SK423090A3 - Recombinant molecule dna coding protein neurotrophin-3, pharmaceutical compositions containing its and their use - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka neurotrofínu-3 (NT-3), nového neurotrofného faktora, ktorý patrí do skupiny génov BDNF/NGF. Gén, ktorý je kódom pre NT-3 bol klonovaný a bol stanovený jeho reťazec a bola tiež dosiahnutá expresia rekombinantného génu pre NT-3 v bunkách cicavcov. Rekombinantný NT-3 má spektrum účinnosti, ktoré je odlišné od spektra BDNF a NGF. Vynález poskytuje reťazce nukleových kyselín, ktoré sú kódom pre NT-3, ďalej v podstate čistý NT-3, fragmenty a deriváty tejto látky a protilátky proti bielkovine NT-3 alebo peptidom, ktoré tvoria jej súčasť. Uvedené produkty je možné použiť pri diagnóze a liečbe rôznych neurologických porúch, najmä periférnych neuropatií, Alzheimerovej choroby a Parkinsonovej choroby.

Doterajší stav techniky

Vývoj a udržiavanie stavu nervového systému závisí na bielkovinách, ktoré sú známe ako neurotrofné faktory. Pri normálnom vývoji centrálnej a periférnej nervovej sústavy dochádza k uhynutiu veľkého počtu neurónov, tento jav zrejme hrá zásadnú úlohu pri regulácii počtu neurónov, ktoré zasahujú do určitej oblasti, ako bolo uvedené v Berg D., 1982, Neuronal Development, 297 až 331, Cowan a ďalší, 1984, 225: 1258 až 1265. Ablačné a transplantačné pokusy na periférnych cieľových tkanivách ukázali, že v priebehu vývoja dochádza k uhynutiu neurónov pri kompetícii vzhľadom na faktory, ktoré obmedzujú možnosť prežitia (neurotrofné faktory), ktoré sú produkované v projekčných oblastiach týchto neurónov. Tieto pozorovania viedli k identifikácii rastového nervového faktora (NGF), ktorý zatiaľ zostáva najlepšie charakterizovanou neurotrofnou molekulou, ako bolo uvedené v publikáciách Levi-Montalcini a Angeletti P. U., 1968, Physiol, Rev. 48:534 až 69, Thoenen H., Barde Y. A:, 1980, Rev. 60:1284 až 335. Porozumenie úlohy a mechanizmu pôsobenia NGF

-2bolo veľmi uľahčené objavením bohatého zdroja tejto bielkoviny v podčeľusťových žľazách myších samcov, čo umožnilo čistenie tejto látky a jej klonovanie (Ullrich a ďalší, 1983, Náture 303:821 až 825, Scott a ďalší, 1983, Náture 302:583 až 40) a tiež produkciu netralizujúcich protilátok. Vzhľadom na to, že NGF podporuje obmedzenú skupinu neurónov, bolo dlho predpokladaná existencia ďalších neurotrofných faktorov (Varon S. a Adler R. 1981, Adv. Cellular Neurobiol. 2:115 až 163, Barde a ďalší, 1987, Prog. Brain Res. 71:185 až 189, Snider W. D. a Johnson E. M., 1989, Ann. Neurol. 26:489 až 506). Teraz je zrejmé, že takéto faktory existujú, avšak malé množstvo týchto faktorov brzdí stanovenie vlastností ich molekúl. Napriek tomu, čistenie malých množstiev dvoch takýchto bielkovín a to neurotrofného faktora z mozgu (BDNF) a ciliárneho neurotrofného faktora (CNTF) v poslednej dobe umožnilo čiastočne zistiť reťazec nukleových kyselín pre tieto látky (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 152, Stockli a ďalší, 1989, Náture 342:21 až 28 a Lin a ďalší, 1989, Science 246:1023 až 25. Cez špecifické zvláštnosti jednotlivých populácií neurónov majú BDNF s NGF (avšak nie s CNTF) dostatočnú štruktúrnu homoiógiu na to, aby bolo možné ich považovať za členy jednej skupiny (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 152).

Iné neurotrofné faktory

V posledných desiatich rokoch bol podaný celý rad správ, týkajúcich sa neurotrofnej účinnosti extraktov rôznych tkanív a tiež živného prostredia rôznych typov buniek za určitých podmienok. Takmer vo všetkých prípadoch však bol pokrok v čistení a stanovení vlastností brzdený malým množstvom účinnej zložky radu pikogramov až nanogramov na gram tkaniva.

Okrem toho boli pre periférne neuróny navrhnuté postupy, ktoré sú plne adekvátne, zatiaľ čo pre centrálny nervový systém dosiaľ nie je k dispozícii postup, ktorý by bol špecifický a reprodukovateľný. Jednotlivé typy periférnych neurónov je možné dokázať ako jednotlivé, ľahko od seba oddeliteľné gangliá, neuróny centrálneho nervového systému sú vo svojej distribúcii vysoko heterogénne. Je teda potrebné špecifické značenie na identifikáciu alebo na obohatenie určitej skupiny neurónov v centrálnom nervovom systéme (CNS). Pok-3rok v získavaní možností takéhoto značenia, napríklad protilátok, namierených proti povrchu bunky alebo zložkám bunkového skeletu alebo špecifické histologické farbivá sú zatiaľ veľmi obmedzené. Bolo preto zatiaľ dokázané, že charakterizácia neurotrofných faktorov, ktoré sú i) menej časté než NGF, ii) ťažko dokázateľné a iii) nedostupné v dostatočnom množstve na vyvolanie produkcie protilátok je nesmierne ťažkým postupom.

Porovnanie rastového faktora z mozgu s nervovým rastovým faktorom

Neurotrofná účinnosť, schopná udržať pri živote neuróny dorzálnych koreňov ganglií kuracieho embrya in vitro bola identifikovaná v upravenom prostredí, v ktorom boli pestované bunky potkanieho gliómu C-6 (Barde a ďalší, 1978, Náture 274:818). Táto účinnosť nebola neutralizovaná protilátkami proti myšaciemu NGF, čo znamená pravdepodobnú prítomnosť iného neurotrofného faktora v tomto prostredí. Podobný účinok, ktorý nebolo možné blokovať protilátkami proti NGF bol dokázaný aj v kultúrach astrogliálnych buniek normálneho mozgu dospelých potkanov (Lindsay 1979, Náture 282:80 až 82, Lindsay a ďalší, 1982, Brain Res. 243:329 až 343) a v extraktoch vyvíjajúceho sa a dospelého mozgu potkanov (Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1199 až 1203) a vyvíjajúcej sa a dospelej kuracej miechy (Lindsay a Peters 1984, Neurosci. 12:45 až 51). Avšak v žiadnom prípade neboli účinné faktory izolované ani identifikované a zostáva pochybné, či pozorovaná účinnosť bola dôsledkom prítomnosti jedného alebo väčšieho počtu rôznych faktorov.

Pri použití mozgu prasaťa ako východiskového materiálu podali Barde a ďalší (1982, EMBO J., 1:549 až 553 správu o faktore, ktorý sa teraz nazýva mozgovým neurotrofným faktorom (BNDF) a ktorý podporuje prežitie neurónov dorzálnych koreňov ganglií u kuracích embryí E10/E11. Neurotrofná účinnosť bola dokázaná pre vysoko bázickú bielkovinu (izoelektrický bod, pl 10,1), ktorá migrovala pri elektroforéze na géli s dodecylsíranom sodným (SDS) ako jednotný pás s molekulovou hmotnosťou 12,3 kjednotky. Purifikačný faktor bol

1,4 x 10θ, avšak výťažok bol veľmi nízky, približne len 1 pg BDNF z 1,5 kg mozgu prasaťa. Okrem toho vzhľadom na to, že posledným stupňom pri čistení

-4tejto látky bola preparatívna elektroforéza na géli, nebolo možné účinnosť BDNF celkom renaturovať vzhľadom na prítomnosť zvyškov SDS (Barde a Thoenen, 1985, Hormones and Celí Regulation, zv. 9, Dumont a ďalší, Elservier Science Publishers, str. 385 až 390). Bolo uvedené, že vysoko bázická povaha a molekulová hmotnosť BDNF boli veľmi blízke monoméru NGF. Avšak BDNF má vlastnosti, ktoré sú odlišné od známych vlastností NGF v tom zmysle, že

a) pri biologickom pokuse s dorzálnymi koreňmi kuracích ganglií nie je možné pozorovať zjavný účinok protilá tok proti NGF na účinnosť BDNF,

b) v tom istom pokuse bol účinok BDNF a NGF aditívny a

c) na rozdiel od NGF nemá BDNF žiadny účinok na prežitie sympatických neurónov u kurčiat E12.

Okrem toho v priebehu štúdií s extraktmi z mozgu bolo pozorované, že neurotrofná účinnosť z týchto zdrojov zrejme pôsobí na senzorické neuróny v neskoršom štádiu vývoja než v prípade NGF. Pri použití disociovaných kultúr neurónov kuracieho embrya, pestovaných na polykatiónovom substráte, ako polylyzíne alebo polyornitíne bolo dokázané, že BDNF umožnil prežitie viacej než 30 % E10-11 (embryonálny deň 10 alebo 11) neurónov dorzálnych koreňových ganglií, avšak pravdepodobne mal len malý vplyv na prežitie tých istých neurónov v E6 (Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1199 až 1203). Za podobných podmienok podporuje NGF prežitie 30 až 40 % E6 neurónov DRG. Je zaujímavé, že neskoršie bolo zistené, že pri pestovaní substrátu, potiahnutého extracelulárnou matricou glykoproteínu laminínu podporoval tak NGF, ako aj BDNF prežitie približne 50 % neurónov DRG kuracích embryí vo veku E6 až E12(Lindsaya ďalší, 1985, Develop. Biol. 112,319 až 328). V tejto publikácii sa uvádza, že účinok NGF a BDNF je aditívny v prípade, že obe tieto látky sú prítomné v sýtiacich koncentráciách.

Skoršie štúdie podľa publikácie Levi-Montalcini, 1966, The Harvey Lectures 60, 217 až 259, týkajúce sa špecifickosti NGF a účinkov tejto látky na neuróny uvádzajú, že NGF zrejme nie je všadeprítomným neurotrofným faktorom, ani pre senzorické neuróny vzhľadom na to, že táto látka nemá žiadny účinok na neuróny v niektorých senzorických hlavových gangliách kuraťa, najmä v ganglion nodosum desiateho hlavového nervu. Pri neskorších štúdiách in

-5vivo (Johnson a ďalší, 1980, Science 210, 916 až 918; Pearson a ďalší, 1983, Develop. Biol. 96, 32 až 36) bolo dokázané, že deprivácia NGF v priebehu embryogenézy nemala žiadny vplyv na prežitie neurónov vo väčšine kraniálnych senzorických gangliách potkana, zatiaľ čo to isté opatrenie viedlo k veľkej deplecii počtu neurónov v senzorických gangliách, odvodených od neurálnej ryhy. Pri podrobnejších štúdiách in vivo (Lindsay a Rohrer, 1985, Develop. Biol. 112, 30 až 48, Davies a Linsay, 1985, Develop. Biol. 111, 62 až 72 a Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí Sci. Suppl. 3, 115 až 129) sa jasne ukázalo, že NGF podporuje prežitie väčšiny senzorických neurónov, odvodených od neurálnej ryhy avšak nemá žiadny zjavný účinok na prežitie kraniálnych senzorických neurónov, odvodených od hlavovej časti zárodkového listu.

Prvým dôkazom špecifickosti BNDF pre neuróny, odlišnej od NGF bola skutočnosť, že in vitro bolo možné dokázať, že čistený BDNF podporuje prežitie 40 až 50 % senzorických neurónov, disociovaných od ganglion nodosum, odvodeného u kuracieho embrya od hlavovej časti zárodkového listu v štúdiu E6, E9 alebo E12 (Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí Sci. Supp. 3, 115 až 129). NGF nemal na tieto neuróny žiadny zjavný účinok ani sám o sebe ani v spojení s BDNF. Ako bolo ďalej dokázané pri použití kultúr explantátov, BDNF zrejme podporuje prežitie a rast neuritov z ostatných senzorických ganglií, vrátane ganglion petrosum, geniculatum a ventrolaterale trigeminu (Davies a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6, 1897 až 1904) žiadne z uvedených ganglií nebolo citlivé na NGF. Vo všetkých vyššie uvedených štúdiách nemali neutralizačné protilátky proti NGF žiadny vplyv na pozorovaný účinok BDNF. Okrem pozorovaných účinkov na neuróny z periférnych ganglií v kultúre bolo dokázané, že BDNF tiež stimuluje prežitie a diferenciáciu neurónových buniek z neurálnej ryhy prepelice (Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41, 79 až 86.

Až dosiaľ brzdila nemožnosť získať dostatočné množstvo BDNF na imunizáciu produkcie protilátok proti BDNF na porovnanie s protilátkami proti NGF v ich účinku na neuróny a tiež nebolo možné vykonať pokusy so skríženou neutralizáciou NGF a BDNF. Teraz však opisujú dve publikácie a to Kalcheim a ďalší, 1987, Embo J., 6, 2871 až 2873 a Hofer a Barde, 1988, Náture 331, 261 až 262) fyziologickú úlohu BDNF u vtákov. V prípade, že sa uloží vo vajci mechanická prekážka medzi dorzálne koreňové gangliá v dňoch E3/E4

-6a ich cieľ v CNS v nervovej trubici, je možné pozorovať, že celý rad neurónov týchto ganglií zahynie (Kalcheim a Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116,451 až 466. Predpokladá sa, že toto uhynutie neurónov by mohlo byť spôsobené nedostatkom neurotrofného faktora z CNS (nervová trubica). Bolo ďalej pozorované, že BDNF v spojení s membránou, opatrenou povlakom laminínu môže zabrániť tomuto uhynutiu buniek (Kalcheim a ďalší, Embo J., 6, 2871 až 2973). Po vstreknutí BDNF do vyvíjajícich sa prepeličích vajec potláča prirodzené uhynutie v ganglion nodosum, čo nie je možné dokázať pre NGF (Hofer a Barde, 1988, Náture 331, 261 až 262).

Okrem účinku na periférne senzorické neuróny v nervovej ryhe aj v hlavovej časti podporuje BDNF prežívanie vyvíjajúcich sa neurónov CNS. Johnson a ďalší (1986, J. Neurosci. 6, 3031 až 3938) uverejnili údaje, ktoré dokazujú, že BDNF podporuje prežitie retinálnych gangliových buniek z potkaních embryí E17. Tým sú rozšírené skoršie poznatky, ktoré dokázali, že niektoré upravené prostredia a extrakty z mozgu, pripravené z cieľových oblastí retinálnych gangliových buniek podporovali prežívanie týchto neurónov (McCaffery a ďalší, 1982, Ex. Brain. Res. 48, 37 až 386, Sarthy a ďalší, 1983, J. Neurosci. 3, 2532 až 2544, Turner a ďalší, 1983, Dev. Brain Res. 6, 77 až 83).

Okrem účinkov na prežitie vyvíjajúcich sa neurónov v kultúre má BDNF tiež zrelé neuróny periférneho aj centrálneho nervového systému v kultúre. Bolo dokázané, že BDNF, rovnako ako NGF, stimuluje regeneráciu axónov z neurónov DRG dospelých potkanov v kultúre (Lindsay, 1988, J. Neurosci. 8, 2394 až 2405), napriek tomu, že zrelé senzorické neuróny zrejme nevyžadujú na svoje prežitie v kultúre in vitro na 3 alebo 4 týždne neurotrofné faktory. Okrem toho v kultúre retinálnych buniek dospelých potkanoch bolo pozorované, že BDNF podporuje tak prežitie, ako aj predĺženie axónov z gangliových buniek sietnice (Thanos a ďalší, 1989, Eur. J. Neurosci. 1, 19 až 26). Porovnanie biologických účinkov NGF a BDNF je zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 1.

-Ί Tabuľka I

Porovnanie biologickej účinnosti BDNF a NGF^X Prežitie

Periférny nervový systém BDNF NGF

i) E6 DRG kurčaťa	-	++
E10 DRG kurčaťa	-	++
E12 symp. kurčaťa
(Barde a ďalší, 1980, vyššie)	-	++
ii) E6-E12 DRG kurčaťa	++	++
E6-E12 nodosum kurčaťa	++	-
E12 symp. kurčaťa	-	++
E12 ciliárny g. kurčaťa
(Lindsay a ďalší, 1985, vyššie)	-	-
iii) E3-E14 kurčaťa:
jugulare	+/++	++
DM-trigemini	+/++	++
petrosum	+/++	-
geniculatum	+/++	-
VL-trigemini	++	+
vestibulare	-	-
mesencephalicum	++	-

(Davies a ďalší, 1986, vyššie,

Barde a ďalší, 1987, Prog.,

Brain Res., 71:185 až 198)

Centrálny nervový systém

i) E177 gangliové bunky sietnice potkana ++ (Johnson a ďalší, 1986,

J. Neurosci. 6:3031 až 3038)

-8Poznámky k tabuľke:

^x v chronologickom poradí podľa dátumu zverejnenia, účinky boli skúmané in vitro ^xx žiadne prežitie (-), malý počet prežití (+), dobré preži tie (++).

Cieľové neuróny pre neurotrofné faktory, odvodené od mozgu

Senzorické neuróny periférnych nervových ganglií pochádzajú z niektorej z dvoch od seba odlišných prechodných embryonálnych štruktúr, z ktorých jedna je nervová ryha a druhá z týchto štruktúr je zväčšená kraniálna časť tejto ryhy zo forme doštičiek. Nervová ryha dáva vznik tak neurónom, ako aj satelitným bunkám autonómnych ganglií a spinálnym senzorickým gangliám, t.j. DRG. Príspevok oboch uvedených štruktúr na tvorbu senzorických ganglií kraniálnych nervov bol študovaný za použitia transplantačného chimérneho systému prepelica/kurča, podľa publikácie Le Douarin, 1973, Develop. Biol. 20:217 až 222, Noden, 1978, Develop. Biol. 67:313 až 329, Narayan a Narayan, 1980, Anat. Rec. 196:71 až 82, Ayer-Le Lievre a Le Douarin, 1982, Develop. Biol. 94: 291 až 310, D’Amico-Martel a Noden, 1983, Am. J. Anat. Rec. 196:445 až 468). V zhrňujúcej publikácii Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí Sci. Supp. 3:115 až 129 sa uvádza, že aspoň u vtákov pochádzajú neuróny distálnych ganglií kraniálnych nervov VII, IX a X (ganglion geniculatum, petrosum a nodosum) a neuróny vestibulárne-akustického komplexu VIII kraniálneho nervu výlučne z hlavovej časti. Trigeminálny ganglion V. kraniálneho nervu obsahuje neuróny z oboch uvedených štruktúr, pričom neuróny z hlavovej časti je možné nájsť prevažne vo ventrolaterálnej časti maxillomandibulárneho laloku, zatiaľ čo satelitné bunky všetkých kraniálnych ganglií majú svoj pôvod zrejme výlučne v nervovej ryhe.

Z pokusov in vitro, pri ktorých boli použité tak explantáty, ako aj disociované neuróny obohatenej kultúry senzorických neurónov miechy a mozgu je zrejmé, že senzorické neuróny z nervovej ryhy odpovedajú na pôsobenie NGF. Na rozdiel od toho, odpovedajú neuróny, ktorých pôvod je v hlavovej časti vrátane neurónov ventrolaterálnej časti ganglia trigeminu a celej populácie neurónov z ganglion vestibulare, geniculatum, petrosum a nodosum v podstate neodpovedajú na pôsobenie NGF v priebehu svojho emryonálneho vývoja. Na-9priek rozdielom v požiadavkách a v odpovedi na NGF, ako je zrejmé z tabuľky 1, sú oba tieto typy neurónov citlivé na účinky BDNF, a to tak pokiaľ ide o prežitie, ako aj pokiaľ ide o vplyv na tvorbu neuritov (Lindsay a ďalší, 1985, J. Celí. Sci. Supp. 3:115 až 129, Lindsay a ďalší, 1985, Develop. Biol. 112:319 až 328, Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41:79 až 86). Tebar a Barde (1988, J: Neurosci. 8:3337 až 3342) študovali väzbové parametre rádioaktívne značeného BDNF na neurónoch ganglií dorzálnych koreňov u kurčaťa. Ich výsledky sú v súlade s výsledkami, ktoré dokazujú existenciu dvoch skupín receptorov BDNF, z ktorých jedna má vysokú afinitu pre BDNF a druhá afinitu nízku. V prípade sympatických nervov neboli pozorované žiadne receptory s vysokou afinitou.

Známe neurónové ciele pre BDNF boli zhrnuté v publikácii Barde a ďalší, 1987, Prog. Brain Res. 71:185 až 189. Pred existenciou tohto vynálezu nebolo možné vykonávať identifikáciu buniek, syntetizujúcich BDNF vzhľadom na to, že neboli k dispozícii sondy typu nukleových kyselín alebo protilátok, špecifických proti BDNF. Pokusy o prípravu polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok proti BDNF boli neúspešné. Tento neúspech zabrzdil molekulárne klonovanie BDNF, stanovenie fyziologického účinku nedostatku BDNF in vivo na vyvíjajúce sa neuróny, kvantitatívne stanovenie BDNF v tkanivách pomocou imunologických skúšok a lokalizáciu BDNF pri použití imunocytochémie.

V nasledujúcej tabuľke II sú uvedené neuróny podľa svojej odpovede na BDNF.

Tabuľka II

Neuróny, odpovedajúce a neodpovedajúce na BDNF^X

A. Odpovedajúce neuróny

I. Senzorické neuróny kurčaťa z nervovej ryhy v

a) gangliách dorzálnych koreňov

b) ganglion jugulare

c) dorsomediálnom gangliu trigeminu

d) mesencefalickom jadre trigeminu^xx

II. Senzorické neuróny kurčaťa z ektodermálnej doštičky

-10a) ganglion nodosum

b) ganglion vestibulare

c) ganglion petrosum

d) ganglion geniculatum

e) ventrolaterálny ganglion trigeminu

III. Gangliové bunky sietnice potkanov

IV. Gangliové bunky sietnice kurčaťa^xxx

B. Neodpovedajúce neuróny

I. Neuróny sympatiku kurčaťa a potkana

II. Parasympatické ciliárne neuróny kurčaťa ^x Barde a ďalší, 1987, Prog. Brai Res. 71:185 až 189 ^xx Davies a ďalší, 1986, Náture 319:497 až 499 ^xxx Rodriguez-Tebar a ďalší, 1989, Dev. Biol. 136:296 až 303

Klonovanie génu pre neurotrofný faktor z mozgu

Kolonovanie génu pre BDNF bolo prvýkrát vykonané postupom, opísaným v US patentovej prihláške č. 07/400,591, podanej 30. augusta 1989, (pozri tiež WO 91/03568). Najskôr boli čistené malé množstvá BDNF z mozgu prasaťa, čím bolo možné stanoviť fragmenty reťazcov aminokyselín, ktoré potom bolo možné použiť na stanovenie zodpovedajúcich reťazcov oligonukleotidov. Tieto syntetické oligonukleotidy boli potom použité ako priméry pri reakciách, založených na polymeráze (PCR) za použitia cDNA templátu, pripraveného z buniek, produkujúcich BDNF. Produkty, získané PCR boli použité ako sondy, umožňujúce klonovanie úplnej cDNA a/alebo génov pre BDNF genómu z rôznych druhov živočíchov vrátane človeka, prasaťa, potkana, myši, reťazce týchto génov boli taktiež stanovené. Expresia rekombinantného BDNF bola dosiahnutá v bunkách COS.

Podstata vynálezu

- 11 Podstatu vynálezu tvorí neurotrofín-3 (NT-3), novoobjavená látka zo skupiny génu pre BDNF. Vynález je sčasti založený na identifikácii oblastí v reťazcoch nukleových kyselín, ktoré sú homológne pre BDNF a NGF (US patentová prihláška č. 07/400,591, podaná 30. augusta 1989, pozri tiež WO 91/03568). Táto metóda bola použitá aj na identifikáciu NT-3.

Vynález sa týka aj rekombinantných molekúl DNA, ktoré sú kódom pre NT-3. V špecifickom uskutočnení vynálezu je DNA, ktorá je kódom pre NT-3 odvodená od DNA človeka, myši alebo potkana.

Spôsobom podľa vynálezu je možné získať nielen bielkoviny NT-3 a príbuzné peptidy, ale aj protilátky, špecifické proti bielkovinám NT-3 a príbuzným peptidom.

Podľa vynálezu je možné NT-3 použiť pri diagnóze a/alebo liečbe neurologických ochorení vrátane periférnych neuropatií ako sú diabetické neuropatie, neuropatie toxické, z nedostatkov vo výžive, hereditárne a tiež neuropatie a tiež neuropatie spojené s ochorením AIDS a s degeneratívnymi ochoreniami, ako je Alzheimerova choroba. Bolo dokázané, že NT-3 podporuje prežívanie dopaminergných neurónov. Je teda možné NT-3 použiť tiež pri Parkinsonovej chorobe. Vzhľadom na to, že NT-3 má spektrum účinnosti, odlišné od spektra BDNF alebo NGF, ide o novú a cennú možnosť vyvolať opätovný rast a regeneráciu centrálneho nervového systému.

Vynález sa týka neurotrofínu-3, čo je nový člen skupiny neurotrofných molekúl z radu BDNF/NGF. Kvôli jasnosti a zrozumiteľnosti bude podrobný opis uskutočnenia rozdelený do nasledujúcich odstavcov:

i) klonovanie neurotrofínu-3, ii) expresia neurotrofínu-3, iii) skúšky biologickej účinnosti neurotrofínu-3, iv) gény pre neurotrofín-3 a bielkoviny,

v) tvorba protilátok proti neurotrofínu-3 a vi) využitie uvedených poznatkov v zmysle vynálezu.

Identifikácia ďalších členov skupiny BDNF/NGF

Klonovanie neurotrofínu-3

-12Gény NT-3 podľa vynálezu je možné identifikovať pri použití vyššie uvedených metód. Podľa dvoch špecifických výhodných uskutočnení vynálezu je možné gén identifikovať a klonovať nasledujúcim spôsobom.

Podľa jedného z výhodných uskutočnení je možné použiť primér v zmysle reťazca (alebo 5') s reťazcom nukleotidov (podľa nomenklatúry IUPAC) GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GA (primér 1, ktorý zahrňuje namiesto štiepenia a endonukleáz Bam Hl a Sacll a primér proti zmyslu reťazca (alebo 3') s reťazcom nukleotidov TCG AATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCA (primér 2, ktorý zahrňuje miesto štiepenia endonukleáz EcoRI a Xbal) pre reakciu s polymerázou (Saiki a ďalší, 1985, Science 230:1350 až 1354) za použitia bežne dodávaného zariadenia Perkin-Elmer Cetus thermal cycler a thermostabilnej DNA-polymerázy z thermus aquaticus (Taq polymeráza). Po približne štyroch cykloch pri teplote 45 °C je možné vykonať zvyšných 36 cyklov pri teplote 49 °C. Výslednou DNA, ktorá je produktom amplifikácie je potom možné oddeliť elektroforézou na polyakrylamidovom gélii a produkt, ktorý svojou dĺžkou zodpovedá očakávanému produktu, t.j. približne 137 párov báz je možné vymyť, reamplifikovať a potom rozštiepiť dvoma reštrikčnými endonukleázami, z ktorých jedna odštiepi gén NGF organizmu v rámci amplifikovaného segmentu a druhá odštiepi reťazec génu BDNF organizmu v rámci amplifikovaného segmentu. Nerozštiepená DNA (ktorá pravdepodobne nie je kódom pre NGF ani pre BDNF vzhľadom na to, že nebola rozštiepená endonukleázou) potom môže byť oddelená od rozštiepenej DNA elektroforézou na polyakrylamidovom géli, vymytá a asymetricky amplifikovaná (Innis a ďalší, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:9436 až 9440) a jej reťazec môže byť analyzovaný (Sanger a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3918 až 3921) napríklad za použitia primérov 1 a 2. Na základe takto získaného reťazca je možné skonštruovať ďalšie priméry v zmysle z proti zmyslu reťazca, ktoré potom presnejšie odrážajú reťazec nového génu. Je možné použiť napríklad ďalšie priméry v zmysle reťazca, ako GGGATTGATGAC AAA (primér 3) a ACTCTCAGTGCAAAACTTCGC (primér 4) a primér proti zmyslu reťazca (5') CGGATCCGAATTCTGCAG(T)-|2V (primér 5). RNA, pripravená z tkaniva, pravdepodobne produkujúceho neurotrofný faktor, napríklad mozgu (za použitia akéhokoľvek štandardného postupu, napríklad podľa publikácie Okaya- 13ma a ďalší, 1987, Meth. Enzymol. 154:3 až 28) môže byť transkribovaná napríklad za použitia priméru 5, ktorý je skonštruovaný tak, aby zodpovedal zakončeniu 3'poly(A) a obsahuje miesto pôsobenia reštrikčnej nukleázy Bam Hl, EcoRI a Pstl (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 152). Výsledná cDNA potom môže byť amplifikovaná PCR za použitia primérov 3 a 5 a potom reamplifikovaná za použitia primérov 4 a 5. Potom je možné vykonať Southern blot za použitia produktov poslednej z uvedených reakcií a hybridizáciu s ³2p-_znač_enou oligonukleotidovou sondou, zodpovedajúcou reťazcu smerom dole od reťazcov primérov 3 a 4. Takto identifikované fragmenty DNA je možné klonovať vo vhodnom vektore a najdlhší získaný včlenený úsek je možné použiť na sériové vyšetrenie zostavy genómu, získanej zo skúmaného organizmu. Pozitívne klony, identifikované týmto spôsobom je potom možné analyzovať štandardným štiepením reštrikčnými enzýmami a stanovením nukleotidového reťazca.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je možné syntetizovať oligonukleotidy, zodpovedajúce segmentom reťazcov bielkoviny, ktoré sú vysoko zachované tak v NGF, ako aj v BDNF. Týmito reťazcami aminokyselín môžu napríklad byť (obr. 7D)

1) Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Val-Cys-Asp-Ser,

2) Lys-Gln-Tyr-Phe-(Tyr/Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys,

3) Gly-Cys-Arg-lle-Asp a

4) Trp-Arg-Phe-lle-Arg-lle-Asp-Thr-(Ser/Ala)-Cys-Val-Cys.

V PCR reakciách je možné použiť celý rad oligonukleotidov v zmysle a proti zmyslu reťazca (s obsahom degenerovanej časti s 15 až 26 nukleotidmi, čo zodpovedá 5 až 9 aminokyselinám vo vyššie uvedenom reťazci bielkoviny v zmysle alebo proti zmyslu reťazca a nedegenerovanými koncovými miestami pôsobenia reštrikčných enzýmov). Je možné vykonať amplifikačné reakcie medzi pármi primérov v zmysle reťazca smerom hore a proti zmyslu smerom dolu za štandardných podmienok pre každý pár primérov, tieto podmienky je možné stanoviť pokusne. Napríklad primér v zmysle reťazca (zodpovedajúci vyššie uvedenému reťazcu 1 aminokyselín) je 5'-GACTCGAGTCGACATCG-GTN-TGY-GAY-WSN-RTN-WS-3' a primér proti zmyslu reťazca (ktorý zodpovedá vyššie uvedenému reťazcu aminokyselín 2) je 5'-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWARAA-RTA-YGT-3' a je možné ho použiť na amplifikačnú reakciu pri použití DNA alebo cDNA genómu, odvodeného od vhodného zdroja, napríklad templátu. Produkt amplifikačnej reakcie za použitia párov primérov v zmysle reťazca smerom dolu a proti zmyslu reťazca smerom hore je možné použiť ako hybridizačné sondy pri Southern blot DNA genómu na identifikáciu produktu PCR, ktorý hybridizuje s DNA genómu, obsahujúci oblasti, homológne vzhľadom na sondy, rovnako ako s oblasťami, ktoré vzhľadom na tieto sondy homológne nie sú (napríklad reťazce odlišné od NGF a BDNF). Produkt PCR, ktorý identifikuje nový reťazec DNA genómu je možné použiť na sériové vyšetrenie zostav genómu alebo cDNA a tým aj na selekciu klonov, ktoré sú kódom pre nové látky zo skupiny génov BDNF/NGF.

Expresia neurotrofínu-3

Reťazec nukleotidov, podľa vynálezu je možné uložiť do vhodného vektora na expresiu, tj. vektora, ktorý obsahuje nutné prvky pre transkripciu a transláciu uloženého kódového reťazca pre bielkovinu. Nutné signály na transkripciu je tiež možné dodať pomocou natívneho génu NT-3 a/alebo oblastí, ktoré ho bezprostredne obklopujú. Na expresiu reťazca, ktorý je kódom pre bielkovinu je možné použiť celý rad systémov vektor-hostiteľ. Ide napríklad o systémy cicavčích buniek, infikovaných vírusom, napríklad vírusom vaccinia, adenovírusom a podobne, o bunky hmyzu, infikované vírusom, napríklad baculovírusom, mikroorganizmy, napríklad kvasinky s obsahom vektorov z kvasiniek alebo baktérie, transformované DNA bakteriofágu, DNA plazmidu alebo DNA kozmidu. Vo výhodnom uskutočnení môže vektor na expresiu obsahovať CMV promótor (Stephens a Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res. 17:7110) a začiatok replikácie SV40. Prvky týchto vektorov na expresiu sa menia podľa účinnosti a špecifickosti. V závislosti na použitom systéme vektor-hostiteľ je možné použiť ktorýkoľvek z celého radu prvkov na transkripciu a transláciu.

Je možné použiť aj ktorúkoľvek zo známych metód na uloženie fragmentov do vektora za účelom konštrukcie vektorov na expresiu, obsahujúcich chimérny gén, ktorý je tvorený príslušnými riadiacimi signálmi na transkripciu a transláciu a kódovým reťazcom pre bielkovinu. Tieto postupy môžu zahrňovať tvorbu rekombinantnej DNA in vitro, syntetické techniky a tiež rekombináciu in

-15vivo (genetickú rekombináciu). Expresiu reťazca nukleovej kyseliny, ktorý je kódom pre bielkovinu NT-3 alebo jej peptidový fragment je možné riadiť pomocou druhého reťazca nukleovej kyseliny tak, že k expresii bielkoviny NT-3 alebo peptidu dochádza v hostiteľovi, transformovanom rekombinantnou molekulou DNA. Je napríklad možné riadiť expresiu NT-3 pomocou akéhokoľvek systému promótora s pomocným prvkom, ktorý je v danej oblasti techniky známy. Promótory, ktoré je možné použiť na dosiahnutie expresie NT-3 sú napríklad promótorová oblasť SV40 (Bernoist a Chambon, 1981, Náture 290:304 až 310), promótor, ktorý je obsiahnutý v 3'-terminálnom opakovaní Rousovho vírusu sarkomu (Yamamoto a ďalší, 1980, Celí 22:787 až 797), promótor pre tymidínkinázu vírusu herpesu (Wagner a ďalší, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:1444 až 1445), riadiaci reťazec metalotionínového génu (Brinster a ďalší, 1982, Náture 296: 39 až 42), prokaryotické vektory na expresiu, napríklad promótor beta-laktamázy (Villa-Komaroff a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727 až 3731) alebo tac-promótor (DeBoer a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21 až 25), súhrn je možné nájsť napríklad v publikácii Useful proteins from rekombinant bacteria, Scientific American, 1980:242:74 až 94. Ďalej je možné použiť vektory ria expresiu v rastlinách s obsahom promótora pre nopalínsyntetázu (Herrera-Estrella a ďalší, Náture 303:209 až 231) alebo promótor RNA 35S vírusu mozaiky karfiolu (Gardner a ďalší, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) a promótor pre fotosyntetický enzým ribulozobifosfátkarboxylázu (Herrerra-Estrella a ďalší, 1984, Náture 310:115 až 120), promótorové prvky z kvasiniek alebo iných húb ako promótor Gal 4, ADC promótor (pre alkoholdehydrogenázu), promótor pre alkalickú fosfatázu a nasledujúce živočíšne oblasti na riadenie transkripcie, ktoré sú špecifické pre určité tkanivá a boli použité v prípade transgénnych živočíchov: riadiaca oblasť génu pre elastázu I, ktorá je účinná v pankreatických bunkách (Swift a ďalší, 1984, Celí 38:639 až 646, Ornitz a ďalší, 1986, Cold Spring Haabor Symp. Quant. Biol. 50:399 až 409, MacDonald, 1987, Hepatology 7:425 až 515), ďalej riadiaca oblasť génu pre inzulín, ktorá je účinná v pankreatických beta-bunkách (Hanahan, 1985, Náture 315:115 až 122), riadiaca oblasť génu pre imunoglobulín, ktorá je účinná v lymfoidných bunkách (Grosschedl a ďalší, 1984, Celí 38:647 až 658, Adames a ďalší, 1985, Natu-16re 318:533 až 538, Alexander a ďalší, 1987, Mol. Celí. Biol. 7:1436 až 1444), riadiaca oblasť vírusu nádoru mliečnej žľazy u myší, ktorá je účinná u buniek samčích pohlavných žliaz, mliečnej žľazy, lymfoidných a tukových bunkách (Leder a ďalší, 1986, Celí 45:485 až 495), riadiaca oblasť génu pre albumín, ktorá je účinná v pečeňových bunkách (Pinkert a ďalší, 1987, Genes and Devel. 1:268 až 276), riadiaca oblasť génu pre alfa-fetoproteín, ktorý je účinný v pečeni (Krumlauf a ďalší, 1985, Mol. Celí. Biol. 5:1639 až 1648), Hammer a ďalší, 1987, Science 235:53 až 58), riadiaca oblasť génu pre 1antitrypsín, ktorá je účinná v pečeni (Kelsey a ďalší, 1987, Genes and Devel. 1:161 až 171), riadiaca oblasť génu pre beta-globín, ktorá je účinná v myeloidných bunkách (Mogram a ďalší, 1985, Náture 315:338 až 340, Kollias a ďalší, 1986, Celí 46:89 až 94), riadiaca oblasť pre gén základnej bielkoviny myoglobínu, ktorá je účinná v oligodendrocytoch (Readhead a ďalší, 1987, Celí 48:703 až 712), riadiaca oblasť pre ľahký reťazec 2 myozínu, ktorá je účinná v kostrovom svale (Sani, 1985, Náture 314:283 až 286) a riadiaca oblasť génu na uvoľňovanie gonadotropínu, ktorá je účinná v hypotalame (Mason a ďalší, 1986, Science 234:1372 až 1378).

Vektory na expresiu, ktoré obsahujú včlenený gén pre NT-3 je možné identifikovať troma zásadnými postupmi:

a) hybridizáciou DNA-DNA,

b) prítomnosťou alebo neprítomnosťou značiaceho génu a

c) podľa expresie včlenených funkcií.

Pri prvom z týchto postupov je možné zistiť prítomnosť cudzorodého génu, včleneného do vektora na expresiu hybridizáciou DNA-DNA za použitia sond, ktoré obsahujú reťazce, homológne s včleneným génom NT-3. Pri druhom z týchto postupov sa identifikuje a podrobí selekcii systém rekombinantného vektora a hostiteľa na základe prítomnosti alebo neprítomnosti určitého značiaceho génu a jeho funkcií (napríklad môže ísť o účinnosť tymidínkinázy, odolnosť proti antibiotikám, transformáciu fenotypu, tvorbu oklúznych teliesok u ba culovírusu a podobne). Tieto funkcie sú spôsobené včlenením cudzorodého génu do vektora. Napríklad v prípade, že sa gén pre NT-3 uloží do značiaceho génu vo vektore, je možné rekombinanty, ktoré ho obsahujú identifikovať podľa straty funkcie, zodpovedajúcej funkcii značiaceho génu. Pri treťom po- 17stupe je možné identifikovať rekombinantné vektory na expresiu podľa expresie cudzorodého génu v rekombinantnej bunke. Tieto postupy môžu byť založené napríklad na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach produktu génu NT-3 v systéme pre biologické skúšky.

Hneď ako je určitá rekombinantná molekula DNA identifikovaná a izolovaná, je možné na jej propagáciu použiť niekoľko postupov. Hneď ako dôjde k stabilizácii systému hostiteľa a rastových podmienok, je možné pripraviť rekombinantné vektory vo väčšom množstve. Ako už bolo vysvetlené, je možné ako vektory použiť napríklad nasledujúce vektory alebo ich deriváty: ľudské alebo iné živočíšne vírusy ako je vírus vaccinia alebo adenovírus, vírus hmyzu, napríklad baculovírus, vektory z kvasiniek, z bakteriofágov (napríklad lambda) a DNA plazmidov a kozmidov a podobne.

Okrem toho je možné voliť kmeň hostiteľských buniek, ktorý mení expresiu uloženého reťazca alebo modifikuje a spracováva produkt génu špecifickým spôsobom. Expresiu niektorých promótorov je možné zvýšiť za prítomnosti niektorých induktorov. Týmto spôsobom je možné riadiť expresiu geneticky pozmeneného NT-3. Okrem toho boli charakterizované rôzne hostiteľské bunky a špecifické mechanizmy na translačné a posttranslačné spracovanie a modifikáciu, napríklad ako sú glykozylácia a odštiepenie bielkovín. Je možné voliť príslušné bunkové línie alebo systémy hostiteľov na zaistenie požadovanej modifikácie a spracovanie cudzorodej bielkoviny. Je napríklad možné použiť expresiu v bakteriálnom systéme na získanie neglykozylovaného bielkovinového produktu. Expresia v kvasinkách poskytne glykozylovaný produkt. Expresiu v bunkách cicavcov je možné využiť na zaistenie natívnej glykozylácie heterológneho NT-3. Okrem toho je možné zaistiť vhodnou voľbou rôznych vektorov a hostiteľov na expresiu spracovanie výsledného produktu, napríklad proteolytické štiepenie v rôznom rozsahu.

V špecifickom uskutočnení je možné klonovať DNA, ktorá je kódom pre preproNT-3 v plazmide pCMV, amplifikovať a potom použiť na transfekciu buniek COS za použitia fosforečnanu vápenatého (Chen a Okayama 1987, Mol. Celí. Biol. 7:2745 až 2752), NT-3 je potom možné izolovať zo živného prostredia, ako je opísané v príslušných odstavcoch príkladov 1 a 2.

-18Pokladá sa za dokázané, že NGF je syntetizovaný v dvoch rôznych prekurzorových formách, krátkej forme a dlhej forme (Darling a ďalší, 1983, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 84:427 až 483). Kratšia forma je v podstate analógom preproformy BDNF a NT-3. Podľa vynálezu môže byť žiadúce využiť systém na expresiu s obsahom DNA, ktorá je kódom pre analogickú dlhú formu BDNF a NT-3. DNA, ktorá je kódom pre tieto dlhé prekurzory môže byť identifikovaná analýzou reťazca cDNA alebo oblastí DNA genómu smerom hore od úplného kódového reťazca pre peptid BDNF alebo NT-3 v otvorenom reťazci v smere translácie. Porovnaním reťazca génu NT-3 s reťazcami NGF a BDNF bolo možné predpovedať dlhý a krátky prekurzor NT-3, ako je zrejmé z obr. 7B. Účinnosť expresie úplného BDNF alebo NT-3 z dlhého a krátkeho prekurzora môže závisieť na systéme na expresiu a môže sa meniť od jedného typu bunkových línií k druhému.

Identifikácia a čistenie produktu génu po expresii

Hneď ako je identifikovaná rekombinantná štruktúra, ktorá je schopná zaistiť expresiu, je možné analyzovať gén, a tiež jeho produkt. Toto je možné dosiahnuť na základe fyzikálnych alebo funkčných vlastností produktu génu vrátane rádioaktívneho značenia s následnou elektroforézou na géli.

Hneď ako bola identifikovaná bielkovina NT-3, je možné ju izolovať a čistiť zvyčajnými postupmi vrátane chromatografie, napríklad je možné použiť chromatografiu na ionomeniči, afinitnú chromatografiu a chromatografiu, pri ktorej je možné oddeliť látky od určitej molekulovej hmotnosti, ďalej je možné použiť odstredenie, rozdiely v rozpustnosti alebo akýkoľvek iný zvyčajný postup na čistenie bielkovín. Funkčné vlastnosti je možné hodnotiť akoukoľvek vhodnou metódou vrátane použitia ganglií dorzálnych miechových koreňov kurčaťa, ganglií hlavovej časti nervovej sústavy alebo neurónov ganglií sympatiku.

Stanovenie biologickej účinnosti NT-3

Na stanovenie je možné použiť akýkoľvek systém, ktorý dovoľuje kvalitatívne alebo kvantitatívne stanoviť účinnosť NT-3. Vzhľadom na to, že NT-3 na *19rozdiel od BDNF a NGF vyvoláva rast neurónov ganglion nodosum z hlavovej časti aj z ganglií sympatiku, je možné použiť akýkoľvek z uvedených systémov a okrem toho ešte ganglia dorzálnych koreňov (DRG) na zistenie účinnosti tejto látky. Skúška na DRG môže byť vykonávaná spôsobom podľa publikácie Barde a ďalší, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1199 až 1203. Pri použití ganglion nodosum je možné postupovať podľa publikácie Lindsay a ďalší, Dev. Biol. 112:319 až 328. Pri použití ganglií sympatiku je možné postupovať podľa publikácie Barde a ďalší, 1982, EMBO J. 1:549 až 553.

Gény pre NT-3 a jeho produkty

Použitím postupov, ktoré boli podrobne vysvetlené v príkladoch 6 a 7 je možné stanoviť reťazce nasledujúcich nukleových kyselín a od nich odvodené reťazce aminokyselín. Ide o reťazec pre NT-3 v genóme myši tak, ako je znázornené na obr. 2. Reťazec pre NT-3 potkana je znázornený na obr. 7. Reťazec DNA pre NT-3 ľudského genómu bol určený a je znázornený na obr. 11, kde je taktiež znázornený analogický reťazec potkana.

Tento vynález poskytuje rekombinantnú molekulu DNA obsahujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu neutotrofin 3 (NT-3) ako je znázornené na obr. 2 alebo obr. 7 alebo na obr. 11 alebo jej podsekvenciu s aktivitou NT-3, ktorá predstavuje aspoň 10 nukleotidov.

Napríklad v molekule DNA podľa nároku 1, v ktorej sekvencia alebo podsekvencia nukleovej kyseliny kódujúca neurotrofín-3 je znázornená na obr. 2 od nukleotidu 598 až po nukleotid 954 alebo na obr. 7 od nukleotidu 508 až po nukleotid 864 alebo ako je znázornená na obr. 11 od nukleotidu 530 až po nukleotid 886.

Molekula DNA podľa vynálezu môže predstavovať sekvenciu cDNA alebo sekvenciu genómovej DNA.

Výhodne molekuly DNA zahrnujú sekvenciu alebo podsekvenciu ľudskej DNA v podstate ako je to znázornené na obr. 11.

Prednostne je molekula DNA obsiahnutá v plazmide pC8-rN3(P1) uloženom v ATCC pod registračným číslom 40766 alebo je obsiahnutá v plazmide pC8-hN3(P1) uloženom v ATCC pod registračným číslom 40765 alebo je obsi-20ahnutá v bakteriofágu 0rN3(G1) uloženom v ATCC pod registračným číslom 40763.

Podobne, molekuly DNA podľa vynálezu môžu byť v podstate homologické s molekulou DNA už opísanou kódujúcou protein s aktivitou NT-3.

Vynález ďalej poskytuje DNA molekulu obsahujúcu sekvenciu, ktorá kóduje sekvenciu aminokyselín v podstate ako je to znázornené na obr. 2, alebo jej podsekvenciu predstavujúcu antigénny determinant.

Voliteľne môže byť expresia sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej protein neurotrofínu-3 alebo peptidický fragment regulovaná druhou sekvenciou nukleovej kyseliny tak, že protein alebo peptid neurotrofínu-3 je expresovaný v hostiteľovi transformovanom rekombinantnou molekulou DNA.

Vynález ďalej poskytuje rekombinantnú molekulu DNA komplementárnu k rekombinantnej molekule DNA opísanej vyššie kódujúcu protein s aktivitou NT-3.

Vynález ďalej poskytuje vektor nukleovej kyseliny obsahujúci molekulu DNA, ktorá už bola opísaná a rekombinantnýmikroorganizmus a rekombinantné eukariotické bunky obsahujúce tieto molekuly nukleovej kyseliny. Rekombinantným mikroorganizmom môže byť napríklad baktéria alebo kvasinka.

Vynález tiež poskytuje vyčistený protein so sekvenciou aminokyselín, ktorá je znázornená na obr. 2 alebo 7 alebo 11, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou antigénny determinant.

Napríklad vyčistený protein môže mať sekvenciu aminokyselín takú aká je znázornená na obr. 2, tvorenú od aminokyseliny 140 až po aminokyselinu 258, alebo jej podsekvenciu obsahujúcu antigénny determinant alebo sekvenciu aminokyselín znázornenú na obr. 7, tvorenú od aminokyseliny 1 až po aminokyselinu 119, alebo jej podsekvenciu obsahujúcu antigénny determinant alebo sekvenciu aminokyselín znázornenú na obr. 11, tvorenú od aminokyseliny 1 až po aminokyselinu 119 sekvencie zrelého proteínu, alebo jej podsekvenciu obsahujúcu antigénny determinant.

Alternatívne vyčistený protein môže mať sekvenciu aminokyselín kódovanú sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá je znázornená pre myšací neurotrofín-3, na obr. 2 alebo jej podsekvenciu obsahujúcu funkčne aktívny peptid alebo sekvencu aminokyselín, ktorá je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny zná- 21 zornenej na obr. 7 pre potkaní neurotrofín-3, alebo jej podsekvenciu obsahujúcu funkčne aktívny peptid alebo sekvenciu aminokyseliny, ktorá je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny znázornenej na obr. 11 pre ľudský neurotrofín3, alebo jej podsekvenciu obsahujúcu funkčne aktívny peptid.

Napríklad vyčistený proteín môže mať sekvenciu aminokyselín znázornenú na obr. 11 tvorenú od aminokyseliny 1 až po aminokyselinu 119 sekvencie zrelého proteínu, alebo jej podsekvenciu pozostávajúcou z funkčne aktívneho peptidu.

Proteín alebo fragment neurotrofínu-3 môže byť glykozylovaný alebo neglykozylovaný.

Tvorba protilátok proti NT-3

Podľa vynálezu je možné použiť NT-3 proteíny alebo peptidy ako imunogénne látky na vyvolanie tvorby protilátok proti NT-3.

Aby bolo možno zvýšiť pravdepodobnosť tvorby imunologickej odpovede na podanie NT-3, je možné analyzovať reťazec aminokyselín tejto látky na identifikáciu častí molekuly, ktoré môžu byť spojené so zvýšenou imunogenitou. Je napríklad možné podrobiť reťazec aminokyselín analýze na počítači na identifikáciu povrchových epitópov spôsobom podľa publikácie Hopp a Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824 až 3828, tento postup bol úspešne použitý na identifikáciu antigénnych peptidov povrchového antigénu vírusu hepatitídy B. Je tiež možné porovnávať dedukované reťazce aminokyselín pre NT3 z rôznych druhov a identifikovať relatívne nehomológne oblastí, tieto oblasti totiž budú pravdepodobne imunogénne u rôznych druhov.

Na prípravu monoklonálnych protilátok proti NT-3 je možné použiť akýkoľvek postup na produkciu protilátok kontinuálnou bunkovou líniou v kultúre. Môže byť použitá napríklad technika za použitia hybridómu, pôvodne publikovaná v Kohler a Milstein, 1975, Náture 256:495 až 497 alebo technika triómu, ľudského hybridómu buniek B (Kozbor a ďalší, 1983, Immunology Today 4:72) a technika za použitia EBV-hybridómu na tvorbu ľudských monoklonálnych protilátok (Cóle a ďalší, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer

-22Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77 až 96) a ďalšie postupy, ktoré taktiež patria do oblasti vynálezu.

Monoklonálne protilátky na liečebné použitie môžu byť ľudské monoklonálne protilátky alebo chimérne protilátky človek-myš (alebo iný druh). Ľudské monoklonálne protilátky je možné získať radom spôsobov, ktoré sú v danej oblasti techniky známe (Teng a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 77308 až 7312, Kozbor a ďalší Immunology Today 4:72 až 79, Olsson a ďalší, 1982, Meth. Enzymol. 92:3 až 16). Chimérne molekuly protilátok je možné pripraviť tak, aby obsahovali myšací antigén, viazaný na ľudskú konštantnú oblasť (Morrison a ďalší, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851. Takeda a ďalší, 1985, Náture 314 až 452).

Na tvorbu monoklonálnych protilátok proti epitopom NT-3 je možné použiť rôzne známe postupy. Na tvorbu protilátky je možné imunizovať rôzne živočíchy injekciou NT-3 proteínu alebo peptidu, môže ísť napríklad k králiky, myši, potkany a podobne. Je tiež možné použiť rôzne pomocné látky na zvýšenie imunologickej odpovede v závislosti na živočíšnom druhu, môže ísť napríklad o Freundovo úplné alebo neúplné pomocné činidlo, o minerálne gély, ako hydroxid hlinitý, zmáčadlá ako lyzolecitín, polyoly typu pluronic, polyanióny, peptidy, olejové emulzie, hemocyaníny, dinitrofenol a potenciálne účinné pomocné látky ľudského pôvodu ako BCG (Bacillus Calmette-Guérin) a Corynebacterium parvum.

Molekulárny kloň protilátky proti ΝΤ-3-epitopu je možné pripraviť známym spôsobom. Je možné použiť postupov s využitím rekombinantnej DNA (Maniatis a ďalší, 1982, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) na konštrukciu reťazcov nukleových kyselín, ktoré sú kódom pre molekulu monoklonálnej protilátky alebo pre jej oblasť pre väzbu antigénu.

Molekuly protilátok je možné čistiť známymi postupmi, ako immunoabsorpciou alebo imunoafinitnou chromatografiou, ďalšími chromatografickými postupmi ako je vysokotlaková kvapalinová chromatografia (HPLC) alebo kombinácia týchto postupov a podobne.

Fragmenty protilátok, ktoré obsahujú idiotyp molekuly je možné získať aj známymi postupmi. Týmito fragmentárni sú napríklad: fragment F(ab')2, ktorý

-23je možné získať štiepením molekuly protilátky pôsobením pepsínu, fragmenty Fab', ktoré je možné vytvoriť redukciou disulfidových mostíkov vo fragmente F(ab')2 a fragmenty 2 Fab alebo Fab, ktoré je možné získať tak, že sa na molekulu protilátky pôsobí papaínom a redukčným činidlom.

Vynález sa týka reťazca nukleových kyselín pre NT-3, čistého NT-3 alebo jeho fragmentovčistých proteínov a ich podsekvencií obsahujúcich funkčne aktívne peptidy z nich vyrobené. NT-3 je možné získať v množstve, dostatočnom na diagnostické a liečebné použitie. Protilátky proti NT-3 a nukleové kyseliny ako sondy je taktiež možné použiť na diagnostické a liečebné účely. Pre väčšinu účelov je výhodné použiť gény pre NT-3 alebo produkty génov z toho istého druhu, hoci môže byť vhodné aj použitie NT-3 z iného druhu v niektorých špecifických uskutočneniach.

Diagnostické aplikácie

Vynález je možné využiť na diagnózu ochorení a porúch nervového systému, ktoré môžu byť spojené s poruchami expresie tejto látky.

V rôznych uskutočneniach vynálezu je možné použiť NT-3 molekuky DNA a podsekvencie podľa vynálezu, príbuzné reťazce nukleových kyselín aj časti týchto reťazcov a príbuzné reťazce vrátane reťazcov komplementárnych ma diagnostické hybridizačné skúšky. Sekvencie podľa vynálezu je možné použiť ako hybridizačné sondy. Hybridizačné skúšky je možné použiť na zistenie, prognózu, diagnózu, zistenie stavu, poruchy alebo pokročilosti ochorenia, spojeného so zmenami v expresii NT-3 vrátane napríklad stavov, ktoré sú výsledkom poškodenia senzorických neurónov. Tieto choroby a stavy zahrňujú napríklad poškodenie CNS, infarkt, infekcie, degeneratívne nervové ochorenia, zhubné ochorenia, postoperačné zmeny, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu alebo Huntingtonovu chorobu. Je napríklad možné skúmať vzorku úplnej RNA vo vzorke tkaniva chorého na prítomnosť mRNA pre NT-3, pričom zistená zmena v množstve mRNA pre NT-3 je ukazovateľom degenerácie neurónov.

V ďalších rôznych uskutočneniach vynálezu je možné použiť protilátky proti NT-3, jeho peptidovým fragmentom alebo jeho derivátom na diagnózu ochorenia a porúch nervového systému, vrátane senzorických porúch a dege-24neratívnych chorôb sietnice, rovnako ako na diagnózu vyššie uvedených ochorení. Protilátky podľa vynálezu je možné napríklad použiť pri hybridizačných postupoch in situ pri použití vzoriek tkaniva z chorého, u ktorého je toto vyšetrenie nutné vykonať. Ďalším príkladom je možné použitie protilátok podľa vynálezu pri skúške ELISA na detekciu a/alebo kvantitatívnemu stanoveniu množstva NT-3 v tkanivách alebo vo vzorkách telesných tekutín. Podobne je možné protilátky podľa vynálezu využiť pri skúške Western blot na detekciu a/alebo na kvantitatívne stanovenie NT-3 v tkanivách alebo vo vzorkách tekutiny.

V ďalších uskutočneniach vynálezu je možné použiť NT-3 proteíny podsekvencie podľa vynálezu, na diagnózu ochorení a porúch nervového systému. Vo zvláštnom uskutočnení je možné použiť NT-3 proteín alebo sekvencie podľa vynálezu na identifikáciu tkaniva alebo buniek, u ktorých dochádza k expresii receptora NT-3, aby bolo možné identifikovať aberancie v expresii tohto receptora a v dôsledku toho aj potenciálne abnormality tkanivovej alebo bunkovej odpovede na NT-3.

Liečebné použitie

Vynález je možné využiť na liečbu ochorení a porúch nervového systému, spojených s poruchami expresie NT-3 alebo ktoré by bolo možné priaznivo ovplyvniť prívodom NT-3 alebo protilátok proti NT-3.

V rôznych uskutočneniach vynálezu je možné podávať NT-3 proteíny alebo jeho podsekvencie podľa vynálezu chorým, ktorých nervový systém bol porušený úrazom, chirurgickým zákrokom, ischémiou, metabolickou chorobou, nedostatkami vo výžive, zhubným ochorením alebo toxickými látkami. V rôznych špecifických uskutočneniach je možné NT-3 podávať miestne na senzorické neuróny, ktoré sú porušené, ide napríklad o neuróny dorzálnych ganglií miechových koreňov alebo o akékoľvek z nasledujúcich tkanív: ganglion geniculatum, petrosum alebo nodosum, vestibuloakustický komplex VIII hlavového nervu, ventrolaterálny pól maxillo-mandibulárneho laloku ganglia trojklanného nervu, mesencefalické jadro pre trigeminus a gangliá sympatiku. Môže byť žiadúce podať proteín alebo podsekvencie podľa vynálezu, vstrebaním z mem-25brány, na ktorej sú adsorbované, môže ísť napríklad o silastickú membránu, ktorú je možné implantovať do blízkosti poškodeného nervu. Vynález je možné použiť aj na urýchlenie rekonvalescencie chorých s diabetickými neuropatiami, ako je mononeuropatia multiplex a diabetická periférna neuropatia.

Okrem diabetickej neuropatie je možné použiť NT-3 proteíny a podsekvencie podľa vynálezu na liečbu iných periférnych neuropatií, napríklad nasledujúcich ochorení. Neuropatie, spojené s infekciou vírusmi vrátane AIDS a s ňou spojenou neuropatiou, infekčná mononukleóza s polyneuritídou, vírusová hepatitída s polyneuritídou, syndróm Guillian-Barre, neuropatie, súvisiace s botulizmom, toxická neuropatia vrátane neuropatie, spôsobenej otravou olovom a alkoholom, neuropatia na základe chybnej výživy vrátane subakútnej kombinovanej degenerácie, angiopatická neuropatia vrátane neuropatie u systemického lupus erythematosus, neuropatia spojená so sarkoidózou, neuropatia spojená s karcinómom, kompresívna neuropatia, napríklad syndróm karpálneho kanálu a hereditárna neuropatia. Z hereditárnych neuropatií, ktoré je možné liečiť podávaním NT-3 alebo príbuzných bielkovín je možné uviesť svalovú atrófiu m. peroneus, familiárnu dysautómiu a progresívnu hypertrofickú neuropatiu.

V ďalšom uskutočnení vynálezu je možné použiť NT-3 proteíny a podsekvencie podľa vynálezu na liečbu kongenitálnych stavov alebo neurodegeneratívnych porúch ako sú Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, roztrúsená skleróza, amyotrofická laterálna skleróza a Huntingtonova chorea.

V špecifickom uskutočnení vynálezu je možné použiť NT-3 proteíny a podsekvencie podľa vynálezu v spojení s chirurgickou implantáciou tkaniva pri liečbe Alzheimerovej choroby a/alebo Parkinsonovej choroby. Ako bude ďalej uvedené, podporuje NT-3 prežitie dopaminergných neurónov. Vzhľadom na to, že v prípade Parkinsonovej choroby dochádza k zničeniu týchto neurónov, je možné použiť NT-3 pri liečbe Parkinsonovej choroby tak, že sa chorým podáva účinné množstvo NT-3. Bolo dokázané, že približne 35 % chorých s Parkinsonovou chorobou trpí taktiež Alzheimerovou demenciou, v tomto prípade môže NT-3 priaznivo ovplyvniť obe choroby. Podobne je možné NT-3 použiť u Alzheimerovej choroby v spojení s Downovým syndrómom. Okrem toho, ako bude ďalej uvedené, dochádza k expresii NT-3 vo veľkom množstve v

-26priebehu vývoja a diferenciácie nervového systému, je teda možné túto látku použiť pri liečbe porúch vývoja nervového systému, napríklad u Downovho syndrómu a tiež pri liečbe porúch spojených s diferenciáciou buniek, ako sú zhubné choroby alebo v prípade porúch, u ktorých by bolo možné dosiahnuť ich priaznivé ovplyvnenie pri regenerácii nervového systému. NT-3, získaný spôsobom podľa vynálezu je možné použiť pri liečbe rôznych demencií a kongenitálnych porúch pamäti.

V ďalších uskutočneniach vynálezu je možné použiť bielkovinu NT-3 alebo podsekvencie podľa vynálezu v spojení s ďalšími cytokínmi na dosiahnutie požadovaného neurotrofného účinku. Napríklad je možné NT-3, získaný spôsobom podľa vynálezu použiť spolu s ďalšou látkou, napríklad NGF alebo BDNF na dosiahnutie synergného stimulačného účinku na rast neurónov a/alebo na udržanie prežitia a/alebo regenerácie alebo návratu funkcie týchto buniek tam, kde môže dôjsť k synergnému účinku kombinácie NT-3 proteínu alebo podsekvencie podľa vynálezu a ďalšie látky v porovnaní s účinkom, ktorý je možné dosiahnuť pri použití len jednej z týchto látok. Je pravdepodobné, že NT-3 môže pôsobiť synergne s ďalšími, od CNS odvodenými faktormi typu peptidov, ktoré dosiaľ nie sú plne charakterizované a tak priaznivo ovplyvniť rast, vývoj a udržanie diferencovanej funkcie širokej škály subpopulácií buniek v centrálnom nervovom systéme. Môže tiež dochádzať k adícii účinku medzi NT-3 a druhým neurotrofným faktorom.

Distribúcia NT-3 v tkanivách, ako už bolo vyššie opísané ukazuje, že k vyššej expresii mRNA pre túto látku dochádza v mozgu, obličkách, srdci a slezine. NT-3, produkovaný v tkanivách, odlišných od nervových tkanív môže, ale nemusí byť totožný s látkou, produkovanou v mozgu. Poruchy, spojené s poruchami expresie NT-3 môžu preto postihnúť tak nervový systém, ako aj iné orgány. Je tiež možné, že blízko príbuzné látky zo skupiny molekúl NT-3 môžu svoju úlohu v nervových a iných tkanivách vzájomne aspoň čiastočne nahradiť. NT-3 podľa vynálezu by teda bolo možné použiť pri liečbe chorôb, postihujúcich nervové tkanivo a na reguláciu iných tkanív, najmä srdca, krvotvorných orgánov, obličiek a retikuloendoteliálneho systému.

Okrem toho, ako už bolo vyššie uvedené, je expresia NT-3 zvýšená u nedospelých živočíchov v porovnaní so živočíchmi dospelými. Podľa vynálezu

-27 by malo byť možné použiť NT-3 zvlášť pri poruchách vývoja alebo tiež pri dosahovaní regenerácie nervového systému po poškodení CNS.

Vynález poskytuje proteín neurotrofínu-3 alebo funkčne aktívny peptidový fragment alebo jeho derivát podľa vynálezu alebo farmaceutický prostriedok obsahujúci protein neurotrofínu-3 alebo funkčne aktívny peptidový fragment alebo jeho derivát podľa vynálezu na použitie ako liečiva na zvýšenie prežitia dopaminergných neurónov u ľudí a zvierat.

Tento vynález tiež poskytuje použitie proteínu neurotrofínu-3 alebo funkčne aktívneho peptidového fragmentu alebo jeho derivátu podľa vynálezu alebo prostriedku, ktorý obsahuje proteín neurotrofínu-3 alebo funkčne aktívny peptidový fragment alebo jeho derivát pri výrobe liečiva na použitie na liečenie chorôb alebo porúch nervového systému ľudí a zvierat.

Farmaceutické prostriedky

Účinné látky podľa vynálezu, ktoré môžu zahrňovať účinné množstvo v podstate čistého proteínu NT-3 alebo jeho fragmentu podľa vynálezu na farmaceutický prijateľnom nosiči.

Účinnú zmes podľa vynálezu je možné podávať v akomkoľvek sterilnom, biologicky kompatibilnom nosiči na farmaceutické účely, napríklad vo fyziologickom roztoku chloridu sodného, prípadne s pufrom, v dextróze alebo vo vode.

Množstvo bielkoviny NT-3, alebo jej podsekvencií podľa vynálezu, ktoré budú účinné proti určitej chorobe alebo poruche bude závisieť na povahe poruchy alebo stave a je možné ich stanoviť bežnými klinickými pokusmi. Tam, kde je to možné, je vždy žiadúce stanoviť krivku závislosti účinku na dávke najskôr in vitro, napríklad biologickým postupom opísaným vyššie a potom na vhodnom živočíšnom modeli pred vykonávaním klinických skúšok. V závislosti na hodnotách, získaných in vitro je potom možné použitím vhodného farmaceutického prostriedku dosiahnuť účinné miestne koncentrácie NT-3 v rozmedzí 0,1 až 10 μg/ml.

Uvedené farmaceutické prostriedky je možné podávať intradermálne, vnútrosvalovo, intraperitoneálne, vnútrožilovo, podkožné, perorálne a intranazálne. Okrem toho môže byť žiadúce privádzať farmaceutický prostriedok

-28podľa vynálezu priamo do nervového systému akýmkoľvek vhodným spôsobom, vrátane injekcií do mozgových komôr alebo intratekálnych injekcií. Injekciu do komôr je možné uskutočniť napríklad pomocou katétra, spojeného so zásobníkom (napríklad Ommayovým zásobníkom).

Okrem toho môže byť žiadúce podávať farmaceutický prostriedok podľa vynálezu miestne do oblasti, kde je potrebné dosiahnuť vyššiu koncentráciu, napríklad lokálnou infúziou v priebehu chirurgického zákroku, injekciou, napríklad použitím katétra alebo pomocou implantátu, ktorý môže byť porézny, neporézny alebo želatínovej povahy vrátane membrán, ako je silastická membrána alebo môže mať implantát tiež tvar vláken.

Podstatu vynálezu tvoria aj farmaceutické prostriedky s obsahom bielkoviny NT-3 alebo subsekvencií podľa vynálezu podávaných cez lipozómy, vo forme mikročastíc alebo mikrokapslí. V rôznych uskutočneniach vynálezu môže byť vhodné použiť takéto prostriedky na dosiahnutie spomaleného uvoľňovania NT-3 alebo príbuzných látok.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je znázornené porovnanie reťazcov BDNF a NGF rôznych živočíšnych druhov. Analýza reťazca génu, ktorý je kódom pre BDNF a v dôsledku tohto odvodenie reťazca aminokyselín pre túto látku dokázalo, že táto bielkovina má rad štruktúrnych podobností s NGF. Primárny reťazec BDNF, rovnako ako jeho všeobecná štruktúra a spôsob jeho ďalšieho spracovania in vivo z prekurzora naznačujú, že gén pre NGF a BDNF je možné odvodiť od predošlého spoločného génu. V prípade, úplného polypeptidu stačí zaviesť do reťazca NGF len tri oblasti s vypustenými časťami reťazca a potom sú všetky zvyšné 5L aminokyseliny spoločné NGF z rôznych druhov a BDNF prasaťa a človeka. Tieto totožné zvyšky zahrňujú všetkých 6 cysteínových zvyškov, čo znamená, že NGF a BDNF majú zrejmé veľmi podobnú sekundárnu štruktúru. Okrem toho, je možné pozorovať štyri úseky po šiestich alebo väčšom počte aminokyselín, v ktorých NGF zo všetkých vyššie uvedených zdrojov a BDNF prasaťa sú totožné alebo sa líšia najviac jednou konzervatívnou ky-29selinou Je teda možné predpokladať, že NGF a BDNF sú blízko príbuzné svojimi génmi.

Na obr. 2 je znázornený reťazec genómu a odvodený reťazec aminokyselín pre NT-3 myši. Reťazec aminokyselín začína prvým kodónom ATG po stop kodónu, zaradenom v správnom poradí. Podčiarknutá časť reťazca znázorňuje uloženie primérov, použitých v prvom stupni PCR. Jediný súhlasný Nglykozylačný reťazec je podčiarknutý dvojito a šípka ukazuje pravdepodobný začiatok úplného NT-3 po jeho spracovaní in vivo.

Na obr. 3 je znázornené porovnanie reťazca aminokyselín NT-3, NGF (Scott a ďalší, 1983, Náture, 302:538 až 540) a BDNF (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 152). Reťazec úplného BDNF myši, tak ako je tu znázornený, je na 100 % totožný s BDNF prasaťa. Veľké písmena a zatienenie ukazuje aminokyseliny, ktoré je možné nájsť v rovnakých polohách vo všetkých troch bielkovinách a šípka označuje všetky cysteínové zvyšky. Hviezdičky označujú vypustené časti, ktoré boli odstránené, aby bola lepšie zrejmá podobnosť štruktúry. V1 až V4 označujú 4 variabilné oblasti, ktoré sú tvorené viac než 3 po sebe idúcimi aminokyselinami.

Na obr. 4 je znázornená distribúcia mRNA pre NT-3 v tkanivách myší. Bolo nanesených 20 pg RNA celkovo do každej dráhy a potom bola vykonaná hybridizácia pomocou 32p__značenej DNA s dvojitým reťazcom ako sondy.

A) Jediný pás, ktorý zodpovedá približne 1,4 kb je možné pozorovať vo všetkých tkanivách, najslabší signál je možné zistiť v pľúcnom tkanive a najsilnejší v tkanive srdcovom. Kostrové svaly boli odobrané zo stehien.

B) V mozgu je možné pozorovať najsilnejší signál v oblasti hippocampu a v mozočku.

Na obr. 5 je znázornené prežívanie senzorických neurónov po ich izolácii z ganglion nodosum, získaného z 8 dní starých kuracích embryí. Celkom 5000 buniek bolo nanesených na platne s obsahom polyomitínlaminínového substrátu a po 24 hodinách boli spočítané prežívajúce neuróny. Použitá koncentrácia BDNF bola trojnásobkom minimálnej koncentrácie, požadovanej pre maximálne prežitie. Nebolo možné pozorovať žiadne prežívajúce neuróny bez pridania tejto látky alebo pri použití prostredia, obsahujúceho bunky COS bez

-30transfekcie v riedení 1:50 alebo za prítomnosti buniek po transfekcii kontrolnou DNA.

Na obr. 6 sú znázornené

A) Produkt, získaný PCR za použitia degenerovaných primérov 1Ba2C (označených R1B/2C). Týmto spôsobom je možné dokázať nový gén pre NT-3, rovnako ako gény pre NGF a BDNF v DNA genómu potkana.

B) Znázornená je mapa reštrikčných miest klonu genómu pre NT-3 potkana. Boli izolované dva nezávislé klony bakte riofágu, ktoré špecificky hybridizujú so sondou R1B/2C, a to z genómu potkana. Je schematicky znázornená reštrikčná mapa jedného z týchto klonov, obsahujúca včlenený reťazec s veľkosťou 19,5 kb. Silnejšia čiara znázorňuje otvorený reťazec, ktorý je kódom pre NT-3 (ORF), ako je taktiež znázornené na obr. 7A. Je tiež znázornená poloha sondy R1B/2C.

Na obr. 7 je znázornený reťazec NT-3 potkana a jeho homológia s NGF a BDNF potkana.

A) Znázornený je nukleotidový reťazec a reťazec aminokyse lín pre NT-3. Je znázornená DNA, ktorá je kódom pre NT-3, translácia aminokyselín je označená nad reťazcom. Hviezdičkami je označený začiatok a koniec reťazca. Aminokyseliny sú číslované od polohy +1, ktorou je označený prvý zvyšok úplného NT-3 (119 aminokyselín). Miesto štiepenia, slúžiace na uvoľnenie úplného NT-3 je uzavreté v obdĺžniku, rovnako ako miesto glykozylácie tesne nad vyššie uvedeným miestom. Ďalšie potenciálne miesto štiepenia, ktoré je podobne uložené na predpokladanom mieste spracovania NGF (Darling a ďalší, 1987, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1:427 až 434), avšak ktoré nie je prenesené do BDNF, je tiež označené obdĺž nikom a okrem toho 7CLEAVE. Šesť cysteínových zvyškov v úplnom NT-3 je podčiarknutých. Metionínový inicializačný kodón pre kratšiu prekurzorovú formu NT-3 (v polo he 139), ktorý označuje začiatok B, ako bude ďalej uvedené, je taktiež podčiarknutý. Je tiež naznačené predpokladané miesto pre väzbu intrónu nad miestom pre začiatok B.

B) Je znázornená podobnosť reťazcov pre NT-3, NGF a BDNF potkana. Bol použitý program MacVector (International Biotechnologies, Inc.) na vytvorenie porovnávacej matrice pre ORF NT-3 s ORF pre NGF a BDNF (s o- 31 kienkom s rozmerom 20, minimálny súhlas bol 20%). Štatisticky význam nesúhlasné miesta reťazca sú označené pod schematickým znázornením reťazca pre NT-3. Ide o dve homológne miesta smerom hore k úplnému NT-3, ktoré sú označené I a II, ako je z výkresu zrejmé. Oblasť I zasahuje smerom hore od miesta pre začiatok B pre krátky prekurzor NT-3, čo podporuje domnienku, že existuje ešte ďalší prekurzor.

C) Je znázornené porovnanie medzi homológnymi oblasťami I a II NT-3, NGF a BDNF. Reťazce pre tieto oblasti sú znázornené tak, že je zrejmá ich homológia, vypustené časti reťazca sú označené Totožné miesta v BDNF alebo NGF s NT-3 sú označené zatiaľ čo identické miesta pre NGF a BDNF sú označené Označenie + v hornej časti reťazca označuje zvyšky, ktoré sú celkom zachované v NT-3 potkana a NGF a BDNF všetkých skúmaných druhov. Sú označené nasledujúce miesta pre NGF, vopred predpokladané pre BDNF a predpokladané aj pre NT-3: inicializačný kodón pre metionín ako začiatok B, ďalej signálny reťazec a miesto štiepenia v tomto reťazci (Edwards a ďalší, 1988, Mol. Celí. Biol. 8:2456 až 64), ďalej predpokladané miesto štiepenia v medziprodukte NGF, ktoré chýba v BDNF, avšak je prítomné v NT-3, miesto príjmu glykozylačnej skupiny, miesto proteolytického štiepenia, ktoré uvoľňuje úplný faktor.

D) Porovnanie reťazca úplných foriem NT-3, BDNF a NGF. Zachované cysteínové zvyšky sú podčiarknuté hviezdička mi. Inak je označenie a ako na obr. 7C. Je označené aj miesto terminálneho štiepenia, prítomné v reťazci NGF.

Na obr. 8 je znázornené porovnanie účinnosti NGF, BDNF a NT-3, ako bolo uskutočnené na explantátoch embryí vo veku 8 dní. Ide o mikrofotografie dorzálnych koreňových ganglií DRG (panely A až D), ganglion nodosum NG (panely E až H), a gangliá sympatického reťazca SG (panely I až L) po pestovaní 24 hodín v prípade DRG a NG alebo 48 hodín v prípade SG buď v neprítomnosti akéhokoľvek neurotrofného faktora (kontroly A, E: a I) alebo za prítomnosti supernatantú buniek COS s obsahom NGF (B, F a J) alebo BDNF (C, G a K) alebo NT-3 (D, H a L). V kontrolných kultúrach takmer nie je možné pozorovať rast neurónov (500 μΙ supernatantú buniek COS po simulovanej transfekcii). Po podaní NGF (10 μΙ) supernatantú buniek COS) bolo možné

-32pozorovať rýchly rast vláken v prípade DRG a SG, avšak nie NG. Pri pridaní väčšieho množstva supernatantu (500 μΙ) nebolo možné pozorovať žiadny rozdiel. Po podaní BDNF (10 μΙ supernatantu buniek COS) bolo možné pozorovať rast vláken v prípade DRG a NG, avšak nie SG. Vyššie množstvo 20 až 500 μΙ taktiež nemalo žiadny vplyv. Po pridaní NT-3 (20 μΙ supernatantu buniek COS v prípade DRG a NG a 200 μΙ v prípade SG) bolo možné pozorovať rast vláken u všetkých troch typov gangliových buniek, aj napriek tomu, že začiatok rastu bol pomalší a menej významný pre SG. Gangliá boli pestované ako explantáty na kolagenovom géli (Lindsay a Rohrer, 1985, Dev. Biol. 112:30 až 48) v prostredí F14, doplnenom 5 % konského séra, ako bolo opísané v Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328. Stupnica bar = 200 μιτι.

Obr. 9 znázorňuje, ako NT-3 podporuje prežitie a rast neuritov v kultúre, vysoko obohatenej o neuróny DRG. Sú uvedené mikrofotografie kultúr s obsahom viac než 95 % neurónov DRG kuracieho embrya (deň 8), na tieto bunky bolo pôsobené 48 hodín (A) supernatantom (500 μΙ) buniek COS po simulovanej transfekcii alebo (B, C) supernatantom (50 μΙ) buniek po transfekcii NT-3. V prípade A a B ide o mikrofágy v tmavom poli. V prípade A (kontroly) prežíva menej než 5 % neurónov, v prípade B prežíva približne 60 % neurónov. Z krivky závislosti dávky a odpovede je možné dokázať, že ide o maximálne možný účinok NT-3 na kuracie neuróny E8 DRG. C) Znázornené je väčšie zväčšenie vo fázovom kontraste tej istej kultúry ako na obr. 7B. Je možné pozorovať väčší počet jasne sfarbených tiel neurónov a v podstate žiadne od neurónov odlišné bunky. Kultúry boli pestované vyššie uvedeným spôsobom (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328). Škála, označená tyčinkou je po 150 μΙ (C).

Na obr. 10. je na porovnanie znázornený výsledok metódy Northern blot pre NT-3, NGF a BDNF u hlodovcov. RNA bola pripravená spôsobom podľa publikácie Auffray C. a Rougeon F., 1980, Eur. J. Biochem. 107:303 až 314 z uvedených tkanív potkana (vľavo) alebo myši (vpravo). Potom bolo 10 pg RNA z uvedeného zdroja podrobených frakcionácii na agarovom géli s 1 % formaldehydu a materiál bol prenesený na nylonovú membránu v 10 x SSC, Northern blot bol vykonaný v trojitom opakovaní podľa publikácie Mahmoudi M. a Lin V.

-33K., Biotechniques 7:331 až 333 pri teplote 68 °C za použitia ³2p-značených fragmentov DNA pre NT-3, NGF a BDNF potkana (Feinberg A. P., Vogelstein B., 1984, Anál. Biochem. 137: 226 až 267) a potom bol materiál premytý pri teplote 68 C v 2 x SSC s 0,1 % SDS. Fragmenty DNA pre NT-3, NGF a BDNF boli odvodené od konštrukcií po ich expresii, tieto konštrukcie obsahovali uvedené gény v plazmide pCDM8. Vložené reťazce s približne 775 bp (Xhol) v týchto konštrukciách boli čistené na géli pred značením rádioaktívnym fosforom. Znázornený je aj gél, farbený etidíniumbromidom, čo dovoľuje porovnanie celkového množstva RNA na vzorku.

Na obr. 11 sú porovnané reťazce DNA pre gény NT-3 človeka a potkana. Začiatok translácie sa nachádza v mieste, označenom PREPRO- a pravdepodobný začiatok úplného NT-3 je označený MATURE--. Úplné bielkoviny NT-3 potkana a človeka majú totožné reťazce aminokyselín, zatiaľ čo ich prepro-oblasti sa od seba líšia v 11 polohách, ktoré sú podčiarknuté.

Na obr. 12 je znázornená expresia NT-3 človeka pri metabolickom značení. 5 x10⁵ buniek COS-M5 bolo uložených vždy do každej petriho misky s priemerom 60 mm a bunky boli pestované cez noc pri teplote 37 °C v úplnom prostredí DMEM s pridaním 10 % séra hovädzieho dobytka (FBS). Potom boli bunky podrobené transfekcii pri použití CaPO4 podľa publikácie Chen a Okayama, 1987, Mol Celí Biol. 7:2745 až 52 a pri použití 20 μg plazmidu pC8-hN3 (P1) s obsahom génu pre NT-3 človeka pod riadením promótora cytomegalovírusu alebo bola vykonaná simulovaná transfekcia bez plazmidovej DNA. Po 48 hodinách boli bunky premyté a 1 hodinu inkubované v 1 ml prostredí DMEM s 1 % FBS bez metionínu a cysteínu. Potom bola k zmesi pridaná zmes ³³S-metionínu a ³³S-cysteínu (vždy 100 pCi, New England Nuclear), bunky boli inkubované ešte 4 hodiny pri 37 C a potom bolo prostredie zliate. Vzorky s objemom 50 μΙ boli zmiešané s 25 μΙ dvojnásobne koncentrovaného pufra pre vzorku s obsahom dodecylsíranu sodného (SDS), zmes bola povarená a podrobená elektroforéze na 15% polyakrylamidovom géli za prítomnosti SDS podľa publikácie Laemmli, 1970, Náture 227:680 až 685. Bielkoviny boli prenesené elektroforeticky (3 hodiny, 100 mA) na nylonovú membránu (immobilon, Millipore) za použitia pufrov, opísaných v publikácii Tow-34bin a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 až 4354. Filtre boli vysušené na vzduchu a značené bielkoviny boli zistené autorádiograficky (16 hodín pri teplote miestnosti za použitia filmu Kodak X-AR s filtrom, zvyšujúcim účinnosť stanovenia - Cronex, (Du Pont).

Na obr. 13 je znázornený stĺpcový graf, ktorý znázorňuje prežitie buniek v prostredí s tyrozínhydroxylázou, kultúry buď neobsahovali supernatant s NT3 (0) alebo obsahovali riedenie 1:300, 1:100, 1:50 alebo 1:25 tohto supernatantu.

Na obr. 14 je znázornený podobný graf ako na obr. 13 s tým rozdielom, že hustota buniek bola 900 000 v jednej miske.

Na obr. 15 je znázornené porovnanie NT-3, BDNF a NGF. V časti A ide o porovnanie syntetických transkriptérov. Bola použitá hybridizácia dot-blot s rádioaktívne značeným oligonukleotidom, homológnym s reťazcom spoločným na 5'- zakončení všetkých troch transkriptov, čím bolo overené, že rovnaké množstvo týchto materiálov (2 ng) syntetického NT-3, BDNF a NGF sú použité po počiatočnej spektrofotometrickej kvantitatívnej analýze ako definované štandardy. V časti B je uvedené stanovenie NT-3, BDNF a NGF na úrovni mRNA v celkovej RNA, pripravenej z mozgu dospelého potkana, porovnanie je vykonané s definovanými syntetickými štandardmi RNA. Hybridizuje sa 10 pg celkovej RNA, izolovanej z mozgu dospelých potkanov a 4, 10 a 20 pg syntetických transkriptov, zodpovedajúcich neurotrofínom. Vykonáva sa northern a hybridizácia za použitia rádioaktívne značených sond, špecifických pre každý z uvedených neurotrofínov.

Na obr. 16 je znázornená expresia NT-3, NGF a NGFR, t.j. expresia génov pre tieto látky v celkovej RNA (10 pg/dráha) z potkaních embryí (A), vyvíjajúceho sa mozgu potkana (B) a vo vybraných tkanivách v perinatálnom období a v dospelosti (C). Tkanivá: A. BR = vzorka tkaniva dospelého mozgu, štandardizovaný na obr. 1B. PLAČ = placenta. EMB = celé embryo. SP.C = miecha. THY - týmus. LIV = pečeň. HRT = srdce. BR = mozog. Rozmery transkriptu sú uvedené na pravej strane ako kilobázy (kb).

Na obr. 17 je znázornená expresia génov pre NT-3, NGF a BDNF v celkove RNA (10 pg/dráha), pripravenej z rôznych oblastí z nervového systému novorodenca (A) a dospelého (B). Oblasti: A. BR = dospelý mozog, štan- 35dardizácia podľa obr. 1B. CBL = mozoček. HBR = zadný mozog. MBR = medzimozog, DIEN = diencephalon. STR = striatum. HIP = hippocampus. CTX = neocortex. OLF = bulbus olfactorius. BR = celý mozog bez mozočka. ADR = nadoblička. RET = sietnica, SC.N = nervus ischiadicus. SP.C. = miecha.

Na obr. 18 je kvantitatívne znázornená úroveň transkripcie NT-4, BDNF a NGF v oblastiach CNS u novorodenca a u dospelého a to tiež v periférnych tkanivách. Na získanie údajov bolo použité sériové denzitometrické meranie a metóda northern blot vrátane prípadov, znázornených na obr. 16, 17 a 19 podľa publikácie Maisonpierre a ďalší, 1990, Science 247:1446 až 14512. Všetky získané hodnoty boli štandardizované s ohľadom na obsah neurotrofínu v dospelom mozgu. Tieto hodnoty, ktoré sú podobné pre všetky tri neurotrofíny sú uvedené na grafe tak, že hodnoty mimo stupnicu sú uvedené nad prerušeným stĺpcom. Sú uvedené výsledky tak pri použití neurónov, ako aj pri použití vzoriek iných tkanív. BRN = mozog bez mozočka, CBL = mozoček, HBR = zadný mozog, MBR = medzimozog, DIE = diencephalon, STR = striatum, HIP = hippocampus, CTX = neocortex, OLF = bulus olpactorius, sp.c = miecha, SC.N. = nervus ischiadicus, RET = sietnica, ADR = nadobličky, HRT = srdce, LIV = pečeň, THY- týmus, SKN = koža, MUS = kostrový sval, LNG = pľúca, INT - črevo, KID = oblička, SPL = slezina.

Na obr. 19 je znázornená expresia génu pre NT-3, BDNF a NGRF v priebehu vývoja miechy (A, E), mozočka (B, F) a hippocampu (C, G). Bolo porovnané množstvo 10 pg celkovej RNA z rôznych období vývoja, pokiaľ ide o expresiu rôznych transkriptov. Denzitometrické kvantitatívne stanovenie hladiny neurotrofínov je uvedené v dráhach E, F a G.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál a metódy

Reakcia za použitia polymerázy

Boli syntetizované dva oligonukleotidové priméry na báze dvoch reťazcov aminokyselín, uchovávaných v BDNF a všetkých známych typoch NGF

-36(Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341: 149 až 152). Reťazec priméru, súhlasného so zmyslom reťazca (alebo 5') bol GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GA (primér 1 podľa nomenklatúry IUPAC, I = inozín) a obsahuje miesta pôsobenia enzýmov BamHI a Sacll, reťazec priméru proti zmyslu reťazca (alebo 3') bol TCGAATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCA a zahrňoval miesta pôsobenia enzýmov EcoRI a Xbal (primér 2). PCR (Saiki a ďalší, 1985, Science 230:1350 až 1354) bola vykonávaná za použitia 1 pg DNA myšieho genómu použitím termálneho cyklického zariadenia Perkin-Elmer Cetur a Taqpolymerázy (Gen AmpTM) p₀ štyroch cykloch pri teplote až 45 °C boli zvyšné cykly (celkom 36) vykonávané pri teplote až 49 °C. Výsledné amplifikované produkty DNA, zodpovedajúce očakávanej dĺžke 137 párov báz boli izolované vymytím z akrylamidového gélu, reamplifikované a potom rozštiepené enzýmami Hindll a Apal, prvý z nich štiepi NGF myši a druhý BDNF myši. Nerozštiepená DNA bola vymytá a asymetricky amplifikovaná (Innis a ďalší, 1988. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:9436 až 9440) a bol stanovený jej reťazec (Sanger a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci USA 72:3918 až 3921) pri použití primérov 1 a 2. NA základe takto získaného reťazca potom boli syntetizované ďalšie 2 priméry v zmysle reťazca, zodpovedajúce nukleotidom 808 až 822 (primér 3) a 824 až 844 (primér 4) s pridanými miestami pôsobenia enzýmov Sal I a Pst I. RNA bola extrahovaná z mozgu dospelých myší, z myšacej pečene a svalov (Okayama a ďalší, 1987, Methods Enzymology 154:2 až 28) a bola použitá jej revezná transkripcia pri použití priméru proti zmyslu reťazca (5') CGGATCCGAATTCTGCAG(T)i2 (primér 5), ktorý bol konštruovaný tak, aby zodpovedal 3'-poly(A)-zakončením a obsahoval miesta klonovania BamHI, EcoRI a Pstl (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 152). Tieto cDNA boli najskôr amplifikované PCR za použitia primérov 3 a 5 a potom reamplifikované použitím primérov 4 a 5. Na produktoch, ktoré sú výsledkom tejto poslednej reakcie bola vykonaná analýza Southern blot a hybridizácia oligonukleotidmi, značenými na svojich zakončeniach 32p a zodpovedajúcimi nukleotidom 879 až 893. Takto identifikované fragmenty DNA boli klonované vo vektore Bluescript SK+ (Stratagene) a najdlhší včlenený reťazec, ktorý bol získaný (460 párov báz) bol použitý na vyšetrenie zostavy genómu EMBL3

- 37myši (Clontech). Boli nájdené dva pozitívne klony a DNA jedného z nich bola rozštiepená rôznymi reštrikčnými enzýmami. Na analýzu reštrikčných fragmentov bol použitý včlenený reťazec so 460 bp. Reťazec so 770 bp (HindlII) a reťazec so 4000 bp (HindlII) bol subklonovaný v Bluescript SK+. Je znázornený úplný reťazec HindlII, 3' a 5'-predížený použitím fragmentu Pstl.

Analýza Northern blot

Celková RNA bola extrahovaná z dospelých samičích tkanív (Okayama a ďalší, 1987, Meth. Enzým. 154:3 až 28) a bola podrobená elektroforéze na agarózovom géli s obsahom 1,3 % formaldehydu (Hehrach a ďalší, 1977, Biochem. 16:4743 až 4751. Potom bola RNA prenesená na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham) a hybrizidovaná cez noc pri teplote 42 °C v 1 ml 200 mM fosforečnanu sodného s pH 7,2 s obsahom 40 % formamidu, 5 x Denhardtov roztok a 200 pg/ml denaturovanej DNA zo spermy lososa. Ako sonda bola použitá ³²P-značená sonda s dvojitým reťazcom (Feinberg a ďalší, 1979, Anál. Biochem. 137:266 až 267), zodpovedajúci nukleotidom 319 až 1093 (obr. 2). Špecifická aktivita bola 1,3 x 10θ impulzov za minútu/pg, k hybridizačnému pufru bolo pridaných 10⁷. Potom bol materiál premývaný 60 minút pri teplote 60 °C v 0,1 x SSC s obsahom 0,5 % SDS. Filtre boli exponované 5 dní pri teplote -70 °C použitím zosilňovacích filtrov.

Expresia Neurotrofínu-3

Boli syntetizované oligonukleotidové priméry, zodpovedajúce prvým 19 nukleotidom (plus miesto pôsobenia enzýmu Bam Hl) na základe reťazca z obr. 2. Po PCR amplifikácii použitím opísaného (obr. 2) Pstl fragmentu genómu ako templátu bol výsledný produkt klonovaný v mieste pôsobenia EcoRI-BamHI vo vektore na expresiu pCMV (Anderson a ďalší, 1989, J. Biol. Chem. 264:8222 až 8229). Nukleotidový reťazec včleneného reťazca NT-3 v pCMV bol stanovený. Bunky COS-1 boli podrobené transfekcii za použitia fosforečnanu vápenatého (Chen a Okayawa, 1987, Mol, Celí. Biol. 7:2745

-38až 2752) a prostredie bolo oddelené vyššie opísaným spôsobom (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 152). Použité kontrolné prostredie bolo získané spracovaním buniek COS-1 pôsobením fosforečnanu vápenatého alebo pomocou konštrukcie pCMV/NT-3, v ktorej bol rozrušený stop-kodón NT-3. Žiadne z prostredí nemalo biologickú účinnosť pri riedení 1:50. Gangliá nodosa boli disociované a neuróny boli pestované na platniach s 24 vyhĺbeninami (Linsay a ďalší, Dev. Biol. 112: 319 až 328) a BDNF bol čistený z mozgu prasaťa (Hofera Barde, 1988, Náture 331:261 až 262).

Výsledky a diskusia

Hlavným problémom pri charakterizácii neurotrofných faktorov je ich výskyt v nesmierne malom množstve. Tak NGF, ako aj BDNF boli charakterizované použitím čistých postupov pre bielkoviny, založených na biologických skúškach sledovania ich účinnosti (Cohen a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46:302 až 311, Barde a ďalší, 1982, EMBO J., 1:549 až 553). Tento postup bol možný v prípade NGF vzhľadom na to, že táto látka sa vyskytuje vo vysokom množstve u dospelých myšacích samcov v podčeľusťovej žľaze, v prípade BDNF sa látka vyskytuje vo väčšom množstve v mozgu prasaťa. Totožnosť rôznych úsekov NGF a BDNF podporovala pravdepodobnosť možnosti použitia odlišnej stratégie než stratégie, zvyčajnej pre gény (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 152). Podrobnejšie porovnanie reťazca aminokyselín NGF a BDNF myši dokázalo existenciu dvoch reťazcov so 6 aminokyselinami (na obr. 2 sú podčiarknuté), ktoré boli zvlášť vhodné na použitie oligonukleotidových primérov pri reakcii PCR (Saiki a ďalší, 1985, Science 230:1350 až 1354). Bol použitý templát myšacieho genómu vzhľadom na to, že v génoch pre NGF a BDNF neprerušujú žiadne intróny exón, ktorý je kódom pre biologicky účinnú bielkovinu. Týmto postupom bola dosiahnutá očakávaná amplifikácia reťazcov pre NGF a BDNF a potom bolo použité štiepenie použitím vhodných reštrikčných enzýmov. Bol analyzovaný reťazec fragmentu DNA, ktorý zostal neporušený, tento reťazec nezodpovedal NGF ani BDNF. Boli syntetizované dva špecifické priméry v zmysle reťazca (alebo 5') pre ďalšiu PCR pri použití komplementárnej DNA, pripravenej reverznou transkripciou

-39RNA, extrahovanej z mozgu myši, svalu a pečene myši ako templátu a 3'primér, konštruovaný tak, aby zodpovedal reťazcom polyA (obr. 2). Uvedené tri tkanivá poskytli amplifikované produkty približne rovnakých rozmerov, boli kolonované a použité na vyšetrenie zostavy myšacieho genómu. Jeden z klonov genómu, nájdený týmto spôsobom bol použitý na analýzu reťazca (obr. 2). Podľa otvorených reťazcov je možné hovoriť o bielkovine so 258 zvyškami aminokyselín (začínajúc prvým zvyškom metionínu po troch stop kodonoch, zaradených v správnom smere), táto bielkovina bola nazvaná neurotrofín-3 (NT-3). V každom ohľade je štruktúra tejto bielkoviny podobná štruktúre NGF a BDNF. Signálny reťazec s 18 zvyškami aminokyselín (s BDNF je totožných 5 a s NGF 9 aminokyselín) je nasledovaný predbežným reťazcom so 121 zvyškami. Takéto reťazce, zúčastňujúce sa pravdepodobne správnej tvorby disulfidových mostíkov týchto bielkovín (Edwards a ďalší, J. Biol. Chem. 263:6810 až 6815) boli nájdené tiež v NGF myší, išlo o reťazce so 103 zvyškami aminokyselín a v BDNF myší (112 zvyškov). Na jediné potenciálne miesto pre N-glykozyláciu je uložených 9 zvyškov (v porovnaní s NGF a BDNF) pred miestom predpokladaného štiepenia a je charakterizované bázickými zvyškami (na obr. 2 znázornené šípkou). Úplný NT-3 je tvorený 119 zvyškami aminokyselín (relatívna molekulová hmotnosť je 13 625 apl je 9,3). Porovnanie medzi úplným NGF, BDNF a NT-3 myši dokazuje totožnosť 54 zvyškov aminokyselín, ako je zrejmé z obr. 2. Všetkých 6 cysteinových zvyškov, o ktorých je známe, že v NGF a BDNF sa zúčastňujú tvorby disulfidových mostíkov (Leibrock a ďalší, Náture, 1989, 341:149 až 152, Angeletti, 1973, Biochemistry, 12:100 až 115) je medzi uchovanými zvyškami, ako je na obr. 3 znázornené šípkami. Pri porovnaní NT-3, BDNF a NGF je možné dokázať, že oproti zachovaným zvyškom v BDNF a NGF (61 totožných zvyškov u myši) dochádza k strate len 7 totožných zvyškov. To znamená, že takmer 50 % primárnej štruktúry je zachovaných, čo je zrejme nutné na tvorbu základného trojrozmerného tvaru, ktorý je spoločný všetkým trom bielkovinám. Okrem toho, pri porovnaní všetkých troch reťazcov bolo možné dokázať štyri variabilné oblasti, z ktorých každá obsahovala 7 až 11 zvyškov (V1 až V4 na obr. 3), tieto oblasti sú zrejmé príčinou špecifickosti látok pre neuróny.

-40Aby bolo možné študovať expresiu génu pre NT-3, bola extrahovaná z rôznych tkanív myši a bola analyzovaná sondou, špecifickou pre NT-3 (obr. 4). Vo všetkých skúmaných tkanivách bolo možné nájsť jediný pás s veľkosťou

1,4 kb (obr. 4A). Avšak úroveň expresie týchto mRNA sa podstatne mení. V mozgu (obr. 4B) je možné dokázať významné rozdiely v jednotlivých oblastiach, najvyššiu úroveň mRNA bolo možné dokázať v mozočku a v hippocampe (obr. 4B). Tieto výsledky ukazujú, že distribúcia mRNA pre NT-3 v tkanivách dospelej myši je veľmi odlišná od distribúcie BDNF a NGF mRNA. Okrem toho je možné mRNA pre BDNF nájsť hlavne v mozgu, zatiaľ čo mRNA pre NGF je len veľmi ťažké dokázať v niektorých tkanivách ako je kostrový sval alebo pečeňové tkanivo (Heumann a ďalší, 1984, EMBO J. 3:3183 až 3189). Je však zaujímavé, že v hippocampe, o ktorom je známe, že v ňom dochádza k expresii mRNA pre NGF (Korsching a ďalší, 1985, EMBO J., 4:1389 až 1393) dochádza k expresii mRNA pre BDNF a NT-3, a to v oveľa väčšej miere, než vo väčšine ostatných oblastí mozgu (obr. 4B).

Aby bolo možné zistiť, či je NT-3 biologicky účinný a či dochádza k jeho sekrécii, bol klonovaný úplný kódový reťazec pre túto látku vo vektore pre expresiu (pCNV), použitom na transfekciu buniek CO D opičích obličiek (obr. 5). Vzhľadom na to, že mRNA pre NT-3 je možné nájsť v periférnych tkanivách, bol pestovaný celý rad embryonálnych kuracích neurónov, o ktorých je známe, že do týchto tkanív zasahujú a vyžadujú trófické faktory pre svoje prežitie. Bolo možné pozorovať, že motorické neuróny, čistené z miechy 6 dní starých embryí (E6) (Dohrman a ďalší, 1986, Dev. Biol. 118, 209 až 221), ciliárne neuróny (E8) a disociované neuróny sympatiku (E11) neboli schopné prežiť za prítomnosti NT-3, avšak senzorické neuróny, izolované z E8 primárnych senzorických ganglií na prítomnosť tejto látky odpovedali. Ako je zrejmé z obr. 5, podporuje NT-3 prežitie približne 30 % neurónov izolovaných z ganglion nodosum. Okrem toho je tento účinok aditívny s účinkom BDNF, syntetizovaným v centrálnych partiách a pôsobiacom na subpopuláciu neurónov ganglion nodosum (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 328) a kombináciou oboch faktorov je možné zaistiť prežitie väčšiny neurónov (90 %, obr. 5). Je nutné uviesť, že mRNA pre NT-3 je možné nájsť vo viscerálnych oblastiach, ktoré tento ganglion ovplyvňuje vrátane srdca, pečene, čreva a pľúc

-41 (obr. 4A). Populácie senzorických neurónov, citlivých na NT-3 boli nájdené aj v E8 disociovaných dorzálnych koreňoch a v gangliách trigeminu a v explantátoch E8 gangliách sympatiku. Zdá sa, že NT-3 je látkou s až dosiaľ necharakterizovanou biologickou účinnosťou v niekoľkých periférnych tkanivách vrátane pečene (Lindsay a Tarbit, Neuro Sci. Lett. 12:195 až 200) a kostrového svalu (Davies, 1986, Dev. Biol. 115:56 až 67), o faktore je známe, že podporuje prežitie viscerálnych a proprioreceptívnych senzorických neurónov, ktoré neodpovedajú na prítomnosť NGF, prehľad je možné nájsť v publikácie Davies, 1987, Development 101:185 až 208.

Spoločným výsledkom týchto pokusov je zistenie, že NT-3 je neurotrofný faktor, ktorý je svojou štruktúrou aj funkciou príbuzný NGF a BDNF, prvým dvom objaveným neurotrofínom. Názov neurotrofín (NT) je pre túto skupinu látok navrhovaný ako analógia s interleukínmi, aby bolo možné ich číslovať v takom poradí, v akom boli objavené.

Príklad 1

Klonovanie a charakterizácia potkanieho génu pre neurotrofín-3

Homológia medzi NGF a BDNF bola využitá pri konštrukcii a klonovaní za účelom objavenia ďalších látok zo skupiny podobných génov. Ďalej bude opísané klonovanie tretej látky z uvedenej skupiny, ktorá bola označená NT3. Tento nový faktor má odlišnú biologickú účinnosť a odlišnú expresiu v priestore a čase v porovnaní s NGF a BDNF.

Materiály a metódy

PCR-reakcie

Boli syntetizované oligonukleotidy s degenerovaným reťazcom, zodpovedajúcim štyrom reťazcom bielkoviny, ktoré sú vysoko konzervované medzi reťazcami NGF a BDNF. Išlo o nasledujúce reťazce, ktoré je možné nájsť na obr. 7D.

-421) Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-\/al-Cys-Asp-Ser,

2) Lys-Gln-Tyr-Phe-(Tyr/Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys,

3) Gly-Cys-Arg-lle-Asp a

4) Trp-Arg-Phe-lle-Arg-lle-Asp-Thr-(Ser/Ala)-Cys-Val-Cys.

V PCR reakciách bol použitý celý rad oligonukleotidových reťazcov v zmysle a proti zmyslu reťazca (s obsahom degenerovanej časti s dĺžkou 15 až 26 nukleotidov, čo zodpovedá 5 až 9 aminokyselinám príslušného bielkovinového reťazca, v zmysle alebo proti zmyslu reťazca, ako aj nedegenerovaných koncových miest pôsobenia reštrikčných enzýmov). Amplifikačné reakcie medzi pármi primérov v zmysle reťazca a proti zmyslu reťazca boli vykonávané podľa doporučenía Perkin-Elmer/Cetus až na teplotu zohrievania pri väzbe, koncentrácii horečnatých iónov a dobe vykonávania extenzie, tieto parametre boli menené na dosiahnutie optimálnych podmienok pre každý pár primérov. Presný reťazec pre primér 1B v zmysle reťazca (ktorý je kódom pre časť bielkovinového reťazca 1 vyššie) bol 5-GACTCGAGTCGACATCGGTNTGY-GAY-WSN-RTNWS-3’ a reťazec priméru proti zmyslu reťazca 2C, ktorý zodpovedá kodónom reťazca 2) vyššie bol 5'-CCAAGCTTCTAGAATTC-CAYTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3' (skratky pre nukleotidy podľa doporučenia IUPAC). Následná analýza reťazca ukázala, že oligonukleotid 1B mal v porovnaní s reťazcom NT-3 dva odlišné nukleotidy, zatiaľ čo reťazec 2C sa líšil len jediným nukleotidom od reťazca NT-3. Rádioaktívne značenie PCR bolo vykonané podľa doporučenej amplifikácie génu reakciou podľa PerkinElmer/Cetus s nasledujúcimi modifikáciami:

až 10 ng templátu DNA v agaróze s nízkou teplotou topenia bolo pridaných k reakčnej zmesi, ktorá obsahovala neznačený dATP, dGTP a dTTP v konečnej koncentrácii 50 μσιοΙ, ďalej 50 gCi alfa32p-dCTP (3000 Ci/mmol) v 50 μΙ reakčnej zmesi a reakčná zmes bola podrobená siedmim amplifikačným cyklom. Amplifikačné priméry boli totožné s degenerovanými primérmi, ktoré boli použité pri pôvodnej PCR-reakcii.

Southern blot DNA potkanieho genómu za použitia sondy pre NT-3

-43R1B/2C-produkt PCR bol získaný amplifikáciou z DNA potkanieho genómu ako templátu použitím degenerovaných primérov 1B a 2C tak, ako boli vyššie opísané. Produkt PCR, odvodený pri použití degenerovaných primérov 1B a 2C a označený R1B/2c pomohol zistiť nový gén, NT-3 a tiež dokázať gény NGF a BDNF v DNA potkanieho genómu. DNA bola pripravená z pečene Fischerových potkanov (Maniatis a ďalší, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), rozštiepená enzýmom EcoRI a 10 pg tohto materiálu bolo podrobených frakcionácii na 1% agarózovom géli. Potom bola DNA prenesená na nitrocelulózu použitím '10 x SSC (Maniatis a ďalší, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), hybridizovaná (Mahmoudi a Lin, 1989, Biotechniques 7:331 až 3) na 32p__značený PCRprodukt R1B/2C pri teplote 60 °C, potom bol materiál premytý 2 x SSC/01%SDS pri teplote 65 °C. Boli dokázané pásy pre NT-3, NGF a BDNF, polohy pásov pre NGF a BDNF boli už skôr stanovené použitím špecifických sond. Rozmery sú uvedené v kb na ľavej strane.

Expresia neurotrofínu 3

Konštrukcia na expresiu potkanieho NT-3 bola získaná použitím PCR na amplifikáciu kódovej oblasti predpokladaného krátkeho prekuzora NT-3 z plazmidu s obsahom fragmentu potkanieho genómu s 3,2 kb s miestom pôsobenia Sstl (obr. 6B), fragment zahrňuje gén pre NT-3. Oligonukleotidy, použité pri PCR-reakcii obsahovali syntetické miesto pôsobenia Xhol na svojom zakončení tak, aby bolo možné uložiť amplifikovanú kódovú oblasť do miesta pôsobenia enzýmu Xhol vo väzbovom reťazci vektora na expresiu pCDM8 (Seed, 1987, Náture 329: 840 až 842). Oligonukleotidom, ktorý bol použitý na amplifikáciu kódovej oblasti potkanieho génu pre NT-3 bol primér v zmysle kódového reťazca 5'-CGGTACCCTCGAGCCACCATGTCCATCT TG l l l l ATGTG-3' (podčiarknutý kodón ATG zodpovedá iniciačnému kodónu štartu B, pričom reťazec smerom dole od ATG presne zodpovedá reťazcu pre NT-3, smerom hore od ATG primér obsahuje syntetické miesto pôsobenia enzýmu Xhol), primérom proti zmyslu kódového reťazca bol primér 5'CGGTACCCTCGAGATGCCAATTCATGTTCTTCCG-3' (podčiarknutý triplet je

-44komplementárny k terminačnému kodónu pre gén NT-3, za týmto tripletom bezprostredne nasleduje presný reťazec NT-3 proti zmyslu reťazca, na konci priméru je zaradené miesto pôsobenia enzýmu Xhol na 5'-zakončení). Výsledný plazmid na expresiu potkanieho NT-3 bol označený pC8-rN3(P1). Podobný spôsob bol už skôr použitý na uloženie kódových oblastí pre potkaní NGF a BDNF do miesta pôsobenia enzýmu Xhol v tom istom vektore pCDM8. Konštrukcie pre NT-3, NGF a BDNF boli použité na transfekciu podľa publikácie Okayama a Berg, 1982, Mol. Celí Biol. 5:1136 až 42 buniek COS-M5 a tieto bunky boli potom použité na naočkovanie platní s priemerom 60 mm v množstve 5 x 10⁵ buniek na platňu a potom boli pestované v 2,5 ml Eaglovho prostredia podľa Dulbeccovej modifikácie s obsahom vysokého množstva glukózy (4500 mg/ml) a 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka. Supernatanty boli oddelené 72 hodín po transfekcii.

Výsledky

Klonovanie génu pre neurotrofín-3

Použitím rôznych párov degenerovaných oligonukleotidov boli získané amplifikačné produkty očakávanej veľkosti tak, ako bolo predpokladané podľa reťazcov NGF a BDNF. Tieto produkty boli najskôr podrobené analýze pôsobením reštrikčných enzýmov na stanovenie relatívneho obsahu NGF, BDNF alebo nových reťazcov. Vo všetkých prípadoch bolo možné dokázať fragmenty, ktoré zodpovedali len NGF a BDNF pomocou farbenia etídiumbromidom. Avšak použitím tých istých PCR-produktov ako hybridizačných sond pri skúške Southern blot na DNA potkanieho genómu bolo možné dokázať, že jeden z produktov (označený R1B/2C, ako je zrejmé z obr. 6A), identifikuje nový reťazec DNA genómu okrem NGF a BDNF. Týmto spôsobom bolo možné metódou Southern blot na PCR-produktoch identifikovať vzácne sa vyskytujúce amplifikované reťazce, ktoré inak nie je možné dokázať. Sondou R1B/2C bolo možné dokázať aj nové reťazce v DNA genómu vývojovo divergentných druhov (vrátane človeka, myši, kurčaťa a Xenopus), takže sa zdá, že sonda identifikuje funkčný gén.

-45Aby bolo možné tento gén izolovať, bolo použitá sonda R1B/2C a sondy, špecifické pre NGF a BDNF (Maniatis a ďalší, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), ďalej zostava DNA genómu potkana (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA), pripravená z DNA potkana kmeňa Sprague-Dawley, čiastočne rozštiepená Sau3A-reštrikčnou endonukleázou a klonovaná vo vektore bakteriofágu EMBL3/SP6/T7. Boli dokázané dva nezávislé klony bakteriofágu, ktoré hybridizovali so sondou R1B/2C, avšak nie s ostatnými dvoma sondami. V prípade, že bola vykonaná analýza miest pôsobenia reštrikčných enzýmov v členených reťazcoch potkanieho genómu v týchto klonoch, bolo možné dokázať, že zodpovedajú tomu istému génu, ako je zrejmé z obr. 6B. Kloň bakteriofágu s najdlhším včleneným reťazcom bol označený rN3(G1). Analýzou reťazca bolo možné dokázať, že gén, identifikovaný pomocou R1B/2C je kódom pre novú zlúčeninu zo skupiny NGF/BDNF (obr. 7), látka bola nazvaná neurotrofín-3.

Analýza reťazca úplného neurotrofínu-3

Analýza reťazca bolo vykonaná dideoxynukleotidovou metódou (Sanger a ďalší, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 až 7) pri použití zostavy SEQUENASE Version 2.0 (United States Biochemical Corporation) pri vykonávaní reakcií podľa doporučenia výrobcu.

NGF má dve odlišné formy prekurzora, a to dlhú (začínajúcu v mieste A) a krátku (začínajúcu v mieste B), oba prekurzory sa od seba líšia dĺžkou svojho N-terminálneho reťazca (Darling a ďalší, 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1:427 až 34, Selby a ďalší, 1987, Mol. Celí. Biol. 7:3057 až 64, Edwards a ďalší, 1988, Mol. Celí. Biol. 8:2456 až 64). Dlhý a krátky prekurzor je možné proteolyticky štiepiť za získania úplného NGF, ktorý tvorí v podstate 120 karboxyterminálnych zvyškov aminokyselín v oboch prekurzoroch. Tiež BDNF má podobné krátke a dlhé formy prekurzorov.

Analýza reťazca NGF z niekoľkých druhov dokázala, že väčšina prídavných N-terminálnych reťazcov sa nachádza na samotných exónoch s výnimkou štyroch kodónov (Val-His-Ser-Val), ktoré sú zahrnuté na 5'zakončení axónu, ktorý je kódom pre celý krátky (začiatok v mieste B) pre-46kurzor. Už skôr bolo uvedené, že dva z uvedených štyroch kodónov (Val-X-XVal) a tiež miesto štiepenia, ktoré ho predchádza je uchované tesne v smere reťazca za uchovaným začiatkom B v génoch pre BDNF z niekoľkých druhov živočíchov. Toto zistenie viedlo k predpokladu, že existujú krátke a dlhé formy prekurzora BDNF. Existuje konzervácia kodóriov Val-X-X-Val, namiesto štiepenia pre akceptor. V potkanovom géne NT-3 sú tieto miesta spolu s predpokladanou hranicou intrónu znázornené na obr. 7A. Analýza reťazca umožnila predpovedať existenciu kódových exónov v smere reťazca pre gén NT-3 tak, že vzniká kód pre dlhší prekurzor. Dôkaz konzervovaného reťazca v smere reťazca od predpokladaného začiatku A pre NT-3 ďalej zosilňuje predpoklad existencie dlhého prekurzora pre BDNF a podporuje názor na vývojovo uchovávanú úlohu tohto dlhého prekurzora u všetkých látok, ktoré patria do skupiny NGF. Predpokladané N-terminálne zakončenie pre úplný NT-3 nasleduje za zvyčajným miestom štiepenia pre proteázu (Arg-Arg-Lys-Arg), ktoré je veľmi podobné miestam v NGF a BDNF, ako je znázornené na obr. 7A a 7C. U niektorých druhov sú dve C-terminálne aminokyseliny NGF taktiež proteolyticky odstraňované. Na rozdiel do NGF nemá NT-3 potkana zreteľné potenciálne miesto štiepenia na svojom C-terminálnom zakončení (obr. 7A, 7C) a teda zrejme, rovnako ako v prípade BDNF u všetkých dosiaľ vyšetrených druhov, teda nedochádza k proteolytickej modifikácii na C-terminálnom zakončení NT3.

Na základe týchto úvah je predpokladaná dĺžka úplného polypeptidú NT-3 celkom 119 zvyškov aminokyselín, vypočítaná hodnota pl je približne 9,5. Pokiaľ ide o rozmer a o náboj je teda NT-3 veľmi blízko príbuzný NGF a BDNF. Sedem N-terminálnych zvyškov aminokyselín úplného NT-3 sa celkom líši od NGF a BDNF. Počnúc ôsmou aminokyselinou v úplnom NT-3 sa dosahuje optimálny súlad vypustením jediného miesta s dvoma aminokyselinami vzhľadom na BDNF a jediného pridania jedného zvyšku aminokyseliny vzhľadom na NGF, ako je zrejmé z obr. 7D. Úplný NT-3 potkana má 57% homológiu zvyškov aminokyselín s potkaním NGF a 58% homológiu s potkaním BDNF. 57 zo 120 zvyškov (48 %) je spoločných všetkým trom bielkovinám (obr. 2D). Šesť cysteínových zvyškov v NGF a BDNF je úplne uchovaných aj v NT-3,

-47oblasti najvyššej homologie medzi všetkými tromi bielkovinami sú v podstate nahustené okolo týchto cysteinových zvyškov.

Analýza prekurzorov neurotrofínu-3

Tesne za predpokladaným miestom štiepenia, ktoré uvoľňuje úplný NT-3 je univerzálne miesto pre glykozyláciu, znázornené na obr. 7A a 7C (Asn-XThr/Ser), ktoré je možné nájsť v rovnakej polohe aj v NGF a BDNF (Ullrich a ďalší, 1983, Náture 303:821 až 5, Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 52). Zatiaľ čo nie je známe, či toto miesto pre glykozyláciu hrá nejakú úlohu pri spracovaní NT-3, NGF alebo BDNF v ich prekurzoroch.

Ďalšie porovnanie reťazca NT-3 s reťazcami NGF a BDNF odhalí dve oblasti homologie aminokyselín smerom hore v reťazci úplného NT-3 (oblasti I a II na obr. 7B a 7C). Oblasť homologie I vedie k predpovedi existencie miesta začiatku B v NT-3 potkana (tak ako bolo vyššie definované pre NGF), toto miesto by pravdepodobne dávalo vznik krátkemu prekurzoru s 258 aminokyselinami, podobne ako je tomu v prípade krátkeho prekurzora pre NGF (241 aminokyselín) a pre BDNF (249 aminokyselín). Sú uchované metionínový inicializačný kodón, sekretorický signálny reťazec a miesto odštiepenia signálneho reťazca pre krátky prekurzor a to vo všetkých troch faktoroch (obr. 7C). Vzhľadom na to, že miesto homologie I je smerom hore od miesta začiatku B, je možné predpovedať aj existenciu dlhého prekurzora pre NT-3, ktorého začiatok by bol v mieste A (obr. 7A, 7B a 7C). Ako bolo dokázané pre NGF (Ullrich a ďalší 1983, Náture 303:821 až 5, Selby a ďalší, 1987, Mol. Celí. Biol. 7:3057 až 64) a predpokladané pre BDNF, takéto miesto začiatku by pravdepodobne bolo zakódované v prídavných exónoch smerom hore od exónu, ktorý je kódom pre celý krátky prekurzor.

Okrem oblastí homologie I a II dokazuje porovnanie hydrofilnosti pre NT3, NGF a BDNF podobnosť štruktúry v prekurzoroch smerom hore od úplných produktov.

Neurotrofná účinnosť neurotrofínu-3

-Neprekvapujúca homológia medzi NT-3, NGF a BDNF vzbudzuje silný dojem, že by NT-3 mal mať neurotrofnú účinnosť. Tak NGF, ako aj BDNF môžu vyvolať prežitie vybraných populácií periférneho a centrálneho nervového systému in vivo a in vitro (súhrná publikácia: Whitemore a Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439 až 64; Lindsay, 1988, Making of the nervous systém, str. 149 až 165; Davies, 1988, Trends Genet. 4:139 až 43). Napríklad pridanie ktoréhokoľvek z týchto faktorov k vyvíjajúcim sa embryám vtákov môže zabrániť prirodzene sa vyskytujúcemu uhynutiu neurónov s špecifických periférnych gangliách (Hoffer a Barde, Náture 331: 261 až 2). V prípade pridania k explantovaným gangliám vyvolávajú NGF a BDNF rast neurónov (Davies a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:1897 až 904). V prípade pridania týchto látok do kultúry disociovaných neurónov ganglií podporujú tieto látky prežitie a diferenciáciu neurónov (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 28). Tieto pokusy in vitro použitím niekoľkých typov kuracích periférnych ganglií boli použité na rozlíšenie medzi neurotrofným účinkom NGF a BDNF. Oba faktory pôsobenia na populáciu senzorických neurónov v dorsálnych koreňových gangliách (DRG), odvodených od dorzálnej ryhy, avšak len BDNF podporuje prežitie senzorických neurónov ganglion nodosum (NG), odvodeného od hlavovej časti (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 28). Naopak NGF a nie BDNF podporuje prežitie a rast neurónov paravertebrálneho reťazca sympatických ganglií (SG) (Barde a ďalší, 1982, EMBO J. 1:549 až 53).

Aby bolo možné stanoviť potenciálnu biologickú účinnosť NT-3, bol uložený gén pre NT-3 potkana do vektora pCDM8 (Seed, 1987, Náture 329:840 až 42), ktorý bol už skôr použitý na predchádzajúcu expresiu BDNF a NGF v bunkách cicavcov. Táto konštrukcia bola upravená na expresiu krátkej formy prekurzora NT-3. Pri expresii krátkych prekurzorov NGF a BDNF bol totiž získaný biologicky účinný materiál (Edwards a ďalší, 1988, Mol. Celí Biol. 8:2456 až 64; Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341:149 až 52). NT-3, NGF a BDNF-konštrukcie boli použité na transfekciu buniek COS. Supernatanty kultúr boli odobrané a skúmané v rôznych koncentráciách na schopnosť vyvolať rast neurónov v explantátoch DRG. Ako bolo možné očakávať, NGF a BDNF vyvolávali pri tomto pokuse rast neurónov (obr. 8). Avšak tiež NT-3 vyvolával silný rast neurónov v tomto pokuse, čo je prvým dôkazom toho, že gén

-49pre NT-3 je kódom pre produkt s neurotrofným účinkom, ako je taktiež zrejmé z obr. 8.

Aby bolo možné zistiť, či NT-3 pôsobí priamo na neuróny, bol tento faktor skúmaný vo vysoko obohatenej kultúre disociovaných neurónov DRG (obr. 9). Vo virtuálnej neprítomnosti Schwannových buniek a fibroplastov vyvolával NT-3 prežitie a rast neurónov a to približne 60 % neurónov. Vzhľadom na to, že NGF a BDNF spoločne podporujú približne 100 % neurónov v tejto kultúre (Lindsay a ďalší, 1985, Dev. Biol. 112:319 až 28) je nutné predpokladať, že NT-3 podporuje prežitie buniek na ktoré pôsobí aspoň jeden z vyššie uvedených faktorov.

Neurotrofná účinnosť NT-3 je odlišná od účinnosti BDNF a NGF

Aby bolo možné ďalej vyšetriť špecifickosť účinku NT-3, bol tento faktor sledovaný na explantátoch NG a SG. Ako bolo možné očakávať, kontrolné pokusy overili, že NGF vyvoláva rast neurónov v explantátoch SG, avšak nie NG a E8 kuracích embryí, zatiaľ čo BDNF vyvoláva rast neurónov v NG, avšak nie u explantátov SG. NT-3 vyvolal rast u explantátov SG aj NG, ako je zrejme z obr. 8, takže jeho špecifickosť je zrejme širšia, než v prípade NGF alebo BDNF. Avšak NT-3, rovnako ako NGF a BDNF nepodporuje prežitie a nevyvoláva rast z explantátov disociovaných, neuróny obohatených kultúr ganglion ciliare kurčaťa. Ako už bolo skôr dokázané, neuróny parasympatiku, ktoré sú v gangliu obsiahnuté, odpovedajú na CNTF potkana, čo je neurotrofný faktor, ktorý patrí do skupiny faktorov NGF/BDNF/NT-3 (Manthorpe a ďalší, 1986, Brain Res. 367:283 až 6; Stockli a ďalší, 1989, Náture 342:21 až 28). Nebolo možné pozorovať žiadnu odpoveď pri žiadnej z týchto skúšok za použitia supernatantov buniek COS po transfekcii kontrolnými vektormi, ako je zrejme z obr. 8.

V nasledujúcej tabuľke IV sú zhrnuté výsledky reprezentačných pokusov, pri ktorých boli merané odpovede explantovaných embryí 8. dňa (E8) a to ganglií dorzálnych koreňov kurčaťa (DRG), ganglion nodosum (NG) a paravertebrálnych ganglií sympatiku (SG) na zvyšujúce sa dávky NT-3. Gangliá boli pestované v kultúre po udanú dobu v 1 ml kolagenového gélu podľa pub-50likácie (Lindsay a Rohrer, 1985, Dev. Biol. 112:30 až 48). Rast vláken bol hodnotený podľa stupnice 0 až 5, kde hodnota 5 je maximálny rast vláken, pozorovaných na dorzálnych gangliách ako odpoveď na dostatočne veľkú (sýtiacu) koncentráciu neurotrofného faktora NGF (1 až 10 ng/ml). NT-3 potkana bol pridávaný ako upravené živné prostredie buniek COS-M5 po transfekcii plazmidom pC8-rN3 (P1) tak, ako bolo opísané vyššie. Ako kontrola bolo použité upravené prostredie buniek COS-M5 po simulovanej transfekcii. Vo všetkých skúšaných dávkach (v rozsahu 50-násobku) vyvolával NT-3 zreteľný rast u všetkých troch typov explantovaných ganglií, aj keď v nižších dávkach bola odpoveď sympatických ganglií nižšia. Maximálna odpoveď neurónov dorzálnych ganglií na NT-3 bola porovnateľná s odpoveďou na NGF a BDNF. U ganglion nodosum bola odpoveď na NT-3 vyššia než maximálna odpoveď na BDNF. Ganglion nodosum nereaguje na NGF. Maximálna odpoveď sympatických ganglií na NT-3 bola nižšia než maximálna odpoveď týchto ganglií na NGF a túto odpoveď bolo možné získať tiež až pri vyšších koncentráciách NT-3, než aké boli potrebné na dosiahnutie maximálnej odpovede na NT-3 u buniek dorzálnych ganglií alebo u ganglion nodosum.

Tabuľka IV

Rekombinantný NT-3 potkana vyvoláva rast vláken explantátov z

DRG = E8 gangliá dorzálnych koreňov kuracieho embrya

NG = E8 ganglion nodosum kuracieho embrya

SG = E8 gangliá paravertebrálneho sympatického reťazca kuracích embryí

Hodnotenie rastu vláken DRG NG SG (24 h) (24 h) (24 h)

Kontrola 500 μΙ supernatantu buniek COS po simulovanej transfekcii

NT-3 10 μΙ supernatant COS

0-0,5

2-3

2-3

- 0,5

NT-3 50 μΙ supernatant COS	3-4	4-5	0-0,5
NT-3 200 μΙ supernatant COS	5X	2 - 3X	0-1
NT-3 500 μΙ supernatant COS	5X	0 - 2X	1 -2

Uvádzané hodnoty sú priemerom rastu vláken vždy zo 4 až 6 ganglií. ^x Pri príliš veľkej koncentrácii NT-3 sa rast vláken znižu je, ako je možné stanoviť dĺžkou vláken na explantátoch DRG a na počte vláken na explantátoch NG.

Účinnosť NT-3 na neuróny cicavcov

Aby bolo možné stanoviť, či NT-3 potkana má účinok neuróny cicavcov, bol opakovaný pokus na explantátoch použitím ganglií dorzálnych koreňov, vybratých z potkaních embryí vo veku 14 dní. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke

V. Ako kontrola bol použitý čistený NGF. E14 explantáty ganglií dorzálnych koreňov potkana (štyri gangliá na 1 ml kultúry) bol pestovaný 24 hodín v podstate rovnakým spôsobom, ktorý bol opísaný pre kuracie gangliá (obr. 8, tabuľka IV) bez pridaného neurotrofného faktora (kontrola), s rastovým faktorom z podčeľusťovej žľazy myši (NGF) alebo s rekombinantným NT-3 potkana (upravené prostredie z buniek COS-M5 po transfekcii plazmidom pC8rN3(P1)), ako bolo opísané vyššie. Každé ganglion bolo vyhodnotené na rast vláken ako bolo opísané v tabuľke IV. Výsledky dokazujú, že rovnako ako NGF, je aj NT-3 účinný pokiaľ ide o podporu rastu vláken v explantátoch ganglií dorzálnych koreňov potkana.

Tabuľka V

Účinok NT-3 na rast vláken v explantátoch ganglií dorzálnych koreňov u potkaních embryí

Hodnotenie rastu vláken u E14 DRG potkana

Kontrola 0, 0, 0, 0,

-52NGF (myš, 5 ng/ml) 4, 4, 4, 3,

NT-3: 30 μΙ NT-3 potkana (supernatant buniek COS) 3, 3, 3, 4,

Hodnotenie v stupnici 0 až 5 je udané pre každé zo štyroch jednotlivých ganglií v kultúre.

Explantáty DRG, SG a NG odpovedali aspoň na dva z troch príbuzných neurotrofných faktorov, maximálna odpoveď u daného ganglia závisela na použitom faktore. V prípade DRG bola odpoveď na sýtiace koncentrácie NGF, BDNF a NT-3 relatívne ekvivalentná. Avšak v prípade NG bola maximálna odpoveď na NT-3 vyššia než na BDNF, zatiaľ čo v prípade SG bola maximálna odpoveď na NT-3 podstatne nižšia a o niečo oneskorená v porovnaní v odpoveďou na NGF.

Miesta syntézy neurotrofínu-3

Bolo dokázané, že v priebehu vývoja závisí prežitie neurónov na cielených neurotrofných molekulách. Tiež kontinuálne prežitie, aj u dospelého, môže vyžadovať trvalú prítomnosť neurotrofných látok (Thoenen a ďalší, 1987, Ciba Found. Symp. 126:82 až 95). V iných prípadoch už prežitie zrelých neurónov nemusí závisieť na neurotrofnom faktore. Bolo však dokázané, že takéto faktory hlboko ovplyvňujú diferencovaný fenotyp neurónov (Lindsay a Harmar, 1989, Náture 337:362 až 4). Pri určení miesta syntézy neurotrofnej molekuly môže preto tiež dôjsť k vysvetleniu jeho fyziologickej úlohy.

Aby bolo možné zistiť miesto syntézy NT-3 a porovnať expresiu NT-3 s expresiou NGF a BDNF, boli pripravené vzorky RNA z rôznych tkanív dospelých potkanov a trojitom opakovaní boli analyzované metódou Northern blot a hybridizované pomocou sond, špecifických pre každý z uvedených génov (obr. 10). Ako už bolo skôr dokázané (Heumann a ďalší, EMBO J., 1984, 3:3183 až 9; Shelton a Reichardt, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7951 až 5), expresia mRNA pre NGF bola najvyššia v mozgu, srdci a slezine. Aspoň stopy však bolo možné dokázať aj v ostatných skúmaných tkanivách. BDNF bol o niečo obmedzený, pokiaľ ide o expresiu: najvyššie hodnoty boli

-53nájdené v mozgu (Leibrock a ďalší, 1989, Náture 341: 149 až 52) a vyššie hladiny bolo možné dokázať aj v srdci, pľúcach a svaloch. Rovnako ako tomu bolo v prípade NGF, bolo možné dokázať transkript NT-3 (1,4 kb) vo všetkých dospelých skúmaných tkanivách. Avšak u všetkých skúmaných periférnych tkanivách bola úroveň expresie mRNA pre NT-3 aspoň porovnateľná s úrovňou v dospelom mozgu a v niektorých prípadoch, ako je oblička a slezina, bola podstatne vyššia.

Bola tiež porovnaná relatívne vysoká koncentrácia transkriptov pre NGF, BDNF a NT-3 v mozgoch novorodencov a dospelých myší. Na rozdiel od NGF a BDNF bola úroveň mRNA pre NT-3 v mozgu novorodencov zvierat vyššia než v mozgu zvierat dospelých (obr. 8). Podrobnejšia analýza dokázala, že úroveň mRNA pre NT-3 v centrálnom nervovom systéme je podstatne vyšší v priebehu fetálneho vývoja a potom klesá na hodnoty, ktoré je možno nájsť u dospelých.

Diskusia

Štruktúrne porovnanie medzi NGF, BDNF a NT-3, prítomnosť niekoľkých uchovávaných oblastí viedla k predpokladu, že funkčné rozdiely medzi týmito bielkovinami sú určované reťazcami, ktoré sa nachádzajú mimo tieto uchovávané oblasti. Predpokladaná existencia dlhého a krátkeho prekurzora všetkých troch bielkovín vyvolala celý rad otázok, týkajúcich sa významu oboch foriem prekurzorov in vivo. Dlhú formu je možné účinnejšie spracovať než formu krátku. Na druhej strane bolo možné z vektorov na expresiu krátkej formy prekurzora týchto faktorov získať materiál, ktorý bol v bunkách COS biologicky účinný.

Zistenie, že uvedené tri neurotrofné faktory majú spektrum účinnosti a expresie, ktoré je špecifické pre tkanivá a pre štádium rastu podporuje myšlienku, že vývoj neurónov závisí na dočasnej a miestne odlišnej expresii určitých neurotrofných molekúl. Vývojový profil expresie NT-3 ukazuje na to, že tento faktor môže hrať zvlášť dôležitú úlohu v skorom štádiu vývoja nervového systému. Počiatočná charakterizácia NT-3 a jeho neurotrofné účinnosť in vitro, spojená s generalizovanou prevalenciou mRNA pre NT-3 tak v dospelom

-54rnozgu, ako aj v periférnych tkanivách dospelých živočíchov ďalej naznačuje, že NT-3 môže mať veľmi široký vplyv na funkciu neurónov a/alebo prežitie a dospelého. Globálnejšia expresia NT-3 je zrejme dôsledkom toho, že NT-3 pôsobí aj na bunky mimo nervového systému, ako je tomu zrejme aj v prípade NGF (Otten a ďalší, 1989, Porc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059 až 10063).

Hoci až dosiaľ nebolo jasne dokázané, že neuróny môžu súčasne odpovedať na viac než jeden neurotrofný faktor, podľa výsledkov skúšok je nutné vedieť, že NGF a BDNF pôsobí na prekrývajúce sa populácie neurónov. Napríklad podanie tak NGF ako aj BDNF môže zachrániť väčšinu neurónov DRG, ktoré by inak uhynuli v priebehu normálneho vývoja vtákov (Hofer a Barde, 1988, Náture 331:261 až 2). Pozorovanie účinku NT-3 na periférne gangliá kurčiat silne podporujú možnosť, že jednotlivé neuróny môžu odpovedať na mnohopočetné priaznivé vplyvy. Ak je tomu tak, vyvolala by možnosť súčasného sprostredkovania týchto vplyvov zaujímavé otázky. Bolo by napríklad možné, že by boli spoločné zložky receptorov a/alebo signálne mechanizmy prevodu pre všetky tri štruktúrne príbuzné neurotrofné faktory. Zásadne by však súčasne odpovedajúce neuróny mohli mať mnohopočetné receptory alebo jediný receptor, ktorý by mohol sprostredkovať odpoveď na všetky faktory. Je však pravdepodobnejšie, že v priestore a čase existujú rozdiely v relatívnej dostupnosti jednotlivých faktorov (Davies a ďalší, 1987, Náture 326:353 až 8). Mohlo by teda byť možné, že rôzne faktory sú dostupné na rôznych miestach toho istého neurónu, napríklad senzorický neurón by mohol získať odlišné faktory od periférneho a centrálneho zakončenia (Kalcheim a ďalší, 1987, Le Douarin, EMBO J., 6:2871 až 3). V prípade, že pre niektoré neuróny sú súčasne dostupné rôzne faktory, môže sa ich účinok doplňovať.

Vysvetlenie individuálnej a potenciálne komplementárnej úlohy NGF, BDNF a NT-3 poskytne zásadnú informáciu na porozumenie vývoja a udržovania nervového systému. Pokusy na zvieratách vzbudzujú názor, že by bolo možné NGF použiť pri liečbe degeneratívnych neurologických stavov (Snider a Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26:489 až 506ô Fischer a ďalší, Náture 329:65 až 8; Phelps a ďalší, 1989, Neurobiol. Aging 10:205 až 7). Klonovanie novej látky zo skupiny génov NGF/BDNF a jej potenciálna interakcia medzi

-55d’alšími látkami z tej istej skupiny vyvolávajú nové úvahy pre potenciálne liečebné použitie týchto bielkovín u neurodegeneratívnych ochorení.

Príklad: Klonovanie a charakterizácia génu pre ľudský neurotrofín-3 8.1. Výsledky

Bola pripravená sonda (R1B/2C) na identifikáciu génu pre NT-3 potkana spôsobom podľa kapitoly 7 vyššie. Ako bolo opísané, bola sonda pripravená pomocou PCR-reakcie z DNA potkanieho genómu za použitia degenerovaných oligonukleotidových primérov, zodpovedajúcich dvom skupinám homológie reťazcov aminokyselín pre NGF a BDNF. Hybridizáciou Southern blot použitím DNA potkanieho genómu, rozštiepenej reštrikčnou endonukleázou EcoRI a sondy R1B/2C bola objavená nová skupina molekúl DNA okrem očakávaných fragmentov, ktoré zodpovedajú génom pre NGF a BDNF.

V prípade, že bola na analýzu hybridizácie Southern blot DNA ľudského genómu, rozštiepenej rôznymi endonukleázami použitá 32p-značená sonda R1B/2C, bolo možné pozorovať hybridizáciu na pásy, zodpovedajúcu génom pre NGF a BDNF, avšak taktiež nové pásy. Napríklad použitím endonukleázy Hindlll bolo možné pozorovať nový pás o približne 1,8 kb, ktorý nezodpovedal ani NGF ani BDNF. Použitím BamHI bolo možné pozorovať nový pás s veľkosťou 15 kb a použitím EcoRI nové pásy s 8 a 12 kb (prítomnosť dvoch pásov je zrejme výsledkom polymorfie miest pôsobenia EcoRI v DNA ľudského genómu). Tieto údaje ukazujú, že DNA ľudského genómu obsahuje gén pre NT-3, ktorý je veľmi blízky génu pre NT-3 potkana. Gén pre ľudský NT-3 bol izolovaný vyšetrením zostavy genómu tak, ako bolo opísané na izoláciu génu pre NT-3 potkana v kapitole 7. Postup bol vykonávaný tak, že zostava ľudského placentárneho genómu, čiastočne rozštiepená enzýmom Sau3A a klonovaná vo vektore lambdaEMBL3/SP6/T7 (Clontech Laboratories, Inc.) bola vyšetrená použitím sondy R1B/2C a sondami pre NGF a BDNF potkana. Bolo predpokladané, že ľudský kloň pre NT-3 bude hybridizovať so sondou R1B/2C, avšak nie so sondami pre NGF a BDNF. Jeden takýto kloň fágu bol medzi približne 8 x 10⁵ plakmi identifikovaný. Tento kloň, označený hN3(G1) obsahoval vloženú ľudskú DNA a približne 16 kb. Bolo vykonaná mapa reštrikčných miest tohto klonu zvyčajným postupom a reštrikčné fragmenty boli podrobené subklonovaniu v plazmide pBluescript (Stratagene) na

I -56ι analýzu reťazca DNA. Reťazec génu pre ľudský NT-3 a odvodený reťazec aminokyselín tohto bielkovinového produktu spolu s reťazcom pre NT-3 potkana sú znázornené na obr. 11.

Diskusia

Výsledky analýzy reťazca dokazujú prekvapivo vysoký stupeň uchovania nukleovej kyseliny a reťazce aminokyselín medzi NT-3 potkana a človeka. V oblasti, ktorá je kódom pre úplný polypeptid (119 aminokyselín) vykazujú gény pre faktor potkana a človeka približne 92% homológiu reťazca DNA. Avšak žiadny z rozdielov medzi nukleotidovým reťazcom potkana a človeka v tejto oblasti nevedie k substitúciám aminokyselín. Odvodený reťazec aminokyselín pre úplný NT-3 človeka a potkana (a tiež myši, kapitola 6 vyššie) je celkom identický). To pripomína vysoký stupeň uchovania v prípade BDNF, kde je tiež možné dokázať úplnú totožnosť reťazca aminokyselín v polypeptide potkana, myši, prasaťa a človeka. Na rozdiel od toho sa reťazec aminokyselín úplného NGF človeka a hlodavca (myši alebo potkana) líši približne o 10 %. Okrem toho reťazec aminokyselín putatívnych prekurzorov pre NT-3 človeka a potkana taktiež vykazujú pozoruhodne malé rozdiely (podčiarknuté na obr. 11). Tesne za predpokladaným miestom štiepenia, ktoré vedie k vzniku úplného NT-3 (Arg-Arg-Lys-Arg) chýba v reťazci ľudského pôvodu jeden kodón (pre Pro), ktorý je prítomný v reťazci potkana. V reťazci potkana a človeka sa od seba taktiež líši jeden blok štyroch aminokyselín a to v prepro-NT-3 a medzi uvedeným blokom a štiepnym miestom pre proteázu je šesť substitúcií aminokyselín.

Biologická účinnosť ľudského NT-3

Vzhľadom na to, že odvodený reťazec aminokyselín úplného ľudského NT-3 je totožný s reťazcom NT-3 potkana, bolo možné predpokladať, že bielkovina človeka aj potkana bude mať tiež neodlíšiteľný biologický účinok. Neurotrofný účinok ľudského NT-3 bol potvrdený uložením klonovaného ľudského génu do vektora na expresiu a to plazmidu pCDM8 a takto získaný výsledný

-57plazmid pC8-hN3(P1) bol použitý na transfekciu buniek C0S-M5 (Chen a Okayama, 1987, Mol. Ceil Biol. 7:2745 až 52), potom bol sledovaný neurotrofný účinok upraveného živného prostredia, v ktorom boli bunky po transfekcii pestované. Gén pre ľudský NT-3 bol amplifikovaný pomocou PCR z bakteriofágu hN3(G1) a uložený do vektora na expresiu pCDM8, ako bolo opísané pre gén potkana v kapitole 7. Výsledný plazmid bol označený pC8-hN3(P1). Reťazec nukleotidov celého včleneného génu pre NT-3 bol stanovený a porovnaný s reťazcom genómu ako bolo uvedené vyššie, aby bolo možné potvrdiť, že v priebehu PCR-amplifikácie a klonovania nedošlo k vzniku žiadnych mutácii. Transfekcia a skúšky boli vykonané v podstate rovnakým spôsobom ako pri stanovení biologickej účinnosti potkanieho NT-3.

Ako bolo predpokladané, bolo dokázané, že ľudský NT-3 má neurotrofný účinok pri skúškach na explantátoch embryí 9. deň (E9), išlo o explantáty ganglií dorzálnych koreňov kurčiat a o ganglion nodosum, ako je zrejmé z tabuľky VI. Gangliá boli pestované (obr. 8, tabuľka IV) 24 hodín za prítomnosti upraveného prostredia (supernatanty) buniek COS-M5 po simulovanej transfekcii alebo po transfekcii plazmidmi (všetky boli odvodené od vektora na expresiu pCDM8), obsahujúcimi kód pre rekombinantný ľudský BDNF alebo rekombinantný NT-3 potkana (rNT-3); plazmid pC8-rN3(P1) alebo rekombinantný NT-3 človeka (hNT-3; plazmid pC8-hNT-3(P1)). Plazmid pre BDNF bol použitý ako pozitívna kontrola vzhľadom na to, že BDNF má neurotrofný účinok tak na gangliá dorzálnych koreňov, ako aj na ganglion nodosum. Ako je zrejmé z tabuľky VI, má rekombinantný NT-3 potkana a človeka v pomerne malých dávkach (porovnaj tabuľku IV) približne rovnaký účinok ako BDNF u ganglií dorzálnych koreňov, podstatne vyšší účinok než BDNF má na ganglion nodosum. Ako je zrejmé z tabuľky VI, má rekombinantný NT-3 človeka a potkana v pomerne malej dávke (porovnaj tabuľku IV) približne rovnaký účinok ako BDNF na gangliá dorzálnych koreňov, podstatne vyšší účinok má na ganglion nodosum. Nebolo možné dokázať žiadny rozdiel v účinnosti medzi NT-3 človeka a potkana.

-58Tabuľka VI

Účinok rekombinantného ľudského NT-3, produkovaného v bunkách COS na gangliá dorzálnych koreňov alebo na ganglion nodosum v explantáte z kuracích embryí. NT-3 potkana má ten istý účinok.

Hodnotenie rastu vláken
	DRG	NG
Kontrola	0, 0, 0, 0, 0, 5	0, 0
BDNF: 20 μί COS supernatantu	3, 3, 3, 3, 3,	1,3
Simulovaná transfekcia:
20 μΙ COS supernatantu	0, 0,5 0, 0,0	0
ľudský NT-3: 20 μΙ COS super.	3, 2,4,3	3,3
NT-3 potkana: 20 μΙ COS sup.	3,4, 4, 3,4	3,4

Hodnotenie znamená rast vláken podľa stupnice 0 až 5 na 1 až 5 jednotlivých gangliách v kultúre (24 h). Je uvedená hodnota pre každý ganglion.

Identifikácia produktu ľudského génu pre NT-3 pomocou metabolického značenia

Predpokladaná veľkosť úplného polypeptidu NT-3 (potkanieho alebo ľudského pôvodu) je 119 aminokyselín, molekulová hmotnosť je 13 600. Aby bolo možné experimentálne stanoviť približnú veľkosť úplného ľudského polypeptidu NT-3, boli bunky, podrobené transfekcii plazmidom na expresiu ľudského NT-3 metabolický značené a upravené prostredie bolo analyzované na prítomnosť nového peptidu. V pokuse, znázornenom na obr. 12 boli bunky COS-M5 podrobené transfekcii plazmidom pC8-hN3(P1), ktorý už bol vyššie opísaný, bunky boli značené zmesou | ³⁵S| metionínu a | ³⁵S| cysteínu, rastové prostredie bolo odobrané a frakcionované za denaturačných podmienok na 15% polyakrylamidovom géli, bielkoviny boli prenesené na membránový filter (Toebin a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 až 4354) a

-59značené polypeptidy boli dokazované autorádiografiou. Bunky po simulovanej transfekcii boli použité ako kontroly (dráha, značená MOCK). Ako je znázornené na obr. 12 plazmid na expresiu pC8-hN3(P1) riadi syntézu jediného polypeptidu s molekulovou hmotnosťou približne 14 000 (na obr. značené NT-3), tento pás nie je možné dokázať u kontrol. V medziach technického delenia toto zistenie je v dobrej zhode s predpokladanou veľkosťou úplného NT-3.

Príklad 2

Účinok neurotrofínu-3 na prežitie dopaminergných neurónov ventrálneho mesencephala embryonálneho potkana v kultúre

Kultúry ventrálneho mesencephala potkanieho embrya E14 boli pestované spôsobom podľa US patentovej prihlášky č. 07/400 591, podanej 30. augusta 1989. Kultúry boli naočkované množstvom 50 000 buniek/cm² (obr.

13) alebo 100 000 buniek/cm² (obr. 14) a potom boli pestované v neprítomnosti zvyšujúceho sa množstva supernatantú kultúry buniek COS, obsahujúceho rekombinantný ľudský NT-3. Po 8 dňoch pestovania boli bunky fixované a farbené monoklonálnou protilátkou proti tyrozínhydroxyláze (TH), ide o značiacu látku pre dopaminergné neuróny. Ako je zrejmé z obr. 13 a 14, bolo dokázané, že zvyšujúce sa množstvo NT-3 zvyšuje počet TH-pozitívnych buniek, ktoré prežívajú po ôsmom dni, maximálnu hodnotu, ktorá je 2,5 krát vyššia než u kontrol je možné dosiahnuť pri riedení supernatantú buniek COS v pomere 1:25. Čistený NGF nemal žiadny účinok, avšak účinok NT-3 bol podobný účinku, ktorý bol preukázaný u BDNF.

Príklad 3

Vplyv NT-3, BDNF a NGF u vyvíjajúceho sa nervového systému potkana. Paralelné a recipročné typy expresie

Metódy

-60Materiály a spôsob odoberania

Potkany Sprague-Dawley (Harlan Sprague Dawley Inc.) boli použité na prípravu všetkých preparátov. Rezy na dospelom mozgu boli vykonávané podľa zvyčajných častí mozgu. Vzorky kôry obsahovali neocertex a dorzálnu časť čuchovej oblasti kôry. Vzorky diencephala boli odoberané použitím stria medullaris a chiasma opticum ako dorzálnych a ventrálnych hraníc tohto útvaru. Vzorky medzimozgu boli odoberané na úrovni colliculi superiores a inferiores dorzálne a zasahovali až k ventrálnemu povrchu mozgu až do najrostrálnejšej hrany pontu. Vzorky zadnej časti mozgu boli odoberané bez mozočku, avšak obsahovali pons a miechu. Je nutné uviesť, že boli odoberané len rostrálnou časťou corpus striatum, aby nedošlo ku kontaminácii talamom. Vzorky hippocampu boli odoberané na úrovni fimbria/fornix až približne ku kaudálnemu pólu. Pri odoberaní vzoriek z mozgu novorodencov potkanov bolo použité podobné ohraničenie s výnimkou stria medullaris. Na získanie embryonálneho tkaniva boli použité potkany s načasovanou graviditou, dátum oplodnenia bol označený E1, deň vrhu PO. Dospelé potkany mali hmotnosť 150 až 275 g (vek 6 až 8 týždňov).

Príprava RNA a Northern blot

Z potkanov Sprague-Dawley boli vybrané zvolené tkanivá a okamžite zmrazené v kvapalnom dusíku. RNA bola izolovaná homogenizáciou tkaniva v 3M LIC1/6M močovine (Bothwell a ďalší, 1990, Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Jones and Bartlett, Boston, MA). RNA (10 pg sa podrobí frakcionácii elektroforézou 4 krát na 1% agarózovom géli (Bothwell a ďalší, vyššie) s následným kapilárnym prenosom na nylonové membrány (magnaGraph. Micron Separations Inc.) za použitia 10 x štandardného roztoku citrátu (SSC) s pH 7. RNA boli zosietené s membránou pomocou UV svetla (Stratalinker, Stratagene, Inc.) a hybridizované pri teplote 68 °C s rádioaktívne značenými sondami za prítomnosti 0,5 M Na2PC>4 s pH 7,1% sérového albumínu hovädzieho dobytka (Frakcia V, Sigma, Inc.), 7% SDS, 1mM EDTA (Mahmoudi a Linn, 1989, Biotechniques 7:31 až 33) a 100 μΙ/ml dena-61 túrovanej DNA zo spermatu lososa, spracovanej pomocou ultrazvuku. Filtre sa premyjú pri teplote 68 °C pomocou 2 x SSC, 01% SDS a potom sa jeden deň až jeden týždeň vykonáva autorádiografia za použitia 1 alebo 2 zosilňujúcich fólií (Cronex, DuPont) a rtg-filmu (Xar-5, Kodak) pri teplote -70 °C. Po zafarbení gélov etídiumbromidom je možné dokázať, že pre rôzne vzorky bolo zistené ekvivalentné množstvo RNA (Maisonpierre a ďalší, 1990, Science 247:1446 až 1451). To bolo potvrdené aj vyšetrením materiálu z Northern blot pomocou sondy, špecifickej pre 28S rRNA.

Príprava sond pre NT-3, BDNF, NGF a NGFR

Molekulárne klonovanie kódových oblastí pre NT-3, BDNF a NGF potkana vo vektore na expresiu pCDM8 už bolo opísané (Aruffo a Seed, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573 až 8577 a Maisonpierre a ďalší, vyššie). Včlenené reťazce s 800 bp (Xhol) v týchto plazmidoch boli oddelené na polyakrylamidovom géli a izolované elektroelúciou (Bothwell a ďalší, vyššie) a potom značené 32p (Bothwell a ďalší, vyššie). Hybridizáciou každej z týchto sond na syntetické NT-3, BDNF a NGF-transkripty bolo možné dokázať, že sonda, špecifická pre jeden neurotrofín nehybridizovala s transkriptami príbuzných neurotrofínov. Sonda pre NGRF potkana bol fragmen cDNA s 1,6 kb (Ncol) s kódovou oblasťou pre potkaniu bielkovinu NGRF (Radeke a ďalší, 1987, Náture 325:593 až 597).

Získanie syntetického transkriptu a kvantitatívne stanovenie

Promótor fágu T7, prítomný v konštrukcii pCDM8/neurotrofín, už opísanej, bol použitý na získanie syntetických transkriptov RNA, zodpovedajúcich zmyslu orientácie kódových oblastí pre NT-3, NGF a BDNF. Množstvo týchto syntetických transkriptov bolo najskôr kvantitatívne určené spektrofotometricky. Potom boli transkripty ďalej sledované použitím koncovo značenej (Bothwell a ďalší, vyššie) 30-mérnej oligonukleotidovej sondy, ktorá hybridizovala so spoločným 5'-zakončením (tesne za promótorom T7) všetkých troch transkriptov. Denzitometrické sledovanie (Šerieš 300 Computing Densitometer,

-62Molecular dynamics, Inc.) syntetických transkriptov po vykonaní dot-blot a Northern blot, hybridizovaných na oligonukleotidovú sondu (hybridizácia a premytie pri 55 °C, inak ako vyššie) dokázalo, že ako definované štandardy boli použité syntetické transkripty v ekvivalentnom množstve (reprezentačné údaje sú uvedené na obr. 15A).

Denzitometrické kvantitatívne stanovenie úrovne transkripcie neurotrofínu

Úroveň transkripcie v rôznych vzorkách bola upravená tak, aby zodpovedala vzorke štandardizovaného mozgového tkaniva dospelého potkana nasledujúcim spôsobom: Do každej vzorky Northern blot bol zaradený ekvivalentný podiel RNA z mozgu dospelého potkana. Denzitometrické stanovenie rôznych rádiografických expozícií pre každú vzorku Northern blot bolo použité na určenie intenzity signálu pre každú skúmanú vzorku. Pre každú sledovanú expozíciu bola intenzita pre každú vzorku delená hodnotou získanou pre signál intenzity tkaniva dospelého mozgu pri tej istej expozícii, čo normalizovalo všetky hodnoty vzhľadom na štandardizovanú vzorku tkaniva dospelého mozgu. Na obr. 18 je uvedené porovnanie úrovne transkripcie u rôznych vzoriek relatívne k hodnotám v dospelom mozgu, pričom hodnota pre dospelý mozog je 1,0. Po stanovení femtogramov (fg) transkriptu neurotrofínu na mikrogram celkovej RNA vo vzorke tkaniva dospelého mozgu bolo možné stanoviť úroveň transkripcie (vo fg^g) vo vzorkách, normalizovaných vzhľadom na vzorku tkaniva dospelého mozgu.

Výsledky

Kvantitatívne stanovenie a porovnanie množstva mRNA pre NT-3, BDNF a NGF v mozgu dospelých potkanov

Bol použitý systém Northern blot, aby bolo možné kvantitatívne stanoviť a porovnať expresiu transkriptov NT-3, BDNF a NGF vo vzorkách rôznych tkanív. Množstvo transkriptu každého neurotrofínu v rôznych vzorkách bolo stanovené kvantitatívne relatívne k definovanému syntetickému štandardu. Syn-63tetické transkripty NT-3, BDNF a NGF, ktorých množstvo bolo presne stanovené boli použité v systéme Northern blot (obr. 15A), okrem toho bolo použitých aj 10 μο celkovej DNA, izolovanej z mozgu dospelých potkanov. Vzorky boli hybridizované s rádioaktívne značenými sondami, špecifickými pre každý neurotrofín a potom bola vykonaná autorádiografia (obr. 15B). Potom bola použitá sériová denzitometria na porovnanie intenzity hybridizačného signálu, získaného z mozgového tkaniva dospelého potkana a zo syntetických štandardov. Toto kvantitatívne stanovenie ukázalo, že úroveň mRNA je približne rovnaká pre všetky tri neurotrofíny v mozgovom tkanive dospelého potkana (40 fg transkriptu NT-3, 45 fg transkriptu pre BDNF a 30 fg transkriptu NGF). Alikvotný podiel tejto štandardizovanej vzorky dospelého mozgu bol zahrnutý do všetkých nasledujúcich skúšok Northern blot, takže bolo možné stanoviť kvantitatívne úroveň expresie neurotrofínu v nových vzorkách RNA porovnaním. Aby bolo možné uľahčiť vizuálne porovnanie troch transkriptov neurotrofínu v rôznych vzorkách, boli expozície v nasledujúcich výkresoch volené tak, že intenzita signálu v štandardnej vzorke tkaniva dospelého mozgu bola podobná pre všetky tri neurotrofíny, čím došlo k normalizácii signálu z iných vzoriek tkaniva k definovanému štandardu.

Expresia génov pre NT-3, BDNF a NGF ako všeobecný jav a špecifické vývojové vlastnosti tejto expresie

Sledovanie expresie génu pre neurotrofín u potkaních embryí ukázalo, že u všetkých troch neurotrofínov dochádza k dramatickému vzostupu úrovne expresie medzi jedenástym a dvanástym embryonálnym dňom (E11 až E12, obr. 16A). Transkripty pre všetky tri neurotrofíny sú distribuované vo veľkom počte tkanív u embryí E12 a E13. Obdobie vzostupu expresie génov pre neurotrofíny je v súlade s obdobím neurogenézy (periférnej aj centrálnej) a so začiatkom tvorby axónov na novo vytvorených neurónoch (Altman a Bayer, 1982, Adv. Anat. Embryol. Celí biol. zv. 74, Altman a Bayer, 1984, tá istá publikácia, zv. 85).

Cez koordinovaný nástup expresie génov pre neurotrofíny v priebehu embryogenézy je možné dokázať, že v porovnaní so štandardnou vzorkou !

-64tkaniva dospelého mozgu je mRNA pre NT-3 v najväčšom množstve v časnom embryonálnom období (180 fg/pg celkovej RNA), zatiaľ čo množstvo mRNA pre BDNF je nižšie (5 až 10 fg/pg celkovej RNA) a množstvo mRNA pre NGF je medzi týmito dvoma hranicami (30 fg/pg celkovej RNA) (obr.. 16A). V prípade, že sa sledujú vo vyvíjajúcom sa mozgu množstvá NT-3 a BDNF, je pomer týchto látok nepriamo úmerný (obr. 16B), to isté platí pre husto inervované srdcové tkanivo (obr. 16C), na začiatku dochádza k vysokej expresii NT-3, ktorá sa potom znižuje a pôvodne nízka expresia BDNF sa zvyšuje, až sa u dospelého dosiahne porovnateľná úroveň. Oproti tomu je expresia NGF v podstate konštantná. Je zaujímavé, že sa expresia NT-3 zvyšuje v priebehu vývoja pečene a detskej žľazy, t.j. orgánov, ktoré nie sú husto inervované, a u ktorých nedochádza k expresii detekovateľného množstva mRNA pre BDNF (obr. 16C).

Expresii transkriptu pre NGFR zjavne predchádza vzostup expresie génu pre neurotrofíny, je prekvapivo vysoká v počiatočnom období vývoja miechy a potom sa znižuje v priebehu prenatálneho vývoja mozgu a postnatálneho vývoja srdca (obr. 16A, B, C).

Porovnanie expresie NT-3, NGF, BDNF a NGFR v nervovom systéme novorodencov a dospelých živočíchov

Aby bolo možné definovať priestorovú distribúciu expresie génu pre neurotrofíny v nervovom systéme potkana a aby bolo možné porozumieť tomu, aký je vzťah medzi vývojom celého mozgu a jeho jednotlivých časti, bola sledovaná expresia génu pre neurotrofíny v mozgu novorodencov a dospelých. U všetkých troch faktorov existuje priestorový a časový rozdiel v expresii (obr. 17). Kvantitatívne stanovenie transkriptov vrátane periférnych tkanív je graficky znázornené na obr. 4. Hlavná podobnosť, spoločná všetkým trom faktorom je ich vysoká úroveň expresie v hippocampe dospelých. Na rozdiel od situácie v periférnych tkanivách dospelých, v ktorých NT-3 a NGF sú pokiaľ ide o expresiu široko rozšírené (Maisonpierre a ďalší, vyššie), je expresia NT-3 a BDNF podobná v tkanivách dospelého mozgu (obr. 17B, 18B). Je zaujímavé, že oba faktory chýbajú v corpus striatum. Avšak medzi NT-3 a BDNF tiež

-65existujú veľmi zaujímavé, zrejme recipročné vzťahy pre expresiu v mozgu novorodencov a dospelých (obr, 17A, B a obr. 18A, B). Expresia NT-3 u novorodencov je najvyššia a súčasne oveľa vyššia než u dospelých v nezrelejších tkanivách, ako sú mozoček, hippocampus a neocortex. Expresia BDNF je najnižšia v týchto oblastiach a najvyššia je v kaudálnejších oblastiach mozgu, kde je podobná úrovni u dospelých, ide o tkanivá, ktoré sú zrelé skôr, ako zadný mozog, medzimozog a diencephalon. Rovnako je tomu v mozgu dospelých, nie je možné dokázať transkripty NT-3 a BDNF v corpus striatum novorodencov zvierat.

V porovnaní s NT-3 a BDNF má rozšírenie mRNA pre NGF menej dramatické rozdiely medzi mozgom dospelých a novorodencov živočíchov (obr. 17,18). Úroveň NGF v bulbus olfaktorius je vyššia u novorodencov, zatiaľ čo v hippocampe a v neocortexe je vyššia u dospelých. Úroveň mRNA pre NGFR je vyššia všeobecne v mozgu novorodencov než u dospelých, výnimočne vysoké množstvo je možné dokázať v mozgu a zadnom mozgu novorodencov živočíchov (obr. 17A, B).

Sledovanie expresie NT-3, NGF a BDNF v priebehu vývoja rôznych oblastí centrálneho nervového systému

Aby bolo možné ďalej sledovať skutočnosť, že k expresii NT-3 dochádza najvýraznejšie v počiatočnom štádiu vývoja určitých oblastí CNS, zatiaľ čo k expresii BDNF dochádza väčšinou neskoršie pri vývoji tých istých oblastí, bola analyzovaná expresia génu pre neurotrofíny v priebehu vývoja troch častí CNS, k zreniu ktorých dochádza vo veľmi odlišných časových obdobiach. Neurogenéza, ktorá je nasledovaná obdobím prirodzene sa vyskytujúceho uhynutia buniek nastupuje veľmi skoro v mieche (E12 až E13) a je skončená niekoľko dní pred narodením (Altman a Bayer, 1984 vyššie). Na rozdiel od tejto skutočnosti vzniká väčšina neurónov v mozočku a hippocampe až po narodení (Altman, 1966, J. Comp. Neur. 128:431 až 474; Schlesingera ďalší, 1975, J. Comp. Neur. 159:149 až 176). V neskoršie sa vyvíjajúcom mozočku je v prvých troch týždňoch života rozsiahla neurogenéza, migrácia neuroblastov a diferenciácia neurónov (Altman, 1966 vyššie). Bolo tiež dokázané, že úroveň

-66mRNA pre NGF v hippocampe je možné zistiť až dva týždne po narodení (Large a ďalší, 1986, Science 234:352 až 355) tento vzostup sa objaví až neskoro po perinatálnom vzostupe proliferácie granulovaných buniek (Altman, 1966 vyššie) a po invázii vláken z cholinergných neurónov spodnej a prednej časti mozgu (koh a Loy, 1989, J. Neurosci.9:2999 až 3018), avšak je v koincidencii s ďalšou cholinergnou diferenciáciou týchto neurónov (Large a ďalší, vyššie).

Výskumy vyvíjajúcej sa miechy (obr. 5A, E) dokazujú vysokú úroveň expresie NT-3 v období E12 až E13 (150 až 280 fg/pg celkovej RNA), potom dochádza k poklesu v období pôrodu a u dospelého takmer nie je možné expresiu dokázať. Oproti tomu mRNA pre BDNF, ktorú je možné len ťažko dokázať v období E12 až E13 je produkovaná vo vysokom množstve v období pôrodu (10 až 20 fg/pg celkovej RNA) a potom u dospelého dochádza k ich poklesu. K expresii mRNA pre NGF dochádza v najvyššom množstve v mieche E12 až E13 (15 až 25 fg/pg celkovej RNA), avšak toto množstvo je približne 10 x nižšie než množstvo mRNA pre NT-3 v tom istom štádiu. K expresii NGFR dochádza v najvyššej miere v počiatočnom štádiu vývoja miechy. Táto expresia bolo skôr uvádzaná do korelácie s obdobím prirodzeného hynutia buniek novovytvorených motorických neurónov v počiatočnom štádiu vývoja miechy (Enfors a ďalší, Neurón 2:1605 až 1613).

V neskoršom štádiu vývoja mozočka (obr. 19B, F) pretrvávajú pozoruhodne vysoké množstvá mRNA pre NT-3 (500 až 820 fg/pg celkovej RNA) v priebehu prvých troch týždňoch po narodení, zatiaľ čo expresia BDNF sa začne zvyšovať až neskoro v tomto období. Len veľmi nízku úroveň expresie NGF je možné dokázať len v prvom štádiu vývoja mozočka. K expresii NGFR dochádza vo vysokom množstve hneď pri vývoji mozočka a potom dochádza k poklesu pred pozorovaným poklesom expresie NT-3.

V hippocampe (obr. 19C, G) sa zvyšujú hodnoty, pre mRNA pre BDNF a NGF z nízkej úrovne v období E17 do stredných hodnôt pri narodení, najvyššie hodnoty sú dosiahnuté u dospelých. Hoci k expresii transkriptov všetkých troch neurotrofínov dochádza v hippocampe dospelých na približne rovnakej úrovni, je predsa expresia NT-3 prekvapivo vyššia než expresia BDNF a NGF v hippocampe v období 317 a pri narodení. Expresia NT-3 v hippocampe novorodencov je rovnako vysoká ako v perinatálnom mozočku, to znamená 820

-67fg/pg celkovej RNA. Na rozdiel od neurotrofínov sa expresia NGFR v priebehu vývoja hippocampu znižuje.

Vo všetkých troch skúmaných oblastiach CNS je teda expresia NT-3 prekvapivo vysoká v priebehu ich vývoja a potom klesá až na hodnoty u dospelých , zatiaľ čo množstvo mRNA pre BDNF, ktoré je zo začiatku nízke sa zvyšuje až na hodnoty u dospelých, ktoré sú podobné ako hodnoty pre NT-3. Na rozdiel od recipročného vzťahu medzi NT-3 a BDNF nemá expresia NGF zvláštny priebeh. K expresii tohto faktora dochádza vo väčšej miere (aj keď v malom množstve) pri počiatočnom vývoji miechy a mozočku a pri neskoršom vývoji v hippocampe.

Diskusia

Naše analýzy dokázali tak podrobnosti, ako aj rozdiely v priestorovej aj časovej distribúcii troch neurotrofínov. Transkripty NT-3, BDNF a NGF zvyšujú svoju expresiu medzi jedenástym a dvanástym dňom embryogenézy potkanov a sú rozšírené u embryí dvanásteho a trinásteho dňa vývoja. Začiatok tohto spoločného zvýšenia expresie je zrejme približne v súlade s nástupom neurogenézy v priebehu vývoja (Altman a Bayer, 1982 vyššie). Toto spojenie podporuje názor, že tri neurotrofíny hrajú zvlášť významnú úlohu pri vývoji nervového systému a sú charakteristické pre obdobie, v ktorom sú prvýkrát potrebné všetky neurotrofíny na udržanie prežitia postmitotických neurónov. Avšak v období, v ktorom dochádza k expresii týchto faktorov by mohlo ukazovať tiež na iné úlohy neurotrofínov vo vyvíjajúcom sa nervovom systéme.

Hoci expresia génov pre všetky tri neurotrofíny začína súčasne, veľmi sa líšia úrovne, ktoré sú dosiahnuté v počiatočnom embryonálnom štádiu. U počiatočných embryí je mRNA pre NT-3 v najvyššom množstve, zatiaľ čo k expresii mRNA pre BDNF dochádza na nízkej úrovni. Tento kontrast medzi expresiou NT-3 a BDNF je možné dokázať v takmer každej skúmanej časti. V priebehu vývoja je expresia NT-3 najvyššia v tých oblastiach CNS, v ktorých nastáva proliferácia, migrácia a diferenciácia neurónov a ich prekurzorov a zvyčajne dramaticky klesá so dozrievaním oblastí CNS. Na rozdiel od toho je expresia BDNF najvyššia u novorodencov v tých oblastiach CNS, v ktorých k

-68neurogenéze už došlo a zvyčajne sa zvyšuje v priebehu dozrievania určitej oblasti CNS. Je zaujímavé, že úroveň, ktorú dosiahnu transkripty NT-3 a BDNF v rôznych oblastiach CNS u dospelých sú podobné. Recipročný vzťah medzi expresiou NT-3 a BDNF v priebehu vývoja spolu s pomerne podobným profilom u CNS dospelých ukazuje, že NT-3 a BDNF môžu v niektorých prípadoch pôsobiť na tie isté populácie nervových buniek v CNS. Ak je tomu skutočne tak, potom zrejme NT-3 hrá dôležitú úlohu pri vývoji týchto neurónov (pravdepodobne v priebehu inervácie cieľových orgánov), zatiaľ čo BDNF pôsobí zrejme v neskoršom štádiu života tých istých neurónov (dozrievanie a udržovanie). Expresia NGF sa v priebehu vývoja miestne mení, avšak tieto zmeny nemajú súvislý vzostup alebo pokles, ako tomu je v prípade NT-3 a BDNF. Úroveň mRNA pre NGFR neodráža špecificky expresiu ktoréhokoľvek z troch génov pre neurotrofíny a je pravdepodobne spoločnou zložkou receptorov pre jednotlivé neurotrofíny (Rodriquez-Tebar a ďalší, 1990, Neurón 4:487 až 492). Expresia NGFR je najvyššia v počiatočných štádiách vývoja rôznych obJastí CNS a existujú zrejme zaujímavé vývojové riedené zmeny v expresii GFR, ktoré je nutné podrobiť ďalšiemu skúmaniu.

Na rozdiel od podobnej distribúcie v CNS dospelých majú NT-3 a BDNF dramaticky odlišné rozdelenie miest expresie v periférnych tkanivách dospelých. Širšia periférna distribúcia transkriptov NT-3 môže odrážať účinnosť tohto faktora na širšiu (a odlišnú) škálu nervových a iných buniek na periférii, než tomu je v prípade BDNF (Mainsonpierre a ďalší, vyššie).

Hoci existujú podstatné dôkazy o tom, že NGF a BDNF hrajú dôležitú úlohu v počiatočných štádiách vývoja nervového systému, výskumy dokazujú ešte významnú koreláciu medzi značne vysokou expresiou NT-3 v počiatočných štádiách vývoja neurónov. Úroveň mRNA pre NT-3 vo vyvíjajúcom sa mozočku a v hippocampe je niekoľkokrát vyššia než množstvo akéhokoľvek iného neurotrofínu v akomkoľvek inom tkanive alebo mozgovej oblasti a viac než 20 x vyššia než množstvo akéhokoľvek iného neurotrofínu v dospelom mozgu. Objavenie NT-3 ako nového faktora, príbuzného NGF, ktorý môže podporovať aspoň niektoré, na BDNF a NGF závislé neuróny (Maisonpierre a ďalší, vyššie) a ktorého dočasná expresia je zjavne v zhode s kritickými obdobiami vývoja neurónov vzbudzuje názor, že NT-3 je tou fyziologickou látkou, ktorá je za

-69normálnych podmienok zodpovedná za niektoré vývojovo dôležité funkcie, ktoré boli skôr pripisované BDNF alebo NGF. Je potrebné objasniť skutočné vývojové úlohy všetkých látok tejto skupiny vzhľadom na možnosti skríženej reakcie protilátok proti týmto príbuzným faktorom (Whittemore a Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439 až 464).

Hoci už bolo skôr dokázané, že NT-3 môže pôsobiť ako klasická látka, podporujúca prežitie neurónov (Maisonpierre a ďalší, vyššie) a aj pri obmedzenej expresii spôsobujúca selekciu a tvorbu vláken u neurónov, táto úloha nijako nevylučuje iné vývojové dôležité úlohy NT-3 (a tiež ďalších neurotrofínov). Expresia NT-3 vo vyvíjajúcom sa nervovom systéme má značnú podobnosť s expresiou nestínu (nová bielkovina vláknitého tvaru, expresia ktorej je charakteristická pre tie oblasti CNS, v ktorých dochádza k neurogenéze, Landahl a ďalší, 1990) a SNAP (antigénna látka, značiaca rastúce neurity - Yamamoto a ďalší, 1986, J. Neurosci. 6:3576 až 3594). Na rozdiel od NGF (Clegg a ďalší, 1989, Dev. Biol. 134:30 až 37) expresii vysokého množstva NT-3 predchádza okamžik, v ktorom nervové vlákna sympatiku dosiahnu srdce. To znamená, že NT-3 by mohol byť viazaný najmä na iné vývojové procesy než je prežitie neurónov, vrátane proliferácie prekurzorov neurónov a ich diferenciácia a/alebo vedenie migrujúcich buniek alebo ich axónov. Ďalším predpokladom tejto dôležitej fyziologickej úlohy NT-3 je nové zistenie, že jeden z neurotrofínov (NGF) môže hrať úlohu pri proliferácii prekurzorov neurónov in vitro. Naopak BDNF napriek svojej prítomnosti v počiatočných vývojových štádiách môže mať všeobecnejšiu úlohu, ktorá zasahuje ďaleko za počiatočné obdobie uhynutia neurónov a selekciu.

Expresia všetkých troch neurotrofínov u dospelých má prekvapujúcu podobnosť, k expresii všetkých troch neurotrofínov dochádza v pomerne vysokom množstve v dospelom hippocampe. V prípade, že sa preruší spojenie cholinergných neurónov zo spodnej časti predného mozgu k hippocampu, má to za následok atrófiu a zníženú produkciu mediátora týmito neurónmi (súhrny článok Snider a Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26:498 až 506). Podobná atrófia je spojená so zlou funkciou pamäti u starnúcich potkanov a u ľudí s Alzheimerovou chorobou. Atrófiu cholinergných neurónov bazálnych častí predného mozgu je možné zvrátiť u potkanov podávaním NGF. Uvedené údaje sú v súlade s

-70možnosťou, že hippocamp dospelých za zvyčajných podmienok je zdrojom všetkých troch neurotrofínov pre bazálnu časť predného mozgu, takže pravdepodobne súčasné dôkazy doplňujúceho sa účinku NGF a BDNF na cholinergných neurónoch v kultúre odrážajú skutočnú fyziologickú úlohu týchto látok. Expresia NT-3 je však v hippocampe veľmi vysoká už v počiatočnom štádiu vývoja a potom klesá na úroveň v dospelom tkanive, ktorá je podobná množstvu BDNF a NGF. Táto počiatočná expresia znovu naznačuje, že by NT-3 mohol hrať celkom špecifickú úlohu pri vedení alebo uskutočňovaní počiatočného spojenia k bazálnej časti predného mozgu alebo s inými aferentnými neurónmi pre hippocampus alebo pri proliferácii prekurzorov granulovaných buniek. Pomerne nízke množstvo NGF v priebehu počiatočného vývoja hippocampu odporuje možnosti, že by túto úlohu mohol hrať NGF (Large a ďalší, vyššie).

Uloženie mikroorganizmov

Dňa 28. februára 1990 bol vo verejnej zbierke kultúr American Type Culture Collection, 12301 Parlawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 uložený súbor plazmidov a DNA bakteriofágov podľa nasledujúcej tabuľky:

kmeň číslo ATTC

bakteriofág (DNA)	hN3(G1)	40763
bakteriofág (DNA)	rN3(G1)	40764
plazmid	pC8-rN3(P1)	40766
plazmid	pC8-hN3(P1)	40765

Vynález nemá byť obmedzený na jednotlivé výhodné uskutočnenia, ktoré boli opísané. Je zrejmé, že by bolo možné vykonať ešte rôzne modifikácie, ktoré by taktiež patrili do rozsahu vynálezu. Tieto modifikácie môže vykonať každý odborník v danej oblasti techniky na základe opisnej a príkladovej časti a výkresov.

Claims (43)

1. Rekombinantná molekula DNA predstavujúca sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje neurotrofín-3 (NT-3) znázornená na obr. 2 alebo obr. 7 alebo obr. 11 alebo jej podsekvenciu s aktivitou NT-3, ktorá predstavuje aspoň 10 nukleotidov.

2. Molekula DNA podľa nároku 1, v ktorej sekvencia alebo podsekvencia nukleovej kyseliny kódujúca neurotrofín-3 je znázornený na obr. 2 od nukleotidu 598 až po nukleotid 954.

3. Molekula DNA podľa nároku 1, v ktorej sekvencia alebo podsekvencia nukleovej kyseliny kódujúca neurotrofín-3 znázornená na obr. 7 od nukleotidu 508 až po nukleotid 864.

4. Molekula DNA podľa nároku 1, v ktorej sekvencia alebo podsekvencia nukleovej kyseliny kódujúca neurotrofín-3 znázornená na obr. 11 od nukleotidu 530 až po nukleotid 886.

5. Molekula DNA podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá predstavuje sekvenciu cDNA.

6. Molekula DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorá predstavuje sekvenciu genómovej DNA.

7. Molekula DNA podľa nároku 1, ktorá predstavuje sekvenciu alebo podsekvenciu ľudskej DNA je znázornená na obr. 11.

8. Molekula DNA podľa nároku 3 obsiahnutá v plazmide pC8-rN3(P1) uloženom v ATCC pod registračným číslom 40766.

9. Molekula DNA podľa nároku 4 obsiahnutá v plazmide pC8-hN3(P1) uloženom v ATCC pod registračným číslom 40765.

-7210. Molekula DNA podľa nároku 4 obsiahnutá v bakteriofágu 0rN3(G1) uloženom v ATCC pod registračným číslom 40763.

11. Molekula DNA kyseliny, ktorá je homologná s molekulou DNA podľa nároku 1, a kóduje proteín s aktivitou neurotrofínu - 3.

12. Molekula DNA podľa podľa nároku 1 obsahujúca sekvenciu aminokyselín znázornenú na obr. 2, alebo jej podsekvenciu obsahujúcu antigénny determinant.

13. Rekombinantná molekula DNA podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, obsahujúca okrem reťazca nukleovej kyseliny, kódujúceho neurotrofín - 3, alebo jeho peptidického fragmentu, reťazec druhej nukleovej kyseliny, ktorý riadi jeho expresiu v hostiteľovi transformovanom uvedenou rekombinantnou molekulou DNA.

14. Molekula DNA podľa nároku 13 obsiahnutá v plazmide pC8-hN3(P1) uloženom v ATCC pod registračným číslom 40765.

15. Molekula DNA podľa nároku 13 alebo 14 kódujúca dlhú prekurzorovú formu NT-3.

16. Rekombinantná molekula nukleovej kyseliny komplementárna k rekombinantnej molekule DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kódujúca proteín s aktivitou neurotrofínu - 3.

17. Vektor nukleovej kyseliny predstavujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.

18. Rekombinantný mikroorganizmus alebo rekombinantná eukaryontná bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.

-7319. Rekombinantný mikroorganizmus podľa nároku 18, ktorým je baktéria alebo kvasinka.

20. Vyčistený proteín so sekvenciou aminokyselín, ktorá je znázornená na obr. 2 alebo 7 alebo 11, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou antigénny determinant.

21. Vyčistený proteín podľa nároku 20, so sekvenciou aminokyselín, ktorá je znázornená na obr. 2, od aminokyseliny 140 až po aminokyselinu 258, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou antigénny determinant.

22. Vyčistený proteín podľa nároku 20 so sekvenciou aminokyselín znázornenou na obr. 7, od aminokyseliny 1 až po aminokyselinu 119, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou antigénny determinant.

23. Vyčistený proteín podľa nároku 20 so sekvenciou aminokyselín znázornenou na obr. 11, od aminokyseliny 1 až po aminokyselinu 119 sekvencie zrelého proteínu, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou antigénny determinant.

24. Vyčistený proteín podľa nároku 20 so sekvenciou aminokyselín kódovanou sekvenciou nukleovej kyseliny znázornenou na obr. 2 pre myšací neurotrofín-3, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou funkčne aktívny peptid.

25. Vyčistený proteín podľa nároku 20 so sekvenciou aminokyselín, ktorá je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny znázornenou na obr. 7 pre potkaní neurotrofín-3, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou funkčne aktívny peptid.

26. Vyčistený proteín podľa nároku 20 so sekvenciou aminokyselín, ktorá je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny znázornenou na obr. 11 pre ľudský neurotrofín-3, alebo s jej podsekvenciou obsahujúcou funkčne aktívny peptid.

-7427. Vyčistený proteín podľa nároku 26 so sekvenciou aminokyselín znázornenou na obr. 11 od aminokyseliny 1 až po aminokyselinu 119 sekvencie zrelého proteínu, alebo s jej podsekvenciou pozostávajúcou z funkčne aktívneho peptidu.

28. Proteín neurotrofínu-3 alebo jeho fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 27, ktorý nie je glykozylovaný.

29. Proteín neurotrofínu-3 alebo jeho fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 27, ktorý je glykozylovaný.

30. Farmaceutická kompozícia vyznačujúca sa t ý m, že pozostáva z účinného množstva proteínu neurotrofínu-3 alebo jeho podsekvencie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 29 a farmaceutický vhodného nosiča.

31. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 30, vyznačujúca sa t ý m, že naviac obsahuje druhú účinnú látku.

32. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 31, vyznačujúca sa t ý m, že druhou účinnou látkou je nervový rastový faktor (NGF).

33. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 31, vyznačujúca sa t ý m, že druhou účinnou látkou je neurotrofný faktor izolovaný z mozgu (BDNF).

34. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 31, vyznačujúca sa t ý m, že druhou účinnou látkou je ďalší člen skupiny BDNF/NGF.

35. Proteín neurotrofínu-3, alebo jeho funkčne aktívna podsekvencia, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 29, alebo kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 30 až 34 na použitie pri liečení ľudí alebo zvierat na podporu prežitia dopaminergných neurónov.

-7536. Použitie proteínu neurotrofínu-3, alebo jeho funkčne aktívnej podsekvencie, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 29, alebo kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 30 až 34 na prípravu liečiva na použitie pri liečení choroby alebo poruchy nervovej sústavy ľudí alebo zvierat.

37. Použitie podľa nároku 36, kde chorobou alebo poruchou nervovej sústavy je degeneratívna choroba.

38. Použitie podľa nároku 37, kde degeneratívna choroba je volená z Alzheimerovej choroby, Huntingtonovej chorey, Parkinsonovej choroby, sklerózy multiplex a amyelotrofnej laterálnej sklerózy.

39. Použitie podľa nároku 36, kde choroba alebo porucha nervovej sústavy zahŕňa poškodenie nervovej sústavy.

40. Použitie podľa nároku 39, kde poškodenie zahŕňa periférnu neuropatiu.

41. Použitie podľa nároku 39, kde poškodenie zahŕňa diabetickú neuropatiu.

42. Použitie podľa nároku 39, kde poškodenie zahŕňa alkoholickú neuropatiu.

43. Použitie podľa nároku 39, kde poškodenie zahŕňa neuropatiu súvisiacu so syndrómom získanej imunodeficiencie.

44. Použitie podľa nároku 39, kde poškodenie je zapríčinené udalosťami volenými z traumy, chirurgického zákroku, infarktu, infekcie a malígneho nádoru.

45. Použitie podľa nároku 36, kde choroba alebo porucha je zapríčinená vystavením účinkom toxickej látky.

76

46. Použitie podľa nároku 36, kde choroba alebo porucha je zapríčinená nutričnou nedostatočnosťou.

47. Použitie podľa nároku 36, kde porucha zahŕňa vrodenú poruchu.