JP2003052387A - 線維芽細胞増殖因子１３ - Google Patents
線維芽細胞増殖因子１３Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト線維芽細胞増殖因子−１３ポリペプチ
ド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ＲＮＡ)を開示する。 【解決手段】 そのようなポリペプチドを組換え技術に
より製造する方法もまた提供する。そのようなポリペプ
チドを、例えば、熱傷および潰瘍の結果としての、創傷
の治癒を促進するために、発作と関連のある、またニュ
ーロン障害によるニューロン損傷を防いで、ニューロン
増殖を促進するために、また皮膚の老化および毛髪の喪
失を防ぐために、初期胚および肢再生における脈管形
成、中胚葉誘導を刺激するために利用する方法もまた開
示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニス
ト、および異常細胞増殖、血管過多疾患、並びに上皮レ
ンズ細胞増殖を防ぐための治療法としてのそれらの使用
もまた開示する。コード配列における変異、および宿主
から得られた試料中のポリペプチドの濃度における変化
を検出するための診断方法もまた開示する。
ド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ＲＮＡ)を開示する。 【解決手段】 そのようなポリペプチドを組換え技術に
より製造する方法もまた提供する。そのようなポリペプ
チドを、例えば、熱傷および潰瘍の結果としての、創傷
の治癒を促進するために、発作と関連のある、またニュ
ーロン障害によるニューロン損傷を防いで、ニューロン
増殖を促進するために、また皮膚の老化および毛髪の喪
失を防ぐために、初期胚および肢再生における脈管形
成、中胚葉誘導を刺激するために利用する方法もまた開
示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニス
ト、および異常細胞増殖、血管過多疾患、並びに上皮レ
ンズ細胞増殖を防ぐための治療法としてのそれらの使用
もまた開示する。コード配列における変異、および宿主
から得られた試料中のポリペプチドの濃度における変化
を検出するための診断方法もまた開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオ
チド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、
本発明のポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子／ヘパリ
ン結合増殖因子として推定的に同定され、以下で「ＦＧ
Ｆ−１３」と呼ぶ。本発明はまた、そのようなポリペプ
チドの作用を阻害することにも関する。 【０００２】線維芽細胞増殖因子は、ヘパリンに結合す
ることを特徴とするタンパク質のファミリーの１つであ
り、従って、ヘパリン結合増殖因子(ＨＢＧＦ)ともまた
呼ばれる。これらのタンパク質の異なったメンバーの発
現は、様々な組織において見い出され、また特定の時間
的および空間的制御下にある。これらのタンパク質は、
線維芽細胞、角膜並びに血管内皮細胞、顆粒球、副腎皮
質細胞、軟骨細胞、筋原細胞、血管平滑筋細胞、レンズ
上皮細胞、メラニン細胞、角化細胞、乏突起神経膠細
胞、星状膠細胞、骨芽細胞、および造血細胞を含め、中
胚葉、外胚葉、および内胚葉起源の様々な細胞に対する
強力なマイトジェンである。 【０００３】各々のメンバーは、他のメンバーと重複し
た機能を有し、その独自の機能スペクトルもまた有す
る。血管内皮細胞の増殖を刺激する能力の他に、ＦＧＦ
−１および２は両方とも、内皮細胞に対して走化性であ
り、またＦＧＦ−２は、内皮細胞が基底膜を貫通するの
を可能とすることが示された。これらの性質と一致し
て、ＦＧＦ−１および２は両方とも、脈管形成を刺激す
る能力を有する。これらの増殖因子の別の重要な特徴
は、創傷の治癒を促進する、それらの能力である。ＦＧ
Ｆファミリーの多くの他のメンバーは、脈管形成および
創傷の治癒を促進するといったような、ＦＧＦ−１およ
び２と同様の活性を共有する。ＦＧＦファミリーの幾つ
かのメンバーは、中胚葉形成を誘導して、ニューロン細
胞、脂肪細胞、および骨格筋細胞の分化を変化させるこ
とが示された。 【０００４】正常な組織における、これらの生物学的活
性以外に、ＦＧＦタンパク質は、腫瘍血管新生を促進す
ることにより、またそれらの発現が脱調節されている場
合には、トランスフォーミングタンパク質として、癌腫
および肉腫での腫瘍形成を促進することと関係してい
る。 【０００５】ＦＧＦファミリーは現在、８つの構造上関
係のあるポリペプチド：塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、in
t ２、hst １／k−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、
角化細胞増殖因子、ＡＩＧＦ(ＦＧＦ−８)からなってお
り、最近、神経膠活性化因子は、ヒト神経膠腫細胞系の
培養上清から精製された新規ヘパリン結合増殖因子であ
ることが示された(Ｍiyamoto, Ｍ.ら、Ｍol. and Ｃel
l. Ｂiol.、１３（７）：４２５１−４２５９（１９９
３）)。各々の遺伝子がクローン化されて、配列決定さ
れている。そのメンバーの２つ、ＦＧＦ−１およびＦＧ
Ｆ−２は、多くの名称で、しかし、最も多くは、各々、
酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子として特徴付けら
れている。正常な遺伝子産物は、大部分の中胚葉および
神経外胚葉由来の細胞の一般的な増殖能力に影響を及ぼ
す。それらは、インビボにおいて脈管形成を誘導するこ
とができ、また初期発生において重要な役割を果たし得
る(Ｂurgess, Ｗ. Ｈ.およびＭaciag, Ｔ.、Ａnnu. Ｒe
v. Ｂiochem.、５８：５７５−６０６（１９８９）)。 【０００６】先に同定したＦＧＦファミリーのメンバー
の多くはまた、同じ受容体にも結合し、これらの受容体
に結合することによって、第二メッセージを誘起する。 【０００７】分泌型のＦＧＦ−１をコードする真核発現
ベクターは、ブタ動脈中への遺伝子移入により導入され
た。このモデルは、インビボにおける動脈壁での遺伝子
機能を明らかにする。ＦＧＦ−１発現は、遺伝子移入か
ら２１日後、ブタ動脈における内膜肥厚を誘導した(Ｎa
bel, Ｅ. Ｇ.ら、Ｎature、３６２：８４４−６（１９
９３）)。塩基性線維芽細胞増殖因子は、腫瘍脈管形成
における、その役割とは無関係に、神経膠腫増殖および
進行を調節し得ること、また塩基性線維芽細胞増殖因子
の放出または分泌は、これらの作用に必要とされ得るこ
とがさらに実証されている(Ｍorrison, Ｒ. Ｓ.ら、Ｊ.
Ｎeurosci. Ｒes.、３４：５０２−９（１９９３）)。 【０００８】塩基性ＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子
はさらに、インビトロにおけるカポジ肉腫細胞の増殖と
関係している(Ｈuang, Ｙ. Ｑ.ら、Ｊ. Ｃlin. Ｉnves
t.、９１：１１９１−７（１９９３）)。そしてまた、
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をコードするcＤＮＡ配
列は、バクテリオファージ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに
より認識される転写プロモーターの下流にクローン化さ
れた。そのようにして得られた塩基性線維芽細胞増殖因
子は、分裂誘発性、プラスミノーゲンアクチベーターの
合成、および脈管形成アッセイにおいて、ヒト胎盤線維
芽細胞増殖因子とは区別できない生物学的活性を有する
ことが示された(Ｓquires, Ｃ. Ｈ.ら、Ｊ. Ｂiol. Ｃh
em.、２６３：１６２９７−３０２（１９８８）)。 【０００９】米国特許第５,１５５,２１４号は、実質的
に純粋な哺乳動物塩基性線維芽細胞増殖因子、およびそ
れらの製造を開示している。ウシおよびヒト塩基性線維
芽細胞増殖因子のアミノ酸配列、さらにはまた、ウシ種
の該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が開示されて
いる。 【００１０】新たに発見されたＦＧＦ−９は、ＦＧＦフ
ァミリーの他のメンバーに対して約３０％の配列類似性
を有する。ファミリーメンバーにおける２つのシステイ
ン残基および他の共通配列もまた、ＦＧＦ−９配列にお
いて十分保存された。ＦＧＦ−９は、酸性および塩基性
ＦＧＦでのように、そのＮ末端に典型的なシグナル配列
を全く有していないことが見い出された。しかし、ＦＧ
Ｆ−９は、その典型的なシグナル配列 ＦＧＦの欠損に
もかかわらず、合成後の細胞から分泌されることが見い
出された(Ｍiyamoto, Ｍ.ら、Ｍol. and Ｃell. Ｂio
l.、１３（７）：４２５１−４２５９（１９９３）)。
さらに、ＦＧＦ−９は、乏突起神経膠細胞２型 星状膠
細胞の始原細胞、ＢＡＬＢ／c３Ｔ３、およびＰＣ−１
２細胞の細胞増殖を刺激するが、ヒト臍静脈内皮細胞の
細胞増殖は刺激しないことが見い出された(Ｎaruo, Ｋ.
ら、Ｊ. Ｂiol. Ｃhem.、２６８：２８５７−２８６４
（１９９３）)。 【００１１】塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦは、細胞増
殖、細胞運動、分化、および生存の強力なモジュレータ
ーであり、外胚葉、中胚葉、および内胚葉由来の細胞タ
イプに対して作用する。これらの２つのＦＧＦは、ＫＧ
ＦおよびＡＩＧＦと共に、タンパク質精製により同定さ
れた。しかし、他の４つのメンバーは、腫瘍遺伝子とし
て単離され、この発現は、胚形成およびあるタイプの癌
に制限された。ＦＧＦ−９は、神経膠細胞に対するマイ
トジェンであることが実証された。ＦＧＦファミリーの
メンバーは、腫瘍形成能力を有することが報告されてい
る。ＦＧＦ−９は、ＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞へとトラン
スフォームした場合には、トランスフォームする能力を
示した(Ｍiyamoto, Ｍ.ら、Ｍol. Ｃell. Ｂiol.、１３
（７）：４２５１−４２５９（１９９３）)。 【００１２】ＦＧＦ−８としてもまた知られているアン
ドロゲン誘導増殖因子(ＡＩＧＦ)は、テストステロンで
刺激されたマウス乳癌細胞(ＳＣ−３)のコンディション
ド培地から精製された。ＡＩＧＦは、特徴のあるＦＧＦ
様増殖因子であり、推定されるシグナルペプチドを有
し、またＦＧＦファミリーの既知のメンバーと３０−４
０％の相同性を共有する。ＡＩＧＦでトランスフォーム
された哺乳動物細胞は、アンドロゲンの不存在下、ＳＣ
−３細胞の増殖に対して著しい刺激効果を示す。従っ
て、ＡＩＧＦは、それが腫瘍細胞自体により分泌される
ことから、ＳＣ−３細胞、およびことによると他の細胞
のアンドロゲン誘導増殖を媒介する。 【００１３】本発明のポリペプチドは、ＦＧＦファミリ
ーの他のメンバーとのアミノ酸配列の相同性の結果とし
て、ＦＧＦファミリーのメンバーとして推定的に同定さ
れている。 【００１４】本発明の一態様により、新規成熟ポリペプ
チド、さらにはまた、生物学的に活性であって、診断上
または治療上有用な、そのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト
起源である。 【００１５】本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、本発明のポリペプ
チドをコードする、単離された核酸分子、さらにはま
た、そのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性
であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメン
トを提供する。 【００１６】本発明のさらに別の態様により、本発明の
ポリペプチドの組換え製造における試薬として有用な、
クーロニングおよび発現プラスミドといったような組換
えベクター、さらにはまた、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸配列を含んでなる組換え原核および／また
は真核宿主細胞の使用によって、そのようなポリペプチ
ドを組換え技術により製造する方法を提供する。 【００１７】本発明のさらなる態様により、そのような
ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを、それに対するアゴニストおよ
びアンタゴニストに関してスクリーニングするために、
また治療目的に、例えば、熱傷および潰瘍の結果として
の、例えば、創傷の治癒を促進するために、発作と関連
のある、またニューロン障害によるニューロン損傷を防
いで、ニューロン増殖を促進するために、また皮膚の老
化および毛髪喪失を防ぐために、初期胚および肢再生に
おける脈管形成および中胚葉誘導を刺激するために利用
する方法を提供する。 【００１８】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。 【００１９】本発明のまた別の態様により、例えば、細
胞トランスフォーメーション、例えば、腫瘍の処置にお
いて、そのようなポリペプチドの作用を阻害するため
の、瘢痕形成(scarring)を減少させて、血管過多疾患を
処置するための、そのようなポリペプチドに対するアン
タゴニスト、およびそれらの使用方法を提供する。 【００２０】本発明の別の態様により、本発明のポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブ
リダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核
酸プローブを提供する。 【００２１】本発明のまた別の態様により、本発明の核
酸配列における変異に関係のある疾患、または疾患に対
する感受率を検出するための、またそのような配列によ
りコードされるポリペプチドの過剰発現を検出するため
の診断アッセイを提供する。 【００２２】本発明の別の態様により、科学調査、ＤＮ
Ａの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関係のあるイ
ンビトロにおける目的に、そのようなポリペプチド、ま
たはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを利用する方法を提供する。 【００２３】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。 【００２４】次の図面は、本発明の具体的な態様の説明
としてのみ記載するものであって、いかようにも限定と
して記載するものではない。第１図は、ＦＧＦ−１３の
cＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。
最初の２１個のアミノ酸残基は、推定されるリーダー配
列を表す。 【００２５】本発明の一態様により、第１図(配列番号
２)の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、ま
たは１９９５年５月１２日にＡＴＣＣ寄託番号第９７１
４７号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核
酸分子(ポリヌクレオチド)を提供する。 【００２６】本発明のＦＧＦ−１３をコードするポリヌ
クレオチドは、ヒト卵巣癌組織から得られたcＤＮＡラ
イブラリー中で発見された。該ＦＧＦ−１３ポリペプチ
ドは、構造上、線維芽細胞増殖因子ファミリーの全ての
メンバーに関係があり、また２１２個のアミノ酸のポリ
ペプチドをコードするオープンリーディングフレームを
含み、このうち、最初の２１個のアミノ酸は推定される
リーダー配列を表すことから、成熟ポリペプチドは１９
１個のアミノ酸を含んでなる。トップのうち、適合は、
１）マウスＡＩＧＦに対して、１８５個のアミノ酸範囲
にわたり、６９％の同一性および８１％の類似性；２）
ニワトリ由来のＦＧＦ−４と、８２個のアミノ酸の領域
で、３０％の同一性および５６％の類似性；３）ヒトＫ
ＧＦと、７８個のアミノ酸範囲にわたり、４１％の同一
性および６４％の類似性である。 【００２７】ＦＧＦ／ＨＢＧＦファミリーのサイン(sig
nature)、ＧＸＬＸ(Ｓ,Ｔ,Ａ,Ｇ)Ｘ６(Ｄ,Ｅ)ＣＸＦＸ
Ｅは、本発明のポリペプチドにおいて保存される(Ｘは
いずれかのアミノ酸残基を意味し；(Ｄ,Ｅ)はＤまたは
Ｅ残基のいずれかを意味し；Ｘ６はいずれかの６つのア
ミノ酸残基を意味する)。 【００２８】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。成熟ポリペ
プチドをコードするコード配列は、第１図(配列番号１)
に示すコード配列もしくは寄託されたクローンのコード
配列と同じであってよく、または遺伝コードの重複また
は縮重の結果として、第１図(配列番号１)のＤＮＡもし
くは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコー
ドする異なったコード配列であってもよい。 【００２９】第１図(配列番号２)の成熟ポリペプチドま
たは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のもの
が含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成
熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは
分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加
的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場
合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチ
ドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'お
よび／または３'といったような非コード配列。 【００３０】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。 【００３１】本発明はさらに、第１図(配列番号２)の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託された
クローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする、
上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレ
オチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する
アレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在し
ない変異体であり得る。 【００３２】従って、本発明には、第１図(配列番号２)
に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクロ
ーンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、その
ようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変
異体は、第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託
されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコード
する。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異
体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれ
る。 【００３３】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、第１図(配列番号１)に示すコード配列の天然に存在
するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配
列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有
し得る。当業界で知られているように、アレル変異体
は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失ま
たは付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であ
り、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的
には変えない。 【００３４】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ド配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分
泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリ
ヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペ
プチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切
断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配
列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付
加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプ
ロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タ
ンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタン
パク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟
タンパク質が残る。 【００３５】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の
両方を有するタンパク質をコードし得る。 【００３６】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson, Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６
７（１９８４）)。 【００３７】「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖
の製造に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；それに
は、コード領域より前および後の領域(リーダーおよび
トレーラー)、さらにはまた、個々のコードセグメント
(エキソン)間の介在配列(イントロン)が含まれる。 【００３８】完全な長さのＦＧＦ−１３遺伝子のフラグ
メントは、完全な長さの遺伝子を単離するために、また
該遺伝子に対して高い配列類似性、または類似の生物学
的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡ
ライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブ
として使用することができる。このタイプのプローブ
は、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、例えば、５
０またはそれ以上の塩基を含むのがよい。該プローブは
また、完全な長さの転写物、およびゲノムクローン、ま
たは調節並びにプロモーター領域、エキソン、およびイ
ントロンが含まれる、完全なＦＧＦ−１３遺伝子を含む
クローンに対応するcＤＮＡクローンを同定するのに使
用することもできる。スクリーニングの例は、既知のＤ
ＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成
することにより、ＦＧＦ−１３遺伝子のコード領域を単
離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補
的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトの
cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーを
スクリーニングするために使用して、ライブラリーのど
のメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定す
る。 【００３９】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましく
は少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列
にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発
明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレ
オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条
件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好
ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、
ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味す
る。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図(配列番号
１)のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードさ
れる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を
実質的にはいずれか保有するポリペプチドをコードす
る。 【００４０】あるいはまた、該ポリヌクレオチドは、本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、また上記
のように、それに対して同一性を有し、また活性を保有
し得るか、または保有し得ない、少なくとも２０塩基、
好ましくは少なくとも３０塩基、またさらに好ましくは
少なくとも５０塩基を有するのがよい。例えば、そのよ
うなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの
回収のための、配列番号１のポリヌクレオチドに対する
プローブとして、または診断プローブとして、またはＰ
ＣＲプライマーとして使用することができる。 【００４１】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チド、さらにはまた、そのフラグメント(このフラグメ
ントは、少なくとも３０塩基、また好ましくは少なくと
も５０塩基を有する)をコードするポリヌクレオチドに
対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくと
も９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％の同
一性を有するポリヌクレオチド、およびそのようなポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関す
る。 【００４２】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下に保
持されるであろう。これらの寄託は、単に便宜として与
えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１
２下に要求されることを承認するものではない。寄託さ
れた物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらに
はまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配
列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合してい
る。寄託された物質を製造し、使用し、または販売する
には、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾
は、ここでは付与されない。 【００４３】本発明はさらに、第１図(配列番号２)の推
定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡに
よりコードされるアミノ酸配列を有するＦＧＦポリペプ
チド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグ
メント、アナログ、および誘導体に関する。 【００４４】第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは
寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナ
ログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチド
を意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部
分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペ
プチドを製造することができるプロプロテインが含まれ
る。 【００４５】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。 【００４６】第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは
寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ
またはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミ
ノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されて
おり、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードに
よりコードされるものであってもよく、またはコードさ
れたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以
上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（ii
i）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増
加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のよ
うな、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リ
ーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精
製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といっ
たような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合し
ているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導
体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範
囲内であると思われる。 【００４７】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。 【００４８】「単離された」という用語は、物質がその
元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の
環境)から除去されていることを意味する。例えば、生
きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
ける共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単
離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクター
の部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、ま
たそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の
部分ではないという点で、なお単離されている。 【００４９】本発明のポリペプチドには、配列番号２の
ポリペプチド(特に、成熟ポリペプチド)、さらにはま
た、配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０
％の類似性(好ましくは少なくとも７０％の同一性)、ま
たさらに好ましくは配列番号２のポリペプチドに対して
９０％の類似性(さらに好ましくは少なくとも９０％の
同一性)、またなおさらに好ましくは配列番号２のポリ
ペプチドに対して少なくとも９５％の類似性(なおさら
に好ましくは少なくとも９５％の同一性)を有するポリ
ペプチドが含まれ、通例、少なくとも３０個のアミノ
酸、またさらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸
を含む、そのようなポリペプチドの部分をもつ、そのよ
うなポリペプチドの部分もまた含まれる。 【００５０】当業界で知られているように、２つのポリ
ペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミ
ノ酸配列およびその同類的アミノ酸置換物を、もう１つ
のポリペプチドの配列と比較することにより測定する。 【００５１】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、対応する完全な長さのポリペプチドをペプチ
ド合成により製造するために使用することができ；従っ
て、そのフラグメントは、完全な長さのポリペプチドを
製造するための中間体として使用することができる。本
発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を使
用して、本発明の完全な長さのポリヌクレオチドを合成
することができる。 【００５２】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。 【００５３】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作することができる(トランスデュースし、ま
たはトランスフォームし、またはトランスフェクトする
ことができる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、
ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された
宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォー
マントを選択し、またはＦＧＦ遺伝子を増幅するのに適
するよう改変された従来の栄養培地で培養することがで
きる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用
に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であっ
て、当業者に明らかであろう。 【００５４】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチド配列を、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ビヒクル、特にベクタ
ーまたはプラスミドのいずれか１つに含ませることがで
きる。そのようなベクターには、染色体、非染色体およ
び合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プ
ラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミ
ドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；
ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬
病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、
他のいずれのベクターまたはプラスミドも、それらが宿
主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用す
ることができる。 【００５５】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。 【００５６】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ. coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
ＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。 【００５７】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ. coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つの遺伝子を含むのが好ましい。 【００５８】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ. coli、Ｓalmonella typhimurium、Ｓt
reptomycesといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；ＤrosophilaＳ２およびＳpodoptera Ｓf９といっ
たような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢowesメラ
ノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物
細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると思われる。 【００５９】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含んでなる。この実施態
様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該
配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配
列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが
多数、当業者に知られていて、市販されている。次のベ
クターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ６
０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、ファージスクリプト
(phagescript)、psiＸ１７４、pＢluescript ＳＫ、pＢ
sＫＳ、pＮＨ８a、pＮＨ１６a、pＮＨ１８a、pＮＨ４６
a(Ｓtratagene)；pＴＲＣ９９Ａ、pＫＫ２２３−３、p
ＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmaci
a)。真核生物用: pＷＬneo、pＳＶ２cat、pＯＧ４４、p
ＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、p
ＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれの
プラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可
能であって、生存可能である限り、使用することができ
る。 【００６０】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲ、ＰＬおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。 【００６１】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis, Ｌ.、Ｄ
ibner, Ｍ.、Ｂattey, Ｌ.、Ｂasic Ｍethodsin Ｍolec
ular Ｂiology（１９８６）)。 【００６２】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。 【００６３】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、第２版（Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、１９８９）により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。 【００６４】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサ
ー(bp １００〜２７０)、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポ
リオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハン
サーが含まれる。 【００６５】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ. coliのアンピ
シリン耐性遺伝子並びにＳ. cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、および下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。 【００６６】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ. coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella ty
phimurium、およびＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
並びにＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。 【００６７】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびpＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadi
son、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。 【００６８】適当な宿主株をトランスフォーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シ
フトまたは化学誘導)により抑制解除して、細胞をさら
なる期間培養する。 【００６９】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。 【００７０】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊することができる。 【００７１】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のウイルスゲノム、例えば、ＳＶ４０の開始
点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライシング
から得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を
使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることが
できる。 【００７２】本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラ
フィーを含め、現在まで使用されている方法により、組
換え細胞培養物から回収して、精製することができる。
必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク
質の立体配置を完成するのに使用することができる。最
後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終
精製工程に使用することができる。 【００７３】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコ
シル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本
発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ
酸残基が含まれ得る。 【００７４】本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増
殖を刺激する能力の結果として、血栓症、動脈硬化症、
および他の心臓血管状態といったような、様々な疾患状
態による虚血組織の脈管再生を刺激するための処置にお
いて使用することができる。これらのポリペプチドはま
た、脈管形成および肢再生を刺激するために使用するこ
ともできる。 【００７５】該ポリペプチドはまた、それらが線維芽細
胞および骨格筋細胞といったような、異なった起源の様
々な細胞に対して分裂誘発性であり、従って、損傷を受
けた、または疾患に罹った組織の修復または置換を促進
することから、負傷、熱傷、手術後の組織修復、および
潰瘍による創傷を処置するために使用することもでき
る。 【００７６】本発明のポリペプチドはまた、ニューロン
増殖を刺激するために、また発作と関連のある、またア
ルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関係
コンプレックスといったような、あるニューロン障害ま
たは神経変性状態において起こるニューロン損傷を処置
する、また防ぐために使用することもできる。ＦＧＦ−
１３は、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し、従って、
それらは、骨および歯周再生を高めて、組織移植片また
は骨移植片を補助するために使用することができる。 【００７７】本発明のポリペプチドはまた、角化細胞増
殖を刺激することにより、日焼けによる皮膚の老化を防
ぐために使用することもできる。 【００７８】該ＦＧＦ−１３ポリペプチドはまた、ＦＧ
Ｆファミリーメンバーが毛髪形成細胞を活性化して、メ
ラニン細胞増殖を促進することから、毛髪の喪失を防ぐ
ために使用することもできる。同じ観点から(along the
same lines)、本発明のポリペプチドは、他のサイトカ
インと組み合わせて使用する場合、造血細胞および骨髄
細胞の増殖および分化を刺激するために使用することが
できる。 【００７９】該ＦＧＦ−１３ポリペプチドはまた、移植
前に臓器を保持するために、または一次組織の細胞培養
を支持するために使用することもできる。 【００８０】本発明のポリペプチドはまた、初期胚にお
いて中胚葉起源の組織を誘導して分化するために使用す
ることもできる。 【００８１】本発明のまたさらなる態様により、科学調
査、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの製造に関係のある
インビトロにおける目的に、またヒト疾患の処置に対す
る診断法および治療法を提供する目的に、そのようなポ
リペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。 【００８２】本発明は、本発明のポリペプチドの受容体
の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子
は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リガン
ドパンニングおよびＦＡＣＳ選別により同定することが
できる(Ｃoliganら、ＣurrentＰrotocols in Ｉmmun.、
１（２)、第５章、（１９９１）)。好ましくは、発現ク
ローニングを使用し、ここでは、ポリアデニル化ＲＮＡ
を該ポリペプチドに応答する細胞、例えば、ＦＧＦファ
ミリータンパク質の複合受容体を含むことが知られてい
るＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＳＣ−３細胞から調製し
て、このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリーをプ
ールに分けて、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応答
しない他の細胞をトランスフェクトするために使用す
る。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェクト
された細胞を、標識化した後の本発明のポリペプチドに
さらす。該ポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的
プロテインキナーゼに対する認識部位の包含を含め、様
々な方法により標識化することができる。 【００８３】固定およびインキュベーションに続いて、
そのスライドをオートラジオグラフ分析にかける。陽性
のプールを同定して、サブプールを調製し、反復サブプ
ーリングおよび再スクリーニング方法を使用して、再び
トランスフェクトし、最終的には、推定される受容体を
コードする単一クローンを得る。 【００８４】受容体を同定するための他の方法として、
標識化ポリペプチドを細胞膜と光親和性により結合させ
るか、または受容体分子を発現する調製物を抽出するこ
とができる。橋かけ(cross-linked)物質をＰＡＧＥ分析
により分けて、Ｘ線フィルムにさらす。該ポリペプチド
の受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグ
メントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけるこ
とができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列
を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを
設計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、
推定される受容体をコードする遺伝子が同定されるであ
ろう。 【００８５】本発明は、化合物をスクリーニングして、
本発明のポリペプチドの作用を変化させる化合物を同定
する方法を提供する。そのようなアッセイの例は、線維
芽細胞が正常に増殖するであろう細胞培養条件下、哺乳
動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニン
グすべき化合物、および３[Ｈ]チミジンを混合すること
を含んでなる。対照アッセイをスクリーニングすべき化
合物の不存在下に行い、該化合物の存在下における線維
芽細胞増殖の量と比較して、各々の場合における３[Ｈ]
チミジンの摂取を測定することにより、該化合物が増殖
を刺激するかどうかを決定することができる。線維芽細
胞増殖の量は、３[Ｈ]チミジンの取り込みを測定する液
体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定す
る。アゴニストおよびアンタゴニスト化合物は両方と
も、この方法により同定することができる。 【００８６】別の方法では、該化合物の存在下、本発明
のポリペプチドの受容体を発現する哺乳動物細胞または
膜調製物を標識化した本発明のポリペプチドと共にイン
キュベートする。次いで、この相互反応を高める、また
はブロックする化合物の能力を測定することができる。
あるいはまた、スクリーニングすべき化合物とＦＧＦ−
１３受容体との相互反応後の、既知の第二メッセンジャ
ーシステムの応答を測定し、該受容体に結合して、第二
メッセンジャー応答を誘起する該化合物の能力を測定し
て、該化合物が可能性のあるアゴニストまたはアンタゴ
ニストであるかどうかを決定する。そのような第二メッ
センジャーシステムには、限定されるものではないが、
cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、ま
たはホスホイノシチド加水分解が含まれる。 【００８７】アンタゴニスト化合物の例には、抗体、ま
た幾つかの場合には、本発明のポリペプチドの受容体に
結合するが、第二メッセンジャー応答は全く誘起せず、
またはＦＧＦ−１３ポリペプチド自体に結合するオリゴ
ヌクレオチドが含まれる。あるいはまた、可能性のある
アンタゴニストは、該受容体に結合するが、第二メッセ
ンジャー応答は全く誘起せず、従って、該ポリペプチド
の作用を有効にブロックする変異型のポリペプチドであ
り得る。 【００８８】ＦＧＦ−１３遺伝子および遺伝子産物に対
する別のアンタゴニスト化合物は、アンチセンス技術を
使用して製造されたアンチセンス構築物である。アンチ
センス技術を使用して、三重らせん形成またはアンチセ
ンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御す
ることができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチド
のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発
明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド
配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩
基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計す
る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝
子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−
Ｌeeら、Ｎucl. Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７
９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８
８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０
（１９９１）を参照)、そのことによって、転写および
本発明のポリペプチドの産生を妨げる。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡ
にハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のポリペプチドへ
の翻訳をブロックする(Ａntisense−Ｏkano、Ｊ. Ｎeur
ochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucle
otides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpress
ion、ＣＲＣ Ｐress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１９８
８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り
込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをイン
ビボにおいて発現させて、該ポリペプチドの産生を阻害
することができる。 【００８９】可能性のあるアンタゴニスト化合物にはま
た、該受容体の結合部位に結合して占有し、そのことに
よって、該受容体をそのポリペプチドに近づき難くする
ことから、正常な生物学的活性を妨げる小さな分子も含
まれる。小さな分子の例には、限定されるものではない
が、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。 【００９０】アンタゴニスト化合物は、本発明のポリペ
プチドの、新生細胞および組織に及ぼす細胞成長および
増殖効果、すなわち、腫瘍の脈管形成の刺激を阻害し、
従って、例えば、腫瘍形成または増殖における、異常細
胞成長および増殖を遅延する、または妨げるために使用
することができる。 【００９１】該アンタゴニストはまた、血管過多疾患を
防いで、嚢外白内障手術後の上皮レンズ細胞の増殖を防
ぐために使用することもできる。本発明のポリペプチド
の分裂誘発活性の防止はまた、バルーン血管形成術後の
再狭窄のような場合にも望ましい。 【００９２】該アンタゴニストはまた、創傷の治癒の間
の瘢痕組織の増殖を防ぐために使用することもできる。 【００９３】該アンタゴニストはまた、薬学上許容され
得る担体、例えば、以下に記載するような担体と共に、
組成物中で使用することもできる。 【００９４】本発明のポリペプチド、アゴニスト、およ
びアンタゴニストは、非経口投与のための医薬組成物を
なすために、適当な薬学的担体と組み合わせて使用する
ことができる。そのような組成物は、治療上有効な量の
ポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニスト、お
よび薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでな
る。そのような担体には、これに限定されるものではな
いが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組
み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべ
きである。 【００９５】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチド、アゴ
ニスト、およびアンタゴニストは、他の治療化合物と共
に使用することができる。 【００９６】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を処置および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも
約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場
合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量
で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路およ
び症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／k
g〜約１mg／kg(体重)である。局所投与の具体的な場合
には、用量は、１cm２当り約０.１μg〜９mgを投与する
のが好ましい。 【００９７】本発明のポリペプチド、およびポリペプチ
ドであるアゴニスト並びにアンタゴニスト化合物はま
た、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのような
ポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に
従って使用することもできる。 【００９８】従って、例えば、細胞を、エクスビボにお
いてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプ
チドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当
業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によっ
て、細胞を当業界で既知の方法により操作することがで
きる。 【００９９】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、該ポリペプチドのインビボにおける発現のために、
細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界
で知られているように、細胞をインビボにおいて処理し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス粒子以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組
み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために
使用することができるアデノウイルスであってもよい。 【０１００】上述のレトロウイルスプラスミドベクター
を得ることができるレトロウイルスには、限定されるも
のではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死
ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイル
ス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイル
ス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖
性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスといったようなレ
トロウイルスが含まれる。一態様では、レトロウイルス
プラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス
から得られる。 【０１０１】該ベクターには、１つまたはそれ以上のプ
ロモーターが含まれる。使用することができる適当なプ
ロモーターには、限定されるものではないが、レトロウ
イルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭiller
ら、Ｂiotechniques、第７巻、第９号、９８０−９９０
（１９８９）に記載されているヒトサイトメガロウイル
ス(ＣＭＶ)プロモーター、またはいずれかの他のプロモ
ーター(例えば、限定されるものではないが、ヒスト
ン、pol III、およびβ−アクチンプロモーターが含ま
れる、真核細胞性プロモーターのような細胞性プロモー
ター)が含まれる。使用することができる他のウイルス
プロモーターには、限定されるものではないが、アデノ
ウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモ
ーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが含
まれる。適当なプロモーターの選択は、本明細書中に含
まれる教示から当業者に明らかであろう。 【０１０２】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターの制御下にある。使用するこ
とができる適当なプロモーターには、限定されるもので
はないが、アデノウイルス主要後期プロモーターのよう
なアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウ
イルス(ＣＭＶ)プロモーターのようなヘテロロガスプロ
モーター；呼吸合胞体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター；
ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターと
いったような誘導可能なプロモーター；熱ショックプロ
モーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプロモー
ター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジ
ンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナ
ーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ(上記の修飾
されたレトロウイルスＬＴＲが含まれる)；β−アクチ
ンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーター
が含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであっ
てもよい。 【０１０３】レトロウイルスプラスミドベクターを使用
して、プロデューサー細胞系を形成するためにパッケー
ジング細胞系をトランスデュースする。トランスフェク
トすることができるパッケージング細胞の例には、限定
されるものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＲＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋envＡm１２、およびＭiller、Ｈuman Ｇene
Ｔherapy、第１巻、５−１４頁（１９９０）（これに記
載されている内容は全て、本発明の一部を構成する）に
記載されているＤＡＮ細胞系が含まれる。該ベクター
は、当業界で知られている方法のいずれかによって、パ
ッケージング細胞をトランスデュースすることができ
る。そのような方法には、限定されるものではないが、
電気穿孔、リポソームの使用、およびＣaＰＯ４沈降が
含まれる。１つの他の方法では、レトロウイルスプラス
ミドベクターをリポソームに封入する、または脂質に結
合させた後、宿主に与えることができる。 【０１０４】該プロデューサー細胞系は、該ポリペプチ
ドをコードする核酸配列が含まれる感染性レトロウイル
スベクター粒子を発生させる。次いで、そのようなレト
ロウイルスベクター粒子を使用して、真核細胞をインビ
トロまたはインビボのいずれかにおいてトランスデュー
スすることができる。トランスデュースされた真核細胞
は、該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するで
あろう。トランスデュースすることができる真核細胞に
は、限定されるものではないが、胚幹細胞、胚癌細胞、
さらにはまた、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、角質細胞、内皮細胞、および気管支上皮細胞が含
まれる。 【０１０５】本発明はまた、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸配列における変異の存在に関係がある疾
患、または疾患に対する感受性を検出するための診断ア
ッセイの一部としての、本発明の遺伝子の使用にも関す
る。 【０１０６】本発明の遺伝子において変異が起こってい
る個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出する
ことができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例え
ば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得る
ことができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用
することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎa
ture、３２４：１６３−１６６（１９８６）)を使用す
ることにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡ
またはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができ
る。例としては、本発明のポリペプチドをコードする核
酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、変異を同定
して分析することができる。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにお
ける変化により検出することができる。点変異は、増幅
されたＤＮＡが、放射能標識化したＲＮＡ、あるいはま
た、放射能標識化したアンチセンスＤＮＡ配列にハイブ
リダイズすることにより同定することができる。完全に
対合している配列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化により、また
は融解温度の相違により、対合していない複式物(duple
xes)と区別することができる。 【０１０７】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、
変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂
げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高
分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。Ｄ
ＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラ
ジエントゲルを変性することで区別することができ、こ
こでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それら
の特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルに
おける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓc
ience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。 【０１０８】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−
４４０１（１９８５）)。 【０１０９】従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲ
ノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保
護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の
使用(例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およ
びサザンブロッティングといったような方法により成し
遂げることができる。 【０１１０】さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ
配列決定に加えて、変異はまた、insitu 分析により検
出することもできる。 【０１１１】本発明はまた、正常な対照の組織試料と比
較しての該タンパク質の過剰発現が、異常細胞増殖、例
えば、腫瘍の存在を検出することができることから、様
々な組織におけるＦＧＦ−１３タンパク質レベルの変化
を検出するための診断アッセイにも関する。宿主から得
られた試料中のタンパク質レベルを検出するために使用
されるアッセイは当業者に周知であって、ラジオイムノ
アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッ
セイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ(Ｃoliganら、Ｃu
rrent Ｐrotocolsin Ｉmmunology、１（２）、第６章、
（１９９１）)は、まず最初に、本発明のポリペプチド
に対する抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナ
ル抗体を調製することを含んでなる。さらに、リポータ
ー抗体を、そのモノクローナル抗体に対して調製する。
そのリポーター抗体に、放射能、蛍光、または本実施例
では、ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような、検
出可能な試薬を結合させる。試料を宿主から取り除い
て、試料中のタンパク質を結合する固形保持体、例え
ば、ポリスチレン皿の上でインキュベートする。次い
で、ウシ血清アルブミンのような、非特異的なタンパク
質と共にインキュベートすることにより、その皿の上の
空いているタンパク質結合部位を全て覆う。次に、モノ
クローナル抗体を皿においてインキュベートするが、そ
の間に、そのモノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に
結合した全ての本発明のポリペプチドに結合する。結合
しなかったモノクローナル抗体を全て、緩衝液で洗い流
す。ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体
を直ちに皿に置くと、リポーター抗体の、問題のタンパ
ク質に結合した全てのモノクローナル抗体への結合が起
こる。 【０１１２】次いで、結合しなかったリポーター抗体を
洗い流す。次いで、ペルオキシダーゼ基質を皿に加え
て、一定時間に発生した色の量は、標準曲線に対して比
較する場合、患者の試料の一定体積中に存在する本発明
のポリペプチドの量の測定値である。 【０１１３】競合アッセイを使用することができ、ここ
では、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を固形保持
体に結合させて、標識化したＦＧＦ−１３および宿主か
ら得られた試料を固形保持体上に通過させて、例えば、
液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出さ
れる標識の量を、試料中の本発明のポリペプチドの量に
関連づけることができる。 【０１１４】「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡ
アッセイに似ている。「サンドイッチ」アッセイでは、
本発明のポリペプチドを固形保持体上に通過させて、固
形保持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第二抗
体を、問題のポリペプチドに結合させる。標識化され、
また第二抗体に特異的な第三抗体を固形保持体上に通過
させて、第二抗体に結合させた後、量を定量することが
できる。 【０１１５】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性の)に
基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置を
マークするのにはほとんど利用できない。本発明による
ＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気
と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【０１１６】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。３'非翻
訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ
中の１つ以上のエクソンをスパン(span)しないプライマ
ーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものと
する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに
使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、そ
れらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを
与えるであろう。 【０１１７】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を使用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に使用することができる他のマッピング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。 【０１１８】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を使用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５０または６０塩基という短
いcＤＮＡで使用することができる。この技術の復習に
は、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂ
asic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク
（１９８８）を参照。 【０１１９】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ. ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。 【０１２０】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。 【０１２１】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の分析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因
となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１
メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺
伝子を仮定する)。 【０１２２】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。 【０１２３】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。 【０１２４】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗
体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ. Ｌiss, Ｉnc.、７７−９６頁にお
いて)が含まれる。 【０１２５】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適
合し得る。それにまた、トランスジェニックマウスを使
用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒ
ト化抗体を発現させることができる。 【０１２６】本発明をさらに、次の実施例に関して記載
する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定され
ないことを理解すべきである。部または量は全て、特に
ことわらない限り、重量単位である。 【０１２７】次の実施例の理解を容易にするために、幾
つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載す
る。 【０１２８】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。 【０１２９】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常使用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。 【０１３０】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel, Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。 【０１３１】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。 【０１３２】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis, Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。 【０１３３】特にことわらない限り、トランスフォーメ
ーションは、Ｇraham, Ｆ.およびＶan der Ｅb, Ａ.、
Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法
に記載されているようにして行った。 【０１３４】 【実施例】実施例 １ＦＧＦ−１３タンパク質の細菌発現および精製 最初に、ＦＧＦ−１３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣ
Ｃ第９７１４７号を、プロセシングされたタンパク質の
５'配列(シグナルペプチド配列なし)およびその遺伝子
の３'側のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して増幅する。その遺伝子に対
応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に
付加する。５'オリゴヌクレオチドプライマー： GCCAGACCAT GGAGAATCAC CCGTCTCCTA AT 32（配列番号３） は、Ｎco制限酵素部位を含む。３'配列： GATTTAAGAT CTCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30 （配列番号４） は、ＢglII部位に対する相補的配列を含み、その後に１
８ヌクレオチドのＦＧＦ−１３コード配列が続く。 【０１３５】その制限酵素部位は、細菌発現ベクター p
ＱＥ−６０(Ｑiagen,Ｉnc. Ｃhatsworth、ＣＡ ９１３
１１)上の制限酵素部位に対応する。pＱＥ−６０は、抗
生物質耐性(Ａmpｒ)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴ
Ｇ−調節可能なプロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リ
ボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵
素部位をコードする。次いで、pＱＥ−６０をＮcoＩお
よびＢglIIで消化した。増幅された配列をpＱＥ−６０
にライゲートして、ヒスチジンタグおよびリボソーム結
合部位(ＲＢＳ)をコードする配列と共に枠内に挿入す
る。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｓ
ambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory
Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８
９）に記載されている手順により、Ｅ.coli.株 Ｍ１５
／rep４(Ｑiagen,Ｉnc.)をトランスフォームする。Ｍ１
５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、
これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイ
シン耐性(Ｋanｒ)も与える。トランスフォーマントを、
それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、
アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。
プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認す
る。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１００ug／m
l)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地中での液
体培養で一晩増殖させる(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を
使用して、大きな培養系に１：１００〜１：２５０の割
合で播種する。細胞を、０.４〜０.６の光学密度６００
(Ｏ.Ｄ. ６００)まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ
(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)
を、最終濃度が１mＭとなるまで加える。ＩＰＴＧは、l
acＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏの
クリアリングを誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞
をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分
離により収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤で
ある６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化する。清澄
後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク
質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キ
レートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化し
たＦＧＦ−１３を精製する(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhrom
atography ４１１：１７７−１８４（１９８４）)。６
モルのグアニジンＨＣl pＨ ５.０中、そのタンパク質
をカラムから溶出し、また再生の目的に、３モルのグア
ニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０ミリ
モルのグルタチオン(還元した)、および２ミリモルのグ
ルタチオン(酸化した)に調節する。この溶液中で１２時
間インキュベーションした後、そのタンパク質を１０ミ
リモルのリン酸ナトリウムに対して透析する。 【０１３６】実施例 ２ バキュロウイルス発現システムを用いての ＦＧＦ−１３
のクローニングおよび発現 完全な長さのＦＧＦ−１３タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列、ＡＴＣＣ第９７１４７号を、遺伝子の５'およ
び３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して増幅する。 【０１３７】 そのＦＧＦ−１３ ５'プライマーは、配列： CTAGTGGATC CCGAGAATCA CCCGTCTCCT 30 （配列番号５） を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)を含む
ことから、この部位でのクローニングは、推定されるＦ
ＧＦ−１３シグナルペプチド切断部位の下流でＦＧＦ−
１３遺伝子の１８ヌクレオチドと共に、バキュロウイル
スシグナル配列を枠内に置くであろう。 その３'プライマーは、配列： CGACTTCTAG AACCTCGGGG ATCTGGCTCC 30 （配列番号６） を有し、また制限エンドヌクレアーゼ ＸbaＩの切断部
位、およびその遺伝子の３'非翻訳配列に対して相補的
な１８ヌクレオチドを含む。 【０１３８】増幅された配列を、市販のキット(「Ｇene
clean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を
使用して、１％ アガロースゲルから単離する。次い
で、そのフラグメントを各々のエンドヌクレアーゼで消
化して、１％ アガロースゲル上で精製する。このフラ
グメントをＦ２と名付ける。 【０１３９】ベクター pＡ２gp(pＶＬ９４１ベクターの
修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システ
ムを用いてのタンパク質の発現に使用する(レビューに
は、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ. １９８７、
Ａ manual of methods for baculovirus vectors and i
nsect cell culture procedures、Ｔexas Ａgricultura
l Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を
参照)。この発現ベクターは、オートグラファ(Ａutogra
pha)カリフォルニア核多角体病ウイルス群(ＡcＭＮＰ
Ｖ)の強力な多角体(polyhedrin)プロモーター、続い
て、制限エンドヌクレアーゼ ＢamＨＩおよびＸbaＩの
認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ) ４０のポリ
アデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。
組換えウイルスを容易に選択するには、Ｅ.coli由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、多角体(polyhedrin)遺
伝子のポリアデニル化シグナルが続く多角体プロモータ
ーと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(c
otransfected)野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒
介される相同組換えのためのウイルス配列を多角体配列
の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベク
ターを、pＲＧ１、pＡc３７３、pＶＬ９４１、およびp
ＡcＩＭ１といったようなpＡ２の代わりに使用すること
ができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳummers,Ｍ.
Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３９)。 【０１４０】プラスミドを制限酵素で消化して、当業界
で既知の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを使用し
て脱リン酸化する。次いで、ＤＮＡを、市販のキット
(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、
Ｃa.)を使用して、１％ アガロースゲルから単離する。
このベクター ＤＮＡをＶ２と名付ける。 【０１４１】フラグメント Ｆ２および脱リン酸化プラ
スミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせ
る。次いで、Ｅ.coli ＤＨ５α細胞をトランスフォーム
して、プラスミド(pＢacＦＧＦ−１３)を含む細菌を、
各々の制限酵素を使用して同定する。クローン化された
フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認す
る。 【０１４２】リポフェクション法を使用して、プラスミ
ド pＢacＦＧＦ−１３ ５μgを市販の線形化バキュロウ
イルス(「ＢaculoＧoldＴＭ バキュロウイルス ＤＮ
Ａ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共
に同時トランスフェクトする(Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１
９８７）)。 【０１４３】各々の場合において、ＢaculoＧoldＴＭ
ウイルス ＤＮＡ １μgおよびプラスミド ５μgを、無
血清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉn
c.、Ｇaithersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイ
タープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポ
フェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μ
lを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートす
る。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グ
レイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播
種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴
加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加
えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で
５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフ
ェクション溶液をプレートから除去して、１０％ ウシ
胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。その
プレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間
培養し続ける。 【０１４４】４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳ
mith(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変更として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔech
nologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲル
を使用するが、このことにより、青色に染色されたプラ
ークを容易に単離することが可能となる。(「プラーク
アッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する
使用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、
Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、
９−１０頁にも見い出すことができる)。 【０１４５】連続希釈してから４日後に、ウイルスを細
胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドル
フピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルス
を含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペン
ドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心
分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上
清を、３５mmの皿に播種した昆虫Ｓf９細胞を感染させ
るのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集
した後、４℃で保存する。 【０１４６】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−ＦＧＦ
−１３を感染させる。６時間後、その培地を除去して、
メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II
培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替
える。４２時間後、５μＣiの３５Ｓ−メチオニンおよ
び５μＣiの３５Ｓ システイン５μＣi(Ａmersham)を加
える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした
後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク
質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
により視覚化する。 【０１４７】実施例 ３ ＣＯＳ細胞における組換えＦＧＦ−１３の発現 プラスミド、ＦＧＦ−１３−ＨＡの発現は、１）ＳＶ４
０ 複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.
coli 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イ
ントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモ
ーターを含む、ベクター pcＤＮＡ３／Ａmp(Ｉnvitroge
n)から得た。完全なＦＧＦ−１３前駆体およびその３'
末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮ
Ａフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域に
クローン化することから、組換えタンパク質発現は、Ｃ
ＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記
のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得
られるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、
Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、および
Ｒ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７：７６７（１９８
４）)。ＨＡタグを標的タンパク質へ融合させることに
より、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する
抗体で容易に検出することが可能となる。 【０１４８】ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメン
トおよびベクター、pcＤＮＡ３／Ａmpを、各々の制限酵
素で消化して、ライゲートさせる。そのライゲーション
混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃloning Ｓ
ystems、Ｌa Ｊolla、ＣＡ)にトランスフォームし、そ
のトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プ
レート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プラスミ
ド ＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正し
いフラグメントの存在に関して制限分析により試験す
る。組換えＦＧＦ−１３ ＣＯＳ細胞の発現には、ＤＥ
ＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベ
クターでトランスフェクトする(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆri
tsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabor
atory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、
（１９８９）)。ＦＧＦ−１３−ＨＡタンパク質の発現
を、放射能標識および免疫沈降法により検出する(Ｅ.Ｈ
arlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanu
al、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８
８）)。トランスフェクションから２日後、細胞を３５
Ｓ−システインで８時間標識化する。次いで、細胞培地
を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０m
Ｍ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％Ｎ
Ｐ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.
５))で溶菌する。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６７
（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地は両方と
も、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降する。沈
降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分
析する。 【０１４９】実施例 ４ 遺伝子治療による発現 線維芽細胞を皮膚生体組織検査により被験者から得る。
その結果得られた組織を組織培養培地に入れて、小片に
分離させる。組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表
面上に置き、約１０片を各々のフラスコに入れる。その
フラスコを上下にひっくり返し、密閉して、室温で一晩
放置する。室温で２４時間放置した後、そのフラスコを
ひっくり返し、その組織の塊はフラスコの底に固定され
たままにしておいて、新たな培地(例えば、１０％ ＦＢ
Ｓ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＨam
のＦ１２培地)を加える。次いで、これを３７℃で約１
週間インキュベートする。この時点で、新たな培地を加
えた後、数日毎に変える。さらに２週間培養した後、単
層の線維芽細胞が現れる。その単層をトリプシン処理し
て、より大きなフラスコへと剥がし取る(scaled)。 【０１５０】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復配列の隣接したpＭＶ−７(Ｋirschmeier, Ｐ. Ｔ.
ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８）)をＥcoＲ
ＩおよびＨindIIIで消化した後、仔ウシ腸ホスファター
ゼで処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分別
し、ガラスビーズを使用して精製する。 【０１５１】本発明のポリペプチドをコードするcＤＮ
Ａを、５'および３'末端配列に各々対応するＰＣＲプラ
イマーを使用して増幅する。ＥcoＲＩ部位を含む５'プ
ライマーおよび３'プライマーは、ＨindIII部位を含
む。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、等量のモロニーマ
ウス肉腫ウイルス線形バックボーンおよびＥcoＲＩ並び
にＨindIIIフラグメントを一緒に加える。その結果得ら
れた混合物を、２つのフラグメントのライゲーションに
適当な条件下に維持する。そのライゲーション混合物を
使用して、細菌ＨＢ１０１をトランスフォームした後、
そのベクターが正しく挿入された問題の遺伝子を有して
いることを確認する目的で、これを、カナマイシンを含
む寒天上に置く。 【０１５２】１０％ 仔ウシ血清(ＣＳ)、ペニシリン、
およびストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾され
たイーグル培地(ＤＭＥＭ)中、両種指向性pＡ３１７ま
たはＧＰ＋am１２パッキング細胞を集密的密度まで組織
培養で増殖させる。次いで、その遺伝子を含むＭＳＶベ
クターを培地に加えて、パッキング細胞をベクターでト
ランスデュースする。ここで、そのパッキング細胞は、
その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を製造する(ここ
で、そのパッキング細胞は、プロデューサー細胞と呼ば
れる)。 【０１５３】新たな培地をトランスデュースされたプロ
デューサー細胞に加えた後、培地を１０cmのプレートの
集密的プロデューサー細胞から収集する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポアフィルターを
通して濾過して、脱離したプロデューサー細胞を除去し
た後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。
培地を線維芽細胞の副次(sub)集密的プレートから除去
して、プロデューサー細胞から得られた培地に素早く置
き替える。この培地を除去して、新たな培地に置き替え
る。ウイルスの力価が高いならば、実質的には全ての線
維芽細胞が感染されるであろし、また選択の必要は全く
ない。力価が非常に低いならば、neoまたはhisといった
ような選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベク
ターを使用する必要がある。 【０１５４】次いで、操作された線維芽細胞を単独で、
またはサイトデックス(cytodex) ３微担体ビーズ上で密
集するまで増殖させた後、宿主に注入する。ここで、そ
の線維芽細胞は、タンパク質産物を製造する。上記の教
示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であ
ることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以
外の方法で、本発明を行うことができる。 【０１５５】 【配列表】 （１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： ヒュー等 （ii） 発明の名称 ： 線維芽細胞増殖因子−１３ （iii） 配列の数 ： ８ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラン， セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： ０８／２０７,４１２ （Ｂ） 出願日 ： １９９４年３月８日 （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−３６４ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ６４１塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： AGGGGGAGAA TCACCCGTCT CCTAATTTTA ACCAGTACGT GAGGGACCAG GGCGCCATGA 120 CCGACCAGCT GAGCAGGCGG CAGATCCGCG AGTACCAACT CTACAGCAGG ACCAGTGGCA 180 AGCACGTGCA GGTCCCCGGG CGTCGCATCT CCGCCACCGC CGAGGACGGC AACAAGTTTG 240 CCAAGCTCAT AGTGGAGACG GACACGTTTG GCAGCCGGGT TCGCATCAAA GGGGCTGAGA 300 GTGAGAAGTA CATCTGTATG AACAAGAGGG GCAAGCTCAT CGGGAAGCCC AGCGGGAAGA 360 GCAAAGACTG CGTGTTCACG GAGATCGTGC TGGAGAACAA CTATACGGCC TTCCAGAACG 420 CCCGGCACGA GGGCTGGTTC ATGGTCTTCA CGCGGCAGGG GCGGCCCCGC CAGGCTTCCC 480 GCAGCCGCCA GAACCAGCGC GAGGCCCACT TCATCAAGCG CCTCTACCAA GGCCAGCTGC 540 CCTTCCCCAA CCACGCCGAG AAGCAGAAGC AGTTCGAGTT TGTGGGCTCC GCCCCCACCC 600 GTCGGACCAA GCGCACACGG CGGCCCCAGC CCCTCACGTA G 641 （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２１２アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ： Arg Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Cys Leu Gln Leu Leu Ile Leu -20 -15 -10 Cys Cys Gln Thr Gln Gly Glu Asn His Pro Ser Pro Asn Phe Asn -5 1 5 Gln Tyr Val Arg Asp Gln Gly Ala Met Thr Asp Gln Leu Ser Arg 10 15 20 Arg Gln Ile Arg Glu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys 25 30 35 His Val Gln Val Pro Gly Arg Arg Ile Ser Ala Thr Ala Glu Asp 40 45 50 Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly 55 60 65 Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala Glu Ser Glu Lys Tyr Ile Cys 70 75 80 Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly Lys Pro Ser Gly Lys Ser 85 90 95 Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr 100 105 110 Ala Phe Gln Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe Met Val Phe Thr 115 120 125 Arg Gln Gly Arg Phe Arg Gln Ala Ser Arg Ser Arg Gln Asn Gln 130 135 140 Arg Glu Ala His Phe Ile Lys Arg Leu Tyr Gln Gly Gln Leu Pro 145 150 155 Phe Pro Asn His Ala Glu Lys Gln Lys Gln Phe Glu Phe Val Gly 160 165 170 Ser Ala Pro Thr Arg Arg Thr Lys Arg Thr Arg Arg Pro Gln Pro 175 180 185 Leu Thr 190 （２） 配列番号３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３２塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号３ ： GCCAGACCAT GGAGAATCAC CCGTCTCCTA AT 32 （２） 配列番号４の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号４ ： GATTTAAGAT CTCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30 （２） 配列番号５の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号５ ： CTAGTGGATC CCGAGAATCA CCCGTCTCCT 30 （２） 配列番号６の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号６ ： CGACTTCTAG AACCTCGGGG ATCTGGCTCC 30 （２） 配列番号７の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： 塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号７ ： （２） 配列番号８の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号８ ： GATTTACTCG AGCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30
チド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、
本発明のポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子／ヘパリ
ン結合増殖因子として推定的に同定され、以下で「ＦＧ
Ｆ−１３」と呼ぶ。本発明はまた、そのようなポリペプ
チドの作用を阻害することにも関する。 【０００２】線維芽細胞増殖因子は、ヘパリンに結合す
ることを特徴とするタンパク質のファミリーの１つであ
り、従って、ヘパリン結合増殖因子(ＨＢＧＦ)ともまた
呼ばれる。これらのタンパク質の異なったメンバーの発
現は、様々な組織において見い出され、また特定の時間
的および空間的制御下にある。これらのタンパク質は、
線維芽細胞、角膜並びに血管内皮細胞、顆粒球、副腎皮
質細胞、軟骨細胞、筋原細胞、血管平滑筋細胞、レンズ
上皮細胞、メラニン細胞、角化細胞、乏突起神経膠細
胞、星状膠細胞、骨芽細胞、および造血細胞を含め、中
胚葉、外胚葉、および内胚葉起源の様々な細胞に対する
強力なマイトジェンである。 【０００３】各々のメンバーは、他のメンバーと重複し
た機能を有し、その独自の機能スペクトルもまた有す
る。血管内皮細胞の増殖を刺激する能力の他に、ＦＧＦ
−１および２は両方とも、内皮細胞に対して走化性であ
り、またＦＧＦ−２は、内皮細胞が基底膜を貫通するの
を可能とすることが示された。これらの性質と一致し
て、ＦＧＦ−１および２は両方とも、脈管形成を刺激す
る能力を有する。これらの増殖因子の別の重要な特徴
は、創傷の治癒を促進する、それらの能力である。ＦＧ
Ｆファミリーの多くの他のメンバーは、脈管形成および
創傷の治癒を促進するといったような、ＦＧＦ−１およ
び２と同様の活性を共有する。ＦＧＦファミリーの幾つ
かのメンバーは、中胚葉形成を誘導して、ニューロン細
胞、脂肪細胞、および骨格筋細胞の分化を変化させるこ
とが示された。 【０００４】正常な組織における、これらの生物学的活
性以外に、ＦＧＦタンパク質は、腫瘍血管新生を促進す
ることにより、またそれらの発現が脱調節されている場
合には、トランスフォーミングタンパク質として、癌腫
および肉腫での腫瘍形成を促進することと関係してい
る。 【０００５】ＦＧＦファミリーは現在、８つの構造上関
係のあるポリペプチド：塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、in
t ２、hst １／k−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、
角化細胞増殖因子、ＡＩＧＦ(ＦＧＦ−８)からなってお
り、最近、神経膠活性化因子は、ヒト神経膠腫細胞系の
培養上清から精製された新規ヘパリン結合増殖因子であ
ることが示された(Ｍiyamoto, Ｍ.ら、Ｍol. and Ｃel
l. Ｂiol.、１３（７）：４２５１−４２５９（１９９
３）)。各々の遺伝子がクローン化されて、配列決定さ
れている。そのメンバーの２つ、ＦＧＦ−１およびＦＧ
Ｆ−２は、多くの名称で、しかし、最も多くは、各々、
酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子として特徴付けら
れている。正常な遺伝子産物は、大部分の中胚葉および
神経外胚葉由来の細胞の一般的な増殖能力に影響を及ぼ
す。それらは、インビボにおいて脈管形成を誘導するこ
とができ、また初期発生において重要な役割を果たし得
る(Ｂurgess, Ｗ. Ｈ.およびＭaciag, Ｔ.、Ａnnu. Ｒe
v. Ｂiochem.、５８：５７５−６０６（１９８９）)。 【０００６】先に同定したＦＧＦファミリーのメンバー
の多くはまた、同じ受容体にも結合し、これらの受容体
に結合することによって、第二メッセージを誘起する。 【０００７】分泌型のＦＧＦ−１をコードする真核発現
ベクターは、ブタ動脈中への遺伝子移入により導入され
た。このモデルは、インビボにおける動脈壁での遺伝子
機能を明らかにする。ＦＧＦ−１発現は、遺伝子移入か
ら２１日後、ブタ動脈における内膜肥厚を誘導した(Ｎa
bel, Ｅ. Ｇ.ら、Ｎature、３６２：８４４−６（１９
９３）)。塩基性線維芽細胞増殖因子は、腫瘍脈管形成
における、その役割とは無関係に、神経膠腫増殖および
進行を調節し得ること、また塩基性線維芽細胞増殖因子
の放出または分泌は、これらの作用に必要とされ得るこ
とがさらに実証されている(Ｍorrison, Ｒ. Ｓ.ら、Ｊ.
Ｎeurosci. Ｒes.、３４：５０２−９（１９９３）)。 【０００８】塩基性ＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子
はさらに、インビトロにおけるカポジ肉腫細胞の増殖と
関係している(Ｈuang, Ｙ. Ｑ.ら、Ｊ. Ｃlin. Ｉnves
t.、９１：１１９１−７（１９９３）)。そしてまた、
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をコードするcＤＮＡ配
列は、バクテリオファージ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに
より認識される転写プロモーターの下流にクローン化さ
れた。そのようにして得られた塩基性線維芽細胞増殖因
子は、分裂誘発性、プラスミノーゲンアクチベーターの
合成、および脈管形成アッセイにおいて、ヒト胎盤線維
芽細胞増殖因子とは区別できない生物学的活性を有する
ことが示された(Ｓquires, Ｃ. Ｈ.ら、Ｊ. Ｂiol. Ｃh
em.、２６３：１６２９７−３０２（１９８８）)。 【０００９】米国特許第５,１５５,２１４号は、実質的
に純粋な哺乳動物塩基性線維芽細胞増殖因子、およびそ
れらの製造を開示している。ウシおよびヒト塩基性線維
芽細胞増殖因子のアミノ酸配列、さらにはまた、ウシ種
の該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が開示されて
いる。 【００１０】新たに発見されたＦＧＦ−９は、ＦＧＦフ
ァミリーの他のメンバーに対して約３０％の配列類似性
を有する。ファミリーメンバーにおける２つのシステイ
ン残基および他の共通配列もまた、ＦＧＦ−９配列にお
いて十分保存された。ＦＧＦ−９は、酸性および塩基性
ＦＧＦでのように、そのＮ末端に典型的なシグナル配列
を全く有していないことが見い出された。しかし、ＦＧ
Ｆ−９は、その典型的なシグナル配列 ＦＧＦの欠損に
もかかわらず、合成後の細胞から分泌されることが見い
出された(Ｍiyamoto, Ｍ.ら、Ｍol. and Ｃell. Ｂio
l.、１３（７）：４２５１−４２５９（１９９３）)。
さらに、ＦＧＦ−９は、乏突起神経膠細胞２型 星状膠
細胞の始原細胞、ＢＡＬＢ／c３Ｔ３、およびＰＣ−１
２細胞の細胞増殖を刺激するが、ヒト臍静脈内皮細胞の
細胞増殖は刺激しないことが見い出された(Ｎaruo, Ｋ.
ら、Ｊ. Ｂiol. Ｃhem.、２６８：２８５７−２８６４
（１９９３）)。 【００１１】塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦは、細胞増
殖、細胞運動、分化、および生存の強力なモジュレータ
ーであり、外胚葉、中胚葉、および内胚葉由来の細胞タ
イプに対して作用する。これらの２つのＦＧＦは、ＫＧ
ＦおよびＡＩＧＦと共に、タンパク質精製により同定さ
れた。しかし、他の４つのメンバーは、腫瘍遺伝子とし
て単離され、この発現は、胚形成およびあるタイプの癌
に制限された。ＦＧＦ−９は、神経膠細胞に対するマイ
トジェンであることが実証された。ＦＧＦファミリーの
メンバーは、腫瘍形成能力を有することが報告されてい
る。ＦＧＦ−９は、ＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞へとトラン
スフォームした場合には、トランスフォームする能力を
示した(Ｍiyamoto, Ｍ.ら、Ｍol. Ｃell. Ｂiol.、１３
（７）：４２５１−４２５９（１９９３）)。 【００１２】ＦＧＦ−８としてもまた知られているアン
ドロゲン誘導増殖因子(ＡＩＧＦ)は、テストステロンで
刺激されたマウス乳癌細胞(ＳＣ−３)のコンディション
ド培地から精製された。ＡＩＧＦは、特徴のあるＦＧＦ
様増殖因子であり、推定されるシグナルペプチドを有
し、またＦＧＦファミリーの既知のメンバーと３０−４
０％の相同性を共有する。ＡＩＧＦでトランスフォーム
された哺乳動物細胞は、アンドロゲンの不存在下、ＳＣ
−３細胞の増殖に対して著しい刺激効果を示す。従っ
て、ＡＩＧＦは、それが腫瘍細胞自体により分泌される
ことから、ＳＣ−３細胞、およびことによると他の細胞
のアンドロゲン誘導増殖を媒介する。 【００１３】本発明のポリペプチドは、ＦＧＦファミリ
ーの他のメンバーとのアミノ酸配列の相同性の結果とし
て、ＦＧＦファミリーのメンバーとして推定的に同定さ
れている。 【００１４】本発明の一態様により、新規成熟ポリペプ
チド、さらにはまた、生物学的に活性であって、診断上
または治療上有用な、そのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト
起源である。 【００１５】本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、本発明のポリペプ
チドをコードする、単離された核酸分子、さらにはま
た、そのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性
であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメン
トを提供する。 【００１６】本発明のさらに別の態様により、本発明の
ポリペプチドの組換え製造における試薬として有用な、
クーロニングおよび発現プラスミドといったような組換
えベクター、さらにはまた、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸配列を含んでなる組換え原核および／また
は真核宿主細胞の使用によって、そのようなポリペプチ
ドを組換え技術により製造する方法を提供する。 【００１７】本発明のさらなる態様により、そのような
ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを、それに対するアゴニストおよ
びアンタゴニストに関してスクリーニングするために、
また治療目的に、例えば、熱傷および潰瘍の結果として
の、例えば、創傷の治癒を促進するために、発作と関連
のある、またニューロン障害によるニューロン損傷を防
いで、ニューロン増殖を促進するために、また皮膚の老
化および毛髪喪失を防ぐために、初期胚および肢再生に
おける脈管形成および中胚葉誘導を刺激するために利用
する方法を提供する。 【００１８】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。 【００１９】本発明のまた別の態様により、例えば、細
胞トランスフォーメーション、例えば、腫瘍の処置にお
いて、そのようなポリペプチドの作用を阻害するため
の、瘢痕形成(scarring)を減少させて、血管過多疾患を
処置するための、そのようなポリペプチドに対するアン
タゴニスト、およびそれらの使用方法を提供する。 【００２０】本発明の別の態様により、本発明のポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブ
リダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核
酸プローブを提供する。 【００２１】本発明のまた別の態様により、本発明の核
酸配列における変異に関係のある疾患、または疾患に対
する感受率を検出するための、またそのような配列によ
りコードされるポリペプチドの過剰発現を検出するため
の診断アッセイを提供する。 【００２２】本発明の別の態様により、科学調査、ＤＮ
Ａの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関係のあるイ
ンビトロにおける目的に、そのようなポリペプチド、ま
たはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを利用する方法を提供する。 【００２３】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。 【００２４】次の図面は、本発明の具体的な態様の説明
としてのみ記載するものであって、いかようにも限定と
して記載するものではない。第１図は、ＦＧＦ−１３の
cＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。
最初の２１個のアミノ酸残基は、推定されるリーダー配
列を表す。 【００２５】本発明の一態様により、第１図(配列番号
２)の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、ま
たは１９９５年５月１２日にＡＴＣＣ寄託番号第９７１
４７号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核
酸分子(ポリヌクレオチド)を提供する。 【００２６】本発明のＦＧＦ−１３をコードするポリヌ
クレオチドは、ヒト卵巣癌組織から得られたcＤＮＡラ
イブラリー中で発見された。該ＦＧＦ−１３ポリペプチ
ドは、構造上、線維芽細胞増殖因子ファミリーの全ての
メンバーに関係があり、また２１２個のアミノ酸のポリ
ペプチドをコードするオープンリーディングフレームを
含み、このうち、最初の２１個のアミノ酸は推定される
リーダー配列を表すことから、成熟ポリペプチドは１９
１個のアミノ酸を含んでなる。トップのうち、適合は、
１）マウスＡＩＧＦに対して、１８５個のアミノ酸範囲
にわたり、６９％の同一性および８１％の類似性；２）
ニワトリ由来のＦＧＦ−４と、８２個のアミノ酸の領域
で、３０％の同一性および５６％の類似性；３）ヒトＫ
ＧＦと、７８個のアミノ酸範囲にわたり、４１％の同一
性および６４％の類似性である。 【００２７】ＦＧＦ／ＨＢＧＦファミリーのサイン(sig
nature)、ＧＸＬＸ(Ｓ,Ｔ,Ａ,Ｇ)Ｘ６(Ｄ,Ｅ)ＣＸＦＸ
Ｅは、本発明のポリペプチドにおいて保存される(Ｘは
いずれかのアミノ酸残基を意味し；(Ｄ,Ｅ)はＤまたは
Ｅ残基のいずれかを意味し；Ｘ６はいずれかの６つのア
ミノ酸残基を意味する)。 【００２８】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。成熟ポリペ
プチドをコードするコード配列は、第１図(配列番号１)
に示すコード配列もしくは寄託されたクローンのコード
配列と同じであってよく、または遺伝コードの重複また
は縮重の結果として、第１図(配列番号１)のＤＮＡもし
くは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコー
ドする異なったコード配列であってもよい。 【００２９】第１図(配列番号２)の成熟ポリペプチドま
たは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のもの
が含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成
熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは
分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加
的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場
合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチ
ドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'お
よび／または３'といったような非コード配列。 【００３０】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。 【００３１】本発明はさらに、第１図(配列番号２)の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託された
クローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする、
上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレ
オチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する
アレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在し
ない変異体であり得る。 【００３２】従って、本発明には、第１図(配列番号２)
に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクロ
ーンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、その
ようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変
異体は、第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託
されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコード
する。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異
体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれ
る。 【００３３】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、第１図(配列番号１)に示すコード配列の天然に存在
するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配
列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有
し得る。当業界で知られているように、アレル変異体
は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失ま
たは付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であ
り、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的
には変えない。 【００３４】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ド配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分
泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリ
ヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペ
プチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切
断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配
列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付
加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプ
ロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タ
ンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタン
パク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟
タンパク質が残る。 【００３５】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の
両方を有するタンパク質をコードし得る。 【００３６】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson, Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６
７（１９８４）)。 【００３７】「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖
の製造に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；それに
は、コード領域より前および後の領域(リーダーおよび
トレーラー)、さらにはまた、個々のコードセグメント
(エキソン)間の介在配列(イントロン)が含まれる。 【００３８】完全な長さのＦＧＦ−１３遺伝子のフラグ
メントは、完全な長さの遺伝子を単離するために、また
該遺伝子に対して高い配列類似性、または類似の生物学
的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡ
ライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブ
として使用することができる。このタイプのプローブ
は、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、例えば、５
０またはそれ以上の塩基を含むのがよい。該プローブは
また、完全な長さの転写物、およびゲノムクローン、ま
たは調節並びにプロモーター領域、エキソン、およびイ
ントロンが含まれる、完全なＦＧＦ−１３遺伝子を含む
クローンに対応するcＤＮＡクローンを同定するのに使
用することもできる。スクリーニングの例は、既知のＤ
ＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成
することにより、ＦＧＦ−１３遺伝子のコード領域を単
離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補
的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトの
cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーを
スクリーニングするために使用して、ライブラリーのど
のメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定す
る。 【００３９】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましく
は少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列
にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発
明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレ
オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条
件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好
ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、
ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味す
る。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図(配列番号
１)のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードさ
れる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を
実質的にはいずれか保有するポリペプチドをコードす
る。 【００４０】あるいはまた、該ポリヌクレオチドは、本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、また上記
のように、それに対して同一性を有し、また活性を保有
し得るか、または保有し得ない、少なくとも２０塩基、
好ましくは少なくとも３０塩基、またさらに好ましくは
少なくとも５０塩基を有するのがよい。例えば、そのよ
うなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの
回収のための、配列番号１のポリヌクレオチドに対する
プローブとして、または診断プローブとして、またはＰ
ＣＲプライマーとして使用することができる。 【００４１】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チド、さらにはまた、そのフラグメント(このフラグメ
ントは、少なくとも３０塩基、また好ましくは少なくと
も５０塩基を有する)をコードするポリヌクレオチドに
対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくと
も９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％の同
一性を有するポリヌクレオチド、およびそのようなポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関す
る。 【００４２】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下に保
持されるであろう。これらの寄託は、単に便宜として与
えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１
２下に要求されることを承認するものではない。寄託さ
れた物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらに
はまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配
列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合してい
る。寄託された物質を製造し、使用し、または販売する
には、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾
は、ここでは付与されない。 【００４３】本発明はさらに、第１図(配列番号２)の推
定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡに
よりコードされるアミノ酸配列を有するＦＧＦポリペプ
チド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグ
メント、アナログ、および誘導体に関する。 【００４４】第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは
寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナ
ログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチド
を意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部
分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペ
プチドを製造することができるプロプロテインが含まれ
る。 【００４５】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。 【００４６】第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは
寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ
またはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミ
ノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されて
おり、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードに
よりコードされるものであってもよく、またはコードさ
れたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以
上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（ii
i）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増
加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のよ
うな、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リ
ーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精
製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といっ
たような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合し
ているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導
体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範
囲内であると思われる。 【００４７】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。 【００４８】「単離された」という用語は、物質がその
元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の
環境)から除去されていることを意味する。例えば、生
きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
ける共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単
離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクター
の部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、ま
たそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の
部分ではないという点で、なお単離されている。 【００４９】本発明のポリペプチドには、配列番号２の
ポリペプチド(特に、成熟ポリペプチド)、さらにはま
た、配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０
％の類似性(好ましくは少なくとも７０％の同一性)、ま
たさらに好ましくは配列番号２のポリペプチドに対して
９０％の類似性(さらに好ましくは少なくとも９０％の
同一性)、またなおさらに好ましくは配列番号２のポリ
ペプチドに対して少なくとも９５％の類似性(なおさら
に好ましくは少なくとも９５％の同一性)を有するポリ
ペプチドが含まれ、通例、少なくとも３０個のアミノ
酸、またさらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸
を含む、そのようなポリペプチドの部分をもつ、そのよ
うなポリペプチドの部分もまた含まれる。 【００５０】当業界で知られているように、２つのポリ
ペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミ
ノ酸配列およびその同類的アミノ酸置換物を、もう１つ
のポリペプチドの配列と比較することにより測定する。 【００５１】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、対応する完全な長さのポリペプチドをペプチ
ド合成により製造するために使用することができ；従っ
て、そのフラグメントは、完全な長さのポリペプチドを
製造するための中間体として使用することができる。本
発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を使
用して、本発明の完全な長さのポリヌクレオチドを合成
することができる。 【００５２】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。 【００５３】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作することができる(トランスデュースし、ま
たはトランスフォームし、またはトランスフェクトする
ことができる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、
ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された
宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォー
マントを選択し、またはＦＧＦ遺伝子を増幅するのに適
するよう改変された従来の栄養培地で培養することがで
きる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用
に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であっ
て、当業者に明らかであろう。 【００５４】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチド配列を、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ビヒクル、特にベクタ
ーまたはプラスミドのいずれか１つに含ませることがで
きる。そのようなベクターには、染色体、非染色体およ
び合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プ
ラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミ
ドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；
ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬
病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、
他のいずれのベクターまたはプラスミドも、それらが宿
主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用す
ることができる。 【００５５】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。 【００５６】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ. coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
ＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。 【００５７】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ. coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つの遺伝子を含むのが好ましい。 【００５８】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ. coli、Ｓalmonella typhimurium、Ｓt
reptomycesといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；ＤrosophilaＳ２およびＳpodoptera Ｓf９といっ
たような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢowesメラ
ノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物
細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると思われる。 【００５９】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含んでなる。この実施態
様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該
配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配
列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが
多数、当業者に知られていて、市販されている。次のベ
クターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ６
０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、ファージスクリプト
(phagescript)、psiＸ１７４、pＢluescript ＳＫ、pＢ
sＫＳ、pＮＨ８a、pＮＨ１６a、pＮＨ１８a、pＮＨ４６
a(Ｓtratagene)；pＴＲＣ９９Ａ、pＫＫ２２３−３、p
ＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmaci
a)。真核生物用: pＷＬneo、pＳＶ２cat、pＯＧ４４、p
ＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、p
ＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれの
プラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可
能であって、生存可能である限り、使用することができ
る。 【００６０】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲ、ＰＬおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。 【００６１】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis, Ｌ.、Ｄ
ibner, Ｍ.、Ｂattey, Ｌ.、Ｂasic Ｍethodsin Ｍolec
ular Ｂiology（１９８６）)。 【００６２】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。 【００６３】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、第２版（Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、１９８９）により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。 【００６４】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサ
ー(bp １００〜２７０)、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポ
リオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハン
サーが含まれる。 【００６５】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ. coliのアンピ
シリン耐性遺伝子並びにＳ. cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、および下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。 【００６６】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ. coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella ty
phimurium、およびＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
並びにＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。 【００６７】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびpＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadi
son、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。 【００６８】適当な宿主株をトランスフォーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シ
フトまたは化学誘導)により抑制解除して、細胞をさら
なる期間培養する。 【００６９】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。 【００７０】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊することができる。 【００７１】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のウイルスゲノム、例えば、ＳＶ４０の開始
点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライシング
から得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を
使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることが
できる。 【００７２】本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラ
フィーを含め、現在まで使用されている方法により、組
換え細胞培養物から回収して、精製することができる。
必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク
質の立体配置を完成するのに使用することができる。最
後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終
精製工程に使用することができる。 【００７３】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコ
シル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本
発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ
酸残基が含まれ得る。 【００７４】本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増
殖を刺激する能力の結果として、血栓症、動脈硬化症、
および他の心臓血管状態といったような、様々な疾患状
態による虚血組織の脈管再生を刺激するための処置にお
いて使用することができる。これらのポリペプチドはま
た、脈管形成および肢再生を刺激するために使用するこ
ともできる。 【００７５】該ポリペプチドはまた、それらが線維芽細
胞および骨格筋細胞といったような、異なった起源の様
々な細胞に対して分裂誘発性であり、従って、損傷を受
けた、または疾患に罹った組織の修復または置換を促進
することから、負傷、熱傷、手術後の組織修復、および
潰瘍による創傷を処置するために使用することもでき
る。 【００７６】本発明のポリペプチドはまた、ニューロン
増殖を刺激するために、また発作と関連のある、またア
ルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関係
コンプレックスといったような、あるニューロン障害ま
たは神経変性状態において起こるニューロン損傷を処置
する、また防ぐために使用することもできる。ＦＧＦ−
１３は、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し、従って、
それらは、骨および歯周再生を高めて、組織移植片また
は骨移植片を補助するために使用することができる。 【００７７】本発明のポリペプチドはまた、角化細胞増
殖を刺激することにより、日焼けによる皮膚の老化を防
ぐために使用することもできる。 【００７８】該ＦＧＦ−１３ポリペプチドはまた、ＦＧ
Ｆファミリーメンバーが毛髪形成細胞を活性化して、メ
ラニン細胞増殖を促進することから、毛髪の喪失を防ぐ
ために使用することもできる。同じ観点から(along the
same lines)、本発明のポリペプチドは、他のサイトカ
インと組み合わせて使用する場合、造血細胞および骨髄
細胞の増殖および分化を刺激するために使用することが
できる。 【００７９】該ＦＧＦ−１３ポリペプチドはまた、移植
前に臓器を保持するために、または一次組織の細胞培養
を支持するために使用することもできる。 【００８０】本発明のポリペプチドはまた、初期胚にお
いて中胚葉起源の組織を誘導して分化するために使用す
ることもできる。 【００８１】本発明のまたさらなる態様により、科学調
査、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの製造に関係のある
インビトロにおける目的に、またヒト疾患の処置に対す
る診断法および治療法を提供する目的に、そのようなポ
リペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。 【００８２】本発明は、本発明のポリペプチドの受容体
の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子
は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リガン
ドパンニングおよびＦＡＣＳ選別により同定することが
できる(Ｃoliganら、ＣurrentＰrotocols in Ｉmmun.、
１（２)、第５章、（１９９１）)。好ましくは、発現ク
ローニングを使用し、ここでは、ポリアデニル化ＲＮＡ
を該ポリペプチドに応答する細胞、例えば、ＦＧＦファ
ミリータンパク質の複合受容体を含むことが知られてい
るＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＳＣ−３細胞から調製し
て、このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリーをプ
ールに分けて、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応答
しない他の細胞をトランスフェクトするために使用す
る。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェクト
された細胞を、標識化した後の本発明のポリペプチドに
さらす。該ポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的
プロテインキナーゼに対する認識部位の包含を含め、様
々な方法により標識化することができる。 【００８３】固定およびインキュベーションに続いて、
そのスライドをオートラジオグラフ分析にかける。陽性
のプールを同定して、サブプールを調製し、反復サブプ
ーリングおよび再スクリーニング方法を使用して、再び
トランスフェクトし、最終的には、推定される受容体を
コードする単一クローンを得る。 【００８４】受容体を同定するための他の方法として、
標識化ポリペプチドを細胞膜と光親和性により結合させ
るか、または受容体分子を発現する調製物を抽出するこ
とができる。橋かけ(cross-linked)物質をＰＡＧＥ分析
により分けて、Ｘ線フィルムにさらす。該ポリペプチド
の受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグ
メントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけるこ
とができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列
を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを
設計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、
推定される受容体をコードする遺伝子が同定されるであ
ろう。 【００８５】本発明は、化合物をスクリーニングして、
本発明のポリペプチドの作用を変化させる化合物を同定
する方法を提供する。そのようなアッセイの例は、線維
芽細胞が正常に増殖するであろう細胞培養条件下、哺乳
動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニン
グすべき化合物、および３[Ｈ]チミジンを混合すること
を含んでなる。対照アッセイをスクリーニングすべき化
合物の不存在下に行い、該化合物の存在下における線維
芽細胞増殖の量と比較して、各々の場合における３[Ｈ]
チミジンの摂取を測定することにより、該化合物が増殖
を刺激するかどうかを決定することができる。線維芽細
胞増殖の量は、３[Ｈ]チミジンの取り込みを測定する液
体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定す
る。アゴニストおよびアンタゴニスト化合物は両方と
も、この方法により同定することができる。 【００８６】別の方法では、該化合物の存在下、本発明
のポリペプチドの受容体を発現する哺乳動物細胞または
膜調製物を標識化した本発明のポリペプチドと共にイン
キュベートする。次いで、この相互反応を高める、また
はブロックする化合物の能力を測定することができる。
あるいはまた、スクリーニングすべき化合物とＦＧＦ−
１３受容体との相互反応後の、既知の第二メッセンジャ
ーシステムの応答を測定し、該受容体に結合して、第二
メッセンジャー応答を誘起する該化合物の能力を測定し
て、該化合物が可能性のあるアゴニストまたはアンタゴ
ニストであるかどうかを決定する。そのような第二メッ
センジャーシステムには、限定されるものではないが、
cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、ま
たはホスホイノシチド加水分解が含まれる。 【００８７】アンタゴニスト化合物の例には、抗体、ま
た幾つかの場合には、本発明のポリペプチドの受容体に
結合するが、第二メッセンジャー応答は全く誘起せず、
またはＦＧＦ−１３ポリペプチド自体に結合するオリゴ
ヌクレオチドが含まれる。あるいはまた、可能性のある
アンタゴニストは、該受容体に結合するが、第二メッセ
ンジャー応答は全く誘起せず、従って、該ポリペプチド
の作用を有効にブロックする変異型のポリペプチドであ
り得る。 【００８８】ＦＧＦ−１３遺伝子および遺伝子産物に対
する別のアンタゴニスト化合物は、アンチセンス技術を
使用して製造されたアンチセンス構築物である。アンチ
センス技術を使用して、三重らせん形成またはアンチセ
ンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御す
ることができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチド
のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発
明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド
配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩
基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計す
る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝
子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−
Ｌeeら、Ｎucl. Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７
９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８
８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０
（１９９１）を参照)、そのことによって、転写および
本発明のポリペプチドの産生を妨げる。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡ
にハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のポリペプチドへ
の翻訳をブロックする(Ａntisense−Ｏkano、Ｊ. Ｎeur
ochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucle
otides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpress
ion、ＣＲＣ Ｐress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１９８
８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り
込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをイン
ビボにおいて発現させて、該ポリペプチドの産生を阻害
することができる。 【００８９】可能性のあるアンタゴニスト化合物にはま
た、該受容体の結合部位に結合して占有し、そのことに
よって、該受容体をそのポリペプチドに近づき難くする
ことから、正常な生物学的活性を妨げる小さな分子も含
まれる。小さな分子の例には、限定されるものではない
が、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。 【００９０】アンタゴニスト化合物は、本発明のポリペ
プチドの、新生細胞および組織に及ぼす細胞成長および
増殖効果、すなわち、腫瘍の脈管形成の刺激を阻害し、
従って、例えば、腫瘍形成または増殖における、異常細
胞成長および増殖を遅延する、または妨げるために使用
することができる。 【００９１】該アンタゴニストはまた、血管過多疾患を
防いで、嚢外白内障手術後の上皮レンズ細胞の増殖を防
ぐために使用することもできる。本発明のポリペプチド
の分裂誘発活性の防止はまた、バルーン血管形成術後の
再狭窄のような場合にも望ましい。 【００９２】該アンタゴニストはまた、創傷の治癒の間
の瘢痕組織の増殖を防ぐために使用することもできる。 【００９３】該アンタゴニストはまた、薬学上許容され
得る担体、例えば、以下に記載するような担体と共に、
組成物中で使用することもできる。 【００９４】本発明のポリペプチド、アゴニスト、およ
びアンタゴニストは、非経口投与のための医薬組成物を
なすために、適当な薬学的担体と組み合わせて使用する
ことができる。そのような組成物は、治療上有効な量の
ポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニスト、お
よび薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでな
る。そのような担体には、これに限定されるものではな
いが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組
み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべ
きである。 【００９５】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチド、アゴ
ニスト、およびアンタゴニストは、他の治療化合物と共
に使用することができる。 【００９６】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を処置および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも
約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場
合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量
で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路およ
び症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／k
g〜約１mg／kg(体重)である。局所投与の具体的な場合
には、用量は、１cm２当り約０.１μg〜９mgを投与する
のが好ましい。 【００９７】本発明のポリペプチド、およびポリペプチ
ドであるアゴニスト並びにアンタゴニスト化合物はま
た、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのような
ポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に
従って使用することもできる。 【００９８】従って、例えば、細胞を、エクスビボにお
いてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプ
チドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当
業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によっ
て、細胞を当業界で既知の方法により操作することがで
きる。 【００９９】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、該ポリペプチドのインビボにおける発現のために、
細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界
で知られているように、細胞をインビボにおいて処理し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス粒子以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組
み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために
使用することができるアデノウイルスであってもよい。 【０１００】上述のレトロウイルスプラスミドベクター
を得ることができるレトロウイルスには、限定されるも
のではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死
ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイル
ス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイル
ス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖
性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスといったようなレ
トロウイルスが含まれる。一態様では、レトロウイルス
プラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス
から得られる。 【０１０１】該ベクターには、１つまたはそれ以上のプ
ロモーターが含まれる。使用することができる適当なプ
ロモーターには、限定されるものではないが、レトロウ
イルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭiller
ら、Ｂiotechniques、第７巻、第９号、９８０−９９０
（１９８９）に記載されているヒトサイトメガロウイル
ス(ＣＭＶ)プロモーター、またはいずれかの他のプロモ
ーター(例えば、限定されるものではないが、ヒスト
ン、pol III、およびβ−アクチンプロモーターが含ま
れる、真核細胞性プロモーターのような細胞性プロモー
ター)が含まれる。使用することができる他のウイルス
プロモーターには、限定されるものではないが、アデノ
ウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモ
ーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが含
まれる。適当なプロモーターの選択は、本明細書中に含
まれる教示から当業者に明らかであろう。 【０１０２】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターの制御下にある。使用するこ
とができる適当なプロモーターには、限定されるもので
はないが、アデノウイルス主要後期プロモーターのよう
なアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウ
イルス(ＣＭＶ)プロモーターのようなヘテロロガスプロ
モーター；呼吸合胞体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター；
ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターと
いったような誘導可能なプロモーター；熱ショックプロ
モーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプロモー
ター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジ
ンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナ
ーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ(上記の修飾
されたレトロウイルスＬＴＲが含まれる)；β−アクチ
ンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーター
が含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドを
コードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであっ
てもよい。 【０１０３】レトロウイルスプラスミドベクターを使用
して、プロデューサー細胞系を形成するためにパッケー
ジング細胞系をトランスデュースする。トランスフェク
トすることができるパッケージング細胞の例には、限定
されるものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＲＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋envＡm１２、およびＭiller、Ｈuman Ｇene
Ｔherapy、第１巻、５−１４頁（１９９０）（これに記
載されている内容は全て、本発明の一部を構成する）に
記載されているＤＡＮ細胞系が含まれる。該ベクター
は、当業界で知られている方法のいずれかによって、パ
ッケージング細胞をトランスデュースすることができ
る。そのような方法には、限定されるものではないが、
電気穿孔、リポソームの使用、およびＣaＰＯ４沈降が
含まれる。１つの他の方法では、レトロウイルスプラス
ミドベクターをリポソームに封入する、または脂質に結
合させた後、宿主に与えることができる。 【０１０４】該プロデューサー細胞系は、該ポリペプチ
ドをコードする核酸配列が含まれる感染性レトロウイル
スベクター粒子を発生させる。次いで、そのようなレト
ロウイルスベクター粒子を使用して、真核細胞をインビ
トロまたはインビボのいずれかにおいてトランスデュー
スすることができる。トランスデュースされた真核細胞
は、該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するで
あろう。トランスデュースすることができる真核細胞に
は、限定されるものではないが、胚幹細胞、胚癌細胞、
さらにはまた、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、角質細胞、内皮細胞、および気管支上皮細胞が含
まれる。 【０１０５】本発明はまた、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸配列における変異の存在に関係がある疾
患、または疾患に対する感受性を検出するための診断ア
ッセイの一部としての、本発明の遺伝子の使用にも関す
る。 【０１０６】本発明の遺伝子において変異が起こってい
る個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出する
ことができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例え
ば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得る
ことができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用
することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎa
ture、３２４：１６３−１６６（１９８６）)を使用す
ることにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡ
またはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができ
る。例としては、本発明のポリペプチドをコードする核
酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、変異を同定
して分析することができる。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにお
ける変化により検出することができる。点変異は、増幅
されたＤＮＡが、放射能標識化したＲＮＡ、あるいはま
た、放射能標識化したアンチセンスＤＮＡ配列にハイブ
リダイズすることにより同定することができる。完全に
対合している配列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化により、また
は融解温度の相違により、対合していない複式物(duple
xes)と区別することができる。 【０１０７】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、
変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂
げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高
分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。Ｄ
ＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラ
ジエントゲルを変性することで区別することができ、こ
こでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それら
の特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルに
おける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓc
ience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。 【０１０８】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−
４４０１（１９８５）)。 【０１０９】従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲ
ノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保
護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の
使用(例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およ
びサザンブロッティングといったような方法により成し
遂げることができる。 【０１１０】さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ
配列決定に加えて、変異はまた、insitu 分析により検
出することもできる。 【０１１１】本発明はまた、正常な対照の組織試料と比
較しての該タンパク質の過剰発現が、異常細胞増殖、例
えば、腫瘍の存在を検出することができることから、様
々な組織におけるＦＧＦ−１３タンパク質レベルの変化
を検出するための診断アッセイにも関する。宿主から得
られた試料中のタンパク質レベルを検出するために使用
されるアッセイは当業者に周知であって、ラジオイムノ
アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッ
セイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ(Ｃoliganら、Ｃu
rrent Ｐrotocolsin Ｉmmunology、１（２）、第６章、
（１９９１）)は、まず最初に、本発明のポリペプチド
に対する抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナ
ル抗体を調製することを含んでなる。さらに、リポータ
ー抗体を、そのモノクローナル抗体に対して調製する。
そのリポーター抗体に、放射能、蛍光、または本実施例
では、ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような、検
出可能な試薬を結合させる。試料を宿主から取り除い
て、試料中のタンパク質を結合する固形保持体、例え
ば、ポリスチレン皿の上でインキュベートする。次い
で、ウシ血清アルブミンのような、非特異的なタンパク
質と共にインキュベートすることにより、その皿の上の
空いているタンパク質結合部位を全て覆う。次に、モノ
クローナル抗体を皿においてインキュベートするが、そ
の間に、そのモノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に
結合した全ての本発明のポリペプチドに結合する。結合
しなかったモノクローナル抗体を全て、緩衝液で洗い流
す。ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体
を直ちに皿に置くと、リポーター抗体の、問題のタンパ
ク質に結合した全てのモノクローナル抗体への結合が起
こる。 【０１１２】次いで、結合しなかったリポーター抗体を
洗い流す。次いで、ペルオキシダーゼ基質を皿に加え
て、一定時間に発生した色の量は、標準曲線に対して比
較する場合、患者の試料の一定体積中に存在する本発明
のポリペプチドの量の測定値である。 【０１１３】競合アッセイを使用することができ、ここ
では、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を固形保持
体に結合させて、標識化したＦＧＦ−１３および宿主か
ら得られた試料を固形保持体上に通過させて、例えば、
液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出さ
れる標識の量を、試料中の本発明のポリペプチドの量に
関連づけることができる。 【０１１４】「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡ
アッセイに似ている。「サンドイッチ」アッセイでは、
本発明のポリペプチドを固形保持体上に通過させて、固
形保持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第二抗
体を、問題のポリペプチドに結合させる。標識化され、
また第二抗体に特異的な第三抗体を固形保持体上に通過
させて、第二抗体に結合させた後、量を定量することが
できる。 【０１１５】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性の)に
基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置を
マークするのにはほとんど利用できない。本発明による
ＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気
と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【０１１６】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。３'非翻
訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ
中の１つ以上のエクソンをスパン(span)しないプライマ
ーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものと
する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに
使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、そ
れらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを
与えるであろう。 【０１１７】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を使用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に使用することができる他のマッピング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。 【０１１８】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を使用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５０または６０塩基という短
いcＤＮＡで使用することができる。この技術の復習に
は、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂ
asic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク
（１９８８）を参照。 【０１１９】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ. ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。 【０１２０】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。 【０１２１】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の分析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因
となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１
メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺
伝子を仮定する)。 【０１２２】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。 【０１２３】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。 【０１２４】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗
体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ. Ｌiss, Ｉnc.、７７−９６頁にお
いて)が含まれる。 【０１２５】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適
合し得る。それにまた、トランスジェニックマウスを使
用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒ
ト化抗体を発現させることができる。 【０１２６】本発明をさらに、次の実施例に関して記載
する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定され
ないことを理解すべきである。部または量は全て、特に
ことわらない限り、重量単位である。 【０１２７】次の実施例の理解を容易にするために、幾
つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載す
る。 【０１２８】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。 【０１２９】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常使用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。 【０１３０】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel, Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。 【０１３１】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。 【０１３２】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis, Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。 【０１３３】特にことわらない限り、トランスフォーメ
ーションは、Ｇraham, Ｆ.およびＶan der Ｅb, Ａ.、
Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法
に記載されているようにして行った。 【０１３４】 【実施例】実施例 １ＦＧＦ−１３タンパク質の細菌発現および精製 最初に、ＦＧＦ−１３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣ
Ｃ第９７１４７号を、プロセシングされたタンパク質の
５'配列(シグナルペプチド配列なし)およびその遺伝子
の３'側のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して増幅する。その遺伝子に対
応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に
付加する。５'オリゴヌクレオチドプライマー： GCCAGACCAT GGAGAATCAC CCGTCTCCTA AT 32（配列番号３） は、Ｎco制限酵素部位を含む。３'配列： GATTTAAGAT CTCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30 （配列番号４） は、ＢglII部位に対する相補的配列を含み、その後に１
８ヌクレオチドのＦＧＦ−１３コード配列が続く。 【０１３５】その制限酵素部位は、細菌発現ベクター p
ＱＥ−６０(Ｑiagen,Ｉnc. Ｃhatsworth、ＣＡ ９１３
１１)上の制限酵素部位に対応する。pＱＥ−６０は、抗
生物質耐性(Ａmpｒ)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴ
Ｇ−調節可能なプロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リ
ボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵
素部位をコードする。次いで、pＱＥ−６０をＮcoＩお
よびＢglIIで消化した。増幅された配列をpＱＥ−６０
にライゲートして、ヒスチジンタグおよびリボソーム結
合部位(ＲＢＳ)をコードする配列と共に枠内に挿入す
る。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｓ
ambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory
Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８
９）に記載されている手順により、Ｅ.coli.株 Ｍ１５
／rep４(Ｑiagen,Ｉnc.)をトランスフォームする。Ｍ１
５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、
これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイ
シン耐性(Ｋanｒ)も与える。トランスフォーマントを、
それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、
アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。
プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認す
る。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１００ug／m
l)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地中での液
体培養で一晩増殖させる(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を
使用して、大きな培養系に１：１００〜１：２５０の割
合で播種する。細胞を、０.４〜０.６の光学密度６００
(Ｏ.Ｄ. ６００)まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ
(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)
を、最終濃度が１mＭとなるまで加える。ＩＰＴＧは、l
acＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏの
クリアリングを誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞
をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分
離により収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤で
ある６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化する。清澄
後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク
質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キ
レートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化し
たＦＧＦ−１３を精製する(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhrom
atography ４１１：１７７−１８４（１９８４）)。６
モルのグアニジンＨＣl pＨ ５.０中、そのタンパク質
をカラムから溶出し、また再生の目的に、３モルのグア
ニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０ミリ
モルのグルタチオン(還元した)、および２ミリモルのグ
ルタチオン(酸化した)に調節する。この溶液中で１２時
間インキュベーションした後、そのタンパク質を１０ミ
リモルのリン酸ナトリウムに対して透析する。 【０１３６】実施例 ２ バキュロウイルス発現システムを用いての ＦＧＦ−１３
のクローニングおよび発現 完全な長さのＦＧＦ−１３タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列、ＡＴＣＣ第９７１４７号を、遺伝子の５'およ
び３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して増幅する。 【０１３７】 そのＦＧＦ−１３ ５'プライマーは、配列： CTAGTGGATC CCGAGAATCA CCCGTCTCCT 30 （配列番号５） を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)を含む
ことから、この部位でのクローニングは、推定されるＦ
ＧＦ−１３シグナルペプチド切断部位の下流でＦＧＦ−
１３遺伝子の１８ヌクレオチドと共に、バキュロウイル
スシグナル配列を枠内に置くであろう。 その３'プライマーは、配列： CGACTTCTAG AACCTCGGGG ATCTGGCTCC 30 （配列番号６） を有し、また制限エンドヌクレアーゼ ＸbaＩの切断部
位、およびその遺伝子の３'非翻訳配列に対して相補的
な１８ヌクレオチドを含む。 【０１３８】増幅された配列を、市販のキット(「Ｇene
clean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を
使用して、１％ アガロースゲルから単離する。次い
で、そのフラグメントを各々のエンドヌクレアーゼで消
化して、１％ アガロースゲル上で精製する。このフラ
グメントをＦ２と名付ける。 【０１３９】ベクター pＡ２gp(pＶＬ９４１ベクターの
修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システ
ムを用いてのタンパク質の発現に使用する(レビューに
は、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ. １９８７、
Ａ manual of methods for baculovirus vectors and i
nsect cell culture procedures、Ｔexas Ａgricultura
l Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を
参照)。この発現ベクターは、オートグラファ(Ａutogra
pha)カリフォルニア核多角体病ウイルス群(ＡcＭＮＰ
Ｖ)の強力な多角体(polyhedrin)プロモーター、続い
て、制限エンドヌクレアーゼ ＢamＨＩおよびＸbaＩの
認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ) ４０のポリ
アデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。
組換えウイルスを容易に選択するには、Ｅ.coli由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、多角体(polyhedrin)遺
伝子のポリアデニル化シグナルが続く多角体プロモータ
ーと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(c
otransfected)野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒
介される相同組換えのためのウイルス配列を多角体配列
の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベク
ターを、pＲＧ１、pＡc３７３、pＶＬ９４１、およびp
ＡcＩＭ１といったようなpＡ２の代わりに使用すること
ができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳummers,Ｍ.
Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３９)。 【０１４０】プラスミドを制限酵素で消化して、当業界
で既知の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを使用し
て脱リン酸化する。次いで、ＤＮＡを、市販のキット
(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、
Ｃa.)を使用して、１％ アガロースゲルから単離する。
このベクター ＤＮＡをＶ２と名付ける。 【０１４１】フラグメント Ｆ２および脱リン酸化プラ
スミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせ
る。次いで、Ｅ.coli ＤＨ５α細胞をトランスフォーム
して、プラスミド(pＢacＦＧＦ−１３)を含む細菌を、
各々の制限酵素を使用して同定する。クローン化された
フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認す
る。 【０１４２】リポフェクション法を使用して、プラスミ
ド pＢacＦＧＦ−１３ ５μgを市販の線形化バキュロウ
イルス(「ＢaculoＧoldＴＭ バキュロウイルス ＤＮ
Ａ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共
に同時トランスフェクトする(Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１
９８７）)。 【０１４３】各々の場合において、ＢaculoＧoldＴＭ
ウイルス ＤＮＡ １μgおよびプラスミド ５μgを、無
血清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉn
c.、Ｇaithersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイ
タープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポ
フェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μ
lを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートす
る。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グ
レイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播
種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴
加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加
えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で
５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフ
ェクション溶液をプレートから除去して、１０％ ウシ
胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。その
プレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間
培養し続ける。 【０１４４】４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳ
mith(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変更として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔech
nologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲル
を使用するが、このことにより、青色に染色されたプラ
ークを容易に単離することが可能となる。(「プラーク
アッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する
使用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、
Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、
９−１０頁にも見い出すことができる)。 【０１４５】連続希釈してから４日後に、ウイルスを細
胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドル
フピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルス
を含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペン
ドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心
分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上
清を、３５mmの皿に播種した昆虫Ｓf９細胞を感染させ
るのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集
した後、４℃で保存する。 【０１４６】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−ＦＧＦ
−１３を感染させる。６時間後、その培地を除去して、
メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II
培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替
える。４２時間後、５μＣiの３５Ｓ−メチオニンおよ
び５μＣiの３５Ｓ システイン５μＣi(Ａmersham)を加
える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした
後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク
質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
により視覚化する。 【０１４７】実施例 ３ ＣＯＳ細胞における組換えＦＧＦ−１３の発現 プラスミド、ＦＧＦ−１３−ＨＡの発現は、１）ＳＶ４
０ 複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.
coli 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イ
ントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモ
ーターを含む、ベクター pcＤＮＡ３／Ａmp(Ｉnvitroge
n)から得た。完全なＦＧＦ−１３前駆体およびその３'
末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮ
Ａフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域に
クローン化することから、組換えタンパク質発現は、Ｃ
ＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記
のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得
られるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、
Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、および
Ｒ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７：７６７（１９８
４）)。ＨＡタグを標的タンパク質へ融合させることに
より、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する
抗体で容易に検出することが可能となる。 【０１４８】ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメン
トおよびベクター、pcＤＮＡ３／Ａmpを、各々の制限酵
素で消化して、ライゲートさせる。そのライゲーション
混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃloning Ｓ
ystems、Ｌa Ｊolla、ＣＡ)にトランスフォームし、そ
のトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プ
レート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プラスミ
ド ＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正し
いフラグメントの存在に関して制限分析により試験す
る。組換えＦＧＦ−１３ ＣＯＳ細胞の発現には、ＤＥ
ＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベ
クターでトランスフェクトする(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆri
tsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabor
atory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、
（１９８９）)。ＦＧＦ−１３−ＨＡタンパク質の発現
を、放射能標識および免疫沈降法により検出する(Ｅ.Ｈ
arlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanu
al、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８
８）)。トランスフェクションから２日後、細胞を３５
Ｓ−システインで８時間標識化する。次いで、細胞培地
を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０m
Ｍ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％Ｎ
Ｐ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.
５))で溶菌する。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６７
（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地は両方と
も、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降する。沈
降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分
析する。 【０１４９】実施例 ４ 遺伝子治療による発現 線維芽細胞を皮膚生体組織検査により被験者から得る。
その結果得られた組織を組織培養培地に入れて、小片に
分離させる。組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表
面上に置き、約１０片を各々のフラスコに入れる。その
フラスコを上下にひっくり返し、密閉して、室温で一晩
放置する。室温で２４時間放置した後、そのフラスコを
ひっくり返し、その組織の塊はフラスコの底に固定され
たままにしておいて、新たな培地(例えば、１０％ ＦＢ
Ｓ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＨam
のＦ１２培地)を加える。次いで、これを３７℃で約１
週間インキュベートする。この時点で、新たな培地を加
えた後、数日毎に変える。さらに２週間培養した後、単
層の線維芽細胞が現れる。その単層をトリプシン処理し
て、より大きなフラスコへと剥がし取る(scaled)。 【０１５０】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復配列の隣接したpＭＶ−７(Ｋirschmeier, Ｐ. Ｔ.
ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８）)をＥcoＲ
ＩおよびＨindIIIで消化した後、仔ウシ腸ホスファター
ゼで処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分別
し、ガラスビーズを使用して精製する。 【０１５１】本発明のポリペプチドをコードするcＤＮ
Ａを、５'および３'末端配列に各々対応するＰＣＲプラ
イマーを使用して増幅する。ＥcoＲＩ部位を含む５'プ
ライマーおよび３'プライマーは、ＨindIII部位を含
む。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、等量のモロニーマ
ウス肉腫ウイルス線形バックボーンおよびＥcoＲＩ並び
にＨindIIIフラグメントを一緒に加える。その結果得ら
れた混合物を、２つのフラグメントのライゲーションに
適当な条件下に維持する。そのライゲーション混合物を
使用して、細菌ＨＢ１０１をトランスフォームした後、
そのベクターが正しく挿入された問題の遺伝子を有して
いることを確認する目的で、これを、カナマイシンを含
む寒天上に置く。 【０１５２】１０％ 仔ウシ血清(ＣＳ)、ペニシリン、
およびストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾され
たイーグル培地(ＤＭＥＭ)中、両種指向性pＡ３１７ま
たはＧＰ＋am１２パッキング細胞を集密的密度まで組織
培養で増殖させる。次いで、その遺伝子を含むＭＳＶベ
クターを培地に加えて、パッキング細胞をベクターでト
ランスデュースする。ここで、そのパッキング細胞は、
その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を製造する(ここ
で、そのパッキング細胞は、プロデューサー細胞と呼ば
れる)。 【０１５３】新たな培地をトランスデュースされたプロ
デューサー細胞に加えた後、培地を１０cmのプレートの
集密的プロデューサー細胞から収集する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポアフィルターを
通して濾過して、脱離したプロデューサー細胞を除去し
た後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。
培地を線維芽細胞の副次(sub)集密的プレートから除去
して、プロデューサー細胞から得られた培地に素早く置
き替える。この培地を除去して、新たな培地に置き替え
る。ウイルスの力価が高いならば、実質的には全ての線
維芽細胞が感染されるであろし、また選択の必要は全く
ない。力価が非常に低いならば、neoまたはhisといった
ような選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベク
ターを使用する必要がある。 【０１５４】次いで、操作された線維芽細胞を単独で、
またはサイトデックス(cytodex) ３微担体ビーズ上で密
集するまで増殖させた後、宿主に注入する。ここで、そ
の線維芽細胞は、タンパク質産物を製造する。上記の教
示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であ
ることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以
外の方法で、本発明を行うことができる。 【０１５５】 【配列表】 （１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： ヒュー等 （ii） 発明の名称 ： 線維芽細胞増殖因子−１３ （iii） 配列の数 ： ８ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラン， セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： ０８／２０７,４１２ （Ｂ） 出願日 ： １９９４年３月８日 （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−３６４ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ６４１塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： AGGGGGAGAA TCACCCGTCT CCTAATTTTA ACCAGTACGT GAGGGACCAG GGCGCCATGA 120 CCGACCAGCT GAGCAGGCGG CAGATCCGCG AGTACCAACT CTACAGCAGG ACCAGTGGCA 180 AGCACGTGCA GGTCCCCGGG CGTCGCATCT CCGCCACCGC CGAGGACGGC AACAAGTTTG 240 CCAAGCTCAT AGTGGAGACG GACACGTTTG GCAGCCGGGT TCGCATCAAA GGGGCTGAGA 300 GTGAGAAGTA CATCTGTATG AACAAGAGGG GCAAGCTCAT CGGGAAGCCC AGCGGGAAGA 360 GCAAAGACTG CGTGTTCACG GAGATCGTGC TGGAGAACAA CTATACGGCC TTCCAGAACG 420 CCCGGCACGA GGGCTGGTTC ATGGTCTTCA CGCGGCAGGG GCGGCCCCGC CAGGCTTCCC 480 GCAGCCGCCA GAACCAGCGC GAGGCCCACT TCATCAAGCG CCTCTACCAA GGCCAGCTGC 540 CCTTCCCCAA CCACGCCGAG AAGCAGAAGC AGTTCGAGTT TGTGGGCTCC GCCCCCACCC 600 GTCGGACCAA GCGCACACGG CGGCCCCAGC CCCTCACGTA G 641 （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２１２アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ： Arg Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Cys Leu Gln Leu Leu Ile Leu -20 -15 -10 Cys Cys Gln Thr Gln Gly Glu Asn His Pro Ser Pro Asn Phe Asn -5 1 5 Gln Tyr Val Arg Asp Gln Gly Ala Met Thr Asp Gln Leu Ser Arg 10 15 20 Arg Gln Ile Arg Glu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys 25 30 35 His Val Gln Val Pro Gly Arg Arg Ile Ser Ala Thr Ala Glu Asp 40 45 50 Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly 55 60 65 Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala Glu Ser Glu Lys Tyr Ile Cys 70 75 80 Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly Lys Pro Ser Gly Lys Ser 85 90 95 Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr 100 105 110 Ala Phe Gln Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe Met Val Phe Thr 115 120 125 Arg Gln Gly Arg Phe Arg Gln Ala Ser Arg Ser Arg Gln Asn Gln 130 135 140 Arg Glu Ala His Phe Ile Lys Arg Leu Tyr Gln Gly Gln Leu Pro 145 150 155 Phe Pro Asn His Ala Glu Lys Gln Lys Gln Phe Glu Phe Val Gly 160 165 170 Ser Ala Pro Thr Arg Arg Thr Lys Arg Thr Arg Arg Pro Gln Pro 175 180 185 Leu Thr 190 （２） 配列番号３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３２塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号３ ： GCCAGACCAT GGAGAATCAC CCGTCTCCTA AT 32 （２） 配列番号４の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号４ ： GATTTAAGAT CTCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30 （２） 配列番号５の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号５ ： CTAGTGGATC CCGAGAATCA CCCGTCTCCT 30 （２） 配列番号６の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号６ ： CGACTTCTAG AACCTCGGGG ATCTGGCTCC 30 （２） 配列番号７の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： 塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号７ ： （２） 配列番号８の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号８ ： GATTTACTCG AGCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＦＧＦ−１３のcＤＮＡ配列および対応する
推定アミノ酸配列を示す。最初の２１個のアミノ酸残基
は、推定されるリーダー配列を表す。
推定アミノ酸配列を示す。最初の２１個のアミノ酸残基
は、推定されるリーダー配列を表す。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/16
17/14 25/00
17/16 35/00
25/00 Ｃ０７Ｋ 14/50
35/00 16/22
Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
16/22 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 ジョン・エム・グリーン
アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ
ザーズバーグ、ダイアモンド・ドライブ
872番
(72)発明者 ヨアヒム・アール・グルーバー
アメリカ合衆国02167マサチューセッツ州
チェスナット・ヒル、ゲリー・ロード47番
(72)発明者 クレイグ・エイ・ローゼン
アメリカ合衆国20882メリーランド州レイ
トンズビル、ローリング・ヒル・ロード
22400番
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 DA02
DA06 EA02 EA04 GA13 HA01
4B063 QA01 QA05 QA18 QQ20 QR16
QS36 QX07
4B064 AG13 CA02 CA10 CA12 CA19
CC24 DA01 DA13
4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01
BA22 BA44 CA53 DC50 NA14
ZA01 ZA36 ZA89 ZA92 ZB26
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10
CA40 EA20 EA50 FA74
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 本願明細書に記載されたいずれかの発
明。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002153584A JP2003052387A (ja) | 2002-05-28 | 2002-05-28 | 線維芽細胞増殖因子１３ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002153584A JP2003052387A (ja) | 2002-05-28 | 2002-05-28 | 線維芽細胞増殖因子１３ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9500361A Division JPH11507504A (ja) | 1995-06-05 | 1995-06-05 | 線維芽細胞増殖因子１３ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003052387A true JP2003052387A (ja) | 2003-02-25 |
Family
ID=19194817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002153584A Pending JP2003052387A (ja) | 2002-05-28 | 2002-05-28 | 線維芽細胞増殖因子１３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003052387A (ja) |
-
2002
- 2002-05-28 JP JP2002153584A patent/JP2003052387A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040817 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20041102 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20041108 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050412 |