JP3738281B2 - 新規な骨芽細胞増殖因子 - Google Patents
新規な骨芽細胞増殖因子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3738281B2 JP3738281B2 JP20125794A JP20125794A JP3738281B2 JP 3738281 B2 JP3738281 B2 JP 3738281B2 JP 20125794 A JP20125794 A JP 20125794A JP 20125794 A JP20125794 A JP 20125794A JP 3738281 B2 JP3738281 B2 JP 3738281B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- bone
- mc3t3
- growth factor
- vol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 title description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 101000634196 Homo sapiens Neurotrophin-3 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract 3
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 claims description 30
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 102000057714 human NTF3 Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 abstract 2
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 abstract 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 abstract 2
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 abstract 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 102000047459 trkC Receptor Human genes 0.000 description 12
- 108010064892 trkC Receptor Proteins 0.000 description 12
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 9
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 4
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 4
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 101100222854 Bacillus subtilis (strain 168) czcO gene Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 3
- 101100537961 Methanosarcina mazei (strain ATCC BAA-159 / DSM 3647 / Goe1 / Go1 / JCM 11833 / OCM 88) trkA2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 101150025395 trkA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150113435 trkA1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 2
- 101100127166 Escherichia coli (strain K12) kefB gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000996663 Homo sapiens Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 2
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 208000010191 Osteitis Deformans Diseases 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000027868 Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 201000010934 exostosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 201000010930 hyperostosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000027202 mammary Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000004579 marble Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- DZNKOAWEHDKBEP-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[6-[bis(2-methoxy-2-oxoethyl)amino]-5-[2-[2-[bis(2-methoxy-2-oxoethyl)amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]-1-benzofuran-2-yl]-1,3-oxazole-5-carboxylate Chemical compound COC(=O)CN(CC(=O)OC)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC(C(=C1)N(CC(=O)OC)CC(=O)OC)=CC2=C1OC(C=1OC(=CN=1)C(=O)OC)=C2 DZNKOAWEHDKBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000005368 osteomalacia Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Psychology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト神経栄養因子3からなる骨代謝疾患の予防および治療剤に関する。さらに詳しくは、本発明は上記ヒト神経栄養因子3を新規な骨芽細胞増殖因子として利用することにより骨形成に関わる疾患、特に骨折の予防および治療剤に関する。
【0002】
【発明の背景】
骨は局所で骨吸収と骨形成を繰り返し、古い骨を新しい骨に置換することで内骨格としての支持機能を維持し、また種々のメカニカルストレスやミネラルバランスの変化に対し、迅速に反応する準備を整えている。この骨再造形は破骨細胞等の骨吸収系細胞、骨芽細胞等の骨形成系細胞が主体となり、両者のカップリングに基づいて遂行される。近年、骨芽細胞の機能は、単に骨形成に止まらず、破骨細胞の分化・活性化に密接に関連し、細胞連鎖的な骨改造現象におけるコントロールセンターとしてその役割を果している可能性が強いことが判明してきている(Inoue,T.,Mebio(1990),Special Version p.2〜7)。
【0003】
骨代謝疾患と総称される疾患の中には,骨粗鬆症(Osteoporosis)、ページェット病(Paget’s disease)、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含まれ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女性および老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と有効な治療法が強く望まれている。
【0004】
骨代謝疾患とは、何らかの骨組織における、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うものであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明を完成させるに至ったものである。
より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、この細胞株により生成されるタンパク質を同定したものである。
【0005】
【従来の技術】
本発明で提供されるヒト神経栄養因子−3(ヒトニューロトロフィン3、以下NT−3と称する。)はHohn,A.等およびMaisonpierre,P.C.等によって発見された(Hohn,A.et al.,Nature,vol.344,p.339−341,1990およびMaisonpierre,P.C.et al.,Science vol.247,p.1446−1451,1990)タンパク質であり、これは神経成長を促進する作用を有する。NT−3は、N末端にTyrをC末端にThrを有する119個のアミノ酸のサブユニットのダイマーからなるタンパク質であり、そのアミノ酸配列は先の文献に示されている。またNT−3はペプロテック(株)(Rocky Hill,NH 08533,USA)より市販されている(カタログ番号450−03)。先に挙げた文献にはNT−3をコードする遺伝子が記載されており、この記載に基づいて、NT−3を製造することができる。NT−3が属する神経成長因子ファミリーは現在、4種類が知られており、NT−3の他に、神経成長因子(以下NGFと呼ぶ)、脳由来神経栄養因子(以下BDNFと呼ぶ)、および、ヒト神経栄養因子−4(ヒトニューロトロフィン4)がある。これらの機能としては、BDNFは海馬の培養系において、アセチルコリンエステラーゼ陽性のニューロン数を増やすこと、およびNT−3はカルシウム結合蛋白(カルビニン)陽性のニューロン数を増やすこと等が知られている(Ip,N.Y.et al.J.Neurosci vol.13,p.3394−3405,1993)。さらに、NT−3は神経堤の前駆細胞の増殖を増加することが報告されている(Kalcheim,C.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,vol.89,p.1661−1665,1992)。
【0006】
一方、神経成長因子の受容体(レセプター)はtrkファミリーであり、これまでtrkA、trkB、trkCの3種類が知られている(Snider,W.D.Cell.vol.77,p.627−638,1994)。それぞれNGFはtrkAに結合し、BDNFはtrkBに結合し、NT−3はtrkCに特異的に結合することが知られている。trkは結腸癌由来のプロトオンコジーンであり、C末端側半分のチロシンキナーゼドメインを含む、チロシンキナーゼ型受容体構造を有する。また、このチロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列は他のレセプタータイプのチロシンキナーゼと相同性が高い。このチロシンキナーゼの活性としては、例えば、NGFの受容体であるtrkAはNGFに応答してチロシンリン酸化を受け、それ自身チロシンキナーゼ活性を示す。このチロシンキナーゼによって、MAP2(microtuble−associated protein 2,Boulton,T.G.et al.Cell vol.65,p.663−675,1991)やホスファリパーゼCがチロシンリン酸化を受け、その結果カルシウムイオンの流入がおきる。このようなシグナル伝達系によって細胞の増殖シグナルが伝わる(池内俊彦ら、実験医学vol.10,p.126−131,1992)。このようにtrkCのようなチロシンキナーゼ型レセプターはリガンドが結合することによりチロシンキナーゼが活性化されシグナル伝達が開始される。リガンドとレセプターの結合によって活性化されるCa2+チャネルはレセプター作動性Ca2+チャネルと呼ばれており、リンパ球、平滑筋などの種々の細胞で調べられている(久野みゆき、実験医学、vol.7,p.73−78,1989)。
【0007】
従来、マウス骨芽細胞様細胞株MC3T3−E1がNT−3のメッセンジャーRNA(mRNA)を発現していること、また、そのmRNAの量はMC3T3−E1細胞をTGF−βで処理することにより優位に増強することが知られていた(中西徹ら,Biochem Biophys.Res.Commun.Vol.198,p.891−897,1994)。MC3T3−E1細胞は、小玉博明ら(Jpn.J.Oral Biol.Vol.23,p.899−901,1981)が確立した細胞株で、マウスの新生頭蓋冠から樹立された石灰化能をもつ細胞株である。しかし、未だNT−3が骨芽細胞増殖因子として働くことは知られていなかった。
【0008】
【問題を解決するための手段】
本発明者は、PCR(ポリメラーゼチェインリアクション)法(PCR Tech−nology,Henry A.Erlich,Stockton Press社,1989)によりMC3T3−E1細胞がtrkCを発現していることを新たに発見した。これらの発見およびtrkCがNT−3の受容体であることに基づいて、MC3T3−E1細胞はNT−3を分泌し、NT−3はオートクリンで増殖すると結論付けた。更に、本発明者は、NT−3をMC3T3−E1細胞の培養液中に加えると、MC3T3−E1細胞を増殖させることおよびNT−3をMC3T3−E1細胞の培養液中に加えると、MC3T3−E1細胞によるカルシウムの取り込みを増加させることを確認し、NT−3が骨芽細胞増殖因子として働くと結論付けた。
【0009】
MC3T3−E1細胞の細胞増殖は、セルプロリフェレーションアッセイキット(アマーシャム社,RPN20とRPN210)で検出した。MC3T3−E1細胞を細胞密度 05×105cells/mlで細胞培養用ディッシュまたは96ウエルプレートに蒔き、4日間培養後、種々の濃度(0.2〜100ng/ml)のNT−3(ペプロテック(株),Rocky Hill,NH 08553,USA,カタログ番号450−03)を培養系に加えた。添加した翌日、アマーシャム社のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。その結果、NT−3がMC3T3−E1細胞の増殖を促すことが明らかになった。さらにカルシウム感受性蛍光試薬を使った蛍光強度の測定(Grynkiewicz,G.etal.J.Biol.Chem.vol.260,p.3440−3450.1985)によって、NT−3がMC3T3−E1細胞のカルシウムを取り込みを促進することが検出された。
即ち、これらの結果からNT−3がtrkCと結合し、オートクリンのメカニズムでMC3T3−E1細胞を増殖させていることが明らかになった。
【0010】
このように、NT−3が骨芽細胞増殖因子として作用することを本発明者らは見出し、そして骨芽細胞増殖因子が骨代謝に重要な因子であることから、本発明はNT−3からなる骨代謝疾患の予防治療剤、特に骨折の子防治療剤を提供するものである。
本発明の医薬の投与方法としては、種々の方法を用いることができるが、静脈内及び筋肉内投与が好ましい。静脈内投与の場合は通常の静脈内注射の他、点滴静注により投与することもできる。
本発明の医薬の剤型としては、種々の形態のものを使用することができるが、液剤として使用ことが好ましい。注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の1種又は2種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアンプルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とすることができる。
本発明の医薬の投与量としては、投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、通常は成人1日当たり本ペプチド誘導体として1〜500mgの範囲が好ましい。
以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0011】
【実施例】
実施例1 trkCの検出
MC3T3−E1細胞を0.5×105cells/mlの細胞密度でシャーレに蒔き、培養を開始した。培養を初めて2、6、10、13、15、28日後の細胞を回収し、その細胞から常法に従いRNAを抽出した。
抽出したRNA 0.2μgを用い、oligo d(T)存在下リバーストランスクリプターゼ(パーキンエルマー社の測定キット/宝酒造社)で処理し、一本鎖cDNAを合成した。一本鎖cDNAは0.5μMのtrkf(配列表配列番号1、アプライドバイオシステムズ社の機械を用いて合成以下同様)とtrkr(配列表配列番号2)のPCRプライマーを用い、通常の条件でアステックPC800((株)アステック)を使用しDNAを増幅し、その増幅した溶液を50倍に希釈し、更にtrkfとtrkr2(配列表配列番号3)で増幅した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にアプライし、362bpのDNAフラグメントがtrkCのバンドとして検出された(図1参照)。
このバンドをゲルから切り出し、フィルターキット(Takara Suptec 01および02、宝酒造社)を用いてDNAを抽出した。次に、ファルマシアシュアークローンキットを使用しDNA断片を平滑化、リン酸化を行い、脱リン酸化したpUC18ベクター(Sambrook,et al.Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratoy Press社,1989)へ挿入した。このプラスミドを大腸菌JM109株へ形質導入し、コロニーを単離培養後ファルマシアフレキシプレップキットを使用しプラスミドを抽出した。このプラスミドを用いDNA塩基配列をジデオキシ法(Sanger,F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.74,p.5463−5487,1977)により決定した。今回決定されたマウスのtrkCの断片(配列表配列番号4)と現在知られているラットおよびブタのtrkCの断片(Merlio,J.P.et al.,Neuroscience,vol.51,p.513−532,1992およびLamballe,F.et al.,Cell,vol.66,p.967−979,1991)との相異性を比較するとそれぞれ、異なる核酸塩基は19と29、アミノ酸残基は1と0であった。
【0012】
実施例2 NT−3によるMC3T3−E1細胞の増殖活性
MC3T3−E1細胞の細胞増殖は、セルプロリフェレーションアッセイキット(アマーシャム社,RPN20とRPN210)で検出した。MC3T3−E1細胞を細胞密度 0.5×105cells/mlで細胞培養用ディッシュまたは96ウエルプレートに蒔き、4日間培養後、種々の濃度(0.2〜100ng/ml)のNT−3(ペプロテック(株),Rocky Hill,NH 08553,USA,カタログ番号 450−03)を培養系に加えた。添加した翌日、アマーシャム社のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。このキットでは、ブロモデオキシウリジン(BrdU)が細胞内のDNAに取り込まれ、BrdUをマウス抗−BrdU抗体で結合し、2次抗体をパーオキシダーゼを結合した抗マウス抗体を用い、パーオキシダーゼ活性で検出するものである。この結果を表1に示す。値は濃度0μg/mlを1.0と表わしたときの相対比活性である。
【0013】
【表1】
【0014】
実施例3 カルシウム取り込みアッセイ
直径35mmディッシュにMC3T3−E1細胞を7.5×104cells/mlで1.5ml蒔き、種々の濃度のNT−3を含む5%ウシ胎児血清/a−MEM(Gibco社製)の培地で1日間培養した。培養後、PBSで2回洗浄後HEPES緩衝液(132mM NaCl,35mM KCl,0.5mM MgCl2,1mM CaCl2,9.5mM HEPES,5mM Glucose,Ph7.4)に溶かした5mM Fura−2AM(Dojin社製)を室温で30分処理した。細胞を洗浄後、340nm/380nmの吸光度比を測定し、0.05ng/mlのNT−3での処理を1とした時の相対比で表わした。この結果を表2に示す。
【0015】
【表2】
【0016】
NT−3を培養系に加えることにより、カルシウムの取り込みが起きることが判明した。これは、受容体であるtrkCを介したシグナルがCa2+チャネルを活性化してカルシウムイオンの流入をもたらしたと考えられる。
【0017】
【発明の効果】
本発明によって提供されるNT−3は、MC3T3−E1細胞の増殖を促し、かつカルシウム取り込みを増加するので、骨代謝性疾患の予防治療剤、特に骨形成に関わる骨折の予防治療剤として有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 trkCの電気泳動パターンの図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト神経栄養因子3からなる骨代謝疾患の予防および治療剤に関する。さらに詳しくは、本発明は上記ヒト神経栄養因子3を新規な骨芽細胞増殖因子として利用することにより骨形成に関わる疾患、特に骨折の予防および治療剤に関する。
【0002】
【発明の背景】
骨は局所で骨吸収と骨形成を繰り返し、古い骨を新しい骨に置換することで内骨格としての支持機能を維持し、また種々のメカニカルストレスやミネラルバランスの変化に対し、迅速に反応する準備を整えている。この骨再造形は破骨細胞等の骨吸収系細胞、骨芽細胞等の骨形成系細胞が主体となり、両者のカップリングに基づいて遂行される。近年、骨芽細胞の機能は、単に骨形成に止まらず、破骨細胞の分化・活性化に密接に関連し、細胞連鎖的な骨改造現象におけるコントロールセンターとしてその役割を果している可能性が強いことが判明してきている(Inoue,T.,Mebio(1990),Special Version p.2〜7)。
【0003】
骨代謝疾患と総称される疾患の中には,骨粗鬆症(Osteoporosis)、ページェット病(Paget’s disease)、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含まれ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女性および老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と有効な治療法が強く望まれている。
【0004】
骨代謝疾患とは、何らかの骨組織における、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うものであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明を完成させるに至ったものである。
より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、この細胞株により生成されるタンパク質を同定したものである。
【0005】
【従来の技術】
本発明で提供されるヒト神経栄養因子−3(ヒトニューロトロフィン3、以下NT−3と称する。)はHohn,A.等およびMaisonpierre,P.C.等によって発見された(Hohn,A.et al.,Nature,vol.344,p.339−341,1990およびMaisonpierre,P.C.et al.,Science vol.247,p.1446−1451,1990)タンパク質であり、これは神経成長を促進する作用を有する。NT−3は、N末端にTyrをC末端にThrを有する119個のアミノ酸のサブユニットのダイマーからなるタンパク質であり、そのアミノ酸配列は先の文献に示されている。またNT−3はペプロテック(株)(Rocky Hill,NH 08533,USA)より市販されている(カタログ番号450−03)。先に挙げた文献にはNT−3をコードする遺伝子が記載されており、この記載に基づいて、NT−3を製造することができる。NT−3が属する神経成長因子ファミリーは現在、4種類が知られており、NT−3の他に、神経成長因子(以下NGFと呼ぶ)、脳由来神経栄養因子(以下BDNFと呼ぶ)、および、ヒト神経栄養因子−4(ヒトニューロトロフィン4)がある。これらの機能としては、BDNFは海馬の培養系において、アセチルコリンエステラーゼ陽性のニューロン数を増やすこと、およびNT−3はカルシウム結合蛋白(カルビニン)陽性のニューロン数を増やすこと等が知られている(Ip,N.Y.et al.J.Neurosci vol.13,p.3394−3405,1993)。さらに、NT−3は神経堤の前駆細胞の増殖を増加することが報告されている(Kalcheim,C.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,vol.89,p.1661−1665,1992)。
【0006】
一方、神経成長因子の受容体(レセプター)はtrkファミリーであり、これまでtrkA、trkB、trkCの3種類が知られている(Snider,W.D.Cell.vol.77,p.627−638,1994)。それぞれNGFはtrkAに結合し、BDNFはtrkBに結合し、NT−3はtrkCに特異的に結合することが知られている。trkは結腸癌由来のプロトオンコジーンであり、C末端側半分のチロシンキナーゼドメインを含む、チロシンキナーゼ型受容体構造を有する。また、このチロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列は他のレセプタータイプのチロシンキナーゼと相同性が高い。このチロシンキナーゼの活性としては、例えば、NGFの受容体であるtrkAはNGFに応答してチロシンリン酸化を受け、それ自身チロシンキナーゼ活性を示す。このチロシンキナーゼによって、MAP2(microtuble−associated protein 2,Boulton,T.G.et al.Cell vol.65,p.663−675,1991)やホスファリパーゼCがチロシンリン酸化を受け、その結果カルシウムイオンの流入がおきる。このようなシグナル伝達系によって細胞の増殖シグナルが伝わる(池内俊彦ら、実験医学vol.10,p.126−131,1992)。このようにtrkCのようなチロシンキナーゼ型レセプターはリガンドが結合することによりチロシンキナーゼが活性化されシグナル伝達が開始される。リガンドとレセプターの結合によって活性化されるCa2+チャネルはレセプター作動性Ca2+チャネルと呼ばれており、リンパ球、平滑筋などの種々の細胞で調べられている(久野みゆき、実験医学、vol.7,p.73−78,1989)。
【0007】
従来、マウス骨芽細胞様細胞株MC3T3−E1がNT−3のメッセンジャーRNA(mRNA)を発現していること、また、そのmRNAの量はMC3T3−E1細胞をTGF−βで処理することにより優位に増強することが知られていた(中西徹ら,Biochem Biophys.Res.Commun.Vol.198,p.891−897,1994)。MC3T3−E1細胞は、小玉博明ら(Jpn.J.Oral Biol.Vol.23,p.899−901,1981)が確立した細胞株で、マウスの新生頭蓋冠から樹立された石灰化能をもつ細胞株である。しかし、未だNT−3が骨芽細胞増殖因子として働くことは知られていなかった。
【0008】
【問題を解決するための手段】
本発明者は、PCR(ポリメラーゼチェインリアクション)法(PCR Tech−nology,Henry A.Erlich,Stockton Press社,1989)によりMC3T3−E1細胞がtrkCを発現していることを新たに発見した。これらの発見およびtrkCがNT−3の受容体であることに基づいて、MC3T3−E1細胞はNT−3を分泌し、NT−3はオートクリンで増殖すると結論付けた。更に、本発明者は、NT−3をMC3T3−E1細胞の培養液中に加えると、MC3T3−E1細胞を増殖させることおよびNT−3をMC3T3−E1細胞の培養液中に加えると、MC3T3−E1細胞によるカルシウムの取り込みを増加させることを確認し、NT−3が骨芽細胞増殖因子として働くと結論付けた。
【0009】
MC3T3−E1細胞の細胞増殖は、セルプロリフェレーションアッセイキット(アマーシャム社,RPN20とRPN210)で検出した。MC3T3−E1細胞を細胞密度 05×105cells/mlで細胞培養用ディッシュまたは96ウエルプレートに蒔き、4日間培養後、種々の濃度(0.2〜100ng/ml)のNT−3(ペプロテック(株),Rocky Hill,NH 08553,USA,カタログ番号450−03)を培養系に加えた。添加した翌日、アマーシャム社のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。その結果、NT−3がMC3T3−E1細胞の増殖を促すことが明らかになった。さらにカルシウム感受性蛍光試薬を使った蛍光強度の測定(Grynkiewicz,G.etal.J.Biol.Chem.vol.260,p.3440−3450.1985)によって、NT−3がMC3T3−E1細胞のカルシウムを取り込みを促進することが検出された。
即ち、これらの結果からNT−3がtrkCと結合し、オートクリンのメカニズムでMC3T3−E1細胞を増殖させていることが明らかになった。
【0010】
このように、NT−3が骨芽細胞増殖因子として作用することを本発明者らは見出し、そして骨芽細胞増殖因子が骨代謝に重要な因子であることから、本発明はNT−3からなる骨代謝疾患の予防治療剤、特に骨折の子防治療剤を提供するものである。
本発明の医薬の投与方法としては、種々の方法を用いることができるが、静脈内及び筋肉内投与が好ましい。静脈内投与の場合は通常の静脈内注射の他、点滴静注により投与することもできる。
本発明の医薬の剤型としては、種々の形態のものを使用することができるが、液剤として使用ことが好ましい。注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の1種又は2種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアンプルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とすることができる。
本発明の医薬の投与量としては、投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、通常は成人1日当たり本ペプチド誘導体として1〜500mgの範囲が好ましい。
以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0011】
【実施例】
実施例1 trkCの検出
MC3T3−E1細胞を0.5×105cells/mlの細胞密度でシャーレに蒔き、培養を開始した。培養を初めて2、6、10、13、15、28日後の細胞を回収し、その細胞から常法に従いRNAを抽出した。
抽出したRNA 0.2μgを用い、oligo d(T)存在下リバーストランスクリプターゼ(パーキンエルマー社の測定キット/宝酒造社)で処理し、一本鎖cDNAを合成した。一本鎖cDNAは0.5μMのtrkf(配列表配列番号1、アプライドバイオシステムズ社の機械を用いて合成以下同様)とtrkr(配列表配列番号2)のPCRプライマーを用い、通常の条件でアステックPC800((株)アステック)を使用しDNAを増幅し、その増幅した溶液を50倍に希釈し、更にtrkfとtrkr2(配列表配列番号3)で増幅した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にアプライし、362bpのDNAフラグメントがtrkCのバンドとして検出された(図1参照)。
このバンドをゲルから切り出し、フィルターキット(Takara Suptec 01および02、宝酒造社)を用いてDNAを抽出した。次に、ファルマシアシュアークローンキットを使用しDNA断片を平滑化、リン酸化を行い、脱リン酸化したpUC18ベクター(Sambrook,et al.Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratoy Press社,1989)へ挿入した。このプラスミドを大腸菌JM109株へ形質導入し、コロニーを単離培養後ファルマシアフレキシプレップキットを使用しプラスミドを抽出した。このプラスミドを用いDNA塩基配列をジデオキシ法(Sanger,F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.74,p.5463−5487,1977)により決定した。今回決定されたマウスのtrkCの断片(配列表配列番号4)と現在知られているラットおよびブタのtrkCの断片(Merlio,J.P.et al.,Neuroscience,vol.51,p.513−532,1992およびLamballe,F.et al.,Cell,vol.66,p.967−979,1991)との相異性を比較するとそれぞれ、異なる核酸塩基は19と29、アミノ酸残基は1と0であった。
【0012】
実施例2 NT−3によるMC3T3−E1細胞の増殖活性
MC3T3−E1細胞の細胞増殖は、セルプロリフェレーションアッセイキット(アマーシャム社,RPN20とRPN210)で検出した。MC3T3−E1細胞を細胞密度 0.5×105cells/mlで細胞培養用ディッシュまたは96ウエルプレートに蒔き、4日間培養後、種々の濃度(0.2〜100ng/ml)のNT−3(ペプロテック(株),Rocky Hill,NH 08553,USA,カタログ番号 450−03)を培養系に加えた。添加した翌日、アマーシャム社のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。このキットでは、ブロモデオキシウリジン(BrdU)が細胞内のDNAに取り込まれ、BrdUをマウス抗−BrdU抗体で結合し、2次抗体をパーオキシダーゼを結合した抗マウス抗体を用い、パーオキシダーゼ活性で検出するものである。この結果を表1に示す。値は濃度0μg/mlを1.0と表わしたときの相対比活性である。
【0013】
【表1】
【0014】
実施例3 カルシウム取り込みアッセイ
直径35mmディッシュにMC3T3−E1細胞を7.5×104cells/mlで1.5ml蒔き、種々の濃度のNT−3を含む5%ウシ胎児血清/a−MEM(Gibco社製)の培地で1日間培養した。培養後、PBSで2回洗浄後HEPES緩衝液(132mM NaCl,35mM KCl,0.5mM MgCl2,1mM CaCl2,9.5mM HEPES,5mM Glucose,Ph7.4)に溶かした5mM Fura−2AM(Dojin社製)を室温で30分処理した。細胞を洗浄後、340nm/380nmの吸光度比を測定し、0.05ng/mlのNT−3での処理を1とした時の相対比で表わした。この結果を表2に示す。
【0015】
【表2】
【0016】
NT−3を培養系に加えることにより、カルシウムの取り込みが起きることが判明した。これは、受容体であるtrkCを介したシグナルがCa2+チャネルを活性化してカルシウムイオンの流入をもたらしたと考えられる。
【0017】
【発明の効果】
本発明によって提供されるNT−3は、MC3T3−E1細胞の増殖を促し、かつカルシウム取り込みを増加するので、骨代謝性疾患の予防治療剤、特に骨形成に関わる骨折の予防治療剤として有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 trkCの電気泳動パターンの図である。
Claims (2)
- ヒト神経栄養因子3(NT−3)からなる骨代謝疾患の予防、治療剤
- ヒト神経栄養因子3(NT−3)からなる骨折の予防、治療剤
Priority Applications (14)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20125794A JP3738281B2 (ja) | 1994-07-22 | 1994-07-22 | 新規な骨芽細胞増殖因子 |
ES95111224T ES2161809T3 (es) | 1994-07-22 | 1995-07-18 | Uso de factor proliferativo osteoblastico. |
AT95111224T ATE206930T1 (de) | 1994-07-22 | 1995-07-18 | Verwendung von osteoblast-proliferationsfaktor |
PT95111224T PT704219E (pt) | 1994-07-22 | 1995-07-18 | Utilizacao de um factor proliferativo osteoblastico |
DK95111224T DK0704219T3 (da) | 1994-07-22 | 1995-07-18 | Anvendelse af faktor for osteoblastisk celledeling |
DE69523250T DE69523250T2 (de) | 1994-07-22 | 1995-07-18 | Verwendung von Osteoblast-Proliferationsfaktor |
EP95111224A EP0704219B1 (en) | 1994-07-22 | 1995-07-18 | Use of osteoblastic proliferative factor |
FI953514A FI953514A (fi) | 1994-07-22 | 1995-07-20 | Uusi osteoblastien proliferaatiotekijä |
AU27105/95A AU693567B2 (en) | 1994-07-22 | 1995-07-20 | A novel osteoblastic proliferative factor |
KR1019950021475A KR100361717B1 (ko) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | 조골세포증식인자 |
NO952912A NO952912L (no) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | En ny osteoblastisk proliferativ faktor |
US08/505,539 US6080720A (en) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | Treatment method of bone and osteoblasts with neurotrophin-3 (NT-3) |
CA002154403A CA2154403A1 (en) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | A novel osteoblast proliferative factor |
HU9502202A HU217082B (hu) | 1994-07-22 | 1995-07-21 | Humán neurotrofin-3 alkalmazása anyagcserével kapcsolatos csontbetegségek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20125794A JP3738281B2 (ja) | 1994-07-22 | 1994-07-22 | 新規な骨芽細胞増殖因子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0834744A JPH0834744A (ja) | 1996-02-06 |
JP3738281B2 true JP3738281B2 (ja) | 2006-01-25 |
Family
ID=16437950
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20125794A Expired - Fee Related JP3738281B2 (ja) | 1994-07-22 | 1994-07-22 | 新規な骨芽細胞増殖因子 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6080720A (ja) |
EP (1) | EP0704219B1 (ja) |
JP (1) | JP3738281B2 (ja) |
KR (1) | KR100361717B1 (ja) |
AT (1) | ATE206930T1 (ja) |
AU (1) | AU693567B2 (ja) |
CA (1) | CA2154403A1 (ja) |
DE (1) | DE69523250T2 (ja) |
DK (1) | DK0704219T3 (ja) |
ES (1) | ES2161809T3 (ja) |
FI (1) | FI953514A (ja) |
HU (1) | HU217082B (ja) |
NO (1) | NO952912L (ja) |
PT (1) | PT704219E (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2787208C (en) * | 2010-01-15 | 2017-06-06 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Use of vanadium compounds to accelerate bone healing |
US20140322292A1 (en) | 2010-12-10 | 2014-10-30 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Insulin-mimetics as therapeutic adjuncts for bone regeneration |
CA2820297C (en) | 2010-12-10 | 2019-06-25 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Implantable devices coated with insulin-mimetic agent composites and methods thereof |
US9931348B2 (en) | 2011-07-06 | 2018-04-03 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Vanadium compounds as therapeutic adjuncts for cartilage injury and repair |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL95511A (en) * | 1989-08-30 | 2000-10-31 | Max Planck Gesellschaft | Neurotrophin-3 a novel neurotrophic factor related to nerve growth and brain derived neurotrophic factor |
AU2460595A (en) * | 1994-05-06 | 1995-11-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods based on the role of neurotrophin 3 in female reproduction |
-
1994
- 1994-07-22 JP JP20125794A patent/JP3738281B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-07-18 DE DE69523250T patent/DE69523250T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-18 AT AT95111224T patent/ATE206930T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-07-18 ES ES95111224T patent/ES2161809T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-18 PT PT95111224T patent/PT704219E/pt unknown
- 1995-07-18 EP EP95111224A patent/EP0704219B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-18 DK DK95111224T patent/DK0704219T3/da active
- 1995-07-20 AU AU27105/95A patent/AU693567B2/en not_active Ceased
- 1995-07-20 FI FI953514A patent/FI953514A/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-07-21 CA CA002154403A patent/CA2154403A1/en not_active Abandoned
- 1995-07-21 HU HU9502202A patent/HU217082B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-21 KR KR1019950021475A patent/KR100361717B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-07-21 US US08/505,539 patent/US6080720A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-21 NO NO952912A patent/NO952912L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2154403A1 (en) | 1996-01-23 |
DE69523250D1 (de) | 2001-11-22 |
AU2710595A (en) | 1996-02-01 |
AU693567B2 (en) | 1998-07-02 |
PT704219E (pt) | 2002-03-28 |
FI953514A (fi) | 1996-01-23 |
HU9502202D0 (en) | 1995-09-28 |
ES2161809T3 (es) | 2001-12-16 |
FI953514A0 (fi) | 1995-07-20 |
US6080720A (en) | 2000-06-27 |
DK0704219T3 (da) | 2002-02-04 |
JPH0834744A (ja) | 1996-02-06 |
NO952912L (no) | 1996-01-23 |
HUT73185A (en) | 1996-06-28 |
NO952912D0 (no) | 1995-07-21 |
KR100361717B1 (ko) | 2003-07-07 |
EP0704219B1 (en) | 2001-10-17 |
KR960003741A (ko) | 1996-02-23 |
EP0704219A3 (en) | 1997-12-10 |
EP0704219A2 (en) | 1996-04-03 |
DE69523250T2 (de) | 2002-07-04 |
HU217082B (hu) | 1999-11-29 |
ATE206930T1 (de) | 2001-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9605073B2 (en) | Modulation of activity of neurotrophins | |
Zhang et al. | Hepatocyte growth factor protects cultured rat cerebellar granule neurons from apoptosis via the phosphatidylinositol‐3 kinase/Akt pathway | |
EP1156820B1 (en) | Use of vascular endothelial growth factor-2 (vegf-2) | |
Zihlmann et al. | The GDNF family members neurturin, artemin and persephin promote the morphological differentiation of cultured ventral mesencephalic dopaminergic neurons | |
US8101571B2 (en) | Treatment methods using NGF variants | |
US7223724B1 (en) | Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells | |
US20020032153A1 (en) | Methods and compositions for the treatment and prevention of erectile dysfunction | |
JP3738281B2 (ja) | 新規な骨芽細胞増殖因子 | |
US20040138128A1 (en) | Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins, hormones and hormone receptors | |
US7132397B1 (en) | Bone morphogenetic protein antagonist based on the mature protein | |
US6630142B2 (en) | Method of treating fibroproliferative disorders | |
JP4094814B2 (ja) | 血管新生抑制剤 | |
JPH09188630A (ja) | 膵臓機能改善剤 | |
US6569419B2 (en) | Methods for promoting production of myelin by Schwann cells | |
Wimalawansa et al. | Rapid publication: Hypocalcemic actions of amylin amide in humans | |
US6809175B1 (en) | Cadherin derived growth factor and its use | |
AU773990B2 (en) | Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins, hormones and hormone receptors | |
US20230000955A1 (en) | Thrombomodulin functional domains for use in promoting osteoblast functions and bone healing | |
Bürvenich et al. | Calcitonin gene-related peptide promotes differentiation, but not survival, of rat mesencephalic dopaminergic neurons in vitro | |
AU718998B2 (en) | Variants of ciliary neurotrophic factor with enhanced receptor selectivity and method for their selection | |
WO1995015176A1 (en) | Methods of promoting the survival and differentiation of subclasses of cholinergic and serotonergic neurons using fibroblast growth factor-5 | |
US6723696B1 (en) | Bone resorption inhibitors | |
WO1995033058A1 (fr) | Codage genique pour le recepteur modifie de la proteine morphogenetique osseuse | |
JP2003052387A (ja) | 線維芽細胞増殖因子13 | |
MXPA03008571A (es) | Estimulacion de osteogenesis usando proteinas de fusion de ligando rank. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050809 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050909 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |