peptidifragmentteja tai johdannaisia vastaan • tai NT-3-yhdistelmä ja ainakin yksi toinen aine, kuten NGF

tai BDNF, mukaanluettuina, voidaan antaa missä tahansa steriilissä biologisesti soveltuvassa farmaseuttisessa kanta-35 jassa, suolaliuos, puskuroitu suolaliuos, daktsrcesi ja vesi mukaanluettuina, mutta ei näihin rajoittuen.

45 105343 NT-3-proteiini, peptidifragmentti tai johdannainen saattaa sisältää aminohapposekvenssin tai sen alasekvenssin, joka on pääpiirteittäin kuten kuvioissa 2, 7 tai 11 on kuvattu; saattaa olla edullista käyttää NT-3-proteiinia, joka kccs-5 tuu erityisesti, koko aminohapposekvenssi tai osa siitä * aminohaposta noin 140 aminohappoon noin 258, kuten kuviossa 2 on kuvattu, aminohaposta noin 1 aminohappoon noin 110 kuviossa 7 tai ensimmäisestä aminohaposta, joka on merkitty "kypsä" kuviossa 11, siinä kuvatun peptidisekvenssin lop-10 puun tai toiminnallisesti ekvivalentti sekvenssi, koska tämän sekvenssin uskotaan sisältävän NT-3-molekyylin toiminnallisen osan. NT-3 voidaan johtaa sekvensseistä, jotka vastaavat minkä tahansa sopivan lajin KT-3-geenejä, ihminen, sika, rotta, kananpoika, lehmä, koira, lammas, vuohi, 15 kissa, kani, jne. mukaanluettuina, mutta ei näihin rajoittuen .

NT-3-proteiinin, peptidifragmentin, jchdannnaisen tai vasta-aineen, joka on tehokas käsiteltäessä tiettyä häiriötä 20 tai olotilaa, määrä riippuu häiriön tai olotilan luonteesta ja se voidaan määrittää standardi kliinisillä tekniikoilla. Milloin mahdollista, en toivottavaa määrittää keksinnön annosvastekäyrä ja farmaseuttiset koostumukset ensin in vitro, esim. supra kuvatussa KT-3 biomäärityssysteemeis-25 sä ja sitten hyödyllisissä eläinmallisysteemeissä ennen ih-' reisissä testaamista. Ferustuen in vitro tieteihin keksinnön spesifisessä suoritusmuodossa farmaseuttinen koostumus, jo-.ka on tehokas edistämään tuntoneuronien selviämistä, saattaa tuottaa paikallisen NT-3-proteiinikonsentraation, joka 30 on noin 0,1-10 ug/ml.

Sisäänvientimenetelmiin kuuluu, mutta ei rajoitu, ihonsi- säinen, lihaksensisäinen, vatsaontelon sisäinen, laskimon sisäinen, ihon alainen, suun kautta tai ner.änsisäinen. Li-35 saksi voi olla toivottavaa viedä keksinnön farmaseuttiset koostumukset sisään keskushermostoon millä tahansa sopivalla tavalla, mahansisäinen ja peitinkalvon sisäinen injektio 46 105343 mukaanluettuina; mahan sisäistä injektiota voidaan helpottaa mahan sisäisellä katedrilla, esimerkiksi kiinnitettynä säiliöön, kuten Ommaya-säiliö.

▼ 5 Lisäksi voi olla toivottavaa antaa keksinnön farmaseuttiset koostumukset paikallisesti alueelle, joka tarvitsee käsittelyä; tämä voidaan saavuttaa esimerkiksi, mutta ei millään tavoin rajoittuen, paikallisella infuusiolla leikkauksen aikana, injektiolla, katedrin avulla tai siirrännäisen a-10 vulla, mainitun siirrännäisen ollessa huokoista, ei-huo-koista tai hyytelömäistä materiaalia, membraanit, kuten sialastinen membraanit tai kuidut mukaanluettuina.

Keksinnöstä saadaan myös farmaseuttiset koostumukset, jotka 15 koostuvat NT-3-proteiineista, peptidifragmenteista tai johdannaisista, joita annetaan liposomien, mikropartikkelien tai mikrokapselien kautta. Keksinnön erilaissa suoritusmuodoissa saattaa olla hyödyllistä käyttää sellaisia koostumuksia, joilla saavutetaan jatkuvasti vapautuva NT-3:n ja 20 NT-3:n kaltaisten tuotteiden vapautuminen.

On muodostettu kuva, että saattaa olla mahdollista viedä sellaisia soluja, jotka aktiivisesti tuottavat NT-3:a, kt-3:n kaltaisia aineita, NT-3-antagonisteja tai anti-NT-3-25 vasta-aineita, alueille, jotka tarvitsevat kohonneita tai vähentyneitä NT-3-konsentraatioita.

6. Esimerkki: Hiiren neurotrofiini-3-geenin kloonaus ja luonnehtiminen 30 6.1. Materiaalit ja menetelmät 6.1.1. Polymeraasiketjureaktio 2 oligonukleotidialuketta syntetisoitiin 2 aminohapposekvenssin, jotka ovat säilyneet BDNFissä ja kaikissa tunne-35 tuissa NGF:ssä, perusteella (Leibrcck et ai., 198S, Nature 341:149-152). Sense- (tai 5') alukkeen sekvenssi oli GGGGA-s TCCGC GGI TGY MGI GGI ATK GA (aluke 1, IUFAC nimistö, ]> 47 105343 inosiini) ja siinä on BamHI- ja SacII-kohdat ja antisense-(tai 3’) aluke TCGAATTCTAG AT ICK IÄT RAA ICK CCA ja siinä on EcoRI- ja Xbal-kohdat (aluke 2). Suoritettiin PCR (Saiki et ai., 1985, Science 230:1350-1354) 1 pg:lla hiiren geno-5 mistä DNA:ta käyttämällä Perkin-Elmer Cetus termistä kier-* toprosessia ja Taq-polymeraasia (Gene Amp'*) . 4 kierroksen jälkeen hybridisaatiolämpötilan ollessa 45 *C suoritettiin jäljelle jääneet 36 kierrosta hybridisaatioilla 49'C:ssa. Saadut amplifioidut DNA-tuotteet, jotka vastasivat odotet-10 tua kokoa (137 emäsparia) eluoitiin akryyliamidigeelistä, amplifioitiin uudestaan ja pilkottiin HindII:lla ja Apal: 11a, edellinen pilkkoi hiiren NGF:ää ja jälkimmäinen hiiren BDNF:ää. Pilkkcmatcn DNA eluoitiin ja amplifioitiin asymmetrisesti (Innis et ai., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei.

15 U.S.A. 85:9436-9440) ja sekvensseitiin (Sanger et ai., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3918-3921) käyttämällä alukkeita 1 ja 2. Perustuen täten saatuun sekvenssiin EYntetisoitiin 2 lisä-sensealuketta, jotka vastasivat nukleotidiä 808-822 (aluke 3) ja 824-844 (aluke 4), johon li- 2 0 sättiin Sali- ja Pstl-kohdat. RNA uutettiin aikuisen hiiren aivoista, maksasta ja lihaksista (Okayama et ai., 1937,

Meth. Enzymology 154:3-28) ja käänteis-transkriptoitiin käyttämällä antisense- (5’) aluketta CGGATCuGAATToTGCAo- 'T)..v (aluke 5) , joka oli suunniteltu sopivan yhteen 3 2 3 ' * I PoXy(A)-Viäntitsn ksnsss siinä oli. Kloonin sRL«]nd.3t c j. · lie, EcoRI:1le ja Pstl:lle (Leibrock et ai.» 1989, Nature 1^1:149-152'. Nämä cDNA:t PCR-amplifioitiin ensin käyttäjällä alukkeita 3 ja 5 ja amplifioitiin uudelleen käyttä--ällä alukkeita 4 ja 5. Suoritettiin Southern blot analyysi • , otteille, i o t k a saatiin tästä viimeisestä reaktiosta ja ‘hybridise! tiin 5‘?-pää-leimatun oi igcnuklectidm kanssa,

10 k a vastasi nukleotidejä 879-893. Täten s.,A

l-agmentit kloonattiin Bluescripf SK+-vektoriin (Stratage-35 ^-) ja pisintä saatua inserttiä (460 emäsparia; käytettiin

Sfe'ulomaan EMEL3-hiiren genomista kirjastoa . ν-^ο.ΐνβ^..,, . ^^y Uttiin 2 sositiivista kloonia ja yhden kloonin DNA pilkottiin erilaisilla restriktioentsyymeillä . Restr j.r.t-.of 1 ag- 48 105343 senttejä koetettiin 460 emäsparin insertin kanssa; 770 emäsparin Hindlll- ja 4000 emäsparin Pstl-fragmentti sub-kloonattiin Bluescript’ SK+:hen. Koko Kindlll-sekvenssi, jota on 3' ja 5' laajennettu käyttämällä Pstl-fragmenttia, 5 nähdään.

6.1.2. Northern blotting

Aikuisista naaraskudcksista uutettiin kckcnais-RNA (Ckayama 10 et ai., 1987, Meth. Enzym. 154:3-28) ja tehtiin elektroforeesi 1,3 % formaldehydiä sisältävissä agarocsigeeleissä (Hehrach et ai., 1977, Biochem.. 16:4743-4751). RNA siirrot-tiin nailonm.embraaneille (Hybond-N, Am.ersham) ja hybridi-soitiin yön yli 42‘C:ssa 1 ml:ssa 200 mM natrium,fosfaatti a 15 (pH 7,2), jossa oli 40 % formam.idia, 5 x Denhardtin liuoj.^ ja 200 ug.ml'1 denaturoitua lohen sperma-DNA: ta. Käytetty koetin oli KP~leimattu, satunnaisesti alukkeita, kaksois--juosteinen koetin (Feinberg et ai., 1979, Anal. Biochem. 137:266-267), joka vastasi nukleiinihappoja 319-1093 (kuv -20 2). Spesifinen aktiivisuus oli 1,3 x 105 cpm x pg': ja 10' lisättiin hybridisaatiopuskuriin. Pestiin 60 min 60^0:£sa 0,1 x S3C:ssä, jossa oli 0,5 % SDS:ää. Suodattimia pidettiin 5 päivää -70C:ssa vahvistuvanjostimien kanssa.

25 6.1.3. Neurotrofiini-3:n ilmeneminen

Syntetisoitiin oligonuklectiöit, jotka vastasivat ensi: m.?,· ___ siä 19 nukleotidiä (plus EcoRI-kohta) ja viimeista 19 nukleotidiä (plus Bam.HI-kchta) kuviossa 2 kuvatusta «v. t _ 30 lukuraamista. PCR-amplifikaation jälkeen, kuvattua Peti nomista fragmenttia (kuvio 2) käytetty templaattina, saat. " ' tuote kloonattiin ekspressiovektorin pCMV EcoRI-BamKI-kob- taan (Andersen et ai., 1989, J. Bicl. Chem. 264:8222-8229;. Määritettiin NT-3-insertin nukleotidisekver.ssi pCMV:llä.

35 COS-1 -solut trar.sf ektoitiin käyttämällä kalsiumf ositat netelmaä (Chen ja Okayava, 1987, Mol. Cell Biol. 7:2745-2752) ja alusta kerättiin kuten aikaisemmin on kuvattu 49 105343 (Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149-152). Käytetyt kontrollialustat saatiin sen jälkeen, kun oli käsitelty COS-l-soluja kalsiumfosfaatilla tai pCMV/NT-3-rakenteella, josta oli NT-3-lopetuskodoni deletoitu. Molemmista alus-5 toista puuttui biologinen aktiivisuus 1: 50-laimennuksella.

- Solmukkeinen ganglia erotettiin ja neuronit viljeltiin 24- kaivon maljoilla (Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 122:319-328) ja BDNF puhdistettiin sian aivoista (Kofer ja Barde, 1988, Nature 331:261-262).

10 6.2.Tulokset la keskustelu Pääongelma luonnehdittaessa neurotrofiinitekijoitä on niiden äärimmäisen alhainen runsaus. Sekä NGF että BDNF 15 luonnehdittiin käyttämällä proteiinin puhdistustekniikoita, jotka perustuvat biologisiin määrityksiin tarkkailemalla niiden aktiivisuutta (Cohen et ai., 1960, Proc. Natl. Λcad. Sei. U.S.A. 46:302-311; Barde et ai., 1982, EMEO J. 1:5·:?-553). Tämä lähestyminen oli mahdollista NGF:llä, koska tätä 20 proteiinia oli epätavallisen runsaasti aikuisen uroehii:a.:.

alaleuan rauhasessa ja BDNF:llä viime kädessä, koska saatavilla oli käytännöllisesti katsoen rajoittamattomasti piisaan aivokudosta. Sekvenssin samankaltaisuudet, jotka havaittiin NGF:ssä ja BDNF:ssä, antavat olettaa, että vei', li. 25 käyttää erilaista strategiaa luonnehtimaan muita jäseniä sellaisesta, joka on määritetty olevan geeniperhe (Leiki o ...

et ai., 1989, Nature 341:149-152). Hiiren NGF- ja BDNF-aminohappe- (a.a) sekvenssien yksityiskohtainen vertailu paljasti 2 kuuden a.a.:n jaksoa (alleviivattu kuviossa 2), 30 jotka näyttivät erityisen soveltuvilta lähestymiseen, jvc_a käytetään oligonukleotidialukkeita polymeraasiketjureaktiossa (PCR) (Saiki et ai., 1985, Science 230:1350-1354). Käytettiin hiiren genomista templaattia, koska NGF- ja BDNF-geeneissä ei introni keskeytä eksenia, joka koodaa 35 biologisesti aktiivisia proteiineja. Tämä lähestymistcipa ΐ Τ.ΤΠΤΓ- “1 —c C C 1 ώη η ,·Χ t· V q m ι 7 A "K rv, rr r- 1 1-λ)* k : ΐ n w 4 * ^ «J V j.Ui, , J ·- <- J » Vi 4||J f — ν* - käyttämällä sopivia restriktioentsyymeja, odotettuun ampli- 50 105343 fikaatioon. DNA-fragmentti, joka jäi koskemattomaksi, sek-venssoitiin ja havaittiin, että sekvenssi ei vastannut BDNF:ää eikä NGF:ää. Syntetisoitiin 2 spesifistä sense-(tai 5’) aluketta lisä-PCR:tä varten käyttämällä templaat-5 tina komplementaarista DNA:ta, joka oli valmistettu RNA:n, joka oli uutettu hiiren aivoista, lihaksesta ja maksasta, kaänteistranskriptaasilla ja 3'-aluke, joka oli suunniteltu sopivan yhteen poly A-sekvenssien kanssa (kuvio 2). Nämä 3 kudosta antoivat amplifioidut tuotteet, joiden koot olivat 10 samanlaiset kuin niillä, jotka kloonattiin ja käytettiin seulomaan hiiren genomista kirjastoa. Yksi täten löydetyistä genomisista klooneista sekvenssoitiin (kuvio 2). Avoin lukuraami ennustaa 258 a.a proteiinia (joka alkaa ensimmäisellä meticniinilla, joka löydetään 3 raamissa olevan lope-15 tuskodonin jälkeen), jota kutsumme neurotrofiini-3:ksi (NT-3). Ennustetun proteiinin yleisrakenne muistuttaa joka suhteessa sitä, joka saatiin NGF:lle ja BDNF:lle: oletettua 18 a.a. signaalisekvenssia (osoittaen 5 ja 9 a.a. samankaltaisuudet BDNF:n ja NGF:n kanssa, vastaavasti) seuraa 121 a.a.

20 pro-sekvenssi. Sellaisia pro-sekvenssejä, oletettavasti liittyvät näiden proteiinien disulfidisiltojen laskostumiseen ja oikeaan muodostukseen (Edwards et ai., J. Bid.

Chem. 263:6810-6815), on löydetty myös hiiren NGF:stä (103 a.a.) ja hiiren BDNF:stä 112 a.a.). Yksi ainoa mahdollinen 25 N-glykosylaatiokohta sijaitsee 9 a.a. ennen (verrattuna 3:n : kanssa BDNF:ssä ja NGFrssä), mitä me ehdotamme olevan pilk- komiskohta, jolle on luonteenomaista emäksisten jäännösten rykelmä, jolloin syntyy valmista NT-3:a (kuvio 2, nuoli).

Valmiin NT-3:n on ennustettu koostuvan 119:stä a.a.:sta 30 (suhteellinen molekyylimassa 13525 ja pl 9,3). Vertailu * valmiin hiiren NGF:n, BDNF:n ja NT-3:n välillä paljastaa 54 « a.a. identtisyyttä (kuvio 2). Kaikki 6 kysteiinijäännöstä, tiedetään NGF:ssä ja BDNF:ssä liittyvän disulfidisiltojen muodostukseen (Leibrock et ai., 19S9, Nature 341:149-152; 35 Angletti, 1973, Biochemistry 12:100-115), kuuluvat säilyneisiin jäännöksiin (kuvio 3, nuolet)· Huomattavaa, NT—3— sekvenssin lisäys NGF- ja BDNF-sekvensseihin paljastaa, 51 105343 että vain 7 a.a. identtisyyttä katoaa (61 a.a. identtisyyttä löydetään, kun verrataan hiiren NGF:ää ja BDNFrää). Täten melkein 50 % primäärirakenteesta on säilynyt ja todennäköisesti tarvitaan 3-dimensionaalisen perusmuodon, joka 5 on yhteinen kaikille kolmelle proteiinille, muodostumiseen.

, Lisäksi 3 sekvenssin vertailu paljastaa 4 muuttuvaa domee- nia, jokainen 7-11 a.a pituudeltaan (numeroitu V1-V4 kuviossa 3) ja oletettavasti liittyvät näiden proteiinien liikkeelle panemaan neuronaali-spesifisyyteen.

10 NT-3-geenin ilmenemiisen tutkimiseksi uutettiin RNA erilaisista hiirikudoksista ja analysoitiin NT-3-speisifisellä koettimella (kuvio 4). Löydettiin yksi ainoa noin 1,4 kiloemäksen vyöhyke kaikista tutkituista kudoksista (kuvio 15 4A). Kuitenkin tämän mRNA-ilmenemisen taso vaihtelee mel koisesti. Aivoissa on löydetty (kuvio 4B) merkittäviä a-lueellisia eroja, korkeimmat mRNA-tasot on havaittu pikkuaivoissa ja aivotursossa (Kuvio 4B). Nämä tulokset osoittavat, että NT-3 mRNA-jakaantuminen aikuisen hiiren kudokses-20 sa on hyvin erilainen kuin BDNF:n ja NGF:n mRNA:ssa. BDNF mRNA:ta löydetään todellakin pääasiallisesti aivoissa ja NGF mRNA:ta tuskin havaitaan kudoksissa kuten maksa tai luurankolihas (Neumann et ai., 1984, EMBO J. 3:3183-3189^

On kuitenkin jännittävää huomata, että aivoturso, jonka 25 tiedetään ilmentävän NGF-mRNA:ta (Korsching et ai., 19£ς " r : EMBO J. 4:1389-1393), ilmentää myös BDNF- ja NT-3-mRNA · e = ja paljon suuremmissa määrin kuin useimmissa aivojen ali,_ eissa (kuvio 4B).

30 Jotta testattaisiin, onko NT-3 biologisesti aktiivista -¾ eritetty proteiini, kloonattiin koko proteiinia koodaava sekvenssi ekspressiovektcriin (pCMV), jota on käytetty transfektoimaan (apinan munuaiset) COS-soluihin (kuvio ^

Koska tiedettiin, että NT-3 mRNA: ta löytyy ääreiskudo'-* ‘"-Is- 35 ta, me viljelimme erilaisia kananpojan alkion neuronejs joiden tiedettiin heijastuvan näihin kudoksiin, ja jotka vaativat kudoksen ravitsemukseen liittyviä tekijöitä o ....

“ 1 v ,, 52 105343 täkseen. Liikehermojen, jotka puhdistettiin 6 päivän ikäisten alkioiden (E6) selkäytimestä (Dohrmann et ai., 1986,

Dev. Biol. 118:209-221), kiliaarineuronien (E8) ja jakaantuneiden sympaattisten neuronien (Eli) ei havaittu selviä-5 van NT-3:n läsnäollessa. Sensorineuronien, jotka oli eristetty E8 primaarisista sensorigangliasta, havaittiin kuitenkin vastaavan. Kuten tässä on näytetty (kuvio 5), NT-3 tukee noin 30 % solmukkeisesta gangliasta eristettyjen neuronien selviämistä. Lisäksi tämä vaikutus on additiivi-10 nen BDNF:ään, joka on syntetisoitu keskusprojekticalueilla ja tiedetään vaikuttavan solmukkeisten neuronien alapopu-laatioon (Lindsay et ai., 1985 Dev. Biol. 112:319-328) ja molemmat tekijät yhdistettynä vapauttaa useimmat neuronit (90 %) (kuvio 5). On tärkeätä huomata, että NT-3 mRNA:ta 15 löydetään tämän ganglion sisäelinkohteista, sydän, suoli, maksa ja keuhkot mukaanluettuina (kuvio 4A). NT-3:een vastaavien sensorineuronien populaatioita löydettiin myös E8 jakaantuneesta selkäydinhermon takajuuresta ja trigemi-naaligangliasta ja E8 sympaattisten hermosolujen scluvil-20 jemistä. Täten näyttää siltä, että NT-3 on tähän asti luonnehtimaton biologinen aktiviteetti, jota on useissa ääreiskudoksissa, maksa (Lindsay ja Tarbit, 1979, Neuro Sei. Lett. 12:195-200) ja luurankolihas mukaanluettuina (Davies, 1986, Dev. Biol. 115:56-67 ja tiedetään tukevan 25 sisäelinten ja proprioseptiivisten sensorineuronien, jotka

B

eivät vastaa NGF:ään, selviämistä (katsaus, katso Davies, 1987, Developmnet 101:185-208).

Yhteenvetona, nämä havainnot osoittavat, että NT—3 c-n 30 neurctrofinen tekijä, joka muistuttaa sekä rakenteeltaan · että toiminnaltaan NGF:ää ja BDNFrää, ensimmäiset 2 r.euro-. trofiinia. Me ehdotamme nimeä neurotrofiini (NT) viittaa maan tämän luokan proteiiniin ja analogisesti interleukn-nien kanssa, ne numeroidaan niiden löytämisjärjestyksessä.

35 53 105343 7. Esimerkki: Rotan neurotrofiini-3-geenin kloonaus ja luonnehtiminen 5 NGF:n ja BDNF:n välistä homologiaa käytettiin suunnitelta-- essa kloonausstrategiaa etsittäessä uusia jäseniä tähän geeniperheeseen. Me raportoimme geenin, joka koodaa BDNF/ NGF-perheen kolmatta jäsentä, jonka olemme merkinneet neu-rotrofiini-3:ksi (NT-3), kloonauksen. Tämä uusi tekijä o-10 soittaa erilaista biologista aktiivisuutta ja ajallispai-kallista ilmenemistä, kun verrataan NGF:ään ja BDNF:ään.

7.1. Materiaalit ja menetelmät 7 jl.1 _._1 ,·___Ρο1 ymeraasiket ju reaktiot 15

Syntetisoitiin degeneroituneet oligonukleotidit, jotka vastaavat neljän proteiinisekvenssin segmenttejä, jotka ovat erittäin säilyneitä NGFrssä ja BDNF:ssä; nämä prcteii-nisekvenssit (joita löydetään kuviossa 7D esitetyissä NGF/ 20 BDNF-sekvensseissä) olivat (1} Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Yai-Cys-Asp-Ser, (2) Lys-Gln-Tyr-Phe-(Tyr/Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys, (3) Gly-Cys-Arg-Ile-Asp ja (4) Trp-Arg-Phe-lle-Aro-Ile-Asp-Thr-(Ser/Ala)-Cys-Val-Cys. PCR-reaktioissa käytettiin degeneroituneiden sense- ja anti-sense oligonuklecti-25 dien sarjoja (joissa degeneroitunut osa oli 15-26 nukleoti-diä pitkä vastaten osoitettujen proteiinisekvenssien 5-? aminohappoa joko sense- tai antisense-suuntaan, samoin kuin ei-degeneroitunut "häntä", joka koodaa restriktioentsyymin tunnistamiskohtia). Suoritettiin amplifikaatioreaktioita 30 vastavirtaan sense- ja myötävirtaan an t i s en s e-a1uk epä r i en välillä Perkin-Elmer/Cetuksen suosittelemien olosuhteiden : mukaisesti, paitsi että hybridisaatiolämpötilaa, MG"-kon- sentraatiota ja lisäaikaa vaihdeltiin jokaiselle alukepa-nlle optimaalisten olosuhteiden määrittämiseksi. IB sense-35 alukkeen tarkka sekvenssi (koodaten osaa proteiini£.c.kven£_ sistä "1" edellä) oli 5'-GACTCGAGTCGACATCG-GTN-TGY-GAY- WSN-PvTN-WS-3' ja 2C anti-sense-aluke (vastaten edellä 54 105343 olevan proteiinisekvenssin "2" osan anti-sense-kodoneja) oli 5'CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3' (lyhenteet nukleotideille kuten IUPAC-koodit). MYöhempi sekvenssianalyysi osoitti, että IB oligonukleotidillä oli 2 5 nukleotidiä, jotka sopivat huonosti yhteen NT-3-sekvenssin kanssa, kun taas 2C oligonukleotidillä oli yksi nukleotidien huono yhteensopivuus NT-3-sekvenssin kanssa. PCR:llä tehty radioleimaus tehtiin Perkin-Elmer/Cetuksen suositteleman geeniamplifikaatioreaktion mukaan seuraavilla modifi-10 kaatioilla: 1-10 ng DNA-templaattia alhaisessa lämpötilassa sulavassa agaroosissa lisättiin reaktioseokseen, jossa oli dATP:tä, dGTP:tä ja DTTP:tä lopullisena 50μΜ:η konsentraa-tiona; 50 pCi ,:F-dCTP (3000 Ci/mmol) lisättiin kohti 50 pl reaktiota ja reaktiolle annettiin tapahtua useita amplifi-15 kaatiokierroksia. Amplifikaatioalukkeet olivat samanlaisia kuin degeneroituneet alukkeet, joita käytettiin alkuperäisessä PCR-reaktiossa.

7.1.2. Rotan g enomisen DNA: n Southern blot käy tt ä m a 1 lä_ NT -20 3-koetinta R1B/2C PCR-tuote saatiin amplifioimalla rotan genomisesta DNA-templaatista käyttämällä degeneroituneita IB- ja 2C-alukkeita, kuten edellä kappaleessa 7.1.1. kuvattiin. PCR-25 tuote, joka johdettiin käyttämällä degeneroituneita IB- ja ·· 2C-alukkeita (merkitty R1B/2C), ilmaisee uuden geenin KT- 3, samoin kuin NGF- ja BDNF-geenit rotan genomisessa DNA: .ssa. DNA valmistettiin Fischer-rottien maksasta (Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold 30 Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) pilkottu Eco Rlrllä ja 10 pg fraktioitiin 1 %:ssa agaroosigeelissä. DNA siirrettiin nitroselluloosalle käyttämällä 10 X SSC:tä, • (Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory

Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) 35 hybridisoitiin (Mahmoudi ]a Lin, 1989, Biotechniques 7:331- 3) 3;P-leimattun R1B/2C PCR-tuotteen kanssa 60C:ssa ja pestiin 2X SSC/0,1 % SDS 65*C:ssa. NT-3-, NGF- ja BDNF- 55 105343 vyöhykkeet kuten osoitettu; NGF- ja BDNF-vyöhykkeiden asemat määritetty aikaisemmin käyttämällä spesifisiä koet-timia. Koot osoitettu kiloemäksinä (kb) vasemmalla.

5 7.1.3. Neurotrofiini-3:n ilmeneminen

Rotan NT-3-ekspressiorakenne tehtiin käyttämällä PCR:ää amplifioimaan oletetun NT-3:n lyhyen prekursorin koodausa-lue plasmidilta, jossa on 3,2 kb Sstl rotan genominen 10 fragmentti (kuvio 6B), joka ylettyy NT-3-geenin yli; PCR- reaktiossa käytetyissä oligonukleotideissä oli synteettiset Xhol-tunnistamiskohdat niiden päissä sallimaan amplifioidun koodausalueen insertion Xhol-kohtaan pCDMS-ekspressiovekto-rin polylinkkerissä (Seed, 1987, Nature 329:840-42). Tarkat 15 oligonukleotidit, joita käytettiin amplifioimaan rotan NT- 3-geenin koodausalue, olivat vastavirta sense-aluke 5’-CGG-TAC CCT CGA GCC ACC ATG TCC ATC TTG TTT TAT GTG -3' (alleviivattu ATG vastaa "B"-aloituskohdan initiaatiokodo-nia, jossa sekvenssit myötävirtaan ATG:stä sopivat yhteen 20 NT-3-sekvenssien kanssa tarhaan; vastavirtaan ATG:stä a-lukkeessa on synteettinen Xhol-kohta) ja myötävirta anti-sense-aluke 5' CGG TAC CCT CGA GAT GCC AAT TCA TGT TCT TCC G -3' (alleviivattu tripletti on komplementaarinen NT-3-geenin lopetuskodonin kanssa; tätä triplettiä reunustaa 25 tarkka anti-sense NT-3-sekvenssi ja tämän alukkeen 5'-• päässä on Xhol-kohta). Saatua rotan NT-3 ekspressio-vektc- ria merkittiin pC8-rN3 (Pl). Samanlaisia strategioita käytettiin aikaisemmin insertoimaan rotan NGF- ja BDNF-koodausaluett saman pCDM8-vektorin Xhol-kohtaan. NT-3-, * 30 NGF- ja BDNF-ekspressiorakenteet transfektoitiin, kuten

Okayama ja Berg (1982, Mol. Cell Biol. 5:1136-42) kuvasivat COS-M5-soluihin, joita oli laitettu 5 x 10' solua/60 mm malja ja kasvatettiin 2,5 ml Dulbecco's Modified Eagle's alustalla, jossa oli runsaasti glukoosia (4500 mg/ml) ja 10 35 % vasikan seerumia; supernatantit kerättiin 72 h transfek- tion jälkeen.

• · 7.2. Tulokset 7.2.1. Neurotrofiini-3-qeenin kloonaaminen 56 105343

Saatiin odotettujen kokoiset amplifikaatiotuotteet (ennus-5 tettu NGF- ja BDNF-sekvensseistä) käyttämällä erilaisia degeneroituneiden oligonukleotidien pareja. Näille tuotteille tehtiin ensin restriktioentsyymianalyysi suhteellisen NGF-, BDNF- tai uusien sekvenssien sisällön määrittämiseksi. Kaikissa tapauksissa oli restriktiofragmentit, jotka 10 vastasivat vain NGF- ja BDNF-sekvenssejä, havaittavissa värjättäessä etidiumbromidilla. Kuitenkin käytettäessä samoja PCR-tuotteita hybridisaatiokoettimina rotan genomisen DNA:n Southern bloteissa paljasti, että yksi tuote (merkitty R1B/2C - katso kuvio 6A) tunnisti uuden genomisen DNA-15 sekvenssin NGF:n ja BDNF:n lisäksi (kuvio 6A); kun täten seulottiin PCR-tuotteita Southern blotilla, saatiin harvinaisia amplifioituja sekvenssejä tunnistetuksi, mitkä muuten olisivat olleet ei-havaittavissa muilla keinoin. R1B/ 2C-koetin havaitsi myös uudet sekvenssit evolutionaalisesti 20 erilaisten lajien genomisessa DNArssa (ihminen, hiiri, ka-nanpoika ja sammakko mukaanluettuina) antaen olettaa, että tämä koetin tunnistaa toiminnallisen geenin.

Jotta tämä geeni eristettäisiin, käytettiin RlB/2C-koetinta 25 samoin kuin NGF:lie ja BDNF:lie spesifisiä koettimia seulomaan (Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) ) rotan genominen DNA-kirjasto (ostettu Clontech Laboratories : sta , Inc., Palo Alto, CA), joka oli valmistettu 30 Spraque-Dawley-rotan DNA:sta (osittain pilkottu Sau3A- - restriktioendonukleaasilla ja kloonattu EMBL3/SP6/T7 bakte-riofaagivektoriin). Kahden itsenäisen bakteriofaagikloonin havaittiin hybridisoituvan RlB/2C-koettimen kanssa, mutta ei kahteen muuhun koettimeen. Näissä klooneissa olevien 35 rotan genomisten inserttien restriktiokartta-analyysit osoittivat, että ne vastaavat samaa geeniä (kuvio 6B).

Bakteriofaagia, jolla oli pisin insertti, merkittiin 4>r- • · 57 105343 N3(G1). Sekvenssianalyysi osoitti, että RlB/2C:llä tunnistettu geeni koodaa NGF/BDNF-perheen uutta jäsentä (katso kuvio 7), jonka olemme nimittäneet neurotrofiini-3:ksi.

5 7.2.2. Valmiin neurotrofiini-3:n sekvenssianalyysi DNA-sekvenssointi suoritettiin dideoksinukleotidiketjun terminaatiomenetelmällä (Sanger et ai., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463-7) käyttämällä SEQUENASE Version 10 2,0 pakkausta, jota United States Biochemical Corporation toimittaa, käyttämällä valmistajan suosittelemia protokol-leja.

NGF:llä on 2 erillistä prekursorimuotoa, joita merkitään 15 "pitkä" (aloittaa aloituskohdasta "A") ja "lyhyt” (aloittaa aloituskohdasta "B") prekursori, jotka eroavat niiden N-terminaalisekvenssien pituudessa (Darling et ai., 1987,

Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1:427-34; Selby et ai., 1987, Mol. Cell Biol. 7:3057-64; Edwards et ai., 1988, 20 Mol. Cell Biol. 8:2456-64). Sekä pitkä että lyhyt prekursori voidaan pilkkoa proteolyyttisesti, jolloin saadaan NGF:n valmis muoto, jossa pääasiallisesti on kummankin prekurso-rin karboksiterminaaliset 120 aminohappoa. BDNF:llä voi samalla lailla olla pitkä ja lyhyt prekursorimuoto.

25 ” Kun on sekvenssoitu NGF-geeniä useista lajeista, on paljas tunut, että suurin osa tästä lisä-N-terminaalisesta sekvenssistä löydetään erillisestä eksonista, paitsi neljälle kodonille (Val-His-Ser-Val), jotka kuuluvat aksonin 5'-. 30 päähän, joka koodaa koko lyhyttä (aloituskohta "B") prekur- soria. Olemme aikaisemmin osoittaneet, että kaksi näistä neljästä kodonista (Val-X-X-Val), samoin kuin RNA-liitosak-septorikohta, joka edeltää niitä, ovat säilyneet juuri vastavirtaan säilyneeseen "B"-aloituskohtaan BDNF-geeneissä, 35 jotka on eristetty useista lajeista; tämä havainto johti meidät ehdottamaan BDNF:n sekä pitkän että lyhyen prekur-sorimuodon olemassaoloa. Rotan NT-3-geenissä ovat Val-X-X- 58 105343

Val-kodonit säilyneet, samoin kuin liitosakseptorikohta; kuviossa 7A on osoitettu tämä liitosakseptorikohta ja ehdotettu introniraja. Nämä sekvenssinäkökohdat johtivat meidät ennustamaan vastavirtaan NT-3-geenin koodaavien 5 eksonien, jotka voisivat koodata pitkän prekursorimuodon, olemassaolon. Säilyneen sekvenssin löytyminen vastavirtaan oletetusta NT-3 "A"-aloituskohdasta vahvistaa vielä meidän ennustustamme pitkän BDNF-prekursorin olemassaolosta ja viittaa tämän pitkän prekursorimuodon tärkeään, evolution-10 aariseen säilyneeseen muotoon kaikille NGF-perheen jäsenille. Valmiin NT-3:n ennustettu N-terminus seuraa kanonista proteaasin pilkkomissekvenssiä (Arg-Arg-Lys-Arg), hyvin samankaltainen kuin NGF:ssä ja BDNF:ssä nähdyt (kuvio 7A, C). Joissakin lajeissa on myös NGF:n C-terminaaliset amino-15 hapot poistettu proteolyyttisesti. Päinvastoin kuin NGF, ei rotan NT-3:ssa ole selvää mahdollista pilkkomiskohtaa sen C-terminuksessa (kuvio 7A,C) ja me päättelemme, että kuten BDNF:llä, kaikissa lajeissa, jotka on tutkittu tähän mennessä, ei NT-3:n C-terminuksessa ole proteolyyttistä modi-20 fikaatiota.

Perustuen näihin huomioihin on valmiin NT-3-polypeptidin ennustettu koko 119 aminohappoa, lasketun pl:n ollessa noin 9,5. Täten NT-3 muistuttaa läheisesti kooltaan ja varauk-25 seitaan NGF:ää ja BDNF:ää. Valmiin NT-3:n 7 N-terminaalista aminohappoa eroavat täydelleen NGF:stä ja BDNF:stä. Aloittamalla valmiin NT-3:n aminohaposta 8, optimaalinen ryhmittyminen vaati kahden aminohapon yksittäisen silmukan suhteessa BDNF:ään ja yhden ainoan aminohapon insertion suh-30 teessä NGF:ään (kuvio 7D). Valmis rotan NT-3 osoittaa 57 % aminohappohomologian rotan NGF:n ja 58 % aminohappohomolo-gian rotan BDNF:n kanssa; 57 120:sta jäännöksestä (48 %) on yhteiset kaikille kolmelle proteiinille (kuvio 2D). NGF:ssä ja BDNF:ssä olevat 6 kysteiinijäännöstä ovat ehdottoman 35 säilyneet NT-3:ssa ja suurimman homologian alueet näiden kolmen proteiinin välillä ovat ryhmittyneet pääasiassa näiden kysteiinijäännösten ympärille.

m » · 7.2.3. Neurotrofiini-3:n prekursorien analyysi 59 105343

Juuri vastavirtaan oletettuun pilkkomiskohtaan, joka va-5 pauttaa valmiin NT-3:n, on yleinen glykosylaatioakseptori-kohta (Asn-X-Thr/Ser, katso kuvio 7A,C), mikä myös on löydetty samasta kohtaan NGF:ssä ja BDNF:ssä (Ullrich et ai., 1983, Nature 303:821-5; Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149-52). Onko tällä glykosylaatiokohdalla osuus NT-3-, 10 NGF- tai BDNF-prekursorien prosessoinnissa, jää tuntemattomaksi .

NT-3-sekvenssin lisävertailu NGF- ja BDNF-prekursorien kanssa paljastaa 2 aminohappohomologian aluetta vastavir-15 taan valmiista NT-3-sekvenssistä (alueet I ja II kuviossa 7B,C). Alueen I homologia johtaa meidät ennustamaan rotan NT-3:n "B" aloituskohdan olemassaolon (kuvattu NGF:lie e-dellä), joka tuottaisi lyhyen 258 aminohapon prekursorin, samanlainen kooltaan kuin NGF:n (241 aminohappoa) ja BDNF:n 20 (249 aminohappoa) lyhyt prekursori; kaikkien kolmen tekijän lyhyiden prekursorien näennäinen metioniini-aloituskodoni, erittävä signaalisekvenssi ja signaalisekvenssipilkkomis-kohta ovat säilyneet (kuvio 70. Koska alue 1 homologia ulottuu vastavirtaan "B" aloituskohtaan, me ennustamme myös 25 NT-3:n pitkän prekursorin olemassaolon, joka aloittaisi "A" aloituskohdasta (katso kuvio 7A,B,C). Kuten on nähty NGF:n kanssa (Ullrich et ai., 1983, Nature 303:821-5; Selby et ai., 1987, Mol. Cell Biol. 7:3057-64) ja ehdotettu BDNF: lie, koodattaisiin sellaista aloituskohta oletettavasti li-30 säaksoniin vastavirtaan yksittäiseen eksoniin, joka koodaa koko lyhyttä prekursoria.

Alueen I ja II aminohappohomologian lisäksi paljastavat NT-3:n, NGF:n ja BDNF:n hydrofiilisyyspiirrokset prekursorien 35 rakenteessa samankaltaisuutta, vastavirtaan valmiista tuotteista.

♦ • · 60 1 0 5 3 4 3 7.2.4. Neurotrofiini-3:11a on neurotrofista aktiivisuutta

Silmiinpistävä homologia NT-3:n, NGF:n ja BDNF:n kesken viittaa vahvasti, että NT-3:lla saattaisi olla neurotrofis-5 ta aktiivisuutta. Kumpikin NGF ja BDNF voivat edistää ääreishermoston ja keskushermoston neuronien valikoitujen populaatioiden selviämistä in vivo ja in vitro (katsauksen tehneet Whittemore ja Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-64; Lindsay, 1988, teoksessa "the Making of the Nervous 10 System", ss. 149-65; Davies, 1988, Trends Genet. 4:139- 43). Esimerkiksi jomman kumman tekijän antaminen kehittyville linnun alkioille estää luonnollisesti tapahtuvaa neu-ronaalista kuolemista spesifisessä ääreisgangliassa (esim.

Hoffer ja Barde, 1988, Nature 331:261-2). Kun lisätään vil-15 jeltyyn gangliaan, indusoivat NGF ja BDNF neuriittikasvan-naista (Davies et ai., 1986, J. Neurosci. 6:1897-904); kun lisätään dissosioituneiden ganglioneuronien viljelmiin, e-distävät nämä tekijät neuronaalista selviämistä ja erilaistumista (Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319-28). Sel-20 laisia in vitro-määrityksiä, joissa käytetään usean tyyppisiä kananpojan ääreisgangliota, on käytetty erottamaan NGF:n ja BDNF:n neurotrofisiä aktiviteettejä. Kun taas molemmat tekijät vaikuttavat sensorineuronipopulaatioihin, jotka on löydetty hermostopienasta johdetusta selkäydinher-25 mon takajuuren gangliasta (DRG), vain BDNF tukee hermon " paksuntumasta johdetun solmukkeisen ganglion (NG) sensori- neuroneja (Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319-28).

NGF voi päinvastoin, mutta BDNF ei, tukea paravertebraali-sen ketjun sympaattisen ganglian (SG) neuronien selviämistä 30 ja kasvua (Barde et ai., 1982, EMBO J. 1:549-53). „

Jotta arvioitaisiin NT-3:n potentiaalinen biologinen aktiivisuus, me insertoimme rotan NT-3-geenin vektoriin, pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840-42), jota aikaisemmin käytet-35 tiin lyhytaikaisesti ilmentämään BDNF:ää ja NGFrää nisäkäs-soluissa. Tämä rakenne suunniteltiin ilmentämään NT-3:n lyhyttä prekursorimuotoa; NGF:n ja BDNF:n lyhyiden prekur- 61 105343 sorimuotojen ilmeneminen on tuottanut biologisesti aktiivista materiaalia (Edwards et al.r 1988, Mol. Cell Biol. 8:2456-64; Leibrock et ai., 1989, Nature 341:149-52). NT- 3-, NGF- ja BDNF-rakenteet transfektoitiin COS-soluihin; 5 kasvusupernatantit kerättiin ja määritettiin ensin vaihte-• levissä konsentraatioissa niiden kyky indusoida neuriitti- kasvainnaisia DRG-viljelmistä. Kuten odotettua, NGF ja BDNF edistivät neuriittikasvannaista tässä määrityksessä (kuvio 8). Ensimmäisessä osoituksessa, että NT-3-geeni tosiasiassa 10 koodaa neurotrofista aktiivisuutta, tämän geenin tuote indusoi runsaan neuriittikasvannaisen DRG-viljelmistä (kuvio 8) .

Jotta saadaan aikaan, että NT-3 vaikuttaa suoraan neuronei-15 hin, me määritimme tämän tekijän erittäin rikastetuissa dissosioituneiden DRG-neuronien viljelmissä (kuvio 9). Schwannin-solujen ja fibroblastien varsinaisesti puuttuessa NT-3 edisti noin 60 % näiden DRG-neuronien selviämistä ja neuriittikasvannaista. Otaksuen, että NGF ja BDNF yhdessä 20 tukevat tosiasiallisesti 100 % DRG-neuroneita viljelmässä (Lindsay et ai., 1985, Dev. Biol. 112:319-28), täytyy o-lettaa, että NT-3 edistää sellaisten solujen selviämistä, jotka myös vastaavat ainakin yhteen kahdesta tekijästä.

25 7.2.5. NT-3:n neurotrofinen aktiivisuus on erilainen kuin NGF:llä ia BDNF:llä NT-3:n neuronaalista spesifisyyttä lisää tutkittaessa me määritimme tekijän NG- ja SG-soluviljelmissä. Kuten odotet-30 tua, kontrollikokeet todistivat, että NGF indusoi neuriittikasvannaisen SG- mutta ei NG-soluviljemistä E8 kananpojan alkioista, kun taas BDNF indusoi neuriittikasvannaisen NG-mutta ei SG-soluviljelmistä. Mielenkiintoista oli, että NT-3 edisti neuriittikasvannaisen sekä NG- että SG-soluviljel-35 mistä (kuvio 8), antaen olettaa että on laajempi spesifisyys kuin kummallakaan NGF:llä tai BDNF:llä. NT-3, kuten NGF ja BDNF epäonnistuvat kuitenkin edistämään selviämistä « « 62 105343 tai edistämään neuriittikasvannaista kananpojan kiliaari-ganglion neuroni-rikastetuista tai dissosioituneista solu-viljelmäkasvustoista. Kuten aikaisemmin on nähty, parasym-paattiset neuronit, jotka sisältävät ganglion, vastasivat 5 rotan CNTF:ään, neurotrofinen tekijä, joka ei ole sukua NGF/BDNF/NT-3-perheelle ((Manthorpe et ai., 1986, Brain Res 367:282-6); Stockli et ai., 1989, Nature 342:21-28). Missään näissä määrityksissä ei nähty vastetta, kun käytettiin COS-soluja, jotka oli transfektoitu kontrollivektoreilla 10 (kuvio 8). Taulukossa 4 nähdään tulokset tyypillisestä koemittauksesta, jossa mitattiin vasteet soluviljellystä alkion päivä 8 kananpojan selkäydinhermon takajuuren gangli-asta (DRG), solmukkeisesta gangliasta (NG) ja paraverte-braalisesta sympaattisesta gangliasta (SG) kasvaviin NT-3-15 annoksiin. Gangliaa viljeltiin osoitetut ajat soluviljelmänä 1 ml kollageenigeelissä, kuten Lindsay ja Rohrer kuvaavat, 1985, Dev. Biol. 112:30-48). Säiekasvain pisteitettiin 0-5 skaalalla, missä 5 on maksimi säiekasvain, mikä havaittiin selkäydinhermon takajuuressa vasteena kyllästettyyn 20 hermokasvutekijäännökseen (NGF) (1-10 ng/ml). Rotan NT-3 annettiin "konditioituna” alustana COS-M5-soluista, jotka oli transfektoitu pC8-rN3-plasmidilla(P1), kuten edellä kuvattiin. Kontrollina käytettiin "konditioitua" alustaa vale-transfektoiduista COS-M5-soluista. Kaikissa testatuis-25 sa annoksissa, yli 50-kertainen alue, NT-3 edisti havaittavaa säiekasvainta kaikista kolmen tyyppisistä soluviljel-lelyistä ganglioista, vaikka alhaisissa annoksissa olivat vasteet heikompia sympaattiselle ganglialle. Selkäydinhermon takajuuren ganglian maksimaalinen säiekasvainvaste NT-30 3:lle oli verrattavissa siihen, mitä on nähty NGF:lle tai BDNF:lie. Solmukkeisen ganglian maksimaalinen vaste NT-3:lle oli suurempi kuin BDNF:lie nähty maksimaalinen vaste. Solmukkeinen ganglia ei osoita säiekasvainvastetta NGF:lie. Sympaattisen ganglian maksimaalinen vaste NT-3:lie oli 35 vähemmän kuin näiden ganglioiden maksimaalinen vaste NGF: lie ja havaittiin korkeimmissa konsentraatioissa kuin vaadittiin maksimaalisille vasteille NT-3:lie selkäydinhermon a * 63 105343 takajuuren tai solmukkeisen ganglian kasvustoissa.

Taulukko 4 5 Rekombinantti rotan NT-3 edistää säiekasvainta seuraavista * soluviljelmistä: DRG * E8 kananpojan alkion selkäydinhermon takajuuren ganglia NG = E8 kananpojan solmukkeinen ganglia 10 SG - E8 kananpojan alkion paravertebraalinen sympaattinen ketjuganglia Säiekasvainpisteet

15 DRG NG SC

(24 h) (24 h) (24 h)

Kontrolli 500 μΐ valetrans- 0-0,5 0 0 fektoitua COS-solusupernatanttia 20 NT-3 10 μΐ COS-solusupern. 2-3 2-3 0-0,5 NT-3 50 μΐ COS-solusupern. 3-4 4-5 0-0,5 NT-3 200 μΐ COS-solusupern. 5* 2-3* 0-1 NT-3 500 μΐ COS-solusupern. 5* 0-2* 1-2 25 Tulokset ovat säiekasvainpisteiden raja 4-6 gangliasta jokaisessa tapauksessa.

* Superkyllästävissä NT-3-tasoissa säiekasvain vähenee määritettynä säikeen pituutena DRG-soluviljelmiin ja säikeiden lukumääränä NG-soluviljelmiin.

30 7.2.6. Rotan neurotrofiini-3 on aktiivinen nisäkäsneuronei-. . hin

Jotta määritetään, onko rotan NT-3:11a aktiivisuutta nisäk-35 kään neuroneihin, toistettiin soluviljelmämääritys käyttä mällä selkäydinhermon takajuuren gangliaa, joka oli leikelty 14 päivän rotan alkioilta (taulukko 5). Puhdistettua 64 105343 NGF:ää käytettiin kontrollina. E14 rotan selkäydinhermon takajuuren ganglian soluviljelmiä (4 gangliaa 1 ml viljelmää kohti) kasvatettiin 24 h, pääasiassa kuten on kuvattu kananpojan ganglialle (kuvio 8, taulukko 8) ilman lisättyä 5 neurotrofiinitekijää (kontrolli), hiiren submaksillaarisen rauhasen hermojen kasvutekijän kanssa (NGF) tai rekombi-nantti rotan NT-3:n kanssa ("konditioitu" alusta COS-M5-soluista, jotka oli transfektoitu pC8-rN3(Pl)-plasmidilla, kuten edellä on kuvattu). Jokaisesta gangliosta pisteitet-10 tiin säiekasvain, kuten on kuvattu (katso taulukko 4). Tulokset osoittavat, että kuten NGF, NT-3 on erittäin aktiivinen edistämään säiekasvainta rotan selkäydinhermon takajuuren ganglian soluviljelmistä.

15 Taulukko 5 NT-3 edistää säiekasvainta rotan alkion selkäydinhermon takajuuren ganglian soluviljelmistä.

20

Saiekasvainpiste El4 rotan DRG

Kontrolli 0,0,0,0 NGF (hiiri, 5 ng/ml) 4,4,4,3 25 NT-3: 20 μΐ rotan NT-3 3,3,3,4 COS-solusupernatanttia Säiekasvainpisteet (skaala 0-5) on annettu jokaiselle neljälle yksittäiselle ganglialle viljelmää kohti.

30

Koska DRG-, NG- ja SG-soluviljelmät jokainen vastaa ainakin kahteen kolmesta läheisesti yhteenkuuluville neurotrofisille tekijöille, annetun ganglion osoittama maksimaalinen vaste riippuu käytetystä tekijästä. DRG:n tapauksessa vaste 35 kyllästettyihin NGF-, BDNF- ja NT-3-tasoihin oli suhteellisen samanarvoista. NG:n kanssa kuitenkin maksimaalinen vaste NT-3:een oli suurempi kuin BDNF:ään, kun taas SG:n kans- 105343

OO

sa maksimaalinen vaste NT-3:een oli olennaisesti alempi ja jonkin verran viivästynyt verrattuna NGF:ään.

1.2.1. Neurotrofiini-3-synteesin kohtien tutkiminen 5 ’ On arveltu, että kehityksen aikana neuronaalinen selviyty minen riippuu kohdejohdetuista neurotrofisistä molekyyleistä. Jatkunut selviytyminen, jopa aikuisessa, saattaa vaatia neurotrofisen vaikutuksen pysyvyyden (Thoenen et ai., 1987, 10 Ciba Found. Symp. 126:82-95). Muissa tapauksissa valmiiden neuronien selviäminen ei enää riipu neurotrofisesta tekijästä; joka tapauksessa sellaisten tekijöiden on osoitettu täysin vaikuttavan neuronien erilaistuneeseen fenotyyppiin (Lindsay ja Harmar, 1989, Nature 337:362-4). Neurotrofisen 15 molekyylin synteesin kohtien määrittäminen saattaa siksi auttaa valaisemaan sen fysiologisia osia.

NT-3-synteesin kohtien tutkimiseksi ja NT-3:n ilmenemisen vertaamista rotan NGF:n ja BDNF:n ilmenemisen kanssa hybri-20 disoitiin kolminkertaiset erilaisten aikuisen rotan kudoksista valmistetut RNA-näytteiden Northern blotit koetti-miin, jotka olivat spesifisiä jokaiselle näille geeneille (kuvio 10). Kuten aikaisemmin on osoitettu (Heumann et ai., 1984, EMBO J. 3:3183-9; Shelton ja Reichardt, 1984, Proc.

25 natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:7951-5), oli NGF:n ilmeneminen suurinta aivoissa, sydämessä ja pernassa; ainakin pienen pieniä tasoja havaittiin kaikissa muissa tutkituissa kudoksissa. BDNF:llä oli paljon rajoitetumpi ilmenemiskuvio; korkeimmat tasot löytyivät aivoissa (Leibrock et ai., 1989, 30 Nature 341:149-52) ja merkittäviä tasoja nähtiin sydämessä, keuhkoissa ja lihaksessa. Kuten NGF:n kanssa, NT-3-trans-: kripti (1,4 kb) havaittiin kaikissa tarkastelluissa aikui sen kudoksissa. Kuitenkin kaikissa tarkastelluissa ääreis-kudoksissa NT-3 mRNA:n ilmenemisen taso oli ainakin verrat-35 tavissa siihen, mikä oli nähty aikuisen aivoissa ja joissakin tapauksissa (esim. munuaiset, perna) oli olennaisesti korkeampi.

66 105343

Me vertasimme mysö NGF-, BDNF- ja NT-3-transkriptien suhteellista runsautta vastasyntyneen ja aikuisen hiiren aivoissa. Päinvastoin kuin sekä NGF että BDNF, oli NT-3 ’ 5 mRNA-taso vastasyntyneen aivoissa korkeampi kuin aikuisen aivoissa (kuvio 8). Yksityiskohtaisempi analyysi on paljastanut, että NT-3 mRNA-tasot keskushermostossa ovat dramaattisesti korkeammat sikiön kehityksen aikana ja laskevat sitten aikuistasoille.

10 7.3. Keskustelu

Rakenteelliset vertailut NGF:n, BDNF:n ja tämän geeniper-heen uusimman jäsenen, NT-3, kesken, tuo esiin useita 15 säilyneitä alueita ja johti ehdotukseen, että toiminnalliset erot näiden proteiinien kesken määritetään sekvensseillä, jotka ovat näiden säilyneiden alueiden ulkopuolella. Kaikkien kolmen proteiinin lyhyen ja pitkän prekursori-muodon ennustettu olemassaolo nostaa jännittäviä kysymyksiä 20 molempien prekursorimuotojen merkityksellisyydestä in vivo.

Pitkiä muotoja voidaan prosessoida paljon tehokkaammin kuin lyhyitä muotoja. Siitä huolimatta näiden tekijöiden lyhyitä prekursorimuotoja ilmentävät vektorit tuottavat biologisesti aktiivista materiaalia COS-soluissa.

25

Meidän havaintomme, että näillä 3 neurotrofisella tekijällä on erillään olevat vaihespesifiset ja kudosspesifiset ilmenemisen mallit, kannattaa havaintoa, että neuraalikehi-tys riippuu tilapäisesti ja avaruudellisesti erilaisesta 30 erillisten neurotrofisten aktiviteettien ilmenemisestä.

NT-3-ilmenemisen kehitysprofiili antaa olettaa, että tällä tekijällä on erityisen tärkeä osuus hermoston aikaisessa kehityksessä. Meidän alkuperäinen NT-3:n neurotrofisen aktiivisuuden in vitro luonnehtiminen, liittyneenä NT-3 35 mRNA:n yleistyneeseen levinnäisyyteen sekä aikuisen aivoissa että aikuisen ääreiskudoksissa, antaa vielä olettaa, että NT-3:11a saattaa olla laajalle levinnyt vaikutus neuro- 67 105343 naalitoimintaan ja/tai selviämiseen aikuisessa. NT-3:n e-nemmän maailmanlaajuinen ilmeneminen myös nostattaa mahdollisuuden, että tämä tekijä toimii hermoston ulkopuolisiin soluihin, kuten on ehdotettu NGF:lle (Otten et ai., 5 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:10059-10063).

Ύ

Vaikka vielä ei olla selvästi osoitettu, että neuroneilla voi samanaikaisesti olla vaste useampaan kuin yhteen neuro-troofiseen tekijään, todiste antaa olettaa, että NGF ja 10 BDNF saattavt vaikuttaa päällekkäinmeneviin populaatioihin. Esimerkiksi, kun annetaan joko NGF:ää tai BDNF:ää, se voi vapauttaa suurimman osan DRG-neuroneja, jotka muuten kuolevat normaalin linnun kehityksen aikana (Hofer ja Barde, 1988, Nature 331:261-2). Meidän huomiomme NT-3:n vaikutuk-15 sista kananpojan ääreisgangliaan kannatta vahvasti jännittävää mahdollisuutta, että yksittäiset neuronit voivat vastata moniin, läheistä sukua oleviin tekijöihin. Jos asia on näin, niin sekä samanaikaisen vastauksen välitys että fysiologinen merkityksellisyys nostattaisi lumoavia kysymyk-20 siä. Esimerkiksi kolmen rakenteellisesti läheisen neuro-trofisen tekijän reseptorien ja/tai signaalitransduktion mekanismin komponentit saattavt olla yhteiset. Periaatteessa samanaikaisesti vastaavilla neuroneilla voisi olla monta reseptoria, jokainen spesifinen annetulle neurotrofiselle 25 tekijälle tai yksittäinen reseptori, joka voi välittää vasteen monille neurotrofisille tekijöille. In vivo nämä erilaiset tekijät voivat olla tarjolla kaikille vastaaville neuroneille. Todennäköisemmin on avaruusajalliset erot yksittäisten tekijöiden suhteellisessa saatavuudessa (esim.

30 Davies et ai., 1987, Nature 326:353-8). Saatta olla jopa mahdollista, että saatavilla on erilaisia tekijöitä saman „ ; neuronin erilaisille kohdille (esim. sensorineuroni saat taa ottaa vastaan erilaisia tekijöitä sen ääreis- ja kes-kusterminaaleista) (Kalcheim et ai., 1987, Le Douarin, EMBO 35 J. 6:2871-3). Jos joillakin neuroneilla on samanaikaisesti useita tekijöitä saatavilla, niin niiden vaikutukset saattaisivat olla joko liialliset tai komplementaariset.

68 105343

Arvioitaessa NGF:nf BDNF:n ja NT-3:n yksittäisiä ja mahdollisia komplementaarisia osuuksia saadaan ratkaisevaa tietoa hermoston normaalin kehityksen ja ylläpitämisen ymmärtämi-5 seen. Eläintutkimukset ovat antaneet olettaa, että NGF:llä saattaa olla arvoa degeneratiivisten neurologisten olosuhteiden käsittelyssä (Snider ja Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26:489-505; Fischer et ai., 1987, Nature 329:65-8; Phelps et ai., 1989, Neurobiol. Aging 10:205-7). NGF/BDNF-geeni-10 perheen uuden jäsenen kloonaaminen ja sen mahdolliset vuorovaikutukset perheen muihin jäseniin nostattaa uusia näkökohtia näiden proteiinien mahdollisiin terapeuttisiin sovellutuksiin neurodegeneratiivisissa sairauksissa.

15 8. Esimerkki: Ihmisen neurotrofiini-3-geenin kloonaaminen ja luonnehtiminen 8.1. Tulokset

Rotan NT-3-geenin tunnistamiseen käytetyn koettimen (R1B/ 20 2C) valmistus suoritettiin kuten esimerkissä kappale 7, supra, on kuvattu. Kuten tässä on kuvattu, koetin valmistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) rotan genomisesta DNA:sta käyttämällä degeneroituja oligonukleotidialukkeita, jotka vastaavat kahta aminohapposekvenssihomologian "laa-25 tikkoa", jotka ovat yhteiset NGF:lle ja BDNF:lle. R1B/2C-; koettimessa olevan DNA-molekyylien populaation, jotka e- dustavat uutta geeniä, läsnäolo paljastettiin alunperin Southern blot-hybridisaatiolla rotan genomiseen DNA:han, joka oli pilkottu EcoRl-restriktioendonukleaasilla; koetin 30 havaitsi uuden DNA-fragmentin, niiden fragmenttien lisäksi, i joiden tiedettiin vastaavan NGF- ja BDNF-geenejä.

Kun käytettiin KP-leimattua RlB/2C:tä koettimena analysoimaan Southern blotteja ihmisen genomisesta DNA:sta, jotka 35 oli pilkottu erilaisilla restriktioendonukleaaseilla, kuten tehtiin rotan DNA:n tapauksessa, hybridisaatio havaittiin vyöhykkeisiin, jotka vastasivat NGF- ja BDNF-geenejä, mutta 69 105343 myös uusiin vyöhykkeisiin. Esimerkiksi havaittiin Hindlll-restriktioendonukleaasilla uusi (s.o. ei-NGF, ei-BDNF) noin 1,8 kb vyöhyke; BamHlrllä havaittiin uusi noin 15 kb vyöhyke; ja EcoRl:llä havaittiin uudet 8 ja 12 kb uudet vyöhyk-5 keet (kahden vyöhykkeen läsnäolo saattaa johtua EcoRI-' restriktiokohtien polymorfismista ihmisen genomisessa DNA:ssa). Nämä tiedot osoittivat, että ihmisen DNA sisältää NT-3-geenin, joka on hyvin säilynyt rottien ja ihmisten välillä.

10

Ihmisen NT-3-geeni eristettiin seulomalla genominen kirjasto, kuten kuvattiin rotan NT-3-geenin eristyksessä (katso esimerkki kappale 7). Lyhyesti, kirjasto, joka koostuu ihmisen istukan genomisen DNA:n osittain Sau3A:lla pilko-15 tuista tuotteista, kloonattiin bakteriofaagivektoriin EMBL3/SP6/T7 (hankittu Clontech Laboratories, Inc.), seulottiin RlB/2C-koettimella ja rotan NGF- ja BDNF-koettimil-la. Ihmisen NT-3-kloonin odotettiin hybridisoituvan R1B/ 2C:hen, mutta ei NGF:ään eikä BDNFrään. Yksi sellainen 20 faagiklooni tunnistettiin noin 8 x 10' seulotusta plakista. Tämän kloonin, jota merkitään ♦hN3(Gl), havaittiin sisältävän ihmisen noin 16 kb DNA-insertin. Kloonille tehtiin restriktiokartta tavaomaisin menetelmin ja valitut restrik-tiofragmentit subkloonattiin plasmidiin pBluescriptll 25 (Stratagene) DNA-sekvenssianalyysiä varten. Ihmisen NT-3- geenin sekvenssi ja sen proteiinituotteen johdettu aminohapposekvenssi rinnakkain rotan NT-3-sekvenssien kanssa nähdään kuviossa 11.

30 8.2. Keskustelu . Sekvenssianalyysin tulokset osoittavat silmiinpistävän suurta säilyvyyttä rotan ja ihmisen NT-3:n välillä nukleii nihappo- ja aminohapposekvenssissä. Alueella, joka koodaa 35 valmista polypeptidiä (119 aminohappoa), on ihmisen ja rotan geeneillä noin 92 % homologia DNA-sekvenssissä. Kuitenkaan mikään eroavuus ihmisen ja rotan välillä nukleotidi- 70 105343 sekvenssissä tällä alueella ei johtanut aminohapposubs-tituutioihin; valmiin rotan ja ihmisen NT-3:n johdetut aminohapposekvenssit (ja hiiren valmiin NT-3:n, katso kappale 6, supra) ovat ehdottoman identtisiä. Tämä tuo 5 mieleen BDNF:n korkean säilyvyysasteen, mikä osoittaa täydellistä identtisyyttä valmiin polypeptidin aminohappo-sekvenssissä rotalla, hiirellä, ihmisellä ja sialla. Päinvastoin, ihmisen valmiin NGF:n ja jyrsijän NGF:n (hiiri tai rotta) aminohapposekvenssit eroavat noin 10 %.

10

Lisäksi oletetun ihmisen ja rotan NT-3-prekursorien aminohapposekvenssit osoittavat myös merkittäviä muutamia eroavuuksia (alleviivattu kuviossa 11). Välittömästi vastavirtaan ennustettua proteaasin pilkkomiskohtaa, joka tuottaisi 15 valmiin NT-3-polypeptidin (Arg-Arg-Lys-Arg), ihmisen sekvenssistä puuttuu yksi kodoni (Pro:lle), joka esiintyy rotan sekvenssissä. Yksi neljän aminohapon blokki eroaa ihmisen ja rotan preproNT-3:n välillä ja 6 yksittäistä aminohappojen lisäsubstituutioita on sirottunut tuon blokin ja 20 ennustetun proteaasipilkkomiskohdan välille.

9. Ihmisen NT-3:n biologinen aktiivisuus

Koska ihmisen valmiin NT-3:n johdettu aminohapposekvenssi 25 on identtinen rotan valmiin NT-3:n kanssa, ennustettiin : vahvasti, että ihmisen ja rotan NT-3-proteiineilla olisi tuskin huomattavia biologisia aktiivisuuksia. Ihmisen NT-3:n neurotrofinen aktiivisuus vahvistettiin insertoimalla kloonattu ihmisen geeni plasmidi-ekspressiovektoriin pCDM8, 30 transfektoimalla saatu plasmidi pC8-hN3(Pl) COS-M5-soluihin -» (kuten Chen ja Okayaman ovat kuvanneet, 1987, Mol. Cell.

Biol. 7:2745-52) ja määrittämällä transfektoitujen solujen neurotrofinen aktiivisuus "konditioidussa" alustassa. Ihmisen NT-3-geeni amplifioitiin PCRrllä bakteriofaagi $>hN3-35 (Gl):stä ja insertoitiin plasmidi-ekspressiovektoriin pCDM8, kuten on kuvattu rotan NT-3-geenille (esimerkki 7); saatua plasmidia merkittiin pC8-hN3(Pl). Määritettiin koko 71 105343 NT-3-insertin nukleotidisekvenssi ja verrattiin genomiseen sekvenssiin, joka oli määritetty kuten edellä on kuvattu, jotta varmistettaisiin, että PCR-amplifikaation ja kloona-usproseduurien aikana ei ole tullut mutaatioita. Transfek-5 tio-ja määritysmenetelmät olivat pääpiirteittäin samanlai-* set kuin ne, joita käytettiin arvoitaessa rotan NT-3:n biologista aktiivisuutta.

Kuten ennustettiin, havaittiin ihmisen NT-3:ssa olevan 10 neurotrofista aktiivisuutta, kun määritettiin kananpojan alkion päivän 9 (E9) selkäydinhermon takajuuren ganglian ja solmukkeisen ganglian soluviljelmistä (taulukko 6). Ganglioita viljeltiin (katso kuvio 8, taulukko 4) 24 h valetrans-fektoitujen COS-M5-solujen tai COS-M5-solujen, jotka oli 15 transfektoitu plasmideilla (kaikki saatu pCDM8 ekspressio- vektorista), jotka koodaavat rekombinanttia ihmisen BDNF:ää tai rekombinanttia rotan NT-3:a [rNT-3; plasmidi pC8-rN3-(Pl)] tai rekombinanttia ihmisen NT-3:a [hNT-3; plasmidi pC8-hN3(Pl)], "konditioidun" alustan (supernatantit) läsnä-20 ollessa. BDNF valittiin positiiviseksi kontrolliksi, koska BDNF:llä tiedetään olevan neurotrofista aktiivisuutta sekä selkäydinhermon takajuuren että solmukkeiseen gangliaan. Kuten taulukossa 6 on näytetty, sekä rotan että ihmisen rekombinantti-NT-3:11a, vaatimattomalla annoksella (vertaa 25 taulukko 4) on likimäärin sama aktiivisuustaso kuin BDNF: llä selkäydinhermon takajuuren gangliaan ja merkittävästi suurempi aktiivisuus kuin BDNF:llä solmukkeiseen gangliaan. Aktiivisuudessa ihmisen versus rotan NT-3 ei havaittu eroa.

72 105343

Taulukko 6

Ihmisen rekombinantti NT-3, joka on tuotettu COS-soluissa, 5 on yhtä aktiivinen kuin on rotan NT-3, kun määritetään kananpojan alkion selkäydinhermon takajuuren ganglian tai solmukkeisen ganglian soluviljelmäkasvatuksista Säiekasvainpiste

10 DRG NG

Kontrolli 0;0;0;0;0,5 0; 0 BDNF: 20 μΐ COS-solusupern. 3;3;3;3;3 1; 3

Vale: 20 μΐ COS-solusupern. 0;0,5;0;0;0 0 15 Ihmisen NT-3: 20 μΐ COS-solusupern. 3;2;4;3 3;3

Rotan NT-3: 20 μΐ COS-solusupern. 3;4;4;3;4 3;4

Pisteet ovat säiekasvaimen mitta (skaala 0-5) nähtynä 1-5 yksittäiselle ganglialle 24 h viljelmässä. Piste jokaiselle 20 yksittäiselle ganglialle nähdään.

10. Ihmisen NT-3-geenituotteen tunnistaminen metabolisella leimauksella 25 Valmiin NT-3-polypeptidin (rotta tai ihminen) ennustettu J koko on 119 aminohappoa, molekyylipainon ollessa 13,6 daltonia. Jotta määritettäisiin kokeellisesti ihmisen .valmiin NT-3-polypeptidin likimääräinen koko, solut, jotka oli transfektoitu ihmisen NT-3-ekspressioplasmidilla, lei-30 mattiin metabolisesti ja "konditioidusta" alustasta analysoitiin uuden polypeptidin läsnäolo. Kuviossa 12 nähdyssä kokeessa COS-M5-solut transfektoitiin plasmidilla pC8-hN3(Pl) (kuvattu edellä), solut leimattiin [nS]metioniinin ja tMS]kysteiinin seoksella, kasvatusalusta kerättiin ja 35 fraktioitiin elektroforeesilla pelkistävissä olosuhteissa 15 % polyakryyliamidigeelissä, proteiinit siirrettiin memb-raanisuodattimelle (pääpiirteittäin kuin Towbin et ai. ku- 73 105343 vanneet, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:4350-4354) ja leimatut polypeptidit havaittiin autoradiografialla. Vale-transfektoituja soluja käytettiin kontrollina (linja merkitty "vale"). Kuten kuviossa 12 nähdään, ohjasi eks-5 pressioplasmidi pC8-hN3(Pl) yksittäisen polypeptidin, noin « 14 kDa, synteesiä (merkitty NT-3 kuvioon), jota ei nähty kontrollissa. Tekniikan erottelukyvyn rajoissa tämä sopii hyvin yhteen valmiin NT-3:n ennustetun koon kanssa.

10 11. Esimerkki: Neurotrofiini-3 tukee viljeltyjen rotan alkion ventraalin keskiaivon dopaminergisten neuronien selviämistä E14 rotan alkion ventraali keskiaivoviljelmät luotiin kuten 15 U.S patenttihakemuksessa, sarjanr. 07/400591, jätetty 30. elokuuta 1989, mikä on liitetty tähän kokonaisuutenaan viitteeksi, on kuvattu. Viljelmät tehtiin 50000 solua/cm1 tiheydellä (kuvio 13) tai 100000 solua/cm1 (kuvio 14) ja kasvatettiin neurotrofisen tekijäkontrollin puuttuessa tai 20 kasvavien COS-solusupernatanttimäärien, joissa oli ihmisen rekombinantti neurotrofiini-3:a (NT-3), läsnäollessa. Sen jälkeen, kun solut olivat olleet 8 päivää viljelmässä, ne fiksattiin ja värjättiin monoklonaalisella vasta-aineella tyrosiinihydroksylaasiksi (TH), dopamenergisten neuronien 25 leimaaja. Kuten kuvioissa 13 ja 14 nähdään, havaittiin kasvavien NT-3-määrien nostavan selllaisten TH-positiivis-ten solujen lukumäärää, jotka selvisivät 8 päivän jälkeen, maksimaalisen kasvun ollessa 2,5-kertainen verrattuna kont-rolliarvoihin NT-3 COS-solusupernatantin 1:25 laimennuksel-30 la. Puhdistetulla hermoston kasvutekijällä ei näyttänyt olevan vaikutusta, mutta NT-3:n vaikutukset olivat saman-„ '·[ laiset kuin mitä havaittiin BDNFrllä.

74 105343 12. Esimerkki: NT-3, BDNF ja NGF kehittyvän rotan hermostossa: ilmenemisen rinnakkaiset samoin kuin vastavuoroiset mallit 5 12.1. Menetelmät 12.1.1. Materiaalit ia leikkelyt

Kaikissa leikkelyissä käytettiin Spraque-Dawley-rottia, jotka saatiin Harlan Spraque Dawleylta, Inc. Aikuisen 10 aivojen leikkelyt johdettiin tavanomaisin paljain silmin näkyvien elinten maamerkeillä. Aivokuorinäytteisiin kuului neokortex ja olfaktorisen aivokuoren dorsaalit osat. Väli-aivonäytteet otettiin käyttämällä ydinrihmaa ja näköhermo-ristiä dorsaalina ja ventraalina maamerkkeinä, vastaavasti. 15 Keskiaivonäytteet otettiin keskiaivojen yläkukkulan ja ala-kukkulan tasolla dorsaalisti ja ulottuen aivojen ventraalin pinnan sillan päänpuoleisimpaan reunaan. Taka-aivoista puuttuivat pikkuaivot, mutta niissä oli silta ja ydin. Pitäisi huomata, että vain aivojuovion päänpuoleisista osista 20 otettiin näyte, jotta vältettäisiin näkökukkulakudoksen kontaminaatiota. Aivotursoon liittyvät näytteet kerättiin hapsu/holvi-tasolta noin hännän (cauda) napaan. Vastasyntyneen aivojen leikkeleissä käytettiin samanlaisia maamerkkejä, paitsi ydinrihmaa. Raskaudessa ajoitettuja rottia käy-25 tettiin alkiokudoksen saamiseksi, päivää jolloin siemenneste oli positiivinen, merkittiin päiväksi El; syntymäpäivää merkittiin PO. Aikuiset rotat olivat keskimäärin 150-275 g (6-8 viikon ikäisiä).

30 12.1.2. RNA-valmiste ja Northern blotit

Valitut kudokset leikeltiin Sprague-Dawley-rotilta ja jäädytettiin välittömästi nestetyppeen. RNA:t eristettiin homogenisoimalla kudokset 3 M:ssa LiCl/6M urea, kuten on 35 kuvattu (Bothwell et ai., teoksessa Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Jones ja Bartlett, Boston, MA). RNA:t (10 pg) fraktioitiin elektorforeettisesti nelin- 105343 kertaisilla 1 % agaroosi/formaldehydigeeleillä (Bothwell et al., supra), jonka jälkeen tehtiin kapillaarisiirto nailon-membraaneille (MagnaGraph, Micron Separtions Inc.) 10 X standardi suolasitraatilla (SSC), pH 7, RNA:t sidottiin 5 ristiin mebraaneihin UV:n avulla altistamalla ultraviolet-» tivalolle (STRATALINKER, Stratagene, Inc.) ja hybridisoi-

tiin 68*C:ssa radioleimattuihin koettimiin 0,5 M NaP04:n (pH

7), 1 % naudan seerumialbumiinin (fraktio V, Sigma, Inc.), 7 % SDS:n, 1 mM EDTA:n (Mahmoidu ja Lin, 1989, Biotechni-10 ques 7:31-33) ja 100 ug/ml sonikoidun, denaturoidun lohen sperman DNA:n läsnäollessa. Suodattimet pestiin 68‘C:ssa 2X SSC:llä, 0,1 % SDS:llä ja altistettiin autoradiografiälle yhdestä päivästä kahteen viikkoon 1-2 vahvistusvarjostimen kanssa (CRONEX1, DuPont) ja röntgenfilmin kanssa (XAR-5, 15 Kodak) -70'C:ssa. Nelinkertaisten geelien etidiumbromidivär-jäys osoitti, että samanarvoiset tasot kokonais-RNA:ta määritettiin erilaisista näytteistä (kuten Maisonpierre et ai., 1990, Science 247:1446-1451); tämä vahvistettiin koettamalla useita blotteja käyttämällä koetinta, joka oli spe-20 sifinen 28S RNA:lle.

12.1.3. NT-3-, BDNF-, NGF- ia NGFR-koettimen valmistus

Rotan NT-3:n, BDNF:n ja NGF:n koodausalueiden molekulaaris-25 ta kloonausta pCDM8 ekspressiovektoriin (Aruffo ja Seed, ’· 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84-8573-8577) on kuvat tu aikaisemmin (Maisonpierre et ai., supra). Näiden plasmi-dien 800 emäsparin (bp) Xhol-insertit erotettiin akryylia-midigeeleissä ja saatiin takaisin elektroeluutiolla (Both-30 well et ai., 1990) ja sen jälkeen leimattiin "P:lla satunnaisella heksameerileimauksella (Bothwell et ai., supra); „ jokaisen näiden koettimen hybridisaatio synteettiseen NT- 3-, BDNF- ja NGF-transkriptiin (katso infra) osoitti, että koetin, joka on spesifinen yhdelle neurotrofiinille, ei 35 hybridisoidu transkripteihin läheistä sukua olevista neurotrof iineista . Rotan NGFR-koetin oli 1,6 kb Ncol cDNA-frag-mentti, joka ulottuu rotan NGFR-proteiinin koodausalueen 76 105343 yli (Radeke et ai., Nature 325:593-597).

12.1.4. Synteettinen transkriptin tuotto ia määritys 5 T7-faagipromoottoria, joka on pCDM8/neurotrofiini ekspres-siorakenteessa, joka on kuvattu edellä, käytettiin tehtäessä synteettisiä RNA-transkriptejä, jotka vastaavat NT-3:n, BDNF:n ja NGF:n koodausalueiden sense-suuntaa. Näiden synteettisten transkriptien määrät määritettiin ensin spektro-10 fotometrisesti. Transkriptejä määritettiin lisää käyttämällä lopusta leimattua (Bothwell et ai., supra) 30-meeri oli-gonukleotidikoetinta, joka hybridisoitui yhteiseen kolmen transkriptin 5'-päähän (juuri myötävirtaan T7-promoottorista) . Densiometrinen pyyhintä (Series 300 Computing Densio-15 meter, Molecular Dynamics, Inc.) piste- ja Northern-blota-tuista transkripteistä, jotka hybridisoituivat oligonukleo-tidikoettimeen (hybridisaatio ja pesu suoritettiin 55'C:ssa, erilailla kuin edellä kuvattiin), vahvisti että käytettiin vastaavat tasot synteettisiä transkriptejä kuvattuina stan-20 dardeina (tyypilliset tiedot kuvattu kuviossa 15A).

12.1.5. Neurotrofiini-transkriptitasoien densiometrinen määritys 25 Transkriptitasot erilaisissa näytteissä normalisoitiin standardisoituun aikuisen rotan aivonäytteeseen (katso supra) seuraavasti. Jokaiseen Northern hiottiin laitettiin samat määrät aikuisen rotan RNA-näytettä. Jokaiseen Northern hiotin autoradiografisiin säteilytyksiin käytettiin 30 densiometristä pyyhkäisyä signaali-intensiivisyyksien määrittämiseksi jokaiselle määritetylle näytteelle. Jokaiselle säteilytykselle, joka oli pyyhkäisty, määritettiin signaali-intensiivisyydet jokaiselle näytteelle. Jokaiselle pyyhkäistylle säteilytykselle, jaettiin jokaisen näytteen 35 signaali-intensiivisyydet arvolla, joka saatiin signaali-intensiivisyydelle aikuisen aivonäytteesä tuossa säteily-tyksessä, mikä normalisoi kaikki arvot suhteessa standardi- 77 105343 soituihin aikuisen aivonäytteisiin. Kuviossa 18 transkrip-titasot eri näytteissä esitetään suhteessa tasoihin aikuisen aivonäytteessä, jolloin taso aikuisen aivoissa on τ mielivaltaisesti asetettu l,0:ksi. Sen jälkeen, kun neuro- 5 trofiinitranskriptin femtogrammat kokonais RNA:ta kohti » aikuisen aivonäytteessä oli määritetty, me pystyimme mää rittämään todelliset transkriptitasot (fg/pg:na) näytteissä, jotka oli normalisoitu suhteessa aikuisen aivonäyt-teeseen.

10 12.2. Tulokset 12.2.1. NT-3-, BDNF- ja NGF-mRNA-tasojen määritys ia vertailu aikuisen rotan aivoissa 15 Me käytimme Northern blot määrityssyteemiä NT-3-, BDNF- ja NGF-transkriptien määrittämiseksi ja ilmenemisen vertaamiseksi erilaisissa kudoksista johdetuissa näytteissä. Jokaisen neurotrofiinitranskriptin määrä erilaisissa näytteissä määritettiin suhteessa kuvattuihin standardeihin. Synteet-20 tiset NT-3-, BDNF- ja NGF-RNA-transkriptit, joiden määrät oli määritetty tarkkaan (katso kuvio 15A ja sen selitys), olivat myös Northern bloteissa, joissa oli myös 10 pg ko-konais-RNA:ta, joka oli eristetty aikuisen rotan aivoista. Blotit hybridisoitiin radioleimattuihin koettimiin, jotka 25 olivat spesifiset jokaiselle neurotrofiinille ja sitten niille tehtiin autoradiografia (kuvio 15B). Pyyhkäisydensi-tometriä käytettiin sitten vertaamaan hybridisaatiosignaa-lin intensiteettejä, jotka saatiin aikuisen aivonäytteestä ja synteettisistä standardeista. Tämä määritys paljasti, 30 että kaikille kolmelle neurotrofiinille aikuisen rotan aivoissa oli likimäärin samat mRNA-tasot (arvioitu 40 fg NT-_ 3-transkriptejä, 45 fg BDNF-transkriptejä ja 30 fg NGF- transkriptejä kohti pg:aa kokonais-RNA:ta). Tätä standardisoitua aikuisen aivonäytettä laitettiin kaikkiin seuraaviin 35 Northern blotteihin, jolloin sallittiin neurotrofiinin ilmenemisen tasojen määritys uusissa RNA-näytteissä vertailemalla (katso infra). Kolmen neurotrofiini-transkriptin nä- 78 105343 kövertailun helpottamiseksi erilaisissa näytteissä, valittiin myöhemmissä kuvissa kuvatut säteilytykset niin, että signaali-intensiivisyydet standardisoiduissa aikuisen aivonäytteessä olivat samanlaiset kaikille kolmelle neuro-5 trofiinille, tällöin normalisoiden signaalit muissa kudosnäytteissä kuvatuksi standardiksi.

12.2.2. NT-3:n, BDNF:n ia NGF:n geeni-ilmenemisellä on yhteisiä samoin kuin ainutlaatuisia piirteitä 10

Kun tutkittiin neurotrofiinigeenin ilmenemistä rotan alkioissa, paljastui, että kaikilla kolmella neurotrofiinilla on dramaattinen kasvu niiden ilmenemistasoissa alkiopäivien 11 ja 12 välillä (E11-E12) (kuvio 16A); kaikki 3 neurotro-15 fiini-transkriptiä ovat laajalle levinneet läpi E12- ja E13-alkioiden. Yhteisen neurotrofiinigeenin ilmenemisen nousun ajoitus on samanaikainen kuin ajanjakso, jolloin neurogeneesis (sekä perifeerisesti että keskeisesti) alkaa tosissaan ja näiden uudestaan muodostuneiden neuronien ak-20 sonien alkuperäisen muokkaamisen kanssa (esim. Altman ja

Bayer, 1982, Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. Voi. 74; Altman ja Bayer, 1984, ibid, Voi. 85).

Huolimatta tästä koordinoidusta neurotrofiinigeenin ilmene-25 misen alkamisesta alkiokauden aikana, paljasti vertailu standardisoituun aikuisen aivonäytteeseen, että NT-3 mRNA on verrattomasti runsain aikaisissa alkioissa (180 fg/pg kokonais RNA), kun taas BDNF mRNA on vähintään runsas (5-10 fg/pg kokonais RNA:ta) ja NGF:ää on läsnä välissä olevi-30 na tasoina (30 fg/pg kokonais RNA:ta) (kuvio 16A). NT-3 ja BDNF jatkavat vastavuoroisen suhteen esittämistä, kun il-menemistasoja seurataan kehittyvissä aivoissa (kuvio 16B) tai tiheästi hermotetussa sydämessä (kuvio 160 - alunperin korkea NT-3-ilmeneminen vähenee, kun taas alunperin alhai-35 nen BDNF-ilmeneminen kasvaa, kunnes lopulta saadaan samanlaiset tasot aikuisessa; NGF-ilmeneminen päinvastoin pysyy melko vakiona. Kiinnostavaa kyllä, NT-3-ilmeneminen kasvaa 79 105343 maksan ja kateenkorvan kehittymisen aikana, elimiä, jotka eivät ole tiheästi hermotetut ja jotka eivät ilmennä havaittavaa BDNF mRNA:ta (kuvio 16C).

5 Alkion NGFR-transkriptin ilmeneminen ilmeisesti edeltää * kasvua neurotrofiinigeenin ilmenemisessä, on silmiinpistä vän korkea aikaisessa selkäytimessä ja laskee aivojen ennen syntymää olevan kehityksen aikana ja sydämen syntymän jälkeen tapahtuvan kehittymisen aikana (kuvio 16A,B,C).

10 12.2.3. NT-3-, BDNF-, NGF- ja NGFR-ilmenemisen vertailu vastasyntyneen ia aikuisen hermostossa

Jotta kuvattaisiin neurotrofiinigeenin ilmenemisen tilaan 15 liittyvää jakaantumista rotan hermostossa ja jotta ymmärrettäisiin, kuinka erilaiset kehitysprofiilit koko aivoissa liittyy kehitysmuutoksiin erillisissä aivojen alueissa, me tutkimme neurotrofiinigeenin ilmenemistä vastasyntyneen ja aikuisen aivoissa. Kaikilla kolmella tekijällä oli erilli-20 set tilaan ja aikaan liittyvät erot niiden ilmenemismallis-saan (kuvio 17). Kuviossa 4 on esitetty transkriptitasojen määritys, ääreiskudoksissa olevat mukaanluettuina, graafisessa muodossa. Pääasiallinen samankaltaisuus, joka oli yhteinen kaikille kolmelle tekijälle, on niiden yhtenäises-25 ti korkea ilmenemistaso aikuisen aivotursossa. Vastakohtana . tilanteelle aikuisen ääreiskudoksessa, jossa NT-3- ja NGF- ilmeneminen on samankaltaisempaa niiden laajassa jakaantumisessa (Maisonpierre et ai., supra), NT-3:lla ja BDNF:llä on selvää samankaltaisuutta niiden kokonaisilmenemismal-30 leissa aikuisen aivoissa (kuvio 17B, 18B); kiinnostavaa että molemmat tekijät silmiinpistävästi puuttuvat aivojuo-.. viosta. Kuitenkin NT-3:11a ja BDNF:llä on myös kiinnosta vimmat ja ilmeisesti vastavuoroiset erot, kun ilmenemistä verrataan vastasyntyneen ja aikuisen aivojen välillä (kuvio 35 17A,B ja kuvio 18A,B). NT-3-ilmeneminen on korkein vasta syntyneessä ja paljon korkeampi kuin aikuisessa, aivojen valmiimmissa alueissa (s.o. pikkuaivot, aivoturso ja neo- 80 105343 cortex). BDNF-ilmeneminen on alhaisinta näillä alueilla ja korkeinta ja samanlaista kuin aikuisella tasoilla kaudaali-simmilla aivojen alueilla, jotka valmistuvat aikaisemmin (s.o. taka-aivot, keskiaivot ja väliaivot). Kuten aikuisen 5 aivoissa, ei NT-3-transkripteja havaita vastasyntyneen aivo juoviossa.

Verrattuna NT-3:hen ja BDNF:hen, on NGF mRNA-tasoilla vähemmän dramaattisemmat erot vastasyntynyt versus aikuisen 10 aivot vertailussa (kuvio 17,18); hajukäämin NGF-tasot ovat korkeammat vastasyntyneellä, kun taas aivoturson ja neocor-teksin NGF-tasot ovat korkeammat aikuisessa. NGFR mRNA-ta-sot olivat yleisesti korkeammat vastasyntyneessä verrattuna aikuisen aivoihin, poikkeuksellisen korkeat tasot vas-15 tasyntyneen aivotursossa ja taka-aivoissa (kuvio 17A,B).

12.2.4. NT-3-, NGF- ia BDNF-ilmenemisen tutkiminen erillisten CNS-alueiden kehittymisen aikana 20 Jotta seurattaisiin vielä käsitystä, että NT-3:a ilmennetään havaittavimmin erityisten CNS-alueiden aikaisessa kehityksessä, koska BDNF:ää ilmennetään pääasiallisesti myöhemmin samojen alueiden kehityksessä, me analysoimme neurotrofiinigeenin ilmenemisen näiden kolmen CNS-alueiden, 25 joiden valmistumisella on hyvin erilainen ajankulku, kehit-tymisen aikana. Neurogeneesis, jonka jälkeen on heti ajanjakso, jolloin tapahtuu luonnollista solukuolemaa, alkaa hyvin aikaisin selkäytimessä (E12-E13) ja päättyy useita päiviä ennen syntymää (Altman ja Bayer, 1984, supra). U-30 seimmat neuronit pikkuaivoissa ja aivotursossa (laskettu · niiden jyvässolupopulaatiolle) päinvastoin muodostuvat syntymän jälkeen (esim. Altman, 1966, J. Comp. Neur. 128: 431-474; Schlessinger et ai., 1975, J. Comp. Neurol. 159: 149-176). Myöhemmin kehittyvissä pikkuaivoissa on laaja 35 neurogeneesi, neuroblastien kulkeutuminen ja neuronaalinen erikoistuminen kolmen ensimmäisen elinviikon aikana (esim.

Altman, 1966, supra). On raportoitu, että NGF mRNA-tasot 81 105343 aivotursossa eivät tule helposti havaittaviksi kunnes noin 2 viikkoa syntymän jälkeen (Largr et ai., 1986, Science 234:352-355); tämä lisääntyminen tapahtuu kauan perinataa-lisen laajan jyvässolulisääntymisen (esim. Altman, 1966, 5 supra) ja etuaivojen tyven koliinivaikutuksen aiheuttavien • säikeiden tunkeutumisen alun jälkeen (Koh ja Loy, 1989, J.

Neurosci. 9:2999-3018), mutta on samanaikaista muun näiden neuronien kolinergisen erilaistumisen kanssa (Large et ai., supra).

10

Tutkimuksemme kehittyvästä selkäytimestä (kuvio 5A,E) paljastaa korkeat NT-3-ilmenemisen tasot E12-E13:ssa (150-280 fg/pg kokonais RNA), mikä vähenee sytymässä ja on melkein havaitsemattomissa aikuisessa. BDNF mRNA, joka on tuskin 15 havaittavissa E12-E13:ssa, tekee piikin syntymässä (10-20 fg/pg kokonais RNA) ja laskee sitten aikuisessa. NGF mRNA: ta ilmennetään korkeimpina tasoina E12-E13 selkäytimessä (15-25 fg/pg kokonais RNA), mutta 10-kertaisesti alempina tasoina kuin NT-3 mRNA-tasot samassa vaiheessa. Kiinnosta-20 vaa, että NGFR:ää ilmennetään korkeimpina tasoina aikaisessa selkäytimessä; tämä ilmeneminen on aikaisemmin korreloinut aikaisessa selkäytimessä uudestaan muodostuneiden liikettä aiheuttavien neuronien luonnollisesti tapahtuvan so-lukuoleman kanssa (Ernfors et ai., 1989, Neuron 2:1605-25 1613).

Myöhään kehittyvissä pikkuaivoissa (kuvio 19B,F) pysyy huomattavan korkeat NT-3 mRNA-tasot (500-820 fg/pg kokonais RNA) läpi kolmen ensimmäisen viikon syntymän jälkeen, kun 30 taas BDNF-ilmeneminen alkaa nousta vasta myöhään tässä jaksossa; hyvin alhaiset tasot NGF-ilmenemistä havaitaan » vain aikaisissa vaiheissa pikkuaivojen kehityksessä. NGFR: ää ilmennetään korkeina tasoina aikaisin pikkuaivojen kehityksessä ja laskee sitten ennen havaittua NT-3-ilmene-35 misen laskua.

Aivotursossa (kuvio 19C,G) sekä BDNF että NGF mRNA-tasot 82 105343 nousevat alhaisista tasoista E17:stä välissä oleviin tasoihin syntymässä ja saavuttavat korkeimmat tasot aikuisessa.

Vaikka kaikkia kolmea neurotrofiinitranskriptiä ilmennetään samoilla tasoilla aikuisen aivotursossa, on NT-3-ilmenemi-5 nen silmiinpistävästi korkeampaa kuin BDNF ja NGF E17:ssä ja vastasyntyneen aivotursossa; NT-3-ilmenemisen tasot vastasyntyneen aivotursossa ovat yhtä korkeat kuin ne, jotka nähtiin perinataalisissa pikkuaivoissa (820 fg/ug kokonais RNA). Päinvastoin kuin neurotrofiineilla laskee NGFR-ilme-10 neminen aivoturson kehityksen aikana.

Kaikissa kolmessa edellä tutkituissa CNS-alueissa on NT-3-ilmeneminen silmiinpistävän korkeaa niiden kehityksen aikana ja laskee sitten aikuisen tasoille, kun taas alunpe-15 rin alhaiset BDNF mRNA-tasot nousevat ja saavuttavat aikuisen tasot samalla lailla kuin NT-3. Verrattuna NT-3:n ja BDNF:n keskinäisiin profiileihin, ei NGF-ilmenemisellä ole mitään yhdenmukaisia malleja; sitä ilmennetään edullisesti (vaikka alhaisina tasoina) aikaisin selkäytimen ja pikkuai-20 vojen kehityksessä, mutta myöhään aivoturson kehityksessä.

12.3. Keskustelu

Analyysimme on paljastanut sekä samankaltaisuuksia että 25 eroja kolmen neurotrofiinitranskriptin avaruusajallisissa jakaantumisissa. Kaikilla NT-3-, BDNF- ja NGF-transkrip-teillä on samanaikainen kasvu niiden ilmenemisessä rotan .sikiökehityksen yhdennentoista ja kahdennentoista päivän välillä ja ovat laajalle levinneet 12 ja 13 päivän alkiois-30 sa. Tämän ilmenemisen yhteisen purkauksen ajoitus sattuu - likimäärin samaan aikaan neurogeneesin kehityksen alun kanssa (esim. Altman ja Bayer, 1982, supra; Altman ja - Bayer, 1984, supra). Tämä yhteys tukee käsitystä, että kolmella neurotrofiinilla on erityisen tärkeät kehityksel-35 liset osat hermostolle ja voi osoittaa ajan, jolloin kaikkia neurotrofiinejä yleisesti tarvitaan ylläpitämään mitoosin jälkeisten neuronien selviämistä. Niiden ilmenemisen 83 105343 ajoitus voisi kuitenkin olla osoitus muista neurotrofiinien rooleista kehittyvässä hermostossa (katso alla).

Vaikka geenin ilmenemisen aloitus tapahtuu samanaikaisesti 5 kolmelle neurotrofiinille, eroavat tasot suuresti, jotka ne - saavuttavat aikaisissa alkioissa. Nt-3 mRNA on verrattomas

ti runsainta alkioissa, kun taas BDNF mRNA:ta ilmennetään alhaisimpina tasoina. Tämä kontrasti NT-3- ja BDNF-ilmene-misen välillä jatkuu melkein jokaisessa tutkitussa tapauk-10 sessa. Kehityksen aikana on NT-3-ilmeneminen huomattavinta CNS-alueilla, joissa tapahtuu neuronien ja niiden prekurso-rien nopea lisääntyminen, vaellus ja erilaistuminen ja y-leensä laskee dramaattisesti CNS-alueilla, kun ne valmistuvat. BDNF-ilmeneminen vastasyntyneessä on päinvastoin 15 huomattavinta CNS-alueilla, joissa neurogeneesi on jo tapahtunut ja yleensä nousee CNS-alueilla niiden valmistuessa. Kiinnostavaa on, että tasot, jotka NT-3- ja BDNF-transkriptit lopuksi saavuttavat erilaisissa aikuisen CNS-alueissa, ovat melko samanlaiset. NT-3- ja BDNF-ilmenemisen 20 vastakkainen suhde kehityksen aikana liittyneenä niiden suhteellisen samanlaisiin profiileihin aikuisen CNS:ssä, osoittavat, että NT-3 ja BDNF saattavat joissakin tapauksissa toimia samoihin neuronaaleihin populaatioihin CNS: ssä. Jos niin on, niin meidän tietomme antaisivat olettaa, 25 että NT-3:lla on tärkeä osa näiden neuronien kehityksessä • (ehkä kohdehermotuksen perustamisen aikana), kun taas BDNF

saattaisi pääasiallisesti toimia myöhemmin samojen neuronien elämässä (s.o. valmistus- tai ylläpitämistekijänä). NGF-ilmeneminen vaihtelee paikallisesti kehityksen aikana, mut-30 ta näillä vaihteluilla ei ole yhdenmukaista mallia kuten NT-3- ja BDNF-ilmenemisellä on. NGFR mRNA-tasot eivät eri-» tyisesti kuvasta minkään kolmen neurotrofiinigeenin ilmene mistä, mikä on yhdenpitävää sen mahdollisuuden kanssa, että se saattaisi toimia yksittäisten neurotrofiinireseptorien 35 yhteisenä komponenttina (Rodriguez-Tebar et ai., 1990, Neuron 4:487-492). NGFR-ilmenemisellä on taipumus olla korkeinta CNS-alueiden aikaisessa kehittymisessä ja meidän 84 105343 tutkimuksemme ovat paljastaneet kiinnostavia kehityksellisesti säädeltäviä muutoksia NGFR-ilmenemisessä, mitkä ovat lisätutkimusten kohteena.

5 Vastakohtana NT-3:n ja BDNF:n samankaltaisille jakaantumisille aikuisen CNS:ssä, on niillä dramaattisesti erilaiset ilmenemismallit aikuisen ääreiskudoksissa; NT-3-transkrip-tien leveämpi perifeerinen jakaantuminen voi heijastaa aktiivisuutta solujen laajemmalle (ja erilaiselle) alueelle 10 (neuraali yhtä hyvin kuin ei-neuraali) ympäristössä kuin BDNF (Maisonpierre et ai., supra).

Vaikka on olemassa melkoisesti todisteita antaen olettaa, että sekä NGF:llä että BDNF:llä on tärkeä aikainen osa 15 hermoston kehityksessä, paljastaa analyysimme paljon yhte-näisemmän ja vaikuttavamman korrelaation merkittävän korkean NT-3-ilmenemisen ja aikaisen neuraalikehityksen aikana.

NT-3 mRNA-tasot kehittyvissä pikkuaivoissa ja vastasyntyneen aivotursossa ovat moninkertaisesti korkeammat kuin 20 minkään muun neurotrofiinin tasot missään muussa kudoksessa tai aivoalueessa ja enemmän kuin 2-kertaisesti korkeammat kuin minkään neurotrofiinin tasot aikuisen aivoissa. NT-3:n löytö uutena NGF:n kaltaisena proteiinina, joka voi tukea ainakin joitakin BDNF- ja NGF-riippuvaisia neuroneja 25 (Maisonpierre et ai., supra) ja joiden ajallinen ilmeneminen selvimmin on rinnan esiintyvä neuraalikehityksen kriittisten jaksojen kanssa, nostattaa mahdollisuuden, että NT-3 on fysiolooginen tekijä, joka tavallisesti on vastuussa joistakin kehityksellisesti tärkeistä toiminnoista, joiden 30 aikaisemmin on sanottu kuuluvan BDNF:lie tai NGF:lle. Tämän - perheen kaikkien jäsenten todellisten kehityksellisten o-< sien uudelleentutkimista tähdennetään, koska on mahdolli suus, että näitä läheistä sukua olevia tekijöitä vastaan olevat vasta-aineet voivat ristiinreagoida (Whittemore ja 35 Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-464).

Vaikka olemme aikaisemmin osoittaneet, että NT-3-voi toimia 85 105343 klassisena neuronaalisena selviävänä molekyylinä (Maison-pierre et a., supra) sallien NT-3:n toimia kohde-johdettuna tekijänä, jonka rajoitettu ilmeneminen johtaa neuronaali-seen valintaan ja karsimiseen, ei tämä millään muotoa sulje 5 pois NT-3:n muita kehityksellisesti tärkeitä osia (yhtä * hyvin muidenkaan neurotrofiinien). NT-3-ilmenemisen mallil la kehittyvässä hermostossa on huomattavia samankaltaisuuksia nestiinin (uusi välimuoto filamenttiproteiini, jonka ilmeneminen on CNS-alueiden, joissa taphtuu neurogeneesi, 10 tunnusmerkki - Lendahl et ai., 1990) ja SNAP (antigeeninen aikaisen neuriittikasvannaisen markkeri - Yamamoto et ai., 1986, J. Neurosci. 6:3576-3594). Päinvastoin kuin tapaus oli NGF:n kanssa (Clegg et ai., 1989, Devel. Biol. 134:30-37), on sympaattisten säikeiden sydämeen tuloa ennen korke-15 at NT-3-ilmenemisen tasot. Täten NT-3 saattaisi olla erityisesti liittynyt kehityksellisiin prosesseihin muihin kuin neuronaalinen selviäminen, neuronaalinen prekursorili-sääntyminen/erilaistuminen ja/tai kulkevien solujen tai niiden aksonien ohjaus; lisäoletukset NT-3:n sellaisista 20 mahdollisista fysiologisista osista tulevat äskettäisistä löydöistä, että yhdellä neurotrofiineista (s.o. NGF) voi olla osa neuronaalisen prekursorin lisääntymisessä in vitro. BDNF:llä voi päinvastoin olla, vaikka sitä on aikaisessa kehityksessä, yleisesti tärkeämpi osa pitkän aikaa 25 alkuperäisen neuronaalin kuoleman ja valinnan jakson jälkeen.

Kaikkien kolmen neurotrofiinin ilmenemisprofiileilla aikuisessa on silmiinpistävää samankaltaisuutta - kaikkia kolmea 30 neurotrofiinia ilmennetään verrattain korkeina tasoina aikuisen aivotursossa. Kun katkaistaan etuaivojen tyven ko-. . linergisten neuronien projektiot aivotursoon, johtaa se surkastumiseen ja näiden neuronien vähentyneeseen lähettä-jäsynteesiin (katsauksen tehneet Snider ja Johnson, 1989, 35 Ann. Neurol. 26:489-506). Samanlainen surkastuminen liittyy muistispesifisten tehtävien huonoon suorittamiseen ikääntyneissä rotissa ja ihmisissä, joilla on Alzheimerin tauti.

86 105343

Etuaivojen tyven kolinergisten neuronien surkastuminen voidaan saada käänteiseksi rottamalleissa antamalla NGF:ää.

Tässä esitetyt tiedot ovat yhtä pitäviä sen mahdollisuuden kanssa, että aikuisen aivoturso voi normaalisti antaa kaik-5 ki 3 neurotrofiinia etuaivojen tyveen, antaen olettaa että äskettäinen osoitus NGF:n ja BDNF:n komplementaarisille toiminnoille viljellyissä kolinergisissä neuroneissa heijastaa todelliset fysiologiset osat näille molekyyleille. NT-3-ilmeneminen on kuitenkin huomattavan korkeaa hyvin 10 aikaisin aivoturson kehityksessä ja laskee sitten aikuisen tasoille, jotka ovat samanlaiset kuin NGF:llä ja BDNF:llä.

Tämä korkea aikainen ilmeneminen jälleen antaa olettaa, että NT-3:lla voi olla ainutlaatuinen osa aikaisten yhteyksien ohjaamisessa tai luomisessa etuaivojen tyvestä tai 15 muista aivoturson tuojista tai dentate jyvässoluprekursori-en lisääntymisessä; NGF:n suhteellisen alhaiset tasot aikaisessa aivoturson kehityksessä ovat olleet todisteena vastaan NGF:n sellaiselle osalle (Large et ai., supra).

20 13. Mikro-organismien tallentaminen

Seuraavat tallennettiin 28 helmikuuta 1990 American Type Culture Collection:iin, 12301 Parklawn Drive, Rockville,

Maryland 20852:

25 ATCC

: Kanta saapumisnr.

bakteriofaagi DNA 4>hN3(Gl) 40763 bakteriofaagi DNA <$rN3(Gl) 40764 plasmidi pC8-rN3(Pl) 40766 30 plasmidi pC8-hN3(Pl) 40765 » ' Tämän keksinnön ei ole tarkoitus rajoittua tässä kuvattujen spesifisten suoritusmuotojen piiriin. Todellakin keksinnön erilaiset modifikaatiot niiden lisäksi, jotka tässä on 35 kuvattu, ovat ilmeisiä ammattimiehille edellä olevasta kuvauksesta ja liitteenä olevasta kuvasta. Sellaisten modifikaatioiden on tarkoitus sopia patenttivaatimusten pii- 87 105343 riin. Tässä on lainattu erilaisia julkaisuja ja ilmoituksia, jotka on liitetty tähän viitteeksi niiden kokonaisuutenaan .

5 Mikro-organismit jatkoa

American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852 10 US

Tallennuspäivä: 7. maaliskuuta 1990 Saapumisnr. 40764

Tallennuspäivä: 7. maaliskuuta 1990 Saapumisnr. 40765

Tallennuspäivä: 7. maaliskuuta 1990 Saapumisnr. 40766 15 1

Claims (21)

105343

1. Eristetty rekombinanttinen nukleiinihapposekvenssi, joka koodaa neurotrofiini-3 (NT-3) -proteiinia, tunnettu 5 siitä, että sillä on aminohapposekvenssi käsittäen sekvenssin: Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser

10 Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ser

15 Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleiinihapposekvenssi, 20 tunnettu siitä, että se käsittää cDNA-sekvenssin tai geno- misen DNA-sekvenssin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleiinihapposekvenssi, tunnettu siitä, että se on DNA-sekvenssi, jossa on ihmisen 25 sekvenssi kuten kuviossa 11 on kuvattu tai sen alasekvens- »· 1 si.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen nukleiinihapposekvenssi, tunnettu siitä, että nukleiinihapposek- 30 venssin, joka koodaa neurotrofiini-3-proteiinia, ilmentymistä säätelee toinen nukleiinihapposekvenssi niin, että ’ - neurotrofiini-3-proteiini ilmentyy isännässä, joka on trans formoitu rekombinanttisella nukleiinihappomolekyylillä.

5. Eristetty rekombinanttinen nukleiinihapposekvenssi, tunnettu siitä, että se on ribonukleiinihappo (RNA) -sek->; venssi, joka on komplementaarinen jonkin edellä olevan pa- 89 105343 tenttivaatimuksen mukaisen rekombinanttisen nukleiinihappo-molekyylin kanssa.

6. Nukleiinihappovektori, tunnettu siitä, että se käsittää 5 jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukaisen nukleiinihappoa ekvens s in .

7. Rekombinanttimikro-organismi, tunnettu siitä, että siinä on jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen nukleiinihap- 10 posekvenssi tai patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, joka mikro-organismi kykenee ilmentämään jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaista nukleiinihapposekvenssiä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen rekombinanttimikro-orga-15 nismi, tunnettu siitä, että se on bakteeri tai hiiva.

9. Solu, tunnettu siitä, että siinä on jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen nukleiinihapposekvenssi tai patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori. 20

10. Menetelmä neurotrofiini-3-proteiinin tuottamiseksi, jossa on patenttivaatimuksessa l kuvattu aminohapposekvenssi, tunnettu siitä, että kasvatetaan rekombinanttista isäntää, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaista 25 rekombinanttista nukleiinihapposekvenssiä tai patenttivaa- > « * timuksen 6 mukaisen vektorin siten, että isäntä ilmentää neurotrofiini-3-proteiinia, ja ilmentynyt neurotrofiini-3-proteiini eristetään. 30 li. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä on eukaryoottinen solu tai mikro-orga- ' '· nismi.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että isäntä on bakteeri tai hiiva. 90 105343

13. Jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neurotrofiini-3-proteiini on ei-glyko-syloitu.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neurotrofiini-3-proteiini on glykosy-loitu.

15. Osoitettavasta leimatun nukleiinihapposekvenssin, joka 10 käsittää ainakin 10 nukleotidia oleellisesti kuten on esitetty kuvion 11 ihmisen sekvenssissä, käyttö in vitro -menetelmässä hermoston sairauden tai häiriön diagnostisoimiseksi.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että hermoston sairaus tai häiriö valitaan tuumorista, de-generatiivisesta sairaudesta ja sensorineuronisairaudesta.

17. Neurotrofiini-3-proteiinin, joka on koodattu jonkin pa-20 tenttivaatimuksen 1-3 mukaisella nukleiinihapolla, käyttö in vitro -menetelmässä edistämään dopaminergisten neuronien selviämistä, jossa menetelmässä dopaminergiset neuronit altistetaan in vitro vaikuttavalle neurotrofiini-3-proteiini -konsentraatiolle. 25

18. Neurotrofiini-3-proteiinin, joka on koodattu jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisella nukleiinihapolla, käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamisessa yhdistämällä neurotrofiini-3-proteiini farmaseuttisesti hyväksyttävän 30 kantajan kanssa.

19. Neurotrofiini-3-proteiinin, joka on saatu jonkin patenttivaatimuksen 10-14 mukaisella menetelmällä, käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamisessa yhdistämällä 35 neurotrofiini-3-proteiini farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. 91 105343