JP2003024066A - ヒトｃｃｎ−様増殖因子 - Google Patents
ヒトｃｃｎ−様増殖因子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なヒトＣＣＮ様増殖因子およびそれをコ
ードするポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 ヒト小ＣＣＮ様増殖因子ポリペプチド
（ＳＣＧＦ）およびそのようなポリペプチドをコードす
るＤＮＡ（ＲＮＡ）および組換え技術によりそのような
ポリペプチドを製造する方法を開示する。また、傷の治
癒または組織の再生、移植片の定着および血管形成のた
めにそのようなポリペプチドを利用する方法も開示す
る。
ードするポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 ヒト小ＣＣＮ様増殖因子ポリペプチド
（ＳＣＧＦ）およびそのようなポリペプチドをコードす
るＤＮＡ（ＲＮＡ）および組換え技術によりそのような
ポリペプチドを製造する方法を開示する。また、傷の治
癒または組織の再生、移植片の定着および血管形成のた
めにそのようなポリペプチドを利用する方法も開示す
る。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのよう
なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関す
る。とりわけ、本発明のポリペプチドは、ときとして以
下で「ＳＣＧＦ」と呼ぶ、ヒト小ＣＣＮ様増殖因子とし
て推定的に同定されている。本発明はまた、そのような
ポリペプチドの作用を阻害することにも関する。本発明
のポリペプチドは、cef １０／cry ６１、結合組織増殖
因子（ＣＴＧＦ）およびnovを含む増殖レギュレーター
のファミリーに関する。本発明のポリペプチドに対応す
るｍＲＮＡは腎臓、肺、心臓および脳の順に多く発現す
る。 【０００２】 【従来の技術】増殖因子および形質転換している癌遺伝
子を含む他のマイトジェンはある種の細胞によって発現
される複雑な遺伝子のセットを迅速に含むことができる
（ラウ（Ｌau，Ｌ.Ｆ.）およびナタンズ（Nathans，
Ｄ.）、Ｍolecular Ａspects ofＣellular Ｒegulatio
n、６：１６５−２０２（１９９１））。これらの遺伝
子は前初期（immediate early）または初期応答遺伝子
と命名されているが、新規のタンパク質合成とは独立し
て増殖因子またはマイトジェンに接触後数分のうちに転
写上活性化される。これらの前初期遺伝子の群は、増殖
および分化、再生および傷の治癒などの複雑な生物学的
なプロセスの調節に必要である細胞外分泌タンパク質を
コードする（ライセック（Ryseck，Ｒ.Ｐ.）ら、Ｃell
ＧrowthＤiffer.、２：２３５−２３３（１９９
１））。 【０００３】この群に属するよく関連したタンパク質は
ニワトリからのcef１０を含み、ウイルス性の癌遺伝子p
p６０v-arcによる誘導の後検出される（シモンズ（Ｓim
ons，Ｄ.Ｌ.）ら、ＰＮＡＳ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１
１７８−１１８２（１９８９））。密に関連したタンパ
ク質cry ６１は血清または血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）によって迅速に活性化される（オブライエン（Ｏ'
Ｂrien，Ｔ.Ｐ.）ら、Ｍol．Ｃell Ｂiol.、１０：３５
６９−３５７７（１９９０））。cef １０およびcyr６
１の間の全体のアミノ酸の同一性はせいぜい８３％であ
る。第３のメンバーはヒト結合組織増殖因子（ＣＴＧ
Ｆ）（ブラドハム（Ｂradham．Ｄ．Ｍ.）ら，Ｊ．Ｃel
l．Ｂiol.、１１４：１２８５−１２９４（１９９１）
である。ＣＴＧＦは、増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を形
質転換することによる活性化後の高いレベルにおけるヒ
ト血管内皮細胞により分泌される。システインリッチペ
プチドであるＣＴＧＦはＰＤＧＦ様の生物学的および免
疫学的活性を示し、ついで細胞表面の受容体の特定のも
のであるとしている。 【０００４】前初期タンパク質の第４のメンバーはfisp
-12であり、血清により誘発されると示されており、レ
ウリン（reurine）ゲノムの領域にマッピングされる
（ライセックら、Ｃell Ｇrowth Ｄiffer. ２：２３５
−２３３（１９９１）。本ファミリーのさらに別のメン
バーはニワトリの遺伝子であり、通常は成人の腎臓細胞
にて得られるnovであり、腎芽細胞腫を誘発した骨髄芽
球症関連ウイルスタイプに過剰発現すると見出されてい
る。さらにニワトリの胎児線維芽細胞におけるアミノ末
端平滑化したnov産物の発現は形質転換に十分であった
（ジョリオットＪoliot，Ｖ．）ら、Ｍol．Ｃell．Ｂio
l.、１２：１０−２１（１９９２））。これらの前初期
遺伝子の発現は増殖因子によって集められる事象のカス
ケードの中で「第三メッセンジャー」として機能する。ま
た、細胞増殖が一般的であるそれらの分化および傷の治
癒などの複雑な生物学的プロセスを統合するのに必要で
あると考えられている。増殖レギュレーターの台頭しつ
つあるファミリーはＣＴＧＦのＣＣＮファミリーと呼ば
れる；cef １０／cyr ６１；およびnovである。本発明
のポリペプチドは増殖レギュレーターのこのファミリー
のメンバーであると考えられている。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明の１つの態様によ
り、新規な成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性で
あり、診断上または治療上有用なそのフラグメント、ア
ナログおよび誘導体を提供する。本発明の１つの態様に
より、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含
め、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸
分子、さらにはまた、そのアナログ、ならびに生物学的
に活性であって、診断上または治療上有用なそのフラグ
メントを提供する。 【０００６】本発明のさらに別の他の態様により、該タ
ンパク質の発現を容易にし、連続発見を促進するような
条件の下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列を含む組換え原核生物および／または真核生物宿主細
胞を培養することを含む組換え技術によるそのようなポ
リペプチドの製造方法を提供する。本発明のさらに別の
態様により、例えば筋肉消耗症、骨粗鬆症を処置するこ
と、移植片の定着を補助する、傷害の治癒および組織再
生を刺激すること、血管形成を促進させ、血管平滑筋お
よび内皮細胞産生を刺激する。本発明のさらに別の態様
により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供す
る。 【０００７】本発明のさらに別の態様により、そのよう
なポリペプチドに対するアンタゴニストを提供する。該
アンタゴニストは、そのようなポリペプチドの作用を阻
害するために使用してよく、例えば、傷の治癒または肺
線維症の間の過剰な結合組織の産生を制限する。本発明
のさらに別の態様により、本発明のポリヌクレオチドの
配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核
酸分子を含む核酸プローブを提供する。 【０００８】本発明のさらに別の態様により、本発明の
ポリペプチドの過少および過剰発現に関する疾患および
そのようなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異
を検出するための診断アッセイを提供する。本発明のさ
らに別の態様により、科学的研究、ＤＮＡの合成および
ＤＮＡベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的
のためにそのようなポリペプチドまたはそのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法
を提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。 【０００９】 【発明の実施の形態】本発明の一つの態様により、図１
〜図２（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する成
熟ポリペプチド、または１９９５年６月２日にＡＴＣＣ
受託番号第９７１７３号として寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
る、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本
発明のポリペプチドをコードするポリネクレオチドはヒ
ト９週齢胎児からのｃＤＮＡライブラリー中で発見され
た。該ポリペプチドはＣＣＮファミリーに構造上関連す
るその成熟タンパク質は１８３アミノ酸を含む最初の２
３アミノ酸残基が推定リーダー配列である２０６のアミ
ノ酸のタンパク質をコードするオープン・リーディング
・フレームを含む。 【００１０】ＣＣＮ増殖因子ファミリーのメンバーとし
てのＳＣＧＦの認定は主としてアミノ酸配列の保存に基
づく。ＣＣＮファミリーに対するホモロジーはすべての
メンバーで約２７％である。ＣＣＮメンバーに対する最
も高いホモロジーはＳＣＧＦの２９を越える長さのアミ
ノ酸で６２％である。本発明のポリペプチドは１０シス
テインを含むシステインリッチである。該ポリペプチド
はＣＴＧＦ、cyr ６１およびnovの約５０％の大きさで
ある。 【００１１】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コーディング鎖または非コーディング(アン
チ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコード
するコーディング配列は、図１〜図２（配列番号：１）
に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコ
ーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コー
ドの重複または縮重の結果として、図１〜図２（配列番
号：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟
ポリペプチドをコードする異なったコード配列であって
もよい。 【００１２】図１〜図２（配列番号：２）の成熟ポリペ
プチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以
下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列、お
よびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配
列といったような付加的コーディング配列；成熟ポリペ
プチドのコーディング配列(また場合により、付加的コ
ーディング配列)、および成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列のイントロンまたは非コーディング配列５'お
よび／または３'といったような非コーディング配列。 【００１３】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディ
ング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはま
た、付加的コーディングおよび／または非コーディング
配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明は
さらに、図１〜図２（配列番号：２）の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌ
クレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異
体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体
またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体で
あり得る。 【００１４】従って、本発明には、図１〜図２（配列番
号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託さ
れたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはま
た、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、こ
れらの変異体は、図１〜図２（配列番号：２）のポリペ
プチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはア
ナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体に
は、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異
体が含まれる。 【００１５】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、図１〜図２（配列番号：１）に示すコーディング配
列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクロ
ーンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体
であるコーディング配列を有し得る。当該技術分野で知
られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以
上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別
の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードさ
れるポリペプチドの機能を実質的には変えない。 【００１６】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現お
よび分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞
からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列と
して機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得
るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有する
ポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞に
より開裂されて、成熟型のポリペプチドを形成したリー
ダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはま
た、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質で
あるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する
成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型
のタンパク質である。プロ配列が一度開裂されると、活
性成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポ
リヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を
有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リ
ーダー配列)の両方を有するタンパク質をコードし得
る。 【００１７】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコーディング配列も有し得る。細菌宿主の場
合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟
ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベク
ターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)で
あってよく、または、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−
７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血
球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフ
ルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトー
プに対応する(ウイルソン（Ｗilson,Ｉ.）ら、Ｃell、
３７：７６７（１９８４）)。 【００１８】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、また好ましくは少なくとも９０％およびより好まし
くは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌク
レオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条
件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好
ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、
ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味す
る。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜図２（配列
番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡにより
コードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的
機能もしくは活性を保持するポリペプチド、すなわちＳ
ＣＧＦポリペプチドとして機能するものをコードする。 【００１９】かわりに、該ポリペプチドは本発明のポリ
ヌクレオチドにハイブリダイズし、および該ポリヌクレ
オチドに上記に示すように同一性を有し、活性は保有し
ていない少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基およ
びより好ましくは少なくとも５０塩基を有する。そのよ
うなポリペプチドは配列番号：１のポリヌクレオチドま
たはその変異体のポリヌクレオチドの、例えば該ポリヌ
クレオチドの回収のためのプローブとして、または診断
プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用してよい。 【００２０】本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際に
は該寄託された物質中の配列が優先する。寄託された物
質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が
要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与
されない。 【００２１】本発明はさらに、図１〜図２（配列番号：
２）の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたc
ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体に関する。図１〜図２
（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤ
ＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用
語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的
機能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。
従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断する
ことにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造
することができるプロプロテインが含まれる。 【００２２】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。図１〜図２（配
列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログは、（i）１つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましく
は、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのよ
うな置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされる
ものであってもよく、またはコードされたものでなくて
もよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基
に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプ
チドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物
(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合
物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは
分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される
配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加
的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものまた
は（v）あるアミノ酸残基を欠如しているが、しかしな
お生物学的活性は保有している成熟ポリペプチドのスプ
ライシング変異体であり得る。そのようなフラグメン
ト、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると思われる。 【００２３】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」と
いう用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然
に存在するなら、天然の環境)から除去されていること
を意味する。例えば、生存動物中にある天然に存在する
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていな
いが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全て
から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベ
クターの一部となり得、および／またはそのようなポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり
得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の
環境の一部ではないという点で、なお単離されている。 【００２４】本発明のポリペプチドは配列番号：２（特
に成熟ポリペプチド）のポリペプチドならびに配列番
号：２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好
ましくは少なくとも７０％の同一性）およびより好まし
くは少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なく
とも９０％の同一性）およびさらになおより一層好まし
くは９５％の類似性（さらになお好ましくは、少なくと
も９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、ま
た、そのようなポリペプチドの部分をも含み、そのよう
なポリペプチドの部分は一般的には少なくとも３０アミ
ノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含
む。 【００２５】当該技術分野において知られているよう
に、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ
酸置換基を第２のポリペプチドの配列に対して比較する
ことにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグ
メントまたは一部はペプチド合成による対応する完全長
のポリペプチドを調製するのに使用されてよい；それゆ
え、該フラグメントは完全長ポリペプチドを産生するた
めの中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレ
オチドのフラグメントまたは一部は本発明の完全長ポリ
ヌクレオチドを合成するために使用してよい。 【００２６】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クロ
ーニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明
のベクターで遺伝的に操作される（トランスデュースさ
れ、または形質転換され、またはトランスフェクトされ
る）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒
子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞
は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを
選択し、またはＳＣＧＦ遺伝子を増幅するのに適するよ
う修飾された従来の栄養培地で培養することができる。
温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択
された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業
者に明らかであろう。 【００２７】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロ
ウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったような
ウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベク
ターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能で
ある限り、使用することができる。 【００２８】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮ
Ａ配列を、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動
可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプ
ロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：
ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌(Ｅ．col
i)、lacまたはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、
および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスで
の遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロ
モーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボ
ソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターは
また、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 【００２９】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったような、または大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるため
に、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を
含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さ
らにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含む
ベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。 【００３０】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyc
es）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typ
himurium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；Drosophila Ｓ２およびＳｆ９といったような昆
虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowesメラノーマといっ
たような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当
な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内
であると思われる。 【００３１】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含む組換え構築物も含ま
れる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で
挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターと
いったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい
態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可
能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含む。適
当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知ら
れており、市販されている。以下のベクターを例として
挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９
（キアゲン（Qiagen））、pＢＳ、pＤ１０、ファージス
クリプト（phagescript）、psiＸ１７４、pbluescript
ＳＫ、pＢＳＫＳ、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８
Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Stratagene））；p
ＴＲＣ９９a、pＫＫ２２３３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ
５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア（Pharmacia））。真
核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、p
ＸＴ１、pＳＧ（ストラタジーン）、pＳＶＫ３、pＢＰ
Ｖ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア）。しかし、他の
いずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中
で複製可能であって、生存可能である限り、使用するこ
とができる。 【００３２】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可
能なマーカーを有する他のベクターを用いて、いずれか
の所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当
なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７であ
る。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lac
Ｉ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲＩ、ＰＬおよ
びtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ前初
期（immediate early）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初
期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、
およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当
なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者
のレベルの範囲内である。 【００３３】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核
細胞であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のよう
な原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。（デイビス（Ｄav
is，Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner，Ｍ.）、バッティー
（Ｂattey，Ｉ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecu
lar Ｂiology）（１９８６））。 【００３４】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambroo
k）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlo
ning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory
Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー
（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、（１９８９）
により記載されており、この開示は、本明細書の一部を
構成する。 【００３５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製起点の後期側にあ
るＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリ
オーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ
ーが含まれる。 【００３６】通例、組換え発現ベクターには、複製起
点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能な
マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子お
よびサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae） Ｔ
ＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせる
ために高度に発現される遺伝子から得られるプロモータ
ーが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、と
りわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）の
ような解糖系酵素、α−因子、酸性ホスファターゼ、ま
たは熱ショックタンパク質などをコードするオペロンか
ら得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開
始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパ
ク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせる
ことができるリーダー配列と共に、適当な相（phase）
で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、
所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化
または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含
まれる融合タンパク質をコードすることができる。 【００３７】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製起点を含むであろ
う。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティ
フィムリウム、ならびにシュードモナス（Pseudomona
s）属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。 【００３８】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、選択可能
なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。そのよう
な市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine
Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデ
ン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐromega
Ｂiotec）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含
まれる。これらのpＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプ
ロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせ
る。 【００３９】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモ
ーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘
導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細
胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的また
は化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の
抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発
現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのよう
な方法は、当業者に周知である。 【００４０】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨ
Ｋ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起
点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいず
れかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終
結配列、および５’に隣接する非転写配列もまた含むで
あろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ
配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とさ
れる非転写遺伝要素を与えることができる。 【００４１】本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラ
フィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回
収して、精製することができる。必要に応じて、タンパ
ク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成す
るのに使用することができる。最後に、高性能液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用する
ことができる。 【００４２】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。 【００４３】本発明のポリペプチドは、傷の治癒およ
び、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺または
腎臓などの組織の再増殖に関する治療に使用してよい。
本発明のポリペプチドは再狭窄、心臓拡張／肥厚（鬱血
性心不全）およびアテローム硬化症などの組織改作（re
modeling）に使用してよい。本発明のポリペプチドは血
管形成を刺激するためおよび、例えば、血管平滑筋およ
び内皮細胞の増殖を増強するために使用してもよい。血
管形成の増加は、虚血組織に対しておよび冠状血管の狭
窄に対する心臓中での側枝（collateral）冠状動脈の成
長に利益がある。 【００４４】本発明のポリペプチドはまた、移植した周
囲の細胞の増殖を刺激するための移植組織定着時に使用
してよく、強化部位に接着しやすくする。本発明のポリ
ペプチドはまた、ＳＣＧＦポリペプチドの発現パターン
が胎児ライブラリーに豊富であるので、胎児の初期の成
長を刺激するために使用してよい。本発明のさらに別の
態様により、そのようなポリペプチドまたはそのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連し
たイン・ビトロでの目的のためおよびヒトの疾患の診断
薬および治療薬を提供する目的のために利用する方法を
提供する。 【００４５】本発明は本発明のポリペプチドの受容体の
同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は当
業者に公知の多数の方法、例えば、リガンドパンニング
およびＦＡＣＳソーティング（コリガン（Ｃoligan）
ら、カレント・プロトコールズ・イン・イムン（Ｃurre
nt Ｐrotocols in Ｉmmun．）、１（２）、第５章、
（１９９１））などにより同定することができる。好ま
しくは、発現クローニングを用い、その際、ポリアデニ
ル化したＲＮＡを該ポリペプチドに応答性の細胞から調
製し、ついでこのＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブ
ラリーをプールに分け、ＣＯＳ細胞またはＳＣＧＦに応
答性でない他の細胞にトランスフェクションするために
使用する。ガラススライド上で増殖させたトランスフェ
クションした細胞を標識したＳＣＧＦにさらす。ＳＣＧ
Ｆはヨウ素化または部位特異的なプロテインキナーゼの
認識部位を含めることを含む多様な手段によって標識す
ることができる。固定およびインキュベーションの後で
スライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正の
プールを同定し、ついでサブプールを調製し、ついで相
互作用性のサブ−プールおよび再スクリーニング方法を
用いて再度トランスフェクションし、最終的に推定受容
体をコードする単一クローンを産生する。 【００４６】受容体の同定のための別法として、標識し
たＳＣＧＦを細胞膜または受容体分子を発現する抽出調
製物と光親和性結合させることができる。架橋した物質
をＰＡＧＥ分析によって分離し、ついでＸ−線フィルム
にさらす。ＳＣＧＦの受容体を含む標識した複合体を切
り出して、ペプチドフラグメントに分離し、タンパク質
マイクロシークエンシングにかける。マイクロシークエ
ンシングから得たアミノ酸配列を推定受容体をコードす
る遺伝子を同定するためｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするための縮重したオリゴヌクレオチドプロー
ブのセットを設計するのに使用する。 【００４７】本発明はまた、ＳＣＧＦ受容体に結合し、
該受容体を活性化させるものを同定するための化合物を
スクリーニングするための方法にも関する。そのような
方法の例はコマイトジェン（comitogen）Ｃon Ａの存在
下、内皮細胞の増殖を刺激するＳＣＧＦの能力を利用す
る。ヒト臍静脈血管内皮細胞を得て、９６ウェルの平ら
な底の培養皿にて培養し（コスター（Ｃostar）、ケン
ブリッジ（Ｃambridge）、マサチューセッツ）、Ｃon-
Ａ（カルビオケム（Ｃalbiochem）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊo
lla）、カリフォルニア）を含む混合物をおいておく。
Ｃon-Ａおよびスクリーニングすべき化合物を加え、３
７℃でインキュベーションした後、培養物を3[Ｈ]チミ
ジンで脈打たせ、ガラスファイバーフィルター（Ｐh
Ｄ；ケンブリッジ・テクノロジー（Ｃambridge Ｔechno
logy）、ウォータータウン（Ｗatertown）、マサチュー
セッツ）上に回収する。３つの培養物の平均の3[Ｈ]チ
ミジン取り込み（ｃｐｍ)を液体シンチレーションカウ
ンター(ベックマン・インストルメンツ（Ｂeckman Ｉns
truments)、アルバイン（Ｉrvine）、カリフォルニア）
を用いて決定する。有意な3[Ｈ]チミジン取り込みは内
皮細胞増殖の刺激を示唆している。 【００４８】アンタゴニストをアッセイするため、上記
のアッセイを行うが、このアッセイにおいてＳＣＧＦは
スクリーニングすべき化合物と一緒に加え、ＳＣＧＦの
存在下での3[Ｈ]チミジン取り込みを抑制する該化合物
の能力は、該化合物がＳＣＧＦのアンタゴニストである
ことを示している。代わりに、ＳＣＧＦアンタゴニスト
は、競合抑制アッセイのための適切な条件下でＳＣＧＦ
および潜在的なアンタゴニストと膜結合性ＳＣＧＦ受容
体または組換え受容体とを合わせることによって検出さ
れてよい。ＳＣＧＦは放射能などで標識化し、それによ
って該受容体結合したＳＣＧＦ分子の数が潜在的なアン
タゴニストの有効性を決定することができる。 【００４９】可能性のあるＳＣＧＦアンタゴニストの例
には、該ポリペプチドに結合する抗体、また幾つかの場
合にはオリゴヌクレオチドが含まれる。かわりに、可能
性のあるアンタゴニストはＳＣＧＦ受容体を認識するが
効果的を全く伝達せず、それによってＳＣＧＦの作用を
競合的に抑制するという、例えば、成熟形態のＳＣＧＦ
などの密接に関連したタンパク質であってよい。 【００５０】別の可能性のあるアンタゴニストにはま
た、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチ
センス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用し
て、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくは
ＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この
方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮ
Ａへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディ
ング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオ
リゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対し
て相補的であるよう設計し(三重らせん−リー（Ｌee）
ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；
クーニー（Ｃooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６
（１９８８）；およびダーバン（Ｄervan）ら、Ｓcienc
e、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことに
よって、転写およびＳＣＧＦの産生を妨げる。アンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいて
mＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＳＣＧＧ
への翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ（Ｏkan
o）、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；オ
リゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・イン
ヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏli
godeoxynucleotidesasＡntisense Ｉnhibitors of Ｇen
e Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣＰress）、ボ
カ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１９８
８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り
込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをイン
ビボにおいて発現させて、ＳＣＧＦの産生を阻害するこ
とができる。 【００５１】可能性のあるＳＣＧＦアンタゴニストに
は、該ペプチドの活性部位、該受容体結合部位または他
の増殖因子結合部位に結合し、それによってＳＣＧＦの
正常な生物学的活性を妨げる小分子が含まれる。小分子
の例には、これらに限定されるものではないが、小ペプ
チドまたはペプチド様分子が含まれる。該アンタゴニス
トを腫瘍中の新規血管成長およびアテローム硬化症およ
びバルーン血管形成術に続く再狭窄においてよくみられ
る平滑筋細胞の新内膜（neointimal）増殖を妨害するの
に使用してよい。 【００５２】該アンタゴニストをまた、手術後、心筋梗
塞後の線繊症または肺線維症に関連した線維外傷を形成
するケロイド中に見られる瘢痕（scar）の過剰な生成を
抑制するために使用してよい。該アンタゴニストを例え
ば、以下に記載するような製薬学的に許容し得る担体と
ともに組成物において使用してよい。本発明のＳＣＧＦ
ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、適
当な製薬学的担体と組み合わせて使用することができ
る。そのような組成物は、治療上有効な量の該ポリペプ
チド、アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学上許
容され得る担体または賦形剤を含む。そのような担体に
は、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。そ
の製剤は、投与方法に適合すべきである。 【００５３】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含む医薬品パックまたはキットも提供する。その
ような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製
造、使用または販売を規制する政府当局により規定され
た形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与
のための製造、使用または販売の、該当局による承認を
表わす。さらに、該医薬組成物は、他の治療化合物と共
に使用することができる。 【００５４】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも
約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場
合、それらは、１日当たり約８mg／kg(体重)を超えない
量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路お
よび症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg
／kg〜約１mg／kg(体重)である。 【００５５】以下に限られるものではないが、ＰＤＧ
Ｆ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦまたはＴＧＦ−βを含む他
の増殖因子と組み合わせたＳＣＧＦは傷の治癒において
見られるような生理学的応答を加速してよい。該ＳＣＧ
Ｆポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよび
アンタゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれること
が多い、そのようなポリペプチドのイン・ビボにおける
発現により、本発明に従って使用することができる。 【００５６】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
ス・ビボ（ex vivo）においてポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した
後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与え
る。そのような方法は、当該技術分野で公知である。例
えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分
野で公知の方法により操作することができる。 【００５７】同様に、例えば、当該技術分野で公知の方
法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のた
めに、細胞をイン・ビボにおいて操作することができ
る。当該技術分野において知られているように、細胞を
イン・ビボにおいて処理してポリペプチドをイン・ビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するた
めのプロデューサー細胞を患者に投与することができ
る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞を
イン・ビボにおいて操作するために使用することができ
るアデノウイルスであってもよい。 【００５８】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【００５９】該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモ
ーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターに
は、以下に限られるものではないが、レトロウイルス
ＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍille
r）ら、Biotechniques、Ｖol．７、Ｎo．９、９８０−
９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター
（例えば、以下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏ
ｌ IIIおよびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物
細胞のプロモーターなどの細胞プロモーター）が含まれ
る。使用されてよい他のウイルスプロモーターは、以下
に限るものではないが、アデノウイルスプロモーター、
チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パ
ルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーター
の選択は、本明細書中の教示から当業者には明らかであ
ろう。 【００６０】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上
記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−ア
クチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモー
ターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターで
あってよい。 【００６１】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
をトランスデュースするのに使用してよい。トランスフ
ェクションしてよいパッケージング細胞の例には、以下
に限るものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれ
（ミラー、Human Gene Therapy、Ｖol．１、５−１４頁
（１９９０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引
用する）。該ベクターは当該技術分野において公知の方
法によりパッケージング細胞をトランスデュースする。
このような方法には、以下に限るものではないが、エレ
クトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈
降が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプ
ラスミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れ
られてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与
されてよい。 【００６２】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生
物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トラ
ンスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース
されてよい真核生物細胞には、以下に限られるものでは
ないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細
胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞Ｂ、ケラチノサイ
ト、内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれる。 【００６３】本発明はまた、診断用として本発明の遺伝
子を使用することにも関する。本発明のポリペプチドを
コードする核酸配列中の変異形態の検出により、疾患、
ＳＣＧＦ中の変異は腫瘍を引き起こすので、例えば腫瘍
などの診断または疾患の罹患し易さの診断が可能であろ
う。 【００６４】ヒトＳＣＧＦにおける変異を有する個体
は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診
断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾
液、組織生検および剖検物質などから得られる。ゲノム
ＤＮＡを直接検出に使用してもよいし、分析前にＰＣＲ
（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎature、３２４：１６３−１
６６（１９８６））により酵素的に増幅してもよい。同
様の目的のため、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた使用して
よい。一例として、ＳＣＧＦをコードする核酸に相補的
なＰＣＲプライマーはＳＣＧＦの変異を同定し分析する
のに使用することができる。例えば、欠失および挿入
は、通常の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさに
おける変化によって検出することができる。点突然変異
は、増幅したＤＮＡを放射性標識したＳＣＧＦ ＲＮＡ
または別法として放射性標識したＳＣＧＦアンチセンス
ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定す
ることができる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼ
Ａ消化によるかまたは融点における差異によってミスマ
ッチの二本鎖から区別することができる。 【００６５】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａフラグメントの電気泳動の移動度における変化の検出
によって行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分
離（high resolution）ゲル電気泳動によって可視化す
ることができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、
別々のＤＮＡフラグメントが、その特異的な融点または
部分的な融点に従って別個の位置でゲルにて減速される
変性ホルムアミド濃度勾配ゲル上で区別してよい（例え
ば、マイヤーズ（Ｍyers）ら、Ｓcience、２３０：１２
４２（１９８５））。 【００６６】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的な
ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングま
たは制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型
（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットな
どの方法により行われてよい。 【００６７】さらに従来のゲル電気泳動およびＤＮＡシ
ークエンシングに加えて、変異はまたイン・サイチュ分
析により検出することができる。ＳＣＧＦタンパク質の
発現は腫瘍形成に関する血管疾患または血管新生に関連
する。ＳＣＧＦは腎臓、肺、心臓または脳に及ぼす癌遺
伝子効果を有する。胎児の組織は急速に増殖し、および
ＳＣＧＦ特異的抗体は、すぐに増殖する腫瘍を検出する
ことができる。ＳＣＧＦはシグナルペプチドを有し、そ
のｍＲＮＡは内皮細胞に非常に多く、および少しは平滑
筋細胞に発現する。従って、抗ＳＣＧＦ抗体は、血管の
疾患または腫瘍形成に関する血管新生の診断に使用でき
る。というのは、該ポリペプチドのレベルの変化はその
ような障害の指標となってよいからである。さらに、Ｓ
ＣＧＦタンパク質は再狭窄、高血圧、鬱血性心不全およ
びアテローム硬化症などの組織改作プロセスに関すると
思われる。 【００６８】競合アッセイを使用してよく、その際、Ｓ
ＣＧＦに特異的な抗体を固相支持体に結合させ、標識し
たＳＣＧＦおよび宿主由来のサンプルを該固相支持体を
通過させ、検出された固相支持体に結合した標識の量を
該サンプル中のＳＣＧＦの量に相関させることができ
る。「サンドイッチ」アッセイはＥＬＩＳＡアッセイと
同様である。「サンドイッチ」アッセイではＳＣＧＦを
固相支持体を通過させ、固相支持体に結合した抗体に結
合する。第二抗体をついでＳＣＧＦポリペプチドに結合
させる。標識されており、第二抗体に特異的である第三
抗体をついで固相支持体を通過させて第二抗体に結合さ
せ、ついでその量を定量することができる。 【００６９】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づ
いた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマー
クするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮ
Ａの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連
遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【００７０】簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー（好ましくは、１５−２５bp）を調製することに
より、配列を染色体にマップすることができる。３'未
翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮ
Ａ中の１を越えるエクソンにまたがらないプライマーを
迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとす
る。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体
を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使
用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブ
リッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろ
う。 【００７１】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、特異的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマッピング方法には、イン
・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識
化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いて
のプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よるプレセレクションが含まれる。 【００７２】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程
で与えることができる。この技術は、５００または６０
０塩基という短いｃＤＮＡで利用することができる。こ
の技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・
クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・マニュ
アル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanual of
Ｂasic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐergamon
Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。 【００７３】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（Ｖ. ＭcＫusick）、メンデリア
ン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheri
tance in Ｍan）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシ
ティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns
Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を
介してオンラインで利用できる)に見出される。つい
で、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患と
の間の関係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺
伝(coinheritance))によって確認する。 【００７４】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因
となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１
メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺
伝子を仮定する)。 【００７５】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公
知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメント
の製造に使用することができる。 【００７６】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。ついで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。 【００７７】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える任意の技
術を使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler）およびミルシュタイン（Ｍilste
in）、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、
トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔ
oday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造
するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Ｃole）
ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・ア
ンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodie
s and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール．リス、イ
ンク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁におい
て)が含まれる。 【００７８】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明
の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現
するのに使用してよい。 【００７９】 【実施例】本発明をさらに、以下の実施例に関して記載
する；しかしながら、本発明は、そのような実施例に限
定されないことを理解すべきである。部または量は全
て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実
施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てく
る方法および／または用語を記載する。「プラスミド」
は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字
および／または数字により示す。本明細書中の出発プラ
スミドは、市販されているか、限定されない基盤の下に
公に入手可能であるか、または公開された方法により入
手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載した
プラスミドと同等のプラスミドは、当該技術分野で公知
であって、当業者に明らかであろう。 【００８０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、典型的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５
〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定
の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者によ
り指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーシ
ョン時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変
えてもよい。消化後、その反応物をポリアクリルアミド
上で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離す
る。 【００８１】開裂したフラグメントのサイズ分離は、ゲ
ッデル（Ｇoeddel, Ｄ）ら、Ｎucleic ＡcidsＲes.、
８：４０５７（１９８０）により記載されている８％
ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレ
オチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポ
リデオキシヌクレオチド、または２つの相補的なポリデ
オキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌ
クレオチドは５'リン酸を有さないことから、キナーゼ
の存在下、ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしに
は、別のオリゴヌクレオチドにライゲーションしないで
あろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されて
いないフラグメントにライゲーションするであろう。 【００８２】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１４
６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ラ
イゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量
の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガ
ーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し
遂げることができる。特にことわらない限り、形質転換
は、グラハム（Ｇraham,Ｆ.）およびファン・デル・エ
ブ（Ｖan der Ｅb,Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６−
４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして
行った。 【００８３】実施例１ ＳＣＧＦの細菌発現および精製 最初に、ＳＣＧＦをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ
を、プロセシングしたＳＣＧＦタンパク質（シグナルペ
プチド配列を含まない）配列の５'およびＳＣＧＦ遺伝
子のベクター配列３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを利用して増幅する。ＳＣＧＦに対
応する別のヌクレオチドをそれぞれ５'および３'配列に
加える。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：
5' CACTGCAAGCTTATTTAAAAATGATGCCACAGAA 3'（配列番
号：３）を有し、該配列はＨindIII制限酵素部位（５'
側の下線）を含み、続いて、プロセシングタンパク質コ
ドンの推定末端アミノ酸から開始するＳＣＧＦコーディ
ング配列の２１ヌクレオチドを含む（３'側の下線）。
３'オリゴヌクレオチドプライマー配列：5' CATGCCTCTA
GATATGGGAGTCTGAGTTCTAAC 3'（配列番号：４）は、Ｘba
Ｉ制限部位（５'側の下線）を含み、続いてカルボキシ
末端５アミノ酸および翻訳停止コドン（３'側の下線）
に対応するヌクレオチドの逆相補物を含む。その制限酵
素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−９（キアゲン、イ
ンク(Ｑiagen Ｉnc.）、チャッツワース（Ｃhatswort
h）、カリフォルニア)の制限酵素部位に一致する。pＱ
Ｅ−９は、抗生物質耐性(Ａmpr)、細菌の複製起点(or
i)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター
(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグ
および制限酵素部位をコードする。 【００８４】ついでpＱＥ−９およびＳＣＧＦＰＣＲ産
物をＨindIIIおよびＸbaＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼと一緒にライゲーションする。所望の組換え体はヒス
チジンタグおよびリボソーム結合部位からの下流に挿入
する。ついでそのライゲーション混合物を使用して、Ｍ
１５［ｐＲＥＰ５］（キアゲン、インク）である大腸菌
株をサンブルック（Ｓambrook，Ｊ.）ら、モレキュラー
・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コー
ルド・スプリング・ラボラトリー・プレス（Ｃold Ｓpr
ing Ｌaboratory Ｐress)、（１９８９）に記載された
方法によって形質転換した。Ｍ１５［ｐＲＥＰ５］はプ
ラスミドpＲＥＰ５の多重コピーを含み、これは、lacｉ
リプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋa
nr)も与える。トランスフォーマントを、それらが、Ｌ
Ｂプレートで増殖する能力により同定しついでアンピシ
リン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。 【００８５】プラスミドＤＮＡを制限分析により単離し
確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp（１０
０μg／ml）およびＫan（２５μg／ml）の両方を補っ
た、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／
Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に
１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、
０.４〜０.６の間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.600)まで増
殖させる。ついで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ
−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとな
るまで加えた。ＩＰＴＧは、lacｉリプレッサーを不活
性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加さ
せることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖
し、培養物は指数的に増殖する。ついで、細胞を遠心分
離により収集した。ＳＣＧＦ／６−ヒスチジン含有Ｍ１
５［ｐＲＥＰ４］細胞を６モルのグアニジンＨＣl、５
０mＭのＮａＰＯ4（ｐＨ８.０）中で溶解した。細胞溶
解物をニッケルキレートカラムにロードし、流して収集
した。そのカラムを６モルのグアニジンＨＣl、５０mＭ
のＮaＰＯ4（pＨ ８.０、６.０、５.０）で洗浄した。
ＳＣＧＦ融合タンパク質（＞９０％の純度）をｐＨ２.
０で溶出した。また再生の目的には、ｐＨ２.０の溶出
物を３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナト
リウム、１０ミリモルのグルタチオン（還元型）および
２ミリモルのグルタチオン（酸化型）に合わせた。この
溶液で１２時間インキュベートした後、該タンパク質を
１０ミリモルのリン酸ナトリウムで透析した。ゲルを流
すため、そのペレットをＳＤＳ／ＮaＯＨおよびＳＤＳ
−ＰＡＧＥローディングバッファー、熱変性させたもの
に再懸濁し、ついで１５％変性ポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動した。該タンパク質はクーマシー・ブリリ
アント・ブルーＲ−２５０（Ｃoomassie Ｂrilliant Ｂ
lue Ｒ−２５０）染色で可視化した。 【００８６】実施例２ バキュロウイルス発現システムを用いてのＳＣＧＦのク
ローニングおよび発現 ＳＣＧＦをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣを、ＳＣＧ
Ｆコーディング領域の５'および３'配列に対応するＰＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。
ＳＣＧＦに対応する別のヌクレオチドを各々、５'およ
び３'配列に加えた。５'オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列：5' CATTCGCGGATCCBCCATCATGCTTCCTCCTGCCATT
CAT 3'（配列番号：５）を有し、該配列はＢamＨＩ制限
酵素部位（５'側の下線）、続いて、プロセシングして
いないタンパク質の推定開始メチオニンから開始する２
１ヌクレオチドの、ＳＣＧＦコーディング配列（３'側
の下線）を含む。３'オリゴヌクレオチドプライマー：
5' CACTGCCTCTAGATATGGGAGTCTGAGTTCTAAC 3'（配列番
号：６）は、ＸbaＩ制限部位（５'側の下線）、続いて
翻訳停止コドン（３'側の下線）の隣にある１６の３'未
翻訳ヌクレオチドに対応するヌクレオチドの逆相補配列
を含む。該制限酵素部位は、バキュロウイルス発現ベク
ターｐＡ２（キアゲン、インク．、チャッツワース、カ
リフォルニア)上の制限酵素部位に対応する。ＳＣＧＦ
ＰＣＲ産物およびｐＡ２は、ついでＢamＨＩおよびＸba
Ｉで消化して一緒にＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーショ
ンした。 【００８７】クローニングされたフラグメントの配列
を、ＤＮＡシークエンシングにより確認する。リポフェ
クション法(フェロナー（Ｆeloner）ら、Ｐroc.Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９
８７）)を利用して、プラスミド pbacＳＣＧＦ ５μgを
市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧoldTM バキ
ュロウイルスＤＮＡ」、ファーミンゲン（Ｐharminge
n）、サン・ディエゴ（Ｓan Ｄiego）、カリフォルニ
ア)１.０μgと共に同時トランスフェクションする。Ｂa
culoＧoldTM ウイルスＤＮＡ １μgおよびプラスミド p
ＢacＳＣＧＦ ５μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)培地
(ライフ・テクノロジーズ・インク（ＬifeＴechnologie
s Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithersburg）、メリ
ーランド)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無
菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン(Ｌipo
fectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合し
て、室温で１５分間インキュベートする。ついで、トラ
ンスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを
含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫
細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加する。そのプレ
ートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合す
る。ついで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベ
ートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液を
プレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグ
レイス昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュ
ベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。 【００８８】４日後、上清を集めて、サマーズおよびス
ミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テ
クオロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガ
ロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色
されたプラークを容易に単離することが可能となる。
(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞
培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロ
ジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバ
キュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができ
る)。４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加えて、青
色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先
端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒天を、
グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチューブ
内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により
除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５
mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用す
る。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃
で保存する。 【００８９】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−ＳＣＧ
Ｆを感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチ
オニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II 培地
(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)
に替える。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチオニンお
よび５μＣiの35Ｓ システイン５μＣi(アマシャム（Ａ
mersham)）を加える。その細胞をさらに１６時間インキ
ュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標
識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジ
オグラフィーにより可視化する。 【００９０】実施例３ ＣＨＯ細胞における組換えＳＣＧＦの発現 ベクターｐＮ３４６をＳＣＧＦタンパク質の発現に使用
する。プラスミドｐＮ３４６はプラスミドのｐＳＶ２−
dhfrが［ＡＴＣＣ受託番号第３７１４６号］の誘導体で
ある。両方のプラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの
制御下でマウスdhfr遺伝子を含む。これらのプラスミド
でトランスフェクションされるチャイニーズハムスター
の卵巣またはジヒドロ葉酸活性を欠如している他の細胞
を、化学療法剤メトトレキセート（methotrexate）を補
った選択培地（αマイナスＭＥＭ、リフト・テクノロジ
ーズ（Ｌift Ｔechnologies）中で細胞を増殖させるこ
とによって選択することができる。メトトレキセート
（ＭＴＸ）に耐性のある細胞中のＤＨＦＲ遺伝子の増幅
はよく証明されている（例えばアルト（Ａlt，Ｆ.
Ｗ.）、ケルムス（Ｋellems，Ｒ.Ｍ.）、ベルチノ（Ｂe
rtino，Ｊ.Ｒ.）およびシムケ（Ｓchimke，Ｒ.Ｔ.）、
１９７８、Ｊ．Ｂiol，Ｃhem．２５３：１３５７−１３
７０、ハムリン（Ｈamlin，Ｊ．Ｌ.）およびマ（Ｍa，
Ｃ.）、１９９０、Ｂiochem．et Ｂiophys．Ａcta、１
０９７：１０７−１４３、ページ（Ｐage，Ｍ．i.）お
よびシデンハム（Ｓydenham，Ｍ．Ａ.）、１９９１、Ｂ
iotechnologyＶol．９：６４−６８参照）。ＭＴＸの増
大する濃度中で増殖させた細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増
幅の結果、標的酵素、ＤＨＦＲの過剰産生による該薬剤
への耐性を高める。第２の遺伝子がdhfr遺伝子に結合す
るならば、通常は同時増幅（co-amplified）され、過剰
発現する。続いて、メトトレキセートを除去する場合、
細胞株は染色体に取り込まれた増幅された遺伝子を含
む。 【００９１】プラスミドｐＮ３４６は興味深い遺伝子の
発現のため、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列
（ＬＴＲ）（カレン（Ｃullen）ら、Ｍolecular and Ｃ
ellular Ｂiology、１９８５年３月、４３８−４４７）
プラスヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺
伝子のエンハンサー（ボスハルト（Ｂoshart）ら、Ｃel
l ４１：５２１−５３０、１９８５）から単離されたフ
ラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の取
り込みを可能にする単独の制限酵素開裂部位である：Ｂ
am ＨＩ、Ｐvul１およびＮru１である。これらのクロー
ニング部位を残して該プラスミドは、３'イントロンお
よびラットプレプロインシュリン遺伝子のポリアデニレ
ーション部位が続く全部で３つのリーディングフレーム
中の翻訳停止コドンを含む。他の高効率なプロモーター
をまた、発現のため、例えばヒトβ−アクチンプロモー
ター、ＳＶ４０初期または後期プロモーターまたは例え
ばＨＩＶまたはＨＴＬＶなどの他のレトロウイルスから
の長い末端反復配列などを使用することができる。mＲ
ＮＡのポリアデニレーションのため、他のシグナル、例
えば、ヒト成長ホルモンまたはグロブリン遺伝子などか
らのシグナルを同様に使用することができる。 【００９２】染色体に取り込まれる関心のある遺伝子を
運搬する安定な細胞株はまた、gpt、Ｇ４１８またはヒ
グロマイシン（Ｈygromycin）などの選択可能なマーカ
ーと同時トランスフェクションに関して選択することが
できる。最初に例えばＧ４１８とメトトレキセートな
ど、１より多い選択可能なマーカーを使用することには
利点がある。プラスミドｐＮ３４６は制限酵素ＢamＨＩ
で消化され、ついで当該技術分野において公知の方法に
よってウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化され
る。ついでそのベクターは１％アガロースゲルから単離
される。完全長のＳＣＦＧタンパク質、ＡＴＣＣ受託番
号第９７１７３号をコードするＤＮＡ配列は該遺伝子の
５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて増幅する： 【００９３】５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列：5' CATCGCGGATCCGCCATCATGCTTCCTCCTGCCATTCAT 3'
（配列番号：７）を有し、該配列はＢamＨＩ制限酵素部
位（５'側の下線）、続いて、真核生物細胞中の翻訳開
始有効シグナルに類似した２１ヌクレオチドを有する
（コザック（Ｋozak，Ｍ.）、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１９
６：９４７−９５０（１９８７））。残りのヌクレオチ
ドは翻訳開始コドン（３'側の下線）を含むアミノ末端
の７アミノ酸に対応する。３'プライマー：5' CACTGCGG
ATCCTATGGGAGTCTGAGTTCTAAC 3'（配列番号：８）は、Ｂ
amＨＩ制限部位（下線）、および続いて翻訳停止コドン
から下流にある１６ヌクレオチドから開始する３'未翻
訳ＤＮＡの逆相補性である。ＰＣＲ産物をＢamＨＩで消
化し、ついで市販の利用可能なキット（「ジーン・クリ
ーン（Ｇeneclean）」、バイオ１０１・インク（ＢＩＯ
１０１ Ｉnc.）、ラ・ホラ、カリフォルニア）を用い
て１％のアガロースゲル上で精製する。ついで、このフ
ラグメントをＢam ＨＩ消化したリン酸化したｐＮ３４
６プラスミドもＴ４ＤＮＡリガーゼとともにライゲーシ
ョンする。Ｘl１Ｂlue（ストラタジーン）大腸菌を形質
転換し、ＬＢ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上
にプレーティングする。適切な方向の所望の組換え体を
産生するコロニーをラウス肉腫ウイルスプロモーターに
対応する５'プライマーおよびＳＣＧＦコドン７３−７
９の逆の相補配列に対応する３'プライマーによりスク
リーニングする。クローニングされたフラグメントの配
列はＤＮＡシークエンシングにより確認される。 【００９４】ＣＨＯ−dhfr−細胞のトランスフェクショ
ン 活性ＤＨＦＲ酵素を欠如しているチャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞をトランスフェクションに使用する。発現
プラスミドpＮ３４６ＳＣＧＦ５μｇをリポフェクチン
法を用いて０.５μｇのプラスミドpＳＶneoとトランス
フェクションする（フェロナー（Ｆeloner）ら、上
記）。プラスミドpＳＶ２−neoは優力な選択可能なマー
カーを含み、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に耐性を与え
る酵素をコードするＴn５からの遺伝子neoを含む。細胞
を１g／mlＧ４１８を補ったαマイナスＭＥＭに播種す
る。２日後、該細胞をトリプシン化し、ついでハイブリ
ドーマクローニングプレート（グライナー（Ｇreine
r）、ドイツ）に播種し、ついで１０−１４日間培養す
る。この時期の後、単一のクローンをトリプシン化し、
ついで多様な濃度のメトトレキセート（２５、５０nm、
１００nm、２００nm、４００nm）を用いて６ウェルのペ
トリ皿に播種する。最も高濃度のメトトレキセートで増
殖しているクローンをついでさらに高濃度のメトトレキ
セートを含む（５００nＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）
新しい６ウェルプレートに移す。同じ手法をクローンの
濃度が１００μＭに増殖するまで繰り返す。所望の遺伝
子産物の発現をウエスタン・ブロット分析およびＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって分析する。 【００９５】実施例４ ノザン・ブロット分析によるＳＣＧＦ遺伝子発現の組織
局在化 ヒト成人脳、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓およ
び膵臓ポリＡ+ｍＲＮＡを各１レーンに含む複数組織の
ノザン・ブロット（クローンテク・ラボラトリーズ・イ
ンク（Ｃlonetech Ｌaboratories，Ｉnc.）、４０３０
ファビアン・ウェイ（Ｆabian Ｗay）；パロ・アルト
（Ｐalo Ａlto）、カリフォルニア９４３０３）をチャ
ーチ・バッファー（Ｃhurch buffer）（チャーチ（Ｃhu
rch，Ｇ．Ｍ.）ギルバート（Ｇilbert，Ｗ.）Ｐroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ８１、１９９１−１９９５
（１９８４））中で６０℃で１時間プレハイブリダイゼ
ーションした。ＳＣＧＦをコードするそのＤＮＡ、ＡＴ
ＣＣ受託番号第９７１７３号をＭ１３フォワードプライ
マー：5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'（配列番号：９）およ
び、リバースプライマー：5' GGAAACAGCTATGACCATG 3'
（配列番号：１０）を用いたｐＢluescript ＳＫ（−）
中にクローニングした全長ｃＤＮＡから増幅した。２５
ナノグラムのＰＣＲ産物を32Ｐ−ｄＣＴＰでランダム・
プライマー標識（プライム−イットII（Ｐrime-Ｉt I
I)、ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓtr
atagene Ｃloning Ｓystems）、１１０１１ノース・ト
ーレイ・パインズ・ロード（Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒ
d.）；ラ・ホラ、カリフォルニア９２０３７）する。熱
変性したＳＣＧＦプローブを直接プレハイブリダイゼー
ションバッファー中に加えて６０℃で１６時間インキュ
ベートする。６０℃の０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中
で２回１０分間の洗浄を行う。オートラジオグラフィー
は−８０℃で行う。 【００９６】実施例５ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。そ
の組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコ
を上下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置す
る。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで
組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含む新しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ
１２ media））を添加する。ついでこれを３７℃で約１
週間インキュベートする。このとき、新しい培地を添加
し引き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液
中に線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン
処理しついでさらに大きなフラスコに合わせて調整す
る。 【００９７】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復配列によりフランキングされたｐＫＶ−７（キルシュ
メイエル（Ｋirschmeier，Ｐ．Ｔ.）ら、ＤＮＡ、７：
２１９−２５（１９８８））をＥco ＲＩおよびＨind I
IIで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理す
る。線形ベクターをアガロースゲル上で分画化し、ガラ
スビーズを使用して精製する。本発明のポリペプチドを
コードするｃＤＮＡをそれぞれ５'端および３'端配列に
対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅する。５'プ
ライマーはＥco ＲＩ部位を含み３'プライマーはＨindI
II部位を含む。モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格
およびＥcoＲＩおよびＨindIIIフラグメントの等量をＴ
４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加する。得られ
た混合物を２つのフラグメントのライゲーションに適し
た条件下で維持する。ライゲーション混合物を細菌ＨＥ
１０１を形質転換するのに使用し、ついで該菌をベクタ
ーが所望の適切に挿入された遺伝子を有することを確認
するためカナマイシン含有寒天上に播種する。 【００９８】両栄養性のｐＡ３１７またはＧp+am１２パ
ッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血清（ＣＳ）、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ
改変イーグル培地（Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagles Ｍ
edium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるまで組織培養
にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶベクターをつ
いで培地に添加し、パッケージング細胞を該ベクターで
トランスデュースする。今度はパッケージング細胞は、
該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケ
ージング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。 【００９９】新しい培地をトランスデュースしたプロデ
ューサー細胞に添加し、引き続き培地を１０ｃｍプレー
ト全面のプロデューサー細胞から回収する。感染性ウイ
ルス粒子を含む使用し尽くした培地をミリポアフィルタ
ーで濾過して分離したプロデューサー細胞を除去し、つ
いでこの培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。
培地を線維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロ
デューサー細胞からの培地とすばやく取り替える。この
培地を除去し、新しい培地で置き換える。ウイルス力価
が高い場合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選
択は一切必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、
neoまたはhisなどの選択可能なマーカーを有するレトロ
ウイルスベクターを使用する必要がある。操作された線
維芽細胞を、単独またはサイトデックス・３・ミクロキ
ャリア・ビーズ（cytodex 3 microcarrier beads）上全
面に増殖した後に、宿主に注入する。該線維芽細胞はタ
ンパク質産物を産生する。先の教示から見て、本発明の
多数の変更および変化が可能であることから、追記する
請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行う
ことができる。 【０１００】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Human CNN-like Growth Factor <130> 183772 <160> 8 <210> 1 <211> 900 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cgccaaacct ctatggatat ataaagggaa gcttgaggag gaatttcaca gttacagtgc 60 agaagcagag gcaaaagaat taaccagctc ttcagtcaag caaatcctct actcaccatg 120 cttcctcctg ccattcattt ctatctcctt ccccttgcat gcatcctaat gaaaagctgt 180 ttggctttta aaaatgatgc cacagaaatc ctttattcac atgtggttaa acctgttcca 240 gcacacccca gcagcaacag cacgttgaat caagccagaa atggaggcag gcatttcagt 300 aacactggac tggatcggaa cactcgggtt caagtgggtt gccgggaact gcgttccacc 360 aaatacatct ctgatggcca gtgcaccagc atcagccctc tgaaggagct ggtgtgtgct 420 ggcgagtgct tgcccctgcc agtgctccct aactggattg gaggaggcta tggaacaaag 480 tactggagca ggaggagctc ccaggagtgg cggtgtgtca atgacaaaac ccgtacccag 540 agaatccagc tgcagtgcca agatggcagc acacgcacct acaaaatcac agtagtcact 600 gcctgcaagt gcaagaggta cacccggcag cacaacgagt ccagtcacaa ctttgagagc 660 atgtcacctg ccaagccagt ccagcatcac agagagcgga aaagagccag caaatccagc 720 aagcacagca tgagttagaa ctcagactcc cataactaga cttactagta accatctgct 780 ttacagattt gattgcttgg aagactcaag cctgccactg ctgttttctc acttgaaagt 840 atatgctttc tgctttgatc aaacccagca agctgtctta agtatcagga ccttctttgg 900 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Lys Pro Pro Ala Ile His Phe Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Cys Ile 1 5 10 15 Leu Met Lys Ser Cys Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Leu 20 25 30 Tyr Ser His Val Val Lys Pro Val Pro Ala His Pro Ser Ser Asn Ser 35 40 45 Thr Leu Asn Gln Ala Arg Asn Gly Gly Arg His Phe Ser Asn Thr Gly 50 55 60 Leu Asp Arg Asn Thr Arg Val Gln Val Gly Cys Arg Glu Leu Arg Ser 65 70 75 80 Thr Lys Tyr Ile Ser Asp Gly Gln Cys Thr Ser Ile Ser Pro Leu Lys 85 90 95 Glu Leu Val Cys Ala Gly Glu Cys Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn 100 105 110 Trp Ile Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser 115 120 125 Gln Glu Trp Arg Cys Val Asn Asp Lys Thr Arg Thr Gln Arg Ile Gln 130 135 140 Leu Gln Cys Gln Asp Gly Ser Thr Arg Thr Tyr Lys Ile Thr Val Val 145 150 155 160 Thr Ala Cys Lys Cys Lys Arg Tyr Thr Arg Gln His Asn Glu Ser Ser 165 170 175 His Asn Phe Glu Ser Met Ser Pro Ala Lys Pro Val Gln His His Arg 180 185 190 Glu Arg Lys Arg Ala Ser Lys Ser Ser Lys His Ser Met Ser 195 200 205 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a Hind III restriction enzyme site followed by n ucleotides of SCGF coding sequence <400> 3 cactgcaagc ttatttaaaa atgatgccac agaa 34 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a Xba I restriction site followed by the reverse complement of nucleotides corresponding to SCGF coding sequence <400> 4 catgcctcta gatatgggag tctgagttct aac 33 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a BamHI restriction enzyme site followed by nucl eotides of SCGF coding sequence <400> 5 cattcgcgga tccbccatca tgcttcctcc tgccattcat 40 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a Xba I restriction site followed by the reverse complement of nucleotides corresponding to SCGF untranslated nucleotide s <400> 6 cactgcctct agatatggga gtctgagttc taac 34 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a BamHI restriction enzyme site followed by nucl eotides resembling an efficient signal for the initiation of translation <400> 7 catcgcggat ccgccatcat gcttcctcct gccattcat 39 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a BamHI restriction site followed by the reverse complement of nucleotides corresponding to SCGF untranslated nucleotide s <400> 8 cactgcggat cctatgggag tctgagttct aac 33 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 forward primer <400> 9 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 reverse primer <400> 10 ggaaacagct atgaccatg 19
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのよう
なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関す
る。とりわけ、本発明のポリペプチドは、ときとして以
下で「ＳＣＧＦ」と呼ぶ、ヒト小ＣＣＮ様増殖因子とし
て推定的に同定されている。本発明はまた、そのような
ポリペプチドの作用を阻害することにも関する。本発明
のポリペプチドは、cef １０／cry ６１、結合組織増殖
因子（ＣＴＧＦ）およびnovを含む増殖レギュレーター
のファミリーに関する。本発明のポリペプチドに対応す
るｍＲＮＡは腎臓、肺、心臓および脳の順に多く発現す
る。 【０００２】 【従来の技術】増殖因子および形質転換している癌遺伝
子を含む他のマイトジェンはある種の細胞によって発現
される複雑な遺伝子のセットを迅速に含むことができる
（ラウ（Ｌau，Ｌ.Ｆ.）およびナタンズ（Nathans，
Ｄ.）、Ｍolecular Ａspects ofＣellular Ｒegulatio
n、６：１６５−２０２（１９９１））。これらの遺伝
子は前初期（immediate early）または初期応答遺伝子
と命名されているが、新規のタンパク質合成とは独立し
て増殖因子またはマイトジェンに接触後数分のうちに転
写上活性化される。これらの前初期遺伝子の群は、増殖
および分化、再生および傷の治癒などの複雑な生物学的
なプロセスの調節に必要である細胞外分泌タンパク質を
コードする（ライセック（Ryseck，Ｒ.Ｐ.）ら、Ｃell
ＧrowthＤiffer.、２：２３５−２３３（１９９
１））。 【０００３】この群に属するよく関連したタンパク質は
ニワトリからのcef１０を含み、ウイルス性の癌遺伝子p
p６０v-arcによる誘導の後検出される（シモンズ（Ｓim
ons，Ｄ.Ｌ.）ら、ＰＮＡＳ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１
１７８−１１８２（１９８９））。密に関連したタンパ
ク質cry ６１は血清または血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）によって迅速に活性化される（オブライエン（Ｏ'
Ｂrien，Ｔ.Ｐ.）ら、Ｍol．Ｃell Ｂiol.、１０：３５
６９−３５７７（１９９０））。cef １０およびcyr６
１の間の全体のアミノ酸の同一性はせいぜい８３％であ
る。第３のメンバーはヒト結合組織増殖因子（ＣＴＧ
Ｆ）（ブラドハム（Ｂradham．Ｄ．Ｍ.）ら，Ｊ．Ｃel
l．Ｂiol.、１１４：１２８５−１２９４（１９９１）
である。ＣＴＧＦは、増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を形
質転換することによる活性化後の高いレベルにおけるヒ
ト血管内皮細胞により分泌される。システインリッチペ
プチドであるＣＴＧＦはＰＤＧＦ様の生物学的および免
疫学的活性を示し、ついで細胞表面の受容体の特定のも
のであるとしている。 【０００４】前初期タンパク質の第４のメンバーはfisp
-12であり、血清により誘発されると示されており、レ
ウリン（reurine）ゲノムの領域にマッピングされる
（ライセックら、Ｃell Ｇrowth Ｄiffer. ２：２３５
−２３３（１９９１）。本ファミリーのさらに別のメン
バーはニワトリの遺伝子であり、通常は成人の腎臓細胞
にて得られるnovであり、腎芽細胞腫を誘発した骨髄芽
球症関連ウイルスタイプに過剰発現すると見出されてい
る。さらにニワトリの胎児線維芽細胞におけるアミノ末
端平滑化したnov産物の発現は形質転換に十分であった
（ジョリオットＪoliot，Ｖ．）ら、Ｍol．Ｃell．Ｂio
l.、１２：１０−２１（１９９２））。これらの前初期
遺伝子の発現は増殖因子によって集められる事象のカス
ケードの中で「第三メッセンジャー」として機能する。ま
た、細胞増殖が一般的であるそれらの分化および傷の治
癒などの複雑な生物学的プロセスを統合するのに必要で
あると考えられている。増殖レギュレーターの台頭しつ
つあるファミリーはＣＴＧＦのＣＣＮファミリーと呼ば
れる；cef １０／cyr ６１；およびnovである。本発明
のポリペプチドは増殖レギュレーターのこのファミリー
のメンバーであると考えられている。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明の１つの態様によ
り、新規な成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性で
あり、診断上または治療上有用なそのフラグメント、ア
ナログおよび誘導体を提供する。本発明の１つの態様に
より、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含
め、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸
分子、さらにはまた、そのアナログ、ならびに生物学的
に活性であって、診断上または治療上有用なそのフラグ
メントを提供する。 【０００６】本発明のさらに別の他の態様により、該タ
ンパク質の発現を容易にし、連続発見を促進するような
条件の下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列を含む組換え原核生物および／または真核生物宿主細
胞を培養することを含む組換え技術によるそのようなポ
リペプチドの製造方法を提供する。本発明のさらに別の
態様により、例えば筋肉消耗症、骨粗鬆症を処置するこ
と、移植片の定着を補助する、傷害の治癒および組織再
生を刺激すること、血管形成を促進させ、血管平滑筋お
よび内皮細胞産生を刺激する。本発明のさらに別の態様
により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供す
る。 【０００７】本発明のさらに別の態様により、そのよう
なポリペプチドに対するアンタゴニストを提供する。該
アンタゴニストは、そのようなポリペプチドの作用を阻
害するために使用してよく、例えば、傷の治癒または肺
線維症の間の過剰な結合組織の産生を制限する。本発明
のさらに別の態様により、本発明のポリヌクレオチドの
配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核
酸分子を含む核酸プローブを提供する。 【０００８】本発明のさらに別の態様により、本発明の
ポリペプチドの過少および過剰発現に関する疾患および
そのようなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異
を検出するための診断アッセイを提供する。本発明のさ
らに別の態様により、科学的研究、ＤＮＡの合成および
ＤＮＡベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的
のためにそのようなポリペプチドまたはそのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法
を提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。 【０００９】 【発明の実施の形態】本発明の一つの態様により、図１
〜図２（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する成
熟ポリペプチド、または１９９５年６月２日にＡＴＣＣ
受託番号第９７１７３号として寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
る、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本
発明のポリペプチドをコードするポリネクレオチドはヒ
ト９週齢胎児からのｃＤＮＡライブラリー中で発見され
た。該ポリペプチドはＣＣＮファミリーに構造上関連す
るその成熟タンパク質は１８３アミノ酸を含む最初の２
３アミノ酸残基が推定リーダー配列である２０６のアミ
ノ酸のタンパク質をコードするオープン・リーディング
・フレームを含む。 【００１０】ＣＣＮ増殖因子ファミリーのメンバーとし
てのＳＣＧＦの認定は主としてアミノ酸配列の保存に基
づく。ＣＣＮファミリーに対するホモロジーはすべての
メンバーで約２７％である。ＣＣＮメンバーに対する最
も高いホモロジーはＳＣＧＦの２９を越える長さのアミ
ノ酸で６２％である。本発明のポリペプチドは１０シス
テインを含むシステインリッチである。該ポリペプチド
はＣＴＧＦ、cyr ６１およびnovの約５０％の大きさで
ある。 【００１１】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コーディング鎖または非コーディング(アン
チ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコード
するコーディング配列は、図１〜図２（配列番号：１）
に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコ
ーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コー
ドの重複または縮重の結果として、図１〜図２（配列番
号：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟
ポリペプチドをコードする異なったコード配列であって
もよい。 【００１２】図１〜図２（配列番号：２）の成熟ポリペ
プチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以
下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列、お
よびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配
列といったような付加的コーディング配列；成熟ポリペ
プチドのコーディング配列(また場合により、付加的コ
ーディング配列)、および成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列のイントロンまたは非コーディング配列５'お
よび／または３'といったような非コーディング配列。 【００１３】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディ
ング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはま
た、付加的コーディングおよび／または非コーディング
配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明は
さらに、図１〜図２（配列番号：２）の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌ
クレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異
体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体
またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体で
あり得る。 【００１４】従って、本発明には、図１〜図２（配列番
号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託さ
れたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはま
た、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、こ
れらの変異体は、図１〜図２（配列番号：２）のポリペ
プチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはア
ナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体に
は、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異
体が含まれる。 【００１５】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、図１〜図２（配列番号：１）に示すコーディング配
列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクロ
ーンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体
であるコーディング配列を有し得る。当該技術分野で知
られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以
上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別
の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードさ
れるポリペプチドの機能を実質的には変えない。 【００１６】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現お
よび分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞
からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列と
して機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得
るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有する
ポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞に
より開裂されて、成熟型のポリペプチドを形成したリー
ダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはま
た、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質で
あるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する
成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型
のタンパク質である。プロ配列が一度開裂されると、活
性成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポ
リヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を
有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リ
ーダー配列)の両方を有するタンパク質をコードし得
る。 【００１７】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコーディング配列も有し得る。細菌宿主の場
合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟
ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベク
ターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)で
あってよく、または、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−
７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血
球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフ
ルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトー
プに対応する(ウイルソン（Ｗilson,Ｉ.）ら、Ｃell、
３７：７６７（１９８４）)。 【００１８】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、また好ましくは少なくとも９０％およびより好まし
くは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌク
レオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条
件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好
ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、
ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味す
る。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜図２（配列
番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡにより
コードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的
機能もしくは活性を保持するポリペプチド、すなわちＳ
ＣＧＦポリペプチドとして機能するものをコードする。 【００１９】かわりに、該ポリペプチドは本発明のポリ
ヌクレオチドにハイブリダイズし、および該ポリヌクレ
オチドに上記に示すように同一性を有し、活性は保有し
ていない少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基およ
びより好ましくは少なくとも５０塩基を有する。そのよ
うなポリペプチドは配列番号：１のポリヌクレオチドま
たはその変異体のポリヌクレオチドの、例えば該ポリヌ
クレオチドの回収のためのプローブとして、または診断
プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用してよい。 【００２０】本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際に
は該寄託された物質中の配列が優先する。寄託された物
質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が
要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与
されない。 【００２１】本発明はさらに、図１〜図２（配列番号：
２）の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたc
ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体に関する。図１〜図２
（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤ
ＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用
語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的
機能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。
従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断する
ことにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造
することができるプロプロテインが含まれる。 【００２２】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。図１〜図２（配
列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログは、（i）１つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましく
は、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのよ
うな置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされる
ものであってもよく、またはコードされたものでなくて
もよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基
に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプ
チドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物
(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合
物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは
分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される
配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加
的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものまた
は（v）あるアミノ酸残基を欠如しているが、しかしな
お生物学的活性は保有している成熟ポリペプチドのスプ
ライシング変異体であり得る。そのようなフラグメン
ト、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると思われる。 【００２３】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」と
いう用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然
に存在するなら、天然の環境)から除去されていること
を意味する。例えば、生存動物中にある天然に存在する
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていな
いが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全て
から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベ
クターの一部となり得、および／またはそのようなポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり
得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の
環境の一部ではないという点で、なお単離されている。 【００２４】本発明のポリペプチドは配列番号：２（特
に成熟ポリペプチド）のポリペプチドならびに配列番
号：２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好
ましくは少なくとも７０％の同一性）およびより好まし
くは少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なく
とも９０％の同一性）およびさらになおより一層好まし
くは９５％の類似性（さらになお好ましくは、少なくと
も９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、ま
た、そのようなポリペプチドの部分をも含み、そのよう
なポリペプチドの部分は一般的には少なくとも３０アミ
ノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含
む。 【００２５】当該技術分野において知られているよう
に、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ
酸置換基を第２のポリペプチドの配列に対して比較する
ことにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグ
メントまたは一部はペプチド合成による対応する完全長
のポリペプチドを調製するのに使用されてよい；それゆ
え、該フラグメントは完全長ポリペプチドを産生するた
めの中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレ
オチドのフラグメントまたは一部は本発明の完全長ポリ
ヌクレオチドを合成するために使用してよい。 【００２６】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クロ
ーニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明
のベクターで遺伝的に操作される（トランスデュースさ
れ、または形質転換され、またはトランスフェクトされ
る）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒
子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞
は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを
選択し、またはＳＣＧＦ遺伝子を増幅するのに適するよ
う修飾された従来の栄養培地で培養することができる。
温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択
された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業
者に明らかであろう。 【００２７】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロ
ウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったような
ウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベク
ターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能で
ある限り、使用することができる。 【００２８】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮ
Ａ配列を、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動
可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプ
ロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：
ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌(Ｅ．col
i)、lacまたはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、
および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスで
の遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロ
モーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボ
ソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターは
また、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 【００２９】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったような、または大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるため
に、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を
含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さ
らにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含む
ベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。 【００３０】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyc
es）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typ
himurium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；Drosophila Ｓ２およびＳｆ９といったような昆
虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowesメラノーマといっ
たような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当
な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内
であると思われる。 【００３１】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含む組換え構築物も含ま
れる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で
挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターと
いったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい
態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可
能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含む。適
当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知ら
れており、市販されている。以下のベクターを例として
挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９
（キアゲン（Qiagen））、pＢＳ、pＤ１０、ファージス
クリプト（phagescript）、psiＸ１７４、pbluescript
ＳＫ、pＢＳＫＳ、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８
Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Stratagene））；p
ＴＲＣ９９a、pＫＫ２２３３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ
５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア（Pharmacia））。真
核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、p
ＸＴ１、pＳＧ（ストラタジーン）、pＳＶＫ３、pＢＰ
Ｖ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア）。しかし、他の
いずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中
で複製可能であって、生存可能である限り、使用するこ
とができる。 【００３２】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可
能なマーカーを有する他のベクターを用いて、いずれか
の所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当
なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７であ
る。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lac
Ｉ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲＩ、ＰＬおよ
びtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ前初
期（immediate early）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初
期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、
およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当
なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者
のレベルの範囲内である。 【００３３】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核
細胞であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のよう
な原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。（デイビス（Ｄav
is，Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner，Ｍ.）、バッティー
（Ｂattey，Ｉ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecu
lar Ｂiology）（１９８６））。 【００３４】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambroo
k）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlo
ning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory
Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー
（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、（１９８９）
により記載されており、この開示は、本明細書の一部を
構成する。 【００３５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製起点の後期側にあ
るＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリ
オーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ
ーが含まれる。 【００３６】通例、組換え発現ベクターには、複製起
点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能な
マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子お
よびサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae） Ｔ
ＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせる
ために高度に発現される遺伝子から得られるプロモータ
ーが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、と
りわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）の
ような解糖系酵素、α−因子、酸性ホスファターゼ、ま
たは熱ショックタンパク質などをコードするオペロンか
ら得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開
始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパ
ク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせる
ことができるリーダー配列と共に、適当な相（phase）
で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、
所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化
または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含
まれる融合タンパク質をコードすることができる。 【００３７】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製起点を含むであろ
う。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティ
フィムリウム、ならびにシュードモナス（Pseudomona
s）属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。 【００３８】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、選択可能
なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。そのよう
な市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine
Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデ
ン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐromega
Ｂiotec）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含
まれる。これらのpＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプ
ロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせ
る。 【００３９】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモ
ーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘
導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細
胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的また
は化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の
抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発
現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのよう
な方法は、当業者に周知である。 【００４０】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨ
Ｋ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起
点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいず
れかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終
結配列、および５’に隣接する非転写配列もまた含むで
あろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ
配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とさ
れる非転写遺伝要素を与えることができる。 【００４１】本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラ
フィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回
収して、精製することができる。必要に応じて、タンパ
ク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成す
るのに使用することができる。最後に、高性能液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用する
ことができる。 【００４２】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。 【００４３】本発明のポリペプチドは、傷の治癒およ
び、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺または
腎臓などの組織の再増殖に関する治療に使用してよい。
本発明のポリペプチドは再狭窄、心臓拡張／肥厚（鬱血
性心不全）およびアテローム硬化症などの組織改作（re
modeling）に使用してよい。本発明のポリペプチドは血
管形成を刺激するためおよび、例えば、血管平滑筋およ
び内皮細胞の増殖を増強するために使用してもよい。血
管形成の増加は、虚血組織に対しておよび冠状血管の狭
窄に対する心臓中での側枝（collateral）冠状動脈の成
長に利益がある。 【００４４】本発明のポリペプチドはまた、移植した周
囲の細胞の増殖を刺激するための移植組織定着時に使用
してよく、強化部位に接着しやすくする。本発明のポリ
ペプチドはまた、ＳＣＧＦポリペプチドの発現パターン
が胎児ライブラリーに豊富であるので、胎児の初期の成
長を刺激するために使用してよい。本発明のさらに別の
態様により、そのようなポリペプチドまたはそのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連し
たイン・ビトロでの目的のためおよびヒトの疾患の診断
薬および治療薬を提供する目的のために利用する方法を
提供する。 【００４５】本発明は本発明のポリペプチドの受容体の
同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は当
業者に公知の多数の方法、例えば、リガンドパンニング
およびＦＡＣＳソーティング（コリガン（Ｃoligan）
ら、カレント・プロトコールズ・イン・イムン（Ｃurre
nt Ｐrotocols in Ｉmmun．）、１（２）、第５章、
（１９９１））などにより同定することができる。好ま
しくは、発現クローニングを用い、その際、ポリアデニ
ル化したＲＮＡを該ポリペプチドに応答性の細胞から調
製し、ついでこのＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブ
ラリーをプールに分け、ＣＯＳ細胞またはＳＣＧＦに応
答性でない他の細胞にトランスフェクションするために
使用する。ガラススライド上で増殖させたトランスフェ
クションした細胞を標識したＳＣＧＦにさらす。ＳＣＧ
Ｆはヨウ素化または部位特異的なプロテインキナーゼの
認識部位を含めることを含む多様な手段によって標識す
ることができる。固定およびインキュベーションの後で
スライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正の
プールを同定し、ついでサブプールを調製し、ついで相
互作用性のサブ−プールおよび再スクリーニング方法を
用いて再度トランスフェクションし、最終的に推定受容
体をコードする単一クローンを産生する。 【００４６】受容体の同定のための別法として、標識し
たＳＣＧＦを細胞膜または受容体分子を発現する抽出調
製物と光親和性結合させることができる。架橋した物質
をＰＡＧＥ分析によって分離し、ついでＸ−線フィルム
にさらす。ＳＣＧＦの受容体を含む標識した複合体を切
り出して、ペプチドフラグメントに分離し、タンパク質
マイクロシークエンシングにかける。マイクロシークエ
ンシングから得たアミノ酸配列を推定受容体をコードす
る遺伝子を同定するためｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするための縮重したオリゴヌクレオチドプロー
ブのセットを設計するのに使用する。 【００４７】本発明はまた、ＳＣＧＦ受容体に結合し、
該受容体を活性化させるものを同定するための化合物を
スクリーニングするための方法にも関する。そのような
方法の例はコマイトジェン（comitogen）Ｃon Ａの存在
下、内皮細胞の増殖を刺激するＳＣＧＦの能力を利用す
る。ヒト臍静脈血管内皮細胞を得て、９６ウェルの平ら
な底の培養皿にて培養し（コスター（Ｃostar）、ケン
ブリッジ（Ｃambridge）、マサチューセッツ）、Ｃon-
Ａ（カルビオケム（Ｃalbiochem）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊo
lla）、カリフォルニア）を含む混合物をおいておく。
Ｃon-Ａおよびスクリーニングすべき化合物を加え、３
７℃でインキュベーションした後、培養物を3[Ｈ]チミ
ジンで脈打たせ、ガラスファイバーフィルター（Ｐh
Ｄ；ケンブリッジ・テクノロジー（Ｃambridge Ｔechno
logy）、ウォータータウン（Ｗatertown）、マサチュー
セッツ）上に回収する。３つの培養物の平均の3[Ｈ]チ
ミジン取り込み（ｃｐｍ)を液体シンチレーションカウ
ンター(ベックマン・インストルメンツ（Ｂeckman Ｉns
truments)、アルバイン（Ｉrvine）、カリフォルニア）
を用いて決定する。有意な3[Ｈ]チミジン取り込みは内
皮細胞増殖の刺激を示唆している。 【００４８】アンタゴニストをアッセイするため、上記
のアッセイを行うが、このアッセイにおいてＳＣＧＦは
スクリーニングすべき化合物と一緒に加え、ＳＣＧＦの
存在下での3[Ｈ]チミジン取り込みを抑制する該化合物
の能力は、該化合物がＳＣＧＦのアンタゴニストである
ことを示している。代わりに、ＳＣＧＦアンタゴニスト
は、競合抑制アッセイのための適切な条件下でＳＣＧＦ
および潜在的なアンタゴニストと膜結合性ＳＣＧＦ受容
体または組換え受容体とを合わせることによって検出さ
れてよい。ＳＣＧＦは放射能などで標識化し、それによ
って該受容体結合したＳＣＧＦ分子の数が潜在的なアン
タゴニストの有効性を決定することができる。 【００４９】可能性のあるＳＣＧＦアンタゴニストの例
には、該ポリペプチドに結合する抗体、また幾つかの場
合にはオリゴヌクレオチドが含まれる。かわりに、可能
性のあるアンタゴニストはＳＣＧＦ受容体を認識するが
効果的を全く伝達せず、それによってＳＣＧＦの作用を
競合的に抑制するという、例えば、成熟形態のＳＣＧＦ
などの密接に関連したタンパク質であってよい。 【００５０】別の可能性のあるアンタゴニストにはま
た、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチ
センス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用し
て、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくは
ＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この
方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮ
Ａへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディ
ング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオ
リゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対し
て相補的であるよう設計し(三重らせん−リー（Ｌee）
ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；
クーニー（Ｃooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６
（１９８８）；およびダーバン（Ｄervan）ら、Ｓcienc
e、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことに
よって、転写およびＳＣＧＦの産生を妨げる。アンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいて
mＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＳＣＧＧ
への翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ（Ｏkan
o）、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；オ
リゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・イン
ヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏli
godeoxynucleotidesasＡntisense Ｉnhibitors of Ｇen
e Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣＰress）、ボ
カ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１９８
８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り
込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをイン
ビボにおいて発現させて、ＳＣＧＦの産生を阻害するこ
とができる。 【００５１】可能性のあるＳＣＧＦアンタゴニストに
は、該ペプチドの活性部位、該受容体結合部位または他
の増殖因子結合部位に結合し、それによってＳＣＧＦの
正常な生物学的活性を妨げる小分子が含まれる。小分子
の例には、これらに限定されるものではないが、小ペプ
チドまたはペプチド様分子が含まれる。該アンタゴニス
トを腫瘍中の新規血管成長およびアテローム硬化症およ
びバルーン血管形成術に続く再狭窄においてよくみられ
る平滑筋細胞の新内膜（neointimal）増殖を妨害するの
に使用してよい。 【００５２】該アンタゴニストをまた、手術後、心筋梗
塞後の線繊症または肺線維症に関連した線維外傷を形成
するケロイド中に見られる瘢痕（scar）の過剰な生成を
抑制するために使用してよい。該アンタゴニストを例え
ば、以下に記載するような製薬学的に許容し得る担体と
ともに組成物において使用してよい。本発明のＳＣＧＦ
ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、適
当な製薬学的担体と組み合わせて使用することができ
る。そのような組成物は、治療上有効な量の該ポリペプ
チド、アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学上許
容され得る担体または賦形剤を含む。そのような担体に
は、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。そ
の製剤は、投与方法に適合すべきである。 【００５３】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含む医薬品パックまたはキットも提供する。その
ような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製
造、使用または販売を規制する政府当局により規定され
た形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与
のための製造、使用または販売の、該当局による承認を
表わす。さらに、該医薬組成物は、他の治療化合物と共
に使用することができる。 【００５４】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも
約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場
合、それらは、１日当たり約８mg／kg(体重)を超えない
量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路お
よび症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg
／kg〜約１mg／kg(体重)である。 【００５５】以下に限られるものではないが、ＰＤＧ
Ｆ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦまたはＴＧＦ−βを含む他
の増殖因子と組み合わせたＳＣＧＦは傷の治癒において
見られるような生理学的応答を加速してよい。該ＳＣＧ
Ｆポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよび
アンタゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれること
が多い、そのようなポリペプチドのイン・ビボにおける
発現により、本発明に従って使用することができる。 【００５６】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
ス・ビボ（ex vivo）においてポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した
後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与え
る。そのような方法は、当該技術分野で公知である。例
えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分
野で公知の方法により操作することができる。 【００５７】同様に、例えば、当該技術分野で公知の方
法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のた
めに、細胞をイン・ビボにおいて操作することができ
る。当該技術分野において知られているように、細胞を
イン・ビボにおいて処理してポリペプチドをイン・ビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するた
めのプロデューサー細胞を患者に投与することができ
る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞を
イン・ビボにおいて操作するために使用することができ
るアデノウイルスであってもよい。 【００５８】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【００５９】該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモ
ーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターに
は、以下に限られるものではないが、レトロウイルス
ＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍille
r）ら、Biotechniques、Ｖol．７、Ｎo．９、９８０−
９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター
（例えば、以下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏ
ｌ IIIおよびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物
細胞のプロモーターなどの細胞プロモーター）が含まれ
る。使用されてよい他のウイルスプロモーターは、以下
に限るものではないが、アデノウイルスプロモーター、
チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パ
ルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーター
の選択は、本明細書中の教示から当業者には明らかであ
ろう。 【００６０】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上
記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−ア
クチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモー
ターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターで
あってよい。 【００６１】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
をトランスデュースするのに使用してよい。トランスフ
ェクションしてよいパッケージング細胞の例には、以下
に限るものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれ
（ミラー、Human Gene Therapy、Ｖol．１、５−１４頁
（１９９０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引
用する）。該ベクターは当該技術分野において公知の方
法によりパッケージング細胞をトランスデュースする。
このような方法には、以下に限るものではないが、エレ
クトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈
降が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプ
ラスミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れ
られてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与
されてよい。 【００６２】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生
物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トラ
ンスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース
されてよい真核生物細胞には、以下に限られるものでは
ないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細
胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞Ｂ、ケラチノサイ
ト、内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれる。 【００６３】本発明はまた、診断用として本発明の遺伝
子を使用することにも関する。本発明のポリペプチドを
コードする核酸配列中の変異形態の検出により、疾患、
ＳＣＧＦ中の変異は腫瘍を引き起こすので、例えば腫瘍
などの診断または疾患の罹患し易さの診断が可能であろ
う。 【００６４】ヒトＳＣＧＦにおける変異を有する個体
は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診
断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾
液、組織生検および剖検物質などから得られる。ゲノム
ＤＮＡを直接検出に使用してもよいし、分析前にＰＣＲ
（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎature、３２４：１６３−１
６６（１９８６））により酵素的に増幅してもよい。同
様の目的のため、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた使用して
よい。一例として、ＳＣＧＦをコードする核酸に相補的
なＰＣＲプライマーはＳＣＧＦの変異を同定し分析する
のに使用することができる。例えば、欠失および挿入
は、通常の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさに
おける変化によって検出することができる。点突然変異
は、増幅したＤＮＡを放射性標識したＳＣＧＦ ＲＮＡ
または別法として放射性標識したＳＣＧＦアンチセンス
ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定す
ることができる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼ
Ａ消化によるかまたは融点における差異によってミスマ
ッチの二本鎖から区別することができる。 【００６５】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａフラグメントの電気泳動の移動度における変化の検出
によって行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分
離（high resolution）ゲル電気泳動によって可視化す
ることができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、
別々のＤＮＡフラグメントが、その特異的な融点または
部分的な融点に従って別個の位置でゲルにて減速される
変性ホルムアミド濃度勾配ゲル上で区別してよい（例え
ば、マイヤーズ（Ｍyers）ら、Ｓcience、２３０：１２
４２（１９８５））。 【００６６】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的な
ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングま
たは制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型
（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットな
どの方法により行われてよい。 【００６７】さらに従来のゲル電気泳動およびＤＮＡシ
ークエンシングに加えて、変異はまたイン・サイチュ分
析により検出することができる。ＳＣＧＦタンパク質の
発現は腫瘍形成に関する血管疾患または血管新生に関連
する。ＳＣＧＦは腎臓、肺、心臓または脳に及ぼす癌遺
伝子効果を有する。胎児の組織は急速に増殖し、および
ＳＣＧＦ特異的抗体は、すぐに増殖する腫瘍を検出する
ことができる。ＳＣＧＦはシグナルペプチドを有し、そ
のｍＲＮＡは内皮細胞に非常に多く、および少しは平滑
筋細胞に発現する。従って、抗ＳＣＧＦ抗体は、血管の
疾患または腫瘍形成に関する血管新生の診断に使用でき
る。というのは、該ポリペプチドのレベルの変化はその
ような障害の指標となってよいからである。さらに、Ｓ
ＣＧＦタンパク質は再狭窄、高血圧、鬱血性心不全およ
びアテローム硬化症などの組織改作プロセスに関すると
思われる。 【００６８】競合アッセイを使用してよく、その際、Ｓ
ＣＧＦに特異的な抗体を固相支持体に結合させ、標識し
たＳＣＧＦおよび宿主由来のサンプルを該固相支持体を
通過させ、検出された固相支持体に結合した標識の量を
該サンプル中のＳＣＧＦの量に相関させることができ
る。「サンドイッチ」アッセイはＥＬＩＳＡアッセイと
同様である。「サンドイッチ」アッセイではＳＣＧＦを
固相支持体を通過させ、固相支持体に結合した抗体に結
合する。第二抗体をついでＳＣＧＦポリペプチドに結合
させる。標識されており、第二抗体に特異的である第三
抗体をついで固相支持体を通過させて第二抗体に結合さ
せ、ついでその量を定量することができる。 【００６９】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づ
いた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマー
クするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮ
Ａの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連
遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【００７０】簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー（好ましくは、１５−２５bp）を調製することに
より、配列を染色体にマップすることができる。３'未
翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮ
Ａ中の１を越えるエクソンにまたがらないプライマーを
迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとす
る。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体
を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使
用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブ
リッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろ
う。 【００７１】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、特異的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマッピング方法には、イン
・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識
化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いて
のプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よるプレセレクションが含まれる。 【００７２】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程
で与えることができる。この技術は、５００または６０
０塩基という短いｃＤＮＡで利用することができる。こ
の技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・
クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・マニュ
アル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanual of
Ｂasic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐergamon
Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。 【００７３】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（Ｖ. ＭcＫusick）、メンデリア
ン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheri
tance in Ｍan）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシ
ティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns
Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を
介してオンラインで利用できる)に見出される。つい
で、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患と
の間の関係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺
伝(coinheritance))によって確認する。 【００７４】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因
となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１
メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺
伝子を仮定する)。 【００７５】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公
知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメント
の製造に使用することができる。 【００７６】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。ついで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。 【００７７】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える任意の技
術を使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler）およびミルシュタイン（Ｍilste
in）、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、
トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔ
oday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造
するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Ｃole）
ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・ア
ンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodie
s and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール．リス、イ
ンク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁におい
て)が含まれる。 【００７８】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明
の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現
するのに使用してよい。 【００７９】 【実施例】本発明をさらに、以下の実施例に関して記載
する；しかしながら、本発明は、そのような実施例に限
定されないことを理解すべきである。部または量は全
て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実
施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てく
る方法および／または用語を記載する。「プラスミド」
は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字
および／または数字により示す。本明細書中の出発プラ
スミドは、市販されているか、限定されない基盤の下に
公に入手可能であるか、または公開された方法により入
手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載した
プラスミドと同等のプラスミドは、当該技術分野で公知
であって、当業者に明らかであろう。 【００８０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、典型的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５
〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定
の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者によ
り指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーシ
ョン時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変
えてもよい。消化後、その反応物をポリアクリルアミド
上で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離す
る。 【００８１】開裂したフラグメントのサイズ分離は、ゲ
ッデル（Ｇoeddel, Ｄ）ら、Ｎucleic ＡcidsＲes.、
８：４０５７（１９８０）により記載されている８％
ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレ
オチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポ
リデオキシヌクレオチド、または２つの相補的なポリデ
オキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌ
クレオチドは５'リン酸を有さないことから、キナーゼ
の存在下、ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしに
は、別のオリゴヌクレオチドにライゲーションしないで
あろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されて
いないフラグメントにライゲーションするであろう。 【００８２】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１４
６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ラ
イゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量
の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガ
ーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し
遂げることができる。特にことわらない限り、形質転換
は、グラハム（Ｇraham,Ｆ.）およびファン・デル・エ
ブ（Ｖan der Ｅb,Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６−
４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして
行った。 【００８３】実施例１ ＳＣＧＦの細菌発現および精製 最初に、ＳＣＧＦをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ
を、プロセシングしたＳＣＧＦタンパク質（シグナルペ
プチド配列を含まない）配列の５'およびＳＣＧＦ遺伝
子のベクター配列３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを利用して増幅する。ＳＣＧＦに対
応する別のヌクレオチドをそれぞれ５'および３'配列に
加える。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：
5' CACTGCAAGCTTATTTAAAAATGATGCCACAGAA 3'（配列番
号：３）を有し、該配列はＨindIII制限酵素部位（５'
側の下線）を含み、続いて、プロセシングタンパク質コ
ドンの推定末端アミノ酸から開始するＳＣＧＦコーディ
ング配列の２１ヌクレオチドを含む（３'側の下線）。
３'オリゴヌクレオチドプライマー配列：5' CATGCCTCTA
GATATGGGAGTCTGAGTTCTAAC 3'（配列番号：４）は、Ｘba
Ｉ制限部位（５'側の下線）を含み、続いてカルボキシ
末端５アミノ酸および翻訳停止コドン（３'側の下線）
に対応するヌクレオチドの逆相補物を含む。その制限酵
素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−９（キアゲン、イ
ンク(Ｑiagen Ｉnc.）、チャッツワース（Ｃhatswort
h）、カリフォルニア)の制限酵素部位に一致する。pＱ
Ｅ−９は、抗生物質耐性(Ａmpr)、細菌の複製起点(or
i)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター
(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグ
および制限酵素部位をコードする。 【００８４】ついでpＱＥ−９およびＳＣＧＦＰＣＲ産
物をＨindIIIおよびＸbaＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼと一緒にライゲーションする。所望の組換え体はヒス
チジンタグおよびリボソーム結合部位からの下流に挿入
する。ついでそのライゲーション混合物を使用して、Ｍ
１５［ｐＲＥＰ５］（キアゲン、インク）である大腸菌
株をサンブルック（Ｓambrook，Ｊ.）ら、モレキュラー
・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コー
ルド・スプリング・ラボラトリー・プレス（Ｃold Ｓpr
ing Ｌaboratory Ｐress)、（１９８９）に記載された
方法によって形質転換した。Ｍ１５［ｐＲＥＰ５］はプ
ラスミドpＲＥＰ５の多重コピーを含み、これは、lacｉ
リプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋa
nr)も与える。トランスフォーマントを、それらが、Ｌ
Ｂプレートで増殖する能力により同定しついでアンピシ
リン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。 【００８５】プラスミドＤＮＡを制限分析により単離し
確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp（１０
０μg／ml）およびＫan（２５μg／ml）の両方を補っ
た、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／
Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に
１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、
０.４〜０.６の間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.600)まで増
殖させる。ついで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ
−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとな
るまで加えた。ＩＰＴＧは、lacｉリプレッサーを不活
性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加さ
せることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖
し、培養物は指数的に増殖する。ついで、細胞を遠心分
離により収集した。ＳＣＧＦ／６−ヒスチジン含有Ｍ１
５［ｐＲＥＰ４］細胞を６モルのグアニジンＨＣl、５
０mＭのＮａＰＯ4（ｐＨ８.０）中で溶解した。細胞溶
解物をニッケルキレートカラムにロードし、流して収集
した。そのカラムを６モルのグアニジンＨＣl、５０mＭ
のＮaＰＯ4（pＨ ８.０、６.０、５.０）で洗浄した。
ＳＣＧＦ融合タンパク質（＞９０％の純度）をｐＨ２.
０で溶出した。また再生の目的には、ｐＨ２.０の溶出
物を３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナト
リウム、１０ミリモルのグルタチオン（還元型）および
２ミリモルのグルタチオン（酸化型）に合わせた。この
溶液で１２時間インキュベートした後、該タンパク質を
１０ミリモルのリン酸ナトリウムで透析した。ゲルを流
すため、そのペレットをＳＤＳ／ＮaＯＨおよびＳＤＳ
−ＰＡＧＥローディングバッファー、熱変性させたもの
に再懸濁し、ついで１５％変性ポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動した。該タンパク質はクーマシー・ブリリ
アント・ブルーＲ−２５０（Ｃoomassie Ｂrilliant Ｂ
lue Ｒ−２５０）染色で可視化した。 【００８６】実施例２ バキュロウイルス発現システムを用いてのＳＣＧＦのク
ローニングおよび発現 ＳＣＧＦをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣを、ＳＣＧ
Ｆコーディング領域の５'および３'配列に対応するＰＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。
ＳＣＧＦに対応する別のヌクレオチドを各々、５'およ
び３'配列に加えた。５'オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列：5' CATTCGCGGATCCBCCATCATGCTTCCTCCTGCCATT
CAT 3'（配列番号：５）を有し、該配列はＢamＨＩ制限
酵素部位（５'側の下線）、続いて、プロセシングして
いないタンパク質の推定開始メチオニンから開始する２
１ヌクレオチドの、ＳＣＧＦコーディング配列（３'側
の下線）を含む。３'オリゴヌクレオチドプライマー：
5' CACTGCCTCTAGATATGGGAGTCTGAGTTCTAAC 3'（配列番
号：６）は、ＸbaＩ制限部位（５'側の下線）、続いて
翻訳停止コドン（３'側の下線）の隣にある１６の３'未
翻訳ヌクレオチドに対応するヌクレオチドの逆相補配列
を含む。該制限酵素部位は、バキュロウイルス発現ベク
ターｐＡ２（キアゲン、インク．、チャッツワース、カ
リフォルニア)上の制限酵素部位に対応する。ＳＣＧＦ
ＰＣＲ産物およびｐＡ２は、ついでＢamＨＩおよびＸba
Ｉで消化して一緒にＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーショ
ンした。 【００８７】クローニングされたフラグメントの配列
を、ＤＮＡシークエンシングにより確認する。リポフェ
クション法(フェロナー（Ｆeloner）ら、Ｐroc.Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９
８７）)を利用して、プラスミド pbacＳＣＧＦ ５μgを
市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧoldTM バキ
ュロウイルスＤＮＡ」、ファーミンゲン（Ｐharminge
n）、サン・ディエゴ（Ｓan Ｄiego）、カリフォルニ
ア)１.０μgと共に同時トランスフェクションする。Ｂa
culoＧoldTM ウイルスＤＮＡ １μgおよびプラスミド p
ＢacＳＣＧＦ ５μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)培地
(ライフ・テクノロジーズ・インク（ＬifeＴechnologie
s Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithersburg）、メリ
ーランド)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無
菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン(Ｌipo
fectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合し
て、室温で１５分間インキュベートする。ついで、トラ
ンスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを
含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫
細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加する。そのプレ
ートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合す
る。ついで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベ
ートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液を
プレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグ
レイス昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュ
ベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。 【００８８】４日後、上清を集めて、サマーズおよびス
ミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テ
クオロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガ
ロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色
されたプラークを容易に単離することが可能となる。
(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞
培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロ
ジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバ
キュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができ
る)。４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加えて、青
色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先
端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒天を、
グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチューブ
内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により
除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５
mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用す
る。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃
で保存する。 【００８９】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−ＳＣＧ
Ｆを感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチ
オニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II 培地
(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)
に替える。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチオニンお
よび５μＣiの35Ｓ システイン５μＣi(アマシャム（Ａ
mersham)）を加える。その細胞をさらに１６時間インキ
ュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標
識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジ
オグラフィーにより可視化する。 【００９０】実施例３ ＣＨＯ細胞における組換えＳＣＧＦの発現 ベクターｐＮ３４６をＳＣＧＦタンパク質の発現に使用
する。プラスミドｐＮ３４６はプラスミドのｐＳＶ２−
dhfrが［ＡＴＣＣ受託番号第３７１４６号］の誘導体で
ある。両方のプラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの
制御下でマウスdhfr遺伝子を含む。これらのプラスミド
でトランスフェクションされるチャイニーズハムスター
の卵巣またはジヒドロ葉酸活性を欠如している他の細胞
を、化学療法剤メトトレキセート（methotrexate）を補
った選択培地（αマイナスＭＥＭ、リフト・テクノロジ
ーズ（Ｌift Ｔechnologies）中で細胞を増殖させるこ
とによって選択することができる。メトトレキセート
（ＭＴＸ）に耐性のある細胞中のＤＨＦＲ遺伝子の増幅
はよく証明されている（例えばアルト（Ａlt，Ｆ.
Ｗ.）、ケルムス（Ｋellems，Ｒ.Ｍ.）、ベルチノ（Ｂe
rtino，Ｊ.Ｒ.）およびシムケ（Ｓchimke，Ｒ.Ｔ.）、
１９７８、Ｊ．Ｂiol，Ｃhem．２５３：１３５７−１３
７０、ハムリン（Ｈamlin，Ｊ．Ｌ.）およびマ（Ｍa，
Ｃ.）、１９９０、Ｂiochem．et Ｂiophys．Ａcta、１
０９７：１０７−１４３、ページ（Ｐage，Ｍ．i.）お
よびシデンハム（Ｓydenham，Ｍ．Ａ.）、１９９１、Ｂ
iotechnologyＶol．９：６４−６８参照）。ＭＴＸの増
大する濃度中で増殖させた細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増
幅の結果、標的酵素、ＤＨＦＲの過剰産生による該薬剤
への耐性を高める。第２の遺伝子がdhfr遺伝子に結合す
るならば、通常は同時増幅（co-amplified）され、過剰
発現する。続いて、メトトレキセートを除去する場合、
細胞株は染色体に取り込まれた増幅された遺伝子を含
む。 【００９１】プラスミドｐＮ３４６は興味深い遺伝子の
発現のため、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列
（ＬＴＲ）（カレン（Ｃullen）ら、Ｍolecular and Ｃ
ellular Ｂiology、１９８５年３月、４３８−４４７）
プラスヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺
伝子のエンハンサー（ボスハルト（Ｂoshart）ら、Ｃel
l ４１：５２１−５３０、１９８５）から単離されたフ
ラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の取
り込みを可能にする単独の制限酵素開裂部位である：Ｂ
am ＨＩ、Ｐvul１およびＮru１である。これらのクロー
ニング部位を残して該プラスミドは、３'イントロンお
よびラットプレプロインシュリン遺伝子のポリアデニレ
ーション部位が続く全部で３つのリーディングフレーム
中の翻訳停止コドンを含む。他の高効率なプロモーター
をまた、発現のため、例えばヒトβ−アクチンプロモー
ター、ＳＶ４０初期または後期プロモーターまたは例え
ばＨＩＶまたはＨＴＬＶなどの他のレトロウイルスから
の長い末端反復配列などを使用することができる。mＲ
ＮＡのポリアデニレーションのため、他のシグナル、例
えば、ヒト成長ホルモンまたはグロブリン遺伝子などか
らのシグナルを同様に使用することができる。 【００９２】染色体に取り込まれる関心のある遺伝子を
運搬する安定な細胞株はまた、gpt、Ｇ４１８またはヒ
グロマイシン（Ｈygromycin）などの選択可能なマーカ
ーと同時トランスフェクションに関して選択することが
できる。最初に例えばＧ４１８とメトトレキセートな
ど、１より多い選択可能なマーカーを使用することには
利点がある。プラスミドｐＮ３４６は制限酵素ＢamＨＩ
で消化され、ついで当該技術分野において公知の方法に
よってウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化され
る。ついでそのベクターは１％アガロースゲルから単離
される。完全長のＳＣＦＧタンパク質、ＡＴＣＣ受託番
号第９７１７３号をコードするＤＮＡ配列は該遺伝子の
５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて増幅する： 【００９３】５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列：5' CATCGCGGATCCGCCATCATGCTTCCTCCTGCCATTCAT 3'
（配列番号：７）を有し、該配列はＢamＨＩ制限酵素部
位（５'側の下線）、続いて、真核生物細胞中の翻訳開
始有効シグナルに類似した２１ヌクレオチドを有する
（コザック（Ｋozak，Ｍ.）、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１９
６：９４７−９５０（１９８７））。残りのヌクレオチ
ドは翻訳開始コドン（３'側の下線）を含むアミノ末端
の７アミノ酸に対応する。３'プライマー：5' CACTGCGG
ATCCTATGGGAGTCTGAGTTCTAAC 3'（配列番号：８）は、Ｂ
amＨＩ制限部位（下線）、および続いて翻訳停止コドン
から下流にある１６ヌクレオチドから開始する３'未翻
訳ＤＮＡの逆相補性である。ＰＣＲ産物をＢamＨＩで消
化し、ついで市販の利用可能なキット（「ジーン・クリ
ーン（Ｇeneclean）」、バイオ１０１・インク（ＢＩＯ
１０１ Ｉnc.）、ラ・ホラ、カリフォルニア）を用い
て１％のアガロースゲル上で精製する。ついで、このフ
ラグメントをＢam ＨＩ消化したリン酸化したｐＮ３４
６プラスミドもＴ４ＤＮＡリガーゼとともにライゲーシ
ョンする。Ｘl１Ｂlue（ストラタジーン）大腸菌を形質
転換し、ＬＢ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上
にプレーティングする。適切な方向の所望の組換え体を
産生するコロニーをラウス肉腫ウイルスプロモーターに
対応する５'プライマーおよびＳＣＧＦコドン７３−７
９の逆の相補配列に対応する３'プライマーによりスク
リーニングする。クローニングされたフラグメントの配
列はＤＮＡシークエンシングにより確認される。 【００９４】ＣＨＯ−dhfr−細胞のトランスフェクショ
ン 活性ＤＨＦＲ酵素を欠如しているチャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞をトランスフェクションに使用する。発現
プラスミドpＮ３４６ＳＣＧＦ５μｇをリポフェクチン
法を用いて０.５μｇのプラスミドpＳＶneoとトランス
フェクションする（フェロナー（Ｆeloner）ら、上
記）。プラスミドpＳＶ２−neoは優力な選択可能なマー
カーを含み、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に耐性を与え
る酵素をコードするＴn５からの遺伝子neoを含む。細胞
を１g／mlＧ４１８を補ったαマイナスＭＥＭに播種す
る。２日後、該細胞をトリプシン化し、ついでハイブリ
ドーマクローニングプレート（グライナー（Ｇreine
r）、ドイツ）に播種し、ついで１０−１４日間培養す
る。この時期の後、単一のクローンをトリプシン化し、
ついで多様な濃度のメトトレキセート（２５、５０nm、
１００nm、２００nm、４００nm）を用いて６ウェルのペ
トリ皿に播種する。最も高濃度のメトトレキセートで増
殖しているクローンをついでさらに高濃度のメトトレキ
セートを含む（５００nＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）
新しい６ウェルプレートに移す。同じ手法をクローンの
濃度が１００μＭに増殖するまで繰り返す。所望の遺伝
子産物の発現をウエスタン・ブロット分析およびＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって分析する。 【００９５】実施例４ ノザン・ブロット分析によるＳＣＧＦ遺伝子発現の組織
局在化 ヒト成人脳、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓およ
び膵臓ポリＡ+ｍＲＮＡを各１レーンに含む複数組織の
ノザン・ブロット（クローンテク・ラボラトリーズ・イ
ンク（Ｃlonetech Ｌaboratories，Ｉnc.）、４０３０
ファビアン・ウェイ（Ｆabian Ｗay）；パロ・アルト
（Ｐalo Ａlto）、カリフォルニア９４３０３）をチャ
ーチ・バッファー（Ｃhurch buffer）（チャーチ（Ｃhu
rch，Ｇ．Ｍ.）ギルバート（Ｇilbert，Ｗ.）Ｐroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ８１、１９９１−１９９５
（１９８４））中で６０℃で１時間プレハイブリダイゼ
ーションした。ＳＣＧＦをコードするそのＤＮＡ、ＡＴ
ＣＣ受託番号第９７１７３号をＭ１３フォワードプライ
マー：5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'（配列番号：９）およ
び、リバースプライマー：5' GGAAACAGCTATGACCATG 3'
（配列番号：１０）を用いたｐＢluescript ＳＫ（−）
中にクローニングした全長ｃＤＮＡから増幅した。２５
ナノグラムのＰＣＲ産物を32Ｐ−ｄＣＴＰでランダム・
プライマー標識（プライム−イットII（Ｐrime-Ｉt I
I)、ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓtr
atagene Ｃloning Ｓystems）、１１０１１ノース・ト
ーレイ・パインズ・ロード（Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒ
d.）；ラ・ホラ、カリフォルニア９２０３７）する。熱
変性したＳＣＧＦプローブを直接プレハイブリダイゼー
ションバッファー中に加えて６０℃で１６時間インキュ
ベートする。６０℃の０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中
で２回１０分間の洗浄を行う。オートラジオグラフィー
は−８０℃で行う。 【００９６】実施例５ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。そ
の組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコ
を上下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置す
る。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで
組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含む新しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ
１２ media））を添加する。ついでこれを３７℃で約１
週間インキュベートする。このとき、新しい培地を添加
し引き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液
中に線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン
処理しついでさらに大きなフラスコに合わせて調整す
る。 【００９７】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復配列によりフランキングされたｐＫＶ−７（キルシュ
メイエル（Ｋirschmeier，Ｐ．Ｔ.）ら、ＤＮＡ、７：
２１９−２５（１９８８））をＥco ＲＩおよびＨind I
IIで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理す
る。線形ベクターをアガロースゲル上で分画化し、ガラ
スビーズを使用して精製する。本発明のポリペプチドを
コードするｃＤＮＡをそれぞれ５'端および３'端配列に
対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅する。５'プ
ライマーはＥco ＲＩ部位を含み３'プライマーはＨindI
II部位を含む。モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格
およびＥcoＲＩおよびＨindIIIフラグメントの等量をＴ
４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加する。得られ
た混合物を２つのフラグメントのライゲーションに適し
た条件下で維持する。ライゲーション混合物を細菌ＨＥ
１０１を形質転換するのに使用し、ついで該菌をベクタ
ーが所望の適切に挿入された遺伝子を有することを確認
するためカナマイシン含有寒天上に播種する。 【００９８】両栄養性のｐＡ３１７またはＧp+am１２パ
ッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血清（ＣＳ）、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ
改変イーグル培地（Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagles Ｍ
edium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるまで組織培養
にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶベクターをつ
いで培地に添加し、パッケージング細胞を該ベクターで
トランスデュースする。今度はパッケージング細胞は、
該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケ
ージング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。 【００９９】新しい培地をトランスデュースしたプロデ
ューサー細胞に添加し、引き続き培地を１０ｃｍプレー
ト全面のプロデューサー細胞から回収する。感染性ウイ
ルス粒子を含む使用し尽くした培地をミリポアフィルタ
ーで濾過して分離したプロデューサー細胞を除去し、つ
いでこの培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。
培地を線維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロ
デューサー細胞からの培地とすばやく取り替える。この
培地を除去し、新しい培地で置き換える。ウイルス力価
が高い場合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選
択は一切必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、
neoまたはhisなどの選択可能なマーカーを有するレトロ
ウイルスベクターを使用する必要がある。操作された線
維芽細胞を、単独またはサイトデックス・３・ミクロキ
ャリア・ビーズ（cytodex 3 microcarrier beads）上全
面に増殖した後に、宿主に注入する。該線維芽細胞はタ
ンパク質産物を産生する。先の教示から見て、本発明の
多数の変更および変化が可能であることから、追記する
請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行う
ことができる。 【０１００】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Human CNN-like Growth Factor <130> 183772 <160> 8 <210> 1 <211> 900 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cgccaaacct ctatggatat ataaagggaa gcttgaggag gaatttcaca gttacagtgc 60 agaagcagag gcaaaagaat taaccagctc ttcagtcaag caaatcctct actcaccatg 120 cttcctcctg ccattcattt ctatctcctt ccccttgcat gcatcctaat gaaaagctgt 180 ttggctttta aaaatgatgc cacagaaatc ctttattcac atgtggttaa acctgttcca 240 gcacacccca gcagcaacag cacgttgaat caagccagaa atggaggcag gcatttcagt 300 aacactggac tggatcggaa cactcgggtt caagtgggtt gccgggaact gcgttccacc 360 aaatacatct ctgatggcca gtgcaccagc atcagccctc tgaaggagct ggtgtgtgct 420 ggcgagtgct tgcccctgcc agtgctccct aactggattg gaggaggcta tggaacaaag 480 tactggagca ggaggagctc ccaggagtgg cggtgtgtca atgacaaaac ccgtacccag 540 agaatccagc tgcagtgcca agatggcagc acacgcacct acaaaatcac agtagtcact 600 gcctgcaagt gcaagaggta cacccggcag cacaacgagt ccagtcacaa ctttgagagc 660 atgtcacctg ccaagccagt ccagcatcac agagagcgga aaagagccag caaatccagc 720 aagcacagca tgagttagaa ctcagactcc cataactaga cttactagta accatctgct 780 ttacagattt gattgcttgg aagactcaag cctgccactg ctgttttctc acttgaaagt 840 atatgctttc tgctttgatc aaacccagca agctgtctta agtatcagga ccttctttgg 900 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Lys Pro Pro Ala Ile His Phe Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Cys Ile 1 5 10 15 Leu Met Lys Ser Cys Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Leu 20 25 30 Tyr Ser His Val Val Lys Pro Val Pro Ala His Pro Ser Ser Asn Ser 35 40 45 Thr Leu Asn Gln Ala Arg Asn Gly Gly Arg His Phe Ser Asn Thr Gly 50 55 60 Leu Asp Arg Asn Thr Arg Val Gln Val Gly Cys Arg Glu Leu Arg Ser 65 70 75 80 Thr Lys Tyr Ile Ser Asp Gly Gln Cys Thr Ser Ile Ser Pro Leu Lys 85 90 95 Glu Leu Val Cys Ala Gly Glu Cys Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn 100 105 110 Trp Ile Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser 115 120 125 Gln Glu Trp Arg Cys Val Asn Asp Lys Thr Arg Thr Gln Arg Ile Gln 130 135 140 Leu Gln Cys Gln Asp Gly Ser Thr Arg Thr Tyr Lys Ile Thr Val Val 145 150 155 160 Thr Ala Cys Lys Cys Lys Arg Tyr Thr Arg Gln His Asn Glu Ser Ser 165 170 175 His Asn Phe Glu Ser Met Ser Pro Ala Lys Pro Val Gln His His Arg 180 185 190 Glu Arg Lys Arg Ala Ser Lys Ser Ser Lys His Ser Met Ser 195 200 205 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a Hind III restriction enzyme site followed by n ucleotides of SCGF coding sequence <400> 3 cactgcaagc ttatttaaaa atgatgccac agaa 34 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a Xba I restriction site followed by the reverse complement of nucleotides corresponding to SCGF coding sequence <400> 4 catgcctcta gatatgggag tctgagttct aac 33 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a BamHI restriction enzyme site followed by nucl eotides of SCGF coding sequence <400> 5 cattcgcgga tccbccatca tgcttcctcc tgccattcat 40 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a Xba I restriction site followed by the reverse complement of nucleotides corresponding to SCGF untranslated nucleotide s <400> 6 cactgcctct agatatggga gtctgagttc taac 34 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a BamHI restriction enzyme site followed by nucl eotides resembling an efficient signal for the initiation of translation <400> 7 catcgcggat ccgccatcat gcttcctcct gccattcat 39 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer containing a BamHI restriction site followed by the reverse complement of nucleotides corresponding to SCGF untranslated nucleotide s <400> 8 cactgcggat cctatgggag tctgagttct aac 33 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 forward primer <400> 9 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 reverse primer <400> 10 ggaaacagct atgaccatg 19
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のポリペプチドのｃＤＮＡおよび対応
する推定アミノ酸配列を示す。最初の２３アミノ酸残基
は推定リーダー配列（下線を付す）を表わす。アミノ酸
に関する標準的な１文字略号を使用する。シークエンシ
ングは、３７３シークエンサー(アプライド・バイオシ
ステムズ、インク（Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.)）を
使用して行った。 【図２】 本発明のポリペプチドのｃＤＮＡおよび対応
する推定アミノ酸配列を示す。最初の２３アミノ酸残基
は推定リーダー配列（下線を付す）を表わす。アミノ酸
に関する標準的な１文字略号を使用する。シークエンシ
ングは、３７３シークエンサー(アプライド・バイオシ
ステムズ、インク（Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.)）を
使用して行った。 【図３】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。 【図４】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。 【図５】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。 【図６】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。
する推定アミノ酸配列を示す。最初の２３アミノ酸残基
は推定リーダー配列（下線を付す）を表わす。アミノ酸
に関する標準的な１文字略号を使用する。シークエンシ
ングは、３７３シークエンサー(アプライド・バイオシ
ステムズ、インク（Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.)）を
使用して行った。 【図２】 本発明のポリペプチドのｃＤＮＡおよび対応
する推定アミノ酸配列を示す。最初の２３アミノ酸残基
は推定リーダー配列（下線を付す）を表わす。アミノ酸
に関する標準的な１文字略号を使用する。シークエンシ
ングは、３７３シークエンサー(アプライド・バイオシ
ステムズ、インク（Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.)）を
使用して行った。 【図３】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。 【図４】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。 【図５】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。 【図６】本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリー
のメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説
明する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 19/10
17/02 21/00
19/10 43/00 １０５
21/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 ＺＮＡ
43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ０７Ｋ 14/475 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 グレッグ・エイ・ヘイスティングス
アメリカ合衆国20874メリーランド州ジャ
ーマンタウン、アンセル・テラス13504番
(72)発明者 マーク・ディ・アダムス
アメリカ合衆国20878メリーランド州ノー
ス・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ
15205番
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02
DA06 EA02 EA04 GA13 HA01
4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01
BA22 NA14 ZA59 ZA94 ZA97
ZB21
4C085 AA14 BB11 CC23 EE01
4C086 AA01 AA04 EA16 NA14 ZA59
ZA94 ZA97 ZB21
4H045 AA10 BA10 CA40 DA50 EA20
EA50 FA74
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 明細書に記載のヒトＣＣＮ−様増殖因
子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002146288A JP2003024066A (ja) | 2002-05-21 | 2002-05-21 | ヒトｃｃｎ−様増殖因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002146288A JP2003024066A (ja) | 2002-05-21 | 2002-05-21 | ヒトｃｃｎ−様増殖因子 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9500359A Division JPH11506918A (ja) | 1995-06-05 | 1995-06-05 | ヒトｃｃｎ−様増殖因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003024066A true JP2003024066A (ja) | 2003-01-28 |
Family
ID=19194677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002146288A Pending JP2003024066A (ja) | 2002-05-21 | 2002-05-21 | ヒトｃｃｎ−様増殖因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003024066A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101810191B1 (ko) | 2016-09-21 | 2017-12-19 | 연세대학교 산학협력단 | 세포 접착의 저해를 위한 줄기세포 성장 인자 또는 그의 단편의 용도 |
-
2002
- 2002-05-21 JP JP2002146288A patent/JP2003024066A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101810191B1 (ko) | 2016-09-21 | 2017-12-19 | 연세대학교 산학협력단 | 세포 접착의 저해를 위한 줄기세포 성장 인자 또는 그의 단편의 용도 |
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