CZ286015B6 - Rekombinantní řetězec DNA, rekombinantní hostitelská buňka, rekombinantní mikroorganismus, čištěná bílkovina s účinností neurotrofinu-3, způsob její výroby, protilátka a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Řešení spočívá v rekombinantním řetězci DNA, kódujícím bílkovinu s aktivitou neurotrofinu-3 a obsahující sekvenci nukleotidů 530 až 886 lidského neurotrofinu-3. Součást řešení tvoří také rekombinantní hostitelská buňka, s výhodou mikroorganismus, obsahující uvedený kódový řetězec, čištěná bílkovina s účinností neurotrofinu-3, obsahující sekvenci aminokyselin 1 až 119 zralého lidského neurotrofinu-3, způsob její výroby, farmaceutický prostředek s obsahem neurotrofinu-3 a protilátka, rozpoznávající neurotrofin-3.ŕ

Description

Rekombinantní řetězec DNA, rekombinantní hostitelská buňka, rekombinantní mikroorganismus, čištěná bílkovina s účinností neurotrofinu-3, způsob její výroby, protilátka a farmaceutický prostředek

Oblast techniky (1)

Vynález se týká neurotrofinu-3 (NT-3), nového neurotrofního faktoru, který náleží do skupiny genů BDNF/NGF. Gen, který je kódem pro NT-3 byl klonován a byl stanoven jeho řetězec a bylo také dosaženo exprese rekombinantního genu pro NT-3 v buňkách savců. Rekombinantní NT-3 má spektrum účinnosti, které je odlišné od spektra BDNF a NGF. Vynález poskytuje řetězce nukleových kyselin, které jsou kódem pro NT-3, dále v podstatě čistý NT-3, fragmenty a deriváty této látky a protilátky proti bílkovině NT-3 nebo peptidům, které tvoří její části. Uvedené produkty je možno užít při diagnóze a léčbě různých neurologických poruch, zejména periferních neuropathií, Alzheimerovy choroby a Parkinsonovy choroby.

Dosavadní stav techniky (2.1)

Vývoj a udržování stavu nervového systému závisí na bílkovinách, které jsou známé jako neurotrofní faktory. Při normálním vývoji centrální a periferní nervové soustavy dochází k uhynutí velkého počtu neuronů, tento jev patrně hraje zásadní úlohu při regulaci počtu neuronů které zasahují do určité cílové oblasti, jak bylo uvedeno vBerg D., 1982, Neuronal Development, 297-331, Cowan a další, 1984, 225:1258-1265. Ablační a transplantační pokusy na periferních cílových tkáních ukázaly, že v průběhu vývoje dochází k uhynutí neuronů při kompetici vzhledem k faktorům, které omezují možnost přežití („neurotrofní faktory“), které jsou produkovány v projekčních oblastech těchto neuronů. Tato pozorování vedla k identifikaci růstového nervového faktoru (NGF), kteiý prozatím zůstává nejlépe charakterizovanou neurotrofní molekulou, jak bylo uvedeno v publikacích Lewi-Montalcini a Angeletti P.U., 1968, Physiol. Rev. 48:534-69, Thoenen H., Barde Y. A., 1980, Rev. 60:1284-335. Porozumění úlohy a mechanismu působení NGF bylo velmi usnadněno objevením bohatého zdroje této bílkoviny v podčelistních žlázách myších samců, což umožnilo čištění této látky a její klonování (Ullrich a další, 1983, Nátuře 303:821-825, Scott a další, 1983, Nátuře 302: 538-40) a také produkci neutralizujících protilátek. Vzhledem ktomu, že NGF podporuje omezenou skupinu neuronů, byla dlouho předpokládána existence dalších neurotrofních faktorů (Varon S. a Adler R. 1981, Adv. Cellular Neurobiol. 2:115-163, Barde a další, 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189. Snider W. D. a Johnson E. M., 1989, Ann. Neurol. 26:489-506). Nyní je zřejmé, že takové faktory existují, avšak nepatrné množství těchto faktorů brzdí stanovení vlastností jejich molekul. Nicméně čištění malých množství dvou takových bílkovin, a to neurotrofního faktoru z mozku (BDNF) a ciliámího neurotrofního faktoru (CNTF) v poslední době umožnilo částečně zjistit řetězec nukleových kyselin pro tyto látky (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-152, Stockli a další, 1989, Nátuře 342: 21-28 a Lin a další, 1989, Science 246:1023-25). Přes specifické zvláštnosti jednotlivých populací neuronů mají BDNF a NGF (avšak nikoliv CNTF) dostatečnou strukturní homologii k tomu, aby bylo možno je považovat za členy jedné skupiny (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-152).

2.2 Jiné neurotrofní faktory

V posledních deseti letech byla podána řada zpráv, týkajících se neurotrofní účinnosti extraktů různých tkání a také živného prostředí různých typů buněk za určitých podmínek. Téměř ve všech případech však byl pokrok v čištění a stanovení vlastností brzděn malým množstvím účinné složky řádu pikogramů až nanogramů na gram tkáně.

-1 CZ 286015 B6

Mimoto byly pro periferní neurony navrženy postupy, které jsou plně adekvátní, zatímco pro centrální nervový systém dosud není k dispozici postup, který by byl specifický a reprodukovatelný. Jednotlivé typy periferních neuronů je možno prokázat jako jednotlivá, snadno od sebe oddělitelná ganglia, neurony centrálního nervového systému jsou ve své distribuci vysoce heterogenní. Je tedy zapotřebí specifického značení k identifikaci nebo k obohacení o určité skupiny neuronů v centrálním nervovém systému (CNS). Pokrok v získávání možností takového značení, například protilátek, namířených proti povrchu buňky nebo složkám buněčného skeletu nebo specifická histologická barviva jsou zatím velmi omezené. Bylo proto prozatím pouze prokázáno, že charakterizace neurotrofních faktorů, které jsou i) méně časté než NGF, ii) nesnadno prokazatelné a iii) nedostupné v dostatečném množství k vyvolání produkce protilátek je nesmírně obtížným postupem.

2.2.1. Srovnání růstového faktoru z mozku s nervovým růstovým faktorem

Neurotrofní účinnost, schopná udržet při životě neurony dorsálních kořenů ganglií kuřecího embrya in vitro byla identifikována v „upraveném prostředí“, v němž byly pěstovány buňky krysího gliomu C-6 (Barde a další, 1978, Nátuře 274:818). Tato účinnost nebyla neutralizována protilátkami proti myšímu NGF, což znamená pravděpodobnou přítomnost jiného neurotrofního faktoru v tomto prostředí. Podobný účinek, který nebylo možno blokovat protilátkami proti NGF byl prokázán také v kulturách astrogliálních buněk normálního mozku dospělých krys (Lindsay 1979, Nátuře 282: 80-82, Lindsay a další, 1982, Brain res. 243:329-343) a v extraktech vyvíjejícího se a dospělého mozku krys (Barde a další, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 1199-1203) a vyvíjející se a dospělé kuřecí míchy (Lindsay a Peters 1984, Neurosci. 12:45-51). Avšak v žádném případě nebyly účinné faktory izolovány ani identifikovány a zůstává pochybné, zda pozorovaná účinnost byla důsledkem přítomnosti jednoho nebo většího počtu různých faktorů.

Při použití mozku vepře jako výchozího materiálu podali Barde a další (1982, EMBO J., 1:549— 553) zprávu o faktoru, který se nyní nazývá mozkovým neurotrofním faktorem (BDNF) a který podporuje přežití neuronů dorsálních kořenů ganglií u kuřecích embryí E10/E11. Neurotrofní účinnost byla prokázána pro vysoce bazickou bílkovinu (isoelektrický bod, pí 10,1), která migrovala při elektroforéze na gelu s dodecylsíranem sodným (SDS) jako jednotný pás s molekulovou hmotností 12,3 k jednotky. Purifikační faktor byl 1,4 x 10⁶, avšak výtěžek byl velmi nízký, přibližně pouze 1 pg BDNF z 1,5 kg mozku vepře. Mimoto vzhledem ktomu, že posledním stupněm při čištění této látky byla preparativní elektroforéza na gelu, nebylo možno účinnost BDNF zcela renaturovat vzhledem k přítomnosti zbytků SDS (Barde a Thoenen, 1985, „Hormones and Cell Regulation“, sv. 9, Dumont a další, Elsevier Science Publishers, str. 385— 390). Bylo uvedeno, že vysoce bazická povaha a molekulová hmotnost BDNF byly velmi blízké monomeru NGF. Avšak BDNF má vlastnosti, které jsou odlišné od známých vlastností NGF v tom smyslu, že

a) při biologickém pokusu s dorsálními kořeny kuřecích ganglií není možno pozorovat zjevný účinek protilátek proti NGF na účinnost BDNF,

b) v tomtéž pokusu byl účinek BDNF a NGF aditivní a

c) na rozdíl od NGF nemá BDNF žádný účinek na přežití sympatických neuronů u kuřat E12.

Mimoto v průběhu studií s extrakty z mozku bylo pozorováno, že neurotrofní účinnost z těchto zdrojů patrně působí na sensorické neurony v pozdějším stadiu vývoje než v případě NGF. Při použití disociovaných kultur neuronů kuřecího embrya, pěstovaných na polykationtovém substrátu, jako polylysinu nebo polyomithinu bylo prokázáno, že BDNF umožnil přežití více než 30% E10—11 (embryonální den 10 nebo 11) neuronů dorsálních kořenových ganglií, avšak

-2CZ 286015 B6 pravděpodobně měl jen malý vliv na přežití týchž neuronů v E6 (Barde a další, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 1199-1203). Za obdobných podmínek podporuje NGF přežití 30 až 40 % E6 neuronů DRG. Je zajímavé, že později bylo zjištěno, že při pěstování substrátu, povlečeného extracelulámí matricí glykoproteinu lamininu podporoval jak NGF, tak BDNF přežití přibližně 50 % neuronů DRG kuřecích embryí ve stáří E6 až E12 (Lindsay a další, 1985, Develop. Biol. 112, 319-328). V této publikaci se uvádí, že účinek NGF a BDNF je aditiní v případě, že obě tyto látky jsou přítomny v sytících koncentracích.

Časné studie podle publikace Levi-Montalcini, 1966, The Harvey Lectures 60, 217-259, týkající se specifičnosti NGF a účinků této látky na neurony uvádějí, že NGF patrně není všudypřítomným neurotrofním faktorem ani pro sensorické neurony vzhledem k tomu, že tato látka nemá žádný účinek na neurony v některých sensorických hlavových gangliích kuřete, zejména v ganglion nodosum desátého hlavového nervu. Při pozdějších studiích in vivo (Johnson a další, 1980, Science 210, 916-918; Pearson a další, 1983, Develop. Biol. 96, 32-36) bylo prokázáno, že deprivace NGF v průběhu embryogeneze neměla žádný vliv na přežití neuronů ve většině kraniálních sensorických gangliích krysy, zatímco totéž opatření vedlo k velké depleci počtu neuronů v sensorických gangliích, odvozených od neurální rýhy. Při podrobnějších studiích in vitro (Lindsay a Rohrer, 1985, Develop. Biol. 112, 30-48, Davies a Linsay, 1985, Develop. Biol. 111, 62-72 a Lindsay a další, 1985, J. Cell Sci. Suppl. 3, 115-129) se jasně ukázalo, že NGF podporuje přežití většiny sensorických neuronů, odvozených od neurální rýhy avšak nemá žádný zjevný účinek na přežití kraniálních sensorických neuronů, odvozených od hlavové části zárodečného listu.

Prvním průkazem specifičnosti BDNF pro neurony, odlišné od NGF byla skutečnost, že in vitro bylo možno prokázat, že čištěný BDNF podporuje přežití 40 až 50 % sensorických neuronů, disociovaných od ganglion nodosum, odvozeného u kuřecího embrya od hlavové části zárodečného listu ve stadiu E6, E9 nebo E12 (Lindsay a další, 1985, J. Cell Sci. Supp. 3, 115— 129). NGF neměl na tyto neurony žádný zjevný účinek ani sám o sobě ani ve spojení s BDNF. Jak bylo dále prokázáno při použití kultur explantátů, BDNF patrně podporuje přežití a růst neuritů z ostatních sensorických ganglií včetně ganglion petrosum, geniculatum a ventrolaterale trigeminu (Davies a další, 1986, J. Neurosci. 6, 1897-1904) žádné z uvedených ganglií nebylo citlivé na NGF. Ve všech svrchu uvedených studiích neměly neutralizační protilátky proti NGF žádný vliv na pozorovaný účinek BDNF. Kromě pozorovaných účinků na neurony z periferních ganglií v kultuře bylo prokázáno, že BDNF také stimuluje přežití a diferenciaci neuronových buněk z neurální rýhy křepelky (Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41, 79-86).

Až dosud brzdila nemožnost získat dostatečné množství BDNF pro imunizaci produkci protilátek proti BDNF pro srovnání s protilátkami proti NGF v jejich účinku na neurony a také nebylo možno provést pokusy se zkříženou neutralizací NGF a BDNF. Nyní však popisují dvě publikace, a to Kalcheim a další, 1987, Embo J., 6, 2871-2873 a Hofer a Barde, 1988, Nátuře 331, 261-262) fyziologickou úlohu BDNF u ptáků. V případě, že se uloží ve vejci mechanická překážka mezi dorsální kořenová ganglia ve dnech E3/E4 a jejich cíl v CNS v nervové trubici, je možno pozorovat, že řada neuronů těchto ganglií zahyne (Kalcheim a Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116, 451-466. Předpokládá se, že toto uhynutí neuronů by mohlo být způsobeno nedostatkem neurotrofního faktoru z CNS (nervové trubice). Bylo dále pozorováno, že BDNF ve spojení s membránou, opatřenou povlakem lamininu může zabránit tomuto uhynutí buněk (Kalcheim a další, Embo J., 6, 2871-2873). Po vstřiknutí BDNF do vyvíjejících se křepeličích vajec potlačuje přirozené uhynutí v ganglion nodosum, což není možno prokázat pro NGF (Hofer a Barde, 1988, Nátuře 331, 261-262). Kromě účinku na periferní sensorické neurony v nervové rýze i v hlavové části podporuje BDNF přežívání vyvíjejících se neuronů CNS. Johnson a další (1986, J. Neurosci. 6, 3031-3938) uveřejnili údaje, které prokazují, že BDNF podporuje přežití retinálních gangliových buněk z krysích embryí E17. Tím jsou rozšířeny dřívější poznatky, které prokazovaly, že některá upravená prostředí a extrakty z mozku, připravené z cílových oblastí retinálních gangliových buněk podporovaly přežívání těchto neuronů (McCaffery a další, 1982,

-3CZ 286015 B6

Ex. Brain. Res. 48, 37-386, Sarthy a další, 1983, J. Neurosci. 3, 2532-2544, Turner a další, 1983, Dev. Brain Res. 6, 77-83).

Kromě účinků na přežití vyvíjejících se neuronů v kultuře má BDNF účinky také na zralé neurony periferního i centrálního nervového systému v kultuře. Bylo prokázáno, že BDNF, stejně jako NGF, stimuluje regeneraci axonů z neuronů DRG dospělých krys v kultuře (Lindsay, 1988, J. Neurosci. 8, 2394-2405), přestože zralé sensorické neurony patrně nevyžadují ke svému přežití v kultuře in vitro na 3 nebo 4 týdny neurotrofní faktory. Mimoto v kultuře retinálních buněk dospělých krys bylo pozorováno, že BDNF podporuje jak přežití, tak prodlužování axonů zgangliových buněk retiny (Thanos a další, 1989, Eur. J. Neurosci. 1, 19-26). Srovnání biologických účinků NGF a BDNF je shrnuto v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Srovnání biologické účinnosti BDNF a NGF*

Periferní nervový systém	Přežití
BDNF	NGF
i) E6 DRG kuřete	-	++
E10 DRG kuřete	-	++
E12 symp. kuřete
(Barde a další, 1980 svrchu)	—	++
ii) E6-E12 DRG kuřete	++	++
E6-E12 nodosum kuřete	++	—
E12 symp. kuřete	-	++
El2 ciliámí g. kuřete
(Lindsay a další, 1985 svrchu)	-	-
iii) E3-E14 kuřete:
jugulare	+/++	+4-
DM-trigemini	+/++	++
petrosum	+/++	-
geniculatum	+/++	-
VL-trigemini	++	-
vestibulare	-	—
mesencephalicum	++	-
(Davies a další, 1986 svrchu,
Barde a další, 1987, Prog.,
Brain Res., 71:185-198)

Centrální nervový systém

i) El7 gangliové buňky sítnice krysy ++ (Johnson a další, 1986,

J. Neurosci. 6:3031-3038)

Poznámky k tabulce:

*v chronologickém pořadí podle data zveřejnění, účinky byly zkoumány in vitro “žádné přežití (-). malý počet přežití (+), dobré přežití (++).

-4CZ 286015 B6

2.2.2. Cílové neurony pro neurotrofní faktory, odvozené od mozku

Sensorické neurony periferních nervových ganglií pocházejí z některé ze dvou od sebe odlišitelných přechodných embryonálních struktur, z nichž jednou je nervová rýha a druhou z těchto struktur je zvětšená kraniální část této rýhy ve formě destiček. Nervová rýha dává vznik jak neuronům, tak satelitním buňkám autonomních ganglií a spinálním sensorickým gangliím, tj. DRG. Příspěvek obou uvedených struktur na tvorbu sensorických ganglií kraniálních nervů byl studován při použití transplantačního chimémího systému křepelka/kuře podle publikace Le Douarin, 1973, Develop. Biol. 20:217-222, Noden, 1978, Develop. Biol. 67:313-329, Narayan aNarayan, 1980, Anat. Rec. 196:71-82, Ayer-Le Lievre a Le Douarin, 1982, Develop. Biol. 94:291-310, D'Amico-Martel a Noden, 1983, Am. J. Anat. Rec. 196:445—468). Ve shrnující publikaci Lindsay a další, 1985, J. Cell Sci. Supp. 3:115-129 se uvádí, že alespoň u ptáků pocházejí neurony distálních ganglií kraniálních nervů VII, IX a X (ganglium geniculatum, petrosum a nodosum) a neurony vestibulámě-akustického komplexu VIII kraniálního nervu výlučně z hlavové části. Trigeminální ganglon V. kraniálního nervu obsahuje neurony zobou uvedených struktur, přičemž neurony z hlavové části je možno nalézt převážně ve ventrolaterální části maxillomandibulámího laloku, zatímco satelitní buňky všech kraniálních ganglií mají svůj původ patrně výlučně v nervové rýze.

Z pokusů in vitro, při nichž byly užity jak explantáty, tak disociované, neurony obohacené kultury sensorických neuronů míchy a mozku je zřejmé, že sensorické neurony z nervové rýhy odpovídají na působení NGF. Na rozdíl od toho odpovídají neurony, jejichž původ je v hlavové části včetně neuronů ventrolaterální části ganglia trigeminu a celé populace neuronů z ganglion vestibulare, geniculatum, petrosum a nodosum v podstatě neodpovídají na působení NGF v průběhu svého embryonálního vývoje. Přes rozdíly v požadavcích a v odpovědi na NGF, jak je zřejmé z tabulky 1, jsou oba typy neuronů citlivé na účinek BDNF, a to jak pokud jde o přežití, tak pokud jde o vliv na tvorbu neuritů (Lindsay a další, 1985, J. Cell. Sci. Supp. 3:115-129, Lindsay a další, 1985, Develop. Biol. 112:319-328, Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41:79-86). Tebar a Barde (1988, J. Neurosci. 8: 3337-3342) studovali vazné parametry radioaktivně značeného BDNF na neuronech ganglií dorsálních kořenů u kuřete. Jejich výsledky jsou v souladu s výsledky, které prokazují existenci dvou skupin receptorů BDNF, z nichž jedna má vysokou afinitu pro BDNF a druhá afinitu nízkou. V případě sympatických nervů nebyly pozorovány žádné receptory s vysokou afinitou.

Známé neuronové cíle pro BDNF byly shrnuty v publikaci Barde a další, 1987, Prog. Brain res. 71:185-189. Před existencí tohoto vynálezu nebylo možné provádět identifikaci buněk, syntetizujících BDNF vzhledem ktomu, že nebyly kdispozici sondy typu kyselin nukleových nebo protilátek, specifických proti BDNF. Pokusy o přípravu polyklonálních nebo monoklonálních protilátek proti BDNF byly neúspěšné. Tento neúspěch zbrzdil molekulární klonování BDNF, stanovení fyziologického účinku nedostatku BDNF in vivo na vyvíjející se neurony, kvantitativního stanovení BDNF ve tkáních pomocí imunologických zkoušek a lokalizaci BDNF při použití imunocytochemie.

V následující tabulce II jsou uvedeny neurony podle své odpovědi na BDNF.

-5CZ 286015 B6

Tabulka II

Neurony, odpovídající a neodpovídající na BDNF*

A. Odpovídající neurony

I. Sensorické neurony kuřete z nervové rýhy v

a) gangliích dorsálních kořenů

b) ganglion jugulare

c) dorsomediálního ganglia trigeminu

d) mesencephalického jádra trigeminu’“

II. Sensorické neurony kuřete z ektodermální destičky

a) ganglion nodosum

b) ganglion vestibulare

c) ganglion petrosum

d) ganglion geniculatum

e) ventrolaterální ganglion trigeminu

III. Gangliové buňky retiny krys

IV. Gangliové buňky retiny kuřete⁵⁰“

A. Neodpovídající neurony

I. Neurony sympatiku kuřete a krysy

II. Parasympatické ciliámí neurony kuřete * Barde a další, 1987. Prog. Brain Res. 71:185-189 “Davies a další, 1986, Nátuře 319: 497-499 ^Rodriguez-Tebar a další, 1989, Dev. Biol. 136:296-303

2.2.3. Klonování genu pro neurotrofní faktor z mozku

Klonování genu pro BDNF bylo poprvé provedeno postupem, popsaným v US patentové přihlášce č. 07/400,591, podané 30. srpna 1989. Nejprve byla čištěna malá množství BDNF z mozku vepře, čímž bylo možno stanovit fragmenty řetězců aminokyselin, které pak bylo možno užít ke stanovení odpovídajících řetězců oligonukleotidů. Tyto syntetické oligonukleotidy pak byly užity jako primery při reakcích, založených na polymeráze (PCR) při použití cDNA templátu, připraveného z buněk, produkujících BDNF. Produkty, získané PCR byly užity jako sondy, umožňující klonování úplné cDNA a/nebo genů pro BDNF genomu z různých druhů živočichů včetně člověka, vepře, krysy a myši, řetězce těchto genů byly rovněž stanoveny. Exprese rekombinantního BDNF bylo dosaženo v buňkách COS.

3. Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří rekombinantní řetězec DNA, kódující bílkovinu s aktivitou neurotrofinu-3 (NT-3) obsahující řetězec nukleotidů 530 až 886 lidského NT-3 z obr. 11.

Součást podstaty vynálezu tvoří také rekombinantní hostitelská buňka, s výhodou mikroorganismus, obsahující uvedený kódový řetězec DNA.

-6CZ 286015 B6

Podstatu vynálezu tvoří také čištěná bílkovina s účinností neurotrofinu-3, obsahující sekvenci aminokyselin 1 až 119 zralého lidského neurotrofínu-3 z obr. 11 a také způsob její výroby v hostitelské buňce s obsahem svrchu uvedené sekvence DNA.

Mimoto tvoří součást podstaty vynálezu také farmaceutický prostředek, obsahující účinné množství neurotrofmu-3 spolu s farmaceutickým nosičem a také protilátka, rozpoznávající neurotrofin-3.

Způsobem podle vynálezu je možno nejen získat bílkoviny NT-3 a příbuzné peptidy, nýbrž také protilátky, specifické proti bílkovinám NT-3 a příbuzným peptidům.

Podle vynálezu je možno NT-3 použít při diagnóze a/nebo léčbě neurologických onemocnění včetně periferních neuropathií jako jsou diabetické neuropathie, neuropathie toxické, z nedostatků ve výživě, hereditámí a také neuropathie spojené s onemocněním AIDS a s degenerativními onemocněními jako je Alzheimerova choroba. Bylo prokázáno, že NT-3 podporuje přežívání dopaminergních neuronů. Je tedy možno NT-3 použít také při Parkinsonově chorobě. Vzhledem ktomu, že NT-3 má spektrum účinnosti, odlišné od spektra BDNF nebo NGF, jde o novou a cennou možnost vyvolat opětný růst a regeneraci centrálního nervového systému.

Popis přiložených výkresů (4)

Na obr. 1 je znázorněno srovnání řetězců BDNF a NGF různých živočišných druhů. Analýza řetězce genu, který je kódem pro BDNF a v důsledku toho odvození řetězce aminokyselin pro tuto látku prokázalo, že tato bílkovina má řadu strukturních podobností s NGF. Primární řetězec BDNF, stejně jako jeho obecná struktura a způsob jeho dalšího zpracování in vivo z prekurzoru naznačují, že geny pro NGF a BDNF je možno odvodit od někdejšího společného genu. V případě úplného polypeptidu stačí zavést do řetězce NGF pouze tři oblasti s vypuštěnými částmi řetězce a pak je všech zbývajících 5L aminokyselin společných NGF z různých druhů a BDNF vepře a člověka. Tyto totožné zbytky zahrnují všech šest cysteinových zbytků, což znamená, že NGF a BDNF mají patrně velmi podobnou sekundární strukturu. Mimoto je možno pozorovat čtyři úseky po šesti nebo větším počtu aminokyselin, v nichž NGF ze všech svrchu uvedených zdrojů a BDNF vepře jsou buď totožné, nebo se liší nejvýš jednou konzervativní aminokyselinou. Je tedy možno předpokládat, že NGF a BDNF jsou blízce příbuzné svými geny.

Na obr. 2 je znázorněn řetězec genomu a odvozený řetězec aminokyselin pro NT-3 myši. Řetězec aminokyselin začíná prvním kodonem ATG po stop kodonu, zařazeném ve správném sledu. Podtržená část řetězce znázorňuje uložení primerú, použitých v prvním stupni PCR. Jediný souhlasný N-glykosylační řetězec je podtržen dvojitě a šipka ukazuje pravděpodobný počátek úplného NT-3 po jeho zpracování in vivo.

Na obr. 3 je znázorněno srovnání řetězce aminokyselin NT-3, NGF (Scott a další, 1983, Nátuře, 302: 538-540) a BDNF (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-152). Řetězec úplného BDNF myši, tak jak je zde znázorněn, je na 100 % totožný s BDNF vepře. Velká písmena a zastínění ukazuje aminokyseliny, které je možno nalézt ve stejných polohách ve všech třech bílkovinách a šipka označují všechny cysteinové zbytky. Hvězdičky označují vypuštěné části, které byly odstraněny, aby byla lépe zřejmá podobnost struktury. VI až V4 označuje 4 variabilní oblasti, které jsou tvořeny více než 3 po sobě jdoucími aminokyselinami.

Na obr. 4 je znázorněna distribuce mRNA pro NT-3 v tkáních myši. Bylo naneseno 20 pg RNA celkově do každé dráhy a pak byla provedena hybridizace pomocí ³²P-značené DNA s dvojitým řetězcem jako sondy.

-7CZ 286015 B6

A) Jediný pás, který odpovídá přibližně 1,4 kb je možno pozorovat ve všech tkáních, nejslabší signál je možno zjistit v plicní tkáni a nejsilnější ve tkáni srdeční. Kosterní svaly byly odebrány ze stehen.

Β) V mozku je možno pozorovat nejsilnější signál v oblasti hipoccampu a v mozečku.

Na obr. 5 je znázorněno přežívání sensorických neuronů po jejich isolaci zganglion nodosum, získaného z 8 dnů starých kuřecích embryí. Celkem 5000 buněk bylo naneseno na plotny s obsahem polyomithinlamininového substrátu a po 24 hodinách byly spočítány přežívající neurony. Použitá koncentrace BDNF byla trojnásobkem minimální koncentrace, požadované pro maximální přežití. Nebylo možno pozorovat žádné přežívající neurony bez přidání této látky nebo při použití prostředí, obsahujícího buňky COS bez transfekce v ředění 1:50 nebo za přítomnosti buněk po transfekci kontrolní DNA.

Na obr. 6 jsou znázorněny

A) Produkt, získaný PCR při použití degenerovaných primerů IB a 2C (označených R1B/2C). Tímto způsobem je možno prokázat nový gen pro NT-3, stejně jako geny pro NGF a BDNF v DNA genomu kiysy.

B) Znázorněna je mapa restrikčních míst klonu genomu pro NT-3 krysy. Byly izolovány dva nezávislé ikony bakteriofágu, které specificky hybridizují se sondou R1B/2C, a to z genomu krysy. Je schematicky znázorněna restrikční mapa jednoho z těchto klonů, obsahující včleněný řetězec o velikosti 19,5 kb. Silnější čára znázorňuje otevřený řetězec, který je kódem pro NT-3 (ORF), jak je rovněž znázorněno na obr. 7A. Je také znázorněna poloha sondy R1B/2C.

Na obr. 7 je znázorněn řetězec NT-3 krysy a jeho homologie s NGF a BDNF krysy.

A) Znázorněn je nukleotidový řetězec a řetězec aminokyselin pro NT-3. Je znázorněna DNA, která je kódem pro NT-3, translace aminokyselin je označena nad řetězcem. Hvězdičkami je označen začátek a konec řetězce. Aminokyseliny jsou číslovány od polohy +1, jíž je označen první zbytek úplného NT-3 (119 aminokyselin). Místo štěpení, sloužící k uvolnění úplného NT-3 je uzavřeno v obdélníku, stejně jako místo glykosylace těsně nad svrchu uvedeným místem. Další potenciální místo štěpení, které je podobně uloženo v předpokládaném místě zpracování NGF (Darling a další, 1987, Cold Spring Harb. Symp. Quant, Biol. 1:427-434), avšak které není přeneseno do BDNF, je rovněž označeno obdélníkem a mimoto „7CLEAVE“. Šest cysteinových zbytků v úplném NT-3 je podtrženo. Methioninový iniciační kodon pro kratší prekurzorovou formu NT-3 (v poloze -139), který označuje počátek „B“, jak bude dále uvedeno, je rovněž podtržen. Je také naznačeno předpokládané místo pro vazbu intronu nad místem pro počátek „B“.

B) Je znázorněna podobnost řetězců pro NT-3, NGF a BDNF krysy. Bylo užito programu Mac Vector (Intemational Biotechnologies, Inc.) k vytvoření srovnávací matrice pro ORF NT-3 s ORF pro NGF a BDNF (s okénkem s rozměrem 20, minimální souhlas byl 20%. Statisticky významná souhlasná místa řetězce, která je možno pozorovat podle diagonály této matrice jsou naznačena pod schematickým znázorněním řetězce pro NT-3. Jde o dvě homologní místa směrem vzhůru k úplnému NT-3, která jsou označena I a II Jak je z výkresu zřejmé. Oblast I zasahuje směrem vzhůru od místa pro počátek „B“ pro krátký prekurzor NT-3, což podporuje domněnku, že existuje ještě delší prekurzor.

C) Je znázorněno srovnání mezi homologními oblastmi I a Π NT-3, NGF a BDNF. Řetězce pro tyto oblasti jsou znázorněny tak, že je zřejmá jejich homologie, vypuštěné části řetězce jsou označeny Totožná místa v BDNF nebo NGF s NT-3 jsou označena identická místa pro

-8CZ 286015 B6

NGF a BDNF jsou označena . Označení „+“ v horní části řetězce označuje zbytky, které jsou zcela zachovány vNT-3 krysy a NGF a BDNF všech zkoumaných druhů. Jsou označena následující místa pro NGF, předem předpovězená pro BDNF a předpokládaná i pro NT-3: iniciační kodon pro methionin jako počátek „B“, dále signální řetězec a místo štěpení v tomto řetězci (Edwards a další, 1988. Mol. Cell. Biol. 8: 2456-64), dále předpokládané místo štěpení v meziproduktu NGF, které chybí v BDNF, avšak je přítomno v NT-3, místo příjmu glykosylační skupiny, místo proteolytického štěpení, které uvolňuje úplný faktor.

D) Srovnání řetězce úplných forem NT-3, BDNF a NGF. Zachované cysteinové zbytky jsou podtrženy hvězdičkami. Jinak je označení „*“, a jako v obr. 7C. Je označeno i místo terminálního štěpení, přítomné pouze v řetězci NGF.

Na obr. 8 je znázorněno srovnání účinnosti NGF, BDNF a NT-3, jak bylo provedeno na explantátech kuřecích embryí ve stáří 8 dnů. Jde o mikrofotografie dorsálních kořenových ganglií DRG (panely A až D), ganglion nodosum NG (panely E až H), a ganglia sympatického řetězce SG (panely i až L) po pěstování 24 hodin v případě DRG a NG nebo 48 hodin v případě SG buď v nepřítomnosti jakéhokoliv neurotrofního faktoru (kontroly A, E a I), nebo za přítomnosti supematantu buněk COS s obsahem NGF (B, F a J) nebo BDNF (C, G a K) nebo NT-3 (D, H a L). V kontrolních kulturách téměř není možno pozorovat růst neuronů (500 μΐ supematantu buněk COS po simulované transfekci). Po podání NGF (10 μΐ supematantu buněk COS) bylo možno pozorovat rychlý růst vláken v případě DRG a SG, avšak nikoliv NG. Při přidání většího množství supematantu (500 μΐ) nebylo možno pozorovat žádný rozdíl. Po podání BDNF (10 μΐ supematantu buněk COS) bylo možno pozorovat růst vláken v případě DRG a NG, avšak nikoliv SG. Vyšší množství 20 až 500 μΐ rovněž nemělo žádný vliv. Po přidání NT-3 (20 μΐ supematantu buněk COS v případě DRG a NG a 200 μΐ v případě SG) bylo možno pozorovat růst vláken u všech tří typů gangliových buněk, přestože počátek růstu byl pomalejší a méně významný pro SG. Ganglia byla pěstována jako explantáty na kolagenovém gelu (Lindsay a Rohrer, 1985, Dev. Biol. 112: 30-48) v prostředí F14, doplněném 5 % koňského séra, jak bylo popsáno v Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112: 319 až 328. Stupnice bar = 200 μπι.

Obr. 9 znázorňuje, jak NT-3 podporuje přežití a růst neuritů v kultuře, vysoce obohacené o neurony DRG. Jsou uvedeny mikrofotografie kultur s obsahem více než 95 % neuronů DRG kuřecího embrya (den 8), na tyto buňky bylo působeno 48 hodin (A) supematantem (500 μΐ) buněk COS po simulované transfekci nebo (B, C) supematantem (50 μΐ) buněk po transfekci NT-3. V případě A a B jde o mikrografy ve tmavém poli. V případě A (kontroly) přežívá méně než 5 % neuronů, v případě B přežívá přibližně 60 % neuronů. Z křivky závislosti dávky a odpovědi je možno prokázat, že běží o maximální možný účinek NT-3 na kuřecí neurony E8 DRG. C) Znázorněno je větší zvětšení ve fázovém kontrastu téže kultury jako na obr. 7B. Je možno pozorovat větší počet jasně zbarvených těl neuronů a v podstatě žádné od neuronů odlišné buňky. Kultury byly pěstovány svrchu uvedeným způsobem (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112: 319-328). Škála, označená tyčinkou je po 150 μΐ (C).

Na obr. 10 je pro srovnání znázorněn výsledek metody northem blot pro NT-3, NGF a BDNF u hlodavců. RNA byla připravena způsobem podle publikace Auffray C. a Rougeon F., 1980, Eur. J. Biochem. 107: 303-314 z uvedených tkání krysy (vlevo) nebo myši (vpravo). Pak bylo 10 pg RNA z uvedeného zdroje podrobeno frakcionaci na agarosovém gelu s 1 % formaldehydu a materiál byl přenesen na nylonovou membránu v 10 x SSC, northem blot byl proveden v trojím opakování podle publikace Mahmoudi M. a Lín V. K., Biotechniques 7:331-333 při teplotě 68 °C při použití ³²P- značených fragmentů DNA pro NT-3, NGF a BDNF krysy (Feinberg A. P., Vogelstein B., 1984, Anal. Biochem. 137:266-267) a pak byl materiál promyt při teplotě 68 °C v 2 x SSC s 0,1 % SDS. Fragmenty DNA pro NT-3, NGF a BDNF byly odvozeny od konstrukcí po jejich expresi, tyto konstrukce obsahovaly uvedené geny v plasmidu pCDM8. Vložené řetězce o přibližně 775 bp (Xhol) v těchto konstrukcích byly čištěny na gelu před

-9CZ 286015 B6 značením radioaktivním fosforem. Znázorněn je i gel, barvený ethidiumbromidem, což dovoluje srovnání celkového množství RNA na vzorek.

Na obr. 11 jsou srovnány řetězce DNA pro geny NT-3 člověka a krysy. Počátek translace se nachází v místě, označeném „PREPRO-“ a pravděpodobný začátek úplného NT-3 je označen „MATURE—“. Úplné bílkoviny NT-3 krysy a člověka mají totožné řetězce aminokyselin, zatímco jejich prepro-oblasti se od sebe liší v 11 polohách, které jsou podtrženy.

Na obr. 12 je znázorněna exprese NT-3 člověka při metabolickém značení. 5 x 10⁵ buněk COSM5 bylo uloženo vždy do každé petriho misky s průměrem 60 mm a buňky byly pěstovány přes noc při teplotě 37 °C v úplném prostředí DMEM s přidáním 10 % séra skotu (FBS). Pak byly buňky podrobeny transfekci při použití CaPO₄ podle publikace Chen a Okayama, 1987. Mol. Cell Biol. 7:2745-52 a při použití 20 pg plasmidu pC8-hN3 (Pl) s obsahem genu pro NT-3 člověka pod řízením promotoru cyto-megaloviru nebo byla provedena simulovaná transfekce bez plasmidové DNA. Po 48 hodinách byly buňky promyty a 1 hodinu inkubovány v 1 ml prostředí DMEM s 1 % FBS bez methioninu a cysteinu. Pak byla ke směsi přidána směs ³⁵S-methioninu a ³⁵S-cysteinu (vždy 100 pCi, New England Nuclear), buňky byly inkubovány ještě 4 hodiny při 37 °C a pak bylo prostředí slito. Vzorky s objemem 50 μΐ byly smíseny s 25 μΐ dvojnásobně koncentrovaného pufru pro vzorek s obsahem dodecylsíranu sodného (SDS), směs byla povařena a podrobena elektroforéze na 15% polyakrylamidovém gelu za přítomnosti SDS podle publikace Laemmli, 1970, Nátuře 227: 680-685. Bílkoviny byly přeneseny elektroforeticky (3 hodiny, 100 mA) na nylonovou membránu (immobilon, Millipore) při použití pufrů, popsaných v publikaci Towbin a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354. Filtry byly usušeny na vzduchu a značené bílkoviny byly zjištěny autoradiograficky (16 hodin při teplotě místnosti při použití filmu Kodak X-AR se stínítkem, zvyšujícím účinnost stanovení - Cronex, (Du Pont).

Na obr. 13 je znázorněn sloupcový graf, který znázorňuje přežití buněk v prostředí styrosinhydroxylázou, kultury buď neobsahovaly supematant s NT-3 (O), nebo obsahovaly ředění 1:300, 1:100, 1:50 nebo 1:25 tohoto supematantu.

Na obr. 14 je znázorněn obdobný graf jako na obr. 13 stím rozdílem, že hustota buněk byla 900 000 v jedné misce.

Na obr. 15 je znázorněno srovnání NT-3, BDNF a NGF. V části A jde o srovnání syntetických transkriptů. Bylo užito hybridizace dot-blot s radioaktivně značeným oligonukleotidem, homologním s řetězcem společným na 5'- zakončení všech tří transkriptů, čímž bylo ověřeno, že stejné množství těchto materiálů (2 ng) syntetického NT-3, BDNF a NGF jsou užity po počáteční spektrofotometrické kvantitativní analýze jako definované standardy. V části B je uvedeno stanovení NT-3, BDNF a NGF na úrovni mRNA v celkové RNA, připravené z mozku dospělé krysy, srovnání je provedeno s definovanými syntetickými standardy RNA. Hybridizuje se 10 pg celkové RNA, izolované z mozku dospělých krys a 4, 10 a 20 pg syntetických transkriptů, odpovídajících neurotrofinům. Provádí se northem blot a hybridizace s použitím radioaktivně značených sond, specifických pro každý z uvedených neurotrofinů.

Na obr. 16 je znázorněna exprese NT-3, NGF a NGFR, tj. exprese genů pro tyto látky v celkové RNA (10 pg/dráha) z krysích embryí (A), vyvíjejícího se mozku krysy (B) a ve vybraných tkáních v perinatálním období a v dospělosti (C). Tkáně: A.BR = vzorek tkáně dospělého mozku, standardizovaný na obr. IB. PLAC = placenta. EMB = celé embryo. SP.C = mícha. THY = thymus. LIV = játra. HRT = srdce. BR = mozek. Rozměry transkriptů jsou uvedeny na pravé straně jako kilobaz (kb).

-10CZ 286015 B6

Na obr. 17 je znázorněna exprese genů pro NT-3, NGF a BDNF v celkové RNA (10 pg/dráha), připravené z různých oblastí z nervového systému novorozence (A) a dospělého (B). Oblasti: A.BR = dospělý mozek, standardizace podle obr. 1B. CBL = mozeček. HBR: = zadní mozek. MBR = mezimozek. DIEN = diencephalon. STR = striatum. HIP = hippocampus. CTX = neocortex. OLF = bulbus olfactorius. BR = celý mozek bez mozečku. ADR = nadledvinka. RET = sítnice. SC.N = nervus ischiadicus. SP.C. = mícha.

Na obr. 18 je kvantitativně znázorněna úroveň transkripce NT-3, BDNF a NGF v oblastech CNS u novorozence a u dospělého, a to také v periferních tkáních. K získání údajů bylo užito sériového densitometrického měření a metody northem blot včetně případů, znázorněných na obr. 16, 17 a 19 podle publikace Maisonpierre a další, 1990, Science 247: 1446-1451. Všechny získané hodnoty byly standardizovány s ohledem na obsah neurotrofinu v dospělém mozku. Tyto hodnoty, které jsou podobné pro všechny tři neurotrofmy jsou uvedeny na grafu tak, že hodnoty mimo stupnici jsou uvedeny nad přerušeným sloupcem. Jsou uvedeny výsledky jak při použití neuronů, tak při použití vzorků jiných tkání. BNR = mozek bez mozečku, CBL = mozeček, HBR = zadní mozek, MBR - mezimozek, DIE - diencephalon, STR = striatum, HIP = hippocampus, CTX = neocortex, OLF = bulbus olphactorius, sp. c = mícha, SC.N. = nervus ischiadicus, RET = sítnice, ADR = nadledvinky, HRT = srdce, LIV = játra, THY = brzlík, SK.N = kůže, MUS = kosterní sval, LNG = plíce, INT = střevo, KID = ledvina, SPL = slezina.

Na obr. 19 je znázorněna exprese genu pro NT-3, BDNF a NGRF v průběhu vývoje míchy (A,

E), mozečku (B, F) a hippocampu (C, G). Bylo srovnáváno množství 10 pg celkové RNA z různých údobí vývoje, pokud jde o expresi různých transkriptů. Densitometrické kvantitativní stanovení hladiny neurotrofínů je uvedeno v drahách E, F a G.

Podrobný popis vynálezu (5)

Vynález se týká neurotrofínu-3, což je nový člen skupiny neurotrofních molekul z řady BDNF/NGF, vynález se týká také dalších možných členů, zjistitelných obdobným způsobem. Pro jasnost a srozumitelnost bude podrobný popis jednotlivých provedení rozdělen do následujících odstavců:

i) identifikace dalších členů skupiny BDNF/NGF, ii) klonování neurotrofinu-3, iii) exprese neurotrofinu-3, iv) zkoušky biologické účinnosti neurotrofinu-3,

v) geny pro neurotrofin-3 a bílkoviny, vi) tvorba protilátek proti neurotrofinu-3 a vii) využití uvedených poznatků ve smyslu vynálezu.

5.1 Identifikace dalších členů skupiny BDNF/NGF

NGF a BDNF jsou základní bílkoviny o přibližně 120 aminokyselinách, kterým je společných přibližně 50 % řetězce aminokyselin včetně úplného zachování šesti cysteinových zbytků, o nichž bylo prokázáno, že v účinném NGF tvoří tři disulfidové můstky (Bradshaw A., 1978, Ann. Rev. Biochem. 47: 191-216 a Leibrock a další, 1989, Nátuře 341: 149-152). Srovnáním řetězců NGF z vývojově divergentních druhů prokázalo, že aminokyseliny, které jsou uloženy v bezprostředním sousedství těchto cysteinových zbytků jsou nejuchovávanější oblastí molekuly (Meier a další, 1986, EMBO J., 5:1489-1493, Selby a další, 1987, J. Neurosci Res. 18: 293298). Je však překvapující, že jsou to právě tyto oblasti, které jsou si v BDNF a NGF nejbližší (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341: 149-152).

-11 CZ 286015 B6

Cílevědomé vyhledávání dalších členů skupiny BDNF/NGF je možno provádět tak, že se využije existence uchovaných segmentů se silnou homologií v NGF a BDNF. Je například možno identifikovat další členy této skupiny látek tak, že se ze skupiny řetězců nukleových kyselin vybírají ty, které mají určitou homologii s BDNF a NGF a z těchto řetězců se pak identifikují ty, které obsahují také řetězce nukleových kyselin, které nejsou homologní s BDNF a NGF. Pod pojmem „nehomologní“ se rozumí oblast, která obsahuje alespoň 6 za sebou následujících nukleotidů, z nichž alespoň dva se liší od řetězce NGF a BDNF.

Vynález se rovněž týká rekombinantních molekul DNA, které jsou homologní NGF a NT-3 nebo NGF a NT-3, avšak které rovněž obsahují oblasti, které s BDNF a NT-3 nebo s NGF a NT-3 homologní nejsou. Tyto další geny ze skupiny BDNF/NGF/NT-3 je možno identifikovat při použití molekulárních sond, které odpovídají oblastem homologie. Při další analýze se pak prokáže, že tyto další geny z uvedené skupiny obsahují řetězce, které se liší od řetězců známých genů ze skupiny genů BDNF/NGF/NT-3.

Specifické provedení vynálezu například navrhuje následující postup:

Je možno syntetizovat skupiny oligonukleotidových sond pro každý ze čtyř uchovaných segmentů, tak jak jsou uvedeny v následující tabulce III, jde o sondy o 10-20 nukleotidech, které representují všechny možné kódové řetězce pro aminokyseliny, nacházející se v NGF nebo BDNF pro tři až sedm po sobě jdoucích kodonů. Při použití číslování vzhledem k aminoterminálnímu zakončení úplného polypeptidu (takže His 134 prepro-BDNF se zpracuje působením Hisl) je možno charakterizovat svrchu uvedené čtyři segmenty takto (číslováno s ohledem na úplné bílkoviny).

Tabulka III

Segment 1:	NGF BDNF	Gly 10 Gly8	-Ser19 -Ser17
Segment 2:	NGF	Lys50	-Cys58
	BDNF	Lys50	-Cys58
Segment 3:	NGF	Gly67	-Asp72
	BDNF	Gly67	-Asp72
Segment 4:	NGF	Trp99	-CysllO
	BDNF	Trp100	-Cysl 11

Syntetické oligonukleotidy, odvozené od párů řetězců ze segmentů, uvedených v tabulce ΙΠ je možno užít jako primery pro amplifikaci PCR řetězců ze zdroje (RNA nebo DNA) potenciálního zájmu. Tento zdroj může zahrnovat mRNA nebo cDNA nebo DNA genomu z jakéhokoliv eukaryotického druhu, schopného exprese polypeptidu, blízce příbuzného BDNF nebo NGF. Při provedení malého množství reakcí, jako šesti PCR reakcí (primer ze segmentu 1 s primerem ze segmentu 2, segment 1 se segmentem 3, segment 1 se segmentem 4, segment 2 se segmentem 3, segment 2 se segmentem 4, segment 3 se segmentem 4) může být možná detekce genu nebo produktu genu, obsahujícího jakékoliv dav ze svrchu uvedených čtyř segmentů nebo zachovaného řetězce, společného NGF a BDNF. V případě, že se syntetizuje několik odlišných primerů pro každý segment, může stále ještě být možné provést úplnou analýzu při provedení poměrně malého počtu reakcí PCR. Je také možno měnit omezení hybridizačních podmínek při použití primeru v PCR reakci, což umožňuje menší nebo větší podobnost řetězce nukleotidů mezi neznámým genem a NGF nebo BDNF. V případě, že segment dříve neznámé sloučeniny ze skupiny genů BDNF/NGF je úspěšně amplifikován, je možno jej molekulárně klonovat

-12CZ 286015 B6 a analyzovat jeho řetězec a pak jej užít jako sondu pro izolaci úplné cDNA nebo klonu genomu. To opět umožní stanovení úplného nukleotidového řetězce neznámého genu, analyzovat jeho expresi a získat jeho bílkovinný produkt pro funkční analýzu.

Mimoto umožňuje vynález využití homologie řetězců NGF/BDNF při konstrukci nových rekombinantních molekul, které náležejí do skupiny genů BDNF/NGF, avšak přirozeně se nevyskytují. Je například možno zkonstruovat rekombinantní molekulu s obsahem částí obou genů NGF a BDNF. Taková molekula by mohla mít vlastnosti BDNF i NGF a tedy nový profil biologické účinnosti, a to v případě agonistů i antagonistů. Je také možno užít primární řetězce BDNF i NGF k předpovědi terciární struktury těchto molekul při využití simulace na počítači. (Hopp a Woods, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:3824-3828). Je možno konstruovat také rekombinantní geny BDNF/NGF vzhledem ke korelaci mezi terciární strukturou a biologickou funkcí. Je rovněž možno konstruovat chimémí geny, obsahující části kteréhokoliv nebo většího počtu genů ze skupiny genů BDNF/NGF.

5.2. Klonování neurotrofinu-3

Gen NT-3 z kteréhokoliv organismu je možno identifikovat při použití oblastí homologií, společných pro BDNF a NGF při použití svrchu uvedených metod. Podle dvou specifických výhodných provedení vynálezu je možno gen identifikovat a klonovat následujícím způsobem.

Podle jednoho z výhodných provedení je možno použít primer ve smyslu řetězce (nebo 5) s řetězcem nukleotidů (podle nomenklatury IUPAC) GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GA (primer 1, který zahrnuje místo štěpení endonukleáz Bam HI a SacII a primer proti smyslu řetězce (nebo 3') s řetězcem nukleotidů TCG AATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCA (primer 2, který zahrnuje místo štěpení endonukleáz EcoRI a Xbal) pro reakci s polymerázou (Saiki a další, 1985, Science 230:1350-1354) při použití běžně dodávaného zařízení Perkin-Elmer Cetus thermal cycler a termostabilní DNA-polymerázy z thermus aquaticus (Taq polymeráza). Po přibližně čtyřech cyklech při teplotě 45 °C je možno provést zbývajících 36 cyklů při teplotě 49 °C. Výslednou DNA, která je produktem amplifikace je pak možno oddělit elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a produkt, který svou délkou odpovídá očekávanému produktu, tj. přibližně 137 párů bází je možno vymýt, reamplifikovat a pak rozštěpit dvěma restrikčními endonukleázami, z nichž jedna odštěpí gen NGF organismu v rámci amplifikovaného segmentu a druhá odštěpí řetězec genu BDNF organismu v rámci amplifikovaného segmentu. Nerozštěpená DNA (která pravděpodobně není kódem pro NGF ani pro BDNF vzhledem k tomu, že nebyla rozštěpena endonukleázou) pak může být oddělena od rozštěpené DNA elektroforézou na polyakrylamidovém gelu, vymyta a asymetricky amplifikována (Innis a další, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci USA 85:9436-9440) a její řetězec může být analyzován (Sanger a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3918-3921) například při použití primerů 1 a 2. Na základě takto získaného řetězce je možno zkonstruovat další příměry ve smyslu a proti smyslu řetězce, které pak přesněji odráží řetězec nového genu. Je možno použít například další primeiy ve smyslu řetězce, jako GGGATTGATGAC AAA (primer 3) a ACTCTCAGTGCAAAACTTCGC (primer 4) a primer proti smyslu řetězce (5') CGGATCCGAATTCTGCAG(T)i₂V (primer 5). RNA, připravená z tkáně, pravděpodobně produkující neurotrofní faktor, například mozku (při použití jakéhokoliv standardního postupu, například podle publikace Okayama a další, 1987, Meth. Enzymol. 154:3-28) může být reverzně transkribována například při použití primeru 5, který je zkonstruován tak, aby odpovídal zakončení 3'poly(A) a obsahuje místo působení restrikční endonukleázy Bam HI, EcoRI a Pstl (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-152). Výsledná cDNA pak může být amplifikována PCR při použití primerů 3 a 5 a pak reamplifikována při použití primerů 4 a 5. Pak je možno provést Southem blot při použití produktů poslední z uvedených reakcí a hybridizaci s ³²P-značenou oligonukleotidovou sondou, odpovídající řetězci směrem dolů od řetězců primerů 3 a 4. Takto identifikované fragmenty DNA je možno klonovat ve vhodném vektoru a nejdelší získaný včleněný úsek je možno užít k sériovému vyšetření sestavy genomu, získané ze zkoumaného organismu. Pozitivní klony, identifikované

-13 CZ 286015 B6 tímto způsobem je pak možno analyzovat standardním štěpením restrikčními enzymy a stanovením nukleotidového řetězce.

V dalším výhodném provedení vynálezu je možno syntetizovat oligonukleotidy, odpovídající segmentům čtyř řetězců bílkoviny, které jsou vysoce zachovány jak v NGF, tak v BDNF. Těmito řetězci aminokyselin mohou například být (obr. 7D)

1) Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Val-Cys-Asp-Ser,

2) Lys-Geb-Tyr-Phe-(Tyr/Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys,

3) Gly-Cys-Arg-Ile-Asp a

4) Trp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-Thr-(Ser/Ala)-Cys-Val-Cys.

V PCR reakcích je možno použít celou řadu oligonukleotidů ve smyslu a proti smyslu řetězce (s obsahem degenerované části o 15 až 26 nukleotidech, což odpovídá 5 až 9 aminokyselinám ve svrchu uvedeném řetězci bílkoviny ve smyslu nebo proti smyslu řetězce s nedegenerovanými „koncovými“ místy působení restrikčních enzymů). Je možno provést amplifikační reakce mezi páry primerů ve smyslu řetězce směrem vzhůru a proti smyslu směrem dolů za standardních podmínek nebo s výhodou za optimálních podmínek pro každý pár primerů, tyto podmínky je možno stanovit pokusně. Například primer ve smyslu řetězce (odpovídající svrchu uvedenému řetězci 1) aminokyselin) je 5'-GACTCGAGTCGACATCGJ3TN- TGY-GAY-WSN-RTNWS-3’ a primer proti smyslu řetězce (který odpovídá svrchu uvedenému řetězci aminokyselin 2) je 5'-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YGT-3' a je možno jej užít k amplifikační reakci při použití DNA nebo cDNA genomu, odvozené od vhodného zdroje jako templátu. Produkt amplifikační reakce při použití párů primerů ve smyslu řetězce směrem dolů a proti smyslu řetězce směrem vzhůru je možno užít jako hybridizační sondy při Southem blot DNA genomu k identifikaci produktu PCR, který hybridizuje s DNA genomu, obsahující oblasti, homologní vzhledem k sondám, stejně jako s oblastmi, které vzhledem k těmto sondám homologní nejsou (například řetězce odlišné od NGF a BDNF). Produkt PCR, kteiý identifikuje nový řetězec DNA genomu je možno užít k sériovému vyšetření sestav genomu nebo cDNA a tím i k selekci klonů, které jsou kódem pro nové látky ze skupiny genů BDNF/NGF.

5.3 Exprese neurotrofinu-3

Řetězec nukleotidů, který je kódem pro NT-3 nebo jeho část je možno uložit do vhodného vektoru pro expresi, tj. vektoru, který obsahuje nutné prvky pro transkripci a translaci uloženého kódového řetězce pro bílkovinu. Nutné signály pro transkripci a translaci je rovněž možno dodat pomocí nativního genu NT-3 a/nebo oblastí, které ho bezprostředně obklopují. K expresi řetězce, který je kódem pro bílkovinu je možno užít celé řady systémů vektor-hostitel. Jde například o systémy savčích buněk, infikovaných virem, například virem vaccinia, adenovirem apod., o buňky hmyzu, infikované virem, například baculovirem, mikroorganismy, například kvasinky s obsahem vektorů z kvasinek nebo bakterie, transformované DNA bakteriofágu, DNA plasmidu nebo DNA kosmidu. Ve výhodném provedení může vektor pro expresi obsahovat CMV promotor (Stephens a Cockett, 1989, Nucl. Acids, Res. 17:7110) a počátek replikace SV40. Prvky těchto vektorů pro expresi se mění podle své účinnosti a specifičnosti. V závislosti na použitém systému vektor-hostitel je možno použít kterýkoliv z celé řady prvků pro transkripci a translaci.

Je také možno užít kteroukoliv ze známých metod pro uložení fragmentů DNA do vektoru za účelem konstrukce vektorů pro expresi, obsahujících chimémí gen, který je tvořen příslušnými řídicími signály pro transkripci a translaci a kódovým řetězcem pro bílkovinu. Tyto postupy mohou zahrnovat tvorbu rekombinantní DNA in vitro, syntetické techniky a také rekombinací in vivo (genetickou rekombinací). Expresi řetězce nukleové kyseliny, který je kódem pro bílkovinu NT-3 nebo její peptidový fragment je možno řídit pomocí druhého řetězce nukleové kyseliny tak, že k expresi bílkoviny NT-3 nebo peptidů dochází v hostiteli, transformovaném rekombinantní molekulou DNA. Je například možno řídit expresi NT-3 pomocí jakéhokoliv

- 14CZ 286015 B6 systému promotoru s pomocným prvkem, který je v oboru znám. Promotory, jichž je možno použít pro dosažení exprese NT-3 jsou například promotorová oblast SV40 (Bemoist aChambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor, který je obsažen v 3'- terminálním opakování Rousova viru sarkomu (Yamamoto a další, 1980, Cell 22: 787-797), promotor po thymidinkinázu viru herpesu (Wagner a další, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci USA 78: 1444-1445), řídicí řetězec metallothioninového genu (Brinster a další, 1982, Nátuře 296: 39—42), prokaryotické vektory pro expresi, například promotor beta-laktamázy (Villa-Komaroff a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) nebo tac-promotor (DeBoer a další, 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25), souhrn je možno nalézt například v publikaci „Usefúl proteins from rekombinant bacteria“, Scientific Američan, 1980: 242: 74-94. Dále je možno užít vektory pro expresi v rostlinách s obsahem promotoru pro nopalinsyntetázu (Herrera-Estrella a další, Nátuře 303: 209-213) nebo promotor RNA 35S viru mosaiky květáku (Gardner a další, 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) a promotor pro fotosyntetický enzym ribulozobifosfátkarboxylázu (Hererra-Estrella a další, 1984, Nátuře 310: 115-120), promotorové prvky z kvasinek nebo jiných hub jako promotor Gal 4, ADC promotor (pro alkoholdehydrogenázu) promotor PGK (pro fosfoglycerolkinázu), promotor pro alkalickou fosfatázu a následující živočišné oblasti pro řízení transkripce, které jsou specifické pro určité tkáně a byly užity v případě transgenních živočichů: řídicí oblast genu pro elastázu I, která je účinná v pankreatických buňkách (Swifit a další, 1984, Cell 38:639-646, Omitz a další, 1986, Cold Spring Haarbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409, MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515), dále řídicí oblast genu pro insulin, která je účinná v pankreatických beta-buňkách (Hanahan, 1985, Nátuře 315:115-122) řídicí oblast genu pro imunoglobulin, která je účinná v lymfoidních buňkách (Grosschedl a další, 1984, Cell 38:647658, Adames a další, 1985, Nátuře 318:533-538, Alexander a další, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), řídicí oblast viru nádoru mléčné žlázy u myší, která je účinná u buněk varlat, mléčné žlázy, lymfoidních a tukových buňkách (Leder a další, 1986, Cell 45:485-495), řídicí oblast genu pro albumin, která je účinná vjatemích buňkách (Pinkert a další, 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), řídicí oblast genu pro alfa-fetoprotein, který je účinný v játrech (Krumlauf a další, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648), Hammer a další, 1987, Science 235:53-58), řídicí oblast genu pro 1-antitrypsin, která je účinná v játrech (Kelsey a další, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), řídicí oblast genu pro beta-globin, která je účinná v myeloidních buňkách (Mogram a další, 1985, Nátuře 315:338-340, Kollias a další, 1986, Cell 46:89-94), řídicí oblast pro gen základní bílkoviny myoglobinu, která je účinná v oligodendrocytech (Readhead a další, 1987, Cell 48:703-712) řídicí oblast pro lehký řetězec 2 myosinu, která je účinná v kosterním svalu (Sani, 1985, Nátuře 314:283-286) a řídicí oblast genu pro uvolňování gonadotropinu, která je účinná v hypothalamu (Mason a další, 1986, Science 234:1372-1378).

Vektory pro expresi, které obsahují včleněný gen pro NT-3 je možno identifikovat třemi zásadními postupy:

a) hybridizací DNA-DNA,

b) přítomností nebo nepřítomností „značícího“ genu a

c) podle exprese včleněných funkcí.

Při prvním z těchto postupů je možno zjistit přítomnost cizorodého genu, včleněného do vektoru pro expresu hybridizací DNA-DNA při použití sond, které obsahují řetězce, homologní s včleněným genem NT-3. Při druhém z těchto postupů se identifikuje a podrobí selekci systém rekombinantního vektoru a hostitele na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určitého „značícího“ genu a jeho funkcí (například může jít o účinnost thymidinkinázy, odolnost proti antibiotikům, transformaci fenotypu, tvorbu oklusních tělísek u baculoviru apod.). Tyto funkce jsou způsobeny včleněním cizorodého genu do vektoru. Například v případě, že se gen pro NT-3 uloží do značícího genu ve vektoru, je možno rekombinanty, které jej obsahují identifikovat podle ztráty funkce, odpovídající funkci značícího genu. Při třetím postupu je možno identifikovat rekombinantní vektory pro expresi podle exprese cizorodého genu v rekombinantní

-15CZ 286015 B6 buňce. Tyto postupy mohou být založeny například na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech produktu genu NT-3 v systému pro biologické zkoušky.

Jakmile je určitá rekombinantní molekula DNA identifikována a izolována, je možno kjejí propagaci užít několika postupů. Jakmile dojde ke stabilizaci systému hostitele a růstových podmínek, je možno připravit rekombinantní vektory ve větším množství. Jak již bylo vysvětleno, je možno jako vektory užít například následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo jiné živočišné viry jako jsou virus vaccinia nebo adenovirus, viry hmyzu, například baculovirus, vektory z kvasinek, z bakteriofágů (například lambda) a DNA plasmidů a kosmidů, a podobně.

Mimoto je možno volit kmen hostitelských buněk, který mění expresi uloženého řetězce nebo modifikuje a zpracovává produkt genu specifickým způsobem. Expresi některých promotorů je možno zvýšit za přítomnosti některých induktorů. Tímto způsobem je možno řídit expresi geneticky pozměněného NT-3. Mimoto byly charakterizovány různé hostitelské buňky a specifické mechanismy pro translační a posttranslační zpracování a modifikaci, například jako jsou glykosylace a odštěpení bílkovin. Je možno volit příslušné buněčné linie nebo systémy hostitelů k zajištění požadované modifikace a zpracování cizorodé bílkoviny. Je například možno použít exprese v bakteriálním systému k získání neglykosylovaného bílkovinného produktu. Exprese v kvasinkách poskytne glykosylovaný produkt. Expresi v buňkách savců je možno využít k zajištění „nativní“ glykosylace heterologního NT-3. Mimoto je možno zajistit vhodnou volbou různých vektorů a hostitelů pro expresi zpracování výsledného produktu, například proteolytické štěpení v různém rozsahu.

Ve specifickém provedení je možno klonovat DNA, která je kódem pro preproNT-3 v plasmidů pCMV, amplifikovat a pak použít k transfekci buněk COS při použití fosforečnanu vápenatého (Chen a Okayama 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752), NT-3 je pak možno izolovat z živného prostředí, jak je popsáno v příslušných odstavcích příkladů 1 a 2.

Pokládá se za prokázané, že NGF je syntetizován ve dvou různých prekurzorových formách, krátké formě a dlouhé formě (Darling a další, 1983, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 84:427^483). Kratší forma je v podstatě analogem preproformy BDNF a NT-3. Podle vynálezu může být žádoucí využít systému pro expresi s obsahem DNA, která je kódem pro analogickou dlouhou formu BDNF a NT-3. DNA, která je kódem pro tyto dlouhé prekurzory může být identifikována analýzou řetězce cDNA nebo oblastí DNA genomu směrem vzhůru od úplného kódového řetězce pro peptid BDNF nebo NT-3 v otevřeném řetězci ve směru translace. Srovnáním řetězce genu NT-3 s řetězci NGF a BDNF bylo možno předpovědět dlouhý a krátký prekurzor NT-3, jak je zřejmé z obr. 7B. Účinnost exprese úplného BDNF nebo NT-3 z dlouhého a krátkého prekurzoru může záviset na systému pro expresi a může se měnit od jednoho typu buněčných linií ke druhému.

5.3.1. Identifikace a čištění produktu genu pro expresi

Jakmile je identifikována rekombinantní struktura, která je schopna zajistit expresi, je možno analyzovat gen, a také jeho produkt. Toho je možno dosáhnout na základě fyzikálních nebo funkčních vlastností produktu genu včetně radioaktivního značení s následnou elektroforézou na gelu.

Jakmile byla identifikována bílkovina NT-3, je možno ji izolovat a čistit obvyklými postupy včetně chromatografie, například je možno užít chromatografie na iontoměniči, afinitní chromatografie a chromatografie, při níž je možno oddělit látky od určité molekulové hmotnosti, dále je možno užít odstředění, rozdílů v rozpustnosti nebo jakéhokoliv jiného obvyklého postupu pro čištění bílkovin. Funkční vlastnosti je možno hodnotit jakoukoliv vhodnou metodou včetně

-16CZ 286015 B6 použití ganglií dorsálních míšních kořenů kuřete, ganglií hlavové části nervové soustavy nebo neuronů ganglií sympatiku.

5.4. Stanovení biologické účinnosti NT-3

Ke stanovení je možno užít jakéhokoliv systému, který dovoluje kvalitativně nebo kvantitativně stanovit účinnost NT-3. Vzhledem ktomu, že NT-3 na rozdíl od BDNF a NGF vyvolává růst neuronů ganglion nodosum z hlavové části i z ganglií sympatiku, je možno užít kterýkoliv z uvedených systémů a mimoto ještě ganglia dorsálních kořenů (DRG) pro zjištění účinnosti této látky. Zkouška na DRG může být prováděna způsobem podle publikace Barde a další, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:1199-1203. Při použití ganglion nodosum je možno postupovat podle publikace Lindsay a další, Dev. Biol. 112: 319-328. Při použití ganglií sympatiku je možno postupovat podle publikace Barde a další 1982, EMBO J. 1: 549-553.

5.5 Geny pro NT-3 a jeho produkty

Při použití postupů které byly podrobně vysvětleny v příkladech 6 a 7 je možno stanovit řetězce následujících nukleových kyselin a od nich odvozené řetězce aminokyselin. Jde o řetězec pro NT-3 v genomu myši, tak jak je znázorněn na obr. 2. Řetězec pro NT-3 krysy je znázorněn na obr. 7. Řetězec DNA pro NT-3 lidského genomu je znázorněn na obr. 11, kde je rovněž znázorněn analogický řetězec krysy. Podle vynálezu je možno užít kterýkoliv z těchto řetězců nebo jeho funkční ekvivalent. Mimoto se vynález týká genů pro NT-3 a odpovídajících bílkovin, tak, jak byly izolovány z buněk vepře, skotu, kočky, ptáků, koní nebo psů a také z primátů a jakýchkoliv dalších živočišných druhů, u nichž NT-3 existuje. Vynález se dále týká částí řetězců nukleových kyselin pro NT-3, pokud obsahují alespoň ty nukleotidy, které se nacházejí v hybridizovatelných částech řetězce NT-3 při použití například při hybridizaci nukleových kyselin, metodách Southem blot a Northem blot a podobně. Vynález se rovněž týká samotného NT-3, jeho fragmentů a derivátů s řetězci aminokyselin, tak, jak jsou znázorněny na obr. 2, 7 a 11 nebo funkčních ekvivalentů. Vynález se rovněž týká fragmentů nebo derivátů NT-3, které obsahují antigenní determinanty nebo které mají biologickou účinnost. Pod tímto pojmem se rozumí pozitivní účinek při zkouškách na známé funkce NT-3, tj. na DRG kuřecího embrya, na ganglion nodosum a na ganglia sympatiku.

Mimoto je možno řetězce nukleových kyselin, znázorněné na obr. 2, 7 a 11 modifikovat tak, že se provedou substituce, přidání nebo vypuštění za vzniku funkčně ekvivalentních molekul. Vzhledem k degeneraci genetického kódového řetězce je možno prakticky použít i jiné řetězce DNA, které jsou kódem pro v podstatě týž řetězec aminokyselin, tak, jak je znázorněn na obr. 2, 7 a 11. Může jít například o nukleotidové řetězce, které obsahují celý gen nebo části genu pro NT-3 z obr. 2, 7 a 11 se změnami, vyvolanými substitucí různých kodonů, které jsou kódem pro ekvivalentní zbytky aminokyselin v řetězci, takže vzniká tak zvaná tichá změna. Vynález zahrnuje rovněž NT-3, jeho fragmenty a jeho deriváty s primárním řetězcem aminokyselin z obr. 2, 7 a 11, avšak s pozměněným řetězcem, v němž jsou některé zbytky aminokyselin nahrazeny funkčně ekvivalentními zbytky za vzniku tiché změny. Je například možno nahradit jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin v řetězci jinými aminokyselinami se stejnou polaritou za vzniku tiché změny. Jako náhradu za některý zbytek aminokyseliny je nutno volit vždy zbytek aminokyseliny ze stejné skupiny. Například nepolárními (hydrofobními) aminokyselinami jsou alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Polární aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Aminokyseliny s pozitivním nábojem (bazické) jsou arginin, lysin a histidin. Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny jsou kyselina asparagová a glutamová. Vynález se rovněž týká NT-3 a jeho fragmentů a derivátů, které byly v průběhu translace nebo po ní různě modifikovány například glykosylací, proteolytickým štěpením, vazbou na molekulu protilátky nebo jiného buněčného ligandu a podobně.

-17CZ 286015 B6

Mimoto může být daný NT-3 mutován in vitro nebo in vivo k vytvoření nebo zamezení translačních, iniciačních a/nebo terminačních řetězců nebo k vytvoření variací kódového řetězce a/nebo k tvorbě nových míst působení restrikčních endonukleáz nebo k odstranění míst již existujících, usnadnění dalších modifikací in vitro. Jakoukoliv metodu mutageneze je možno v těchto případech užít, například může jít o mutagenezu, cílenou na určité místo podle publikace Hutchinson a další, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551, dále může jít o použití TAB^R-vazných řetězců (Pharmacia) apod.

5.6. Tvorba protilátek proti NT-3

Podle vynálezu je možno užít NT-3, jeho fragmenty nebo jeho deriváty jako imunogenní látky k vyvolání tvorby protilátek proti NT-3.

Aby bylo možno zvýšit pravděpodobnost tvorby imunologické odpovědi na podání NT-3, je možno analyzovat řetězec aminokyselin této látky k identifikaci částí molekuly, které mohou být spojeny se zvýšenou imunogenitou. Je například možno podrobit řetězec aminokyselin analýze na počítači k identifikaci povrchových epitopů způsobem podle publikace Hopp a Woods, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78:3824-3828, tento postup byl úspěšně použit k identifikaci antigenních peptidů povrchového antigenů viru hepatitidy B. Je také možno srovnávat dedukované řetězce aminokyselin pro NT-3 z různých druhů a identifikovat relativně nehomologní oblasti, tyto oblasti totiž budou pravděpodobně imunogenní u různých druhů.

Pro přípravu monoklonálních protilátek proti NT-3 je možno užít jakýkoliv postup pro produkci protilátek kontinuální buněčnou linií v kultuře. Může být užita například technika s použitím hybridomu, původně publikovaná v Kohler a Milstein, 1975, Nátuře 256: 495—497 nebo technika triomu, lidského hybridomu buněk B (Kozbor a další, 1983, Immunology Today 4: 72) a technika s použitím EBV-hybridomu k tvorbě lidských monoklonálních protilátek (Cole a další, 1985, „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy“, Alan R. Liss, lne., str. 77-96) a další postupy, které rovněž spadají do oboru vynálezu.

Monoklonální protilátky pro léčebné použití mohou být lidské monoklonální protilátky nebo chimémí protilátky člověk-myš (nebo jiný druh). Lidské monoklonální protilátky je možno získat řadou způsobů, které jsou v oboru známy (Teng a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:7308-7312, Kozbor a další, Immunology Today 4: 72-79, Olsson a další, 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Chimémí molekuly protilátek je možno připravit tak, aby obsahovaly myší antigen, vázaný na lidskou konstantní oblast (Morrison a další, 1984, proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851, Takeda a další, 1985, Nátuře 314:452).

Pro tvorbu monoklonálních protilátek proti epitopům NT-3 je možno užít různých postupů. Ke tvorbě protilátky je možno imunizovat různé živočichy injekcí NT-3, může jít například o králíky, myši, krysy apod. Je také možno užít různých pomocných látek ke zvýšení imunologické odpovědi v závislosti na živočišném druhu, může jít například o Freundovo úplné nebo neúplné pomocné činidlo, o minerální gely, jako hydroxid hlinitý, smáčedla jako lysolecithin, polyoly typu pluronic, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemocyaniny, dinitrofenol a potenciálně účinné pomocné látky lidského původu jako BCG (Bacillus CalmetteGuérin) a Corynebacterium parvum.

Molekulární klon protilátky proti NT-3-epitopu je možno připravit známým způsobem. Je možno užít postupů s využitím rekombinantní DNA (Maniatis a další, 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, New York) ke konstrukci řetězců nukleových kyselin, které jsou kódem pro molekulu monoklonální protilátky nebo pro její oblast pro vazbu antigenů.

-18CZ 286015 B6

Molekuly protilátek je možno čistit známými postupy, jako immunoabsorpcí nebo imunoafinitní chromatografií, dalšími chromatografíckými postupy jako je vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) nebo kombinace těchto postupů apod.

Fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp molekuly je možno také získat známými postupy. Těmito fragmenty jsou například: fragment F(ab')₂, který je možno získat štěpením molekuly protilátky působením pepsinu, fragmenty Fab', které je možno vytvořit redukcí disulfídových můstků ve fragmentu F(ab')₂ a fragmenty 2 Fab nebo Fab, které je možno získat tak, že se na molekulu protilátky působí papainem a redukčním činidlem.

Využití vynálezu (5.7)

Vynález se týká řetězce nukleových kyselin pro NT-3, čistého NT-3, jeho fragmentů nebo jeho derivátů. NT-3 je možno získat v množství, dostatečném pro diagnostické a léčebné použití. Protilátky proti NT-3 a nukleové kyseliny jako sondy je rovněž možno užít k diagnostickým i léčebným účelům. Pro většinu účelů je výhodné užít geny pro NT-3 nebo produkty genů z téhož druhu, přestože může být vhodné i využití NT-3 z jiného druhu v některých specifických provedeních.

5.7.1. Diagnostické aplikace

Vynález, který se týká nukleových kyselin, které jsou kódem pro NT-3, čistého NT-3, jeho fragmentů a jeho derivátů a také protilátek proti NT-3, jeho fragmentům a jeho derivátům je možno využít k diagnóze onemocnění a poruch nervového systému, které mohou být spojeny s poruchami exprese této látky.

V různých provedeních vynálezu je možno užít NT-3, geny pro NT-3 a příbuzné řetězce nukleových kyselin i části těchto řetězců a příbuzné řetězce včetně řetězců komplementárních k diagnostickým hybridizačním zkouškám. Řetězce nukleových kyselin pro NT-3 nebo části těchto řetězců s obsahem přibližně 15 nukleotidů je možno užít jako hybridizační sondy. Hybridizační zkoušky je možno použít ke zjištění, prognóze, diagnóze, zjištění stavu, poruchy nebo pokročilosti onemocnění, spojeného se změnami v expresi NT-3 včetně například stavů, které jsou výsledkem poškození sensorických neuronů. Tyto nemoci a stavy zahrnují například poškození CNS, infarkt, infekce, degenerativní nervová onemocnění, zhoubná onemocnění, postoperativní změny, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu nebo Huntingtonovu chorobu. Je například možno zkoumat vzorek úplné RNA ve vzorku tkáně nemocného na přítomnost mRNA pro NT-3, přičemž zjištěná změna v množství mRNA pro NT-3 je ukazatelem degenerace neuronů.

V dalších různých provedeních vynálezu je možno užít protilátky proti NT-3, jeho peptidovým fragmentům, nebo jeho derivátům k diagnóze onemocnění a poruch nervového systému, včetně sensorických poruch a degenerativních chorob sítnice, stejně jako k diagnóze svrchu uvedených onemocnění. Protilátky podle vynálezu je možno například užít při hybridizačních postupech in šitu při použití vzorků tkání z nemocného, u nějž je toto vyšetření nutno provést. Dalším příkladem je možné použití protilátek podle vynálezu při zkoušce ELIS A k detekci a/nebo kvantitativnímu stanovení množství NT-3 ve tkáních nebo vzorcích tělesných tekutin. Podobně je možno protilátky podle vynálezu využít při zkoušce Western blot k detekci a/nebo kvantitativnímu stanovení NT-3 ve tkáních nebo ve vzorcích tekutiny.

V dalších provedeních vynálezu je možno použít NT-3, jeho peptidové fragmenty nebo deriváty k diagnóze onemocnění a poruch nervového systému. Ve zvláštním provedení je možno použít NT-3 nebo jeho peptidové fragmenty k identifikaci tkání nebo buněk, u nichž dochází k expresi receptoru NT-3, aby bylo možno identifikovat aberance v expresi tohoto receptoru a v důsledku toho i potenciální abnormality tkáňové nebo buněčné odpovědi na NT-3.

-19CZ 286015 B6

5.7.2 Léčebné použití

Vynález, který se týká nukleových kyselin, které jsou kódem pro NT-3, jeho peptidových fragmentů nebo jeho derivátů a také protilátek proti NT-3, jeho peptidovým fragmentům nebo jeho derivátům je možno využít k léčbě onemocnění a poruch nervového systému, spojených s poruchami exprese NT-3 nebo které by bylo možno příznivě ovlivnit přívodem NT-3 nebo protilátek proti NT-3.

V různých provedeních vynálezu je možno podávat NT-3, jeho peptidové fragmenty nebo jeho deriváty nemocným, jejichž nervový systém byl porušen úrazem, chirurgickým zákrokem, ischemií, metabolickou chorobou, nedostatky ve výživě, zhoubným onemocněním nebo toxickými látkami. V různých specifických provedeních je možno NT-3 podávat místně na sensorické neurony, které jsou porušeny, jde například o neurony dorsálních ganglií míšních kořenů nebo o jakoukoliv z následujících tkání: ganglion geniculatum, petrosum nebo nodosum, vestibuloakustický komplex VIII hlavového nervu, ventrolaterální pól maxillo-mandibulámího laloku ganglia trojklanného nervu, mesencephalické jádro pro trigeminus a ganglia sympatiku. Může být žádoucí podat NT-3 nebo příbuzné peptidy vstřebáním z membrány, na niž jsou adsorbovány, může jít například o silastickou membránu, kterou je možno implantovat do blízkosti poškozeného nervu. Vynález je možno užít i k urychlení rekonvalescence nemocných s diabetickými neuropatiemi, jako je mononeuropatie multiplex a diabetická periferní neuropatie.

Kromě diabetické neuropatie je možno užít NT-3 nebo příbuzné peptidy k léčbě jiných periferních neuropatií, například následujících onemocnění: Neuropatie, spojené s infekcí viry včetně AIDS a s ní spojenou neuropatií, infekční mononukleóza s polyneuritidou, virová hepatitis s polyneuritidou, syndrom Guillian-Barre, Neuropathie, související s botulismem, toxická neuropatie včetně neuropatie, způsobené otravou olovem a alkoholem, neuropatie na základě chybné výživy včetně subakutní kombinované degenerace, angiopatická neuropatie včetně neuropatie u systemického lupus erythematosus, neuropatie spojená se sarkoidózou, neuropatie spojená s karcinomem, kompresivní neuropatie, například syndrom karpálního kanálu a hereditámí neuropatie. Z hereditámích neuropatií, které je možno léčit podáváním NT-3 nebo příbuzných bílkovin je možno uvést svalovou atrofii m. peroneus, familiární dysautomii a progresivní hypertrofickou neuropatií.

V dalším provedení vynálezu je možno užít bílkovinu NT-3, její peptidové fragmenty nebo deriváty k léčbě kongenitálních stavů nebo neurodegenerativních poruch jako jsou Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza a Huntingtonova chorea.

Ve specifickém provedení vynálezu je možno použít bílkovinu NT-3, její fragmenty nebo její deriváty ve spojení s chirurgickou implantací tkání při léčbě Alzheimerovy choroby a/nebo Parkinsonovy choroby. Jak bude dále uvedeno, podporuje NT-3 přežití dopaminergních neuronů. Vzhledem ktomu, že v případě Parkinsonovy choroby dochází ke zničení těchto neuronů, je možno užít NT-3 při léčbě Parkinsonovy choroby tak, že se nemocným podá účinné množství NT-3. Bylo prokázáno, že přibližně 35 % nemocných s Parkinsonovou chorobou trpí rovněž Alzheimerovou demencí, v tomto případě může NT-3 příznivě ovlivnit obě choroby. Podobně je možno NT-3 užít u Alzheimerovy choroby ve spojení s Downovým syndromem. Mimoto, jak bude dále uvedeno, dochází k expresi NT-3 ve velkém množství v průběhu vývoje a diferenciace nervového systému, je tedy možno tuto látku užít při léčbě poruch vývoje nervového systému, například u Downova syndromu a také při léčbě poruch, spojených s dediferenciací buněk, jako jsou zhoubné choroby, nebo v případě poruch, u nichž by bylo možno dosáhnout jejich příznivého ovlivnění při regeneraci nervového systému. NT-3, získaný způsobem podle vynálezu je možno užít při léčbě různých demencí a kongentiálních poruch paměti.

-20CZ 286015 B6

V dalších provedeních vynálezu je možno použít bílkovinu NT-3, její fragmenty nebo její deriváty ve spojení s dalšími cytokiny k dosažení požadovaného neurotrofního účinku. Například je možno NT-3, získaný způsobem podle vynálezu užít spolu s další látkou, například NGF nebo BDNF k dosažení synergního stimulačního účinku na růst neuronů a/nebo k udržení přežití a/nebo regenerace nebo návratu funkce těchto buněk tam, kde může dojít k synergnímu účinku kombinace NT-3, jeho derivátů nebo jeho fragmentů a další látky ve srovnání s účinkem, jehož je možno dosáhnout při použití pouze jedné z těchto látek. Je pravděpodobné, že NT-3 může působit synergně s dalšími, od CNS odvozenými faktory typu peptidů, které dosud nejsou plně charakterizovány a tak příznivě ovlivnit růst, vývoj a udržení diferencované funkce široké škály subpopulací buněk v centrálním nervovém systému. Může také docházet k adici účinku mezi NT-3 a druhým neurotrofním faktorem.

Je dále pravděpodobné, že bude možné vyvinout na základě plné charakterizace molekuly NT-3, jejích peptidových fragmentů a jejich derivátů nebo mutant nové peptidy, které budou schopny antagonizovat alespoň některé nebo všechny účinky NT-3. Tyto antagonisty NT-3 by pak bylo možné použít při selektivní ablaci sensorických neuronů, například při léčbě chronických bolestivých syndromů.

V ještě dalších provedeních vynálezu je možno podávat protilátky proti bílkovině NT-3, peptidovým fragmentům této látky nebo jejím derivátům nemocným, trpícím různými nervovými poruchami nebo chorobami, které lze příznivě ovlivnit podáváním těchto látek. Může být například zapotřebí podávat tyto protilátky nemocným s příliš vysokou tvorbou NT-3. Tyto protilátky by mělo být možné použít při aberantní regeneraci sensorických neuronů, například pooperativních, nebo jak již bylo svrchu uvedeno, při chronických bolestivých syndromech.

Distribuce NT-3 v tkáních, jak již bylo svrchu popsáno ukazuje, že k vyšší expresi mRNA pro tuto látku dochází v mozku, ledvinách, srdci a slezině. NT-3, produkovaný v tkáních, odlišných od nervových tkání může, ale nemusí být totožný s látkou, produkovanou v mozku. Poruchy, spojené s poruchami exprese NT-3 mohou proto postihnout jak nervový systém, tak i jiné orgány. Je také možné, že blízce příbuzné látky ze skupiny molekul NT-3 mohou svou úlohu v nervových i jiných tkáních vzájemně alespoň částečně nahradit. NT-3 podle vynálezu by tedy bylo možné použít při léčbě chorob, postihujících nervovou tkáň i regulaci jiných tkání, zejména srdce, krvetvorných orgánů, ledvin a retikuloendotheliálního systému.

Mimoto, jak již bylo svrchu uvedeno, je exprese NT-3 zvýšena u nedospělých živočichů ve srovnání s živočichy dospělými. Podle vynálezu by mělo být možno užít NT-3 zvláště při poruchách vývoje nebo také při dosahování regenerace nervového systému po poškození CNS.

5.8. Farmaceutické prostředky

Účinné látky podle vynálezu, které mohou zahrnovat celý produkt genu pro NT-3 nebo jeho část včetně peptidových fragmentů a derivátů nebo protilátky proti NT-3 nebo jejich fragmenty nebo protilátky proti fragmentům nebo derivátům této látky, nebo kombinace NT-3 a alespoň jedné další látky, jako NGF nebo BDNF je možno podávat vjakémkoliv sterilním, biologicky kompatibilním nosiči pro farmaceutické účely, například ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, popřípadě s pufrem, v dextróze nebo ve vodě.

Bílkovina NT-3, její peptidové fragmenty nebo její deriváty mohou obsahovat řetězec aminokyselin nebo část tohoto řetězce, tak jak je znázorněn na obr. 2, 7 nebo 11, s výhodou obsahují tyto látky celý řetězec nebo část řetězce v rozsahu aminokyselin 140 až 258, jak je znázorněn na obr. 2, od aminokyseliny 1 do 119 na obr. 7 nebo od první aminokyseliny označené „mature“ na obr. 11 až do konce znázorněného peptidového řetězce, nebo funkční ekvivalent tohoto řetězce s funkční částí molekuly NT-3. NT-3 je možno odvodit od řetězců, odpoví

-21 CZ 286015 B6 dajících genu NT-3 různých druhů živočichů, včetně například člověka, vepře, krysy, kuřete, krávy, psa, ovce, kozy, kočky, králíka apod.

Množství bílkoviny NT-3, jejích peptidových fragmentů, derivátů nebo protilátek proti uvedeným látkám, které by byly účinné proti určité chorobě nebo poruše bude záviset na povaze poruchy nebo stavu aje možno je stanovit běžnými klinickými pokusy. Tam, kde je to možné, je vždy žádoucí stanovit křivku závislosti účinku na dávce nejprve in vitro, například biologickým postupem popsaným svrchu a pak na vhodném živočišném modelu před prováděním klinických zkoušek. V závislosti na hodnotách, získaným in vitro je pak možno při použití vhodného farmaceutického prostředku dosáhnout účinné místní koncentrace NT-3 v rozmezí 0,1 až 10 pg/ml.

Uvedené farmaceutické prostředky je možno podávat intradermálně, nitrosvalově, intraperitoneálně, nitrožilně, podkožně, perorálně a intranasálně. Mimoto může být žádoucí přivádět farmaceutický prostředek podle vynálezu přímo do nervového systému jakýmkoliv vhodným způsobem, včetně injekcí do mozkových komor nebo intrathekálních injekcí. Injekci do komor je možno uskutečnit například pomocí kathetru, spojeného se zásobníkem, (například Ommayovým zásobníkem).

Mimoto může být žádoucí podávat farmaceutický prostředek podle vynálezu místně do oblasti, kde je zapotřebí dosáhnout vyšší koncentrace, například lokální infuzí v průběhu chirurgického zákroku, injekcí, například při použití kathetru nebo pomocí implantátu, který může být porézní, neporézní nebo želatinové povahy včetně membrán, jako je sialastická membrána nebo může mít implantát také tvar vláken.

Podstatu vynálezu rovněž tvoří farmaceutické prostředky s obsahem bílkoviny NT-3, jejích peptidových fragmentů nebo jejích derivátů, podávaných přes liposomy, ve formě mikročástic nebo mikrokapslí. V různých provedeních vynálezu může být vhodné použít takové prostředky k dosažení zpomaleného uvolňování NT-3 nebo příbuzných látek.

Je pravděpodobné, že může být vhodné přivádět do oblastí, v nichž by mělo být dosaženo vyšší nebo nižší koncentrace NT-3 přímo buňky, aktivně produkující NT-3, příbuzné látky, antagonisty NT-3 nebo protilátky proti NT-3.

6. Příklad: Klonování a charakterizace genu pro NT-3 myši

6.1. Materiál a metody

6.1.1. Reakce s použitím polymerázy

Byly syntetizovány dva oligonukleotidové primery na bázi dvou řetězců aminokyselin, uchovávaných v BDNF a všech známých typech NGF (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149152). Řetězec primeru, souhlasného se smyslem řetězce (nebo 5') bal GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GA (primer 1 podle nomenklatury IUPAC, I = inosin) a obsahuje místa působení enzymů BamHI a SacII, řetězec primeru proti smyslu řetězce (nebo 3') byl TCGAATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCA a zahrnoval místa působení enzymů EcoRI a Xbal (primer 2). PCR (Saiki a další 1985, Science 230:1350-1354) byla prováděna při použití 1 pg DNA myšího genomu při použití termálního cyklického zařízení Perkin-Elmer Cetur a Taq-polymerázy (Gen Amp™). Po čtyřech cyklech při teplotě až 45 °C byly zbývající cykly (celkem 36) prováděny při teplotě až 49 °C. Výsledné amplifikované produkty DNA, odpovídající očekávané délce 137 párů bází byly izolovány vymytím z akrylamidového gelu, reamplifikovány a pak rozštěpeny enzymy Hindi! a Apal, první z nich štěpí NGF myši a druhý BDNF myši. Nerozštěpená DNA byla vymyta a asymetricky amplifikována (Innis a další, 1988,

-22CZ 286015 B6

Proč. Nati. Acad. Sci USA 85: 9436-9440) a byl stanoven její řetězec (Sanger a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci USA 72: 3918-3921) při použití primerů 1 a 2. Na základě takto získaného řetězce pak byly syntetizovány další 2 primery ve smyslu řetězce, odpovídající nukleotidům 808822 (primer 3) a 824-844 (primer 4) s přidanými místy působení enzymů Sal I a Pst I. RNA byla extrahována z mozku dospělých myší, z myších jater a svalů (Okayama a další, 1987, Methods Enzymology 154:2-28) a bylo užito její reverzní transkripce při použití primeru proti smyslu řetězce (5') CGGATCCGAATTCTGCAG(T)_]2 (primer 5), který byl konstruován tak, aby odpovídal 3'-poly(A)-zakončením a obsahoval místa klonování BamHI, EcoRl a Pstl (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-152). Tyto cDNA byly nejprve amplifikovány PCR při použití primerů 3 a 5 a pak reamplifíkovány při použití primerů 4 a 5. Na produktech, které jsou výsledkem této poslední reakce byla provedena analýza Southem blot a hybridizace oligonukleotidy, značenými na svých zakončeních ³²P a odpovídajícími nukleotidům 879-893. Takto identifikované fragmenty DNA byly klonovány ve vektoru Bluescript SK+ (Stratagene) a nejdelší včleněný řetězec, který byl získán (460 párů bází) byl užit k vyšetření sestavy genomu EMBL3 myši (Clontech). Byly nalezeny dva pozitivní klony a DNA jednoho žních byla rozštěpena různými restrikčními enzymy. K analýze restrikčních fragmentů byl užit včleněný řetězec o 460 bp. Řetězec o 770 bp (HindlII) a řetězec o 4000 bp (Hind III) byl subklonován v Bluescript SK+. Je znázorněn úplný řetězec HindlII, 3'- a 5'- prodloužený při užití fragmentu Pstl.

6.1.2. Analýza Northem blot

Celková RNA byla extrahována z dospělých samičích tkání (Okayama a další, 1987, Meth. Enzym. 154:3-28) a byla podrobena elektroforéze na agarozovém gelu s obsahem 1,3% formaldehydu (Hehrach a další, 1977, Biochem. 16:4743-4751). Pak byla RNA přenesena na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham) a hybridizována přes noc při teplotě 42 °C v 1 ml 200 mM fosforečnanu sodného o pH 7,2 s obsahem 40 % formamidu, 5 x Denhardtův roztok a 200 pg/ml denaturované DNA ze spermatu lososa. Jako sonda byla užita ³²P-značená sonda s dvojitým řetězcem (Feinberg a další, 1979, Anal. Biochem. 137:266-267), odpovídající nukleotidům 319-1093 (obr. 2). Specifická aktivita byla 1,3 x 10⁸ impulsů za minutu/pg, k hybridizačnímu pufru bylo přidáno 10⁷. Pak byl materiál promýván 60 minut při teplotě 60 °C v 0,1 x SSC s obsahem 0,5 % SDS. Filtry byly exponovány 5 dnů při teplotě -70 °C při použití zesilujících filtrů.

6.1.3 Exprese Neurotrofínu-3

Byly syntetizovány oligonukleotidové primery, odpovídající prvním 19 nukleotidům (plus místo působení enzymu EcoRl) a posledním 19 nukleotidům (plus místo působení enzymu Bam HI) na základě řetězce z obr. 2. Po PCR amplifikaci při použití popsaného (obr. 2) Pstl fragmentu genomu jako templátu byl výsledný produkt klonován v místě působení EcoRI-BamHI ve vektoru pro expresi pCMV (Anderson a další, 1989, J. Biol. Chem. 264:8222-8229). Nukleotidový řetězec včleněného řetězce NT-3 vpCMV byl stanoven. Buňky COS-1 byly podrobeny transfekci při použití fosforečnanu vápenatého (Chen a Okayawa, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752) a prostředí bylo odděleno svrchu popsaným způsobem (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-152). Použité kontrolní prostředí bylo získáno zpracováním buněk COS-1 působením fosforečnanu vápenatého nebo pomocí konstrukce pCMV/NT-3, v níž byl rozrušen stop-kodon NT-3. Žádné z prostředí nemělo biologickou účinnost při ředění 1:50. Ganglia nodosa byla disociována a neurony byly pěstovány na plotnách s 24 vyhloubeními (Linsay a další, Dev. Biol. 112: 319-328) a BDNF byl čištěn z mozku vepře (Hofer a Barde, 1988, Nátuře 331:261-262).

-23CZ 286015 B6

6.2. Výsledky a diskuse

Hlavním problémem při charakterizaci neurotrofních faktorů je jejich výskyt v nesmírně malém množství. Jak NGF, tak BDNF byly charakterizovány při použití čisticích postupů pro bílkoviny, založených na biologických zkouškách sledování jejich účinnosti (Cohen a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 46:302-311, Barde a další, 1982, EMBO J., 1:549-553). Tento postup byl možný v případě NGF vzhledem k tomu, že tato látka se vyskytuje ve vysokém množství u dospělých myších samců v podčelistní žláze, v případě BDNF se látka vyskytuje ve větším množství v mozku vepře. Totožnost různých úseků NGF a BDNF podporovala pravděpodobnost možnosti použití odlišné strategie než strategie, obvyklé pro geny (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341: 149-152). Podrobnější srovnání řetězce aminokyselin NGF a BDNF myši prokázalo existenci dvou řetězců o 6 aminokyselinách (na obr. 2 jsou podtrženy), které byly zvláště vhodné pro použití oligonukleotidových primerů při reakci PCR (Saiki a další, 1985, Science 230:13501354). Byl užit templát myšího genomu vzhledem ktomu, že v genech pro NGF a BDNF nepřerušují žádné introny exon, který je kódem pro biologicky účinnou bílkovinu. Tímto postupem bylo dosaženo očekávané amplifikace řetězců pro NGF a BDNF a pak bylo užito štěpení při použití vhodných restrikčních enzymů. Byl analyzován řetězec fragmentu DNA, který zůstal neporušený, tento řetězec neodpovídal ani NGF, ani BDNF. Byly syntetizovány dva specifické primery ve smyslu řetězce (nebo 5) pro další PCR při použití komplementární DNA, připravené reverzní transkripcí RNA, extrahované z mozku myši, svalu a jater myši jako templátu a 3'-primer, konstruovaný tak, aby odpovídal řetězcům polyA (obr. 2). Uvedené tři tkáně poskytly amplifikované produkty přibližně stejných rozměrů, byly klonovány a použity k vyšetření sestavy myšího genomu. Jeden z klonů genomu, nalezený tímto způsobem byl užit k analýze řetězce (obr. 2). Podle otevřených řetězců je možno soudit na bílkovinu o 258 zbytcích aminokyselin (počínaje prvním zbytkem methioninu po třech stop kodonech, zařazených ve správném směru), tato bílkovina byla nazvána neurotrofin-3 (NT-3). V každém ohledu je struktura této bílkoviny obdobná struktuře NGF a BDNF. Signální řetězec o 18 zbytcích aminokyselin (s BDNF je totožných 5 a s NGF 9 aminokyselin) je následován předběžným řetězcem o 121 zbytcích. Takové řetězce, účastnící se pravděpodobně správné tvorby disulfidových můstků těchto bílkovin (Edwards a další, J. Biol. Chem. 263:6810-6815) byly nalezeny také v NGF myší, šlo o řetězce se 103 zbytky aminokyselin a v BDNF myši (112 zbytků). Jediné potenciální místo pro N-glykosylaci je uloženo 9 zbytků (ve srovnání s NGF a BDNF) před místem předpokládaného štěpení a je charakterizováno bazickými zbytky (na obr. 2 znázorněno šipkou). Úplný NT-3 je tvořen 119 zbytky aminokyselin (relativní molekulová hmotnost je 13 625 a pl je 9,3). Srovnání mezi úplným NGF, BDNF a NT-3 myši prokazuje totožnost 54 zbytků aminokyselin, jak je zřejmé z obr. 2. Všech 6 cysteinových zbytků, o nichž je známo, že v NGF a BDNF jsou účastny tvorby disulfídových můstků (Leibrock a další, Nátuře, 1989, 341:149-152, Angeletti, 1973, Biochemistry, 12:100-115) je mezi uchovanými zbytky, jak je na obr. 3 znázorněno šipkami. Při srovnání NT-3, BDNF a NGF je možno prokázat, že oproti zachovaným zbytkům v BDNF a NGF (61 totožných zbytků u myši) dochází ke ztrátě pouze 7 totožných zbytků. To znamená, že téměř 50 % primární struktury je zachováno, což je patrně nutné pro tvorbu základního trojrozměrného tvaru, který je společný všem třem bílkovinám. Mimoto při srovnání všech tří řetězců bylo možno prokázat čtyři variabilní oblasti, z nichž každá obsahovala 7 až 11 zbytků (VI až V4 na obr. 3), tyto oblasti jsou patrně příčinou specifičnosti látek pro neurony.

Aby bylo možno studovat expresi genu pro NT-3, byla extrahována RNA z různých tkání myši a byla analyzována sondou, specifickou pro NT-3 (obr. 4). Ve všech zkoumaných tkáních bylo možno nalézt jediný pás o velikosti 1,4 kb (obr. 4A). Avšak úroveň exprese těchto mRNA se podstatně mění. V mozku (obr. 4B) je možno prokázat význačné rozdíly v jednotlivých oblastech, nejvyšší úroveň mRNA bylo možno prokázat v mozečku a v hippocampu (obr. 4B). Tyto výsledky prokazují, že distribuce mRNA pro NT-3 ve tkáních dospělé myši je velmi odlišné od distribuce BDNF a NGF mRNA. Mimoto je možno mRNA pro BDNF nalézt převážně v mozku, zatímco mRNA pro NGF je jen velmi obtížné prokázat v některých tkáních

-24CZ 286015 B6 jako je kosterní sval nebo jatemí tkáň (Heumann a další, 1984, EMBO J. 3: 3183-3189). Je však zajímavé, že v hippocampu, o němž je známo, že vněm dochází k expresi mRNA pro NGF (Korsching a další, 1985, EMBO J., 4:1389-1393) dochází rovněž k expresi mRNA pro BDNF a NT-3, a to v daleko větší míře než ve většině ostatních oblastí mozku (obr. 4B).

Aby bylo možno zjistit, zda je NT-3 biologicky účinný a zda dochází kjeho sekreci, byl klonován úplný kódový řetězec pro tuto látku ve vektoru pro expresi (pCMV), užitém ktransfekci buněk COD opičích ledvin (obr. 5). Vzhledem ktomu, že mRNA pro NT-3 je možno nalézt v periferních tkáních byla pastována řada embryonálních kuřecích neuronů, o nichž je známo, že do těchto tkání zasahují a vyžadují trofické faktory pro své přežití. Bylo možno pozorovat, že motorické neurony, čištěné z míchy 6 dnů starých embryí (E6) (Dohrman a další, 1986, Dev. Biol. 118; 209-221), ciliámí neurony (E8) a disociované neurony sympatiku (El 1) nebyly schopny přežít za přítomnosti NT-3, avšak sensorické neurony, izolované z E8 primárních sensorických ganglií na přítomnost této látky odpovídaly. Jak je zřejmé z obr. 5, podporuje NT-3 přežití přibližně 30 % neuronů izolovaných z ganglion nodosum. Mimoto je tento účinek aditivní s účinkem BDNF, syntetizovaným v centrálních partiích a působícím na subpopulaci neuronů ganglion nodosum (Lindsay a další, 1985., Dev. Biol. 112-319-328) a kombinací obou faktorů je možno zajistit přežití většiny neuronů (90 %, obr. 5). Je nutno uvést, že mRNA pro NT-3 je možno nalézt ve viscerálních oblastech, které toto ganglion ovlivňuje včetně srdce, jater, střeva a plíce (obr. 4A). Populace sensorických neuronů, citlivých na NT-3 byly nalezeny také v E8 disociovaných dorsálních kořenech a v gangliích trigeminu a v explantátech E8 gangliích sympatiku. Zdá se tedy, že NT-3 je látkou s až dosud necharakterizovanou biologickou účinností v několika periferních tkáních včetně jater (Lindsay a Tarbit, Neuro Sci. Lett. 12:195-200) a kosterního svalu (Davies, 1986, Dev. Biol. 115: 56-67), o faktoru je známo, že podporuje přežití viscerálních a proprioceptivních sensorických neuronů, které neodpovídají na přítomnost NGF, přehled je možno nalézt v publikaci Davies, 1987, Development 101: 185-208.

Společným výsledkem těchto pokusů je zjištění, že NT-3 je neurotrofní faktor, který je svou strukturou i funkcí příbuzný NGF a BDNF, prvním dvěma objeveným neurotrofinům. Název neurotrofin (NT) je pro tuto skupinu látek navrhován jako analogie s interleukiny, aby bylo možno je číslovat v takovém pořadí, v jakém, byly objeveny.

7. Příklad: Klonování a charakterizace krysího genu pro neurotrofin-3

Homologie mezi NGF a BDNF bylo využito při konstrukci a klonování za účelem objevení dalších látek ze skupiny obdobných genů. Dále bude popsáno klonování třetí látky z uvedené skupiny, která byla označena NT-3. Tento nový faktor má odlišnou biologickou účinnost a odlišnou expresi v prostoru a čase ve srovnání s NGF a BDNF.

7.1. Materiály a metody

7.1.1. PCR-reakce

Byly syntetizovány oligonukleotidy s degenerovaným řetězcem, odpovídající čtyřem řetězcům bílkoviny, které jsou vysoce konzervovány mezi řetězci NGF a BDNF. Šlo o následující řetězce, které je možno nalézt na obr. 7D.

1) Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Val-Cys-Asp-Ser,

2) Lys-Gln-Tyr-Phe-(Tyr/phe)-Glu-Thr-Lys-Cys,

3) Gly-Cys-Arg-Ile-Asp a

4) T rp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-Thr-f Ser/Ala)-Cys-V al-Cy s.

-25CZ 286015 B6

Při PCR-reakcích byla užita celá řada oligonukleotidových řetězců ve smyslu i proti smyslu řetězce (s obsahem degenerované části o délce 15 až 26 nukleotidů, odpovídající 5 až 9 aminokyselinám příslušného bílkovinného řetězce ve směru nebo proti smyslu řetězce, jakož i nedegenerovaných „koncových“ míst působení restrikčních enzymů. Amplifikační reakce mezi páiy primerů ve smyslu a proti smyslu řetězce byly prováděny podle doporučení PerkinElmer/Cetus až na teplotu zahřívání při vazbě, koncentraci hořečnatých iontů a dobu provádění extenze, tyto parametry byly měněny k dosažení optimálních podmínek pro každý pár primerů. Přesný řetězec pro primer IB ve smyslu řetězce (kterýje kódem pro část bílkovinného řetězce 1) svrchu) byl 5'-GACTCGAGTCGACATCGGTN-TGY-GAY-WSN-RTN-WS-3' a řetězec primerů proti smyslu řetězce 2C, který odpovídá kodonům řetězce 2) svrchu byl 5CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3' (zkratky pro nukleotidy podle doporučení IUPAC). Následná analýza řetězce prokázala, že oligonukleotid IB měl ve srovnání s řetězcem NT-3 dva odlišné nukleotidy, zatímco řetězec 2C se lišil pouze jediným nukleotidem od řetězce NT-3. Radioaktivní značení PCR bylo provedeno podle doporučené amplifikace genu reakcí podle Perkin-Elmer/Cetus s následujícími modifikacemi:

až lOng tamplátu DNA v agaroze s nízkou teplotou tání bylo přidáno k reakční směsi, která obsahovala neznačený dATP, dGTP a dTTP v konečné koncentraci 50 pmol, dále 50 pCi alfa³²P-dCTP (3000 Ci/mmol) v 50 μΐ reakční směsi a reakční směs byla podrobena sedmi amplifikačním cyklům. Amplifikační primery byly totožné s degenerovanými primery, které byly použity při původní PCR-reakci.

7.1.2. Southem blot DNA krysího genomu při použití sondy pro NT-3

RlB/2C-produkt PCR byl získán amplifikací z DNA krysího genomu jako templátu při použití degenerovaných primerů IB a 2C, tak, jak byly svrchu popsány v odstavci 7.1.1. Produkt PCR, odvozený při použití degenerovaných primerů IB a 2C a označený R1B/2C pomohl zjistit nový gen, NT-3 a také prokázat geny NGF a BDNF v DNA krysího genomu. DNA byla připravena z jater Fischerových krys (Maniatis a další, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), rozštěpena enzymem EcoRI a 10 pg tohoto materiálu bylo podrobeno frakcionaci na 1% agarozovém gelu. Pak byla DNA přenesena na nitrocelulózu při použití 10 x SSC (Maniatis a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), hybridizována (Mahmoudi a Lin, 1989, Biotechniques 7:331-3) na ³²P-značený PCR-produkt R1B/2C při teplotě 60 °C, pak byl materiál promyt 2 x SSC/01% SDS při teplotě 65 °C. Byly prokázány pásy pro NT-3, NGF a BDNF, polohy pásů pro NGF a BDNF byly již dříve stanoveny při použití specifických sond. Rozměry jsou uvedeny v kb na levé straně.

7.1.3. Exprese Neurotrofinu-3

Konstrukce pro expresi krysího NT-3 byla získána při použití PCR k amplifikací kódové oblasti předpokládaného krátkého prekurzoru NT-3 z plasmidu s obsahem fragmentu krysího genomu o 3,2 kb s místem působení Sstl (obr. 6B), fragment zahrnuje gen pro NT-3. Oligonukleotidy, použité při PCR-reakci obsahovaly syntetické místo působení Xhol na svém zakončení, tak aby bylo možno uložit amplifikovanou kódovou oblast uložit do místa působení enzymu Xhol ve vazném řetězci vektoru pro expresi pCDM8 (Seed, 1987, Nátuře 329: 840-842). Oligonukleotidem, který byl použit pro amplifikace kódové oblasti krysího genu pro NT-3 byl primer ve smyslu kódového řetězce 5'-CGGTACCCTCGAGCCACCATGTCCATCTTGTTTTATGTG-3' (podtržený kodon ATG odpovídá iniciačnímu kodonů startu „B“, přičemž řetězec směrem dolů od ATG přesně odpovídá řetězci pro NT-3, směrem vzhůru od ATG primer obsahuje syntetické místo působení enzymu Xhol), primerem proti smyslu kódového řetězce by primer 5'-CGGTACCCTCGAGATGCCAATTCATGTTCTTCCG-3' (podtržený triplet je komplementární k terminačnímu kodonů pro gen NT-3, za tímto tripletem bezprostředně následuje přesný

-26CZ 286015 B6 řetězec NT-3 proti smyslu řetězce, na konci primerů je zařazeno místo působení enzymu Xho’ na 5-zakončení). Výsledný plasmid pro expresi krysího NT-3 byl označen pC8-rN3(P i Podobný způsob byl již dříve použit pro uložení kódových oblastí pro krysí NGF a BDNF ť místa působení enzymu Xhol v tomtéž vektoru pCDM8. Konstrukce pro NT-3, NGF a BDN ; byly užity pro transfekci podle publikace Okayama a Berg, 1982, Mol. Cell Biol. 5:1136-42 buněk COS-M5 a tyto buňky byly pak užity k naočkování ploten o průměru 60 mm v množství 5 x 10⁵ buněk na plotnu a pak byly pěstovány v 2,5 ml Eaglova prostředí podle Dulbeccovy modifikace s obsahem vysokého množství glukózy (4500 mg/ml) a 10% fetálního séra skotu. Supematanty byly odděleny 72 hodin po transfekci.

7.2 Výsledky

7.2.1. Klonování genu pro neurotrofin-3

Použitím různých párů degenerovaných oligonukleotidů byly získány amplifikační produkty očekávané velikosti, tak jak bylo předpokládáno podle řetězců NGF a BDNF. Tyto produkty byly nejprve podrobeny analýze působením restrikčních enzymů ke stanovení relativního obsahu NGF, BDNF nebo nových řetězců. Ve všech případech bylo možno prokázat fragmenty, které odpovídaly pouze NGF a BDNF pomocí barvení ethidiumbromidem. Avšak při použití týči) PCR-produktů jako hybridizačních sond při zkoušce Southem blot na DNA krysího genom; bylo možno prokázat, že jeden z produktů (označený R1B/2C, jak je zřejmé z obr. 6Á). identifikuje nový řetězec DNA genomu mimo NGF a BDNF. Tímto způsobem bylo možno metodou Southem blot na PCR-produktech identifikovat vzácně se vyskytující amplifikované řetězce, které jinak není možné prokázat. Sondou R1B/2C bylo možno prokázat i nové řetězec v DNA genomu vývojově divergentních druhů (včetně člověka, myši, kuřete a Xenopus), takže se zdá, že sonda identifikuje funkční gen.

Aby bylo možno tento gen izolovat, byla užita sonda R1B/2C a sondy, specifické pro NGF a BDNF (Maniatis a další, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manula, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), dále sestava DNA genomu krysy (Clontech Laboratories lne.. Palo Alto, CA), připravená z DNA krys kmene Sprague-Dawley, částečně rozštěpená Sau3Arestrikční endonukleázou a klonovaná ve vektoru bakteriofágu EMBL3/SP6/T7. Byly prokázány dva nezávislé klony bakteriofágu, které hybridizovaly se sondou R1B/2C, avšak nikoliv s ostatními dvěma sondami. V případě, že byla provedena analýza míst působení restrikčních enzymů ve včleněných řetězcích krysího genomu v těchto klonech, bylo možno prokázat, / odpovídají témuž genu, jak je zřejmé z obr. 6B. Klon bakteriofágu s nejdelším včleněným řetězcem byl označen rN3(Gl). Analýzou řetězce bylo možno prokázat, že gen, identifikovaný pomocí R1B/2C je kódem pro novou sloučeninu ze skupiny NGF/BDNF (obr. 7), látka byla pojmenována neurotrofin-3.

7.2.2. Analýza řetězce úplného neurotrofinu-3

Analýza řetězce byla prováděna dideoxynukleotidovou metodou (Sanger a další, 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463-7) při použití sestavy SEQUENASE Version 2,0 (United States Biochemical Corporation) při provádění reakcí podle doporučení výrobce.

NGF má dvě odlišné formy prekurzoru, a to „dlouhou“ (začínající v místě „A“) a krátkou (začínající v místě „B“), oba prekurzoiy se od sebe liší délkou svého N-terminálního řetězce (Darling a další, 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1: 427-34; Selby a další, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3057-64; Edwards a další, 1988. Mol. Cell Biol. 8:2456-64). Dlouhý i krátký prekurzor je možno proteolyticky štěpit za získání úplného NGF, který tvoří v podstatě 120 karboxyterminálních zbytků aminokyselin v obou prekurzorech. Také BDNF má podobné krátké a dlouhé formy prekurzorů.

-27CZ 286015 B6

Analýza řetězce NGF z několika druhů prokázala, že většina přídatných N-terminálních řetězců se nachází na samostatných exonech s výjimkou čtyř kodonů (Val-His-Ser-Val), které jsou zahrnuty na 5'-zakončení axonů, který je kódem pro celý krátký (začátek v místě ,3“) prekurzoru. Již dříve bylo uvedeno, že dva z uvedených čtyř kodonů (Val-X-X_Val) a také místo štěpení, které je předchází je uchováváno těsně ve směru řetězce za uchovávaným počátkem „B“ v genech pro BDNF z několika druhů živočichů. Tento objev vedl k předpokladu, že existují krátké a dlouhé formy prekurzoru BDNF. Existuje konzervace kodonů Val-X-X-Val, místo štěpení pro akceptor. V kiysím genu NT-3 jsou tato místa spolu s předpokládanou hranicí intronu znázorněna na obr. 7A. Analýza řetězce umožnila předpovědět existenci kódových exonů ve směru řetězce pro gen NT-3 tak, že vzniká kód pro delší prekurzor. Průkaz konzervovaného řetězce ve směru řetězce od putativního počátku „A“ pro NT-3 dále zesiluje předpoklad existence dlouhého prekurzoru pro BDNF a podporuje názor na vývojově uchovávanou úlohu tohoto dlouhého prekurzoru u všech látek, které náleží do skupiny NGF. Předpokládané Nterminální zakončení pro úplný NT-3 následuje za obvyklým místem štěpení pro proteázu (ArgArg-Lys-Arg), které je velmi podobné místům v NGF a BDNF, jak je znázorněno na obr. 7A a 7C. U některých druhů jsou dvě C-terminální aminokyseliny NGF rovněž proteolyticky odstraňovány. Na rozdíl od NGF nemá NT-3 krysy zřetelné potenciální místo štěpení na svém C. terminálním zakončení (obr. 7A, 7C) a tedy patrně, stejně jako v případě BDNF u všech dosud vyšetřených druhů tedy nedochází k proteolytické modifikaci na C-terminálním zakončení NT3.

Na základě těchto úvah je předpokládaná délka úplného polypeptidu NT-3 celkem 119 zbytků aminokyselin, vypočítaná hodnota pí je přibližně 9,5. Pokud jde o rozměr a o náboj je tedy NT-3 velmi blízce příbuzný NGF a BDNF. Sedm N-terminálních zbytků aminokyselin úplného NT-3 se zcela liší od NGF a BDNF. Počínaje osmou aminokyselinou v úplném NT-3 se dosahuje optimálního souladu za vypuštění jediného místa s dvěma aminokyselinami vzhledem k BDNF a jediného přidání jednoho zbytku aminokyseliny vzhledem kNGF, jak je zřejmé z obr. 7D. Úplný NT-3 krysy má 57% homologii zbytků aminokyselin s krysím NGF a 58% homologii s krysím BDNF. 57 ze 120 zbytků (48 %) je společných všem třem bílkovinám (obr. 2D). Šest cysteinových zbytků v NGF a BDNF je naprosto uchováno také v NT-3, oblasti největší homologie mezi všemi třemi bílkovinami jsou v podstatě nahuštěny kolem těchto cysteinových zbytků.

7.2.3. Analýza prekurzorů neurotrofínu-3

Těsně za předpokládaným místem štěpení, které uvolňuje úplný NT-3 je univerzální místo pro glykosylaci, znázorněné na obr. 7A a 7C (Asn-X-Thr/Ser), které je možno nalézt ve stejné poloze také v NGF a BDNF (Ullrich a další, 1983, Nátuře 303: 821-5, Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-52). Zatím není známo, zda toto místo pro glykosylaci hraje nějakou úlohu při zpracovávání NT-3, NGF nebo BDNF v jejich prekurzorech.

Další srovnání řetězce NT-3 s řetězci NGF a BDNF odhalí dvě oblasti homologie aminokyselin směrem vzhůru v řetězci úplného NT-3 (oblasti I a II v obr. 7B a 7C). Oblast homologie I vede k předpovědi existence místa počátku „B“ v NT-3 krysy (tak jak bylo svrchu definováno pro NGF), toto místo by pravděpodobně dávalo vznik krátkému prekurzoru o 258 aminokyselinách, podobně jako je tomu v případě krátkého prekurzoru pro NGF (241 aminokyselin (a pro BDNF (249 aminokyselin). Jsou uchovány methioninový iniciační kodon, sekretorický signální řetězec a místo odštěpení signálního řetězce pro krátký prekurzor, a to ve všech třech faktorech (Obr. 7C). Vzhledem k tomu, že místo homologie I je směrem vzhůru od místa počátku „B“, je možno předpovědět také existenci dlouhého prekurzoru pro NT-3, jehož začátek by byl v místě „A“ (Obr. 7A, 7B a 7C). Jak bylo prokázáno pro NGF (Ultich a další, 1983, Nátuře 303: 821-5, Selby a další, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 3057-64) a předpokládáno pro BDNF, takové místo počátku by pravděpodobně bylo zakódováno v přídatných exonech směrem vzhůru od exonu, který je kódem pro celý krátký prekurzor.

-28CZ 286015 B6

Mimo oblastí homologie I a II prokazuje srovnání hydrofilnosti pro NT-3, NGF a BDNF podobnost struktury v prekurzorech směrem vzhůru od úplných produktů.

7.2.4. Neurotrofní účinnost neurotrofmu-3

Překvapující homologie mezi NT-3, NGF a BDNF vzbuzuje silný dojem, že by NT-3 měl mít neurotrofní účinnost. Jak NGF, tak BDNF mohou vyvolat přežití vybraných populací periferního a centrálního nervového systému in vivo i in vitro (souhrnná publikace: Whitemore a Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12: 439-64; Lindsay, 1988, „Making of the nervous systém“, str, 149— 165; Davies, 1988, Trends Genet. 4:139-43). Například přidání kteréhokoliv z těchto faktorů k vyvíjejícím se embryím ptáků může zabránit přirozeně se vyskytujícímu uhynutí neuronů ve specifických periferních gangliích (Hoffer a Barde, Nátuře 331:261-2). V případě přidání k explantovaným gangliím vyvolávají NGF a BDNF růst neuronů (Davies a další, 1986, J. Neurosci. 6: 1897-904). V případě přidání těchto látek do kultury disociovaných neuronů ganglií podporují tyto látky přežití a diferenciaci neuronů (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319-28). Tyto pokusy in vitro při použití několika typů kuřecích periferních ganglií byly užity k rozlišení mezi neurotrofním účinkem NGF a BDNF. Oba faktory působí na populaci sensorických neuronů v dorsálních kořenových gangliích (DRG), odvozených od dorsální rýhy, avšak pouze BDNF podporuje přežití sensorických neuronů ganglion nodosum (NG), odvozeného od hlavové části (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319-28). Naopak NGF a nikoliv BDNF podporuje přežití a růst neuronů paravertebrálního řetězce sympatických ganglií (SG) (Barde a další, 1982, EMBO J. 1:549-53).

Aby bylo možno stanovit potenciální biologickou účinnost NT-3, byl uložen gen pro NT-3 krysy do vektoru pCDM8 (Seed, 1987, Nátuře 329:840-42), který byl již dříve užit pro přechodnou expresi BDNF a NGF na buňkách savců. Tato konstrukce byla upravena pro expresi krátké formy prekurzoru NT-3. Při expresi krátkých prekurzorů NGF a BDNF byl totiž získán biologicky účinný materiál (Edwards a další, 1988, Mol. Cell Biol. 8: 2456-64; Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-52). NT-3, NGF a BDNF-konstrukce byly užity k transfekci buněk COS. Supematanty kultur byly odebrány a zkoumány v různých koncentracích na schopnost vyvolat růst neuronů v explantátech DRG. Jak bylo možno očekávat, NGF a BDNF vyvolávaly při tomto pokusu růst neuronů (obr. 8). Avšak také NT-3 vyvolával silný růst neuronů v tomto pokusu, což je prvním průkazem toho, že gen pro NT-3 je kódem pro produkt s neurotrofním účinkem, jak je rovněž zřejmé z obr. 8.

Aby bylo možno zjistit, za NT-3 působí přímo na neurony, byl tento faktor zkoumán ve vysoce obohacené kultuře disociovaných neuronů DRG (obr. 9). Ve virtuální nepřítomnosti Schwannových buněk a fibroblastů vyvolával NT-3 přežití a růst neuronů, a to přibližně 60 % neuronů DRG. Vzhledem ktomu, že NGF a BDNF společně podporují přibližně 100% neuronů v této kultuře (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112: 319-28) je nutno předpokládat, že NT-3 podporuje přežití buněk, na něž působí alespoň jeden ze svrchu uvedených faktorů.

7.2.5. Neurotrofní účinnost NT-3 je odlišná od účinnosti BDNF a NGF

Aby bylo možno dále vyšetřit specifičnost účinku NT—3, byl tento faktor sledován na explantátech NG a SG. Jak bylo možno očekávat, kontrolní pokusy ověřily, že NGF vyvolává růst neuronů v explantátech SG, avšak nikoliv NG z E8 kuřecích embryí, zatímco BDNF vyvolává růst neuronů u NG, avšak nikoliv u explantátů SG. NT-3 vyvolal růst u explantátů SG i NG, jak je zřejmé z obr. 8, takže jeho specifičnost je patrně širší než v případě NGF nebo BDNF. Avšak NT-3, stejně jako NGF a BDNF nepodporuje přežití a nevyvolává růst z explantátů disociovaných, neurony obohacených kultur ganglion ciliare kuřete. Jak již bylo dříve prokázáno, neurony parasympatiku, které jsou v gangliu obsaženy odpovídají na CNTF krysy, což je neurotrofní faktor, který nenáleží do skupiny faktorů NGF/BDNF/NT-3

-29CZ 286015 B6 (Manthorpe a další, 1986, Brain Res. 367: 283-6; Stockli a další, 1989, Nátuře 342:21-28). Nebylo možno pozorovat žádnou odpověď při žádné z těchto zkoušek při použití supematantů buněk COS po transfekci kontrolními vektory, jak je zřejmé z obr. 8.

V následující tabulce IV jsou shrnuty výsledky representativních pokusů, při nichž byly měřeny odpovědi explantovaných embryí 8. dne (E8), a to ganglií dorsálních kořenů kuřete (DRG), ganglion nodosum (NG) a paravertebrálních ganglií sympatiku (SG) na zvyšující se dávky NT-3. Ganglia byla pěstována v kultuře po udanou dobu v 1 ml kolagenového gelu podle publikace Lindsay a Rohrer, 1985, Dev. Biol. 112:30-48). Růst vláken byl hodnocen podle stupnice 0 až 5, kde hodnota 5 je maximální růst vláken, pozorovaných na dorsálních gangliích jako odpověď na dostatečně velkou (sytící) koncentraci neurotrofního faktoru NGF (1-10 ng/ml). NT-3 krysy byl přidáván jako upravené živné prostředí buněk COS-M5 po transfekci plasmidem pC8-rN3(Pl), tak jak bylo popsáno svrchu. Jako kontrola bylo užito upravené prostředí buněk COS-M5 po simulované transfekci. Ve všech zkoušených dávkách (v rozsahu 50-násobku) vyvolával NT-3 zřetelný růst u všech tří typů explantovaných ganglií, i když v nižších dávkách byla odpověď sympatických ganglií nižší. Maximální odpověď neuronů dorsálních ganglií na NT-3 byla srovnatelná s odpovědí na NGF a BDNF. U ganglion nodosum byla odpověď na NT-3 vyšší než maximální odpověď na BDNF. Ganglion nodosum nereaguje na NGF. Maximální odpověď sympatických ganglií na NT-3 byla nižší než maximální odpověď těchto ganglií na NGF a tuto odpověď bylo možno získat také až při vyšších koncentracích NT-3, než jakých bylo zapotřebí pro dosažení maximální odpovědi na NT-3 u buněk dorsálních ganglií nebo u ganglion nodosum.

Tabulka IV

Rekombinantní NT-3 krysy vyvolává růst vláken explantátů z

DRG = E8 ganglia dorsálních kořenů kuřecího embrya

NG = E8 ganglion nodosum kuřecího embrya

SC = E8 ganglia paravertebrálního sympatického řetězce kuřecích embryí

Hodnocení růstu vláken

	DRG (24h)	NG (24h)	SC (24h)
Kontrola 500 μΐ supematantu
buněk COS po simulované
transfekci	0-0,5	0	0
NT-3 10 μΐ supemat. COS	2-3	2-3	0-0,5
NT-3 50 μΐ supemat COS	3-4	4-5	0-0,5
NT-3 200 μΐ supemat. COS	5X	2-3*	0-1
NT-3 500 μΐ supemat. COS	5*	0-2x	1-2

Uváděné hodnoty jsou průměrem růstu vláken vždy ze 4 až 6 ganglií.

* Při příliš velké koncentraci NT-3 se růst vláken snižuje, jak je možno stanovit délkou vláken na explantátech DRG a na počtu vláken na explantátech NG.

-30CZ 286015 B6

7.2.6. Účinnost NT-3 na neurony savců

Aby bylo možno stanovit, zda NT-3 krysy má účinek na neurony savců, byl opakován pokus š explantátech při použití ganglií dorsálních kořenů, vyjmutých z krysích embryí ve stáří 14 dnů. Výsledky jsou shrnuty v tabulce V. Jako kontrola byl užit čištěný NGF. E14 explantáty ganglií dorsálních kořenů krysy (čtyři ganglia na 1 ml kultury) byly pěstovány 24 hodin v podstatě stejným způsobem, který byl popsán pro kuřecí ganglia (obr. 8, tabulka IV) bez přidanéhc neurotrofního faktoru (kontrola), s růstovým faktorem z podčelistní žlázy myši (NGF) nebo s rekombinantním NT-3 krysy (upravené prostředí z buněk COS-M5 po transfekci plasmidern pC8-rN3(Pl)), jak bylo popsáno svrchu. Každé ganglion bylo vyhodnoceno na růst vláken jal bylo popsáno u tabulky IV. Výsledky prokazují, že stejně jako NGF, je i NT-3 účinný pokud jde o podporu růstu vláken v explantátech ganglií dorsálních kořenů krysy.

Tabulka V

Účinek NT-3 na růst vláken v explantátech ganglií dorsálních kořenů u krysích embryí ____________hodnocení růstu vláken u E14 DRG krysy__ Kontrola 0, 0 0, 0

NGF (myš, 5 ng/ml) 4, 4, 4, 3

NT-3: 20 μΐ NT-3 krysy (supematant buněk COS) 3,3,3,4

Hodnocení ve stupnici 0 až 5 je udáno pro každé ze čtyř jednotlivých ganglií v kultuře.

Explantáty DRG, SG a NG odpovídaly alespoň na dva ze tří příbuzných neurotrofních faktorů, maximální odpověď u daného ganglia závisela na použitém faktoru. V případě DRG byla odpověď na sytící koncentrace NGF, BDNF i NT-3 relativně ekvivalentní. Avšak v případě NG byla maximální odpověď na NT-3 vyšší než na BDNF, zatímco v případě SG byla maximální odpověď na NT-3 podstatně nižší a poněkud opožděná ve srovnání s odpovědí na NGF.

7.2.7. Místa syntézy neurotrofmu-3

Bylo prokázáno, že v průběhu vývoje závisí přežití neuronů na cílených neurotrofiiídi molekulách. Také kontinuální přežití, i u dospělého, může vyžadovat trvalou přítomnost neurotrofních látek (Thoenen a další, 1987, Ciba Found. Symp. 126:82-95). V jiných případech již přežití zralých neuronů nemusí záviset na neurotrofním faktoru. Bylo však prokázáno, že takové faktory hluboce ovlivňují diferencovaný fenotyp neuronů (Lindsay a Harmar, 1989, Nátuře 337:362-4). Při určení místa syntézy neurotrofní molekuly může proto také dojít k osvětlení jeho fyziologické úlohy.

Aby bylo možno zjistit místo syntézy NT-3 a srovnat expresi NT-3 s expresí NGF a BDNF, byiy připraveny vzorky RNA z různých tkání dospělých krys a v trojím opakování byly analyzovány metodou Northem blot a hybridizovány pomocí sond, specifických pro každý z uvedených genů (Obr. 10). Jak již bylo dříve prokázáno (Heumann a další, EMBO J., 1984, 3: 3183-9; Sheltor: aReichardt, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 7951-5), exprese mRNA pro NGF byh. nejvyšší v mozku, srdci a slezině. Alespoň stopy však bylo možno prokázat i v ostatních zkoumaných tkáních. BDNF byl poněkud omezen, pokud jde o expresi: nejvyšší hodnoty byly nalezeny v mozku (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149-52) a vyšší hladiny bylo možrr prokázat také v srdci, plicích a svalech. Stejně jako tomu bylo v případě NGF, bylo možní prokázat transkript NT-3 (1,4 kb) ve všech dospělých zkoumaných tkáních. Avšak u všeď

-31 CZ 286015 B6 zkoumaných periferních tkání byla úroveň exprese mRNA pro NT-3 alespoň srovnatelná s úrovní v dospělém mozku a v některých případech, jako je ledvina a slezina, byla podstatně vyšší.

Byla také srovnávána relativní vysoká koncentrace transkriptů pro NGF, BDNF a NT-3 v mozcích novorozených a dospělých myší. Na rozdíl od NGF i BDNF byla úroveň mRNA pro NT-3 v mozku novorozených zvířat vyšší než v mozku zvířat dospělých (obr. 8). Podrobnější analýza prokázala, že úroveň mRNA pro NT-3 v centrálním nervovém systému je podstatně vyšší v průběhu fetálního vývoje a pak klesá na hodnoty, které lze nalézt u dospělých.

7.3. Diskuse

Strukturní srovnání mezi NGF, BDNF a NT-3, přítomnost několika uchovávaných oblastí vedla k předpokladu, že funkční rozdíly mezi těmito bílkovinami jsou určovány řetězci, které se 15 nacházejí mimo tyto uchovávané oblasti. Předpokládaná existence dlouhého a krátkého prekurzoru všech tří bílkovin vyvolala řadu otázek, týkajících se významu obou forem prekurzorů in vivo. Dlouhou formu je možno účinněji zpracovat než formu krátkou. Na druhé straně bylo možno z vektorů pro expresi krátké formy prekurzoru těchto faktorů získat materiál, který byl v buňkách COS biologicky účinný.

Zjištění, že uvedené tři neurotrofní faktory mají spektrum účinnosti a exprese, které je specifické pro tkáně a pro stadium růstu podporuje myšlenku, že vývoj neuronů závisí na dočasné a místně odlišné expresi určitých neurotrofních molekul. Vývojový profil exprese NT-3 ukazuje na to, že tento faktor může hrát zvláště důležitou roli v časném stadiu vývoje nervového systému. 25 Počáteční charakterizace NT-3 a jeho neurotrofní účinnosti in vitro, spojená s generálizovanou prevalencí mRNA pro NT-3 jak v dospělém mozku, tak v periferních tkáních, dospělých živočichů dále napovídá, že NT-3 může mít velmi široký vliv na funkci neuronů a/nebo přežití u dospělého. Globálnější exprese NT-3 je patrně důsledkem toho, že NT-3 působí také na buňky mimo nervový systém, jak je tomu patrně také v případě NGF (Otten a další, 1989, Proč. Nati. 30 Acad. Sci. USA 86: 10059-10063).

Přestože až dosud nebylo jasně prokázáno, že neurony mohou současně odpovídat na více než jeden neurotrofní faktor, podle výsledků zkoušek je nutno mít za to, že NGF a BDNF působí na překrývající se populace neuronů. Například podání jak NGF tak BDNF může zachránit 35 převážnou část neuronů DRG, které by jinak uhynuly v průběhu normálního vývoje ptáků (Hofer a Barde, 1988, Nátuře 331:261-2). Pozorování účinku NT-3 na periferní ganglia kuřat silně podporují možnost, že jednotlivé neurony mohou odpovídat na mnohočetné příznivé vlivy. Je-li tomu tak, vyvolala by možnost současného zprostředkování těchto vlivů zajímavé otázky. Bylo by například možné, že by byly společné složky receptorů a/nebo signální mechanismy převodu 40 pro všechny tři strukturně příbuzné neurotrofní faktory. Zásadně by však současně odpovídající neurony mohly mít mnohočetné receptory nebo jediný receptor, který by mohl zprostředkovat odpověď na všechny faktory. Je však pravděpodobnější, že v prostoru a čase existují rozdíly v relativní dostupnosti jednotlivých faktorů (Davies a další, 1987, Nátuře 326:353-8). Mohlo by také být možné, že různé faktory jsou dostupné na různých místech téhož neuronu, například 45 sensorický neuron by mohl získávat odlišné faktory od periferního a centrálního zakončení (Kalcheim a další, 1987, Le Douarin, EMBO J. 6: 2871-3). V případě, že pro některé neurony jsou současně dostupné různé faktory, může se jejich účinek doplňovat.

Osvětlení individuální a potenciálně komplementární úlohy NGF, BDNF a NT-3 poskytne 50 zásadní informaci pro porozumění normálního vývoje a udržování nervového systému. Pokusy na zvířatech vzbuzují názor, že by bylo možno NGF použít při léčbě degenerativních neurologických stavů (Snider a Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26:489-506; Fischer a další, Nátuře 329: 65-8; Phelps a další, 1989, Neurobiol. Aging 10:205-7). Klonování nové látky ze skupiny

-32CZ 286015 B6 genů NGF/BDNF a její potenciální interakce mezi dalšími látkami z téže skupiny vyvolávají nové úvahy pro potenciální léčebné použití těchto bílkovin u neurodegenerativních onemocnění.

8. Příklad: Klonování a charakterizace genu pro lidský neurotrofin-3

8.1. Výsledky

Byla připravena sonda (R1B/2C) pro identifikaci genu pro NT-3 krysy způsobem podle kapitoly 7 svrchu. Jak bylo popsáno, byla sonda připravena pomocí PCR-reakce z DNA krysího genomu při použití degenerovaných oligonukleotidových primerů, odpovídajících dvěma skupinám homologie řetězců aminokyselin pro NGF a BDNF. Hybridizací Southem blot při použití DNA krysího genomu, rozštěpené restrikční endonukleázou EcoRI a sondy R1B/2C byla objevena nová skupina molekul DNA kromě očekávaných fragmentů, které odpovídají genům pro NGF a BDNF.

V případě, že byla k analýze hybridizace Southem blot DNA lidského genomu, rozštěpené různými endonukleázami užita ³²P-značená sonda R1B/2C, bylo možno pozorovat hybridizací na pásy, odpovídající genům pro NGF a BDNF, avšak také nové pásy. Například při použití endonukleázy HindlII bylo možno pozorovat nový pás o přibližně 1,8 kb, který neodpovídal ani NGF, ani BDNF. Při použití BamHI bylo možno pozorovat nový pás o velikosti 15 kb a při použití EcoRI nové pásy o 8 a L2 kb (přítomnost dvou pásů je patrně výsledkem polymorfie míst působení EcoRI v DNA lidského genomu). Tyto údaje ukazují, že DNA lidského genomu obsahuje gen pro NT-3, který je velmi blízký genu pro NT-3 krysy. Gen pro lidský NT-3 byl izolován vyšetřením sestavy genomu, tak, jak bylo popsáno pro izolaci genu pro NT-3 krysy v kapitole 7. Postup byl prováděn tak, že sestava lidského placentámího genomu, částečně rozštěpená enzymem Sau3A a klonovaná ve vektoru bakteriofágu lambdaEMBL3/SP6/T7 (Clontech Laboratories, lne.) byla vyšetřena při použití sondy R1B/2C a sondami pro NGF a BDNF krysy. Bylo předpokládáno, že lidský klon pro NT-3 bude hybridizovat se sodnou R1B/2C, avšak nikoliv se sondami pro NGF a BDNF. Jeden takový klon fágu byl mezi přibližně 8x 10⁵ plaky identifikován. Tento klon, označený hN3(Gl) obsahoval vloženou lidskou DNA o přibližně 16 kb. Byla provedena mapa restrikčních míst tohoto klonu obvyklým postupem a restrikční fragmenty pak byly podrobeny subklonování v plasmidu pBluescript (Stratagene) k analýze řetězce DNA. Řetězec genu pro lidský NT-3 a odvozený řetězec aminokyselin tohoto bílkovinného produktu spolu s řetězcem pro NT-3 krysy jsou znázorněny na obr. 11.

8.2. Diskuse

Výsledky analýzy řetězce prokazují překvapivě vysoký stupeň uchování nukleové kyseliny i řetězce aminokyselin mezi NT-3 krysy a člověka. V oblasti, která je kódem pro úplný polypeptid (119 aminokyselin) vykazují geny pro faktor krysy a člověka přibližně 92% homologii řetězce DNA. Avšak žádný z rozdílů mezi nukleotidovým řetězcem krysy a člověka v této oblasti nevede k substitucím aminokyselin. Odvozený řetězec aminokyselin pro úplný NT3 člověka a krysy (a také myši, kapitola 6 svrchu) je zcela identický). To připomíná vysoký stupeň uchování v případě BDNF, kde je také možno prokázat úplnou totožnost řetězce aminokyselin v polypeptidů krysy, myši, vepře a člověka. Na rozdíl od toho se řetězec aminokyselin úplného NGF člověka a hlodavce (myši nebo krysy) liší přibližně o 10 %. Mimoto řetězce aminokyselin putativních prekurzorů pro NT-3 člověka a krysy rovněž vykazují pozoruhodně malé rozdíly (podtržené na obr. 11). Těsně za předpokládaným místem štěpení, které vede ke vzniku úplného NT-3 (Arg-Arg-Lys-Arg) chybí v řetězci lidského původu jeden kodon (pro Pro), který je přítomen v řetězci krysy. V řetězci krysy a člověka se od sebe rovněž liší jeden blok čtyř aminokyselin, a to v prepro-N3-3 a mezi uvedeným blokem a štěpným místem pro proteázu je šest dalších substitucí aminokyselin.

-33CZ 286015 B6

9. Biologická účinnost lidského NT-3

Vzhledem ktomu, že odvozený řetězec aminokyselin úplného lidského NT-3 je totožný s řetězcem NT-3 krysy, bylo možno předpokládat, že bílkovina člověka i krysy bude mít také neodlišitelný biologický účinek. Neurotrofní účinek lidského NT-3 byl potvrzen uložením klonovaného lidského genu do vektoru pro expresi, a to plasmidu pCDM8 a takto získaný výsledný plasmid pC8-hN3(Pl) byl užit k transfekci buněk COS-M5 (Chen a Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7:2745-52), načež byl sledován neurotrofní účinek upraveného živného prostředí, v němž byly buňky po transfekci pěstovány. Gen pro lidský NT-3 byl amplifikován pomocí PCR z bakteriofágu hN3(Gl) a uložen do vektoru pro expresi pCDM8, jak bylo popsáno pro gen krysy v kapitole 7. Výsledný plasmid byl označen pC8-hN3(Pl). Řetězec nukleotidů celého včleněného genu pro NT-3 byl stanoven a srovnán s řetězcem genomu jako svrchu aby bylo možno potvrdit, že v průběhu PCR-amplifikace a klonování nedošlo ke vzniku žádných mutací. Transfekce a zkoušky byly provedeny v podstatě stejným způsobem jako při stanovení biologické účinnosti krysího NT-3.

Jak bylo předpověděno, bylo prokázáno, že lidský NT-3 má neurotrofní účinek při zkouškách na explantátech embryí 9. dne (E9), šlo o explantáty ganglií dorsálních kořenů kuřat a o ganglion nodosum, jak je zřejmé z tabulky VI. Ganglia byla pěstována (Obr. 8, tabulka IV) 24 hodin za přítomnosti upraveného prostředí (supematanty) buněk COS-M5 po simulované transfekci nebo po transfekci plasmidy (všechny byly odvozeny od vektoru pro expresi pCDM8), obsahujícími kód pro rekombinantní lidský BDNF nebo rekombinantní NT-3 krysy (rNT-3; plasmid pC8rN3(Pl)) nebo rekombinantní NT-3 člověka (hNT-3; plasmid pC8-hNT-3(Pl)). Plasmid pro BDNF byl užit jako pozitivní kontrola vzhledem k tomu, že BDNF má neurotrofní účinek jak na ganglia dorsálních kořenů, tak na ganglion nodosum. Jak je zřejmé z tabulky VI, má rekombinantní NT-3 krysy a člověka v poměrně malých dávkách (srovnej tabulku IV) přibližně stejný účinek jako BDNF u ganglií dorsálních kořenů, podstatně vyšší účinek jako BDNF má na ganglion nodosum. Jak je zřejmé z tabulky VI, má rekombinantní NT-3 člověka i krysy v poměrně malé dávce (srovnej tabulka IV) přibližně stejný účinek jako BDNF na ganglia dorsálních kořenů podstatně vyšší účinek má na ganglion nodosum. Nebylo možno prokázat žádný rozdíl v účinnosti mezi NT-3 člověka a krysy.

Tabulka VI

Účinek rekombinantního lidského NT-3, produkovaného v buňkách COS na ganglia dorsálních kořenů nebo ganglion nodosum v explantátu z kuřecích embryí. NT-3 krysy má týž účinek

Hodnocení růstu vláken

DRG NG

Kontrola	0,0,0,0, 0,5	0,0
BDNF: 20 μΐ COS supematantu	3,3,3,3,3	1,3
Simulovaná transfekce:
20 μΐ COS supematantu	0, 0,5 0,0,0	0
lidský NT-3: 20 μΐ COS sup.	3,2,4,3	3,3
NT-3 krysy: 20 μΐ COS supemat.	3,4,4,3,4	3,4

Hodnocení znamená růst vláken podle stupnice 0 až 5 na 1 až 5 jednotlivých gangliích v kultuře (24 h). Je uvedena hodnota pro každé ganglion.

-34CZ 286015 B6

10. Identifikace produktu lidského genu pro NT-3 pomocí metabolického značení

Předpokládaná velikost úplného polypeptidu NT-3 (krysího nebo lidského původu) je 119 aminokyselin, molekulová hmotnost 13 600. Aby bylo možno experimentálně stanovit přibližnou velikost úplného lidského polypeptidu NT-3, byly buňky, podrobené transfekci plasmidem pro expresi lidského NT-3 metabolicky značeny a upravené prostředí bylo analyzováno na přítomnost nového polypeptidu. V pokusu, znázorněném na obr. 12 byly buňky COS₌M5 podrobeny transfekci plasmidem pC8-hN3(Pl), který již byl svrchu popsán, buňky byly značeny směsí 1³⁵S| methioninu a 1³⁵S| cysteinu, růstové prostředí bylo odebráno a frakcionováno za denaturačních podmínek na 15% polyakrylamidovém gelu, bílkoviny byly přeneseny na membránový filtr (Toebin a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354) a značené polypeptidy byly prokazovány autoradiografií. Buňky po simulované transfekci byly užity jako kontroly (dráha, značená „MOCK“). Jak je znázorněno na obr. 12 plasmid pro expresi pC8hN3(Pl) řídí syntézu jediného polypeptidu s molekulovou hmotností přibližně 14 000 (na obr. značeno NT-3), tento pás není možno prokázat u kontrol. V mezích technického dělení toto zjištění je v dobré shodě s předpokládanou velikostí úplného NT-3.

11. Příklad: Účinek neurotrofinu-3 na přežití dopaminergních neuronů ventrálního mesencephala embryonální krysy v kultuře

Kultury ventrálního mesencephala krysího embrya E14 byly pěstovány způsobem podle US patentové přihlášky č. 07/400 591, podané 30. srpna 1989. Kultury byly naočkovány množstvím 50 000 buněk/cm² (obr. 13) nebo 100 000 buněk/cm² (obr. 14) a pak byly pěstovány v nepřítomnosti neurotrofního faktoru (kontroly) nebo za přítomnosti zvyšujícího se množství supematantu kultury buněk COS, obsahujícího rekombinantní lidský NT-3. Po 8 dnech pěstování byly buňky fixovány a barveny monoklonální protilátkou proti tyrosinhydroxyláze (TH), jde o značící látku pro dopaminergní neurony. Jak je zřejmé z obr. 13 a 14, bylo prokázáno, že zvyšující se množství NT-3 zvyšuje počet TH-pozitivních buněk, které přežívají po osmém dni, maximální hodnoty, která je 2,5krát vyšší než u kontrol je možno dosáhnout při ředění supematantu buněk COS v poměru 1 : 25. Čištěný NGF neměl žádný účinek, avšak účinek NT-3 byl podobný účinku, který byl prokázán u BDNF. ^{12 * * * * * * * * * * * * * * * *}

12. Příklad: Vliv NT-3, BDNF a NGF u vyvíjejícího se nervového systému krysy. Paralelní a reciproční typy exprese

12.1. Metody

12.1.1. Materiály a způsob odebírání

Krysy Sprague-Dawley (Harlan Sprague Dawley lne.) byly užity k přípravě všech preparátů.

Řezy na dospělém mozku byly prováděny podle obvyklých částí mozku. Vzorky kůry obsahovaly neocortex a dorsální část čichové oblasti kůry. Vzorky diencephala byly odebírány při použití stria medullaris a chiasma opticum jako dorsálním a ventrálních hranic tohoto útvaru. Vzorky mezimozku byly odebírány na úrovni colliculi superiores a inferiores dorsálně a zasahovaly až k ventrálnímu povrchu mozku až do nejrostrálnější hrany pontu. Vzorky zadní části mozku byly odebírány bez mozečku, avšak obsahovaly pons a míchu. Je nutno uvést, že byly odebírány pouze rostrální části corpus striatum, aby nedošlo ke kontaminaci thalamem. Vzorky hippocampu byly odebírány na úrovni fimbria/fomix až přibližně ke kaudálnímu pólu.

Při odebírání vzorků z mozku novorozených krys bylo užito podobného ohraničení s výjimkou stria medullaris. Pro získání embryonální tkáně byly užity krysy s načasovanou březostí, datum zabřeznutí bylo označeno El, den vrhu PO. Dospělé krysy měly hmotnost 150-275 g (6 až 8 týdnů stáří).

-35CZ 286015 B6

12.1.2. Příprava RNA a Northem blot

Z krys Sprague-Dawley byly vyříznuty zvolené tkáně a okamžitě zmrazený v kapalném dusíku. RNA byla izolována homogenizací tkáně ve 3M LIC1/6M močovině (Bothwell a další, 1990, Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Jones and Bartlett, Boston, MA). RNA (10 pg se podrobí frakcionaci elektroforézou ve čtverém opakování na 1% agarozovém gelu (Bothwell a další, svrchu) s následným kapilárním přenosem na nylonové membrány (magnaGraph. Micron Separations lne.) při použití 10 x standardního roztoku citrátu (SSC) o pH 7. RNA byly zesítěny s membránou pomocí UV světla (Stratalinker, Stratagene, lne.) a hybridizovány při teplotě 68 °C s radioaktivně značenými sondami za přítomnosti 0,5 M NaPO₄ o pH 7, 1% sérového albuminu skotu (Frakce V, Sigma, lne.), 7% SDS, lmM EDTA (Mahmoudi a Linn, 1989, Biotechniques 7:31-33) a 100 pg/ml denaturované DNA ze spermatu lososa, zpracované pomocí ultrazvuku. Filtry se promyjí při teplotě 68 °C pomocí 2 x SSC, 01% SDS a pak se jeden den až jeden týden provádí autoradiografie při použití 1 nebo 2 zesilujících fólií (Cronex, DuPont) a rtg-filmu (Xar-5, Kodak) při teplotě -70 °C. Po zbarvení gelů ethidiumbromidem je možno prokázat, že pro různé vzorky bylo zjištěno ekvivalentní množství RNA (Maison-pierre a další, 1990, Science 247:1446-1451). To bylo potvrzeno také vyšetřením materiálu z Northem blot pomocí sondy, specifické pro 28S rRNA.

12.1.3 Příprava sond proNT-3, BDNF, NGF aNGFR

Molekulární klonování kódových oblastí pro NT-3, BDNF a NGF krysy ve vektoru pro expresi pCDM8 již bylo popsáno (Aruffo a Seed, 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 a Maisonpierre a další, svrchu). Včleněné řetězce o 800 bp (Xhol) v těchto plasmidech byly odděleny na polyakrylamidovém gelu a izolovány elektroelucí (Bothwell a další, svrchu), a pak značeny ³²P (Bothwell a další, svrchu). Hybridizací každé z těchto sond na syntetické NT-3, BDNF a NGF-transkripty bylo možno prokázat, že sonda, specifická pro jeden neurotrofin nehybridizovala s transkripty příbuzných neurotrofinů. Sonda pro NGRF krysy byl fragment cDNA o 1,6 kb (Ncol) škodovou oblastí pro krysí bílkovinu BGRF (Radeke a další, 1987, Nátuře 325: 593-597).

12.1.4. Získání syntetického transkriptu a kvantitativní stanovení

Promotor fágu T7, přítomný v konstrukci pCDM8/neurotrofin, tak, jak bylo svrchu popsáno, byl užit k získání syntetických transkriptu RNA, odpovídajících smyslu orientace kódových oblastí pro NT-3, NGF a BDNF. Množství těchto syntetických transkriptů bylo nejprve kvantitativně určeno spektrofotometricky. Pak byly transkripty dále sledovány při použití koncově značené (Bothwell a další, svrchu) 30-memí oligonukleotidové sondy, která hybridizovala se společným

5-zakončením (těsně za promotorem T7) všech tri transkriptů. Densitometrické sledování (Series 300 Computing Densitometer, Molecular dynamics, lne.) syntetických transkriptů po provedení dot-blot n Northem blot, hybridizovaných na oligonukleotidovou sondu (hybridizace a promytí při 55 °C, jinak jako svrchu) prokázalo, že jako definované standardy byly užity syntetické transkripty v ekvivalentním množství (representativní údaje jsou uvedeny na obr. 15A).

12.1.5. Densitometrické kvantitativní stanovení úrovně transkripce neurotrofmu

Úroveň transkripce v různých vzorcích byla upravena tak, aby odpovídala vzorku standardizované mozkové tkáně dospělé krysy následujícím způsobem: Do každého vzorku Northem blot byl zařazen ekvivalentní podíl RNA z mozku dospělé krysy. Densitometrické stanovení různých radiografických expozic pro každý vzorek Northem blot bylo užito k určení intensity signálu pro každý zkoumaný vzorek. Pro každou sledovanou expozici byla intensita signálu pro každý vzorek dělena hodnotou, získanou pro signál intensity tkáně dospělého mozku při téže expozici,

-36CZ 286015 B6 což normalizovalo všechny hodnoty vzhledem ke standardizovanému vzorku tkáně dospělého mozku. Na obr. 18 je uvedeno srovnání úrovně transkripce u různých vzorků relativně k hodnotám v dospělém mozku, přičemž hodnota pro dospělý mozek se pokládá za 1,0. Po stanovení femtogramů (fg) transkriptu neurotrofinu na mikrogram celkové RNA ve vzorku tkáně dospělého mozku bylo možno stanovit úroveň transkripce (ve fg/pg) ve vzorcích, normalizovaných vzhledem ke vzorku tkáně dospělého mozku.

12.2. Výsledky

12.2.1. Kvantitativní stanovení a srovnání množství mRNA pro NT-3, BDNF a NGF v mozku dospělých krys

Bylo užito systému Northem blot, aby bylo možno kvantitativně stanovit a srovnat expresi transkriptů NT-3, BDNF a NGF ve vzorcích různých tkání. Množství transkriptu každého neurotrofinu v různých vzorcích bylo stanoveno kvantitativně relativně k definovanému syntetickému standardu. Syntetické transkripty NT-3, BDNF a NGF, jejichž množství bylo přesně stanoveno byly užity v systému Northem blot (obr. 15A), mimoto bylo užito také 10 pg celkové DNA, izolované z mozku dospělých krys. Vzorky byly hybridizovány s radioaktivně značenými sondami, specifickými pro každý neurotrofín a pak byla provedena autoradiografie (obr. 15B). Pak bylo užito sériové densitometrie k srovnání intensity hybridizačního signálu, získaného z mozkové tkáně dospělé krysy a ze syntetických standardů. Toto kvantitativní stanovení prokázalo, že úroveň mRNA je přibližně stejná pro všechny tři neurotrofiny v mozkové tkáni dospělé krysy (40 fg transkriptu NT-3, 45 fg transkriptu pro BDNF a 30 fg transkriptu NGF). Alikvotní podíl tohoto standardizovaného vzorku dospělého mozku byl zahrnut do všech následujících zkoušek Northem blot, takže bylo možno stanovit kvantitativně úroveň exprese neurotrofinu v nových vzorcích RNA srovnáním. Aby bylo možno usnadnit visuální srovnání tří transkriptů neurotrofínů v různých vzorcích, byly expozice v následujících výkresech voleny tak, že intensita signálu ve standardizovaném vzorku tkáně dospělého mozku byla obdobná pro všechny tři neurotrofiny, čímž došlo k normalizaci signálu z jiných vzorků tkáně k definovanému standardu.

12.2.2. Exprese genů pro NT-3, BDNF a NGF jako obecný jev a specifické vývojové vlastnosti této exprese

Sledování exprese genu pro neurotrofín u krysích embryí ukázalo, že u všech tří neurotrofínů dochází k dramatickému vzestupu úrovně exprese mezi jedenáctým a dvanáctým embryonálním dnem (E11-E12, Obr. 16A). Transkripty pro všechny tři neurotrofiny jsou distribuovány ve velkém počtu tkání u embryí E12 a E13. Údobí vzestupu exprese genů pro neurotrofiny je v souladu s obdobím neurogeneze (periferní i centrální) a se začátkem tvorby axonů na nově vytvořených neuronech (Altman a Bayer, 1982, Adv. Anat. Embryol. Cell. Biol. sv. 74, Altman a Bayer, 1984, tamtéž, sv. 85).

Přes koordinovaný nástup exprese genů pro neurotrofiny v průběhu embryogeneze je možno prokázat, že ve srovnání se standardizovaným vzorkem tkáně dospělého mozku je mRNA pro T3 v největším množství včasném embryonálním období (180 fg/ pg celkové RNA), zatímco množství mRNA pro BDNF je nižší (5-10 fg/ pg celkové RNA) a množství mRNA pro NGF je mezi těmito dvěma hranicemi (30 fg/ pg celkové RNA) (obr. 16A). V případě, že se sledují ve vyvíjejícím se mozku množství NT-3 a BDNF, je poměr těchto látek nepřímo úměrný (obr. 16B), totéž platí pro hustě inervovanou srdeční tkáň (obr. 18C), na počátku dochází k vysoké expresi NT-3, která se pak snižuje a původně nízká exprese, BDNF se zvyšuje, až se u dospělého dosáhne srovnatelné úrovně. Naproti tomu je exprese NGF v podstatě konstantní. Je zajímavé, že se exprese NT-3 zvyšuje v průběhu vývoje jater a brzlíku, tj. orgánů, které

-37CZ 286015 B6 nejsou hustě inervovány a u nichž nedochází k expresi detekovatelného množství mRNA pro BDNF (obr. 16C).

Exprese transkriptu pro NGFR zjevně předchází vzestup exprese genu pro neurotrofíny, je překvapivě vysoká v časném období vývoje míchy a pak se snižuje v průběhu prenatálního vývoje mozku a postnatálního vývoje srdce (obr. 16A, B, C).

12.2.3. Srovnání exprese NT-3, NGF, BDNF a NGFR v nervovém systému novorozených a dospělých živočichů.

Aby bylo možno definovat prostorovou distribuci exprese genu pro neurotrofíny v nervovém systému krysy a aby bylo možno porozumět tomu, jaký je vztah mezi vývojem celého mozku a jeho jednotlivých částí, byla sledována exprese genu pro neurotrofíny v mozku novorozených a dospělých. U všech tří faktorů existuje prostorový a časový rozdíl v expresi (obr. 17). Kvantitativní stanovení transkriptů včetně periferních tkání je graficky znázorněno na obr. 4. Hlavní podobnost, společná všem třem faktorům je jejich vysoká úroveň exprese vhippocampu dospělých. Na rozdíl od situace v periferních tkáních dospělých, v nichž NT-3 a NGF jsou pokud jde o expresi široce rozšířeny (Maisonpierre a další, svrchu), je exprese NT-3 a BDNF obdobná ve tkáni dospělého mozku (obr. 17B, 18B). Je zajímavé, že oba faktory chybí v corpus striatum. Avšak mezi NT-3 a BDNF také existují velmi zajímavé, zřejmě reciproční vztahy pro expresi v mozku novorozených a dospělých (obr. 17A, B a obr. 18A, B). Exprese NT-3 u novorozených je nejvyšší a současně daleko vyšší než u dospělých v nezralejších tkáních, jako jsou mozeček, hippocampus a neocortex. Exprese BDNF je nejnižší v těchto oblastech a nejvyšší je v kaudálnějších oblastech mozku, kde je obdobná úrovni u dospělých, jde o tkáně, které jsou zralé dříve, jako zadní mozek, mezimozek a diencephalon. Stejně jako je tomu v mozku dospělých, není možno prokázat transkripty NT-3 a BDNF v corpus striatum novorozených živočichů.

Ve srovnání sNT-3 a BDNF má rozšíření mRNA pro NGF méně dramatické rozdíly mezi mozkem dospělých a novorozených živočichů (obr. 17, 18). Úroveň NGF v bulbus olfaktorius je vyšší o novorozených, zatímco v hippocampu a v neocortexu je vyšší u dospělých. Úroveň mRNA pro NGFR je vyšší obecně v mozku novorozených než u dospělých, výjimečně vysoké množství je možno prokázat v mozečku a zadním mozku novorozených živočichů (obr. 17A, B).

12.2.4. Sledování exprese NT-3, NGF a BDNF v průběhu vývoje různých oblastí centrálního nervového systému

Aby bylo možno dále sledovat skutečnost, že k expresi NT-3 dochází nejvýrazněji v časném stadiu vývoje určitých oblastí CNS, zatímco k expresi BDNF dochází převážně později při vývoji týchž oblastí byla analyzována exprese genu pro neurotrofíny v průběhu vývoje tří částí CNS, kjejichž zrání dochází ve velmi odlišných časových obdobích. Neurogeneze, která je následována obdobím přirozeně se vyskytujícího uhynutí buněk nastupuje velmi záhy v míše (E12-E13) a je ukončena několik dnů před narozením (Altman a Bayer, 1984 svrchu). Na rozdíl od této skutečnosti vzniká většina neuronů v mozečku a hippocampu až po narození (Altman, 1966, J. Comp. Neur. 128: 431-474; Schlesinger a další, 1975, J. Comp. Neur. 159: 149-176). V později se vyvíjejícím mozečku je v prvních třech týdnech života rozsáhlá neurogeneze, migrace neuroblastů a diferenciace neuronů (Altman, 1966 svrchu). Bylo rovněž prokázáno, že úroveň mRNA pro NGF v hippocampu je možno zjistit až dva týdny po narození (Large a další, 1986, Science 234: 352-355) tento vzestup se objeví až dlouho po perinatálním vzestupu proliferace granulovaných buněk (Altman, 1966 svrchu) a po invazi vláken z cholinergních neuronů spodní a přední části mozku (Koh a Loy, 1989, J. Neurosci. 9: 2999-3018), avšak je v koincidenci s další cholinergní diferenciací těchto neuronů (Large a další svrchu).

-38CZ 286015 B6

Výzkumy vyvíjející se míchy (obr. 5A, E) prokazují vysokou úroveň exprese NT-3 v období E12-E13 (150-280 fg/ pg celkové RNA), pak dochází k poklesu v období porodu a u dospělého téměř není možno expresi prokázat. Oproti tomu mRNA pro BDNF, kterou lze jen obtížně prokázat v období E12-E13 je produkována ve vysokém množství v období porodu (1020 fg/ pg celkové RNA) a pak u dospělého dochází k jejímu poklesu. K expresi mRNA pro NGF dochází vnejvyšším množství v míše E12-E13 (15-25 fg/ pg celkové RNA), avšak toto množství je přibližně lOx nižší než množství mRNA pro NT-3 v tomtéž stadiu. K expresi NGFR dochází v nejvyšší míře v časném stadiu vývoje míchy. Tato exprese byla dříve uváděna do korelace s obdobím přirozeného hynutí buněk nově vytvořených motorických neuronů v časném stadiu vývoje míchy (Enfors a další, Neuron 2: 1605-1613).

V pozdějším stadiu vývoje mozečku (obr. 19B, F) přetrvávají pozoruhodně vysoká množství mRNA pro NT-3 (500-820 fg/ pg celkové RNA) v průběhu prvních tří týdnů po narození, zatímco exprese BDNF se počne zvyšovat až pozdě v tomto období. Pouze velmi nízkou úroveň exprese NGF je možno prokázat jen v prvním stadiu vývoje mozečku. K expresi NGFR dochází ve vysokém množství záhy při vývoji mozečku a pak dochází k poklesu před pozorovaným poklesem exprese NT-3.

V hippocampu (obr. 19C, G) se zvyšují hodnoty pro mRNA pro BDNF a NGF z nízké úrovně v období E17 do středních hodnot při narození, nejvyšších hodnot je dosaženo u dospělých. Přestože k expresi transkriptů všech tří neurotrofinů dochází v hippocampu dospělých na přibližně stejné úrovni, je přece exprese NT-3 překvapivě vyšší než exprese BDNF a NGF v hippocampu v období 317 a při narození. Exprese NT-3 v hippocampu novorozených je stejně vysoká jako v perinatálním mozečku, to znamená 820 fg/ pg celkové RNA. Na rozdíl od neurotrofinů se exprese NGFR v průběhu vývoje hippocampu snižuje.

Ve všech třech zkoumaných oblastech CNS je tedy exprese NT-3 překvapivě vysoká v průběhu jejich vývoje a pak klesá až na hodnoty u dospělých, zatímco množství mRNA pro BDNF, které je zpočátku nízké se zvyšuje až na hodnoty u dospělých, které jsou obdobné jako hodnoty pro NT-3. Na rozdíl od recipročního vztahu mezi NT-3 a BDNF nemá exprese NGF zvláštní průběh. K expresi tohoto faktoru dochází ve větší míře (i když v malém množství) při časném vývoji míchy a mozečku a při pozdějším vývoji v hippocampu.

12.3. Diskuse

Naše analýzy prokázaly jak podobnosti, tak rozdíly v prostorové i časové distribuci transkriptů tří neurotrofinů. Transkripty NT-3, BDNF a NGF zvyšují svou expresi mezi jedenáctým a dvanáctým dnem embryogeneze krys a jsou rozšířeny u embryí dvanáctého a třináctého dne vývoje. Začátek tohoto společného zvýšení exprese je patrně přibližně v souladu s nástupem neurogeneze v průběhu vývoje (Altman a Bayer, 1982 svrchu). Toto spojení podporuje názor, že tři neurotrofiny hrají zvláště významnou úlohu při vývoji nervového systému a jsou charakteristické pro období, v němž je poprvé zapotřebí všech neurotrofinů k udržení přežití postmitotických neuronů. Avšak období, v němž dochází k expresi těchto faktorů by mohlo ukazovat také na jiné úlohy neurotrofinů ve vyvíjejícím se nervovém systému.

Přestože exprese genů pro všechny tři neurotrofiny začíná současně, velmi se liší úrovně, kterých je dosaženo v časném embryonálním stadiu. U časných embryí je mRNA pro NT-3 v největším množství, zatímco k expresi mRNA pro BDNF dochází na nízké úrovni. Tento kontrast mezi expresí NT-3 a BDNF je možno prokázat v téměř každé zkoumané části. V průběhu vývoje je exprese NT-3 nejvyšší v těch oblastech CNS, v nichž nastává proliferace, migrace a diferenciace neuronů a jejich prekurzorů a obvykle dramaticky klesá se zráním oblastí CNS. Na rozdíl od toho je exprese BDNF nejvyšší u novorozených v těch oblastech CNS, v nichž k neurogenezi již došlo a obvykle se zvyšuje v průběhu zrání určité oblasti CNS. Je zajímavé, že úroveň, jíž

-39CZ 286015 B6 dosáhnou transkripty NT-3 a BDNF v různých oblastech CNS u dospělých jsou obdobné. Reciproční vztah mezi expresí NT-3 a BDNF v průběhu vývoje spolu s poměrně podobným profilem u CNS dospělých ukazuje, že NT-3 a BDNF mohou v některých případech působit na tytéž populace nervových buněk v CNS. Je-li tomu skutečně tak, pak patrně NT-3 hraje důležitou úlohu při vývoji těchto neuronů (pravděpodobně v průběhu inervace cílových orgánů), zatímco BDNF působí patrně v pozdějším stadiu života týchž neuronů (zrání a udržování). Exprese NGF se v průběhu vývoje místně mění, avšak tyto změny nemají souvislý vzestup nebo pokles, jako tomu je v případě NT-3 a BDNF. Úroveň mRNA pro NGFR neodráží specificky expresi kteréhokoliv ze tří genů pro neurotrofiny a je pravděpodobně společnou složkou receptorů pro jednotlivé neurotrofiny (Rodriguez-Tebar a další, 1990, Neuron 4:487-492). Exprese NGFR je nejvyšší v časných stadiích vývoje různých oblastí CNS a existují patrně zajímavé vývojově řízené změny v expresi NGFR, které je nutno podrobit dalšímu zkoumání.

Na rozdíl od podobné distribuce v CNS dospělých mají NT-3 a BDNF dramaticky odlišné rozdělení míst exprese v periferních tkáních dospělých. Širší periferní distribuce transkriptů NT3 může odrážet účinnost tohoto faktoru na širší (a odlišnou) škálu nervových i jiných buněk na periferii, než tomu je v případě BDNF (Maisonpierre a další, svrchu).

Přestože existují podstatné důkazy o tom, že NGF i BDNF hrají důležitou úlohu v časných stadiích vývoje nervového systému, výzkumy prokazují ještě významnou korelaci mezi značně vysokou expresí NT-3 v časných stadiích vývoje neuronů. Úroveň mRNA pro NT-3 ve vyvíjejícím se mozečku a v hippocampu je několikrát vyšší než množství jakéhokoliv jiného neurotrofinu v jakékoliv jiné tkáni nebo mozkové oblasti a více než 20x vyšší než množství jakéhokoliv jiného neurotrofinu v dospělém mozku. Objev NT-3 jako nového faktoru, příbuzného NGF, který může podporovat alespoň některé, na BDNF a NGF závislé neurony (Maisonpierre a další, svrchu) a jehož dočasná exprese je zjevně ve shodě s kritickými obdobími vývoje neuronů vzbuzuje názor, že NT-3 je tou fyziologickou látkou, která je za normálních podmínek zodpovědná za některé vývojově důležité funkce, které byly dříve připisovány BDNF nebo NGF. Je zapotřebí objasnit skutečné vývojové úlohy všech látek této skupiny vzhledem k možnosti zkřížené reakce protilátek proti těmto příbuzným faktorům (Whittemore a Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12: 439—464).

Přestože jsme již dříve prokázali, že NT-3 může působit jako klasické látky, podporující přežití neuronů (Maisonpierre a další, svrchu) a i při omezené expresi působící selekci a tvorbu vláken u neuronů, tato úloha nijak nevylučuje jiné vývojově důležité úlohy NT-3 (a také dalších neurotrofinů). Exprese NT-3 ve vyvíjejícím se nervovém systému má značnou podobnost s expresí nestinu (nová bílkovina vláknitého tvaru, jejíž exprese je charakteristická pro ty oblasti CNS, v nichž dochází k neurogenezi, Landahl a další, 1990) a SNAP (antigenní látka, značící rostoucí neurity - Yamamato a další, 1986, J. Neurosci. 6: 3576-3594). Na rozdíl od NGF (Clegg a další, 1989, Devl. Biol. 134: 30-37) exprese vysokého množství NT-3 přechází okamžik, v němž nervová vlákna sympatiku dosáhnou srdce. To znamená, že NT-3 by mohl být vázán zejména na jiné vývojové procesy než je přežití neuronů, včetně proliferace prekurzorů neuronů a jejich diferenciace a/nebo vedení migrujících buněk nebo jejich axonů. Dalším předpokladem této důležité fyziologické úlohy NT-3 je nové zjištění, že jeden z neurotrofinů (NGF) může hrát úlohu při proliferaci prekurzorů neuronů in vitro. Naopak BDNF přes svou přítomnost v časných vývojových stadiích může mít obecnější úlohu, která zasahuje daleko za počáteční období uhynutí neuronů a selekci.

Exprese všech tří neurotrofinů u dospělých má překvapující podobnost- k expresi všech tří neurotrofinů dochází v poměrně vysokém množství v dospělém hippocampu. V případě, že se přeruší spojení cholinergních neuronů ze spodní části předního mozku k hippocampu, má to za následek atrofii a sníženou produkci mediátoru těmito neurony (souhrnný článek Snider aJohnson, 1989, Ann. Neurol. 26: 489-506). Podobná atrofie je spojena se špatnou funkcí paměti u stárnoucích krys a u lidí s Alzheimerovou chorobou. Atrofii cholinergních neuronů

-40CZ 286015 B6 bazální části předního mozku je možno zvrátit u krys podáváním NGF. Uvedené údaje jsou v souladu s možností, že hippocampus dospělých za obvyklých podmínek je zdrojem všech tří neurotrofinů pro bazální část předního mozku, takže pravděpodobně současné průkazy doplňujícího se účinku NGF a BDNF na cholinergních neuronech v kultuře odráží skutečnou fyziologickou úlohu těchto látek. Exprese NT-3 je však v hippocampu velmi vysoká již v časném stadiu vývoje a pak klesá na úroveň v dospělé tkáni, která je obdobná množství BDNF a NGF. Tato časná exprese znovu napovídá, že by NT-3 mohl hrát zcela specifickou úlohu při vedení nebo uskutečnění časného spojení k bazální části předního mozku nebo sjinými aferentními neurony pro hippocampus nebo při proliferaci prekurzorů granulovaných buněk. Poměrně nízké množství NGF v průběhu časného vývoje hippocampu odporuje možnosti, že by tuto roli mohl hrát NGF (Large a další, svrchu).

13. Uložení mikroorganismů

Dne 28. února 1990 byl ve veřejné sbírce kultur Američan Type Culture Collection, 12301 Parlawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 uložen soubor plasmidů a DNA bakteriofágů podle následující tabulky:

	kmen	číslo ATTC
bakteriofág (DNA)	0hN3(Gl)	40763
bakteriofág (DNA)	0rN3(Gl)	40764
plasmid	pC8-rN3(Pl)	40766
plasmid	PC8-hN3(Pl)	40765

Vynález nemá být omezen na jednotlivá výhodná provedení, která byla popsána. Je zřejmé, že by bylo možno provést ještě různé modifikace, které by rovněž spadaly do rozsahu vynálezu. Tyto modifikace může provést každý odborník na základě popisné a příkladové části a výkresů.

Claims (26)

1. Rekombinantní řetězec DNA, kódující bílkovinu s aktivitou neurotrofinu-3 (NT-3), obsahující řetězec nukleotidů 530 až 886 lidského NT-3 z obr. 11.

2. Rekombinantní řetězec DNA podle nároku 1, jehož exprese kódového řetězce DNA pro neurotrofin-3 ve formě bílkoviny je řízena regulačními oblastmi pro expresi v hostiteli, transformovaném touto rekombinantní molekulou DNA.

3. Rekombinantní hostitelská buňka obsahující řetězec DNA podle nároku I.

4. Rekombinantní hostitelská buňka obsahující řetězec DNA podle nároku 2.

5. Rekombinantní mikroorganismus, obsahující řetězec DNA podle nároku 1.

6. Rekombinantní mikroorganismus, obsahující řetězec DNA podle nároku 2.

7. Rekombinantní mikroorganismus podle nároků 5 nebo 6, kterým je bakterie nebo kvasinka.

8. Čištěná bílkovina s účinností neurotrofínu-3 obsahující sekvenci aminokyselin 1 až 119 z obr. 11 zralého lidského neurotrofinu-3.

-41 CZ 286015 B6

9. Způsob výroby neurotrofinu-3 ve formě bílkoviny podle nároku 8, vyznačující se tím, že se pěstuje hostitelská buňka nebo mikroorganismus podle nároků 4 nebo 5 tak, že dochází k expresi řetězce DNA hostitelskou buňkou nebo mikroorganismem a vytvořený neurotrofín-3 ve formě bílkoviny se izoluje.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že hostitelem je eukaryotická buňka.

11. Protilátka, rozpoznávající neurotrofín-3 ve formě bílkoviny podle nároku 8.

12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství bílkoviny neurotrofínu-3 podle nároku 8 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

13. Neurotrofin-3 ve formě bílkoviny podle nároku 8 pro použití při léčení onemocnění nebo poruchy nervového systému u člověka nebo j iného živočicha.

14. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení degenerativního onemocnění nervového systému.

15. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení Alzheimerovy choroby, Huntingtonovy choroby, Parkinsonovy choroby, roztroušené sklerózy a amyotrofícké laterální sklerózy.

16. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení poškození nervového systému.

17. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení periferní neuropathie.

18. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení diabetické neuropathie.

19. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení alkoholické neuropathie.

20. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení neuropathie, spojené se syndromem AIDS.

21. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení úrazu nervové tkáně, stavů po chirurgických zákrocích, po infarktech, při infekci nebo při zhoubném bujení.

22. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení stavů po expozici toxickým látkám.

23. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení stavů způsobených nedostatkem živných látek.

24. Bílkovina podle nároku 8 pro léčení vrozených poruch nervového systému.

25. Neurotrofin-3 ve formě bílkoviny podle nároku 8 pro podporu přežívání dopaminergních neuronů.

26. Protilátka podle nároku 11, která je rozeznatelně značená, pro léčení nebo pro diagnostiku člověka nebo jiného živočicha.