JPH11513883A - ヒト血管内皮増殖因子２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトVEGF2ポリペプチドおよびそのようなVEGF2ポリペプチドをコードするDNA(RNA)が開示される。組換え技術によってそのようなポリペプチドを産生するための手順、ならびにそのようなポリペプチドに対する抗体およびアンタゴニストも提供される。創傷治癒を刺激するため、および血管組織の修復のために、そのようなポリペプチドを使用する方法も開示される。腫瘍増殖、炎症を阻害するため、ならびに糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を処置するために、このアンタゴニストを使用する方法も提供される。宿主由来のサンプル中の、VEGF2コード配列における変異、およびVEGF2タンパク質の濃度の変化を検出するための診断方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト血管内皮増殖因子２ 本出願は、Rosen，C.らによって1994年３月８日に米国特許商標庁に出願され 、そして出願番号第08/207,550号を与えられた先の出願の一部継続出願である。 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に 関する。本発明のポリペプチドは、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーとし て同定された。より詳細には、本発明のポリペプチドは血管内皮増殖因子２であ り、時折、本明細書中以下で「VEGF2」という。本発明はまた、そのようなポリ ペプチドの作用を阻害することに関する。 新たな血管の形成、すなわち脈管形成は、胚の発生、それに続く成長、および 組織修復のために必須である。しかし、脈管形成は、新生物(例えば、腫瘍およ び神経膠腫)のような特定の病的状態に必須な部分である。そして異常な脈管形 成は、炎症、慢性関節リウマチ、乾唐、および糖尿病性網膜症のような他の疾患 に関連する(Folkman，J.およびKlagsbrun，M.，Science 235:442-447，(1987)) 。 酸性および塩基性の両方の線維芽細胞増殖因子分子は、内皮細胞および他の細 胞タイプについてのマイトジェンである。アンギオトロピン(angiotropin)およ びアンギオゲニンは脈管形成を誘導し得るが、これらの機能は不明である(Folkm an，J.，1993，Cancer Medicine 153-170頁，Lea and Febiger Press)。血管内 皮細胞に対して高度に選択的なマイトジェンは、血管内皮増殖因子、すなわちVE GFであり(Ferrara，N.ら、Endocr．Rev．13:19-32，(1992))、血管透過因子(VPF )としても知られる。血管内皮増殖因子は、その標的細胞特異性が血管内皮細胞 に制限されているようである、分泌される脈管形成マイトジェンである。 マウスVEGF遺伝子は、特徴付けられ、そして胚形成におけるその発現パターン が解析された。VEGFの持続的な発現が、有窓内皮に隣接する上皮細胞において( 例えば、脈絡叢および腎糸球体において)観察された。このデータは、内皮細胞 の増殖および分化の多機能性レギュレーターとしてのVEGFの役割に一致した。(B reier，G.ら、Development，114:521-532(1992)。 VEGFは、間葉細胞についてのマイトジェンである血小板由来増殖因子(PDGF)の α鎖およびβ鎖、ならびに内皮細胞マイトジェンである胎盤増殖因子(PLGF)に構 造的に関連する。これらの３つのタンパク質は、同一のファミリーに属し、そし て保存されたモチーフを共有する。ジスルフィド結合の形成に寄与する８つのシ ステイン残基は、これらのタンパク質において厳密に保存される。オルタナティ ブスプライシングされたmRNAが、VEGF，PLGF、およびPDGFのいずれにおいても同 定されており、そしてこれらの異なるスプライシング産物は、生物学的活性およ びレセプター結合特異性が異なる。VEGFおよびPDGFは、ホモ二量体またはヘテロ 二量体として機能し、そしてレセプターに結合する。このレセプターは、レセプ ターの二量体化の後に内因性のチロシンキナーゼ活性を顕す。 VEGFは、オルタナティブスプライシングによる、121、165、189、および206ア ミノ酸の４つの異なる形態を有する。VEGF121およびVEGF165は、可溶性でありそ して脈管形成を促進し得る。一方、VEGF189およびVEGF206は、細胞表面中のヘパ リン含有プロテオグリカンに結合される。VEGFの時期的および空間的な発現は、 血管の生理学的増殖に相関していた(Gajdusek，C.M.,およびCarbon，S.J.，Cell Physiol.，139:570-579，(1989); McNeil，P.L.，Muthukrishnan，L.，Warder ，E.，D'Amore，P.A.，J．Cell．Biol.，109:811-822,(1989))。その高親和性結 合部位は、組織切片において内皮細胞上のみに位置付けられる(Jakeman，L.B.ら 、Clin．Invest．89:244-253，(1989))。この因子は下垂体細胞およびいくつか の腫瘍細胞株から単離され得、そしてある種のヒト神経膠腫と関係している(Pla te，K.H．Nature 359:845-848，(1992))。興味深いことに、VEGF121またはVEGF1 65の発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に、ヌードマウス中で腫瘍を形成 する能力を与える(Ferrara，N.ら、J．Clin．Invest．91:160-170，(1993))。抗 VEGFモノクローナル抗体によるVEGF機能の阻害は、免疫欠損マウスにおける腫瘍 増殖を阻害することが示された(Kim，K.J.，Nature 362:841-844，(1993))。さ らに、VEGFレセプターのドミナントネガティブ変異体が、マウスにおける膠芽腫 増殖を阻害することが示された。 血管透過因子はまた、傷害の停止後でさえも血漿タンパク質に対する持続的な 微小血管の高透過性(microvascular hyperpermeability)(これは、正常な創傷治 癒の特徴的な特性である)を担うことが見出されている。これは、VPFが、創傷治 癒における重要な因子であることを示唆する。Brown，L.F.ら、J．Exp．Med.，1 76:1375-9(1992)。 VEGFの発現は、血管新生した組織(例えば、肺、心臓、胎盤、および固形腫瘍) において高く、そして時間的および空間的の両方で脈管形成に相関する。VEGFは また、インビボで脈管形成を誘導することが示されている。脈管形成は正常組織 、特に血管組織の修復に必須であるので、VEGFは血管組織修復を促進させること における使用が提案されてきた(例えば、アテローム性動脈硬化症において)。 Chenらに1991年12月17日に発行された米国特許第5,073,492号は、適切な環境 において内皮細胞の増殖を相乗的に増強するための方法を開示する。この方法は 、環境にVEGF、エフェクター、および血清由来因子を添加する工程を包含する。 また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットDNAが、ポリメラーゼ連鎖反応技術 により調製された。このDNAは、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれとして も存在し得るタンパク質をコードする。このタンパク質は、哺乳動物血管内皮細 胞マイトジェンであり、そして、1992年９月30日に公開された欧州特許出願第92 302750.2号に開示されるように、それ自体が血管の発達および修復の促進のため に有用である。 本発明のポリペプチドは、ヒトVEGFに対するアミノ酸配列相同性に基づいて、 新規な血管内皮増殖因子として推定的に同定された。 本発明の１つの局面によれば、新規な成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に 活性な、そして診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナログ、お よび誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のポリペプチドで ある。 本発明の別の局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離された核 酸分子が提供される。この核酸分子は、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびに 生物学的に活性な、そして診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、ア ナログ、および誘導体を含む。 本発明のなお別の局面によれば、組換え技術により、そのようなポリペプチド を産生するためのプロセスが提供される。このプロセスは、本発明のポリペプチ ドをコードする核酸配列を含む、組換え原核生物宿主細胞および／または組換え 真核生物宿主細胞を、このタンパク質の発現およびその後のこのタンパク質の回 収を促進する条件下で培養する工程を包含する。 本発明のなおさらなる局面によれば、治療的目的のため(例えば、脈管形成の 刺激のため、創傷治癒の刺激のため、および血管組織の修復の促進のため)に、 そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌク レオチドを利用するためのプロセスが提供される。 本発明のなお別の局面によれば、そのようなポリペプチドに対する抗体が提供 される。 本発明のなお別の局面によれば、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニ ストが提供され、これは、例えば、腫瘍の増殖を阻害するため、糖尿病性網膜症 、炎症、慢性関節リウマチ、および乾癖の処置のために、そのようなポリペプチ ドの作用を阻害するために使用され得る。 本発明の別の局面によれば、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズする に十分な長さの核酸分子を含む、核酸プローブが提供される。 本発明の別の局面によれば、本発明の核酸配列およびそのような核酸配列にコ ードされるタンパク質における変異に関する疾患または疾患に対する感受性を診 断する方法が提供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベク ターの製造に関連するインビトロの目的のために、そのようなポリペプチド、ま たはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するプロセス が提供される。 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ るべきである。 以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含 される本発明の範囲を限定することを意味しない。 図１は、本発明のcDNA配列、および本発明のポリペプチドの対応する推定アミ ノ酸配列を示す。アミノ酸についての標準的な１文字略号を使用する。配列決定 を、373自動化DNAシーケンサー(Applied Biosystems，Inc.)を使用して行なった 。配列決定の精度は、97％より大きいことが予測される。 図２は、本発明のポリペプチドとヒトPDGF/VEGFファミリーの他のメンバーと の間のアミノ酸配列相同性の実例である。ボックス領域は、保存された配列およ び８つの保存されたシステイン残基の位置を示す。 図３は、本発明のポリペプチドのインビトロでの転写、翻訳、および電気泳動 の後のゲルの写真を示す。レーン１：¹⁴Ｃおよびレインボー分子量マーカー；レ ーン２：FGFコントロール；レーン３：M13逆方向プライマーおよびM13正方向プ ライマーによって産生されたVEGF2；レーン４：M13逆方向プライマーおよびVEGF -F4プライマーによって産生されたVEGF2；レーン５：M13逆方向プライマーおよ びVEGF-F5プライマーによって産生されたVEGF2。 図４。VEGF2ポリペプチドは、Sf9細胞からなるバキュロウイルス系において発 現される。培地および細胞の細胞質由来のタンパク質を、還元条件下および非還 元条件下でSDS-PAGEによって分析した。 図５。本発明の核酸配列で感染したSf9細胞由来の培地を沈澱させ、そして再 懸濁した沈澱をSDS-PAGEによって分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで 染色した。 図６。VEGF2を培地上清から精製し、そして還元剤であるβ-メルカプトエタノ ールの存在下および非存在下でSDS-PAGEによって分析し、そしてクマシーブリリ アントブルーで染色した。 図７。RP-300カラム(0.21×3cm、Applied Biosystems，Inc.)を使用した精製V EGF2の逆相HPLC分析。カラムを0.1％のトリフルオロ酢酸(溶媒A)で平衡化し、そ してタンパク質を、０％〜60％の溶媒Ｂ(0.07％TFAを含むアセトニトリルからな る)の7.5分間の勾配で溶出した。タンパク質溶出を、215nm(赤線)および280nm( 青線)の吸光度でモニターした。溶媒Ｂの％を緑線で示す。 図８は、塩基性線維芽細胞増殖因子との比較における、血管内皮細胞の増殖へ の部分精製VEGF2タンパク質の影響を例示する。 図９は、血管内皮細胞の増殖への精製VEGF2タンパク質の影響を例示する。 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントを意味 する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域(リーダーおよび トレイラー)、ならびに個々のコードセグメント(エキソン)の間の介在する配列( イントロン)を含む。 本発明の１つの局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペ プチド、またはATCC受託番号97161として1995年５月24日に寄託されたクローン のcDNAにコードされる成熟ポリペプチド、または図１に示すアミノ酸残基よりも 少ないアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子(ポ リヌクレオチド)が提供される。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、初期のヒト胚(８〜 ９週)破骨細胞腫、成人心臓またはいくつかの乳癌細胞株から得られ得る。本発 明のポリヌクレオチドは、９週齢の初期のヒト胚由来cDNAライブラリー中に発見 された。これは、VEGF/PDGFファミリーに構造的に関連する。VEGF2は、419アミ ノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。この 最初のおよそ23アミノ酸残基は推定のリーダー配列であり、その結果、成熟タン パク質は396アミノ酸を含む。そしてこのタンパク質は、ヒト血管内皮増殖因子 に対して最大のアミノ酸配列相同性(30％の同一性)を示し、PDGFα(23％)および PDGFβ(22％)がそれに続く。 ８つすべてのシステインが、ファミリーの４つのメンバー内すべてで保存され ることは特に重要である(図２の四角で囲んだ領域を参照のこと)。さらに、PDGF /VEGFファミリーの特徴であるPXCVXXXRCXGCCN(配列番号３)が、VEGF2において保 存される(図２を参照のこと)。 本発明のVEGF2ポリペプチドは、全長ポリペプチドならびに任意のリーダー配 列および全長ポリペプチドの活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配 列を含むことが意図される。活性フラグメントは、配列番号２および図２に示す 全長アミノ酸配列の419アミノ酸の全てよりも少ないアミノ酸を有するが、図２ において保存されることが示される８つのシステイン残基をなお含み、そしてそ のようなフラグメントはVEGF2活性をなお含む、全長アミノ酸配列の任意の部分 を含むことを意図する。 正常組織には、少なくとも２つのオルタナティブスプライシングされたVEGF2m RNA配列が存在する。全長および短縮型のそれぞれに対応する２つのVEGF2 mRNA 配列のサイズを、図３に示す。レーン５は、本発明のVEGF2ポリペプチドをコー ドするオルタナティブスプライシングされたmRNAの存在を示す２本のバンドを示 す。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態(このDNAは、cDNA、 ゲノムDNA、および合成DNAを包含する)であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で あり得、そして一本鎖である場合は、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖 であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配 列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコー ド配列が、遺伝コードの重複性または縮重の結果として、図１のDNAまたは寄託 したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なるコード配列であり得る。 図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコ ード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列(および随意のさらなるコード配 列)および非コード配列(例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配 列の5'および/または3'の非コード配列)。 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列およ び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託 したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナロ グ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関 する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺 伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。 従って本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクロ ーンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は 、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペ プ チドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。そのようなヌクレ オチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を包含 する。 本明細書中上記で示したように、このポリヌクレオチドは、図１に示すコード 配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体で あるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１ 以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列 の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させ ない。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列 は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する 、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、 例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が使用される場合は 、ヘマグルチニン(HA)タグであり得る。HAタグはインフルエンザヘマグルチニン タンパク質に由来するエピトープと一致する(Wilson，I.ら、Cell，37:767(1984 ))。 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントを意味 する；これは、コード領域に先行する領域および後に続く領域(リーダーおよび トレイラー)、ならびに個々のコードセグメント(エキソン)の間の介在する配列( イントロン)を含む。 本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全長cDNAを単離するため、およびこの 遺伝子に対する高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他のcDNAを単 離するための、cDNAライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブと して使用され得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも30塩基を有 し、そして、例えば、50以上の塩基を含み得る。このプローブをまた、全長転写 物に対応するcDNAクローン、およびゲノムクローン、または調節領域およびプロ モーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含むクローンを 同定するために使用し得る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプロー ブを合成するために公知のDNA配列を使用して、遺伝子のコード領域を単離する 工程を包含する。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴ ヌクレオチドを使用して、ヒトのcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリー をスクリーニングし、このライブラリーのどのメンバーにこのプローブがハイブ リダイズするかを決定する。 本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、そし てより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配 列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中 上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ ヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件 」は、配列間に少なくとも95％、および好ましくは少なくとも97％の同一性が存 在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味する。好ましい実 施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ クレオチドは、図１(配列番号１)のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる 成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する ポリペプチドをコードする。 あるいは、ポリヌクレオチドは、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、そし てより好ましくは少なくとも50塩基を有し得、これは本発明のポリヌクレオチド にハイブリダイズし、そしてこれは本明細書中上記のように、それらに対する同 一性を有し、そしてこれは活性を保持していてもいなくてもよい。例えば、その ようなポリヌクレオチドを、配列番号１のポリヌクレオチドについてのプローブ として、例えばこのポリヌクレオチドの回収のために、または診断プローブとし て、またはPCRプライマーとして使用し得る。 従って、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも90％、そしてより好ま しくは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにそれらのフ ラグメント(このフラグメントは少なくとも30塩基、そして好ましくは少なくと も50塩基を有する)、そしてそのようなポリヌクレオチドにコードされるポリペ プチドに関する。 本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約の約定の下に維持される。これらの寄託物は、単に当業者への 便宜のために提供されるのみであり、そして米国特許法第112条の下で寄託が必 要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配 列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書 中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛 盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が 必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではな い。 本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したcDNA によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのようなポ リペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。 用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプ チドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合は、図２に示す VEGFタンパク質の保存されたモチーフ、および本質的に同じ生物学的な機能また は活性を保持するポリペプチドを意味する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または 合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 図１のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフ ラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)そこで１以上のアミノ酸残基が保 存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)で置換され、そして そのような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによりコードされるアミノ 酸残基であり得るかあり得ないもの、または(ii)そこで1以上のアミノ酸残基が 置換基を含有するもの、または(iii)そこで成熟ポリペプチドがポリペプチドの 半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合 物に融合されているもの、または(iv)そこでさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチ ドに融合されているもの、または(v)そこで配列番号２に示すより少ないアミノ 酸残基を含み、そして保存されたモチーフを保持し、そしてなお依然としてVEGF ファミリーのポリペプチドの特徴的な活性を保持しているものであり得る。その ようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業 者の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態 で提供され、そして好ましくは均質に精製される。 用語「単離された」は、物質がその本来の環境(例えば、それが天然に存在す る場合は、天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きて いる動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは 、単離されているわけではなく、しかし天然の系において共存する物質の幾らか または全部と分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単 離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および ／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であ り得るが、それにもかかわらずそのようなベクターまたは組成物はその天然の環 境の一部ではない、という点で単離されている。 本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド(特に成熟ポリペプチド) 、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも70％の類似性(好まし くは少なくとも70％の同一性)を有するポリペプチド、そしてより好ましくは配 列番号２のポリペプチドに対して少なくとも90％の類似性(より好ましくは少な くとも90％の同一性)を有するポリペプチド、そしてさらにより好ましくは配列 番号２のポリペプチドに対して少なくとも95％の類似性(さらにより好ましくは 少なくとも95％の同一性)を有するポリペプチドを含み、そのようなポリペプチ ドの部分もまた含むにのポリペプチドのそのような部分は、一般に、少なくとも 30アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含む)。 当該分野に公知であるように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つ のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリ ペプチド配列に対して比較することによって決定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分を、ペプチド合成により対応 する全長ポリペプチドを産生するために使用し得る；従って、このフラグメント は、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用し得る。本発明のポリ ヌクレオチドのフラグメントまたは部分を、本発明の全長ポリヌクレオチドを合 成するために使用し得る。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ チドの産生に関する。 宿主細胞は、本発明のベクター(これは、例えば、クローニングベクターまた は発現ベクターであり得る)を用いて遺伝子操作(形質導入されるか、または形質 転換されるか、またはトランスフェクトされる)される。ベクターは、例えば、 プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細 胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または本発明のVEGF2遺 伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地において培養され得る。培 養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用 された条件であり、そして当業者には明らかである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す るための種々の発現ベクターの任意の１つに含まれ得る。そのようなベクターは 、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。そのよう なベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキ ュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに 由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂 犬病のようなウイルスDNAを包含する。しかし、宿主中で複製可能で、そして存 続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。 適切なDNA配列は、種々の手順によりベクター中に挿入され得る。一般に、DNA 配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入さ れる。そのような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。 発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列(プロモーター)に作動的に 連結され、mRNAの合成を指示する。そのようなプロモーターの代表的な例として は、以下が挙げられる：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはtrp、λ ファージP_Lプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそれ らのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。 発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネ ーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し 得る。 さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため の表現型形質(例えば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター ゼまたはネオマイシン耐性、またはE.coliにおけるテトラサイクリン耐性または アンピシリン耐性)を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。 本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質 を発現させるために用いられ得る。 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞(例えば、E .coli 、Streptomyces 、Salmonella typhimurium)；真菌細胞(例えば酵母)；昆 虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9)；動物細胞(例えば、CHO 、COS、またはBowes黒色腫)；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選 択は、本明細書の教示により当業者の範囲内であると考えられる。 さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む 組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクターま たはウイルスベクター)を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向 または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物 はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを包含 する)を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ り、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQ E70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescriptS K、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3、 pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、 pXT1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG，pSVL(Pharmacia)。しかし、それ らが宿主中で複製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のプラスミドま たはベクターも使用され得る。 プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクタ ーまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子か ら選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特によ く知られた細菌性プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびt rpを包含する。真核生物性プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、 初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスＩ型メタロ チオネインを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当 業者のレベル内である。 さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。 宿主細胞は、高等真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核生物細胞 (例えば、酵母細胞)であり得るか、または宿主細胞は原核生物細胞(例えば、細 菌細胞)であり得る。宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトラン スフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレク トロポレーションにより達成され得る(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Me thods in Molecular Biology，(1986))。 宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する ために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは 、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で、適切な プロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、そのようなタンパ ク質を産生するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得 る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクター および発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)(この開示は、本明細書中に参考と して援用される)に記載される。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ ー内にエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーはDNAの シス作用性エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモータ ーに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点(bp100〜270)の後期 側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー 、 複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ ーが挙げられる。 一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と する選択マーカー(例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisia e のTRPI遺伝子)および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロ モーターを含有する。そのようなプロモーターは、特に解糖酵素(例えば、3-ホ スホグリセリン酸キナーゼ(PGK))、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショ ックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳 開始配列および翻訳終結配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周 辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立て られる。随意に、異種配列は、所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド(例えば 、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製)を含む融合タンパク 質をコードし得る。 細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DN A配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的なプ ロモーターで作動可能な読みとり相で挿入することにより構築される。ベクター は、ベクターの維持を確実にし、そして所望により宿主内での増幅を提供するた めに１つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を含有する。形質転換のた めに適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimur ium 、およびPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々 の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。 代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは 、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含む市 販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。 そのような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，U ppsala，Sweden)およびGEMI(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を包含する。 これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造 配列と組み合わされる。 適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて 、 選択されたプロモーターは適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)に より誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。 細胞は、代表的には遠心分離により回収され、物理的手段または化学的手段に より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音 波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ り破砕され得、そのような方法は、当業者に周知である。 種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い られ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載された サル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞 株(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株)を包含する。哺乳動物発 現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そし て任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部 位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング 非転写配列をも含む。SV40スプライスに由来するDNA配列およびポリアデニル化 部位は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。 ポリペプチドは、以下の方法により組換え細胞培養物から回収および精製され 得る。これらの方法は、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまた は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎 水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロ キシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを包 含する。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ(refolding)工程が、成熟タ ンパク質を完全な配置とするために使用され得る。最終的に、高性能液体クロマ トグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。 本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物または化学合成手順の産物で あり得るか、または原核生物宿主または真核生物宿主(例えば、培養中の細菌、 酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞)から組換え技術により産生され得 る。組換え産生手順に用いられる宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコ シル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはま た、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 図８および９に示すように、最初の46アミノ酸を除いた配列番号２のVEGF2ポ リペプチドは、血管内皮細胞についての強力なマイトジェンであり、そしてその 増殖および分化を刺激する。このポリペプチドをコードするVEGF2核酸配列につ いて行なったノーザンブロット解析にこで、いくつかのヒト組織由来の20μgのR NAを³²Ｐ-VEGF2でプローブした)の結果、このタンパク質が心臓および肺におい て活発に発現し、このことはマイトジェン活性のさらなる証拠であることを示す 。 従って、VEGF2を、脈管形成を促進し、例えば、冠状動脈バイパス外科手術が 行なわれる移植組織の増殖を刺激するために使用し得る。VEGF2をまた、創傷治 癒を促進するため、特に、損傷を受けた組織を血管再生させるか、または虚血の 間および新しい毛細管の脈管形成が所望される場所での側副血流を刺激するため に使用し得る。VEGF2を、皮膚の潰瘍(褥癒を含む)、静脈の潰瘍、および糖尿病 性潰瘍のような全層創傷を処置するために使用し得る。さらに、VEGF2を、皮膚 移植片または皮弁が全層熱傷および全層損傷を修復するために使用される、この ような熱傷および損傷を処置するために使用し得る。VEGF2をまた、例えば、外 傷による裂傷および外科手術に関連する切断の修復のために、形成外科における 使用のために使用し得る。 これらと同じようにして、VEGF2を、損傷を受けた骨、歯周組織、または靭帯 組織の増殖を誘導するために使用し得る。VEGF2をまた、疾患および外傷によっ て損傷を受けた歯の支持組織(セメント質および歯周靭帯を含む)を再生するため に使用し得る。 脈管形成は創傷を清潔かつ非感染に保つのに重要であるので、VEGF2を、外科 手術に関連して、および切断の修復後に使用し得る。VEGF2をまた、感染の危険 性が高い腹部創傷の処置のために使用し得る。 VEGF2を、血管移植手術において内皮形成(endothelialization)を促進するた めに使用し得る。移植された材料または合成した材料のいずれかを用いる血管移 植片の場合、VEGF2を移植片の表面または連結部に適用して血管内皮細胞の増殖 を促進し得る。VEGF2をまた、心筋梗塞の結果としての心筋組織の損傷を修復す るために使用し得る。VEGF2をまた、虚血後の心血管系を修復するために使用し 得る。VEGF2をまた、冠状動脈疾患、ならびに末梢および中枢神経系の血管疾患 の結果として損傷を受けた血管組織を処置するために使用し得る。 VEGF2をまた、身体内に移植されるべき人工の補てつ物または天然の器官を被 覆して移植材料の拒絶反応を最少にし、そして移植された材料の血管新生を刺激 するために使用し得る。 VEGF2をまた、例えば、アテローム性動脈硬化症の間に生じ、そして血管組織 が損傷を受けるバルーン血管形成の後に必要とされる、血管組織の修復のために 使用し得る。 VEGF2核酸配列およびVEGF2ポリペプチドをまた、科学的研究、DNAの合成、お よびDNAベクターの製造に関連するインビトロの目的のため、およびヒトの疾患 を治療するための診断薬および治療薬の産生のために使用し得る。例えば、VEGF 2を、血管内皮細胞のインビトロでの培養のために使用し得、ここで、VEGF2は10 pg/ml〜10ng/mlの濃度で条件的培地に添加される。 全長VEGF2遺伝子のフラグメントを、cDNAライブラリーのためのハイブリダイ ゼーションプローブとして使用して、この遺伝子に対する高い配列類似性または 同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離し得る。このタイプのプローブは 、一般に、少なくとも50塩基対を有するが、それらはさらに多数の塩基を有し得 る。このプローブをまた、全長転写物に対応するcDNAクローン、ならびに調節領 域およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全なVEGF2遺 伝子を含むゲノムクローン(単数または複数)を同定するために使用し得る。スク リーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のDN A配列を使用するVEGF2遺伝子のコード領域を単離する工程が挙げられる。本発明 の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを使用して 、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングし、この ライブラリーのどのメンバーがこのプローブとハイブリダイズするかを決定する 。 本発明は、VEGF2レセプターの同定のための方法を提供する。このレセプター をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法(例えば、リガンドパンニン グおよびFACSソーティング(Coliganら、Current Protocols in Immun.,1(2),第 ５章、(1991)))によって同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使用し 、 ここで、ポリアデニル化されたRNAをVEGF2に応答する細胞から調製し、そしてこ のRNAから作製したcDNAライブラリーをプールに分割し、そしてCOS細胞またはVE GF2に応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラススラ イド上で増殖するトランスフェクトされた細胞を、標識したVEGF2に曝す。VEGF2 を、部位特異的タンパク質キナーゼについての認識部位のヨウ素化または封入を 含む、種々の手段によって標識し得る。固定およびインキュベーションに続いて 、スライドをオートラジオグラフィー分析に供する。陽性のプールを同定し、そ してサブプールを調製し、そして反復サブプール化および再スクリーニングプロ セスを用いて再度トランスフェクトし、最終的に推定のレセプターをコードする 単一のクローンを生じる。 レセプター同定のための別のアプローチとして、標識したVEGF2は、細胞膜に 光学的親和的に結合され得るか、またはレセプター分子を発現する抽出調製物で あり得る。架橋した材料をPAGEによって分離し、そしてＸ線フィルムに曝す。次 いで、VEGF2を含有する標識した複合体を取り出し、ペプチドフラグメントに分 解し、そしてタンパク質微量配列決定に供する。微量配列決定から得られたアミ ノ酸配列を使用して、縮重オリゴヌクレオチドプローブの対を設計し、cDNAライ ブラリーをスクリーニングして推定のレセプターをコードする遺伝子を同定する 。 本発明はまた、VEGF2のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を同定 するための化合物のスクリーニング方法に関する。そのような方法の１例は、コ マイトジェンCon Aの存在下でヒト内皮細胞の増殖を顕著に刺激するVEGF2の能力 を利用する。内皮細胞を得、そしてCon-A(Calbiochem，La Jolla，CA)を補充し た反応混合物中で96ウェル平底培養プレート(Costar，Cambridge，MA)で培養す る。Con-A、本発明のポリペプチド、およびスクリーニングされるべき化合物を 添加する。37℃でのインキュベーションの後、[³H]を取り込むに十分な時間、１ μCiの³[H]チミジン(５Ci/mmol；１Ci=37BGq；NEN)を培養物に適用し、そしてグ ラスファイバーフィルター(Cambridge Technology，Watertown，MA)上に回収す る。３連の培養物の平均の³[H]チミジン取り込み(cpm)を、液体シンチレーショ ンカウンター(Beckman Instruments，Irvine，CA)を使用して決定する。化合物 を除去するコントロールアッセイと比較して有意な[³H]チミジン取り込みは、内 皮細胞増殖の刺激を示す。 アンタゴニストについてアッセイするために、上記のアッセイを行ない、そし て化合物がVEGF2の存在下での³[H]チミジン取り込みを阻害する能力は、この化 合物がVEGF2に対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、VEGF2アンタ ゴニストを、競合阻害アッセイに適切な条件下で、VEGF2および潜在的なアンタ ゴニストと、膜に結合したVEGF2レセプターまたは組換えレセプターとを組み合 わせることによって検出し得る。VEGF2を、例えば、放射能によって標識し得、 その結果、レセプターに結合したVEGF2分子の数が潜在的なアンタゴニストの有 効性を決定し得る。 あるいは、VEGF2とレセプターとの相互作用の後の公知のセカンドメッセンジ ャーシステムの応答を、この化合物の存在下または非存在下で測定し、そして比 較する。そのようなセカンドメッセンジャーシステムは、cAMPグアニル酸シクラ ーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解を包含するが、これ らに限定されない。別の方法において、VEGF2レセプターを発現する哺乳動物細 胞または膜調製物を、この化合物の存在下で、標識したVEGF2と共にインキュベ ートする。次いで、この相互作用を増強またはブロックする、この化合物の能力 を測定し得る。 潜在的なVEGF2のアンタゴニストは、抗体、またはある場合にはオリゴヌクレ オチドを含み、これはこのポリペプチドに結合し、そしてVEGF2の機能を有効に 消去させる。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、VEGF2レセプターに結合す る、密接に関連するタンパク質であり得るが、しかし、それらはこのポリペプチ ドの不活性な形態であり、それによりVEGF2の作用を妨げる。これらのアンタゴ ニストの例は、VEGF2ポリペプチドのネガティブドミナント変異体を包含し、例 えば、VEGF2のヘテロ二量体形態の一方の鎖は優性であり得、そして生物学的活 性を保持しないように変異し得る。ネガティブドミナント変異体の例は、二量体 VEGF2の短縮版を包含する。これは別の二量体と相互作用して、野生型VEGF2を形 成し得るが、しかし得られるホモ二量体は不活性であり、特徴的なVEGF活性を示 すことができない。 別の潜在的なVEGF2アンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製され るアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を、３重らせんの形成またはア ンチセンスDNAまたはRNAを介して遺伝子発現を制御するために使用し得る。これ らの方法は両方ともDNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば 、このポリヌクレオチド配列の５'コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドを コードし、約10〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計 するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、遺伝子の転写に関与する領 域に相補的であるように設計され(三重らせん-Leeら、Nucl．Acids Res.，6:307 3(1979); Cooneyら、Science，241:456(1988);およびDervanら、Science，251:1 360(1991)を参照のこと)、それにより、VEGF2の転写および産生を妨げる。アン チセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、そし てmRNA分子のVEGF2ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス-Okano， J．Neurochem.，56:560(1991); 遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとして のオリゴデオキシヌクレオチド、CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。上記のオ リゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果、アンチセンスRNAまた はDNAがインビボで発現してVEGF2の産生を阻害し得る。 潜在的なVEGF2アンタゴニストはまた、ポリペプチドの活性部位に結合し、そ してこの部位を占め、それにより基質が触媒部位に接近できないようにし、その 結果、正常な生物学的活性が妨げられる、低分子を含む。低分子の例は、低分子 ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定されない。 アンタゴニストは、固形腫瘍転移に必要な限定的な脈管形成を処置するために 使用され得る。 VEGF2をコードするmRNAは、少なくとも２種の乳癌細胞株において中程度のレ ベルで発現されることが見出される。このことは、悪性の表現型におけるVEGF2 ポリペプチドの役割を示す。神経膠腫はまた、本発明のアンタゴニストで処置さ れ得る新生物の１つのタイプである。 アンタゴニストはまた、血管透過性の増大により引き起こされる慢性炎症を処 置するために使用され得る。これらの疾患に加えて、アンタゴニストはまた、糖 尿病に関連する網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を処置するために使用さ れ得る。 アンタゴニストを、薬学的に受容可能なキャリア(例えば、本明細書中以下に 記載するような)を有する組成物中で使用し得る。 VEGF2ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬 学的キャリアと組み合わせて使用され得る。そのような組成物は、治療的有効量 のポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニスト、および薬学的に受容 可能なキャリアまたは賦形剤を含む。そのようなキャリアは、生理食塩水、緩衝 化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれら の組合せを包含するが、これらに限定されない。処方物は、投与の様式に合わせ るべきである。 本発明はまた、１つ以上の本発明の薬学的組成物の成分で充填した１つ以上の 容器を備えた薬学的パックまたはキットを提供する。そのような容器には、薬剤 または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によって指定 される形式の通知を伴い得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、ま たは販売の機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他の治療用化合物 と組み合わせて使用され得る。 薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、ま たは皮内経路のような便利な方法で投与され得る。薬学的組成物は、特定の適応 症を処置および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、薬学的組 成物は、少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合はこ れらは一日あたり約８mg/kg体重を超えない量で投与される。ほとんどの場合、 投薬は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約10μg/kg体重〜約１mg/k g体重である。 VEGF2ポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニストまたはアンタゴニ ストはまた、インビボでのそのようなポリペプチドの発現により本発明に従って 用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。 従って、例えば、骨髄細胞のような細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌ クレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作され た細胞はポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。そのような方法は当 該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNA を含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操 作され得る。 同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分 野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発 明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた めのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボで のポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。そのような方法により本発 明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教 示により当業者には明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発 現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以外のもの(例えば、アデノウイルス)であり 得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作す るために使用され得る。 本明細書中上記で述べたレトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレ トロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイ ルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウ イルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス)、アデノウイル ス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを包含するが、これらに限定 されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モ ロニーマウス白血病ウイルスに由来する。 ベクターは１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーター は、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス( CMV)プロモーター(Millerら、Biotechniques，第７巻、第９号，980-990(1989) に記載される)、または他の任意のプロモーター(例えば、真核生物細胞性プロモ ーターのような細胞プロモーター(ヒストン、pol III、およびβアクチンのプロ モーターを包含するが、これらに限定されない))を包含するが、これらに限定さ れない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモータ ー、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモータ ーを包含するが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細 書中に含まれる教示から、当業者に明らかである。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下 にある。使用され得る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモー ターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス(CMV) プロモーターのような異種プロモーター；RSウイルス(RSV)プロモーター；MMTプ ロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱シ ョックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロ ビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイル スチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR(本明細書上記の改変した レトロウイルスLTRを含む)；β-アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモ ンプロモーターを包含するが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポ リペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得る パッケージング細胞の例は、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-1 9-17-H2、ψCRE、ψCRIP，GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞株(その全体が 本明細書中で参考として援用される、Miller，Human Gene Therapy，第１巻、5- 14頁(1990)に記載される)を包含するが、これらに限定されない。ベクターは、 当該分野で公知の任意の手段を介してパッケージング細胞を形質導入し得る。そ のような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO₄沈 澱を包含するが、これらに限定されない。別のものでは、レトロウイルスプラス ミドベクターは、リポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質に結合され 得、次いで宿主に投与され得る。 プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レ トロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルスベク ター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入 するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコー ドする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚性幹細胞、胚 性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイ ト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、これらに限定されない。 本発明はまた、VEGF2核酸配列中の変異の存在と関連する疾患または疾患に対 する感受性を検出するための診断アッセイの一部としてのVEGF2遺伝子の使用に 関する。 VEGF2遺伝子に変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得 る。診断のための核酸は、患者の細胞(例えば、血液、尿、唾液、組織生検、お よび剖検材料)から得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか 、または分析の前にPCR(Saikiら、Nature，324：163-166(1986))を使用して酵素 的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的のために使用され得る。例 として、VEGF2をコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、VEGF2変異を同定 および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入が、正常な遺伝子 型との比較における増幅産物のサイズの変化によって検出され得る。点変異が、 増幅されたDNAを放射標識されたVEGF2 RNA、あるいは放射標識されたVEGF2アン チセンスDNA配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。完全にマッ チした配列は、RNase A消化により、または融解温度の違いにより、ミスマッチ な二重鎖から区別され得る。 DNA配列の差異に基づく遺伝的試験は、変性剤を用いるかまたは用いない、ゲ ル中でのDNAフラグメントの電気泳動移動度の変化の検出によって達成され得る 。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって可視化され得 る。異なる配列のDNAフラグメントは、異なるDNAフラグメントの移動度がそれら の特異的融解温度または部分的融解温度に従ってゲル中で異なる位置に遅れる、 変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別され得る(例えば、Myersら、Science，230:1 242(1985)を参照のこと)。 特定の位置での配列の変化はまた、RNaseプロテクション、およびS1プロテク ションのようなヌクレアーゼプロテクションアッセイ、または化学的切断法(例 えば、cottonら、PNAS，USA，85:4397-4401(1985))によって示され得る。 従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNaseプロテクシ ョン、化学的切断、直接的DNA配列決定、または制限酵素の使用(例えば、制限酵 素断片長多型(RFLP))、およびゲノムDNAのサザンブロットのような方法によって 達成され得る。 より伝統的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はインサイチュ 分析によってもまた検出され得る。 本発明はまた、正常なコントロールの組織サンプルと比較したVEGF2タンパク 質の過剰発現が、疾患(例えば、異常な細胞分化)の存在または疾患に対する感受 性を検出し得るので、種々の組織におけるVEGF2タンパク質のレベルの変化を検 出するための診断アッセイに関する。宿主由来のサンプル中のVEGF2タンパク質 のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そして 、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISA アッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを包含する。ELISAアッセイ(Coliga nら、Current Protocols in Immunology，1(2)，第６章、(1991))は、最初に、V EGF2抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、を調製する工程を包 含する。さらに、レポーター抗体が、モノクローナル抗体に対して調製される。 レポーター抗体に、放射能、蛍光、または本実施例では、西洋ワサビペルオキシ ダーゼ酵素のような検出可能な試薬が結合される。サンプルを宿主から取り出し 、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体(例えば、ポリスチレン ディッシュ)上でインキュベートする。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタ ンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質と共にイ ンキュベートすることによって覆う。次に、モノクローナル抗体をディッシュ内 でインキュベートし、その間にモノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに 結合した任意のVEGF2タンパク質に結合する。全ての結合していないモノクロー ナル抗体を、緩衝液で洗浄して除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合さ せたレポーター抗体をディッシュ内に入れ、VEGF2に結合した任意のモノクロー ナル抗体へレポーター抗体を結合させる。次いで、結合していないレポーター抗 体を洗浄して除去する。次いで、ペルオキシダーゼ基質をディッシュに添加し、 そして標準曲線と比較した場合、所定の時間内の発色の量が、患者のサンプルの 所定の容量内に存在するVEGF2タンパク質の量の測定値である。 競合アッセイが使用され得、ここではVEGF2に特異的な抗体が固体支持体に結 合される。次いで本発明のポリペプチドを、例えば、放射能によって標識し、そ して宿主由来のサンプルを固体支持体に通過させ、そして例えば、液体シンチレ ーションクロマトグラフィーによって検出される標識の量を、サンプル中のVEGF 2の量に相関付け得る。 「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」 アッセイにおいて、VEGF2を固体支持体に通過させ、そして固体支持体に結合し た抗体に結合させる。次いで、第２の抗体をVEGF2に結合させる。次いで、標識 されかつ第２の抗体に対して特異的な第３の抗体を固体支持体に通過させ、そし て第２の抗体に結合させ、次いで量を定量し得る。 本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。配列は、個々のヒト染 色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る 。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位 置のマーキングに利用可能な実際の配列データ(反復多型)に基づいた染色体マー キング試薬はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、これ らの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階であ る。 簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー(好ましくは15〜25bp)を調 製することにより染色体にマッピングされ得る。cDNAのコンピューター解析が、 ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑に するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマ ーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに 使用される。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみ が増幅フラグメントを生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て るための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に 使用して、類似の方法において特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは 大きなゲノムクローンのプールを用いて下部位置決め(sublocalization)が達成 され得る。その染色体にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピン グストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、フローサイトメトリ ーで選別した標識した染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNA ライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する 。 中期染色体展開物へのcDNAクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ ン(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技 術は、50または60塩基という短いcDNAで使用され得る； この技術の総説として は、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques．Pergamon P ress，New York(1988)を参照のこと。 一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、配列の染色体上での物理 的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。(そのようなデータは、例えば 、V．McKusick，Mendelian Inheritance in Manに見出される(Johns Hopkins Un iversity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である))。次いで、 同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析(物理 的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する 必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体 には観察されない場合、この変異は疾患の原因となる因子であると考えられる。 物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患 に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的 な原因となる遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像 度で、そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。） このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらの アナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗 体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体 、およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの 産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、そのような抗体およびフラグ メントの産生のために使用され得る。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ 得る。この動物は、好ましくはヒトでない。次いで、このようにして得られた抗 体は、ポリペプチド自体を結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体を結合する抗体を 生成するために使用され得る。次いで、そのような抗体は、そのポリペプチドを 発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル 抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の 技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein ，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブ リドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4: 72)、およびヒトモノクロ ーナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられる。 単鎖抗体の産生について記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発明 の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適合させ得る。 また、トランスジェニックマウスを、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対す るヒト化抗体を発現させるために使用し得る。 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はそのよ うな実施例に限定されないことを理解されたい。全ての部または量は、他に明記 しない限り重量基準である。 以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い所定の方法および ／または用語を記載する。 「プラスミド」は、大文宇および／または数字の前および／または後の小文字 のｐにより示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるかまたは制限 無く公的に入手可能であるかのいずれかであり、または公開された手順に従って 入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価 のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の所定の配列でのみ作用する制限酵素でDNAを触媒反 応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販さ れており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公 知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNA フラグメントが約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用される。プ ラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜50 μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限 酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にて の約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者 の説明書に従って変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直 接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。 切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res. ，8: 4057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行わ れる。 「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相 補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ れ得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキ ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連 結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに 連結する。 「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形 成するプロセスをいう(Maniatis,T.ら、前出、146頁)。他に提供されていなけれ ば、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラ グメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)を用いて達成され 得る。 他に記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb，A.，Virology ，52:456-457(1973)の方法に記載のように実施した。 実施例１ ヒト組織および乳癌細胞株におけるVEGF2の発現パターン ノーザンブロット解析を、ヒト組織およびヒト乳癌細胞株におけるVEGF2遺伝 子の発現レベルを試験するために行なった。全細胞性RNAサンプルを、RNAzol^TM Bシステム(Biotecx Laboratories，Inc.)を用いて単離した。各々の特定された 乳房組織および細胞株から単離された約10μgの全RNAを、１％アガロースゲルで 分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした(Molecular Cloning，Samb rook FritschおよびManiatis，Cold Spring Harbor Press，1989)。標識反応は 、 Stratagene Cloning Systems，Inc.，Prime-Itキットに従って50 ngのDNAフラグ メントを用いて行なった。標識したDNAを、5 Prime--3 Prime，Inc.，Boulder， CO，USAからのSelect-G-50カラムを用いて精製した。次いで、フィルターを、放 射性標識した全長VEGF2遺伝子と、1,000,000 cpm/mlで0.5M NaPO₄および７％SDS 中で65℃で一晩ハイブリダイズした。0.5×SSC、0.1％SDSで、室温で２回および 60℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを増感スクリーンとともに−70℃で一 晩曝露した。1.6Kdのメッセージが２つの乳癌細胞株において観察された。 実施例２ バキュロウイルス発現系を用いるVEGF2のクローニングおよび発現 Ｎ末端で46アミノ酸を除いたVEGF2タンパク質をコードするDNA配列(ATCC受託 番号97161を参照のこと)を、遺伝子の５'配列および３'配列に対応するPCRオリ ゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した： ５'プライマーは、配列TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAT CCC GCC ATG GAG G CC ACG GCT TAT GC(配列番号４)を有し、そしてBamHI制限酵素部位(太字)、およ びVEGF2(ヌクレオチド150-166)の５'配列に相補的な17ヌクレオチド配列を含む 。 ３'プライマーは、配列GATC TCT AGA TTA GCT CAT TTG TGG TCT(配列番号５) を有し、制限酵素XbaIの切断部位、および停止コドンおよび停止コドンの前の15 ヌクレオチド配列を含むVEGF2の３'配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。 増幅された配列を、市販のキット(「Geneclean」，BIO 101，Inc.，La Jolla ，CA.)を用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、フラグメントをエ ンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIで消化し、次いで再び１％アガロースゲル上 で精製した。このフラグメントを、BamHIおよびXbaI部位でpAcGP67Aバキュロウ イルス移入ベクター(PHarmingen)に連結した。この連結によって、VEGF2 cDNAを バキュロウイルスgp67遺伝子のシグナル配列とともにインフレームでクローン化 し、そしてベクター中のシグナル配列の３'末端に配置した。これをpAcGP67A-VE GF2と称する。 発現のためにpRG1ベクターにgp67遺伝子のシグナル配列とともにVEGF2をクロ ーン化するために、シグナル配列およびいくつかの上流の配列を有するVEGF2を 、 XhoIおよびXbaI制限酵素により、VEGF2 cDNAの上流に位置するXho制限エンドヌ クレアーゼ部位、およびXbaI制限エンドヌクレアーゼ部位で、pAcGP67A-VEGF2プ ラスミドから切り出した。このフラグメントを１％アガロースゲル上で残りのベ クターから分離し、そして「Geneclean」キットを使用して精製した。このフラ グメントを、F2と称した。 PRG1ベクター(pVL941ベクターの変異体)をバキュロウイルス発現系を用いるVE GF2タンパク質の発現のために用いる(総説については、Summers，M.D.およびSmi th，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and insect ce ll culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555を参照のこと)。この発現ベクターは、Autographa californica核多角 体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エン ドヌクレアーゼBamHI、SmaI、XbaI，BglII、およびAsp718の認識部位を含む。制 限エンドヌクレアーゼXhoIについての部位は、BamHI部位の上流に位置する。Xho IとBamHIとの間の配列は、PAcGp67A(テープ上で変化なし)ベクター中のその配列 と同じである。シミアンウイルス(SV)40のポリアデニル化部位を、効率的なポリ アデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli 由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグ ナルが続くポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を 、同時トランスフェクトした野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのため にウイルス配列により両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクター が、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pVL941，およびpAcIM1(Luc kow，V.A.およびSummers，M.D.、Virology，170:31-39)。 プラスミドを制限酵素XboIおよびXbaIで消化し、次いで当該分野で公知の手順 により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、市販のキット (「Geneclean」BIO 101 Inc．La Jolla，CA)を使用して、DNAを１％アガロース ゲルより単離した。このベクターDNAをV2と称する。 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連 結した。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよびXbaI を用いて、VEGF2遺伝子を有するプラスミド(pBac gp67-VEGF2)を含む細菌を同定 した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。 ５μgのプラスミドpBac gp67-VEGF2を、リポフェクション法(Felgnerら Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987))を用いて、1.0μgの市販の線状 化したバキュロウイルス(「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Diego，CA.)で同時トランスフェクトした。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac gp67-VEGF2を 、50μlの無血清Grace培地(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)を含む マイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlリポフェ クチンおよび90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキ ュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清を有さないGr ace培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞(ATCC CR L 1711)に滴下して加えた。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するため に、前後に振盪した。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。５ 時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児 血清を補充した１mlのGrace昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーター に戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。 ４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith(前出)による記載と同様に プラークアッセイを行なった。改変法として、「Blue Gal」(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)と共にアガロースゲルを用いた。これは、青く染色された プラークの容易な単離を可能とする。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はま た、Life Technologies Inc.、Gaithersburgにより配布される昆虫細胞培養およ びバキュロウイルス学の使用者ガイド(９〜10頁)においても見い出され得る)。 連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加し、青く染色されたプラークをエッ ペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、 200μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁した。寒天を、短時 間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用し て、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させた。４日後、これらの培養 ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させた。細胞を、 感染多重度(MOI)１で組換えバキュロウイルスV-gp67-VEGF2で感染させた。６時 間後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地 (Life Technologies Inc.，Gaithersburg)に置き換えた。42時間後、５μCiの³⁵ Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン(Amersham)を添加した。細胞を、 さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により回収し、そして標 識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化した 。 培地およびSf9細胞の細胞質由来のタンパク質を、還元条件下または非還元条 件下でSDS-PAGEによって分析した。図４を参照のこと。培地を、50mM MES(pH5.8 )に対して透析した。透析の後に沈澱を得、そして100mMクエン酸Na(pH5.0)中に 再懸濁した。再懸濁した沈澱を、SDS-PAGEによって再度分析し、そしてクマシー ブリリアントブルーで染色した。図５を参照のこと。 培地の上清をまた、50mM MES(pH5.8)中で1:10に希釈し、そして１ml/分の流速 でSP-650Mカラム(1.0×6.6cm、Toyopearl)に適用した。タンパク質を、200、300 、および500mM NaClでの段階勾配で溶出した。VEGF2を、500mMでの溶出を用いて 得た。溶出物を還元剤β-メルカプトエタノールの存在下または非存在下で、SDS -PAGEで分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。図６を参照の こと。 実施例３ COS 細胞における組換えVEGF2の発現 プラスミドVEGF2-HAの発現を、ベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)から誘導する 。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含む：１)SV40複製起点、２)アンピシリン耐性遺 伝子、３)E．coli複製起点、４)ポリリンカー領域、SV40イントロン、およびポ リアデニル化部位が続くCMVプロモーター。完全なVEGF2前駆体、およびその３' 末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベク ターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現は CMVプロモーター下で指示される。HAタグは、先に記載されたようなインフルエ ンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(I．Wilson、H．Nim an、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 3 7，7 67(1984))。標的タンパク質へのHAタグの融合により、HAエピトープを認識する 抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。 プラスミド構築ストラテジーを以下に記述する： VEGF2をコードするDNA配列(ATCC受託番号第97161号)を、２つのプライマーを 用いるPCRにより構築した：５'プライマー（CGC GGA TCC ATG ACT GTA CTC TAC CCA)(配列番号６)は、BamHI部位、それに続く開始コドンから始まるVEGF2コード 配列の18ヌクレオチドを含む；３'配列(CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CAT TTG TGG TCT３')(配列番号７)は、XbaI部位 、HAタグ、XhoI部位、およびVEGF2コード配列の最後の15ヌクレオチド(停止コド ンは含まない)に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、BamHI部位、XhoI 制限エンドヌクレアーゼ部位およびインフレーム融合したHAタグが続くコード配 列、HAタグに隣接する翻訳終結停止コドン、およびXbaI部位を含む。PCR増幅DNA フラグメントおよびベクター(pcDNAI/Amp)を、BamHIおよびXbaI制限酵素で消化 し、そして連結した。連結混合物を、E．coli SURE株(Stratagene Cloning Syst ems，La Jolla，CA 92037)に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン 培地プレートにプレーティングし、そして耐性コロニーを選択した。プラスミド DNAを形質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試 験した。組換えVEGF2の発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法により発現ベク ターでトランスフェクトした(J．Sambrook，E．Fritsch、T．Maniatis、Molecul ar Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。 VEGF2-HAタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した。(E ．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor L aboratory Press，(1988))。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-シス テインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤(R IPA緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶解した(Wilson，I.ら、同上 37:767(1984))。細胞溶解物およ び培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈降したタン パク質を15％SDS-PAGEゲルで分析した。 実施例４ 血管内皮細胞の増殖への部分精製VEGF2タンパク質の影響 １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、４％ウシ胎児血清(FBS)、16単位/m lのヘパリン、および50単位/mlの内皮細胞増殖補充物(ECGS，Biotechniques，In c.)を含むM199培地に２〜５×10⁴細胞/35mmディッシュの密度で播種した。２日 目に、培地を、10％FBS、８単位/mlのヘパリンを含むM199に置き換えた。最初の 45アミノ酸残基を除いた配列番号２のVEGF2タンパク質(VEGF)および塩基性FGF(b FGF)を示した濃度で添加した。４日目および６日目に、培地を置き換えた。８日 目に、Coulter Counterで細胞数を決定した(図８を参照のこと)。 実施例５ 血管内皮細胞の増殖への精製VEGF2タンパク質の影響 １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、４％ウシ胎児血清(FBS)、16単位/m lのヘパリン、50単位/mlの内皮細胞増殖補充物(ECGS，Biotechniques，Inc.)を 含むM199培地に２〜５×10⁴細胞/35mmディッシュの密度で播種した。２日目に、 培地を、10％FBS、８単位/mlのヘパリンを含むM199と置き換えた。最初の45アミ ノ酸残基を除いた配列番号２の精製VEGF2タンパク質(VEGF)をこの時点で培地に 添加した。４日目および６日目に、培地を新鮮な培地および補充物と置き換えた 。８日目に、Coulter Counterで細胞数を決定した(図９を参照のこと)。 実施例６ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得られる組織を組織培養培 地中に置き、そして小片に分ける。組織の小塊を、組織培養フラスコの湿った表 面上に置き、各フラスコ中におよそ10片を置く。フラスコの上下を逆さにし、密 閉し、そして室温に一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを反転させ、そし て組織塊をフラスコの底に付着したままにし、そして新鮮な培地(例えば、10％F BS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するHamのF12培地)を添加する 。次いで、これを37℃でおよそ１週間インキュベートする。この時点で新鮮な培 地 を添加し、その後数日ごとに取り替える。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の 単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコに大きく (scale)する。 モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するpMV-7(Kirschmeier，P .T.ら、DNA，7: 219-25(1988))をEcoRIおよびHindIIIを用いて消化し、続いて仔 ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分別し 、そしてガラスビーズを用いて精製する。 本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ5'末端配列および3'末端 配列に対応するPRCプライマーを用いて増幅する。5'プライマーはEcoRI部位を含 み、そして3'プライマーはHindIII部位をさらに含む。等量のモロニーマウス肉 腫ウイルス直鎖状骨格、ならびに増幅されたEcoRIおよびHindIIIフラグメントを 、T4 DNAリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメ ントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を使用して、細菌HB101を形 質転換し、次いで、これを、適切に挿入された目的の遺伝子をベクターが有する ことを確認する目的のために、カナマイシン含有寒天上にプレーティングする。 アンホトロピックpA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％仔ウシ血清 (CS)、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するDulbecco改変Eagle培地( DMEM)における組織培養物中で、コンフルエントな密度になるまで増殖させる。 次いで、遺伝子を含むMSVベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞 をベクターで形質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を含有す る感染性ウイルス粒子を産生する(この時点でパッケージング細胞は、プロデュ ーサー細胞と呼ばれる)。 新鮮な培地を、形質導入したプロデューサー細胞に添加し、その後、コンフル エントなプロデューサー細胞の10cmプレートから培地を回収する。感染性ウイル ス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポア(millipore)フィルターを通して濾過 して、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細 胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去 し、そして直ちにプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去 し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての 線維芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選 択マーカー(例えば、neo、またはhis)を有するレトロウイルスベクターを使用す ることが必要である。 次いで、操作された線維芽細胞は、単独で、またはcytodex 3マイクロキャリ アービーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注 入する。この時点で、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。 本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、従っ て、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は特に記載した以外の方法で実施され得 る。

【手続補正書】 【提出日】１９９９年３月３１日 【補正内容】 6.1．請求の範囲を別紙の通り補正する。 6.2．明細書を以下の通り補正する。 （１）明細書第６頁第６行に、「に寄託された」とあるのを「アメリカンタイプ カルチャーコレクション，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2 209に寄託された」に補正する。 （２）明細書第31頁第７行に、「1.6 Kd」とあるのを「1.6 Kb」に補正する。 （３）明細書第39頁〜第46頁の配列表を、別紙の通り補正する。 請求の範囲１．配列番号２からなるタンパク質の成熟部分を含む単離されたタンパク質分子 。 ２．配列番号２からなるタンパク質のプロタンパク質部分を含む請求項１に記載 の単離されたタンパク質分子。 ３．配列番号２からなるタンパク質を含む、請求項２に記載の単離されたタンパ ク質分子。 ４．配列番号２のアミノ酸108〜121を含む、単離されたタンパク質分子。 ５．配列番号２のアミノ酸85〜165を含む、請求項４に記載の単離されたタンパ ク質分子。 ６．配列番号２のアミノ酸24〜373を含む、請求項５に記載の単離されたタンパ ク質分子。 ７．配列番号２のアミノ酸１〜373を含む、請求項６に記載の単離されたタンパ ク質分子。 ８．配列番号２のアミノ酸−23〜373を含む、請求項７に記載の単離されたタン パク質分子。 ９．配列番号２のアミノ酸−46〜373を含む、請求項８に記載の単離されたタン パク質分子。 １０．配列番号２のポリペプチドフラグメントを含む単離されたタンパク質分子 であって、ここで、該フラグメントは、脈管形成活性を有する、単離されたタン パク質分子。 １１．配列番号２のポリペプチドフラグメントを含む単離されたタンパク質分子 であって、ここで、該フラグメントは、内皮細胞増殖活性を有する、単離された タンパク質分子。 １２．配列番号２の少なくとも30個の連続するアミノ酸のポリペプチドフラグメ ントを含む単離されたタンパク質分子。 １３．前記ポリペプチドフラグメントが、配列番号２の少なくとも50個の連続す るアミノ酸を含む、請求項１２に記載の単離されたタンパク質分子。 １４．異種ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜１３に記載のタンパク質分子 。 １５．ホモダイマーを含む、請求項１〜１３に記載のタンパク質分子。 １６．グリコシル化されている、請求項１〜１３に記載のタンパク質分子。 １７．患者における内皮細胞の増殖を刺激する方法において使用するための、請 求項１〜１３に記載のタンパク質分子を含む組成物であって、ここで、該方法は 、請求項１〜１３に記載のタンパク質分子を該患者に投与する工程を包含し、該 患者は創傷を有する、組成物。 １８．前記方法が、脈管形成を刺激する、請求項１７に記載の組成物。 １９．前記患者が、ヒトである、請求項１７に記載の組成物。 ２０．患者における内皮細胞の増殖を刺激する方法において使用するための、請 求項１〜１３に記載のタンパク質分子を含む組成物であって、ここで、該方法は 、請求項１〜１３に記載のタンパク質分子を該患者に投与する工程を包含し、該 患者は血管系の組織の損傷を有する、組成物。 ２１．前記方法が、脈管形成を刺激する、請求項２０に記載の組成物。 ２２．前記患者が、ヒトである、請求項２０に記載の組成物。 ２３．患者における内皮細胞の増殖を刺激する方法において使用するための、請 求項１〜１３に記載のタンパク質分子を含む組成物であって、ここで、該方法は 、請求項１〜１３に記載のタンパク質分子を患者に投与する工程を包含し、該患 者は骨および組織の損傷を有する、組成物。 ２４．前記方法が、脈管形成を刺激する、請求項２３に記載の組成物。 ２５．前記患者が、ヒトである、請求項２３に記載の組成物。 ２６．請求項１〜１３に記載のタンパク質分子を含む、組成物。 ２７．配列番号２のタンパク質の成熟部分をコードする核酸配列を含む、単離さ れたポリヌクレオチド。 ２８．前記核酸配列が、配列番号２のタンパク質のプロタンパク質部分をコード する、請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ２９．ヒトVEGF-2をコードする、請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチ ド。 ３０．配列番号２のアミノ酸108〜121のポリペプチドをコードする核酸配列を含 む、単離されたポリヌクレオチド。 ３１．前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸85〜165を含む、請求項３０ に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ３２．前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸24〜373を含む、請求項３１ に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ３３．前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜373を含む、請求項３２ に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ３４．前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸−23〜373を含む、請求項３ ３に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ３５．前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸−46〜373を含む、請求項３ ４に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ３６．配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号１の相補体からなるポリヌ クレオチドに、以下の条件： 0.5M NaPO₄ 、７％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中で、65℃でのハイブリダイ ゼーション、および0.5×SSC、0.1％ SDSで60℃での洗浄； の下でハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。 ３７．配列番号２のポリペプチドフラグメントをコードする核酸配列を含む単離 されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドフラグメントは、脈 管形成活性を有する、単離されたポリヌクレオチド。 ３８．配列番号２のポリペプチドフラグメントをコードする核酸配列を含む単離 されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドフラグメントが内皮 細胞増殖活性を有する、単離されたポリヌクレオチド。 ３９．配列番号２の少なくとも30個の連続するアミノ酸のポリペプチドフラグメ ントをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。 ４０．配列番号２の少なくとも50個の連続するアミノ酸のポリペプチドフラグメ ントをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。 ４１．請求項２７〜３８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 ４２．遺伝子発現を制御する調節配列に作動性に連結された請求項２７〜３８に 記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。 ４３．異種調節配列と作動可能に連結された請求項２７〜３８に記載のポリヌク レオチドを含む宿主細胞。 ４４．異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７〜３８に記載の核酸配列 。 ４５．異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２ ７〜３８に記載の核酸配列。 ４６．VEGF-2タンパク質を産生するための方法であって、以下： (a) 請求項４３に記載の遺伝子操作された宿主細胞を、該タンパク質を産生す るに適切な条件下で培養する工程；および (b) 該細胞培養物から該タンパク質を回収する工程、 を包含する、方法。 ４７．請求項４６に記載の方法により産生されたVEGF2タンパク質。 ４８．請求項２７〜３８に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。 ４９．請求項１に記載のタンパク質分子に対する抗体。 ５０．請求項１に記載のタンパク質分子 についてのアゴニストとして有効な化合 物。５１．請求項１に記載のタンパク質分子 に対するアンタゴニストとして有効な化 合物。５２．請求項４９に記載の抗体を含む、組成物。 ５３．請求項５０に記載の化合物を含む、組成物。 ５４．請求項５１に記載の化合物を含む、組成物。 ５５． 請求項１に記載のタンパク質分子の発現に関連する疾患または疾患に対す る感受性を診断するためのプロセスであって： 該タンパク質分子をコードする核酸配列における変異を決定する工程を包含す る、プロセス。５６ ．診断プロセスであって： 宿主由来のサンプル中の請求項１に記載のタンパク質分子の存在について分析 する工程を包含する、プロセス。５７ ．請求項１に記載のタンパク質分子についてのレセプターに結合し、そして 該レセプターを活性化または阻害する化合物を同定するための方法であって： その表面で該タンパク質分子についてのレセプターを発現している細胞を、該 レセプターへの結合を可能にする条件下で、スクリーニングされるべき化合物と 接触させる工程であって、該レセプターが、該レセプターへの化合物の結合に応 じて検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と結合している、工程；および 該化合物と該レセプターとの相互作用によって生じるシグナルの存在または非 存在を検出することによって、該化合物が該レセプターに結合し、そして該レセ プターを活性化または阻害するかどうかを決定する工程、 を包含する、方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６２９ Ａ６１Ｋ 31/00 ６２９Ａ ６３５ ６３５ 38/22 39/395 Ｎ 39/395 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/515 Ｃ０７Ｋ 14/515 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＩＬ ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フ，ジン−シャン アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザースバーグ，ホワード ランディン グ ドライブ 16125 (72)発明者 カオ，リアン 香港 ユニバーシティ オブ ホンコン, デパートメント オブ マイクロバイオロ ジー，クイーン メアリー ホスピタル

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）配列番号２に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）該（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、かつこれに対して 少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド；および （ｃ）該（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメ ント、 からなる群より選択されるメンバーを含む、ポリヌクレオチド。 ２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．配列番号２に示すポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレ オチド。 ４．配列番号２に示す-46〜373を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記 載のポリヌクレオチド。 ５．配列番号２に示す１〜373を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記 載のポリヌクレオチド。 ６．単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）ATCC受託番号97161に含まれるDNAによってコードされる成熟ポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ATCC受託番号97161に含まれるDNAによって発現されるポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチド； （ｃ）該（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、かつ これに対して少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド フラグメント、 からなる群より選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。 ７．請求項２に記載のDNAを含む、ベクター。 ８．請求項７に記載のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。 ９．ポリペプチドを産生するためのプロセスであって、請求項８に記載の宿主細 胞から前記DNAによりコードされるポリペプチドを発現させる工程を包含する、 プロセス。 １０．ポリペプチドを発現し得る細胞を作製するためのプロセスであって、請求 項７に記載のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程を包含 する、プロセス。 １１．ポリペプチドであって、（ｉ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポ リペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；（ii）配列 番号２のアミノ酸１〜アミノ酸373を含むポリペプチド；および（iii）ATCC受託 番号97161のcDNAによりコードされるポリペプチド、ならびに該ポリペプチドの フラグメント、アナログ、および誘導体、からなる群より選択される、ポリペプ チド。 １２．請求項１１に記載のポリペプチドについてのアゴニストとして有効な化合 物。 １３．請求項１１に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストとして有効な化 合物。 １４．VEGF2を必要とする患者の処置方法であって、該患者に請求項１１に記載 のポリペプチドの治療有効量を投与する工程を包含する、方法。 １５．前記治療有効量のポリペプチドが、該ポリペプチドをコードするDNAを前 記患者に提供し、そして該ポリペプチドをインビボで発現させることによって投 与される、請求項１４に記載の方法。 １６．VEGF2を必要とする患者の処置方法であって、該患者に請求項１２に記載 の化合物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。 １７．VEGF2を阻害する必要がある患者の処置方法であって、該患者に請求項１ ３に記載のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含する、方法。 １８．請求項１１に記載のポリペプチドの発現に関連する疾患または疾患に対す る感受性を診断するためのプロセスであって： 該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を決定する工程を包含する 、プロセス。 １９．診断プロセスであって： 宿主由来のサンプル中の請求項１１に記載のポリペプチドの存在について分析 する工程を包含する、プロセス。 ２０．請求項１１に記載のポリペプチドについてのレセプターに結合し、そして 該レセプターを活性化または阻害する化合物を同定するための方法であって： その表面で該ポリペプチドについてのレセプターを発現している細胞を、該レ セプターへの結合を可能にする条件下で、スクリーニングされるべき化合物と接 触させる工程であって、該レセプターが、該レセプターへの化合物の結合に応じ て検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と結合している、工程；および 該化合物と該レセプターとの相互作用によって生じるシグナルの存在または非 存在を検出することによって、該化合物が該レセプターに結合し、そして該レセ プターを活性化または阻害するかどうかを決定する工程、 を包含する、方法。