JP2003079371A - ヒト血管内皮増殖因子３ - Google Patents
ヒト血管内皮増殖因子３Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 本発明のポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦに対
するアミノ酸配列相同性に基づいて、新規な血管内皮増
殖因子として推定的に同定された。本発明の１つの局面
によれば、 新規な成熟ポリペプチド、ならびに生物学
的に活性な、そして診断的または治療的に有用な、その
フラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。
本発明のポリペプチドは、ヒト起源のポリペプチドであ
る。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）特定の配列のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズし得、かつこれに対して少なくとも７０％同一で
あるポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または
（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメ
ント、からなる群より選択されるメンバーを含む、ポリ
ヌクレオチド。
するアミノ酸配列相同性に基づいて、新規な血管内皮増
殖因子として推定的に同定された。本発明の１つの局面
によれば、 新規な成熟ポリペプチド、ならびに生物学
的に活性な、そして診断的または治療的に有用な、その
フラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。
本発明のポリペプチドは、ヒト起源のポリペプチドであ
る。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）特定の配列のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズし得、かつこれに対して少なくとも７０％同一で
あるポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または
（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメ
ント、からなる群より選択されるメンバーを含む、ポリ
ヌクレオチド。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにそのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発
明のポリペプチドは、血管内皮増殖因子ファミリーのメ
ンバーとして同定された。より詳細には、本発明のポリ
ペプチドは血管内皮増殖因子３であり、時折、本明細書
中以下で「ＶＥＧＦ３」という。本発明はまた、そのよ
うなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】新たな血管の形成、すなわち脈管形成
は、胚の発生、それに続く成長、および組織修復のため
に必須である。しかし、脈管形成は、新生物（例えば、
腫瘍および神経膠腫）のような特定の病的状態に必須な
部分である。そして異常な脈管形成は、炎症、慢性関節
リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜症のような他の疾
患に関連する（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＫｌａｇｓ
ｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２−４
４７，（１９８７））。 【０００３】酸性および塩基性の両方の線維芽細胞増殖
因子分子は、内皮細胞および他の細胞タイプについての
マイトジェンである。アンギオトロピン（ａｎｇｉｏｔ
ｒｏｐｉｎ）およびアンギオゲニンは脈管形成を誘導し
得るが、これらの機能は不明である（Ｆｏｌｋｍａｎ，
Ｊ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１５
３−１７０頁，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｐｒ
ｅｓｓ）。血管内皮細胞に対して高度に選択的なマイト
ジェンは、血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧＦであり
（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１
３：１９−３２，（１９９２））、血管透過因子（ＶＰ
Ｆ）としても知られる。血管内皮増殖因子は、その標的
細胞特異性が血管内皮細胞に制限されているようであ
る、分泌される脈管形成マイトジェンである。 【０００４】マウスＶＥＧＦ遺伝子は、特徴付けられ、
そして胚形成におけるその発現パターンが解析された。
ＶＥＧＦの持続的な発現が、有窓内皮に隣接する上皮細
胞において（例えば、脈絡叢および腎糸球体において）
観察された。このデータは、内皮細胞の増殖および分化
の多機能性レギュレーターとしてのＶＥＧＦの役割に一
致する（Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ，１１４：５２１−５３２（１９９２））。 【０００５】ＶＥＧＦは、間葉細胞についてのマイトジ
ェンである血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のα鎖およ
びβ鎖、ならびに内皮細胞マイトジェンである胎盤増殖
因子（ＰＬＧＦ）に構造的に関連する。これらの３つの
タンパク質は、同一のファミリーに属し、そして保存さ
れたモチーフを共有する。ジスルフィド結合の形成に寄
与する８つのシステイン残基は、これらのタンパク質に
おいて厳密に保存される。オルタナティブスプライシン
グされたｍＲＮＡが、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、およびＰＤ
ＧＦのいずれについても同定されており、そしてこれら
の異なるスプライシング産物は、生物学的活性およびレ
セプター結合特異性が異なる。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ
は、ホモ二量体またはヘテロ二量体として機能し、そし
てレセプターに結合する。このレセプターは、レセプタ
ーの二量体化の後に内因性のチロシンキナーゼ活性を顕
す。 【０００６】ＶＥＧＦは、オルタナティブスプライシン
グによる、１２１、１６５、１８９、および２０６アミ
ノ酸の４つの異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１およ
びＶＥＧＦ１６５は、可溶性でありそして脈管形成を促
進し得る。一方、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ３０６
は、細胞表面中のヘパリン含有プロテオグリカンに結合
される。ＶＥＧＦの時期的および空間的な発現は、血管
の生理学的増殖に相関していた（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，
Ｃ．Ｍ．，およびＣａｒｂｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３９：５７０−５７９，（１９８
９）；ＭｃＮｅｉｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈ
ｎａｎ，Ｌ．，Ｗａｒｄｅｒ，Ｅ．，Ｄ’Ａｍｏｒｅ，
Ｐ．Ａ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０９：８１１
−８２２，（１９８９））。その高親和性結合部位は、
組織切片において内皮細胞上のみに位置付けられる（Ｊ
ａｋｅｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
８９：２４４−２５３，（１９８９））。この因子は下
垂体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、
そしてある種のヒト神経膠腫と関係している（Ｐｌａｔ
ｅ，Ｋ．Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４５−８４８，
（１９９２））。興味深いことに、ＶＥＧＦ１２１また
はＶＥＧＦ１６５の発現は、チャイニーズハムスター卵
巣細胞に、ヌードマウス中で腫瘍を形成する能力を与え
る（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．９１：１６０−１７０，（１９９３））。抗ＶＥ
ＧＦモノクローナル抗体によるＶＥＧＦ機能の阻害は、
免疫欠損マウスにおける腫瘍増殖を阻害することが示さ
れた（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４
１−８４４，（１９９３））。さらに、ＶＥＧＦレセプ
ターのドミナントネガティブ変異体が、マウスにおける
膠芽腫増殖を阻害することが示された。 【０００７】血管透過因子はまた、傷害の停止後でさえ
も血漿タンパク質に対する持続的な微小血管の高透過性
（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅ
ａｂｉｌｉｔｙ）（これは、正常な創傷治癒の特徴的な
特性である）を担うことが見出されている。これは、Ｖ
ＰＦが、創傷治癒における重要な因子であることを示唆
する。Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１７６：１３７５−９（１９９２）。 【０００８】ＶＥＧＦの発現は、血管新生した組織（例
えば、肺、心臓、胎盤、および固形腫瘍）において高
く、そして時間的および空間的の両方で脈管形成に相関
する。ＶＥＧＦはまた、インビボで脈管形成を誘導する
ことが示されている。脈管形成は正常組織、特に血管組
織の修復に必須であるので、ＶＥＧＦは血管組織修復を
促進させることにおける使用が提案されてきた（例え
ば、アテローム性動脈硬化症において）。 【０００９】Ｃｈｅｎらに１９９１年１２月１７日に発
行された米国特許第５，０７３，４９２号は、適切な環
境において内皮細胞の増殖を相乗的に増強するための方
法を開示する。この方法は、環境にＶＥＧＦ、エフェク
ター、および血清由来因子を添加する工程を包含する。
また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮＡが、
ポリメラーゼ連鎖反応技術により調製された。このＤＮ
Ａは、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれとしても
存在し得るタンパク質をコードする。このタンパク質
は、哺乳動物血管内皮細胞マイトジェンであり、そし
て、１９９２年９月３０日に公開された欧州特許出願第
９２３０２７５０．２号に開示されるように、それ自体
が血管の発達および修復の促進のために有用である。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明のポリペプチド
は、ヒトＶＥＧＦに対するアミノ酸配列相同性に基づい
て、新規な血管内皮増殖因子として推定的に同定され
た。 【００１１】本発明の１つの局面によれば、新規な成熟
ポリペプチド、ならびに生物学的に活性な、そして診断
的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体が提供される。本発明のポリペプチド
は、ヒト起源のポリペプチドである。 【００１２】 【課題を解決するための手段】本発明によると、以下の
項目１〜２０が提供され、上記目的が達成される。（項
目１．）単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）配列番号２に示すポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつこれに対して少なくとも７０％同一であるポリ
ヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌ
クレオチドフラグメント、からなる群より選択されるメ
ンバーを含む、ポリヌクレオチド。 【００１３】（項目２．）前記ポリヌクレオチドがＤＮ
Ａである、項目１に記載のポリヌクレオチド。 【００１４】（項目３．）配列番号２に示すポリペプチ
ドをコードする、項目２に記載のポリヌクレオチド。 【００１５】（項目４．）配列番号２に示すポリペプチ
ドをコードする、項目２に記載のポリヌクレオチド。 【００１６】（項目５．）配列番号２に示すポリペプチ
ドをコードする、項目２に記載のポリヌクレオチド。 【００１７】（項目６．）単離されたポリヌクレオチド
であって： （ａ）寄託したクローンに含まれるＤＮＡによってコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド； （ｂ）寄託したクローンに含まれるＤＮＡによって発現
されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし得、かつこれに対して少なくとも７０％同一
であるポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドのポリヌクレオチドフラグメント、からなる群より選
択されるメンバーを含む、ポリヌクレオチド。 【００１８】（項目７．）項目２に記載のＤＮＡを含
む、ベクター。 【００１９】（項目８．）項目７に記載のベクターで遺
伝子操作された宿主細胞。 【００２０】（項目９．）ポリペプチドを産生するため
のプロセスであって、項目８に記載の宿主細胞から前記
ＤＮＡによりコードされる前記ポリペプチドを発現させ
る工程を包含する、プロセス。 【００２１】（項目１０．）ポリペプチドを発現し得る
細胞を作製するためのプロセスであって、項目７に記載
のベクターで該細胞を形質転換またはトランスフェクト
する工程を包含する、プロセス。 【００２２】（項目１１．）ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘
導体；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸２２
１を含むポリペプチド；および（ｉｉｉ）受託したクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド、なら
びに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および
誘導体、からなる群より選択される、ポリペプチド。 【００２３】（項目１２．）項目１１に記載のポリペプ
チドに対するアゴニストとして有効な化合物。 【００２４】（項目１３．）項目１１に記載のポリペプ
チドに対するアンタゴニストとして有効な化合物。 【００２５】（項目１４．）ＰＧＳＧ−１を必要とする
患者の処置方法であって、該患者に項目１１に記載のポ
リペプチドの治療有効量を投与する工程を包含する、方
法。 【００２６】（項目１５．）前記治療有効量のポリペプ
チドが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを前記患者
に提供し、そして該ポリペプチドをインビボで発現させ
ることによって投与される、項目１４に記載の方法。 【００２７】（項目１６．）ＶＥＧＦ３を必要とする患
者の処置方法であって、該患者に項目１２に記載の化合
物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。 【００２８】（項目１７．）ＶＥＧＦ３を阻害する必要
がある患者の処置方法であって、該患者に項目１３に記
載のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含
する、方法。 【００２９】（項目１８．）項目１１に記載のポリペプ
チドの発現に関連する疾患または疾患に対する感受性を
診断するためのプロセスであって：該ポリペプチドをコ
ードする核酸配列における変異を決定する工程を包含す
る、プロセス。 【００３０】（項目１９．）診断プロセスであって：宿
主由来のサンプル中の項目１１に記載のポリペプチドの
存在について分析する工程を包含する、プロセス。 【００３１】（項目２０．）項目１１に記載のポリペプ
チドに対するレセプターに結合し、そして該レセプター
を活性化または阻害する化合物を同定するための方法で
あって：その表面上に該ポリペプチドに対するレセプタ
ーを発現している細胞を、該レセプターへの結合を可能
にする条件下で、スクリーニングされるべき化合物と接
触させる工程であって、該レセプターが、該レセプター
への化合物の結合に応答して検出可能なシグナルを提供
し得る第２の成分と結合している、工程；および該化合
物と該レセプターとの相互作用によって生じるシグナル
の存在または非存在を検出することによって、該化合物
が該レセプターに結合し、そして該レセプターを活性化
または阻害するかどうかを決定する工程、を包含する、
方法。 【００３２】 【発明の実施の形態】本発明の別の局面によれば、本発
明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提
供される。この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ならびに生物学的に活性な、そして
診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナ
ログ、および誘導体を含む。 【００３３】本発明のなお別の局面によれば、組換え技
術により、そのようなポリペプチドを産生するためのプ
ロセスが提供される。このプロセスは、本発明のポリペ
プチドをコードする核酸配列を含む、組換え原核生物宿
主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を、この
タンパク質の発現およびその後のこのタンパク質の回収
を促進する条件下で培養する工程を包含する。 【００３４】本発明のなおさらなる局面によれば、治療
的目的のため（例えば、脈管形成の刺激のため、創傷治
癒の刺激のため、および血管組織の修復の促進のため）
に、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを利用するための
プロセスが提供される。 【００３５】本発明のなお別の局面によれば、そのよう
なポリペプチドに対する抗体が提供される。 【００３６】本発明のなお別の局面によれば、そのよう
なポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、こ
れは、例えば、腫瘍の増殖を阻害するため、糖尿病性網
膜症、炎症、慢性関節リウマチ、および乾癬の処置のた
めに、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために
使用され得る。 【００３７】本発明の別の局面によれば、本発明の核酸
配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸
分子を含む、核酸プローブが提供される。 【００３８】本発明の別の局面によれば、本発明の核酸
配列およびそのような核酸配列にコードされるタンパク
質における変異に関する疾患または疾患に対する感受性
を診断する方法が提供される。 【００３９】本発明のなおさらなる局面によれば、科学
的研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に
関連するインビトロの目的のために、そのようなポリペ
プチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを利用するプロセスが提供される。 【００４０】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるべきである。 【００４１】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定することを意味しない。 【００４２】本発明の１つの局面によれば、図１（配列
番号２）の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチ
ド、または１９９５年５月２６日にＡＴＣＣ受託番号 と
して寄託されたクローンのｃＤＮＡにコードされる成熟
ポリペプチドをコードする単離された核酸分子（ポリヌ
クレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドは、初期のヒト胚（８〜９
週）破骨細胞腫、成人心臓、またはいくつかの乳癌細胞
株から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト
結腸組織に由来するｃＤＮＡライブラリー中に発見され
た。これは、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーに構造的に
関連する。ＶＥＧＦ３は、２２１アミノ酸残基のタンパ
ク質をコードするオープンリーディングフレームを含
む。このタンパク質は、ヒト血管内皮増殖因子に対して
最大のアミノ酸配列相同性（３６．１９９％の同一性、
および６６．０６３％の類似性）を示す。 【００４３】８つすべてのシステインが、本発明のポリ
ペプチド内すべてで保存され、そしてＰＤＧＦ／ＶＥＧ
Ｆファミリーの特徴であるＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣ
Ｎが、ＶＥＧＦ３において保存される（図２を参照のこ
と）ことは特に重要である。 【００４４】本発明のＶＥＧＦ３ポリペプチドは、全長
ポリペプチドならびに任意のリーダー配列および全長ポ
リペプチドの活性フラグメントをコードするポリヌクレ
オチド配列を含むことが意図される。活性フラグメント
は、配列番号２および図１に示す全長アミノ酸配列の２
２１アミノ酸の全てよりも少ないアミノ酸を有するが、
図１において保存されることが示される８つのシステイ
ン残基をなお含み、そしてそのようなフラグメントはＶ
ＥＧＦ３活性をなお含む、全長アミノ酸配列の任意の部
分を含むことを意図する。 【００４５】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡの形態（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する）であり得る。
ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖で
ある場合は、コード鎖または非コード（アンチセンス）
鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配
列は、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託
したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるい
はそのコード配列が、遺伝コードの重複性または縮重の
結果として、図１（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託し
たｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異な
るコード配列であり得る。 【００４６】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得
る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ
チドのコード配列（および随意のさらなるコード配
列）、および非コード配列（例えば、イントロンまたは
成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または
３’の非コード配列）。 【００４７】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
包含する。 【００４８】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託した
クローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
の、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードす
る本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関す
る。ポリヌクレオチドの改変体は、このポリヌクレオチ
ドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはこのポリヌ
クレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。 【００４９】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポ
リヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図
１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、誘導体、またはアナログをコードする。そのよ
うなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、
および付加または挿入改変体を包含する。 【００５０】本明細書中上記で示したように、このポリ
ヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列
または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する
対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分
野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌク
レオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌク
レオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポ
リペプチドの機能を実質的に変化させない。 【００５１】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポ
リペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターによ
り供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。また
は、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、Ｃ
ＯＳ−７細胞）が使用される場合は、ヘマグルチニン
（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグはインフルエンザヘ
マグルチニンタンパク質に由来するエピトープと一致す
る（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。 【００５２】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生
に関与するＤＮＡのセグメントを意味する；これは、コ
ード領域に先行する領域および後に続く領域（リーダー
およびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント
（エキソン）の間の介在する配列（イントロン）を含
む。 【００５３】本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全
長ｃＤＮＡを単離するため、およびこの遺伝子に対する
高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の
ｃＤＮＡを単離するための、ｃＤＮＡライブラリーにつ
いてのハイブリダイゼーションプローブとして使用され
得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも
３０塩基を有し、そして、例えば、５０以上の塩基を含
み得る。このプローブをまた、全長転写物に対応するｃ
ＤＮＡクローン、およびゲノムクローン、または調節領
域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロン
を含む完全な遺伝子を含むクローンを同定するために使
用し得る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチド
プローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を使用し
て、遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。本
発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオ
リゴヌクレオチドを使用して、ヒトのｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニン
グし、このライブラリーのどのメンバーにこのプローブ
がハイブリダイズするかを決定する。 【００５４】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましく
は少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細書
中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用
語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも
９５％、および好ましくは少なくとも９７％の同一性が
存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じるこ
とを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上
記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託し
たｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質
的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する
ポリペプチドをコードする。 【００５５】あるいは、ポリヌクレオチドは、少なくと
も２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましく
は少なくとも５０塩基を有し得、これは本発明のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズし、そしてこれは本明細書
中上記のように、それらに対する同一性を有し、そして
これは活性を保持していてもいなくてもよい。例えば、
そのようなポリヌクレオチドを、配列番号１のポリヌク
レオチドについてのプローブとして、例えばこのポリヌ
クレオチドの回収のために、または診断プローブとし
て、またはＰＣＲプライマーとして使用し得る。 【００５６】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、そして
より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド、ならびにそれらのフラグメント（このフ
ラグメントは少なくとも３０塩基、そして好ましくは少
なくとも５０塩基を有する）、そしてそのようなポリヌ
クレオチドコードされるポリペプチドに関する。 【００５７】本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
約定の下に維持される。これらの寄託物は、単に当業者
への便宜のために提供されるのみであり、そして米国特
許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを認めた
わけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配
列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されてお
り、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も
抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売する
ためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実
施許諾はこれによって与えられるわけではない。 【００５８】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、
アナログ、および誘導体に関する。 【００５９】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを
いう場合は、図１（配列番号２）に示すＶＥＧＦタンパ
ク質の保存されたモチーフ、および本質的に同じ生物学
的な機能または活性を保持するポリペプチドを意味す
る。 【００６０】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドで
あり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００６１】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）そこで
１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基
（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてそ
のような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによ
りコードされるアミノ酸残基であり得るかあり得ないも
の、または（ｉｉ）そこで１以上のアミノ酸残基が置換
基を含有するもの、または（ｉｉｉ）そこで成熟ポリペ
プチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例
えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に
融合されているもの、または（ｉｖ）そこでさらなるア
ミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているもの、また
は（ｖ）そこで配列番号２に示すより少ないアミノ酸残
基を含み、そして保存されたモチーフを保持し、そして
なお依然としてＶＥＧＦファミリーのポリペプチドの特
徴的な活性を保持しているものであり得る。そのような
フラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中
の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 【００６２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。 【００６３】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、それが天然に存在する場合は、天然の環
境）から取り出されていることを意味する。例えば、生
きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは、単離されているわけでは
なく、しかし天然の系において共存する物質の幾らかま
たは全部と分離されている同一のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌ
クレオチドはベクターの一部であり得、および／または
そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組
成物の一部であり得るが、それにもかかわらずそのよう
なベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではな
い、という点で単離されている。 【００６４】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに配列番
号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性
（好ましくは少なくとも７０％の同一性）を有するポリ
ペプチド、そしてより好ましくは配列番号２のポリペプ
チドに対して少なくとも９０％の類似性（より好ましく
は少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチド、
そしてさらにより好ましくは配列番号２のポリペプチド
に対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好まし
くは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチド
を含み、そのようなポリペプチドの部分もまた含む（こ
のポリペプチドのそのような部分は、一般に、少なくと
も３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０
アミノ酸を含む）。 【００６５】当該分野に公知であるように、２つのポリ
ペプチドの間の「類似性」は、１つのポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２の
ポリペプチドの配列に対して比較することによって決定
される。 【００６６】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分を、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用し得る；従って、このフラグメ
ントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用し得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成
するために使用し得る。 【００６７】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。 【００６８】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作（形質導入されるか、また
は形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）
される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒
子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細
胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、
または本発明のＶＥＧＦ３遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地において培養され得る。培養
条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択
される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当
業者には明らかである。 【００６９】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターの任意の１つに含まれ
得る。そのようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染
色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。そ
のようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌
性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵
母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み
合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルス
ＤＮＡを包含する。しかし、宿主中で複製可能で、そし
て存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され
得る。 【００７０】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クター中に挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。そのような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。 【００７１】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（プロモーター）に作動的に連結され、ｍＲ
ＮＡの合成を指示する。そのようなプロモーターの代表
的な例としては、以下が挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ
４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒ
ｐ、λファージＰＬプロモーター、および原核生物細胞
または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝
子の発現を制御することが公知である他のプロモータ
ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクタ
ーはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得
る。 【００７２】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質（例え
ば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダク
ターゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉに
おけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）
を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。 【００７３】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００７４】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｆ９
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳ、またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書の教
示により当業者の範囲内であると考えられる。 【００７５】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して購入可能である。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔ
ｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核
生物性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、
ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ
３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、それらが宿主中で複製可能で、そして存
続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクタ
ーも使用され得る。 【００７６】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。
真核生物性プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミ
ジンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レト
ロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスＩ型メタロチオ
ネインを包含する。適切なベクターおよびプロモーター
の選択は、十分に当業者のレベル内である。 【００７７】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主
細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。
宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、またはエレクトロポレーションにより
達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。 【００７８】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチ
ドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得
る。 【００７９】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御
下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、そのようなタ
ンパク質を産生するために、本発明のＤＮＡ構築物に由
来するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核生物宿主お
よび真核生物宿主で使用される適切なクローニングベク
ターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載され
る。 【００８０】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクター内にエンハンサ
ー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常は約１０〜
約３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してそ
の転写を増大させる。例としては、複製起点（ｂｐ１０
０〜２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイト
メガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製
起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノ
ウイルスエンハンサーが挙げられる。 【００８１】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および
下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来プロ
モーターを含有する。そのようなプロモーターは、特に
解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱
ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し
得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配
列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列
と適切な相内で組立てられる。随意に、異種配列は、所
望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発現さ
れた組換え産物の安定化または簡略化された精製）を含
む融合タンパク質をコードし得る。 【００８２】細菌での使用に有用な発現ベクターは、所
望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な
翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能
的なプロモーターで作動可能な読みとり相で挿入するこ
とにより構築される。ベクターは、ベクターの維持を確
実にし、そして所望により宿主内での増幅を提供するた
めに１つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およ
びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々
の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得
る。 【００８３】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。そのよ
うな市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕ
ｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分
は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わされる。 【００８４】適切な宿主系統の形質転換および適切な細
胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモ
ーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的
誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養
される。 【００８５】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００８６】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得、そのような方法は、当業者に周知
である。 【００８７】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７
５（１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯ
Ｓ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の細
胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、
およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクタ
ーは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサ
ーを含み、そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプラ
イスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フラ
ンキング非転写配列をも含む。ＳＶ４０スプライスに由
来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は、必要な
非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。 【００８８】ポリペプチドは、以下の方法により組換え
細胞培養物から回収および精製され得る。これらの方法
は、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオン
または陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ
ースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキ
シルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンク
ロマトグラフィーを包含する。必要に応じて、タンパク
質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟
タンパク質を完全な配置とするために使用され得る。最
終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
が、最終的な精製工程に用いられ得る。 【００８９】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物または化学合成手順の産物であり得るか、または
原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から
組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用い
られる宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシ
ル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発
明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残
基を含み得る。 【００９０】ＶＥＧＦ３ポリペプチドを、脈管形成を促
進し、例えば、冠状動脈バイパス外科手術が行われる移
植組織の増殖を刺激するために使用し得る。ＶＥＧＦ３
をまた、創傷治癒を刺激するため、特に、損傷を受けた
組織、または新しい毛細管の脈管形成が所望される場所
で血管再生させるために使用し得る。ＶＥＧＦ３を、皮
膚の潰瘍（褥瘡を含む）、静脈の潰瘍、および糖尿病性
潰瘍のような全層創傷を処置するために使用し得る。さ
らに、ＶＥＧＦ３を、皮膚移植片または皮弁が全層熱傷
および全層損傷を修復するために使用される、このよう
な熱傷および損傷を処置するために使用し得る。ＶＥＧ
Ｆ３をまた、例えば、外傷による裂傷および外科手術に
関連する切断の修復のために、形成外科における使用の
ために使用し得る。 【００９１】これらと同じようにして、ＶＥＧＦ３を、
損傷を受けた骨、歯周組織、または靭帯組織の増殖を誘
導するために使用し得る。ＶＥＧＦ３をまた、疾患およ
び外傷によって損傷を受けた歯の支持組織（セメント質
および歯周靭帯を含む）を再生するために使用し得る。 【００９２】脈管形成は創傷を清潔かつ非感染に保つの
に重要であるので、ＶＥＧＦ３を、外科手術に関連し
て、および切断の修復後に使用し得る。ＶＥＧＦ３をま
た、感染の危険性が高い腹部創傷の処置のために使用し
得る。 【００９３】ＶＥＧＦ３を、血管移植手術において内皮
形成（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を促進
するために使用し得る。移植された材料または合成した
材料のいずれかを用いる血管移植片の場合、ＶＥＧＦ３
を移植片の表面または連結部に適用して血管内皮細胞の
増殖を促進し得る。ＶＥＧＦ３を、心筋梗塞の結果とし
ての心筋組織の損傷を修復するためにまた使用し得る。
ＶＥＧＦ３をまた、虚血後の心血管系を修復するために
使用し得る。ＶＥＧＦ３をまた、冠状動脈疾患、ならび
に末梢および中枢神経系の血管疾患の結果として損傷を
受けた血管組織を処置するために使用し得る。 【００９４】ＶＥＧＦ３をまた、身体内に移植されるべ
き人工の補てつ物または天然の器官を被覆して移植材料
の拒絶反応を最少にし、そして移植された材料の血管新
生を刺激するために使用し得る。 【００９５】ＶＥＧＦ３をまた、例えば、アテローム性
動脈硬化症の間に必要とされる、および血管組織が損傷
を受けるバルーン血管形成の後に必要とされる、血管組
織の修復のために使用し得る。 【００９６】ＶＥＧＦ３核酸配列およびＶＥＧＦ３ポリ
ペプチドをまた、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤ
ＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的のた
め、およびヒトの疾患を治療するための診断薬および治
療薬の産生のために使用し得る。例えば、ＶＥＧＦ３
を、血管内皮細胞のインビトロでの培養のために使用し
得、ここで、ＶＥＧＦ３は１０ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／
ｍｌの濃度で条件的培地に添加される。 【００９７】本発明は、ＶＥＧＦ３レセプターの同定の
ための方法を提供する。このレセプターをコードする遺
伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンド
パンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎ．，１（２），第５章、（１９９１）））によ
って同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使
用し、ここで、ポリアデニル化されたＲＮＡをＶＥＧＦ
３に応答する細胞から調製し、そしてこのＲＮＡから作
製したｃＤＮＡライブラリーをプールに分割し、そして
ＣＯＳ細胞またはＶＥＧＦ３に応答しない他の細胞をト
ランスフェクトするために使用する。ガラススライド上
で増殖するトランスフェクトされた細胞を、標識したＶ
ＥＧＦ３に曝す。ＶＥＧＦ３を、部位特異的タンパク質
キナーゼについての認識部位のヨウ素化または封入を含
む、種々の手段によって標識し得る。固定およびインキ
ュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフ
ィー分析に供する。陽性のプールを同定し、そしてサブ
プールを調製し、そして反復サブプール化および再スク
リーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、
最終的に推定のレセプターをコードする単一のクローン
を生じる。 【００９８】レセプター同定のための別のアプローチと
して、標識したＶＥＧＦ３は、細胞膜と光学的親和的に
結合され得るか、またはレセプター分子を発現する抽出
調製物であり得る。架橋した材料をＰＡＧＥによって分
離し、そしてＸ線フィルムに曝す。次いで、ＶＥＧＦ３
を含有する標識した複合体を取り出し、ペプチドフラグ
メントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供す
る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を使用し
て、縮重オリゴヌクレオチドプローブの対を設計し、ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセプ
ターをコードする遺伝子を同定する。 【００９９】本発明はまた、ＶＥＧＦ３のアゴニストま
たはアンタゴニストである化合物を同定するための化合
物のスクリーニング方法に関する。そのような方法の１
例は、コマイトジェンＣｏｎ Ａの存在下でヒト内皮細
胞の増殖を顕著に刺激するＶＥＧＦ３の能力を利用す
る。内皮細胞を得、そしてＣｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を補充した反応混合
物中で９６ウェル平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で培養する。Ｃｏｎ−Ａ、本
発明のポリペプチド、およびスクリーニングされるべき
化合物を添加する。３７℃でのインキュベーションの
後、［３Ｈ］を取り込むに十分な時間、１μＣｉの
３［Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７Ｂ
Ｇｑ；ＮＥＮ）を培養物に適用し、そしてグラスファイ
バーフィルター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）上に回収する。３
連の培養物の平均の３［Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐ
ｍ）を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）
を使用して決定する。化合物を除去するコントロールア
ッセイと比較して有意な［３Ｈ］チミジン取り込みは、
内皮細胞増殖の刺激を示す。 【０１００】アンタゴニストについてアッセイするため
に、上記のアッセイを行ない、そして化合物がＶＥＧＦ
３の存在下での３［Ｈ］チミジン取り込みを阻害する能
力は、この化合物がＶＥＧＦ３に対するアンタゴニスト
であることを示す。あるいは、ＶＥＧＦ３アンタゴニス
トと、競合阻害アッセイに適切な条件下で、ＶＥＧＦ３
および潜在的なアンタゴニストを、膜に結合したＶＥＧ
Ｆ３レセプターまたは組換えレセプターとを組合せるこ
とによって検出し得る。ＶＥＧＦ３を、例えば、放射能
によって標識し得、その結果、レセプターに結合したＶ
ＥＧＦ３分子の数が潜在的なアンタゴニストの有効性を
決定し得る。 【０１０１】あるいは、ＶＥＧＦ３とレセプターとの相
互作用の後の公知のセカンドメッセンジャーシステムの
応答を、この化合物の存在下または非存在下で測定し、
そして比較する。そのようなセカンドメッセンジャーシ
ステムは、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャ
ンネル、またはホスホイノシチド加水分解を包含する
が、これらに限定されない。別の方法において、ＶＥＧ
Ｆ３レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物
を、この化合物の存在下で、標識したＶＥＧＦ３と共に
インキュベートする。次いで、この相互作用を増強また
はブロックする、この化合物の能力を測定し得る。 【０１０２】潜在的なＶＥＧＦ３のアンタゴニストは、
抗体、またはある場合にはオリゴヌクレオチドを含み、
これはこのポリペプチドに結合し、そしてＶＥＧＦ３の
機能を有効に消去させる。あるいは、潜在的なアンタゴ
ニストは、ＶＥＧＦ３レセプターに結合する、密接に関
連するタンパク質であり得るが、しかし、それらはこの
ポリペプチドの不活性な形態であり、それによりＶＥＧ
Ｆ３の作用を妨げる。これらのアンタゴニストの例は、
ＶＥＧＦ３ポリペプチドのネガティブドミナント変異体
を包含し、例えば、ＶＥＧＦ３のヘテロ二量体形態の一
方の鎖は優性であり得、そして生物学的活性を保持しな
いように変異し得る。ネガティブドミナント変異体の例
は、二量体ＶＥＧＦ３の短縮版を包含する。これは別の
二量体と相互作用して、野生型ＶＥＧＦ３を形成し得る
が、しかし得られるホモ二量体は不活性であり、特徴的
なＶＥＧＦ活性を示すことができない。 【０１０３】別の潜在的なＶＥＧＦ３アンタゴニスト
は、アンチセンス技術を使用して調製されるアンチセン
ス構築物である。アンチセンス技術を、３重らせんの形
成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して遺伝
子発現を制御するために使用し得る。これらの方法は両
方ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合
に基づく。例えば、このポリヌクレオチド配列の５’コ
ード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、約
１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドは、遺伝子の転写に関与する領域に相補的
であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７
９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５
６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、そ
れにより、ＶＥＧＦ３の転写および産生を妨げる。アン
チセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲ
ＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧ
Ｆ３ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセン
ス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５
６０（１９９１）；遺伝子発現のアンチセンスインヒビ
ターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８
８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達
され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが
インビボで発現してＶＥＧＦ３の産生を阻害し得る。 【０１０４】潜在的なＶＥＧＦ３アンタゴニストはま
た、ポリペプチドの活性部位に結合し、そしてこの部位
を占め、それにより基質が触媒部位に接近できないよう
にし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる、低
分子を含む。低分子の例は、低分子ペプチドまたはペプ
チド様分子を包含するが、これらに限定されない。 【０１０５】アンタゴニストは、脈管形成および新血管
形成が腫瘍増殖に必須な段階であるので、腫瘍を処置す
るために使用され得る。ＶＥＧＦ３をコードするｍＲＮ
Ａは、少なくとも２種の乳癌細胞株において中程度のレ
ベルで発現されることが見出される。このことは、悪性
の表現型におけるＶＥＧＦ３ポリペプチドの役割を示
す。神経膠腫はまた、本発明のアンタゴニストで処置さ
れ得る新生物の１つのタイプである。 【０１０６】アンタゴニストはまた、血管透過性の増大
により引き起こされる炎症を処置するために使用され得
る。これらの疾患に加えて、アンタゴニストはまた、糖
尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を処置す
るために使用され得る。 【０１０７】アンタゴニストを、薬学的に受容可能なキ
ャリア（例えば、本明細書以下に記載するような）を有
する組成物中で使用し得る。 【０１０８】ＶＥＧＦ３ポリペプチド、ならびにアゴニ
ストおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと
組み合わせて使用され得る。そのような組成物は、治療
的有効量のポリペプチドまたはアゴニストもしくはアン
タゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは
賦形剤を含む。そのようなキャリアは、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組合せを包含するが、これ
らに限定されない。処方物は、投与の様式に合わせるべ
きである。 【０１０９】本発明はまた、１つ以上の本発明の薬学的
組成物の成分で充填した１つ以上の容器を備えた薬学的
パックまたはキットを提供する。そのような容器には、
薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統
制する政府機関によって指定される形式の通知を伴い
得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、ま
たは販売の機関による認可を表す。さらに、薬学的組成
物は、他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。 【０１１０】薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、
筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、または皮内経路のよう
な便利な方法で投与され得る。薬学的組成物は、特定の
適応症を処置および／または予防するのに有効な量で投
与される。一般に、薬学的組成物は、少なくとも約１０
μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場合
はこれらは一日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量
で投与される。ほとんどの場合、投薬は、投与経路、症
状などを考慮して、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重〜
約１ｍｇ／ｋｇ体重である。 【０１１１】ＶＥＧＦ３ポリペプチド、およびポリペプ
チドであるアゴニストまたはアンタゴニストはまた、イ
ンビボでのそのようなポリペプチドの発現により本発明
に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」
といわれる。 【０１１２】従って、例えば、骨髄細胞のような細胞
は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次
いで、操作された細胞はポリペプチドで処置されるべき
患者に提供される。そのような方法は当該分野で周知で
ある。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコード
するＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用によ
り、当該分野で公知の手順によって操作され得る。 【０１１３】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞
は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボで
のポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。そ
のような方法により本発明のポリペプチドを投与するた
めのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示によ
り当業者には明らかであるはずである。例えば、細胞を
操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以
外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これ
は、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで
細胞を操作するために使用され得る。 【０１１４】本明細書中上記で述べたレトロウイルスプ
ラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスは、モ
ロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロ
ウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫
ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病
ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス）、アデノウイル
ス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを包
含するが、これらに限定されない。１つの実施態様にお
いて、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニー
マウス白血病ウイルスに由来する。 【０１１５】ベクターは１つ以上のプロモーターを含
む。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター、およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， 第７巻、第９号，
９８０−９９０（１９８９）に記載される）、または他
の任意のプロモーター（例えば、真核生物細胞性プロモ
ーターのような細胞プロモーター（ヒストン、ｐｏｌ
ＩＩＩ、およびβ−アクチンのプロモーターを包含する
が、これらに限定されない））を包含するが、これらに
限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーター
は、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ
（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプ
ロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切
なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示か
ら、当業者に明らかである。 【０１１６】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロ
モーターのようなアデノウイルスプロモーター；または
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような
異種プロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモータ
ー；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ーのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモータ
ー；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモータ
ー；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジン
キナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナー
ゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書上記
の改変したレトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチ
ンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーター
を包含するが、これらに限定されない。プロモーターは
また、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然
のプロモーターであり得る。 【０１１７】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株を形質導入してプロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１
７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、Ｖ
Ｔ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株
（その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉ
ｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，第
１巻、５−１４頁（１９９０）に記載される）を包含す
るが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で
公知の任意の手段を介してパッケージング細胞を形質導
入し得る。そのような手段は、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱を包含す
るが、これらに限定されない。別のものでは、レトロウ
イルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル
化され得るか、または脂質に結合され得、次いで宿主に
投与され得る。 【０１１８】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルス
ベクター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれか
で、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。
形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコード
する核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細
胞は、胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、
肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮
細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、これらに限
定されない。 【０１１９】本発明はまた、ＶＥＧＦ３核酸配列中の変
異の存在と関連する疾患または疾患に対する感受性を検
出するための診断アッセイの一部としてのＶＥＧＦ３遺
伝子の使用に関する。 【０１２０】ＶＥＧＦ３遺伝子に変異を有する個体は、
種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断の
ための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、
組織生検、および剖検材料）から得られ得る。ゲノムＤ
ＮＡは、検出のために直接使用され得るか、または分析
の前にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４：
１６３−１６６（１９８６））を使用して酵素的に増幅
され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的のた
めに使用され得る。例として、ＶＥＧＦ３をコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーが、ＶＥＧＦ３変異を
同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失
および挿入が、正常な遺伝子型との比較における増幅産
物のサイズの変化によって検出され得る。点変異が、増
幅されたＤＮＡを放射標識されたＶＥＧＦ３ ＲＮＡ、
あるいは放射標識されたＶＥＧＦ３アンチセンスＤＮＡ
配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。
完全にマッチした配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化により、
または融解温度の違いにより、ミスマッチな二重鎖から
区別され得る。 【０１２１】ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的試験は、
変性剤を用いるかまたは用いない、ゲル中でのＤＮＡフ
ラグメントの電気泳動移動度の変化の検出によって達成
され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲ
ル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のＤＮ
Ａフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメントの移動度
がそれらの特異的融解温度または部分的融解温度に従っ
てゲル中で異なる位置に遅れる、変性ホルムアミド勾配
ゲル上で識別され得る（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３０：１２４２（１９８５）を参照のこ
と）。 【０１２２】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮａ
ｓｅプロテクション、およびＳ１プロテクションのよう
なヌクレアーゼプロテクションアッセイ、または化学的
切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，
８５：４３９７−４４０１（１９８５））によって示さ
れ得る。 【０１２３】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、化学
的切断、直接的ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用
（例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ））、および
ゲノムＤＮＡのサザンブロットのような方法によって達
成され得る。 【０１２４】より伝統的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加えて、変異はインサイチュ分析によってもま
た検出され得る。 【０１２５】本発明はまた、正常なコントロールの組織
サンプルと比較したＶＥＧＦ３タンパク質の過剰発現
が、疾患（例えば、異常な細胞分化）の存在または疾患
に対する感受性を検出し得るので、種々の組織における
ＶＥＧＦ３タンパク質のレベルの変化を検出するための
診断アッセイに関する。宿主由来のサンプル中のＶＥＧ
Ｆ３タンパク質のレベルを検出するために使用されるア
ッセイは、当業者に周知であり、そして、ラジオイムノ
アッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分
析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッ
セイを包含する。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎ
ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，１（２），第６章、（１９９１））
は、最初に、ＶＥＧＦ３抗原に特異的な抗体、好ましく
はモノクローナル抗体、を調製する工程を包含する。さ
らに、レポーター抗体が、モノクローナル抗体に対して
調製される。レポーター抗体に、放射能、蛍光、または
本実施例では、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のよう
な検出可能な試薬が結合される。サンプルを宿主から取
り出し、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体
支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキ
ュベートする。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタ
ンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミンのような非特
異的タンパク質と共にインキュベートすることによって
覆う。次に、モノクローナル抗体をディッシュ内でイン
キュベートし、その間にモノクローナル抗体がポリスチ
レンディッシュに結合した任意のＶＥＧＦ３タンパク質
に結合する。全ての結合していないモノクローナル抗体
を、緩衝液で洗浄して除去する。西洋ワサビペルオキシ
ダーゼに結合させたレポーター抗体をディッシュ内に入
れ、ＶＥＧＦ３に結合した任意のモノクローナル抗体へ
レポーター抗体を結合させる。次いで、結合していない
レポーター抗体を洗浄して除去する。次いで、ペルオキ
シダーゼ基質をディッシュに添加し、そして標準曲線と
比較した場合、所定の時間内の発色の量が、患者のサン
プルの所定の容量内に存在するＶＥＧＦ３タンパク質の
量の測定値である。 【０１２６】競合アッセイが使用され得、ここではＶＥ
ＧＦ３に特異的な抗体が固体支持体に結合される。次い
で本発明のポリペプチドを、例えば、放射能によって標
識し、そして宿主由来のサンプルを固体支持体に通過さ
せ、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラ
フィーによって検出される標識の量を、サンプル中のＶ
ＥＧＦ３の量に相関付け得る。 【０１２７】「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡ
アッセイに類似する。「サンドイッチ」アッセイにおい
て、ＶＥＧＦ３を固体支持体に通過させ、そして固体支
持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第２の抗体
をＶＥＧＦ３に結合させる。次いで、標識されかつ第２
の抗体に対して特異的な第３の抗体を固体支持体に通過
させ、そして第２の抗体に結合させ、次いで量を定量し
得る。 【０１２８】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
であり得る。配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色体位置のマーキングに利用可能
な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体マー
キング試薬はほとんどない。本発明による染色体へのＤ
ＮＡのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝
子とを相関させることにおける重要な第１段階である。 【０１２９】簡略に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマッピングされ得る。ｃＤＮＡの
コンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエ
キソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑にする
プライマーを迅速に選択するために使用される。次い
で、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有す
る体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用さ
れる。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含有する
ハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。 【０１３０】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、類似の方法において特定の染色
体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクロ
ーンのプールを用いて下部位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌ
ｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。その染色体にマッピ
ングするために同様に使用され得る他のマッピングスト
ラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、フ
ローサイトメトリーで選別した標識した染色体でのプレ
スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラ
リーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前
選択を包含する。 【０１３１】中期染色体展開物へのｃＤＮＡクローンの
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、５０または６０塩基という短いｃ
ＤＮＡで使用され得る；この技術の総説としては、Ｖｅ
ｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａＭ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ．ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）を参照のこと。 【０１３２】一旦配列が正確な染色体位置にマッピング
されると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地
図のデータと相関させ得る。（そのようなデータは、例
えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉ
ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎＭａｎに見出される（Ｊｏ
ｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＷｅｌ
ｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライン
で入手可能である））。次いで、同一の染色体領域にマ
ッピングされた遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物
理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１３３】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変
異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正
常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因
となる因子であると考えられる。 【０１３４】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的な原因となる遺伝子の１つであり得る。
（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして２
０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチ
ド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそ
れらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、そ
れらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用
され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はま
た、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならび
にＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリー
の産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、そ
のような抗体およびフラグメントの産生のために使用さ
れ得る。 【０１３５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくはヒトでない。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
を結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体を結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、そのような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からポリペプチドを単離するために使用され得
る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続
培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用
され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏ
ｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂ
ｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生す
るためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９
８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられ
る。 【０１３６】単鎖抗体の産生について記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスを、
本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体
を発現させるために使用し得る。 【０１３７】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はそのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。全ての部または量は、他に
明記しない限り重量基準である。 【０１３８】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い所定の方法および／または用語を記載
する。 【０１３９】「プラスミド」は、大文字および／または
数字の前および／または後の小文字のｐにより示され
る。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるかまた
は制限無く公的に入手可能であるかのいずれかであり、
または公開された手順に従って入手可能なプラスミドか
ら構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価
のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者に
は明らかである。 【０１４０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の所定の配
列でのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒反応的に切断
することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵
素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因
子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用さ
れた。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに約２
０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のた
めのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的に
は５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、
より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のため
の適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定され
る。３７℃にての約１時間のインキュベーション時間が
通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従っ
て変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミド
ゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離す
る。 【０１４１】切断されたフラグメントのサイズ分離は、
Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載され
た８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 【０１４２】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。 【０１４３】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、前出、１４６頁）。他
に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条
件で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメン
ト０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。 【０１４４】他に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に
記載のように実施した。 【０１４５】 【実施例】実施例１ バキュロウイルス発現系を用いるＶＥＧＦ３のクローニ
ングおよび発現 ＶＥＧＦ３タンパク質をコードする寄託したクローンに
含まれるＤＮＡを、遺伝子の５’配列および３’配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅した：５’プライマーは、配列５’ＧＣＡＴＧＧＡ
ＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣ（配列
番号４）を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位、およ
びＶＥＧＦ３の５’配列に相補的なヌクレオチド配列
（ヌクレオチド１５０−１６６）を含む。 【０１４６】３’プライマーは、配列５’ＧＣＡＴＴＣ
ＴＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣ
３’（配列番号５）を有し、そして制限酵素ＸｂａＩの
切断部位、およびＶＥＧＦ３の３’配列に相補的なヌク
レオチドを含む。 【０１４７】増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．）を用いて、１％アガロースゲルか
ら単離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアー
ゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで再び１％
アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、リ
ーダーペプチド配列を有するＡ２ＧＰバキュロウイルス
移入ベクター（ＰＨａｒｍｉｎｇｅｎ）にＢａｍＨＩお
よびＸｂａＩ部位で連結した。この連結によって、ＶＥ
ＧＦ３ ｃＤＮＡをバキュロウイルスｇｐ６７遺伝子の
シグナル配列とともにインフレームでクローン化し、そ
してベクター中のシグナル配列の３’末端に配置した。
これをｐＡ２ＧＰ−ＶＥＧＦ３と称する。 【０１４８】発現のためにｐＲＧ１ベクターにｇｐ６７
遺伝子のシグナル配列とともにＶＥＧＦ３をクローン化
するために、シグナル配列およびいくつかの上流の配列
を有するＶＥＧＦ３を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵
素により、ＶＥＧＦ３ ｃＤＮＡの上流に位置するＸｈ
ｏ制限エンドヌクレアーゼ部位、およびＸｂａＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ部位で、ｐＡ２ＧＰ−ＶＥＧＦ３プラ
スミドから切り出した。このフラグメントを１％アガロ
ースゲル上で残りのベクターから分離し、そして「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」キットを使用して精製した。このフラ
グメントを、Ｆ２と称した。 【０１４９】Ａ２ＧＰベクター（ｐＶＬ９４１ベクター
の変異体）をバキュロウイルス発現系を用いるＶＥＧＦ
３タンパク質の発現のために用いる（総説については、
Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．
１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆ
ｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓａｎｄ
ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌ
ｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。この発現
ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポ
リヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ、
およびＡｓｐ７１８の認識部位を含む。制限エンドヌク
レアーゼＸｈｏＩについての部位は、ＢａｍＨＩ部位の
上流に位置する。ＸｈｏＩとＢａｍＨＩとの間の配列
は、ｐＡｃＧｐ６７Ａベクター中のその配列と同じであ
る。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部
位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換え
ウイルスを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポ
リアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモーター
と同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、同時トラン
スフェクトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同
組換えのためにウイルス配列により両端で隣接させる。
多くの他のバキュロウイルスベクターが、Ａ２ＧＰの代
わりに用いられ得る。例えば、ｐＲＧ１、ｐＡｃ３７
３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１（Ｌｕｃｋｏ
ｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）。 【０１５０】プラスミドを制限酵素ＸｂｏＩおよびＸｂ
ａＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウ
シ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、
市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して、Ｄ
ＮＡを１％アガロースゲルより単離した。このベクター
ＤＮＡをＶ２と称する。 【０１５１】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、
そして酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて、ＶＥＧ
Ｆ３遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃ ｇｐ６７−
ＶＥＧＦ３）を含む細菌を同定した。クローン化フラグ
メントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。 【０１５２】５μｇのプラスミドｐＢａｃ Ａ２ＧＰ−
ＶＥＧＦ３を、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
４：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．
０ｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂａｃｕ
ｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮ
Ａ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ．）とともに同時トランスフェクトした。 【０１５３】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイル
スＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃ Ａ２ＧＰ
−ＶＥＧＦ３を、５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープ
レートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌリ
ポフェクチンおよび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加
し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートし
た。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清
を有さないＧｒａｃｅ培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織
培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １７１１）に滴下して加えた。プレートを、
新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振盪し
た。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベート
した。５時間後、トランスフェクション溶液をプレート
から除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍ
ｌのＧｒａｃｅ昆虫培地を添加した。プレートをインキ
ュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続け
た。 【０１５４】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法としては、「Ｂｌｕｅ
Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）と共にアガロースゲ
ルを用いた。これは、青く染色されたプラークの容易な
単離を可能とする。（「プラークアッセイ」の詳細な記
述はまた、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇにより配布される昆虫
細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９
〜１０頁）においても見い出され得る）。 【０１５５】連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加
し、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブに再懸濁した。寒天を、短時間の遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を
使用して、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞
に感染させた。４日後、これらの培養ディッシュの上清
を回収し、次いで４℃で保存した。 【０１５６】Ｓｆ９細胞を、１０％熱失活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）１で組換えバキュロウイルスＶ−Ａ２Ｇ
Ｐ−ＶＥＧＦ３で感染させた。６時間後、培地を除去
し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９
００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。
４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μ
Ｃｉの３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し
た。細胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後
細胞を遠心分離により回収し、そして標識されたタンパ
ク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
により可視化した。 【０１５７】培地およびＳｆ９細胞の細胞質由来のタン
パク質を、還元条件下または非還元条件下でＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分析した。培地を、５０ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ５．８）に対して透析した。透析の後に沈澱を
得、そして１００ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）中に
再懸濁した。再懸濁した沈澱を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って再度分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで
染色した。 【０１５８】培地の上清をまた、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐ
Ｈ５．８）中で１：１０に希釈し、そして１ｍｌ／分の
流速でＳＰ−６５０Ｍカラム（１．０×６．６ｃｍ、Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ）に適用した。タンパク質を、２０
０、３００、および５００ｍＭＮａＣｌでの段階勾配で
溶出した。ＶＥＧＦ３を、５００ｍＭでの溶出を用いて
得た。溶出物を還元剤β−メルカプトエタノールの存在
下または非存在下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そし
てクマシーブリリアントブルーで染色した。 【０１５９】実施例２ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得ら
れる組織を組織培養培地中に置き、そして小片に分け
る。組織の小塊を、組織培養フラスコの湿った表面上に
置き、各フラスコ中におよそ１０片を置く。フラスコの
上下を逆さにし、密閉し、そして室温に一晩放置する。
室温で２４時間後、フラスコを反転させ、そして組織塊
をフラスコの底に付着したままにし、そして新鮮な培地
（例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレ
プトマイシンを有するＨａｍのＦ１２培地）を添加す
る。次いで、これを３７℃でおよそ１週間インキュベー
トする。この時点で新鮮な培地を添加し、その後数日ご
とに取り替える。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の
単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより
大きなフラスコに大きく（ｓｃａｌｅ）する。 【０１６０】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，
Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７： ２１９−２５（１９８
８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化
し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状
ベクターをアガロースゲル上で分別し、そしてガラスビ
ーズを用いて精製する。 【０１６１】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応
するＰＲＣプライマーを用いて増幅する。５’プライマ
ーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウ
イルス直鎖状骨格、ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つの
フラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混
合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次い
で、これを、適切に挿入された目的の遺伝子をベクター
が有することを確認する目的のために、カナマイシン含
有寒天上にプレーティングする。 【０１６２】アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋
ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（Ｃ
Ｓ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有する
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にお
ける組織培養物中で、コンフルエントな密度になるまで
増殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培
地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形
質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子
を含有する感染性ウイルス粒子を産生する（この時点で
パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれ
る）。 【０１６３】新鮮な培地を、形質導入したプロデューサ
ー細胞に添加し、その後、コンフルエントなプロデュー
サー細胞の１０ｃｍプレートから培地を回収する。感染
性ウイルス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポア（ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過して、剥離
したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用
いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサ
ブコンフルエントなプレートから除去し、そして直ちに
プロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地
を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの
力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、
そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選
択マーカー（例えば、ｎｅｏ、またはｈｉｓ）を有する
レトロウイルスベクターを使用することが必要である。 【０１６４】次いで、操作された線維芽細胞は、単独
で、またはｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアービー
ズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれ
かで、宿主に注入する。この時点で、線維芽細胞は、タ
ンパク質産物を産生する。 【０１６５】実施例３ ＶＥＧＦ３の細菌発現および精製 ＶＥＧＦ３をコードする寄託したクローンのＤＮＡを、
プロセシングされたＶＥＧＦ３タンパク質（シグナルペ
プチド配列を除く）の５’配列に対応するＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーおよびＶＥＧＦ３遺伝子に対し
て３’側のベクター配列を使用して、最初に増幅する。
ＶＥＧＦ３に対応するさらなるヌクレオチドを５’配列
および３’配列にそれぞれ加えた。５’オリゴヌクレオ
チドプライマーは、配列５’ＧＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣ
ＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＴＣ（配列番号６）を
有し、ＳｐｈＩ制限酵素部位、それに続くプロセシング
されたタンパク質コドンの推定の末端アミノ酸から始ま
るＶＥＧＦ３コード配列を含む。３’配列５’ＧＡＣＴ
ＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣ
３’（配列番号７）は、ＶＥＧＦ３ＤＮＡ挿入物の３’
側に位置するＢｇｌＩ部位に相補的な配列を含む。制限
酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−７０（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃ
ｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）上の制限酵素
部位に一致する。ｐＱＥ−７０は、抗生物質耐性（Ａｍ
ｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−調節可
能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結
合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部
位をコードする。次いでｐＱＥ−９をＳｐｈＩおよびＢ
ｇｌＩＩで消化した。増幅した配列を、ｐＱＥ−７０に
連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードす
る配列とインフレームで挿入した。次いで、連結混合物
を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載の手順に従っ
て、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラ
スミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含んでおり、これは
ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシ
ン耐性（Ｋａｎｒ）に寄与する。形質転換体を、ＬＢプ
レートで増殖するそれらの能力によって同定し、そして
アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。
プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確
認した。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１０
０μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方
を補充したＬＢ培地中の液体培養物中で、一晩（Ｏ／
Ｎ）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を使用して、１：１００
〜１：２５０の比で、大きな培養物を接種する。細胞を
０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ．
６００）まで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプ
ロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を１ｍＭ
の最終濃度まで添加した。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレ
ッサーを不活化することにより、Ｐ／Ｏの開放（ｃｌｅ
ａｒ）を誘導して、遺伝子発現の増加を導く。細胞を、
さらに３〜４時間、増殖させた。次いで、細胞を遠心分
離によって回収した。細胞ペレットを、カオトロピック
剤の６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化した。澄明化後、
可溶化したＶＥＧＦ３を、６−Ｈｉｓタグを含むタンパ
ク質による強い結合を可能にする条件下で、ニッケルキ
レートカラムのクロマトグラフィーによってこの溶液か
ら精製した（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４（１９８
４））。ＶＥＧＦ３を、６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ
５．０）中でカラムから溶出し、そして再生の目的のた
めに、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリ
ウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）、および２ｍＭ
グルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での１
２時間のインキュベートション後、タンパク質を１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムに対して透析した。 【０１６６】本発明の多くの改変および変形が、上記の
教示を考慮すれば可能であり、従って、添付の請求の範
囲の範囲内で本発明は特に記載した以外の方法で実施さ
れ得る。 【０１６７】 【表１Ａ】 【０１６８】 【表１Ｂ】【０１６９】 【表１Ｃ】 【０１７０】 【発明の効果】本発明は、上述した構成であるので、前
述した課題が達成される。
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにそのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発
明のポリペプチドは、血管内皮増殖因子ファミリーのメ
ンバーとして同定された。より詳細には、本発明のポリ
ペプチドは血管内皮増殖因子３であり、時折、本明細書
中以下で「ＶＥＧＦ３」という。本発明はまた、そのよ
うなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】新たな血管の形成、すなわち脈管形成
は、胚の発生、それに続く成長、および組織修復のため
に必須である。しかし、脈管形成は、新生物（例えば、
腫瘍および神経膠腫）のような特定の病的状態に必須な
部分である。そして異常な脈管形成は、炎症、慢性関節
リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜症のような他の疾
患に関連する（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＫｌａｇｓ
ｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２−４
４７，（１９８７））。 【０００３】酸性および塩基性の両方の線維芽細胞増殖
因子分子は、内皮細胞および他の細胞タイプについての
マイトジェンである。アンギオトロピン（ａｎｇｉｏｔ
ｒｏｐｉｎ）およびアンギオゲニンは脈管形成を誘導し
得るが、これらの機能は不明である（Ｆｏｌｋｍａｎ，
Ｊ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１５
３−１７０頁，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｐｒ
ｅｓｓ）。血管内皮細胞に対して高度に選択的なマイト
ジェンは、血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧＦであり
（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１
３：１９−３２，（１９９２））、血管透過因子（ＶＰ
Ｆ）としても知られる。血管内皮増殖因子は、その標的
細胞特異性が血管内皮細胞に制限されているようであ
る、分泌される脈管形成マイトジェンである。 【０００４】マウスＶＥＧＦ遺伝子は、特徴付けられ、
そして胚形成におけるその発現パターンが解析された。
ＶＥＧＦの持続的な発現が、有窓内皮に隣接する上皮細
胞において（例えば、脈絡叢および腎糸球体において）
観察された。このデータは、内皮細胞の増殖および分化
の多機能性レギュレーターとしてのＶＥＧＦの役割に一
致する（Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ，１１４：５２１−５３２（１９９２））。 【０００５】ＶＥＧＦは、間葉細胞についてのマイトジ
ェンである血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のα鎖およ
びβ鎖、ならびに内皮細胞マイトジェンである胎盤増殖
因子（ＰＬＧＦ）に構造的に関連する。これらの３つの
タンパク質は、同一のファミリーに属し、そして保存さ
れたモチーフを共有する。ジスルフィド結合の形成に寄
与する８つのシステイン残基は、これらのタンパク質に
おいて厳密に保存される。オルタナティブスプライシン
グされたｍＲＮＡが、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、およびＰＤ
ＧＦのいずれについても同定されており、そしてこれら
の異なるスプライシング産物は、生物学的活性およびレ
セプター結合特異性が異なる。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ
は、ホモ二量体またはヘテロ二量体として機能し、そし
てレセプターに結合する。このレセプターは、レセプタ
ーの二量体化の後に内因性のチロシンキナーゼ活性を顕
す。 【０００６】ＶＥＧＦは、オルタナティブスプライシン
グによる、１２１、１６５、１８９、および２０６アミ
ノ酸の４つの異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１およ
びＶＥＧＦ１６５は、可溶性でありそして脈管形成を促
進し得る。一方、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ３０６
は、細胞表面中のヘパリン含有プロテオグリカンに結合
される。ＶＥＧＦの時期的および空間的な発現は、血管
の生理学的増殖に相関していた（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，
Ｃ．Ｍ．，およびＣａｒｂｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３９：５７０−５７９，（１９８
９）；ＭｃＮｅｉｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈ
ｎａｎ，Ｌ．，Ｗａｒｄｅｒ，Ｅ．，Ｄ’Ａｍｏｒｅ，
Ｐ．Ａ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０９：８１１
−８２２，（１９８９））。その高親和性結合部位は、
組織切片において内皮細胞上のみに位置付けられる（Ｊ
ａｋｅｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
８９：２４４−２５３，（１９８９））。この因子は下
垂体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、
そしてある種のヒト神経膠腫と関係している（Ｐｌａｔ
ｅ，Ｋ．Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４５−８４８，
（１９９２））。興味深いことに、ＶＥＧＦ１２１また
はＶＥＧＦ１６５の発現は、チャイニーズハムスター卵
巣細胞に、ヌードマウス中で腫瘍を形成する能力を与え
る（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．９１：１６０−１７０，（１９９３））。抗ＶＥ
ＧＦモノクローナル抗体によるＶＥＧＦ機能の阻害は、
免疫欠損マウスにおける腫瘍増殖を阻害することが示さ
れた（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４
１−８４４，（１９９３））。さらに、ＶＥＧＦレセプ
ターのドミナントネガティブ変異体が、マウスにおける
膠芽腫増殖を阻害することが示された。 【０００７】血管透過因子はまた、傷害の停止後でさえ
も血漿タンパク質に対する持続的な微小血管の高透過性
（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅ
ａｂｉｌｉｔｙ）（これは、正常な創傷治癒の特徴的な
特性である）を担うことが見出されている。これは、Ｖ
ＰＦが、創傷治癒における重要な因子であることを示唆
する。Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１７６：１３７５−９（１９９２）。 【０００８】ＶＥＧＦの発現は、血管新生した組織（例
えば、肺、心臓、胎盤、および固形腫瘍）において高
く、そして時間的および空間的の両方で脈管形成に相関
する。ＶＥＧＦはまた、インビボで脈管形成を誘導する
ことが示されている。脈管形成は正常組織、特に血管組
織の修復に必須であるので、ＶＥＧＦは血管組織修復を
促進させることにおける使用が提案されてきた（例え
ば、アテローム性動脈硬化症において）。 【０００９】Ｃｈｅｎらに１９９１年１２月１７日に発
行された米国特許第５，０７３，４９２号は、適切な環
境において内皮細胞の増殖を相乗的に増強するための方
法を開示する。この方法は、環境にＶＥＧＦ、エフェク
ター、および血清由来因子を添加する工程を包含する。
また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮＡが、
ポリメラーゼ連鎖反応技術により調製された。このＤＮ
Ａは、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれとしても
存在し得るタンパク質をコードする。このタンパク質
は、哺乳動物血管内皮細胞マイトジェンであり、そし
て、１９９２年９月３０日に公開された欧州特許出願第
９２３０２７５０．２号に開示されるように、それ自体
が血管の発達および修復の促進のために有用である。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明のポリペプチド
は、ヒトＶＥＧＦに対するアミノ酸配列相同性に基づい
て、新規な血管内皮増殖因子として推定的に同定され
た。 【００１１】本発明の１つの局面によれば、新規な成熟
ポリペプチド、ならびに生物学的に活性な、そして診断
的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体が提供される。本発明のポリペプチド
は、ヒト起源のポリペプチドである。 【００１２】 【課題を解決するための手段】本発明によると、以下の
項目１〜２０が提供され、上記目的が達成される。（項
目１．）単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）配列番号２に示すポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつこれに対して少なくとも７０％同一であるポリ
ヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌ
クレオチドフラグメント、からなる群より選択されるメ
ンバーを含む、ポリヌクレオチド。 【００１３】（項目２．）前記ポリヌクレオチドがＤＮ
Ａである、項目１に記載のポリヌクレオチド。 【００１４】（項目３．）配列番号２に示すポリペプチ
ドをコードする、項目２に記載のポリヌクレオチド。 【００１５】（項目４．）配列番号２に示すポリペプチ
ドをコードする、項目２に記載のポリヌクレオチド。 【００１６】（項目５．）配列番号２に示すポリペプチ
ドをコードする、項目２に記載のポリヌクレオチド。 【００１７】（項目６．）単離されたポリヌクレオチド
であって： （ａ）寄託したクローンに含まれるＤＮＡによってコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド； （ｂ）寄託したクローンに含まれるＤＮＡによって発現
されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし得、かつこれに対して少なくとも７０％同一
であるポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチ
ドのポリヌクレオチドフラグメント、からなる群より選
択されるメンバーを含む、ポリヌクレオチド。 【００１８】（項目７．）項目２に記載のＤＮＡを含
む、ベクター。 【００１９】（項目８．）項目７に記載のベクターで遺
伝子操作された宿主細胞。 【００２０】（項目９．）ポリペプチドを産生するため
のプロセスであって、項目８に記載の宿主細胞から前記
ＤＮＡによりコードされる前記ポリペプチドを発現させ
る工程を包含する、プロセス。 【００２１】（項目１０．）ポリペプチドを発現し得る
細胞を作製するためのプロセスであって、項目７に記載
のベクターで該細胞を形質転換またはトランスフェクト
する工程を包含する、プロセス。 【００２２】（項目１１．）ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘
導体；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸２２
１を含むポリペプチド；および（ｉｉｉ）受託したクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド、なら
びに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および
誘導体、からなる群より選択される、ポリペプチド。 【００２３】（項目１２．）項目１１に記載のポリペプ
チドに対するアゴニストとして有効な化合物。 【００２４】（項目１３．）項目１１に記載のポリペプ
チドに対するアンタゴニストとして有効な化合物。 【００２５】（項目１４．）ＰＧＳＧ−１を必要とする
患者の処置方法であって、該患者に項目１１に記載のポ
リペプチドの治療有効量を投与する工程を包含する、方
法。 【００２６】（項目１５．）前記治療有効量のポリペプ
チドが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを前記患者
に提供し、そして該ポリペプチドをインビボで発現させ
ることによって投与される、項目１４に記載の方法。 【００２７】（項目１６．）ＶＥＧＦ３を必要とする患
者の処置方法であって、該患者に項目１２に記載の化合
物の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。 【００２８】（項目１７．）ＶＥＧＦ３を阻害する必要
がある患者の処置方法であって、該患者に項目１３に記
載のアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を包含
する、方法。 【００２９】（項目１８．）項目１１に記載のポリペプ
チドの発現に関連する疾患または疾患に対する感受性を
診断するためのプロセスであって：該ポリペプチドをコ
ードする核酸配列における変異を決定する工程を包含す
る、プロセス。 【００３０】（項目１９．）診断プロセスであって：宿
主由来のサンプル中の項目１１に記載のポリペプチドの
存在について分析する工程を包含する、プロセス。 【００３１】（項目２０．）項目１１に記載のポリペプ
チドに対するレセプターに結合し、そして該レセプター
を活性化または阻害する化合物を同定するための方法で
あって：その表面上に該ポリペプチドに対するレセプタ
ーを発現している細胞を、該レセプターへの結合を可能
にする条件下で、スクリーニングされるべき化合物と接
触させる工程であって、該レセプターが、該レセプター
への化合物の結合に応答して検出可能なシグナルを提供
し得る第２の成分と結合している、工程；および該化合
物と該レセプターとの相互作用によって生じるシグナル
の存在または非存在を検出することによって、該化合物
が該レセプターに結合し、そして該レセプターを活性化
または阻害するかどうかを決定する工程、を包含する、
方法。 【００３２】 【発明の実施の形態】本発明の別の局面によれば、本発
明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提
供される。この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ならびに生物学的に活性な、そして
診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナ
ログ、および誘導体を含む。 【００３３】本発明のなお別の局面によれば、組換え技
術により、そのようなポリペプチドを産生するためのプ
ロセスが提供される。このプロセスは、本発明のポリペ
プチドをコードする核酸配列を含む、組換え原核生物宿
主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を、この
タンパク質の発現およびその後のこのタンパク質の回収
を促進する条件下で培養する工程を包含する。 【００３４】本発明のなおさらなる局面によれば、治療
的目的のため（例えば、脈管形成の刺激のため、創傷治
癒の刺激のため、および血管組織の修復の促進のため）
に、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを利用するための
プロセスが提供される。 【００３５】本発明のなお別の局面によれば、そのよう
なポリペプチドに対する抗体が提供される。 【００３６】本発明のなお別の局面によれば、そのよう
なポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、こ
れは、例えば、腫瘍の増殖を阻害するため、糖尿病性網
膜症、炎症、慢性関節リウマチ、および乾癬の処置のた
めに、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために
使用され得る。 【００３７】本発明の別の局面によれば、本発明の核酸
配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸
分子を含む、核酸プローブが提供される。 【００３８】本発明の別の局面によれば、本発明の核酸
配列およびそのような核酸配列にコードされるタンパク
質における変異に関する疾患または疾患に対する感受性
を診断する方法が提供される。 【００３９】本発明のなおさらなる局面によれば、科学
的研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に
関連するインビトロの目的のために、そのようなポリペ
プチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを利用するプロセスが提供される。 【００４０】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるべきである。 【００４１】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定することを意味しない。 【００４２】本発明の１つの局面によれば、図１（配列
番号２）の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチ
ド、または１９９５年５月２６日にＡＴＣＣ受託番号 と
して寄託されたクローンのｃＤＮＡにコードされる成熟
ポリペプチドをコードする単離された核酸分子（ポリヌ
クレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドは、初期のヒト胚（８〜９
週）破骨細胞腫、成人心臓、またはいくつかの乳癌細胞
株から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト
結腸組織に由来するｃＤＮＡライブラリー中に発見され
た。これは、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーに構造的に
関連する。ＶＥＧＦ３は、２２１アミノ酸残基のタンパ
ク質をコードするオープンリーディングフレームを含
む。このタンパク質は、ヒト血管内皮増殖因子に対して
最大のアミノ酸配列相同性（３６．１９９％の同一性、
および６６．０６３％の類似性）を示す。 【００４３】８つすべてのシステインが、本発明のポリ
ペプチド内すべてで保存され、そしてＰＤＧＦ／ＶＥＧ
Ｆファミリーの特徴であるＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣ
Ｎが、ＶＥＧＦ３において保存される（図２を参照のこ
と）ことは特に重要である。 【００４４】本発明のＶＥＧＦ３ポリペプチドは、全長
ポリペプチドならびに任意のリーダー配列および全長ポ
リペプチドの活性フラグメントをコードするポリヌクレ
オチド配列を含むことが意図される。活性フラグメント
は、配列番号２および図１に示す全長アミノ酸配列の２
２１アミノ酸の全てよりも少ないアミノ酸を有するが、
図１において保存されることが示される８つのシステイ
ン残基をなお含み、そしてそのようなフラグメントはＶ
ＥＧＦ３活性をなお含む、全長アミノ酸配列の任意の部
分を含むことを意図する。 【００４５】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡの形態（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する）であり得る。
ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖で
ある場合は、コード鎖または非コード（アンチセンス）
鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配
列は、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託
したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるい
はそのコード配列が、遺伝コードの重複性または縮重の
結果として、図１（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託し
たｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異な
るコード配列であり得る。 【００４６】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得
る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ
チドのコード配列（および随意のさらなるコード配
列）、および非コード配列（例えば、イントロンまたは
成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または
３’の非コード配列）。 【００４７】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
包含する。 【００４８】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託した
クローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
の、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードす
る本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関す
る。ポリヌクレオチドの改変体は、このポリヌクレオチ
ドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはこのポリヌ
クレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。 【００４９】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポ
リヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図
１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、誘導体、またはアナログをコードする。そのよ
うなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、
および付加または挿入改変体を包含する。 【００５０】本明細書中上記で示したように、このポリ
ヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列
または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する
対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分
野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌク
レオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌク
レオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポ
リペプチドの機能を実質的に変化させない。 【００５１】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポ
リペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターによ
り供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。また
は、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、Ｃ
ＯＳ−７細胞）が使用される場合は、ヘマグルチニン
（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグはインフルエンザヘ
マグルチニンタンパク質に由来するエピトープと一致す
る（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。 【００５２】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生
に関与するＤＮＡのセグメントを意味する；これは、コ
ード領域に先行する領域および後に続く領域（リーダー
およびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント
（エキソン）の間の介在する配列（イントロン）を含
む。 【００５３】本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全
長ｃＤＮＡを単離するため、およびこの遺伝子に対する
高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の
ｃＤＮＡを単離するための、ｃＤＮＡライブラリーにつ
いてのハイブリダイゼーションプローブとして使用され
得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも
３０塩基を有し、そして、例えば、５０以上の塩基を含
み得る。このプローブをまた、全長転写物に対応するｃ
ＤＮＡクローン、およびゲノムクローン、または調節領
域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロン
を含む完全な遺伝子を含むクローンを同定するために使
用し得る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチド
プローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を使用し
て、遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。本
発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオ
リゴヌクレオチドを使用して、ヒトのｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニン
グし、このライブラリーのどのメンバーにこのプローブ
がハイブリダイズするかを決定する。 【００５４】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましく
は少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細書
中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用
語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも
９５％、および好ましくは少なくとも９７％の同一性が
存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じるこ
とを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上
記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託し
たｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質
的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する
ポリペプチドをコードする。 【００５５】あるいは、ポリヌクレオチドは、少なくと
も２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましく
は少なくとも５０塩基を有し得、これは本発明のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズし、そしてこれは本明細書
中上記のように、それらに対する同一性を有し、そして
これは活性を保持していてもいなくてもよい。例えば、
そのようなポリヌクレオチドを、配列番号１のポリヌク
レオチドについてのプローブとして、例えばこのポリヌ
クレオチドの回収のために、または診断プローブとし
て、またはＰＣＲプライマーとして使用し得る。 【００５６】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、そして
より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド、ならびにそれらのフラグメント（このフ
ラグメントは少なくとも３０塩基、そして好ましくは少
なくとも５０塩基を有する）、そしてそのようなポリヌ
クレオチドコードされるポリペプチドに関する。 【００５７】本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
約定の下に維持される。これらの寄託物は、単に当業者
への便宜のために提供されるのみであり、そして米国特
許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを認めた
わけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配
列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されてお
り、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も
抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売する
ためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実
施許諾はこれによって与えられるわけではない。 【００５８】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、
アナログ、および誘導体に関する。 【００５９】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを
いう場合は、図１（配列番号２）に示すＶＥＧＦタンパ
ク質の保存されたモチーフ、および本質的に同じ生物学
的な機能または活性を保持するポリペプチドを意味す
る。 【００６０】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドで
あり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００６１】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）そこで
１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基
（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてそ
のような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによ
りコードされるアミノ酸残基であり得るかあり得ないも
の、または（ｉｉ）そこで１以上のアミノ酸残基が置換
基を含有するもの、または（ｉｉｉ）そこで成熟ポリペ
プチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例
えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に
融合されているもの、または（ｉｖ）そこでさらなるア
ミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているもの、また
は（ｖ）そこで配列番号２に示すより少ないアミノ酸残
基を含み、そして保存されたモチーフを保持し、そして
なお依然としてＶＥＧＦファミリーのポリペプチドの特
徴的な活性を保持しているものであり得る。そのような
フラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中
の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 【００６２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。 【００６３】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、それが天然に存在する場合は、天然の環
境）から取り出されていることを意味する。例えば、生
きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは、単離されているわけでは
なく、しかし天然の系において共存する物質の幾らかま
たは全部と分離されている同一のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌ
クレオチドはベクターの一部であり得、および／または
そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組
成物の一部であり得るが、それにもかかわらずそのよう
なベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではな
い、という点で単離されている。 【００６４】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに配列番
号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性
（好ましくは少なくとも７０％の同一性）を有するポリ
ペプチド、そしてより好ましくは配列番号２のポリペプ
チドに対して少なくとも９０％の類似性（より好ましく
は少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチド、
そしてさらにより好ましくは配列番号２のポリペプチド
に対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好まし
くは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチド
を含み、そのようなポリペプチドの部分もまた含む（こ
のポリペプチドのそのような部分は、一般に、少なくと
も３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０
アミノ酸を含む）。 【００６５】当該分野に公知であるように、２つのポリ
ペプチドの間の「類似性」は、１つのポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２の
ポリペプチドの配列に対して比較することによって決定
される。 【００６６】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分を、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用し得る；従って、このフラグメ
ントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用し得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成
するために使用し得る。 【００６７】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。 【００６８】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作（形質導入されるか、また
は形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）
される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒
子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細
胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、
または本発明のＶＥＧＦ３遺伝子を増幅するために適切
に改変した従来の栄養培地において培養され得る。培養
条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択
される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当
業者には明らかである。 【００６９】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターの任意の１つに含まれ
得る。そのようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染
色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。そ
のようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌
性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵
母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み
合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルス
ＤＮＡを包含する。しかし、宿主中で複製可能で、そし
て存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され
得る。 【００７０】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クター中に挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。そのような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。 【００７１】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（プロモーター）に作動的に連結され、ｍＲ
ＮＡの合成を指示する。そのようなプロモーターの代表
的な例としては、以下が挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ
４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒ
ｐ、λファージＰＬプロモーター、および原核生物細胞
または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝
子の発現を制御することが公知である他のプロモータ
ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクタ
ーはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得
る。 【００７２】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質（例え
ば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダク
ターゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉに
おけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）
を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。 【００７３】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００７４】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｆ９
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳ、またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書の教
示により当業者の範囲内であると考えられる。 【００７５】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して購入可能である。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔ
ｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核
生物性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、
ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ
３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、それらが宿主中で複製可能で、そして存
続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクタ
ーも使用され得る。 【００７６】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。
真核生物性プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミ
ジンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レト
ロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスＩ型メタロチオ
ネインを包含する。適切なベクターおよびプロモーター
の選択は、十分に当業者のレベル内である。 【００７７】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主
細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。
宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、またはエレクトロポレーションにより
達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。 【００７８】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチ
ドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得
る。 【００７９】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御
下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、そのようなタ
ンパク質を産生するために、本発明のＤＮＡ構築物に由
来するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核生物宿主お
よび真核生物宿主で使用される適切なクローニングベク
ターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載され
る。 【００８０】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクター内にエンハンサ
ー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常は約１０〜
約３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してそ
の転写を増大させる。例としては、複製起点（ｂｐ１０
０〜２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイト
メガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製
起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノ
ウイルスエンハンサーが挙げられる。 【００８１】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および
下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来プロ
モーターを含有する。そのようなプロモーターは、特に
解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱
ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し
得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配
列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列
と適切な相内で組立てられる。随意に、異種配列は、所
望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発現さ
れた組換え産物の安定化または簡略化された精製）を含
む融合タンパク質をコードし得る。 【００８２】細菌での使用に有用な発現ベクターは、所
望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な
翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能
的なプロモーターで作動可能な読みとり相で挿入するこ
とにより構築される。ベクターは、ベクターの維持を確
実にし、そして所望により宿主内での増幅を提供するた
めに１つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およ
びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々
の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得
る。 【００８３】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。そのよ
うな市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕ
ｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分
は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わされる。 【００８４】適切な宿主系統の形質転換および適切な細
胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモ
ーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的
誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養
される。 【００８５】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００８６】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得、そのような方法は、当業者に周知
である。 【００８７】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７
５（１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯ
Ｓ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の細
胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、
およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクタ
ーは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサ
ーを含み、そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプラ
イスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フラ
ンキング非転写配列をも含む。ＳＶ４０スプライスに由
来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は、必要な
非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。 【００８８】ポリペプチドは、以下の方法により組換え
細胞培養物から回収および精製され得る。これらの方法
は、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオン
または陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ
ースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキ
シルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンク
ロマトグラフィーを包含する。必要に応じて、タンパク
質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟
タンパク質を完全な配置とするために使用され得る。最
終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
が、最終的な精製工程に用いられ得る。 【００８９】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物または化学合成手順の産物であり得るか、または
原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から
組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用い
られる宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシ
ル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発
明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残
基を含み得る。 【００９０】ＶＥＧＦ３ポリペプチドを、脈管形成を促
進し、例えば、冠状動脈バイパス外科手術が行われる移
植組織の増殖を刺激するために使用し得る。ＶＥＧＦ３
をまた、創傷治癒を刺激するため、特に、損傷を受けた
組織、または新しい毛細管の脈管形成が所望される場所
で血管再生させるために使用し得る。ＶＥＧＦ３を、皮
膚の潰瘍（褥瘡を含む）、静脈の潰瘍、および糖尿病性
潰瘍のような全層創傷を処置するために使用し得る。さ
らに、ＶＥＧＦ３を、皮膚移植片または皮弁が全層熱傷
および全層損傷を修復するために使用される、このよう
な熱傷および損傷を処置するために使用し得る。ＶＥＧ
Ｆ３をまた、例えば、外傷による裂傷および外科手術に
関連する切断の修復のために、形成外科における使用の
ために使用し得る。 【００９１】これらと同じようにして、ＶＥＧＦ３を、
損傷を受けた骨、歯周組織、または靭帯組織の増殖を誘
導するために使用し得る。ＶＥＧＦ３をまた、疾患およ
び外傷によって損傷を受けた歯の支持組織（セメント質
および歯周靭帯を含む）を再生するために使用し得る。 【００９２】脈管形成は創傷を清潔かつ非感染に保つの
に重要であるので、ＶＥＧＦ３を、外科手術に関連し
て、および切断の修復後に使用し得る。ＶＥＧＦ３をま
た、感染の危険性が高い腹部創傷の処置のために使用し
得る。 【００９３】ＶＥＧＦ３を、血管移植手術において内皮
形成（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を促進
するために使用し得る。移植された材料または合成した
材料のいずれかを用いる血管移植片の場合、ＶＥＧＦ３
を移植片の表面または連結部に適用して血管内皮細胞の
増殖を促進し得る。ＶＥＧＦ３を、心筋梗塞の結果とし
ての心筋組織の損傷を修復するためにまた使用し得る。
ＶＥＧＦ３をまた、虚血後の心血管系を修復するために
使用し得る。ＶＥＧＦ３をまた、冠状動脈疾患、ならび
に末梢および中枢神経系の血管疾患の結果として損傷を
受けた血管組織を処置するために使用し得る。 【００９４】ＶＥＧＦ３をまた、身体内に移植されるべ
き人工の補てつ物または天然の器官を被覆して移植材料
の拒絶反応を最少にし、そして移植された材料の血管新
生を刺激するために使用し得る。 【００９５】ＶＥＧＦ３をまた、例えば、アテローム性
動脈硬化症の間に必要とされる、および血管組織が損傷
を受けるバルーン血管形成の後に必要とされる、血管組
織の修復のために使用し得る。 【００９６】ＶＥＧＦ３核酸配列およびＶＥＧＦ３ポリ
ペプチドをまた、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤ
ＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的のた
め、およびヒトの疾患を治療するための診断薬および治
療薬の産生のために使用し得る。例えば、ＶＥＧＦ３
を、血管内皮細胞のインビトロでの培養のために使用し
得、ここで、ＶＥＧＦ３は１０ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／
ｍｌの濃度で条件的培地に添加される。 【００９７】本発明は、ＶＥＧＦ３レセプターの同定の
ための方法を提供する。このレセプターをコードする遺
伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンド
パンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎ．，１（２），第５章、（１９９１）））によ
って同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使
用し、ここで、ポリアデニル化されたＲＮＡをＶＥＧＦ
３に応答する細胞から調製し、そしてこのＲＮＡから作
製したｃＤＮＡライブラリーをプールに分割し、そして
ＣＯＳ細胞またはＶＥＧＦ３に応答しない他の細胞をト
ランスフェクトするために使用する。ガラススライド上
で増殖するトランスフェクトされた細胞を、標識したＶ
ＥＧＦ３に曝す。ＶＥＧＦ３を、部位特異的タンパク質
キナーゼについての認識部位のヨウ素化または封入を含
む、種々の手段によって標識し得る。固定およびインキ
ュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフ
ィー分析に供する。陽性のプールを同定し、そしてサブ
プールを調製し、そして反復サブプール化および再スク
リーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、
最終的に推定のレセプターをコードする単一のクローン
を生じる。 【００９８】レセプター同定のための別のアプローチと
して、標識したＶＥＧＦ３は、細胞膜と光学的親和的に
結合され得るか、またはレセプター分子を発現する抽出
調製物であり得る。架橋した材料をＰＡＧＥによって分
離し、そしてＸ線フィルムに曝す。次いで、ＶＥＧＦ３
を含有する標識した複合体を取り出し、ペプチドフラグ
メントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供す
る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を使用し
て、縮重オリゴヌクレオチドプローブの対を設計し、ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセプ
ターをコードする遺伝子を同定する。 【００９９】本発明はまた、ＶＥＧＦ３のアゴニストま
たはアンタゴニストである化合物を同定するための化合
物のスクリーニング方法に関する。そのような方法の１
例は、コマイトジェンＣｏｎ Ａの存在下でヒト内皮細
胞の増殖を顕著に刺激するＶＥＧＦ３の能力を利用す
る。内皮細胞を得、そしてＣｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を補充した反応混合
物中で９６ウェル平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で培養する。Ｃｏｎ−Ａ、本
発明のポリペプチド、およびスクリーニングされるべき
化合物を添加する。３７℃でのインキュベーションの
後、［３Ｈ］を取り込むに十分な時間、１μＣｉの
３［Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７Ｂ
Ｇｑ；ＮＥＮ）を培養物に適用し、そしてグラスファイ
バーフィルター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）上に回収する。３
連の培養物の平均の３［Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐ
ｍ）を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）
を使用して決定する。化合物を除去するコントロールア
ッセイと比較して有意な［３Ｈ］チミジン取り込みは、
内皮細胞増殖の刺激を示す。 【０１００】アンタゴニストについてアッセイするため
に、上記のアッセイを行ない、そして化合物がＶＥＧＦ
３の存在下での３［Ｈ］チミジン取り込みを阻害する能
力は、この化合物がＶＥＧＦ３に対するアンタゴニスト
であることを示す。あるいは、ＶＥＧＦ３アンタゴニス
トと、競合阻害アッセイに適切な条件下で、ＶＥＧＦ３
および潜在的なアンタゴニストを、膜に結合したＶＥＧ
Ｆ３レセプターまたは組換えレセプターとを組合せるこ
とによって検出し得る。ＶＥＧＦ３を、例えば、放射能
によって標識し得、その結果、レセプターに結合したＶ
ＥＧＦ３分子の数が潜在的なアンタゴニストの有効性を
決定し得る。 【０１０１】あるいは、ＶＥＧＦ３とレセプターとの相
互作用の後の公知のセカンドメッセンジャーシステムの
応答を、この化合物の存在下または非存在下で測定し、
そして比較する。そのようなセカンドメッセンジャーシ
ステムは、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャ
ンネル、またはホスホイノシチド加水分解を包含する
が、これらに限定されない。別の方法において、ＶＥＧ
Ｆ３レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物
を、この化合物の存在下で、標識したＶＥＧＦ３と共に
インキュベートする。次いで、この相互作用を増強また
はブロックする、この化合物の能力を測定し得る。 【０１０２】潜在的なＶＥＧＦ３のアンタゴニストは、
抗体、またはある場合にはオリゴヌクレオチドを含み、
これはこのポリペプチドに結合し、そしてＶＥＧＦ３の
機能を有効に消去させる。あるいは、潜在的なアンタゴ
ニストは、ＶＥＧＦ３レセプターに結合する、密接に関
連するタンパク質であり得るが、しかし、それらはこの
ポリペプチドの不活性な形態であり、それによりＶＥＧ
Ｆ３の作用を妨げる。これらのアンタゴニストの例は、
ＶＥＧＦ３ポリペプチドのネガティブドミナント変異体
を包含し、例えば、ＶＥＧＦ３のヘテロ二量体形態の一
方の鎖は優性であり得、そして生物学的活性を保持しな
いように変異し得る。ネガティブドミナント変異体の例
は、二量体ＶＥＧＦ３の短縮版を包含する。これは別の
二量体と相互作用して、野生型ＶＥＧＦ３を形成し得る
が、しかし得られるホモ二量体は不活性であり、特徴的
なＶＥＧＦ活性を示すことができない。 【０１０３】別の潜在的なＶＥＧＦ３アンタゴニスト
は、アンチセンス技術を使用して調製されるアンチセン
ス構築物である。アンチセンス技術を、３重らせんの形
成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して遺伝
子発現を制御するために使用し得る。これらの方法は両
方ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合
に基づく。例えば、このポリヌクレオチド配列の５’コ
ード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、約
１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドは、遺伝子の転写に関与する領域に相補的
であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７
９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５
６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、そ
れにより、ＶＥＧＦ３の転写および産生を妨げる。アン
チセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲ
ＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧ
Ｆ３ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセン
ス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５
６０（１９９１）；遺伝子発現のアンチセンスインヒビ
ターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８
８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達
され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが
インビボで発現してＶＥＧＦ３の産生を阻害し得る。 【０１０４】潜在的なＶＥＧＦ３アンタゴニストはま
た、ポリペプチドの活性部位に結合し、そしてこの部位
を占め、それにより基質が触媒部位に接近できないよう
にし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる、低
分子を含む。低分子の例は、低分子ペプチドまたはペプ
チド様分子を包含するが、これらに限定されない。 【０１０５】アンタゴニストは、脈管形成および新血管
形成が腫瘍増殖に必須な段階であるので、腫瘍を処置す
るために使用され得る。ＶＥＧＦ３をコードするｍＲＮ
Ａは、少なくとも２種の乳癌細胞株において中程度のレ
ベルで発現されることが見出される。このことは、悪性
の表現型におけるＶＥＧＦ３ポリペプチドの役割を示
す。神経膠腫はまた、本発明のアンタゴニストで処置さ
れ得る新生物の１つのタイプである。 【０１０６】アンタゴニストはまた、血管透過性の増大
により引き起こされる炎症を処置するために使用され得
る。これらの疾患に加えて、アンタゴニストはまた、糖
尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を処置す
るために使用され得る。 【０１０７】アンタゴニストを、薬学的に受容可能なキ
ャリア（例えば、本明細書以下に記載するような）を有
する組成物中で使用し得る。 【０１０８】ＶＥＧＦ３ポリペプチド、ならびにアゴニ
ストおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと
組み合わせて使用され得る。そのような組成物は、治療
的有効量のポリペプチドまたはアゴニストもしくはアン
タゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは
賦形剤を含む。そのようなキャリアは、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組合せを包含するが、これ
らに限定されない。処方物は、投与の様式に合わせるべ
きである。 【０１０９】本発明はまた、１つ以上の本発明の薬学的
組成物の成分で充填した１つ以上の容器を備えた薬学的
パックまたはキットを提供する。そのような容器には、
薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統
制する政府機関によって指定される形式の通知を伴い
得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、ま
たは販売の機関による認可を表す。さらに、薬学的組成
物は、他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。 【０１１０】薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、
筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、または皮内経路のよう
な便利な方法で投与され得る。薬学的組成物は、特定の
適応症を処置および／または予防するのに有効な量で投
与される。一般に、薬学的組成物は、少なくとも約１０
μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場合
はこれらは一日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量
で投与される。ほとんどの場合、投薬は、投与経路、症
状などを考慮して、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重〜
約１ｍｇ／ｋｇ体重である。 【０１１１】ＶＥＧＦ３ポリペプチド、およびポリペプ
チドであるアゴニストまたはアンタゴニストはまた、イ
ンビボでのそのようなポリペプチドの発現により本発明
に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」
といわれる。 【０１１２】従って、例えば、骨髄細胞のような細胞
は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次
いで、操作された細胞はポリペプチドで処置されるべき
患者に提供される。そのような方法は当該分野で周知で
ある。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコード
するＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用によ
り、当該分野で公知の手順によって操作され得る。 【０１１３】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞
は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボで
のポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。そ
のような方法により本発明のポリペプチドを投与するた
めのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示によ
り当業者には明らかであるはずである。例えば、細胞を
操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以
外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これ
は、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで
細胞を操作するために使用され得る。 【０１１４】本明細書中上記で述べたレトロウイルスプ
ラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスは、モ
ロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロ
ウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫
ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病
ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス）、アデノウイル
ス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを包
含するが、これらに限定されない。１つの実施態様にお
いて、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニー
マウス白血病ウイルスに由来する。 【０１１５】ベクターは１つ以上のプロモーターを含
む。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイル
スＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター、およびヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， 第７巻、第９号，
９８０−９９０（１９８９）に記載される）、または他
の任意のプロモーター（例えば、真核生物細胞性プロモ
ーターのような細胞プロモーター（ヒストン、ｐｏｌ
ＩＩＩ、およびβ−アクチンのプロモーターを包含する
が、これらに限定されない））を包含するが、これらに
限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーター
は、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ
（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプ
ロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切
なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示か
ら、当業者に明らかである。 【０１１６】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロ
モーターのようなアデノウイルスプロモーター；または
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような
異種プロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモータ
ー；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ーのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモータ
ー；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモータ
ー；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジン
キナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナー
ゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書上記
の改変したレトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチ
ンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーター
を包含するが、これらに限定されない。プロモーターは
また、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然
のプロモーターであり得る。 【０１１７】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株を形質導入してプロデューサー細胞
株を形成するために使用される。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１
７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、Ｖ
Ｔ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株
（その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉ
ｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，第
１巻、５−１４頁（１９９０）に記載される）を包含す
るが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で
公知の任意の手段を介してパッケージング細胞を形質導
入し得る。そのような手段は、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱を包含す
るが、これらに限定されない。別のものでは、レトロウ
イルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル
化され得るか、または脂質に結合され得、次いで宿主に
投与され得る。 【０１１８】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルス
ベクター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれか
で、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。
形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコード
する核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細
胞は、胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、
肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮
細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、これらに限
定されない。 【０１１９】本発明はまた、ＶＥＧＦ３核酸配列中の変
異の存在と関連する疾患または疾患に対する感受性を検
出するための診断アッセイの一部としてのＶＥＧＦ３遺
伝子の使用に関する。 【０１２０】ＶＥＧＦ３遺伝子に変異を有する個体は、
種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断の
ための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、
組織生検、および剖検材料）から得られ得る。ゲノムＤ
ＮＡは、検出のために直接使用され得るか、または分析
の前にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４：
１６３−１６６（１９８６））を使用して酵素的に増幅
され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的のた
めに使用され得る。例として、ＶＥＧＦ３をコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーが、ＶＥＧＦ３変異を
同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失
および挿入が、正常な遺伝子型との比較における増幅産
物のサイズの変化によって検出され得る。点変異が、増
幅されたＤＮＡを放射標識されたＶＥＧＦ３ ＲＮＡ、
あるいは放射標識されたＶＥＧＦ３アンチセンスＤＮＡ
配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。
完全にマッチした配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化により、
または融解温度の違いにより、ミスマッチな二重鎖から
区別され得る。 【０１２１】ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的試験は、
変性剤を用いるかまたは用いない、ゲル中でのＤＮＡフ
ラグメントの電気泳動移動度の変化の検出によって達成
され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲ
ル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のＤＮ
Ａフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメントの移動度
がそれらの特異的融解温度または部分的融解温度に従っ
てゲル中で異なる位置に遅れる、変性ホルムアミド勾配
ゲル上で識別され得る（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３０：１２４２（１９８５）を参照のこ
と）。 【０１２２】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮａ
ｓｅプロテクション、およびＳ１プロテクションのよう
なヌクレアーゼプロテクションアッセイ、または化学的
切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，
８５：４３９７−４４０１（１９８５））によって示さ
れ得る。 【０１２３】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、化学
的切断、直接的ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用
（例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ））、および
ゲノムＤＮＡのサザンブロットのような方法によって達
成され得る。 【０１２４】より伝統的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加えて、変異はインサイチュ分析によってもま
た検出され得る。 【０１２５】本発明はまた、正常なコントロールの組織
サンプルと比較したＶＥＧＦ３タンパク質の過剰発現
が、疾患（例えば、異常な細胞分化）の存在または疾患
に対する感受性を検出し得るので、種々の組織における
ＶＥＧＦ３タンパク質のレベルの変化を検出するための
診断アッセイに関する。宿主由来のサンプル中のＶＥＧ
Ｆ３タンパク質のレベルを検出するために使用されるア
ッセイは、当業者に周知であり、そして、ラジオイムノ
アッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分
析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッ
セイを包含する。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎ
ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，１（２），第６章、（１９９１））
は、最初に、ＶＥＧＦ３抗原に特異的な抗体、好ましく
はモノクローナル抗体、を調製する工程を包含する。さ
らに、レポーター抗体が、モノクローナル抗体に対して
調製される。レポーター抗体に、放射能、蛍光、または
本実施例では、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のよう
な検出可能な試薬が結合される。サンプルを宿主から取
り出し、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体
支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキ
ュベートする。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタ
ンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミンのような非特
異的タンパク質と共にインキュベートすることによって
覆う。次に、モノクローナル抗体をディッシュ内でイン
キュベートし、その間にモノクローナル抗体がポリスチ
レンディッシュに結合した任意のＶＥＧＦ３タンパク質
に結合する。全ての結合していないモノクローナル抗体
を、緩衝液で洗浄して除去する。西洋ワサビペルオキシ
ダーゼに結合させたレポーター抗体をディッシュ内に入
れ、ＶＥＧＦ３に結合した任意のモノクローナル抗体へ
レポーター抗体を結合させる。次いで、結合していない
レポーター抗体を洗浄して除去する。次いで、ペルオキ
シダーゼ基質をディッシュに添加し、そして標準曲線と
比較した場合、所定の時間内の発色の量が、患者のサン
プルの所定の容量内に存在するＶＥＧＦ３タンパク質の
量の測定値である。 【０１２６】競合アッセイが使用され得、ここではＶＥ
ＧＦ３に特異的な抗体が固体支持体に結合される。次い
で本発明のポリペプチドを、例えば、放射能によって標
識し、そして宿主由来のサンプルを固体支持体に通過さ
せ、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラ
フィーによって検出される標識の量を、サンプル中のＶ
ＥＧＦ３の量に相関付け得る。 【０１２７】「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡ
アッセイに類似する。「サンドイッチ」アッセイにおい
て、ＶＥＧＦ３を固体支持体に通過させ、そして固体支
持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第２の抗体
をＶＥＧＦ３に結合させる。次いで、標識されかつ第２
の抗体に対して特異的な第３の抗体を固体支持体に通過
させ、そして第２の抗体に結合させ、次いで量を定量し
得る。 【０１２８】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
であり得る。配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色体位置のマーキングに利用可能
な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体マー
キング試薬はほとんどない。本発明による染色体へのＤ
ＮＡのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝
子とを相関させることにおける重要な第１段階である。 【０１２９】簡略に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマッピングされ得る。ｃＤＮＡの
コンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエ
キソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑にする
プライマーを迅速に選択するために使用される。次い
で、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有す
る体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用さ
れる。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含有する
ハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。 【０１３０】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、類似の方法において特定の染色
体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクロ
ーンのプールを用いて下部位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌ
ｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。その染色体にマッピ
ングするために同様に使用され得る他のマッピングスト
ラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、フ
ローサイトメトリーで選別した標識した染色体でのプレ
スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラ
リーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前
選択を包含する。 【０１３１】中期染色体展開物へのｃＤＮＡクローンの
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、５０または６０塩基という短いｃ
ＤＮＡで使用され得る；この技術の総説としては、Ｖｅ
ｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａＭ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ．ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）を参照のこと。 【０１３２】一旦配列が正確な染色体位置にマッピング
されると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地
図のデータと相関させ得る。（そのようなデータは、例
えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉ
ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎＭａｎに見出される（Ｊｏ
ｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＷｅｌ
ｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライン
で入手可能である））。次いで、同一の染色体領域にマ
ッピングされた遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物
理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１３３】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変
異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正
常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因
となる因子であると考えられる。 【０１３４】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的な原因となる遺伝子の１つであり得る。
（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして２
０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチ
ド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそ
れらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、そ
れらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用
され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はま
た、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならび
にＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリー
の産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、そ
のような抗体およびフラグメントの産生のために使用さ
れ得る。 【０１３５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくはヒトでない。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
を結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体を結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、そのような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からポリペプチドを単離するために使用され得
る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続
培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用
され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏ
ｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂ
ｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生す
るためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９
８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられ
る。 【０１３６】単鎖抗体の産生について記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスを、
本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体
を発現させるために使用し得る。 【０１３７】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はそのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。全ての部または量は、他に
明記しない限り重量基準である。 【０１３８】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い所定の方法および／または用語を記載
する。 【０１３９】「プラスミド」は、大文字および／または
数字の前および／または後の小文字のｐにより示され
る。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるかまた
は制限無く公的に入手可能であるかのいずれかであり、
または公開された手順に従って入手可能なプラスミドか
ら構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価
のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者に
は明らかである。 【０１４０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の所定の配
列でのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒反応的に切断
することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵
素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因
子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用さ
れた。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに約２
０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のた
めのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的に
は５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、
より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のため
の適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定され
る。３７℃にての約１時間のインキュベーション時間が
通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従っ
て変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミド
ゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離す
る。 【０１４１】切断されたフラグメントのサイズ分離は、
Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載され
た８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 【０１４２】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。 【０１４３】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、前出、１４６頁）。他
に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条
件で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメン
ト０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。 【０１４４】他に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に
記載のように実施した。 【０１４５】 【実施例】実施例１ バキュロウイルス発現系を用いるＶＥＧＦ３のクローニ
ングおよび発現 ＶＥＧＦ３タンパク質をコードする寄託したクローンに
含まれるＤＮＡを、遺伝子の５’配列および３’配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅した：５’プライマーは、配列５’ＧＣＡＴＧＧＡ
ＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣ（配列
番号４）を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位、およ
びＶＥＧＦ３の５’配列に相補的なヌクレオチド配列
（ヌクレオチド１５０−１６６）を含む。 【０１４６】３’プライマーは、配列５’ＧＣＡＴＴＣ
ＴＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣ
３’（配列番号５）を有し、そして制限酵素ＸｂａＩの
切断部位、およびＶＥＧＦ３の３’配列に相補的なヌク
レオチドを含む。 【０１４７】増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．）を用いて、１％アガロースゲルか
ら単離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアー
ゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで再び１％
アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、リ
ーダーペプチド配列を有するＡ２ＧＰバキュロウイルス
移入ベクター（ＰＨａｒｍｉｎｇｅｎ）にＢａｍＨＩお
よびＸｂａＩ部位で連結した。この連結によって、ＶＥ
ＧＦ３ ｃＤＮＡをバキュロウイルスｇｐ６７遺伝子の
シグナル配列とともにインフレームでクローン化し、そ
してベクター中のシグナル配列の３’末端に配置した。
これをｐＡ２ＧＰ−ＶＥＧＦ３と称する。 【０１４８】発現のためにｐＲＧ１ベクターにｇｐ６７
遺伝子のシグナル配列とともにＶＥＧＦ３をクローン化
するために、シグナル配列およびいくつかの上流の配列
を有するＶＥＧＦ３を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵
素により、ＶＥＧＦ３ ｃＤＮＡの上流に位置するＸｈ
ｏ制限エンドヌクレアーゼ部位、およびＸｂａＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ部位で、ｐＡ２ＧＰ−ＶＥＧＦ３プラ
スミドから切り出した。このフラグメントを１％アガロ
ースゲル上で残りのベクターから分離し、そして「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」キットを使用して精製した。このフラ
グメントを、Ｆ２と称した。 【０１４９】Ａ２ＧＰベクター（ｐＶＬ９４１ベクター
の変異体）をバキュロウイルス発現系を用いるＶＥＧＦ
３タンパク質の発現のために用いる（総説については、
Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．
１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆ
ｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓａｎｄ
ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌ
ｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）。この発現
ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポ
リヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ、
およびＡｓｐ７１８の認識部位を含む。制限エンドヌク
レアーゼＸｈｏＩについての部位は、ＢａｍＨＩ部位の
上流に位置する。ＸｈｏＩとＢａｍＨＩとの間の配列
は、ｐＡｃＧｐ６７Ａベクター中のその配列と同じであ
る。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部
位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換え
ウイルスを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポ
リアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモーター
と同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、同時トラン
スフェクトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同
組換えのためにウイルス配列により両端で隣接させる。
多くの他のバキュロウイルスベクターが、Ａ２ＧＰの代
わりに用いられ得る。例えば、ｐＲＧ１、ｐＡｃ３７
３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１（Ｌｕｃｋｏ
ｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）。 【０１５０】プラスミドを制限酵素ＸｂｏＩおよびＸｂ
ａＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウ
シ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、
市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して、Ｄ
ＮＡを１％アガロースゲルより単離した。このベクター
ＤＮＡをＶ２と称する。 【０１５１】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、
そして酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて、ＶＥＧ
Ｆ３遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃ ｇｐ６７−
ＶＥＧＦ３）を含む細菌を同定した。クローン化フラグ
メントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。 【０１５２】５μｇのプラスミドｐＢａｃ Ａ２ＧＰ−
ＶＥＧＦ３を、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
４：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．
０ｇの市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂａｃｕ
ｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮ
Ａ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ．）とともに同時トランスフェクトした。 【０１５３】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイル
スＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃ Ａ２ＧＰ
−ＶＥＧＦ３を、５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープ
レートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌリ
ポフェクチンおよび９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加
し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートし
た。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清
を有さないＧｒａｃｅ培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織
培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １７１１）に滴下して加えた。プレートを、
新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振盪し
た。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベート
した。５時間後、トランスフェクション溶液をプレート
から除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍ
ｌのＧｒａｃｅ昆虫培地を添加した。プレートをインキ
ュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続け
た。 【０１５４】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法としては、「Ｂｌｕｅ
Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）と共にアガロースゲ
ルを用いた。これは、青く染色されたプラークの容易な
単離を可能とする。（「プラークアッセイ」の詳細な記
述はまた、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇにより配布される昆虫
細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９
〜１０頁）においても見い出され得る）。 【０１５５】連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加
し、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフ
チューブに再懸濁した。寒天を、短時間の遠心分離によ
り除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を
使用して、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞
に感染させた。４日後、これらの培養ディッシュの上清
を回収し、次いで４℃で保存した。 【０１５６】Ｓｆ９細胞を、１０％熱失活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）１で組換えバキュロウイルスＶ−Ａ２Ｇ
Ｐ−ＶＥＧＦ３で感染させた。６時間後、培地を除去
し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９
００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。
４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μ
Ｃｉの３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し
た。細胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後
細胞を遠心分離により回収し、そして標識されたタンパ
ク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
により可視化した。 【０１５７】培地およびＳｆ９細胞の細胞質由来のタン
パク質を、還元条件下または非還元条件下でＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分析した。培地を、５０ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ５．８）に対して透析した。透析の後に沈澱を
得、そして１００ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）中に
再懸濁した。再懸濁した沈澱を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って再度分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで
染色した。 【０１５８】培地の上清をまた、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐ
Ｈ５．８）中で１：１０に希釈し、そして１ｍｌ／分の
流速でＳＰ−６５０Ｍカラム（１．０×６．６ｃｍ、Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ）に適用した。タンパク質を、２０
０、３００、および５００ｍＭＮａＣｌでの段階勾配で
溶出した。ＶＥＧＦ３を、５００ｍＭでの溶出を用いて
得た。溶出物を還元剤β−メルカプトエタノールの存在
下または非存在下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そし
てクマシーブリリアントブルーで染色した。 【０１５９】実施例２ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得ら
れる組織を組織培養培地中に置き、そして小片に分け
る。組織の小塊を、組織培養フラスコの湿った表面上に
置き、各フラスコ中におよそ１０片を置く。フラスコの
上下を逆さにし、密閉し、そして室温に一晩放置する。
室温で２４時間後、フラスコを反転させ、そして組織塊
をフラスコの底に付着したままにし、そして新鮮な培地
（例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレ
プトマイシンを有するＨａｍのＦ１２培地）を添加す
る。次いで、これを３７℃でおよそ１週間インキュベー
トする。この時点で新鮮な培地を添加し、その後数日ご
とに取り替える。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の
単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより
大きなフラスコに大きく（ｓｃａｌｅ）する。 【０１６０】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，
Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７： ２１９−２５（１９８
８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化
し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状
ベクターをアガロースゲル上で分別し、そしてガラスビ
ーズを用いて精製する。 【０１６１】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応
するＰＲＣプライマーを用いて増幅する。５’プライマ
ーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウ
イルス直鎖状骨格、ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つの
フラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混
合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次い
で、これを、適切に挿入された目的の遺伝子をベクター
が有することを確認する目的のために、カナマイシン含
有寒天上にプレーティングする。 【０１６２】アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋
ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（Ｃ
Ｓ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有する
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にお
ける組織培養物中で、コンフルエントな密度になるまで
増殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培
地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形
質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子
を含有する感染性ウイルス粒子を産生する（この時点で
パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれ
る）。 【０１６３】新鮮な培地を、形質導入したプロデューサ
ー細胞に添加し、その後、コンフルエントなプロデュー
サー細胞の１０ｃｍプレートから培地を回収する。感染
性ウイルス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポア（ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過して、剥離
したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用
いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサ
ブコンフルエントなプレートから除去し、そして直ちに
プロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地
を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの
力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、
そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選
択マーカー（例えば、ｎｅｏ、またはｈｉｓ）を有する
レトロウイルスベクターを使用することが必要である。 【０１６４】次いで、操作された線維芽細胞は、単独
で、またはｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアービー
ズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれ
かで、宿主に注入する。この時点で、線維芽細胞は、タ
ンパク質産物を産生する。 【０１６５】実施例３ ＶＥＧＦ３の細菌発現および精製 ＶＥＧＦ３をコードする寄託したクローンのＤＮＡを、
プロセシングされたＶＥＧＦ３タンパク質（シグナルペ
プチド配列を除く）の５’配列に対応するＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーおよびＶＥＧＦ３遺伝子に対し
て３’側のベクター配列を使用して、最初に増幅する。
ＶＥＧＦ３に対応するさらなるヌクレオチドを５’配列
および３’配列にそれぞれ加えた。５’オリゴヌクレオ
チドプライマーは、配列５’ＧＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣ
ＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＴＣ（配列番号６）を
有し、ＳｐｈＩ制限酵素部位、それに続くプロセシング
されたタンパク質コドンの推定の末端アミノ酸から始ま
るＶＥＧＦ３コード配列を含む。３’配列５’ＧＡＣＴ
ＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣ
３’（配列番号７）は、ＶＥＧＦ３ＤＮＡ挿入物の３’
側に位置するＢｇｌＩ部位に相補的な配列を含む。制限
酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−７０（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃ
ｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）上の制限酵素
部位に一致する。ｐＱＥ−７０は、抗生物質耐性（Ａｍ
ｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−調節可
能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結
合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部
位をコードする。次いでｐＱＥ−９をＳｐｈＩおよびＢ
ｇｌＩＩで消化した。増幅した配列を、ｐＱＥ−７０に
連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードす
る配列とインフレームで挿入した。次いで、連結混合物
を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載の手順に従っ
て、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラ
スミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含んでおり、これは
ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシ
ン耐性（Ｋａｎｒ）に寄与する。形質転換体を、ＬＢプ
レートで増殖するそれらの能力によって同定し、そして
アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。
プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確
認した。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１０
０μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方
を補充したＬＢ培地中の液体培養物中で、一晩（Ｏ／
Ｎ）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を使用して、１：１００
〜１：２５０の比で、大きな培養物を接種する。細胞を
０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ．
６００）まで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプ
ロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を１ｍＭ
の最終濃度まで添加した。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレ
ッサーを不活化することにより、Ｐ／Ｏの開放（ｃｌｅ
ａｒ）を誘導して、遺伝子発現の増加を導く。細胞を、
さらに３〜４時間、増殖させた。次いで、細胞を遠心分
離によって回収した。細胞ペレットを、カオトロピック
剤の６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化した。澄明化後、
可溶化したＶＥＧＦ３を、６−Ｈｉｓタグを含むタンパ
ク質による強い結合を可能にする条件下で、ニッケルキ
レートカラムのクロマトグラフィーによってこの溶液か
ら精製した（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４（１９８
４））。ＶＥＧＦ３を、６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ
５．０）中でカラムから溶出し、そして再生の目的のた
めに、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリ
ウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）、および２ｍＭ
グルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での１
２時間のインキュベートション後、タンパク質を１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムに対して透析した。 【０１６６】本発明の多くの改変および変形が、上記の
教示を考慮すれば可能であり、従って、添付の請求の範
囲の範囲内で本発明は特に記載した以外の方法で実施さ
れ得る。 【０１６７】 【表１Ａ】 【０１６８】 【表１Ｂ】【０１６９】 【表１Ｃ】 【０１７０】 【発明の効果】本発明は、上述した構成であるので、前
述した課題が達成される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のｃＤＮＡ配列、および本
発明のポリペプチドの対応する推定のアミノ酸配列を示
す。アミノ酸についての標準的な１文字略号を使用す
る。配列決定を、３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使
用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きい
ことが予測される。 【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のｃＤＮＡ配列、および本
発明のポリペプチドの対応する推定のアミノ酸配列を示
す。アミノ酸についての標準的な１文字略号を使用す
る。配列決定を、３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使
用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きい
ことが予測される。 【図２】図２は、本発明のポリペプチドとヒトＶＥＧＦ
との間のアミノ酸配列相同性の実例である。
発明のポリペプチドの対応する推定のアミノ酸配列を示
す。アミノ酸についての標準的な１文字略号を使用す
る。配列決定を、３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使
用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きい
ことが予測される。 【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のｃＤＮＡ配列、および本
発明のポリペプチドの対応する推定のアミノ酸配列を示
す。アミノ酸についての標準的な１文字略号を使用す
る。配列決定を、３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使
用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きい
ことが予測される。 【図２】図２は、本発明のポリペプチドとヒトＶＥＧＦ
との間のアミノ酸配列相同性の実例である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 29/00
29/00 １０１
１０１ 43/00 １０５
43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(71)出願人 597018381
9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ,
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(72)発明者 フ ジン−シャン
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
ガイザースバーグ， ホワード ランデ
ィング ドライブ 16125
(72)発明者 ヘンリック オールセン
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
ガイザースバーグ， ケンドリック プ
レイス 182
(72)発明者 クレイグ エイ． ローゼン
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル， ローリング ヒル
ロード 22400
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02
DA06 EA04 GA13 HA01 HA17
4C084 AA13 BA01 BA02 BA08 BA22
BA23 CA18 DB52 NA14 ZA331
ZA361 ZA441 ZA891 ZB111
ZB151 ZC412
4C086 AA02 AA03 EA16 NA14 ZA33
ZA36 ZA44 ZA89 ZB11 ZB15
ZC41
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）図１Ａ〜図１Ｂに示すポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつこれに対して少なくとも７０％同一であるポリ
ヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌ
クレオチドフラグメント、からなる群より選択されるメ
ンバーを含む、ポリヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002166355A JP2003079371A (ja) | 2002-06-06 | 2002-06-06 | ヒト血管内皮増殖因子３ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002166355A JP2003079371A (ja) | 2002-06-06 | 2002-06-06 | ヒト血管内皮増殖因子３ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50037897A Division JP2001509001A (ja) | 1995-06-06 | 1995-06-06 | ヒト血管内皮増殖因子３ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003079371A true JP2003079371A (ja) | 2003-03-18 |
Family
ID=19195045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002166355A Pending JP2003079371A (ja) | 2002-06-06 | 2002-06-06 | ヒト血管内皮増殖因子３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003079371A (ja) |
-
2002
- 2002-06-06 JP JP2002166355A patent/JP2003079371A/ja active Pending
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