JPH11507809A

JPH11507809A - ヒト肝ガン由来増殖因子−２

Info

Publication number: JPH11507809A
Application number: JP9500351A
Authority: JP
Inventors: エイ．クンシュ，チャールズ; エイ．ローゼン，クレイグ
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 1999-07-13
Also published as: EP0833892A1; CA2223733A1; AU2692295A; WO1996039485A1; US20030022312A1; EP0833892A4

Abstract

(57)【要約】ヒト肝ガン由来の増殖因子ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするDNA（RNA）ならびに組換え技術によるこのようなポリペプチドを産生するための手順が開示される。組織の修復および組織の増殖の刺激のためにこのようなポリペプチドを利用するための方法がまた開示される。このようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよび腫瘍増殖および瘢痕を遅延させるための治療としてのそれらの使用もまた開示される。宿主由来のサンプル中のこのポリペプチドのコード配列における変異およびこのポリペプチドの濃度変化を検出するための診断方法がまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト肝ガン由来増殖因子-２本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、肝ガン由来の増殖因子（時々、本明細書中で以降「HDGF-2」という）として推定的に同定された。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。細胞増殖は、種々の成長因子およびサイトカインによって調節される。これらは、転写因子の活性化に対する細胞内の生化学的シグナルのカスケードを誘発するための特異的膜レセプターに結合し、それにより種々のサブセットの遺伝子の種々の活性化および抑制をもたらす（Aaroson,S.A、Science,254:1146-1153(199 1)）。肝ガン由来の増殖因子（HDGF）は、最近クローン化されている（Nakamura,H. ら、J.Bio.Chem.,269(40):25143-25149(1994)）。HDGFは、線維芽細胞に対して分裂促進的な（mitogenic）ヘパリン結合タンパク質である。HDGFは、ヒト肝ガン由来の細胞株HuH-7の馴化培地よりSwiss 3T3細胞中へのトリチウム化チミジンの組み込みによって精製された。HDGFは、シグナルペプチドを有しないが、cDNA クローンのトランスフェクション後、COS-7細胞の培地中に分泌される。これは、ヘパリン結合タンパク質であり、そしていくつかの腫瘍由来の細胞株および組織中に遍在的に発現する。これは、肝ガン細胞の細胞質中に局在し、そして強い成長刺激活性を有する。本発明のポリペプチドは、HDGF-2ポリペプチドとして推定的に同定された。この同定は、ヒトHDGFに相同なアミノ酸配列の結果として作製されている。本発明の１つの局面によれば、新規の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログ、およびそれらの誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源である。本発明の別の局面によれば、単離された核酸分子が提供され、それには、mRNA 、DNA，cDNA、ゲノムDNA、ならびにそのアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメントが含まれる。本発明のなおさらに別の局面によれば、組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。組換え技術は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を、このタンパク質の発現を促進する条件下で培養し、その後このタンパク質を回収する工程を包含する。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それに対するアゴニストおよびアンタゴニスト化合物をスクリーニングする目的、および治療目的（例えば、火傷、組織修復、および潰瘍の結果としての傷害の治癒の促進、血栓症および動脈硬化症を処置すること、神経障害による神経損傷を防止し、そして神経増殖を促進すること、骨および歯周の再生を促進すること、日焼けを処置すること、骨髄細胞および角膜に内皮の成長および／または分化を刺激すること、肌の老化および抜け毛を防止すること、器官形成を刺激すること）に利用するプロセスが提供される。本発明のさらなる局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズするために十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブがまた提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別の局面によれば、それらに対するレセプターに結合および活性化することによって本発明のポリペプチドを模倣するアゴニストが提供される。本発明のさらに別の局面によれば、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供される。これは、このようなポリペプチドの作用を阻害する（例えば、血管形成、腫瘍新脈管形成後の再狭窄の処置において、瘢痕形成（scarring ）を防止し、そして血管過多症（hyper-vascular disease）を処置すること）ために使用される。本発明のなお別の局面によれば、疾患および本発明の核酸配列内の変異に関連する疾患に対する感受性を検出するための、およびこのような配列によりコードされるポリペプチドの過剰発現を検出するための診断アッセイが提供される。本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNA合成およびDNAベクターの製造に関連するインビトロにおける目的のために利用するためのプロセスが提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様を例示するものであり、請求の範囲により包含される本発明の範囲を制限することを意味しない。図１は、HDGF-2のcDNA配列、および対応するHDGF-2の推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準的な１文字表記を使用する。配列決定は、373自動化DNAシーケンサー（Applied Biosystems,Inc.）を用いて行った。図２は、本発明のポリペプチド（上列）とヒトHDGF-1（下列）との間のアミノ酸組成である。本発明の１つの局面によれば、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたは1995年５月24日にATCC受託番号第号として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、心臓、脳、および骨格筋から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト臍静脈内皮組織由来の cDNAライブラリー中で発見された。これは、HDGFファミリーに構造的に関連する。これは、249アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンレーディングフレームを含む。このタンパク質は、201アミノ酸長にわたり、ヒトHDGFに対して最も高い程度の相同性（23％の同一性および61％の類似性）を示す。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAはcDNA、ゲノムD NA、および合成DNAを包含する）の形態であり得る。一本鎖がコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る場合、DNAは二本鎖または一本鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）の DNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得るがこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。従って、本発明は、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。この変異体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を含む。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。本発明はまたポリヌクレオチドを包含し、ここで成熟ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を援助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）に対する同じリーディングフレームで融合され得る。リーダー配列を有するポリペプチドはプレプロテインであり、そしてポリペプチドの成熟形態を形成するために宿主細胞により切断されたリーダー配列を有し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる５’アミノ酸残基であるプロプロテインをコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロプロテインであり、およびタンパク質の不活性形態である。プロ配列が一旦切断されれば、活性な成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質をコードし得るか、あるいはプロ配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合は、血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37:767 (1984)）。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAセグメントを意味する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域（リーダーおよびトレイラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。全長のHDGF-2遺伝子のフラグメントは、全長のHDGF-2遺伝子を単離するための、およびこの遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも 30塩基を有し、そして例えば、50またはそれ以上の塩基を含み得る。このプローブはまた、全長の転写産物に対応するcDNAクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エクソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のDNA配列を使用することにより、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、このプローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかを決定するために、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用される。本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％および好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。あるいは、このポリヌクレオチドは、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、そしてより好ましくは50塩基を有し得る。これらは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして、本明細書上記のように、それに対する同一性を有し、そして活性を保持してもよいし、または保持しなくてもよい。例えば、このようなポリヌクレオチドは、例えば、このポリヌクレオチドの回収のために配列番号１のポリヌクレオチドのためのプローブとして、あるいは診断プローブまたはPCRプライマーとして使用され得る。従って、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、ならびに少なくとも30塩基、そして好ましくは少なくとも50塩基を有するそのフラグメントに対して、そしてそのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも 90％、そしてより好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチドならびに、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドに関する。本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の存続期間の下に維持される。これらの寄託物は、単に当業者の便宜上提供されるのみであり、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するHDGF-2ポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換アミノ酸残基がその遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であるかもしれないし、またはそうではないかもしれないもの、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは(iv)さらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融合され、そして成熟ポリペプチドの精製に使用されるものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではない点で、なお単離され得る。本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号２のポリペプチドと少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくとも70％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）、そしてさらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも95％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そして、また一般的に少なくとも30アミノ酸そしてより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むポリペプチドのこのような一部分を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。当該分野に公知であるように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配列に対して、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入、または形質転換、またはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地において培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を含む。このようなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージDNAとの組み合わせ由来のベクター；ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coll. lacまたはtrp 、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えば、E.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上のマーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、 Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。より詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。この構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を含み、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70 、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript．psiX174、pbluescript SK 、pbsks，pNH8a、pNH16a，pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、p KK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核生物性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、p XT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターが、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびpCM7である。特によく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt，λP_R、P_Lおよびt rpを含む。真核生物プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインIを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）あるいは下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basi c Methods in Molecular Biology,(1986))。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、第２版、Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点の後期側bp100〜270のSV 40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRPI遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、中でも、解糖酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列と適切な相で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを有する作動可能な読み取り相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望により宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typh imurium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp sala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を含む。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法（このような方法は、当業者に周知である）により破砕され得る。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23: 175(1981)により記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、を含有し、そしてまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列を含有する。SV40スプライスに由来するDNA配列、およびポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る。 HDGF-2ポリペプチドは、以下で使用される方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完了するために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程のために用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物であり得るか、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞による）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリペプチドは、血管形成能力の結果として、血管内皮細胞増殖を刺激し、そして種々の疾患病状（例えば、血栓症、動脈硬化症、および他の心血管病状）による虚血組織の再血管形成を刺激するための処置に使用され得る。これらのポリペプチドはまた、血管形成能力の結果として、中胚葉の誘導および初期胚における四肢の再生を刺激するために使用され得る。ポリペプチドはまた、損傷、火傷、手術、および潰瘍による傷の治癒を促進するために使用され得る。なぜならこれらのポリペプチドが、異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対して細胞分裂促進性であり、そしてそれゆえ、損傷を受けた組織または疾病組織の修復または置換を促進するからである。本発明のポリペプチドはまた、神経の成長を刺激するために、そして特定の神経損傷またはアルツハイマー病、パーキンソン病、およびAIDS関連コンプレックスのような神経変性状態に生じる神経損傷を処置および予防するために使用され得る。このポリペプチドは、軟骨細胞増殖を刺激するために使用され、従ってこのポリペプチドは骨の再生および歯周の再生を増大するために、そして組織移植または骨の移植片を支援するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、ケラチン生成細胞の増殖を刺激することにより、日焼けによる皮膚老化を妨げるために使用され得る。このポリペプチドはまた、毛髪形成細胞を活性化し、そしてメラニン細胞増殖を促進することにより、脱毛を防止するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激するために使用され得る。ポリペプチドはまた、移植前の器官を維持するために、または初代組織の細胞培養を支持するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、中胚葉起源の組織を誘導して初期胚を分化させるために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および研究材料として使用され得る。本発明は、本発明のポリペプチドのレセプターの同定のための方法を提供する。このレセプターをコードする遺伝子は、例えば、リガンドパニングおよびFACS 探索(Coliganら、Current Protocols in Immun.,1(2),第５章、(1991))のような、当該業者に公知の多数の方法により同定され得る。好ましくは、発現クローニングは、ポリアデニル化RNAがHDGF-2ポリペプチドに応答性の細胞から調製される場合に使用される。そしてこのRNAから作製されたcDNAライブラリーをプールに分割し、そして応答しないCOS細胞または他の細胞にトランスフェクトするために使用される。スライドガラス上で増殖したトランスフェクトした細胞を、標識されたHDGF-2に曝露する。HDGF-2ポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位の含有を含む種々の手段により標識され得る。固定およびインキュベーションの後、スライドをオートラジオグラフィー分析に供する。陽性プールを同定しそしてサブプールを調製しそして反復性のサブプールおよび再スクリーニングプロセスを用いて再トランスフェクトし、推定のレセプターをコードする単一クローンを最終的に得る。レセプター同定のための１つの別のアプローチとして、標識されたリガンドは、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光学親和結合（photoaffinity linked）され得る。架橋物質はPAGE分析により分離され、そしてＸ線フィルムに曝露される。リガンドーレセプターを含有する標識された複合体は、切り出され、ペプチドフラグメントに分解され、そしてタンパク質微小配列決定に供され得る。微小配列決定から得られたアミノ酸配列は、一連の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計して推定のレセプターをコードする遺伝子を同定するためのcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用される。本発明は、化合物をスクリーニングして、HDGF-2レセプター（アゴニスト）に結合し、かつ活性化するか、またはHDGF-1レセプター（アンタゴニスト）に結合し、かつ阻害する化合物を同定する。例えば、競合アッセイが使用され得、ここで、HDGF-2レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物を標識されたHDGF -2および試験されるべき化合物と共にインキュベートする。HDGF-2レセプターに競合するための化合物の能力は、化合物の存在および非存在における結合HDGF-2 ポリペプチドの量を同定するために、液体シンチレーションカウンティングによって同定され得る。あるいは、アゴニスト化合物は、試験されるべき化合物の相互作用の後、公知のセカンドメッセンジャー系の応答を検出することによって同定され得、そして HDGF-2レセプターは、放射能を有する化合物を標識すること、およびHDGF-2レセプターを発現する細胞と接触することにより測定される。このようなセカンドメッセンジャー系は、cAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解を含むが、これらに限定されない。アンタゴニスト化合物は、このアッセイを用いて同定され得、ここで、アンタゴニストは、レセプターに結合するがセカンドメッセンジャー応答を誘発せず、その結果そのレセプター由来のHDGF-2ポリペプチドを効率よく阻止する。上記のアッセイについて細胞を調製する方法は、細胞集団（レセプターを含まないと仮定される）をHDGF-2レセプターをコードするDNAを含む適切なベクターでトランスフェクトする工程を包含し、それにより細胞はレセプターを発現する。適切な応答系は、所望のセカンドメッセンジャー経路(cAMP、イオンチャンネル、ホスホイノシチドキナーゼ、またはカルシウム応答を含む）を含む適切な宿主へのDNAのトランスフェクションによって得られる。このようなトランスフェクション系は、種々の化合物および細胞に曝露されたポリペプチドの活性を分析するための応答系を提供する。特異性アッセイにおいて、HDGF-2の増殖刺激活性は、Nakamura,H.ら、Clin.Ch im．Acta,183:273-284(1989)（これは、本明細書によりその全体が参考として援用される）によるWeissアルビノマウス3T3細胞への[³H]チミジンの取り込みを測定することによる潜在的な化合物の存在下でアッセイされ得る。アンタゴニスト化合物の例としては、HDGF-2レセプター上の種々の重要な位置を有する、免疫反応性であり、そしてレセプターに結合し、そしてHDGF-2ポリペプチド由来のレセプターをブロックする抗体が挙げられる。抗体には、一般に、抗体の抗原結合部位に結合した独特の決定基を認識する抗イディオタイプの抗体が含まれる。このタイプの抗体は、HDGF-2ポリペプチド自身に対して調製されて抗体に結合し、そして抗体のそのレセプターとの相互作用を防止する。 HDGF-2自身との競合においてHDGF-2レセプターに結合するがセカンドメッセンジャー応答を惹起しないオリゴペプチドはまた、アンタゴニスト化合物として使用され得る。オリゴペプチドの例としては、例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられる。オリゴペプチドはまた、HDGF-2の活性部位に結合して、HD GF-2のそのレセプターとの相互作用をブロックし得る。アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス構築物はまた、HDGF-2ポリペプチドの産生を防止するためのアンタゴニスト化合物として使用され得る。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAを介した遺伝子発現を制御するために用いられ得、これらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、長さが約10〜40 塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNA オリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん-Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979); Cooneyら、Scienc e，241:456(1988);およびDervanら、Science，251: 1360(1991)を参照のこと）、それにより、転写およびHDGF-2の産生を阻害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のHDGF-2ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス-Okano、J．Neurochem.，56:56 0(1991); 遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴヌクレオチド，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、アンチセンスRNAまたはDNAが、HDGF-2の産生を阻害するためにインビボで発現され得る。アンタゴニストは、新生物細胞および組織上での本発明のポリペプチドの細胞成長および増殖効果を（すなわち、腫瘍の血管形成の刺激）を阻害するために使用され得る。そしてそれゆえ、異常な細胞成長および増殖（例えば、腫瘍形成または増殖において）を遅延するかまたは妨げる。アンタゴニストはまた、血管過多疾患の予防に使用され得、そしてカプセル外の白内障手術後の上皮レンズ細胞の増殖を妨げる。本発明のポリペプチドの細胞分裂促進性活性の予防はまた、血管形成術バルーン後の再狭窄のような場合に所望される。アンタゴニストはまた創傷治癒の間の瘢痕組織の炎症および増殖を妨ぐために使用され得る。アンタゴニストはまた薬学的に受容可能なキャリア（例えば、以下に記載のような）を有する化合物において使用され得る。本発明のポリペプチドおよびアゴニストならびにアンタゴニスト化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチドまたは化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに、本発明のポリペプチドおよび化合物は、他の治療化合物と共に用いられ得る。これらの薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または皮内経路によるような簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の徴候の処置および／または予防に効果的な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日あたり約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日あたり約10μg/kg体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。 HDGF-2ポリペプチドおよびポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエクソビボで操作され得、次いで、この操作された細胞はポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知であり、そして本明細書中の教示から明らかである。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入される。その結果、ここでパッケージング細胞は、目的の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビボにおける細胞を操作するために、およびインビボでのポリペプチドの発現を操作するために患者に投与され得る。このような方法による本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかであるはずである。本明細書中上記の、誘導され得るレトロウイルスプラスミドベクター由来のレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスより誘導される。ベクターは、１以上のプロモーターを含有する。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびMillerら、Biotechniqu es 、第７巻、第９号、980-990（1989）に記載されるヒトサイトメガロウイルス (CMV) プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、これらに限定しないが、ヒストン、pol III，およびβ−アクチンプロモーターを包含する、真核生物細胞性プロモーターのような細胞プロモーター）を包含するが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる技術より当業者に明らかである。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、以下を包含するが、これらに限定されない：アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターのような異種プロモーター；RSウイルス(respiratory syncytial virus)（RSV）プロモーター；MMT プロモーターのような誘導プロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；ヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR（本明細書中上記の改変されたレトロウイルスLTRを包含する）；β−アクチンプロモーター；およびヒト増殖ホルモンプロモーター。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入するために使用され、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-1 9-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、および本明細書中でその全体が参考として援用される、Miller、Human Gene Therapy，第１巻、5-14頁（1990 ）に記載されるDAN細胞株を含むが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手法を通じてパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手法は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO₄沈澱を包含するが、これらに限定されない。１つの改変においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中へカプセル化され得るか、または脂質と結合し、次いで宿主に投与され得る。プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロ、またはインビボのいずれかにおいて、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚幹細胞、胚癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、および気管支の上皮細胞を包含するが、これらに限定されない。本発明はまた、診断としてのHDGF-2遺伝子の使用に関する。HDGF-2をコードする核酸配列における変異の検出は、疾患またはHDGF-2の過小発現を生じる疾患に対する感受性の診断を可能にする。ヒトHDGF-2遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組織バイオプシー、および剖検材料）より得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析前にPCRを用いることにより酵素的に増幅され得る（Saikiら、Nature、324:163-166(1986)）。RNAまたはcDNAもまた同じ目的のために使用され得る。一例として、本発明のポリペプチドをコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、HDGF-2変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により検出され得る。点突然変異は、放射標識されたHDGF -2 RNAまたは、あるいは、放射標識されたHDGF-2アンチセンスDNA配列に、増幅したDNAをハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全に対合した配列は、RNase A消化または融解温度の差により、ミスマッチした二本鎖と区別され得る。参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違は、直接配列決定法によって明らかにされ得る。さらに、クローン化DNAセグメントは、特異的なDNAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。本方法の感度は、PCRと組み合わせた場合、大いに増強される。例えば、配列決定プライマーは、二本鎖 PCR産物または改変PCRによって生成された一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用いる従来の手順によって、または蛍光タグを用いる自動配列決定手順によって行われる。 DNA配列の相違に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル中のDNAフラグメントの電気泳動の移動度における変化の検出により達成され得る。小さな配列の欠損および挿入は、高分離ゲル電気泳動により視覚化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミドグラジエントゲル上で区別され得る。このゲル中で、異なるDNAフラグメントの移動度は、それらの特異的な融解温度または部分的融解温度に従い、異なる位置に、ゲル中で、遅滞される（例えば、Myersら、Science、230:1242(1985)）。特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNas e保護およびS1保護または化学的切断法（例えば、cottonら、PNAS、USA、85:439 7-4401(1985)））により明らかにされ得る。従って、特定のDNA配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的切断、直接DNA配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多形(RFLP)）、およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法により達成され得る。より慣習的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析により検出され得る。本発明はまた、種々の組織におけるHDGF-2タンパク質のレベルの変化を検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サンプルと比較したこのタンパク質の過剰発現は、例えば、新生物において生じる異常な細胞の分化および増殖の存在を検出し得るからである。宿主に由来するサンプル中の HDGF-2タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者には周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、および好ましくは、ELISAアッセイを含む。ELISAアッセイは、最初にHDGF-2抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体がこのモノクローナル抗体に対して調製される。このレポーター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射能、蛍光、またはこの実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を結合させる。ここで、サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、ウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質を用いてインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされる。この間に、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合した任意のHDGF-2タンパク質に結合する。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液で洗い出される。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したレポーター抗体はここで、ディッシュ中に置かれ、HDGF-2と結合した任意のモノクローナル抗体に対するレポーター抗体の結合を生じる。次いで、非結合レポーター抗体は、洗い出される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに加えられ、そして所定の時間内の発色量は、標準曲線と比較した場合、患者サンプルの所定の容量中に存在するHDGF-2タンパク質の測定値である。競合アッセイが使用され得る。ここで、HDGF-2に特異的な抗体は、固体支持体に結合し、そして標識HDGF-2および宿主由来のサンプルは、固体支持体上を通過し、そして、固体支持体に結合した検出された標識の量は、サンプル中のHDGF-2 の量と相関し得る。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多形）に基づく染色体標識試薬はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させる重要な第１段階である。簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25 bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。この遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドの PCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的局在性(sublocalization)が達成され得る。その染色体に対してマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別(flo w-sorted)染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を含む。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、少なくとも50または60塩基を有するcDNAを用いて使用され得る。この技術の総説としては、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techni ques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、V．McK usick，Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medic al Libraryからオンラインで入手可能である）に見出される。次いで、同一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連結解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子でありそうである。物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度で、そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を含む。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株の培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(K ohlerおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁）が挙げられる。単鎖抗体を産生するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合し得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使用され得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、出現頻度の高い所定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、先行する小文字のｐおよび／またはそれに続く大文字および／または数字により命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には通常明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的のために、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントには、約２単位の酵素が約20μlの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜50μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８: 4 057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、同上、146頁)。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb，A.，Virology，52: 456-457(1973)の方法に記載のように実施された。実施例１ HDGF-2 タンパク質の細菌発現および精製 HDGF-2をコードするDNA配列（ATCC受託番号第号）を、タンパク質の５’ 配列および遺伝子に対する３’ベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。この遺伝子に対応するさらなるヌクレオチドを、５'および３'配列にそれぞれ添加した。HDGF-2の５'オリゴヌクレオチド TGFα-HIIコード配列が続く。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターpQE-9（Qiagen、 Inc．、Chatsworth、C A 91311）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQ E-9をBamHIおよびHindIIIで消化する。増幅された配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli M15/rep4株(Qiagen,Inc)を、Sambrook，J.ら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1 989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4は、 lacIリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Kan^r）をもまた付与するプラスミドpREP4のマルチコピーを含有する。形質転換体をLBプレート上で増殖する能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離して、制限酵素分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、 Amp（100μg/ml）およびKan（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させる。O/N培養物を用いて、1:100〜1:250の比で大規模培養物に接種する。細胞を、600の光学密度（O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にする。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化し、P/ Oリーディングを解読して遺伝子発現を増加することにより誘導する。細胞を３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により収集する。この細胞ペレットをカオトロピック薬剤6MグアニジンHCl中で可溶化する。明澄化の後、6-Hisタグを含有するタンパク質による緊密な結合を可能にする条件下でのニッケル−キレートカラムにおけるクロマトグラフィーによって、この溶液から可溶化HDGF-2 を精製する(Hochuli,Eら、J.Chromatography 411:177-184(1984))。このタンパク質を6MグアニジンHCl pH5.0でカラムから溶出し、そして復元のために3MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、および２mM グルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での12時間のインキュベーションの後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析した。実施例２バキュロウイルス発現系を用いるケモカインHDGF-2の発現および精製全長のHDGF-2タンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第号）を、遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。（配列番号５）を有し、そしてBamHI制限酵素部位（太字）、それに続く真核生物細胞における翻訳の開始に有効なシグナルに類似する６ヌクレオチド（Kozak ，M、J．Mol．Biol.，196，947-950，(1987)）を含み、HDGF-2遺伝子の25ヌクレオチドが続く（翻訳開始コドン「ATG」は下線を付される）。３’プライマーは、配列５’ GCATGGTACCTCACCTAGGAAGAAGGAGGTCTTCAC ３’（配列番号６）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼAsp718の切断部位およびHD GF-2遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な26ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamH IおよびAsp718で消化し、そして次いで再び１％アガロースゲルで精製した。このフラグメントをF2と称する。ベーターpA2（pVL941ベクターの改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を用いるHDGF-2タンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D. およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for bacul ovirus vectors and insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californ ica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列により両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pA2の代わり（例えば、pRG1，pAc373、pVL941、およびpAcIM1）に用いられ得る（Luckow，V.A.およびSummers，M.D.、Virology ，170:31-39）。プラスミドを制限酵素で消化し、そして次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。このベクターDNAをV2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。次いで、E．coli XL-1 Blue細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよび Asp718を用いて、HDGF-2遺伝子を有するプラスミド（pBac-HDGF-2）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。５μgのプラスミドpBac-HDGF-2を、リポフェクション法（Felgnerら Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化バキュロウイルス（「BaculoGold^TMbaculovirus DNA」，Pharmingen，San Diego， CA.）とともにコトランスフェクトした。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac-HDGF-2を、50 μlの無血清グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェション混合物を、無血清グレース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養法およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。連続希釈物の４日後、ウィルスを細胞に加え、そして青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ中で再懸濁した。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュに播種されたSf9細胞を感染するために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で増殖した。細胞を、感染多重度（MOI）２で、組換えバキュロウイルスV-HDGF-2で感染させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II 培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５μ Ciの³⁵S−メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。実施例３ COS 細胞における組換えHDGF-2の発現プラスミドCMV-HDGF-2 HAの発現は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invltro gen）に由来する：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．co li複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロン、およびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。完全なHDGF-2前駆体およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。それゆえ、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下で支配される。HAタグは、以前に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wllsonら、Cell 37，767(1984 )）。標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体での組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する：プラスミドベクターpBluescript中に含まれるHDGF-2をコードするDNA配列（AT CC受託番号第号）は、５’末端においてpBluescriptベクタープライマー（T 3）およびXhoI制限部位を含むHDGF-2コード配列の３’末端におけるHDGF-2特異的プライマーを用いるPCRによって増幅される。PCRを介した増幅後、得られたPC R産物を、BamHIおよびXhoIを用いて消化し、そしてXhoI制限部位の後ろにインフレームでHAタグを含む改変pcDNA-1ベクターに連結した。得られたプラスミドは、Ｃ末端でHAタグにインフレームで融合した全コード配列が続くHDGF-2の５’非翻訳領域を含む。連結混合物を、E．coli SURE株（Stratagene Cloning Systems,La Jolla，CA ）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析により試験する。組換えHDGF-2の発現のために、COS細胞を、DEAE-DEXTRAN法（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Man iatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Pre ss，(1989)）により発現ベクターでトランスフェクトする。HDGF-2-HAタンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法（E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）により検出する。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システインで８時間標識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM N aCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))(Wil son，I.ら、同上 37:767(1984))で溶解する。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させる。沈降したタンパク質を、 15％SDS-PAGEゲルで分析する。実施例４遺伝子治療を介した発現線維芽細胞を皮膚バイオプシーにより被験体から得る。生じた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小片を、各フラスコに約10片ずつ、組織培養フラスコの湿った表面上に置く。このフラスコを上下逆さに回し、堅く密封して室温で一晩放置する。室温で24時間後、このフラスコを逆さにし、そして組織の小片をフラスコの底に固定し、そして新鮮な培地（例えば10％FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシン含有Ham's F12培地、）を添加する。次いで、これを37℃で約１週間インキュベートする。このとき、新鮮な培地を添加し、そして続いて、２、３日毎に培地を交換する。さらなる２週間の培養後、線維芽細胞の単層が出現する。この単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコヘスケールアップする。 Moloneyマウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートの側面に配置されるp MV-7(Kirschmeler,P.T.ら、DNA,7:219-25(1988)を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、そして続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線状化ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを用いて精製する。本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ各５’および３’末端配列に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。５’プライマーはEcoRI部位を含有し、そして３’プライマーはさらにHindIII部位を含有する。等量のMoloneyマウス肉腫ウイルス線状化骨格と増殖したEcoRIおよびHidIIIフラグメントとを、T 4 DNAリガーゼの存在下に共に加える。生じた混合物を２つのフラグメントの連結のために適切な条件下に維持する。この連結混合物を用いて細菌HB101を形質転換し、次いで、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、これをカナマイシン含有アガー上にプレートする。アンフォトロピックpA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％仔ウシ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)中でコンフルエントな密度まで組織培養で増殖する。次いで、遺伝子を含有するMSVベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する。このパッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染ウイルス粒子を産生する（このパッケージング細胞はプロデューサー細胞といわれる）。形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、そして続いて、この培地をコンフルエントなプロデューサー細胞の10cmプレートから回収する。感染ウイルス粒子を含有する使用した培地を、ミリポアフィルターを通して濾過して未接着のプロデューサー細胞を取り除き、そして次いでこの培地を線維芽細胞の感染に使用する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから取り除き、プロデューサー細胞由来培地に素早く置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地に置き換える。ウイルスの力価が高い場合、次いで、実質的にすべての線維芽細胞が感染され、そして選択の必要はない。ウイルス力価が非常に低い場合、次いでneoまたはhisのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。次いで、単独でまたはサイトデックス(cytodex)３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖した後のいずれかで、操作された線維芽細胞を宿主に注入する。この線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。本発明の多数の改変および種々の変化が上記の教示に照らして可能であり、そしてそれゆえ、添付の請求の範囲の範囲内で、特に記載のない限りは本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたポリヌクレオチドであって、以下： (a)図１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b)ATCC受託番号第号に含まれるDNaによって発現するアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (c)(a)または(b)の該ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、そして該ポリヌクレオチドと少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド；および (d)(a)もしくは(b)または(c)の該ポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント、からなる群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。２．配列番号２のアミノ酸１〜249を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。３．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。４．請求項３に記載の前記ベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞。５．ポリペプチドを生成するプロセスであって、以下の工程：請求項４に記載の宿主細胞から該ポリペプチドによってコードされるポリペプチドを発現する工程、を包含する、プロセス。６．請求項３に記載のベクターを用いて、細胞を遺伝子操作する工程を包含する、ポリペプチドの発現が可能な細胞を生成するためのプロセス。７．(i)配列番号２の推定アミノ酸配列、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体を有するポリペプチド；および(ii)ATCC受託番号第号のcDNA によってコードされるポリペプチドならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体、からなる群から選択される、ポリペプチド。８．前記ポリペプチドが、図１のアミノ酸を含む、請求項13に記載のポリペプチド。９．請求項７に記載のポリペプチドに対する抗体。１０．請求項７に記載の前記ポリペプチドの活性化を阻害する化合物。１１．HDGF-2の必要性を有する患者の処置のための方法であって、以下：請求項７に記載の治療有効量のポリペプチドを該患者に投与する工程、を包含する、方法。１２．請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記治療有効量のポリペプチドを、該ポリペプチドをコードする患者のDNAに提供する工程、および該ポリペプチドをインビボで発現させる工程により投与する、方法。１３．HDGF-2ポリペプチドを阻害する必要性を有する患者の処置のための方法であって、以下：請求項１０に記載の治療有効量の化合物を患者に投与する工程；を包含する、方法。１４．患者において請求項７に記載のポリペプチドの過少発現に関する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプロセスであって、以下：患者由来のサンプルにおいて該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を同定する工程、を包含する、プロセス。１５．診断プロセスであって、以下：宿主由来のサンプルにおいて請求項７に記載の前記ポリペプチドの存在を分析する工程、を包含する、診断プロセス。１６．請求項７に記載のポリペプチドのアゴニストである化合物を同定する方法であって、以下の工程：該ポリペプチドのレセプターをその表面上で発現する細胞と化合物とを該レセプターへの結合を許容する条件下で接触させる工程であって、該レセプターは、該化合物の該レセプターへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合される、工程；および該化合物の該レセプターとの相互作用により生じるシグナルの存在を検出することによって、該化合物が該レセプターに結合し、そして活性化するかどうかを同定する工程、を包含する、方法。１７．請求項１３に記載のポリペプチドに結合し、そして活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、以下の工程： HDGF-2ポリペプチドおよびスクリーニングされるべき化合物と、HDGF-2レセプターポリペプチドをその表面上で発現する細胞をと該レセプターポリペプチドへの結合を許容する条件下で接触させる工程であって、該レセプターは、化合物の該レセプターポリペプチドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合される、工程；およびシグナルの非存在を検出することによって、該化合物がHDGF-2ポリペプチドを阻害するかどうかを同定する工程、を包含する、方法。