CZ250499A3 - Použití nukleové kyseliny k indukci inervace svalů a růstu axonů motorických neuronů - Google Patents

Description

Použití nukleové kyseliny k indukci inerva.ee svalů a růstu axonů motorických neuronů ¹ , . .

Oblast techniky

Odkaz na , související částečně' pokračovací ' , přihláškou č. 03/785074 podané 17·. ledna 1997·.

Předkládaný vynález se týká způsobu přenosu ' nukleové kyseliny do motorických neuronů; který spočívá v tom, že se nukleová kyselina podává dd svalové tkáně. Vynález.se zejména týká léčení · nemocí .nervového 'systému tím, .že se intramuskulárhě podává terapeutický gen a ' tento' gen. .se přenese do míšních motorických neuronů. Vynález se také týká farmaceutického přípravku obsahujícího gen vé 'formě' 'vhodné pro intramuskulární podávání.

přihlášku': Tato přihláška je dřívější přihlášky

Dosavadní stav techniky

Nemoci motorických. . neuronů, jako je. amyotrofičká laterální skleró.za (A.LS) a dětské spihální muskulární atrofie' (SMA) jsou často velmi vyčerpávající nemoci odolné léčebným zásahům. ALS vede k těžkému poškozehí a vždy je. letální. A.LS má incidenci 2,5/100 000, přičemž' tendence je stále rostoucí, a prevalenci 6 až 10/1.00 000- (Leign, Pathógénic mechanisms in anyotrophic lateral sclerosis. and other motor ¹neurons' dísorders in Neuródegenerative . diseases by CALNE, Saunders W.B. .Eds, Philadelphia, U.S.A., 1994). ALS’ trpí přinejmenším 90 .000 lidí v rozvinutých, zemích, většinou·' dospělých v.šesté dekádě věku.' Nemoc, je doprovázena progresivní paralýzou,

0 · * · 0 000 0 0 0 0

00 *00 00 ·· 000 000

0*00 0000 0 0

vedoucí k úplné ztrátě motorických a.respiračních .funkcí a posléze k smrti, a-sice s latencí dvou. až osmi let (průměr je tři roky) od výskytu prvních -symptomů-. 5' % případů ALS je familiárního původu a zbývajících 95 % jsou případy sporadické. Za patologii ve 20 % familiérní formy jsou zodpovědné bodové mutace v genu pro superoxiddismutážu (SOD1) z

,obsahující Cu/Zn, lokalizovanou na chromosorau 21q22-l (Rosen, et al., Mutations in Cu/Zn superoxide- dismutasé gene are.' associated with familial -amyotrophic lateral scierosis, . Ňature, 362, 59-62, 1993, review in Rowland, Amyotrophic lateral scierosis: Human' challenge for neuroscience, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 1251-1253, - 1995) . Tyto mutace přitom nesnižují- dismutázovou aktivitúr SOD. Patořyziolcoický ' základ sporadických forem je dosud neznámý. .Ačkoliv podávání přípravku' Rílutek poskytuje mírné zvýšení pravděpodobnosti přežití, není pro tuto nemoc_i dosud k dispozici žádný léčebný postup. '

Dětská- spináíní . muskulární. atrofie je -'autosómálně recesivní nemoc, která vé své nejsilnější formě '(SMA typu Ij postihuje .1/16 000 až 25 000 dětí v Evropě a Severní Americe.

,U pacientů trpících SMA.-l se'projevuje slabost již před třemi měsíci věku ,a nikdy nejsou schopni udržet polohu v sedu. . Průměrná očekávaná délka života je 8 měsíců s'95% mortalitou před dosažením- 2 let (viz přehled Crawfořd a Pardo, The neurobiologv of childhood spinal muscular atrophy, Neurobiol. of Disease, 3, ' 97-110, 1996) .) . Tato nemoc je spojena .

s mutacemi v genu SMN (Lefebvre ět al ·., Identification, and characterization of a spinal muscular atrophy determining gene, Cell, 80, 155-165, 1995). Neexistuje žádná'léčba této' τ' >

nemoci. ' , . .

«·· · · · · ·· «· *« ·« · · ··

Neurotrofické faktory

Neurotrofické faktory byly navrženy .jako potenciální léčiva pro nemoci, motorických neuronů (Thoenen et al.. Exp. Neurology ' . 124,-47-5-5, 1993) . A skutečně přežíváni embryonálních motorických neuronů v kultuře je prodlouženo aplikací· členů rodiny neurotrofinů, jako je např.· mozkový rieurotrofický faktor . (brain derived· neurotrophic ' factor, BDNF), neuroťrofin 3 (NT-3), NT-4 (NT—4/5), cvtokinv jako např. ciliární neurotrofický -faktor- (ciliary neurotrophic factor, CNTF), leukemický inhibitory factor,· LÍF) á .inhibiční faktor (leukaemia kardiotrofin-1, '' neurotrof ický faktor gliovýchh .buněk' (glíal cell line-ďerived neurotrophic factor, GDNF), růstový faktor, podobný inzulínu (insulin-likegrowth factor-1, IGF-1) a členové rodiny FGF -(přehled 'viz Henderson, Neurotrophic factors as therapeutic agents- in amyotrophic lateral sclerosis: potential and 'pitfalls.·. InSerratrice. G.T. and Munsat T.L. eds. Pathogenesis and tňerapy of amyotrophic lateral -sclerosis. Advances in Neurology, 68, pp. -235-24.0, 1995. Lippmcott-Raven. publishers, Philadelphia; Pennica et al., Oardiotrophin-l, a cvtokine present .in embryonic muscle, suppórts. long-term survival of spinal motoneuronš·. Neuron, 17, 63-74, 1996). ' '·.

Bylo pozorováno, že aplikace CNTF in vivo' snižovala míru 'buněčné smrti přirozeně se^; vyskytující v embryonálním vývoji (Oppeňheim et al., Control- of embryonnic motóneuron survival in vivo by,-ciliary neurotrophic factor. Science, 251, 16161618,' 1991), 'á totéž bylo pozorováno pro B-DNF (Oppeňheim et al.,. Brain-derived neurotrophic factor rescues developing avian motoneuronš from cell death. Nátuře, 360, 755-757,

1992), GDNF (Oppeňheim et al., Developing motor rteurons rescued from programmed and .axotomy-induced cell death by GDNF. Ňature, 373, 344-346, 1995).,. a kardiotrofin-1 (Pennica

I

st al., . 1995). U několika faktorů .bylo prokázáno, že u. novorozených hlodavců zabraňují odumírání retrográdních motorických neuronů po· 'akutní axotomii periferních nervů (Sendtner et .al.,-Ciliary· neurotroptuc factor prevents the degenération of motor neurons after axotomy, Nátuře 345, 44CU '441, 1990, Sendtner' et al., Ciliary neurotrophic .factor prevents degeneratioň o.f motor- neurons in mouše mutant Progressive motor neuronopathy. Nátuře, ' 353, 502-504., 1992;

Sendtner - et al·.·,. Brain-deríved neurotrophic- prevents ' the death of. motoheurcns in newborn. rats '-after nerve section. Nátuře, 360, .757-759, 1992; , Vejsada et- al·., Quantitative comparison of the transient 'rescu.e. -effects of neurotrophic factors on -axotomised motoneurons in vivo. Eurí J'.- Neurosci , 7, 108-115, 1995).Také ochranný účinek CNTF a/nebo BDNF byl popsán na dvou ' zvířecích ..modelech dědičné .progresivní motorické degenerace (Sendtner et al., .1992; 'Mitsumoto et al·., Arrest of motor neuron diseaše in -wobbTer mice cotreated with CNTF and BDNF. Science, 265, 1107-1110, 1994),.

Údaje, ukazující, že neurotrofické faktory - zvyšuji přežívání motorických neuronů v různých pokusných podmínkách', vedou k předpokladu, že ' -.tyto molekuly by mohly, snížit náchylnost - motorických neuronů k.nemocem u lidí. Avšak použití, trofických faktorů u pacientů je omezeno vzhledem k-jejich špatné biologické dostupnosti. po systémovém podávání.

, Nurotrofické faktory systémově- podávané pronikají do nervového systému- s -nízkou, účinnosti vzhledem k přítomnosti bariéry. . Jenom hematoencefalické injikované.ho faktoru se, dostane až nejpravděpodobněji, na (Dittrich 'et , al., pharacókinetics and acute phase response. Ann. Neurol., 35, velmi malý-. podíl k motorickými neuronům, úrovni neuromuskulárních synapsí

Ciliary neurotrophic cancer;

* ··* • ·♦

151-163, 1934, Yan et al., 1994). Navíc jsou trofické faktory rychle degradovány a vykazují velmi krátký biologický poločas po systémovém podaní (2,9 minuty pro CNTF u krysy,' viz'

Dittrich et. al., 1994, Cedarbaum et al., A double-blind placebo-controlled clinical trial of subcutaňeous recombinant.

'human ciliary neurotrophic factor' (rHCNTF) in amyotrophic lateral sclerosis. Neurology, 46, 1244-1249, 1996).

V důsledku toho je třeba podávat vysoké dávky, aby vůbec bylo možné dosáhnout terapeuticky účinné koncentrace na úrovni motorických neuronů. Avšak, takové dávky zase mají negativní vedlejší účinky. To . bylo ukázáno v klinických zkouškách s CNTF injikovaným. pacientům s ALS. Injikované dávky, které vykazovaly terapeutický účinek u zvířat (Mitsumoto et al.,

1994)', byly nad prahem toxicity pro člověka ((Milier et al., ' '

A. placebo-controlled trial of recombinant human cíiiary neurotrophic (rnCNT.F) factor in amyotrophic lateral sclerosis. Anňaís Neurob., 39, 256-260, 1996). a u nej vyšších ^!dávek byly zjištěny škodlivé vedlejší účinky jako kašel, asteníe, nevolnost, ztráta hmotnosti a dokonce' zvýšená úmrtnost, přičemž se neprojevilo žádné prospěšné působení podávaného CNTF (Milier et al., 1996) .'

Aby bylo -možné neurotrofické 'faktory klinicky použit, je tedy potřeba vyvinout vhodné postupy in vivo podávání. Terapeutický přenos . genů, vé srovnání s přímým 'podáváním proteinu, 'nabízí potenciální výhody jako je např. nepřerušená a/nebo cílená produkce požadovaného' transgenu in vivo.

Genová terapie

Genová terapie je rychle se rozvíjející účinný postup pro léčení a. ovlivňování mnohých nemocí. Příklady, účinných režimů genové terapie se již.běžně objevují v literatuře (viz např. Roth et al., Nátuře Medicine, Vol.' 2,' 985-991, 1996).

ff * · · · r v,*· * · · * « · · ·<· · c flfl ·«* ··· • I» * · «flflfl · ·

Genové terapie, zahrnující podávání modifikovaných virů jako vektorů, představuje zvláště slibný přístup k'léčení neůrodegenerativních nemocí. K. virům, které se v současnosti užívají v genové- terapii, patří adenoviry { (Le Gal La Salle et al.·,·' Science 259, 988-990), herpétické. viry, adenoasociované- viry a retroviry. Výzkumy. ukázaly·, ' že 'tyto vektory, 'a zejména adenoviry, jsou schopny infikovat, buňky centrálního nervového systému s vysokou' účinností. Tyto výsledky umožnily vývoj metod pro léčení nemocí centrálního nervového systému přímou injekcí' rekombinantního adénovirn obsahujícího terapeutický gen .(viz dokument W094/08026, na který se zde plně odkazujeme) do .centrálního nervovéhosystému (zvláště stereotaktickou metodou).'

Vzhledem- k neurodegenerativním nemocém nebo poraněním spojeným s míchou,, genová terapie .poskytuje -z-působ, jak bojovat proti degeneraci - motorických neuronů (mótoneuronú). tím., -že se podávají - terapeutické: geny, jako např. .gen kódující 'neurótrófický faktor nebo 'růstový faktor pro motorické neurony. Avšak dosavadní metody·jsou značně omezeny nedostatkem vhodných způsobů umožňujících specifický -přenos genu- do motorických neuronů. Předkládaný vynález řeší tento problém. I > . ·

Podstata vynálezu • Předkládaný vynález popisuje' zvláště účinný způsob' selektivního přenosu genů do motorických neuronů. ;

Jeden- aspekt, předkládaného .vynálezu poskytuje způsob přenosu nukleové kyseliny-do motorických neuronů savců, který spočívá' v tom, že: obsahuje podání uvedené 'nukleové kyseliny do svalové tkáně, kde je nukleová kyselina přenesena do motorických neuronů.

Dalším, aspektem předkládaného vynálezu je- způsob přenosu nukleové kyseliny do motorických neuronůsavců, který spočívá v tom, že obsahuje podání uvedené nukleové kyseliny do svalové tkáně v blízkosti místa nervového. spojení, souvisejícího se- zvoleným funkčním úsekem'' míchy, kde 'je. nukleová kyselina přenesena do motorických neuronů.

Dalším . aspektem 'předkládaného vynálezu je způsob přípravy proteinu v motorických neuronech .savce,· který spočívá v tom, Že se podá nukleová kyselina kódující uvedený protein do svalové tkáně,,'kde je uvedená nukleová kyselina přenesena do motorických neuronů'.a exprimováná. Ve výhodném provedení' předkládaného ‘ vynálezu je· protein produkován 'na postsynaptickém konci neuromuskulárního spojení..

Předkládaný vynález také poskytuje způsob ' indukce periferního nebo ko.laterálního růstu konců'motorických áxonů, který spočívá v .tom, že se podá do svalové tkáně 'nukleová kyselina, která indukuje růst zakončení· motorických áxonů; Ve výhodném provedení vynálezu·' nukleová kyselina kóduje, protein jako j-e např. neurotrof ický faktornebo- růstový faktor:

; . Dalším aspektem předkládaného vynálezu je· způsob ochrany· před axonální. degenerací, který spočívá v tom,' že se podává nukleová kyselina do svalové tkáně' .savce, kde je -uvedená nukleová . kyselina přenesena ' do motorických 'neuronů a ochraňuje tak proti axonální degeneraci. ,

Ještě . další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu léčení poškození nervové soustavy, ' které , spočívá v tom, že se podává nukleová kyselina kódující neuroaktivní· látku do svalové tkáně, kde je uvedená nukleová kyselina přenesena do motorických neuronů. ' Výhodná provedení, předkládaného vynález.u se týkají léčení nervových poškození • · * • · 1 · ♦ » * · λ

a neurodegenerativních nemocí jako je amyotrofická laterální ^:skleróza a dětská spinální muskulární atrofie.

Výhodný aspekt' předkládaného- vynálezu se', týká způsobuléčení amyotrofické laterální sklerózy, který spočívá v tom, že do svalové tkáně savce trpícího toto nemocí se podává replíkačně defektní -adenoyírus obsahující gen kódující neurotrofin-3.

Popis obrázků ' ' ' .

Obr. 1: β-galaktosidázové značení¹ podélných řezů ('50 um) z míchy krysy v 'lumbální' oblasti', po intramuskulární injekci adenovirus.-p-gal,akíosidáza do lýtkového svalu

- difúzní značení mnohých motoneuronových buněčných těl (Δ) ·^: intenzivnější značení několika motorických neuronů na úrovni, buněčného těla a neuritů, ukazující tak' typickou morfologii motorických·neuronů (^Λ/·

Obr’. 2: shodně s 1, větší' zvětšeni, β-galaktosidázové· značení podélných řezů (50- μπι) z míchy krysy v lumbální oblasti, podntramuskulární.' injekci adenovirus^-galaktosidázá ¹ do lýtkového svalu.

.1 '

Obr. . 3: β-galaktosidázové a ' současné imunohistochemickéZnačení podélných řezů (50 pm) z míchy' krysy' V lumbální oblasti, po intramuskulární. · injekci > adenovirus-βgalaktosidáza do lýtkového svalu.

Obr.. 4; Křivky přežívání myší..pmn ošetřovaných AD-NT3 .

'··»· * · · * , « « * « « * · « i ♦ * ·’ · * · ··· *0*

Obr. 5: Amplituda svalového , akčního potenciálu po supramaximální stimulaci- isčhiadického nervu ‘ u _ myší pmn; kterým se podávaly adenoviry.

Obr. 6: _ Imunitní odpověď po injekci . adenoviru. β-galaktosidážová -aktivita ve svalů· preinjikovaných myši a myší ber preinjekce. Obr. Ί: vyhodnocení injekce nahé DNA.

Panel-A: Srovnáni nahé DNA a adenoviru Panel B: Vliv šarže dávky ^;

Panel C: Srovnání promotorů CMV a RSV. u novorozených myší . ' .

Panel D: Srovnání promotorů CMV a RSV ů dospělých myší

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález' popisuje zvláště účinný -způsob selektivního přenosu genů Čta motorických neuronů. Vynález ukazuje, že je možné uskutečnit specifický přenos genů do motorických neuronů.' podáním do svalu. Původce' zjistil/ že adenoviry- jsou výhodně pohlcovány v úrovni neuromuskulárního spojení (motorické plotenky) ’ a přenášeny do buněčného těla motorických, neuronů (ventrálni míšní roh) - retrogřádním transportem podél -axonů motorických neuronů. Intramuskulární .injekce, -rekombinantních adenovirů expřimujících trofické faktory představují zvláště atraktivní způsob podávání.. Po .intramuskulární injekci , adenoviry infikují myotubuly a tím umožní, aby byl trofický faktor produkován na synaptickém konci motoneuronů a byl- nepřetržitě' uvolňován do oběhu, intramuskulární injekce vede k retrográdnímu transportu ínjikovaného rekombinantního adenoviru, a, to umožňuje infekci

4 4 motorických neuronů s vysokoui účinnosti ((Finieis et al., Specifi.c and efficíent gene traň.sfer stratégy offers new potentialities for the treatment of motor -neurone diseases. Nsuroreporť, 7, 373-378, 1995). To. pak vede k produkci _: transgenu v. mise. '

Intramuskulárni podáváni terapeutického genu představuje nový a velmi specifický' zp.ůs-ob infekce motorických' neuronů pomocí retrográdního transportu-.

Předkládaný 'vynález, tak umožňuje přesně se .zaměřit . na oblast míchy, kde je třeba působit, ’ v závislosti- na 'lokalizaci poranění a/nebo .degenerace. Zvláště výhodně umožňuje předkládaný vynález specificky a jednostranně' ’ ¹ \ infikovat motorické'neurony.různých.funkčních úseků míchy na základě přesné mapy . ňueromus kulami ch 'spojeni..' Předkládaný vynález je pokládán za .méně zraňující a více specifický zásah než stereotaktická injekce; do parenchymu míchy, které jsou více. difúzní a nejsou ome-zeny -na motorické neurony.

Definice ' ' .· '

Následující' termíny se žívají'' v předkládaném 'popisu a jsou· užitečné k porozumění předmětu a příkladů, provedení předkládaného vynálezu. ¹

Polypeptid je polymerní sloučenina . obsahující koyalentně spojené zbytky aminokyselin. Aminokyseliný mají · následující obecnou strukturu:

^: H. . . ' -.

R '— C — COOH | - S nh₂ .' '

Aminokyseliny se rozdělují do sedmi skupin na základě- jejich 'postranního řetězce R: 1) alifatické .postranní řetězce, < ί li

2) postranní řetězce obsahující hydroxylovou (OH) skupinu, 3) postranní řetězce obsahující atomy síry, 4) postranní řetězce obsahující'' kyselou nebo.' amidovou skupinu, 5) postranní řetězce obsahující bazickouskupinu, 6) postranní řetězce obsahující- aromatický kruh, a ' 7), aminokyselina, kde. je postranní s aminoskupinou. _; ,

Protein je polypeptid, který má 'strukturní nebo fc prolin', 'což. je řetězce ¹ fúzován funkční roli v živé buňce.

Polypeptidy' a proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být giykosylované'nebo neglykosylované

Varianta. polypeptidu nebo proteinu je jakýkoliv analog, fragment,· derivát nebo mutan.ta, které jsou ' odvozeny, z polypeptidu nebo 'proteinu 'a- které sl přitom uchovávají přinejmenším jednu -biologickou vlastnost· polypeptidu nebo proteinu. V přírodě mohou existovat ' různé ·, varianty polypeptidu nebo proteinu. Tyto varianty mohou''být alelické · i varianty, které .se . liší rozdíly v'nukleotidových sekvencích strukturního, genu kódujícího protein, nebo se .mohou týkat odlišného způsobu sestřihu nebo posttranslačních modifikaci. Odborník může vytvářet varianty pomocí substitucí, delecí, adicí- nebo přemístění jedné nebo několika' aminokyselin. K takovým variantám, kromě jiného, 'patří a) varianty,, kde jeden, nebo několik aminokyselinových zbytků je nahrazen konzervativní nebo nekonzervativní . aminokyselinou, b) varianty, kde je k polypeptidu nebo proteinu přidána jedna nebo několik aminokyselin, c) varianty.,, kde jedna -nebo několik aminokyselin obsahuje' „substituovanou skupinu, d) varianty, kde polypeptid nebo protein je fúzován s jiným polypeptidem- jako je např. sérový albumin. Způsoby pro tiskání takových variant, včetně enzymatických, genetických « »*· * ·* * · (suprese, 'delece, mutace atd.) a chemických metod jsou odborníkovi dostatečně známy;

Všechny takové .alelické' varianty, analogy, fragmenty, deriváty, mutanťy a modifikace, ' včetně forem alternativně sestřižených mRNA a alternativně posttransiačně modifikovaných forem, vedoucí ke vzniku derivátů polvpeptidu, který se' uchovává nějakou'vlastnost polypěptidu, spadají také do předmětu předkládaného vynálezu. - ,

Nukleová kyselina’’· je polymerní sloučenina obsahující kovalentně navázané podjednotky zvané nukleotidy.-'K núkleovým-. kyselinám- . patří polyribonukleová kyselina (RNA) nebo polydeoxyribonukleová 'kyselina (DNA), přičemž obě mohou být jak v jednořetězcově zahrnu j.e cDNA, 'genomovou tak i ve

DNA, dvouřetězcové -rormě. DNA syntetickou DNA a serr.isvntetickou DNA. Sekvence, která kóduje protein, ·, se- .nazývá

J sense sekvence.

Regulační- úsek znamená takový úseksekvence nukleové kyseliny, který reguluje ' expresi, jiné sekvence nukleové kyseliny. Regulační úsek může' obsahovat sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za expresi určité . nukleové kyseliny (homologní úsek) nébo může _: obsahovat sekvence odlišného původu (odpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Konkrétně se může jednat,,o -sekvence eukaryotických nebo virových genů', -nebo odvozené sekvence-, které stimulují nebo potlačují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým . '.způsobem .a indukovatélným. -'nebo neindukovatelným způsobem. Regulační úseky obsahují počátky replikace, místa sestřihu RNA, 'zesilovače (enhancery), sekvence pro ukončení transkripce (terminátory transkripce), signální sekvence, které směřují polypeptid do sekretorické metabolické dráhy cílové, buňky,, a promotory.

Φ φ φφφ φ φ *φ φφφ» φ φφ ·«· «0 φ ♦ φφφφφ» φφφφ · φ · φ φ φ

Regulační- úsek z heterologního zdroje je regulační úsek,' který není přirozeně spojen s- exptimovanou nukleovou

I kyselinou. K heterologním regulačním úsekům 'patří regulační úseky z odlišných biologických druhů, regulační. úseky z odlišných genů, hybridní regulační sekvence a regulační sekvence, . které' 'se nevyskytují v přírodě, ale které jsou vytvořeny odborníkem.. .

Termín vektor označuje jakýkoliv prostředek pro přenos nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu dd hostitelské buňky.. Termín vektor zahrnuje jak virové tak i nevirové prostředky ·' sloužící k vnesení nukleové kyseliny do buňky in vitro, ex vivo nebo in vivo. K nevirovým vektorům patří plazmidy, liposomy,· elektricky .nabité lipidy (cytofektinyl,

DNA-protěinové komplexy a biopolvmery. , K virovým· vektorům patří např. retroviry, adeno-asocidyané viry, virus neštovic, bakuloviry, virus- vakcinie, · virus herpes' simplex, virus

Epstein-Barrové a adenovirové vektory. Kromě ; nukleové kyseliny podle vynálezu, může vektor ještě obsahovat jeden nebo- několik 'regulačních úseků a/nebo jeden nebo několik selektovatelných markérů užitečných pro 'selekci,' měření a monitorování výsledků přenosu nukleové· kyseliny . (ke > , · zjištění -do jaké tkáně byla přenesena, jak dlouho -trvá exprese apod.}.

.Farmaceuticky přijatelný nosič obsahuje ředidla 'a plnidla, která jsou farmaceuticky přijatelná vzhledem ke způsobům podávání, jsou sterilní, a mohou to být vodné nebo olejové suspenze,' připravené pomocí vhodných dispergujících nebo-\ zvlhčujících a suspendujících činidel·.· Konkrétní farmaceuticky přijatelný nosič a jeho poměr k účinné látce se stanoví .na základě rozpustnosti a Chemických' vlastností sloučeniny, konkrétního způsobu podávání, a také' podle standardní farmaceutické praxe. .· ··· • * <

Termín ''motorický neuron označuje neuron^ který řídí pohyb vůlí ovládaných svalů.

Obecné techniky molekulární genetiky

Techniky rekombinantní DNA jsou odborníkům známy'. Obecné techniky klonovaní- a -exprese rekombinantních .molekul jsou popsány v příručkách Maniatise - (Molecular. Clonina, ' Cold Spring Ha-rbor Laboratories, 1982) a A.usubela (Current Protocols.. in .Molecular Biology, Wiley and Sons, ,1987), které jsou zahrnuty v odkazech. ' ' '

Nukleové kyseliny 'Předkládaný vynález se týká' zjištění, že intramuskulární podání, je prostředkem pro přenos sekvence nukleové kyseliny do motorických neuronů. Nukleová kyseliny podle, předkládaného vynálezu výhodně kóduje -neuroa-ktivní látku, tj . · látku schopnou projevit prospěšný účinek na' nervové buňky. Může to být látka, která je schopna kompenzovat nedostatek nebo naopak redukovat přebytek nějaké endogenní . látky. .Alternativně to může 'být látka, .která buňkám uděluje nějakou novou vlastnost.

Neuroaktivní látky mohou- být anti-sense . sekvence nebo proteiny. .K proteinům- vhodným k provádění předkládaného vynálezu patří růstové- faktory, .neurotrofickě faktory, cytokiný, enzymy účastnící se . syntézy neurotransmiterů (nervových přenašečů) , enzymy, receptory neurotransmiterů a receptory hormonů. , . ' .

Výhodnými růstovými faktory jsou. faktory stimulující kolonie (colonv stimulating factor, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF. apod.), fibroblastové růstové· faktory (fibroblast growth factor, FGFa, FGFb) nebo růstový faktor' cévních .buněk ývascular cell growth fac,ťor, VEGF) . 2 neurotrofických • 44 v * w v

4 «44 4

4·· »44 44 44 ··· 444

4 4 · 4444 · · '' 44 · · 444· 4444

15.

faktorů jsou výhodnými faktory ciliární neurotrofický faktor (ciliary neurotrophic factor, . CNTFj, faktory . dozrávání gliovýcn buněk (glial .cell maturation factor, GMFa, · GMFb),. GDNF, 3DNF,'NT-3, NT-5 a další.

Zvláště výhodný j.e neurtroř ický faktor NT-3. Úplná nukléotidová sekvence kódující NT-3 byla popsána v, dokumentu' W091/03569, na jehož plné, znění se tímto odkazujeme.

Výhodně cytokiny podle vynálezu jsou interleukiny a inťerferonv. , Enzymy spadající do- předmětu předkládaného vynálezu jsou enzymy účastnící se biosyntézy neurotransmiterů (např. tvrosinhydroxyláza, ' acetylcholintrarisferáza, dekarboxvláza kyseliny glutamová) a lysosomové ·, enzymy (hexosoaminidáza, , arylsulfatáza, . glukocerebrosidázá, HGPRTb.· Výhodné jsou enzymy účastnící se detox-ifikace volných radikálů (jako 'superoxiddismutáza I, II· a III; . kataláza, glutaťhionperóxidáza). K receptorúm patři např.. androgenní receptory ' (podílející se na Kěnnedyho nemoci) .

Tyto proteiny se mohou· užít buďto v'nativní formě nebo ve formě její variantv nebo ·fraamen-tu.

^: Neuróaktivní látkou může být také anti-sense sekvence. Pomocí anti-sense nukleových¹ kyselin'lze. dosáhnout utlumení (až .inhibice) genové exprese na. úrovni translace nebo transkripce. Anti-sense¹ nukíeové kyseliny podle předkládaného vynálezů jsou 'výhodně fragmenty nukíeové kyseliny, schopné specificky hybridizovat s nukleovou kyselinou kódující endogenní neuróaktivní . látku 'nebo odpovídající mRNA. Tyto anti-sense nukíeové kyseliny mohou být syntetické oligonukleotidy, volitelně modifikované kvůli zlepšení . jej ich stability a selektivity. Mohóu to být také sekvence DNA, jejichž exprese v buňce vede- k tvorbě RNA komplementární k celé nebo části¹ mRNA kódující endogenní neuróaktivní látku. Anti-sense nukíeové kyseliny mohou být φ- φ φφφ «φφφ « · φ « • · φ φφφ φφ φφ φφφ φφφ

Φ·ΦΦ · φ φ φ · φ φφ φ· φφ φφ φφ φφ připraveny expresi celé nebo části nukleové kyseliny, která kóduje endogenní neuroaktivní látku, v opačné orientaci,, jak je popsáno v dokumentu E? 140308·. Jakákoliv délka ''antisense sekvence je , vhodná pro použití podle předkládaného vynálezu, pokud je schopna snížit nebo zcela blokovat expresiendogenní neuroaktivní látky. Výhodně ' je .anti-sense sekvence dlouhá alespoň .20 nukleotidů. Příprava a .použití anti-sense -hukleových. kyselin, 'DNA -kódujících anti-sense RNA a použití anti-serise oligonukleotidůa genů je popsáno v dokumentu W092/15680; jehož plný obsah je zahrnut do odkazů. . '

Nukleová kyselina může být -přírodního nebo umělého původu.- Může' to být zejména . genomová DNA (gDNA), komplementární DNA ' (cDNA)', hybridní . sekvence nebo syntetická či semisyntetická sekvence. Sekvence může pocházet z člověka, Zvířete, rostliny,· bakterie, viru atd. Lze ji získat způsobem, -který je .odborníkovi ' známý, zvláště screeningem knihoven, chemickou syntézou, nebo alternativně smíšenými metodami zahrnujícími chemické nebo enzymatické modifikace sekvencí získaných screeningen knihoven. Výhodně se jedná o-cDNA nebo gDNA. ·

Regulační úseky

Obecně jsou nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu spojeny s jedním nebo několika regulačními úseky. Výběr vhodného regulačního .úseku je'' rutinní záležitost v rámci schopností odborníka.

. Regulační úseky mohou -.o.bsahovat pr.omotorový úsek pro funkční transkripci v motorických neuronech, a také úsek lokalizovaný na 3'-konci požadovaného genu-,' který specifikuje signál pro terminaci (ukončení) transkripce á polyadenylační místo. Všechny tyto prvky vytvářejí expresní' kazetu.

0 000 0 0 00 * · · · • * 0 000 » 0* 0*0 00* ' 0 · 0 · 0000 * 0

K promotorům, které mohou být užity v předkládaném vynálezu, patří jak konstitutivní promotory tak i regulované' .(indukovatelné) 'promotory. Promotorem může být promotor, který .-je přirozeně zodpovědný za expresi dané nukleové kyseliny. Může to být také oromotor z heterologního^-. zdroje. Zejména se může jednat o promotorovou sekvenci eukaryotíckých nebo virových -genů. Tak např. tg . může být promotorové sekvence odvozená z genomu 'buňky, které má být infikována. Podobně 'to může být promotorové 'sekvence z genomu viru, včetně užitého adenoviru. V této souvislosti je možné uvést např.promotory genů E1A, MLP, CMV.a RSV. apod.

Kromě toho· je možné modifikovat promotor' tak, ' že se k němu přidají 'aktivační nebo regulační sekvence nebo sekvence· umožňující tkáňově specifickou .nebo ·.převládající expresi (promotor enolázy 'nebo GFAP apod.). Pokud nukleové kyselina neobsahuje promotorovou sekvenci, může být vložena do virového genomu, downstream (po směru transkripce) .od .takové promotorové sekvence. ¹ '

K promotorům .vhodným -pro provedení ’ předkládaného, vynálezu patří obecné promotory (např. HPRT, vimentin, aktin, tubúlin), promotory intermediálních filament (např. desminu, neurofilamnt,. keratinu, GFAPj ,· promotory terapeutických, genů (např. typu MĎR, CFTR, faktoru VIII), tkáňově specifické promotory (např.. promotor aktinu v buňkách hladkého svalstva), promotory aktivované přednostně v dělících se buňkách, promotory odpovídající -.na podnět ’ (např. \ receptor' steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové), tetracyklinem regulované transkripční modulátory, .-promotor bezprostředně časných genů cytomegaloviru, retrovirového LTR, metalothioneninu, SV40, 'Ela a MLP. Tetracyklinem regulované transkripční modulátory a promotor , CMV ' jsou popsány /

4 ··· • 44

- * • · 4 * · · 4 4.4· 4·4 ··* • 4 · · · 4 4 ' · 4 *

1S v dokumentech WO 96/01313, u’S 5, 168,062 a US 5, 385,339, na jejichž plné zněni.se odkazujeme.

Vektory ’

Jak již bylo uvedeno výše, termín vektor označuje ' jakýkoliv prostředek’ pro přenos nukleové kyseliny., podle předkládaného vynálezu do hostitelské buňky. Výhodné vektory λ jsou virové vektory, jako např. retroviry, herpétické viry, adenoviry. a adeno-asocíované viry.

Výhodně jsou '.virové vektory replikačně défektní, tzn. nejsou schopny autonomně se replikovat v cílové' buňce. Obecně řečeno, genom replikačně deřektních viru použitých podle předkládaného. vynálezu postrádá alespoň jeden úsek, který j-e nezbytný pro replikaci viru v infikované buňce. Takové úseky mohou být buďto eliminovány (celé nebo částečně), nebo ' ·. jakoukoliv technikou odborníkovi .známou změněny na nefunkční úseky. K těmto technikám patří úplné odstranění, substituce (jinou sekvencí, zejména vloženou požadovanou nukleovou ' kyselinou), částečná delece nebo adice jedné nebo .několika baží v úseku nezbytném pro replikaci. Takové techniky se mohou 'provádět' iň-vitro (na izolované DNÁ) nebo. j in -sítu pomocí způsobů genových manipulací nebo působením mutagenních činidel, . ’ ' ·.

. Výhodně si replikačně defektní virus ponechává sekvence ’ nezbytné pro enkapsidaci virových částic.

Retroviry jsou integrující viry, které infikují dělící sé buňky.. Retrovirový .genom obsahuje dva úseky LTR, enkapsidační sekvenci· a tři kódující úseky (gag/ pol' a> env). Konstrukce ' rekombinantních retrovirových vektorů již byla popsána (např. EP 453242, EP178220, Bernstein et. al. Genet. Eng. .7 · (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689,· ' atd.). V-rekombinantních retroviro.vých vektorech · j sou obecně •·· Φ« φ φ' · « «

9 9 9· · * · · · « • * φφ.

geny gag, pol a env odstraněny, buďto celé nebo částečně, a nahrazeny požadovanou sekvencí nukleové kyseliny. Takové vektory se mohou konstruovat z různých typů retrovirů jako je např. HIV, MoMuLV (murine Moloney leukaemia virus], MSV (murine Moloney sarcoma virus), HaSV (Harvey sarcoma virus); SNV (spleen ,necrosis virus); RSV (Rous sarcoma virus) a Frienčův virus. Defektní' re.trovirové vektory byly popsány v .dokumentu W95/02697.

Obecně řečeno, pro konstrukci rekombinantního retrovirů .obsahujícího' sekvenci nukleové kyseliny se připraví 'plazmid, který obsahuje oba LTR, enkapsidační sekvenci . a kódující sekvenci. Tento -konstrukt -se pak použije 'k'transfekci pakážovací (balicí) buněčné linie, která je schopná nahradit v trans retrovirové' funkce 'chybějící v plazmidu. Pakážovací linie jsou tedy obecně schopny-, exprímovat. geny >gag, pol a-env.- Takové pakážovací linie byly již ,'ve stavu techniky popsány, např. buněčná linie PA.317 .(US 4,.861,719), PsiCRP ' (W090/02806). .a GP+envAm-12 (WO39/Q715Q)'. . Kromě toho rekombinantní retrovirové vektory mohou obsahovat modifikace uvnitř úseků LTR. potlačující transkripční aktivitu a také rozsáhlé .enkapsidační sekvence, které mohou obsahovat -část .genu gag (Bender et al.·, J..- Virol. 61/ 1987, 1639).

Rekombinantní retrovirové vektory se purifikuji, standardními , J. . ' : způsoby, které jsou odborníkovi známy. .

Adeno-ašbciovarié virý (AAV) jsou'DNA. viry relativně malé rvelikosti,- které se mohou integrovat,- a sice stabilním a-místně-specifickým způsobem, do genomu -buněk, které infikují. Jsou schopny infikovat široké spektrum buněk, aniž by působily- na buněčný růst, mbr.fologii nebo. diferenciaci buněk a má se,za to, že se nepodílejí na žádné lidské nemoci. Genom AAV býl již klonován, sekvencován.a charakterizován. Je tvořen přibližně 4700 bázemi a- obsahuje na každém · konci.

• · ftftft • ftft * • · · · ' ·· ·· ftft'· ftftftft • · · · tft ftft ·· ftl [prevracene koncové se účastni vi-rove pravá část -genomu, invertovanou . terminální repetici opakované 'sekvenční úseky), ITR, tj. úsek dlouhý 145 baží, který, slouží jako virový r.eplikační počátek. Zbytek genomu tvoří'dva esenciální úseky, které nesou enkapsidační funkce: levá část genomu obsahující - gen rep 'replikace a exprese virových genů, a /

obsahující gen cap kóduje virový kapsidový protein. -

Použití vektoru- odvozených z AAV pro přenos genů in-vitro.-a' in vivo -bvio již popsáno -(WO91/13088, W093/09239, ·' US

4,797,363,. US 5,139,941 a EP 488528). Uvedené 'publikace popisují různé- konstrukty 'derivátů AAV,. kde , jsou gen- rep a/nebo gen cap ' deletovány. ' a nahrazeny požadovaným .genem, a použití těchto, konstruktů k přenosu .požadovaného genu in vitro (do buněk v kulturách) . nebo ih vivo (přímo do organismu)

Replikačně .defektní- r e kombi hant ní AAV podle předkládaného vynálezu mohou být - připraveny (současnou transfekcí) 'plazmidem obsahujícím požadovanou sekvenci nukleové kyseliny obklopenou dvěma úseky invertované terminální . repetice (í.TR). - z AAV, a plazmidem- nesoucím enkapsidační.geny (rep a- cap) AAV, a to .buněčné liriie, která je infikována 'lidským pomocným’ (helper) virem . (např. adenovirem) . Takto připravené rekombinantní AAV se purifikují 'standardním způsobem.

Předkládaný vynález se proto také týká rekombinantního viru odvozeného z AAV, jehož genom. obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje neuroaktivní látku,. ohraničenou,dvěma úseky ITR z AAV'. Vynález 'se také týká plazmidu obsahujícího sekvenci nukleové kyseliny, .která kóduje neuroaktivní látku, ohraničenou dvěma- úseky ITR z AAV. Takový pla.zmid se může užit pro přenossekvence nukleové kyseliny tak jak je> s tím, že pokud je to vhodné, může plazmid být součástí liposomového vektoru (pseudo-virus). , i·· * « 99 · • ·

9 9 » · · · 9 9 9 ·· ·· ·· ♦ · *·

2!

Ve výhodném provedení vynálezu je vektor adenovirový vektor. ' .

Adenovirus je DNA' virus eukarvot, který může být modifikován tak, aby účinně přenášel nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu do buněk různých typů.'

Existují různé sérotypy adenovirů. Z těchto sérotypů jsou pro-použití podle předkládaného'· vynále.zu výhodné lidské adenovirv typu 2 a 5 (Ad 2 nebo Ad 5) . K 'ádenovirům zvířecího původu, které, mohou být užity podle ’ předkládaného vynálezu, patří viry psího', hovězího, myšího., (např·. Mávl, ^zBeard et al, Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího a opičího původů '(např. SAV) . Výhodně- jé adenovirus zvířecího původupsí adenovirus, výhodněji adenovirus .· CAV2' (např. 'kmen Manhattan nebo'A2.6/'61, ATCC VR-300)·. '

Replikačně’, defektní .adenovirové .vektory ' -podle předkládaného vynálezu, výhodně obsahují' úseky ITR, ’ ’ . + λ enkapsidační sekvenci a požadovanou nukleovou kyselinu. Ještě výhodněji, je alespoň úsek El adenovirovéno vektoru nefunkční. Delece v úseku El zasahuje Zpravidla od nukleotidu 455 do 3329 v sekvenci adenovirů Á5 (PvuII-BglII fragment) nebo 382 až 3446 (HinfII-Sau3A fragment) . I Jiné úseky mohou být modifikovány, úsek E3 (W095/02697), úsek E2 (W094/28933) , úsek_ Ξ4 ' (W094/28152, , W094/126.49'. a W095/02697) nebo úseky kteréhokoliv z pozdních genů LI až L5.

J

Ve výhodném provedení vynálezu má adenovirový vektor deleci v úseku El- (Ad 1.0}. Příklady adenovirů S delecí v El jsou uvedeny v dokumentu EP 185.573, na který' se tímto odkazujeme.. V dalším výhodném' provedení má adenovirový-vektor deleci v úsecích El a ,E4 (Ad3.0). Příklady adenovirů jsou popsány v dokumentech WO95/O2697 V dalším s delecemi' . El/E'4 a W.O96/22378, na jejichž obsah se odkazujeme.

' / výhodném proveení má adenovirový vektor deleci v úseku El, do k * ··*

I · · « ► · · * «· ·· v « v » ·· · · *« · · 9 ♦ «· · · «9 · 9 9 0·· ♦· ·.· · · «· »» ·· ·· kterého byl vložen úsek E4 a požadovaná sekvence nukleové kyseliny (viz FP. 94/13355, na jejíž obsah se tímto odkazujeme) .

Replikačně defektní rekombinantní adenoviry' podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny . jakýmkoliv způsobem odborníkovi známým (Levrero 'et .al., Gene 101 (1991)

195, EP' 185. 5.73; Graham, ΞΜΒ0 J. 3 (198-4)^2917). .Konkrétně v

mohou být připraveny, homologni. rekombinací mezi-· adenóvirem. a plazmidem, který nese, kromě jiného, požadovanou ' sekvenci ,'DNA... K homologni rekombinací dojde., v důsledku kotransfekce uvedeného adenoviru a plazmidu do vhodné buněčné linie. Vhodná buněčná linie, která, se může ' .použít, - výhodně musí i)¹ být transřoimovatelná .uvedenými' :/prvky ’ a , ii)· obsahovat sekvence, které jsou schopny komplementovat , část genomu replikačně defektriího 'adenoviru, výhodně v integrované formě, aby sě zabránilo riziku rekombinace. Příkladem-buněčné linie, která sě může užít, je 'linie lidských embryonálních ledvínných buněk -293' (Graham et al., J. Genů Virol. 36,. 1977, 59) , která obsahuje levou část genomu adenoviru A.d5. (12%) integrovanou do svého 'genomu, a buněčné linie, které jsou schopny komplementovat funkce Sl .a Ξ4, jak byly popsány v přihláškách WO 94/26914 ,' a WO95/02697. . Rekombinantní adenoviry se izolují a-purifikují standardními způsoby, které jsou odborníkovi známy.

Způsoby podávání . . . . ' ' .

Způsob, podle předkládaného vynálezu umožňuje 'přesně se zaměřit na motorické neurony v. každém míšním funkčním úseku míchy. Takže, v závislosti na tom, kde je poškozené místo, které se má léčit, podávání se provádí do. svalu, který má nervové spojení s daným místem. Podle předkládaného vynálezu, je nyní možné, po rozumném výběru různých injekcí, infikovat • · ··* · · »» φ φ « · • ·· · · · ·« ' · #·· ΙΟ • · « · Φ·#,·· · β ·· · . ·* *· ·· ·· specificky a jednostranně velký počet míšních motorických i

neuronů distribuovaných v .různých oblastech.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu podáváni do svalů- horní končetiny '(biceps, triceps) umožňuje přenos genu do motorických neuronů krční oblasti, podávání do svalu hrudníku .(prsní sval) ^: dovoluje ' přenos · genu do motorických neuronů hrudní oblasti nebo podávaní, do .svalů dolní 'končetiny (sval lýtkový) umožňuje přenos genu do motorických¹ neuronů lumbální.a sakrální oblasti. ,

Je možné užít'k podávání’do .těchto motorických neuronů i jiné svaly a také je možné· zaměřit se na jiné 'motorické neurony. Pro' tento účel je možné využit ' přesnou mapu neuromuskulárních spojů k tomu,, abý se určil, v .závislosti -na cílené oblasti míchy, nejvhodnější sval (-y) . ^Takové mapy jsou odborníkům známy (viz zejména -Nicholopoulos et al·., J. Comp. Neurol. 217, 73-35; Peyronnard et Charon, Exp’. 3rain-p.es, 50, 125-132) . V závislosti . na úseku . míchy, který má . být infikován, je možné ' vybrat jeden nebo několik .svalů, ' o kterých je známo, že jsou inervováhy z uvedeného úseku míchy.

'Intramuskulární podávání, lze. provádět různými způsoby. Podle, prvního 'provedení- se podávání provádí injekcí do několika míst 'téhož svalu, aby . se ovlivnil velký počet motorických zakončení. Toto provedení je zvláště účinné, když se jedná o sval, kde není identifikováno místo vstupu nervu do svalu. Pokud je možnémísto vstupu' nervu lokalizovat, pak je výhodné podávání jednou· nebo několika injekcemi přímo do tonotcp místa nebo' do .jeho blízkostí.· Podle 'tohoto provedení vynálezu účinnost přenosu- je ' vyšší,' neboť větší . podíl podaríéhó vektoru je · absorbován v oblasti neuromuskulárních plotének.

• β « · • flfl · · · · · • * · · · · . · ♦ · « • · · · · · ·« « · · · · ··· • · · fl fl··· · fl

Ve, výhodném provedeni předkládaného vynálezu ' se intramuskulární podáváníprovádí injekcemi do několika míst' téhož svalu. V-jiném výhodném provedení -vynálezu se intramuskulární podávání provádí injekcí(injekcemi) v, bodě vstupu nervu nebo v jeho blízkosti.

Výhodný předmětem předkládaného- -vynálezu· je způsob přenosu nukleovýcn kyselin do motorických neuronů, kterýobsahuje muskulárni. podání adenovirového vektoru,- kterýobsahuje uvedenou nukleovou kyselinu vé svém. genomu. Výhodně je způsob předkládaného vynálezu prováděn injekcí(injekdemi) do několika- míst' téhož -svalu, -nebo, pokud ,je m-ožné lokalizovat' místo', vstupu - nervu, -jednou nebo několika injekcemi přímo do oblasti vstupu nervů nebo do jeho blízkosti. ¹

Farmaceutické přípravky '

Pro použití podle předkládaného 'vynálezu j sou ’ nukleové kyseliny, buďto ve formě -vektoru nebo samotné ''nahé' DNA kombinovány s jedním .nebp několika farmaceuticky přijatelnými nosiči pro .injikovatelné přípravky.. To.-· jsou zvláště isotonické,- sterilní, solné roztoky (dihydrogen- ' - nebo hydrogenfosforečnan sodný, chlorid- sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý apod., a směsi těchto solí) nebo suché, zvláště . lyofilizóvané . přípravky,' . které, v závislosti na ]

případu, po přidání sterilní vody-nebo fyziologického roztoku' umožní vytvořit injikovatelný roztok. . - ·

Výhodný injikovatelný přípravek může být' roztok- nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném rozpouštědle nebo ředidle. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů jsou solné roztoky, pufrované solné roztoky, isotonické roztoky (např. dihydrogen-. nebo' hydrogenfosforečnan. sodný, chlorid ♦ « · • ftft • ft · sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý apod., a směsi těchto soli), Ringerúv roztok, dextróza; voda, sterilní voda, glycerol, etanol a jejich kombinace. 1,3-buťandiol a sterilní stálé oleje se obvykle užívají' jako rozpouštědla nebo suspendační média; Jakýkoliv směsný stálý olej sé může použít včetně syntetických .mono- nebo diglyceridů. -Mastné kyseliny jako kyselina ' olejová 'jsou -také' vhodné pro přípravu injekčních přípravků.

Dávka viru, pro ' podávání se upraví v závislosti na jrůzných parametrech, a zvláště v závislosti na uvažovaném místě (svalu) podávání, počtu injekcí,· -genu, který má být exprimován- nebo alternativně na požadované délce léčení. Obecně je . .rekombinantní adenovirus,' podle- předkládaného vynálezu formulován a podáván _:v dávkách mez.i iQ⁴ a' 1Ό¹⁴ pfu a výhodně od 10° do 10^u pfu. 'Hodnota pfu, (plaque forming unit)^! odpovídá infekčnosti, virového' roztoku, a určuje se tak, že se infikuje vhodná buněčná kultura, a' měří se, obecně 'po 15, dnech, počet- plaků infikovaných buněk. Technika -pro určení- titřu virového roztoku 'je v odborné literatuře dobře popsána. ’ '

Ve výhodném provedení vynálezu přípravek .obsahuje adenovirus -obsahující gen , NT-3 '(AdNT-3)· v koncentraci přibližné lxlO⁹pfu/100 μΐ.

Nukleová kyselina' může. být podávána také jako -''nahá. DNA.. Způsoby· formulace- a podávání nahé DNA jsou popsány v patentech US 5,580,859 a US 5,589,- 466, na jejichž obsah se tímto odkazujeme.

• Přípravky podle- předkládaného vynálezu, jsou zvláště vhodné pro podávání do motorických neuronů, jak bylo již výše -popsáno. , ' • · * · • - ·· • 0 • ♦ · » · » · · · · • · «· *· ·« · · · ·

Léčení poškození motorických neuronů

Předkládaný vynález je zvláště vhodný pro léčení úrazů míchy nebo degenerativních onemocnění motorických neuronů. Úrazy míchy.'odpovídají v podstatě řezům v úrovni, motorických neuronů, kdy jsou· odděleny od aferentnícú drah z vyšších center, což způsobuje jejich degeneraci. Přenos genů .podle předkládaného vynálezu kódujících růstové, faktory, .např. do motorických neuronů v nižší úrovni, než je. léze, nyní nabízí možnost prostřednictvím retrográdního transportu omezit nebo dokonce zabránit takové degenerací.'

K neuropatiím motorických neuronů patří . amyotrofická laterální skleróza, spinální amyotrofie typu I (WerdningHoffmanova nemoc),' typu II- nebo typu , III. (Kulgelberg. Welanderopva nemoc), a bulbélní spinální amyotrofie (jako.-'je. např: . Kennedvho nemoc). ' Přenos genů podle předkládaného vynálezu kódujících růstové faktory nebo jiných -molekul, .které projevují neurotrof ický účinek na. motorických neuronech zasažených degenerací, . dále nabízí uplatnění při novém

I způsobu léčení i těchto''nemocí . _;

Účinnost způsobu podle- předkládaného vynálezu je možné demonstrovat na zvířecích .modelech, jako 'jě- např. model částečného nebo úplného přeříznutí míchy (myš Wobler zvířecí model pro výzkum amyotrofické laterální -'sklerózy, Leestma J.E., Ám_; J. Pathol. 100, 821-824), myš- mnd (motor neuron desease, zvířecí model pro.· výzkum amyotrof ické laterální- sklerózy, Messer. et al. ,·' 1992, Genomícs 18, 797802) , myš' pmn (progrésive motor neuron neuropathý, zvířecí model pro výzkum motorické nervové degenerace v průběhuvývoje), SOD*'myš, což je transgenni myš exprimuj ící- mutované formy Cu/Zn. SOD·', zodpovědné za familiární formy amyotrof ické laterální sklerózy, jak je ' ilustrováno v. pří kladech Λ Inkorporacé, tolerance a bezpečnost pro- člověka mohou být · · « · · ♦ · testovány na modelových kulturách' lidských embryonálních míšních neuronů'in vitro.

Příklady provedení vynálezu .

-Předkládaný vynález bude podrobněji popsán pomocí následujících příkladů, které' je třeba .považovat za ilustrativní,, avšak v žádném případě limitující.· V příkladu 1 je demonstrována ' infekce _: .· a retrogřádní transport v motorických neuronech po intramuskulární injekci replikačně defektního, adenoviru obsahujícího markerový gen. Příklad 1 .dále' demonstruje účinek adénovirovýchvektorů na hostitelský imunitní systém' a 'zánětlivou'· odpověď. Příklad- 2 demonstruje účinnost AdNT-3 . na dvou zvířecích modelech amyotrofické laterální sklerózy. Příklad 3 demonstruje expresi markerového genu po, podaní nahé DNA do svalové tkáně.

Příklad 1 , ' , } ·,

Injekce adenoviru s genem pro β-galaktosidázu do lýtkového svalu intaktní krysy nebo krysy, která byla podrobena polovičnímu přetnutí míchy (hemisekci) v hrudní oblasti

Tento příklad popisuje přenos genu β-gal do oblasti lumbálních motorických neuronů podáním adenoviru, obsahujícího uvedený gen, do- lýtkového svalu..

' I . .

Konkrétně byla. studie- provedena na. modelu- krysy- která byla podrobena polovičnímu přetnutí' míchy ' ve spodní, hrudní oblasti,' což mělo za následek paralýzu buďto jedné nebo obou dolních končetin zvířete. Takové· přetnutí odděluje motorické neurony od jejich -aferentních drah přicházejících z.vyšších center a způsobuje jejich degenraci. Podávání se' provádělo • 4 • 4 * 44

2S tak, -.aby se .infikovaly prostřednictvím retrográdního transportu motorické neurony pod úrovní léze.

' Adenovirový vektor použitý v tomto' příkladu je. vektor Ad.RSV.pgal. Tento vektor ' postrádá sekvence nutné pro jeho' replikaci, ale obsahuje sekvence nutné pro penetraci do buněk infikovatelných- tímto vektorem ,a také' všechny ..esenciální /sekvence hutné,, pro- énkapsidaci . adenovirů... Nese také, pod kontrolou promotoru RSV) gen pro.. β-galaktosidázu 'z E. coli. Konstrukce defektního rekombinantního adenovirů .Ad.RSVPgal již byla popsána v odborné literatuře (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin.' Invest. 90, -19,92, 626) . ' Stručně řečeno, adenovirus A.d.RSvPgal'·. je defektní 'rekombinantní adenovirus (ze kterého ,byly odstraněny úseky El a. E3). získaný homologní.· rekombinací ·, in vivo mezi mu-tantou adenovirů.. A,d-dl324 (Thimmappáya et al..,' Cell 31, 1982, -543) a 'plazmidem pAd.RSvpgal „(Akli et 'al., 1993)/ Plazmid pAd.RSVpgal' .obsahuje, ve. směrů 5'-> 3': , ' . ¹

- .fragment Pvul odpovídající levému konci adenovirů AJd5, .který, obsahuje: sekvenci ITR, počátek replikace', enkapsídační signály a enhancer- E1A,' .

- gen kódující .β-galaktosidázu řízený promotorem RSV (z viru- Rousova sarkomu), '

- druhý fragment genomu adenovirů Ad5, ' který umožňuje homologní rekombinací mezi plazmidem pAd.RSVPgal a- adenovirem dl324/ -.· . ' - Po linearizaci enzymem Clal- byly plazmid pAd.RSVpgal ' a' adenovirus dl324. kotrans řeko vány (společně transfekovánv) do buněk linie' 293 v přítomnosti kalciumfosfátu, aby. došlo k homologní rekombinací. Rekombiantní adenovirus takto . připravený byl dále selektován purifikací. plaků. ' Po izolaci byla rekombinantní 'virová DNA, amplifikována v buněčné linii _;293, ' což vedlo ke vzniku supernatantu·' z kultury, který • · · • * • 0 • ··· obsahoval nepurifixovaný rekombinantní defektní adenovirus s titrem kolem 10*° přu/ml. Virové .částice pak byly petrifikovány centrifugací na gradientu ‘ chloridu, česného obecně známým způsobem (viz např. Graham.et al., Virology 52,' 1973, 456) . Adenovirus byl pak žit v purifikováné formě v pufrovaném solném roztoku (PBS);

Do lýtkového svalu byly podány 3 injekce adenoviru Ad-RSV-p-gal (10⁷ pfu na injekci) právě po té,' co zvíře prodělalo částečné přetnutí míchy (dolní , hrudní oblast, následkembylo paralyzování jedné -nebo obou dolních končetin zvířete. Do každého místa vpichu bylo injikováno 9 μΐ adenoviru injekční stříkačkou Hamilton.

Zvířata byla’ usmrcena (perfúzí ‘ 4% paraformaldehyóu) čtyři dny , po inj.ekci, což je minimální čas k.tomu, ' aby se projevil' retrográdní transport ze, svalu do míchy.’ Byly odebrány 3 vzorky míchy z krční, hrudní a lumbální .oblasti a,nařezány na 50pm řezy. Řezy bylý ošetřeny tak, aby se zvýraznila β-galaktosidáza, což. umožnilo vizualizovat buňky, které byly infikovány virem. Některé řezy byly . pak .ošetřeny imunohitochemickými činidly pro CGRP (anti-Calcitohin Gene Relatied Peptid”), což umožnilo specifické zviditelnění motorických neuronů.

β-galaktosidáza· byla zviditelněna -použitím substrátu X-gal, kdy produkt reakce poskytuje modré zbarvení.

Peptid příbuzný kalcitoninovému genu, CGRP, je néúrotransmiter (nervový^:přenašeč) specifický pro motorické neurony. Je detekován ' imunohistochemickým způsobem se sekundární protilátkou spřaženou- s peroxidázou a diaminobenzidinem jako .substrátem, výsledný reakční produkt poskytuje kaštanové -zbarvení.

Detekce β-galaktosidázy umožnila vizualizovat přítomnost infikovaných, motorických neuronů, a to 'Výlučně v lumbální

9 99 9 9 * « · « Φ Φ φ

Φ ·Φ φ Φ Φ ΦΦ «· ΦΦΦ ΦΦΦ Φ ΦΦΦ ΦΦΦ» φ φ oblasti pod úrovní léze v případě krys s hsmisekcí, a na straně odpovídající injekci.

Bylo získáno obarvení (označení) dvojího typu, difúzní obarvení buněčného těla velkého počtu motorických neuronu, a méně intenzívní’ obarvení buněčného těla a„neuritů menšího počtu motorických neuronů. Tento rozdíl v· intenzitě barvení je dán- pravděpodobně skutečností, že pouze několik, neuronů, ležících velmi blízko místu injekce, bylo schopno intenzivně absorbovat virus. ,

Imunohístochemické značení pomocí anti-CGRP spřažené s β-galaktosidázou umožnilo demonstrovat, metodou dvojitého barvení, že prakticky všechna buněčná těla pozitivní na CGRP (tzn.· motorické neurony) byla infikována virem..

Vliv na imunitní/zánětlivou reakci po intramuskulární injekci adenoviru ’ '

Imunita: Z epidemiologických studií vyplývá, že až 60% populace starší 30 let má protilátky'proti adenoviru typu 5 .(Matsuse Immunohistochernical- and in šitu hybridisation detection of 'adenovirus early -region ΙΑ (Ε IA) gene in the microglia of human brain tissue. J..Clin. Pathol., 47275277, 1994). Existence této předchozí . imunity by mohla omezovat - účinnost injekcí rekombianntího· adenoviru. Pro ověření této možnosti byly myši preinjikovánv subkutánně nízkou dávkou defektního Ad-RSVpgal (106 pfu) k preimunizaci zvířat. Tři .týdny po preimunizačni injekci bylo' podáno' intramuskulárně 2,5 x IQ⁹ pfu Ad-RSVpgal. Týden po intramuskulární injekci byla porovnána· exprese β-galaktosidázy ve svalu u naivních a preinjikovaných zvířat. Pokusy byly provedeny, s transgenními zvířaty tolerantními • 000 • 00 k β-gal, aby se zabránilo imunitní odpovědi proti -transgenu. K pokusům byl užity vektory Adl:0 nebo 3.0(dll007). Exprese β-gal ve svalu byla kvantifikována lumínometrickou analýzou. Porovnání enzymatické aktivity, vyjádřená v procentech, pozorované u preinjikovaných-zvířat a kontrolních zvířat, je uvedeno na obr. 5. . '

Závěr: Údaje vedou k závěru, že preinjekce- ovlivňuje pouze mírným způsobem účinnost intramuskulárního ' přenosuadenoviru. Tři týdny po intramuskulární injekci, hladina transgenní exprese u preinjikovaných zvířat byla 90 % hladiny kontrolních zvířat, která nebyla preinjikována.

Zánětlivá reakce: '

Pro srovnání zánětu vyvolaného Adl. 0 a Ad3.0 bvl lýtkový sval myši injhikován 10³ pfu Ad 1.0 Ξ3+ nebo Ad 3.0 (dlÍ014) kódujícími β-galaktosidázu.- Pro injekce se užila transgenní. zvířata tolerantní k β-gal, aby se zabránilo vzniku zánětlivé reakce na transgen. Dva a sedm dní po injekci nebyl u svalů inj ikovaných PS-S žádný zánět. .Naproti tomu každý sval injikovaný Aď jévil proměnlivý počet zánětlivých ložisek, se srovnatelnou intenzitou pro Ad 1'. 0 E3 + a, Ad 3.0 (n=2 v každém pokusu). Exprese β-gal byla detekována ve svalových vláknech a také v endo- a-epimysiu. Počet označených svalových jader 'byl vyšší v případě -Ad 1.0 E3+ než pro Ad 3.0. '

Závěr: Tyto krátkodobé experimenty .neprokázaly- zlepšení ani zánětlivé reakce ani počtu značených buněk po i.m. injekci Ad 3'. 0 ve srovnáni s Ad 1.0 . Je třeba ještě zkoumat, zda by Ad 3.0 nemohl dlouhodobě vés.t k vyšší stabilitě exprese transgenu.

• «44

4 • 44 · · · I « « ·· 444 V 4 4

44«· · · « · • 4 ·* ·4 ·· ·· ·· 'Příklad '2

Příklady aplikace předkládaného vynálézu na zvířecích modelech uznávaných, jako modely amyofrofické laterální sklerózy

Zvířecí modely > . .. , pmn myši: Mutanta s prógesivní motorickou neuropatií (pmn)· ' vznikla spontánně a nemoc se dědí autosomálně recesivním způsobem ((Schmalbruch and Skovgaard-Jensen, Progressive motor neuropathy (pmm), a new neurological mutant in the mouše .· Mousé Genome, 87, 113, 1990). Mutovaný .gen je neznámý, ale ' bvl lokalizován ha chromosomuó.. .Ho.mozygotní myši pmn/pmn trpí degeneraci kaudo-kraniálních-motorických neuronů a .5 až 7 týdnů po narozeni umírají, pravděpodobně v důsledku clenerv.ace dýchacích svalů. Detailní histopatologické Studie frenického nervu ukazuje, že nemoc ' je důsledkem odumírání s degenerací distálního axonu a- relativním 'zachováním proximálních axpnů a buněčných těl . (Schmalbruch et^al., A new mouše mutant with Progressive motor , neuropathy. ’ J, Neuropathol. Exp. Neurol., 50, 192-204, 1991).

Elektromyografická analýza (Kennel ,et al., Neuromuscular function impairment is· not caused by-motor neurone -loss ,in FALS mice: an electromyographical ' study.· Neuroreport, 7, 1427-1431., 1996; Kénnel ef al·.·, Electromyographical and motor performance studies in thepmn mouše _ model· of neurodegenerativ-e disease. Neurobiology of Disease, 3, 137147, 1996) ukázala,' že myši pmn vykazují charakteristické rysy nalézané u AL5 pacientů jako je např. čistý neurogenní· obrazec,' přítomnost fibrilací, snížená rychlost motorického vedení. Naopak jiné rysy ALS pacientů,· jako .je zvětšení φφφ • φ φ · • · · φ • · ·φ φφφφ • φ · φφφ φφ · · φφφ φφφ φφφφ φφφφ φ φφ φφ φφ φφ φφ φφ akčního potenciálu motorické jednotky se u pmn myší

I nepozorují.

SOD* myši: Byly vytvořeny transgenní myši exprimující mutované formy'Cu/Zn· SOD zodpovědné za familiární formy. ALS. Zvířata nadměrně- exprimující lidskou SOD, kde je alanin nahrazen glycinem v poloze 93 (SOD*)., vykazují progresivní degeneraci motorických neuronů vedoucí'·· k paralýze a smrti ve stáří 4 až 5 měsíců (Gurney et al., Motor neuron degeneration in. mice expřessing 'a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science/ 254/ 1772-1775, 1994). První klinické známky spočívají v mírném třesu končetiny, kolem 90 dne věku a pokračují zkrácením délky kroku ve 125 dnech (Chiu et al., 1995). Hísťologické studie, ukázaly, že došlo ke Vzniku vakuol mitochondriálního původu' kolem 37. dne a ke ztrátě motorických neuronů docházelo- od 90. dne. (Chiu et al., Agedependant penetránce of disease 'in. a třansgehic model oř familial amyotrophic lateral sclerosis', Mol. Cell. NeUrosci.,,

6, 349-362, 1995). Kompenzační kolaterální reinervace byla pozorována u nervosválových spojení (Chiu et al·., 1995) .· SOD* myši splňovaly .všechna' · Lambertova elektrofyziologická kritéria, která charakterizují ALS (Kennel et al., 1996). Avšak špatný terapeutický účinek .riluzolu na SOD* myši by mohl nasvědčovat, že představují nej těžší' formu- nemoci.

Konstrukt AdNT-3.

' Myší gen NT-3 byl izolován jako. PCR fragment velikosti 1045 bp. obsahující 'úplnou pre^prósekvenci NTt3 a.prostřednictvím míst EcoRV byl klonován .do kyvadlového plazmidu obsahujícího invertované terminální repetice (ITR) adenovirového genomu, enkapsidační sekvence a adenovirové sekvence nezbytné pro následnou homologní rekombinaci.

• · ·· • ·» »·«« · · β « t 9 ·♦ ·· *· ·· V« ·

3-í

Transkripce NT-3 j-e řízena LTR promotorem viru Rousova sarkomu (RSV) a ukončována polyA signálem přítomnými v NT-3 genu a adenovirovém genu pIX přilehlém k 3'konci. Replikačně defektní adenovirový vektor AdNT-3 je deietován v úsecích El a ' E3 a ' byl. získán in vivo homologní rekombinací' linearizovaného plazmidu pAdNT-3 s gencmem AdRSVpgal·· naštěpeným Clal '{(Štratford-Perricaudet· et al., Widespreadlong term gene transfer to'mouše skeletal muscles and heart, J. Clin. Invest. 90, 626-S30, 1992).

Příklad 2A ‘ v

' ’ I

Podávání adenoviru kódujícího NT-3 do svalu pmn myší.

. pmn myši byly injikovány , aděnovirovým vektorem, který kódoval myší NT-3 řízený promotorem RSV, - jak bylo již výše popsáno, ve stáří 3 až 5 dnů. Dávka viru, (IQ⁵ .přu ve 100. μΐ na. zvíře) byla jednostranně injikována do 3 svalových skupin, lýtkového svalu, trojhlavého sválu a dlouhých svalů prsních.

Exprese transsgenu po ' injekci byla nejdříve testována pomocí adenovirového' vektoru {A.dluc) kódujícího ¹ gen luciferázv světlušek. 25. Hen bylo zjištěno více. než 99· % luciferázové aktivity v .injikovaných svalových skupinách, a pouze okrajová aktivita byla detekována v játrech (0.4%), srdci (0,1%)·, plicích' . (0,1%) , a žádná aktivita nebyla zjištěna v bránici ani ve slezině.

Po podáni vektoru Ad-NT3 byly transkripty adenovirovu NT-3 detekovány v .'inj i kovaném lýtkovém svalu od 15.. db 35. dne, což demonstruje expresi po době .delši než 4 týdny po přenosu genu NT-3. Žádné transkripty adenovirovu NT-3 nebyly detekovány v jiných- tkáních s výjimkou míchy.

25. den ..vykazoval injikovány, 'lýtkový sval vice než lOOnásobné zvýšení imunoreaktivity. NT-3 (300 ng/g čerstvé

0 »0 ·

0 0 »0

0 0 0 • 4 ·· i » 0 «00 * ♦ 1 * · > I • 0 ♦· ·*· hmotnosti u Ad-NT-3 neinjikovaných zvířat!

ínjikovaného sval.u vs. 2,4 ng/g u

Současně byla imunoreaktivita. NT-3 detekována v séru pmn myší ošetřených AdNT-3 a přesahovala asi o 11 ng/ml základní hladinu u neinjikovaných zvířat.

Podávání Ad-ŇT3zlepšilo délku’ života pmn myší , .Všechny neošětřované' pmn myši. uhynuly před 57. dnem, ·> . ' . ¹ průměrná délka přežití byla 40,4 ± 2,4 dnů (Ν=14) (viz obr. 4) . .'Kontrolní vektor .Ad-LacZ, podávaný intramus kulami injekcí, nijak nezlepšil přežívání pmn myší (40,0 ± 2,5 dnů, N=12) . Naproti' tomu' pmn myši, kterým .se podával A.dNT.3 přežívaly .až do 89. dně'. Jejich délka života '.se významně, ) · prodloužila na,-61,3 ±2,5 dne. (n=16, p < 0,00'l·),' což znamená 50% prodloužení délky života. Některé pmn -myši, kterým se podávala- pětkrát' vyšší- dávka, adenoviru (5 x 10^s p-řu) ' už nejevily další prodlužování délky života (49/57/61 dnů, průměr¹ 567, dnů) . · '

Ad-NT3 'zlepšuje neuromuskulární funkce

Aby se podrobně chrakterizoval postup nemoci ú pmn myší léčených Ad-NT3 byla- provedena elektromyografická (EMG) ' studie, kde., se užívaly tři parametry EMG:.- i) spontánní deneřvační ' aktivita . .(fibrilace) v.lýtkovém svalu, ii) amplituda- evokované odpovědi (složený svalový akční potenciál, CMAP) a iii) spontánní elektrická aktivita bránice

i) Fibrilace -označují počátek' ‘funkčního, denervačního .' procesu, objevují se před 17, dnem jak u myší léčených Ád-NT3· tak i u neléčeňých. ' ii) Amplituda CMAP lýtkového svalu se .zvětšuje s věkem a u normálních myší dosahuje ustálené hodnoty.80 až 90 mV ve stáří' 45 . dnů. U neléčených myší je dosaženo maxima-. 20 až· 30 mV odpovídající 40’ % normálu kolem, 20. dne bez dalšího

I » · · » > · · » ·· ·· ··· ··· • · ·· ·· · · > · · · ·· *· zvyšovaní denervace amplitudy (obr. 5) pravěpodobně- v důsledku probíhající

Podávání ?.d-N?3 indukovalo významnou obnovu ČILA?

ve třech týdnech představovala 70% normálních myší. Amplitudy .CMAP se nelišily u pmn myší. mezi pravo.u a levou končetinou v případě jednostranně injikované myši.

iii) Protože denervace ’ bránice pravděpodobně ' určuje průběh nemoci u pmn myší, byl, zkoumán účinek léčení A.d-NT3 na elektrickou aktivitu svalů 35. den. Vdechová ráze , byla charakterizována výronem, aktivity, zatímco výdechová fáze ' byla charakteristická elektrickým' klidem. -Počet pozitivníchnegat-ivních výchylek '(obratů) v obrazci . impulsů v průběhu výronu je měřítkem počtu vybití motorických jednotek. 'Počet obratů na ječen vdechový' výron byl: redukován o 65 % u neléčených pmn .myší' ve srovnání se zdravými vrstevníky- (n=4 v každé skupině), maximální amplituda' výronů byla stejná v obou. skupinách. , U pmn myší léčených Ad-NT3 nebyl počet obratů na výron významně změněn, ale maximální amplituda se významně zvýšila ve srovnání s neléčenými pmn myšmi (viz tabulka 1) . ''

Tabulka 1

	Kontrola (n=4) '	Neléčené pmn (n=4)	pmn léčené NT3 (n=4)
Průměrná délka trvání vdechového výronu (ms)	138,8 ± 4,4	77,2 ± 7,7 . ’(P < 0,003)a	99,1 ± 14,1 (P < 0,037jb (P < 0,22)
Průměrný počet obratů na jeden výron	119,4 ±6,0	40,7 ± 8,5 (P < 0,001)3	4 6,9 ± 5,5 . (P < 0, 001) (P ,< 0,57} =
Průměrná hodnota ' maximální , amplitudy (pV)	626' +. 95	695 ± 78 (P < 0,61)3	1062 ± 70 (P < 0,011)b (P < 0,018)=

• 14 • 4

K tab. 1: ³: kontrola vs. neléčené pmn ^s: kontrola vs. NT3-léčené pmn neléčené pmn vs. NT3-pmn

Hodnoty byly. 62 6 ± 95 mV pro zdravé a 695 ± .78 mV pro neléčené pmn myši, zatímco pro pmn myš.i léčené Ad.-NT3 byly 1062.+ 70 mV. Zvýšení vrcholové amplitudy při děchovém výronu vede k 'domněnce, že 'Ad-NT3 způsobuje zvětšení velikosti motorické jednotky u pmn myší, což je dokladem indukce periferního nebo kola.terálního růstu konců motorických axónů. Závěry. elektromyografické analýzy byly potvrzeny histologickou analýzou inervace neuromuskulárnich plotének u léčených a kontrolních myší.

Ad-NT3 chrání před degenerací axonů

Prodloužená délka života a zlepšené neuromuskulérní funkce myší pmn léčených NT3 se odrazily ve zvýšeném počtu vláken frenického' nervu, který inervuje bránici. Světelná mikrokopie 25. dne ukázala, ,že počet axonů u^J neléčených pmn myší a myší léčených AdlaZ se snížil na 122 ± 13 (n=6) a 120 ± 11 (n=8j ve srovnání' s hodnotou 263 ± 8 (n-4) pro normální zdravé myši. 'Počet myelinizovaných vláken, frenického nervu pmn myší, ktereým byl injikován AdNT3, byl významně vyšší (164 ± 15,n=8, P<0,05), což odpovídá 30% 'snižerií ztrát myelinizovaných vláken. 35. den, kdy již několik neléčených pmn myší uhynulo, pmn .myši léčené Ad-NT3 měly ,stále více myelinizovaných vláken (130 ± 7, n=8)' než neléčené myši (118 ± 4, n=10) nebo pmn myši' injikované AdlacZ (115· ± 4,n=8), i když. tyto rozdíly byly méně výrazně než o deset, dní dříve.

• * • ··» a a a · a ··

Zesilující účinky současného léčení AdNT-3 a-AdCNTF

Účinek NT-3 je zesílen působením CNTF, molekulou známou svým neuroprotektivním účinkem na pmri modelu (Sendtner et al·., Nátuře 373, 344-346 (1995); Sagot et al., Eur J. Neuros.ci. 7, 1313-1322 (1995). Mvším byla oddávána' kombinace AdNT-3 a -AdCNTE, což je adenovirový· vektor kódující biologicky aktivní a secernovatelnou ' formu. CNTF. Průměrné přežívání takto léčených pmn myší (66 ±7,6 dnů,· n=ll) bylo vyšší než pro každé ošetření samostatně (AdNT-3: 61,6 ±2,5, n=16, AdCNTF: 52,9 ± 4,4, n=13j , ačkoliv tyto rozdíly byly pod hladinou statistické'významnosti. Avšak všechny myši pmn, které přežily déle' než 3 měsíce _;(maximum 105 dnů) patřily do skupiny AdNT-3+AdCNTF.

Ve stáří 25 dnů zvířata, kterým se podávaly současně AdNT-3 a AdCNTF, měla 192 ± 11 vláken frenického nervu (n=8), zatímco zvířata . léčená samotným AdNT-3 měla 164' ±’ 1.5 a zvířata léčená samotným AdCNTF měla 167 ± 21 (n=4) 'vláken.

35. den počet vláken ve skupině AdNT-3+AdCNTF poklesl na 157 ± 10 (n=10), což bylo významně' více než u skupiny AdNT-3 (130 ± 7-, p<0., 05)' a nebo ' kontrolní skupině (neiéčené: 11S ± 4, ri=10, injekce AdlacZ: 115 ± 4, n=8, p<0,01).'. Tedy 25. a 35. den byla ztráta myelinizovaných vláken o 3,0% menší •á o 20% menší u zvířat, která dostávala AdCNTF navíc k AdNT3, ve srovnání se zvířaty, .která dostávala samotný AdN.T-3.

Podávání AdNT-3 a AdCNTF indukuje reinervaci· svalu

Elektorfyziologické nálezy vedly k domněnce, že dochází k reinervaci u myší pmn léčených AdNT-3. Byl proto vyšetřován obrazec terminální inervace v povrchových hýžďových svalech pomocí metody užívající acetylcholinesterázu-stříbro (Namba et al., Am. J. Clin. Pathol. 47, 773-783, 1967; Gurneý et ál., J. Neurosci: 12,· 3241-3247, 1992). U normálních myší • ··· φ Φβ • φ ječen terminální axon je obvykle napojen na jednu ploténku a pouze několik axonů se větví v jejich poslední- Ranvierově uzlině a zásobují tak dvě pioténky. U neléčených pmn myší byl· velmi redukován počet -axonů intramuskulárních nervových větví, z nervů ’ vycházelo po.uze několik svazků terminálních axonů a na mnohých ploténkách chyběly axony vůbec. Pioténky ¹ stále ještě spojené kaxonůměly stejný 'j.eden-ku-jedné vzorec inervace jako normální myši: jak terminální axqn tak jeho terminální větve obsahovaly slepá rozšíření a terminální větvení bylo řídké. Argentof í lni. granule označovaly průběh degenerace axonů' a byly také v nervových větvích. Na některých místech se objevily jemné.· výběžky ž konců rozpadlých axonů a také z Ranvierových . uzlin, ale tyto' výběžky, byly tenké (pravděpodobně nebyly myelinizované) a obvykle nedosahovaly až. k ploténce. -Sensorická inervace svalových vřetének zůstala zachována. 'U jedné ze tří pmn myší léčených. A.dNT-3 byl vzorec takový, že svazky terminálních axonů vycházející z větví byly více nápadné v následujících Ranvierových uzlinách' a každý vedl k několika ploténkám. Po léčení A.ďNT-3+AdCNTF, kdy byla provedena analýza 4 myší, plóténková. oblast svalu_x byla vyplněna překříženými. axony, které vedly k ploténkám hroznovitě uspořádaným. U těchto -. myší skutečně chyběly pioténky, které bv' neměly axony. Axony . přibli.žúj ící se k ploténkám byly krátké a většinou vycházely' z Ranvierových uzlin, ale také často z jiných piotének (terminální výběžky). Nebylo neobvyklé, pozorovat terminální 'výběžek vedoucí k ploténce, která zase měla terminální. výběžek vedoucí k druhé p-ioténce. . '

l.

Závěry studie s .pmn myšmi

Intramuskulární injekce AdNT-3 vede u pmn myši, k 50% prodloužení délky života. Byly určeny . fyziologické •mechanismy, které jsou pravděpodobně zodpovědné za účinek NT-3 na délku života: ochrana axonů před degenerací a stimulace ko.laterálního růstu na úrovni terminálních zakončení. ' l '

Účinek kombinovaného působení AdNT-3+AdCNTF na přežívání

I . ' '1 axonů a maximální délku života pmn myší byl'výraznější než.u samotného AdNT-3 nebo AdCNTF. To vede k domněnce, že u pmn myší tyto dva faktory zřejmě působí na odlišné subpópulace motorických neuronů, nebo jsou důležité v různých stadiích degenerace motorických neuronů, nebo dokonce ovlivňují různým způsobem jiné než nervové buňky,, např. svalové buňky' .(Helgren et al., Cell 76, 493-504, 1994) nebo Schwannóvv buňky. Tato zjištění posilují terapeutický,potenciál současného podávání neurotrofických .faktorů, které patří do různých rodin.

r¹

Tyto výsledky jsou první ukázkou 'důsledku 'genového !

přenosu in vivo na délku života \u· zvířecího modelu ' nemoci. Kromě toho tato studie představuje silnou podporu pro' použití genové 'terapie zprostředkované aděnoviry v případě nemocí motorických neuronů. . Skutečně systémovými injekcemi rekombinantního' proteinu NT-3 nelze dosáhnout srovnatelných výsledků. Podávání NT-3 zprostředkované adenovirem modifikuje profil biologické dostupnosti NT-3 Ve. srovnání se' systémovým podáváním , proteinu. Protein je ' vytvářen. ' jak na postsynaptickém konci neuromus.kulárního spojení tak i v těle nervové buňky a je'nepřetržitě uvolňován do oběhu.

• · ·· fl flfl

Příklad 2S

Podávání adenoviru kódujícího neurótrófický faktor do svalu myší SOD*

Pokusná zvířata: zvířata pro pokusy byla dodána firmou Transgenic Alliance.” SOD* myši představují zvířata s velkou variabilitou v délce života, což může být až 50 dnů. rozdíl v délce života myší, .kterým se' dostalo stejného zacházení ve stejnou dobu. Z tohoto’ důvodu . je pro dosažení statisticky významných.výsledků potřeba velkého počtu zvířat.

Obecné, metody ,

Zvířatům byly injikovány různé 'adenovirové .konstrukty (.AdNT-3, A.dCNTF, AdBDNF, AdGDNF, Αά-β-gal) v různém stáří. Evokovaná motorická odpověď lýtkového svalu.po¹ supramaximální stimulací ischiadického nervu . byla zaznamenávána pro každé zvíře každých . 10 dnů. Bylo také provedeno srovnání s ríluzo.lém. ...

Účinek intramuskulární injekce AdNT-3 .

Novorozeným a dospělým zvířatům byly aplikovány intramuskulární injekce adenovirového vektoru ..kóduj ícího myší NT-3 pod kontrolou promotoru RSV. Zvířata byla injikována buďto ve stáří.4 až 5 týdnů, těsně před projevením prvního .nedostatku na elektromyografu, nebo ve 13 týdnech, .kdy se objevily první klinické symptomy. '. .

Data ukazují, že intramuskulární injekce AdNT-3 myším SODt vedla ke zvýšení délky života o 9 až 14' dnů ve srovnání s neinjikovanou kontrolou.. Tyto pozorované rozdíly jsou statisticky významné. Zajímavé je, že k prodloužení délky života dochází, když jsou zvířata injikována ve 1,3. týdnu, tj. v době, kdy.se objevují první příznaky.

• * · · ft ftft

Tabulka 2

	Injekce Ve věku	Ad-NT 3	Ad β-gal	néinj ikována
	novorozenci	163,9 ± 5,34 (n=12) P2 0,049 vs, neinjik. P2 0,003 vs. Ad β-gal	145,17 ± 2,'45 . (n=10);
	4 až 5	161,26 i 2,86 (n=15)	152,16 ± 3,32	152,04± 3,02
	týdnů ‘	P2 0', 045 vs. neinj ik. P2 0,043 vs. Ad β-gal	(n=Í8)	(n=24)
-	13 týdnů	166,·9 ±4,17 (n=10) P2 0, 009 vs. neinjik.	ND ' .

N.D- nestanoveno

V jiném pokusů byl injikován adenovirus kódující' β-gal nebo NŤ-3 do 3 až 4 týdny starých mysl FALSgssa/· což je kmen transgennícjh myší exprimujících mutovanou formu lidské' SOD (93Gíy -» Ala)a projevujících progresivní degeneraci motorických neuronů, která vede k paralýze končetin a smrti během 4 až 6 měsíců (Gurney et al., 1994) .

Celkem bylo injikováno 5 x 10^s ,až 10³ pfu na 1 zvíře, a sice dávkováno po čtvrtinách do -každého lýtkového Svalu a bicepsu. Byla .stanovena letálnosť·. Neošetřovaná zvířata žila 1.42,4 ± 4, 5 dnů, což se statisticky nelišilo od'zvířat, kterým se injikovai Ad β-gal (147,8 ± 3,0). Avšak zvířata, kterým se injikovai Ad-NT3 žila 162,86 ± 5,75 dnů-. 6 ze 7 zvířat léčených A.dNT-3 žilo dokonce déle než' nejstarší z neléčených zvířat. 5 zvířat -z téže skupiny žilo déle než nejstarší ze zvířat, kterým, se· podával'Adp-gal. Tyto výsledky

000« 0 000 0 00 0 000 000 00 ·0 00· 000 0000 00·· · · 00 00 00 00 00 '0 0 ukazují, že injekce adenoviru exprimuj ící h'o neurotrof-in mohou zpomalit progresi nemocí u zvířecího modelu ALS·

Evokovaná motorická'odpověď lýtkového' svalu po stimulaci ischiadického nervu byla vyšetřována v různém stáří, .'u tohoto pařamteru byla pozorována velmi .vysoká variabilita.· Pravidelné snížení bylo pozorováno v průběhu'nemoci u každého zvířete (Kennel, et al., 1996), ale rychlost a rozsah tohoto sníženi, nebylo možné korelovat s.délkou života. Podávání AdNT3 nevedlo k žádné významné změně tohoto parametru.

Žádný významný účinek na délku života u SOD* myší nebyl pozorován, když - se, . podávaly intramuskulámě jiné rekombinantní · viry, zejména: Ad-G.DNF, Ad-CNTF, Ad-BDNF injikovaný při narození, Ad-GDNe injikovaný v .5 nebo 13 týdnech, kombinace Ad-GDNF-ί-Ad-BDNF nebo . Ad-GDN Fa Ad-CNTF injikované při narození nebo Ad-GDNF+Ad-CNTF injikované v 5 týdnech. . .

Účinek Riluzolu

Riluzol je^- lékem pro ALS, který je schválen FDA. .Bylo' prokázáno, že zpomaluje medián času do uhynutí u modelu ALS transgenních myší. Tyto myši exprimuji lidskou Superoxiddismutázu nesoucí jednu z mutací nalezených u familiární formy lidské ALS. Riluzol patří do třídy benzothiazolů.· Chemicky se jedná 'o . 2-amino-6-(trifluormetóxy)-benzothiazol.

Účinek Riluzolu na myši SOD* byl testován třemi různými způsoby. ' . ·.

Perorální podávání dávek 4 a 8 mg/den/kg myším SOD* od 5. týdne věku neovlivnilo nijak délku života.

Riluzol byl SOD* myším přidáván do vody k piti v koncentraci 100 pg/ml, což jsou podmínky, které způsobovaly 13 „denníprodloužení života u lidí dle publikace Gurney et ' * · ·· • · I al. (Pathogenic mech.anisms in familial amyotrophoc lateral sclerosis dus to mutation of Cu,Zn superoxide dismutase.

I

Path. Biol. 44, 51-56, 1996) .'. To odpovídá- .přibližně dávce 20 až 25 mg/kg/den, při které nebyl pozorován žádný účinek na délku života u SOD* myší (léčená zvířata 151,8 ± 6,26,,n=ll).

Závěr: Riluzol v koncentraci od 2,5 do 16ti násobku dávky koncentrace , účinné v klinických . testech u člověka (lOOmg/pacien.t/den, t j . asi 1,5 mg/kg/den) nemel u SOD* myší žádný účinek na - délku života. Z toho vyplývá, že myši SOD* představují zřejmě .velmi silnou formu lidské ALS. Tento závěr je podporován i skutečností, že myši SOD*' jsou modelem familiární formy ALS, které má rannější nástup a horší prognózu než sporadické formy ((Rowland, Amyotrophic lateral sclerosis: Kuman .challenge, for neurosčience. P.roc. Nati. Acad., Sci- USA, 92, 1251-1253, 1995; .-Gurneý et al.,' 1996)'.'

Údaje ukazují, že Ad-NT3 injikovaný intramuskulárně SOD* myším vede k prodloužení délky života o 9 až 14 dní ve srovnání s kontrolou, přičemž toto zvýšení bylo statisticky významné. Je třeba přitom upozornit na, tři zajímaví rysy:

a) Prodloužení délky života bylo . pozorováno,· pokud se .injikovala dospělá myš již vykazující první klinické příznaky nemoci.

b) Žádný léčebný .účinek ani . prodloužení života nebylo' .’ pozorováno, když se -SOD* myším'· injikoval protein NT-3.

Tudíž, stejně jako u ' pmn myší, výsledek ukazuje -výhodu přenosu.-terapeutického proteinu prostřednictvím¹ přenosu genu.

c) V našich pokusech nebylo pozorováno' žádné prodloužení .života u SOD* myší po podávání Riluzolu. To vede k závěru, že jakéhokoliv jiné léčení, které prodlužuje život SOD* myším, pravděpodobně bude mít i u. lidí lepší účinek než

Riluzol. ' • ♦ 0 0* 0.000 0 · ♦ 0 • ♦ · 0·· 00 0 · 000 000 0-0 0 0 0 0 00 0 0 00 *0 00 00 00 00

Terapeutického účinku bylo také 'dosaženo intrathekálním podáváním (viz dokument W094/08026) nebo s viry exprimujícími jiné trofické faktory.· - .

Příklad 3 .Intramuskulární podávání nahé DNA

Údaje z testů na pmn a SOD* myších ukazují, že intramuskulární injekce rekombinantního adenoviru exprimujícího trofický faktor může vést k léčebnému účinku ů téchto zvířat. Pozorované účinky mohou být ' důsledkem retrográdní infekce motorických neuronů a exprese trofických faktorů v míše. Alternativně, trofické . .faktory mohou projevovat svou aktivitu po té, · co byly uvolněny do oběhu z infikovaných svalů. V takovém případě by jakákoliv účinná metoda pro přenos neurotrofického genu do svalu .vedla k prospěšným účinkům podobným tem, které byly pozorovány při adenovirové infekci... ’

Přenos genů do kosterní svaloviny lze uskutečnit .také přímou injekcí'- nahé DNA- ((Wolfi .et al., Direct gene transfer into mouše muscle in vivo. Science, 247, 1465-1463,.· 1990). Dosud bylo publikováno několik příkladů intramuskulárního přenosu genů, které kódují -secernovatelné proteiny, kdy úroveň exprese transgenu byla, dostatečná pro dosažení fyziologického účinku. Byla provedena studie možného terapeutického potenciálu přenosu nahé DNA v případě nemocí motorických neuronů. '

Srovnání hladiny'exprese transgenu po injekci Ad a nahé DNA Rekombinantní adenovirus kódující .luciferázu (AdCMVLuc) •nebo plazmid exprimující stejný transgen (pCMVLuc) pod kontrolou promotoru ,CMV byly injikovány do lýtkového svalu * φ • · fl4« ♦ Φ φ * • Φ Φ Φ«Φ * · · « φφφ ΦΦ· • · Φ · ΦΦφφ φ »

ΦΦΦΦ φφ «Φ φφφφ /6, myší. Po injekci. 10⁹.pfu AdCMVLuc byio detekováno ve svalu 100 až 300 pg luciferázy. Tato hodnota byla srovnatelná s hodnotou získanou po .'injekci pCMVLuc {obr. 7, panel a) . Avšak variabilita v rámci skupiny byla mnohem vyšší při použití nahé DNA^- ve srovnání s adenovirovým . vektorem. Skutečně rozdíl až v hodnotě 2^j až 3 -log V expresi transgenu byl typicky pozorován při použití nahé ONA, zatímco , při použití viru byly odchylky-uvnitř skupiny v- rozsahu 1’ log.

Analýza . parametrů potenciálně ovlivňujících účinnost přenosu/exprese genu.

Promotor RSV/CMV: Promotory RSV a CMV poskytují srovnatelnou.expresi transgenu, pokud se užily ú novorozených myší. Když šlo o injekce dospělým myším, 72 hodin po injekci promotor, RSV vedl k hladině exprese luciferázy, která byla více než lOx nižší než s CMV promotorem. Avšak po 30 dnech po injekci byly, ú obou konstruktů', pozorovány 'podobné hladiny (obr. 7,panely c a d).

Stáří v době injekce: Injekce dospělým nebo novorozeným zvířatům vedla ke srovnatelným hladinám exprese transgenu, když bylea zvířata usmrcena 30 dní' po injekci. Naproti tomu, pokud byla zvířata usmrcena po .72 hodinách, hladina exprese luciferázy řízené RSV byla více než lOx vyšší ú.novorozených než .u dospělých, zatímco u promotoru CMV byla- pozorována opačná tendence (Obr.' 7) .

Vliv ' šarže přípravku: Až desetinásobný rozdíl v expresi luciferázy· byl pozorovatelný , mezi dvěma různými šaržemi téhož. plazmidů, připraveného pomocí standardních komerčních' souprav (obr. ,7). Naproti tomu, hladina transgenní exprese byla konstantní, když se použily různé, šarže připravené naší produkční’ skupinou. To podtrhuje nutnost kontrolovat podmínky přípravy plazmidů.' .

ft · ft ftftft • ftftftft ft ftft* · ft · ft ««ftft ftftftft ft ·

Injikovaný sval, pohlaví, způsob injekce: .Žádné podstatné rozdíly nebyly pozorovány v závislosti na indikovaném svalu (triceps nebo lýtkový sval), pohlaví nebo způsobu podání injekce (transkutánní nebo chirurgický).

Závěr z pokusu s nahou DNA: Výsledky ukázaly, že intramuskulární injekce nahé DNA vedla k,hladině fransgenní ή

exprese srovnatelné s hladinou pozorovanou - po intramuskulární injekci adenoviru. Avšak variabilita' mezi zvířaty je mnohem vyšší s .nahou DNA než v případě adenoviru. Údaje také podtrhují nutnost kontrolovat přípravu plazmidů, které se' injikují. . .

f '

Všechny¹ publikace, použité k diskusi, 'jsou plně zahrnuty v odkazech. .

Odborník okamžitě ocení,. že 'předkládaný· Vynález je upraven tak, že je možné ho provádět'a dosáhnout požadovaných výhodných· účinků. Peptidy, polynukleotidy a způsobypopsané v předkládaném vynálezu představují výhodná provedení vynálezu a jsou uvedeny jen jako ilustrativní příklady, 'aniž by jakkoliv omezovaly předmět vynálezu. Odborníkovi jsou zřejmé změny, které spadají do předmětu vynálezu, který je definován následujícími nároky.

?V Mlf-ty} • 444 • 44 • 44 4 4 4 · · 4 »4 44 44 44 4« 4 4

Claims (3)

PATENTOVÉ N A R OK Y

¹ /

13. Použití podle'nároku 12, kdy nukleová kyselina je vložena . do genomu adenoviru v úseku El, E3- nebo, E4.

14 . Použití DNA. podle nároku-1, kdy, nukleová . kyselina je nahá 15. Použití podle nároku 1, kdy nukleová. • kyselina kóduje . neuroakt. ivní látku. 16. Použití podle nároku 15, kdy nukleová kyselina kóduj e růstový faktor, neurotrofický faktor, cytokin, nervový přéhašeč , enzym nebo receptor'. /

17. Použití podle nároku 15, kdy nukleová kyselina obsahuje 1 · signály umožňující expresi neuroaktivní látky v motorických neuronech. '

18. Použití podle nároku 1, kdy-nukleové kyseliny se podávají do svalů horních končetin.

• φ φ · * φ • φφ* φφφφ φ

Φφφ* φ φφφφ Φφφφ ’ φ ” · ·· ·· φφ φφ φφ φφ

19. Použití podle nároku 13, kdy svaly jsou biceps a/nebo triceps.

20. Použiti podle nároku 1, kdy nukleová kyseliny se podávajído svalů hrudníku.

, v

1. Použití' jedné nebo více nukleových kyselin pro přípravu přípravku vhodného k réiňervacř svalů a k indukci růstu % zakončení motorických áxonů.

2,1; Použití podle nároku 20,. kdy svaly jsou prsní svaly.

22. Použití podle nároku 1, kdy nukleová kyseliny se podávají do svalů dolních končetin.

.' λ

23. Použití podle nároku 22, kdy svaly jsou lýtkové svaly.

24. Foužití podle nároku 1, kdy podávání obsahuje injekce do několika míst téhož svalů. ,

25. Použiti podle nároku· 1, které obsahuje podávání nukleová kyseliny do svalové tkáně v blízkosti, nervové dráhy spojené ' s vybraným funkčním úsekem. míchy, přičemž, nukleová kyselina je předána.do motorických neuronů.

26. Použití jedné nebo více nukleových kyselin pro přípravu přípravku vhodného pro -tvorbu proteinu . v savčích motorických neuronech, přičemž toto použití obsahuje podávání jedné nebo více nukleových' kyselin kódujících uvedený protein do svalové · tkáně, přičemž nukleová kyselina je předána do motorických neuronů a exprimovana.

27. Použití podle ' nároku 26, .kdy protein se tvoří na' postsynaptickém zakončeni neuromuskulárního spojení.

• 4 ·

4 4 · • 444 • 4 » 44 • · ♦ ♦ · 4 _V *

44 44 44 44

44 44

28. Použití podle nároku 26, kdy motorické neurony jsou aferentní motorické neurony a nukleové --kyselina je exprimována v míše.

29. Použití podle, kteréhokoliv z nároků 1' a 26, :kdy jedna nebo více nukleových kyselin kódují.neurotrofin-3 a 'CNTF.

30. Použití jedné nebo více nukleových kyselin pro přípravu \ . ^v přípravku vhodného k léčení poškození nervové soustavy, přičemž toto použití obsahuje podávání, a to do svalové tkáně savce trpícího tímto poškozením, nukleových- kyselin f

kódujících neurotrofin-3 a nukleových kyselin, kódujících CN.TF. .- . ' '31. Použití' podle nároku 30, kdy nukleové kyseliny jsou nahé DNA kódující, neurotrofin-3 a nahé DNA kódující CNTF..

2. Použití' podle nároku '1, kdy nukleové kyseliny kódují protein.

3.· Použití podle nároku· 1 k léčení poškození..' nervového systému. . ·.'

4. Použití podle nároků 3, kdy .poškození je nervové / · poškození.

5,. ' 'Použití , podle nároku í

neurodegenerativní nemoc.

3, kdy ' poškození

6. ·· Použití podle nároku 5, kdy .nemoc je amyotrořická laterální skleróza nebo dětská .spihální muskulární atrofie.

7. Použití podle nároku 1-, kdy nukleová kyselina' je vložena do vektoru. ' , '

8. Použiti podle nároku 7, kdy vektor je vybrán 2e skupiny obsahující adenovirus, retrovirus, herepetický virus a adeno-asocióvaný virus.

9. Použití podle nároku 8, kdy vektor je replikačně.defektní virus.'

49 **·· ···· · · 1 * · · ·· · «00 0 01 ···· ··*· · 00 0« 00 00 00 10. Použití, po.dle původu'. nároku 9, kdy virus je virus lidského .11. Použití podle původu. f nároku 9, kdy . virus ' je virus zvířecího 12·. Použití podle nároku 9, kdy virus je aděnovirus , kterému

chybí celý nebo část úseku El a celý nebo' část úseku E3 a/nebo úsek E4 adenovirového' genomu.

3,2. Použití podle nároku 30, kdy nukleové kyseliny jsou ..vloženy do replikačně defektního adenoviru, který obsahuje- gen kódující neurotrofin-3- a replikačně defektního adenoviru, který obsahuje gen kódující CNTF.