JPH11506921A

JPH11506921A - ヒトｇ−タンパク質受容体ｈｃｅｇｈ４５

Info

Publication number: JPH11506921A
Application number: JP9500370A
Authority: JP
Inventors: ソペット，ダニエル・アール; リ，イ; ローゼン，クレイグ・エイ; ルーベン，スティーブン・エム
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1999-06-22
Also published as: WO1996039439A1; CA2221637A1; AU2663495A; EP0835264A1; EP0835264A4

Abstract

(57)【要約】ヒトＧ−タンパク質受容体ポリペプチドＨＣＥＧＨ４５、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。そのようなポリペプチドを、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するために利用する方法を開示する。該アンタゴニストを治療的に使用して、ＰＡＣＡＰ過剰分泌状態を治療し、薬理的健忘症モデルを創成し、一方該アゴニストを使用して健忘症およびアルツハイマー病を治療することができる。受容体の核酸配列における変異および該受容体の可溶性体のレベルの変化を検出するための診断方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＧ−タンパク質受容体ＨＣＥＧＨ４５本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とくに、本発明のポリペプチドは、ヒト７−膜貫通受容体である。該膜貫通受容体はＧ−タンパク質結合性受容体である。さらに詳しくは、該７ −膜貫通受容体は、健忘症様神経ペプチドに対するヒトＧ−タンパク質脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）様受容体として推定的に同定されており、以降“ＨＣＥＧＨ４５”と称することもある。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇ−タンパク質および／または第二メッセンジャー、例えば、cＡＭＰを含む信号伝達経路に関与するタンパク質により媒介されることは十分確立されている(Ｌefkowitz、Ｎature、３５１：３５３−３５４(１９９１))。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇ−タンパク質またはＰＰＧタンパク質を伴う経路に関与するタンパク質と呼ぶ。これらのタンパク質の幾つかの例には、アドレナリン作動薬およびドーパミンに対する受容体のようなＧＰＣ受容体(Ｋobilka,Ｂ.Ｋ.ら、ＰＮＡＳ、８４：４６−５０ (１９８７);Ｋobilka,Ｂ.Ｋ.ら、Ｓcience、２３８：６５０−６５６(１９８７) ;Ｂunzow,Ｊ.Ｒ.ら、Ｎature、３３６：７８３−７８７(１９８８))、Ｇ−タンパク質自体、エフェクタータンパク質、例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、並びにアクチュエーター(actuator)タンパク質、例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ(Ｓimon, Ｍ.Ｉ.ら、Ｓcience、２５２：８０２−８(１９９１)が含まれる。例えば、信号伝達の１つの型では、ホルモン結合の効果は、細胞内部での、酵素、アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存して、ＧＴＰはまたホルモン結合に影響を及ぼす。Ｇ −タンパク質は、ホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと連結する。Ｇ−タンパク質は、ホルモン受容体により活性化された場合、ＧＴＰを結合ＧＤＰと交換することが示された。次いで、そのＧＴＰ担持型は、活性化アデニル酸シクラーゼに結合する。Ｇ−タンパク質自体により触媒される、ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は、Ｇ−タンパク質をその基本の不活性型へと戻す。従って、Ｇ−タンパク質は、受容体からエフェクターへと信号を中継ぎする中間体として、および信号の持続時間を制御する時計として、二重の役割を果たす。欧州特許公開番号０６１８２９１Ａ２に、ウシ大脳から精製されたＰＡＣＡＰ受容体タンパク質が、開示されており、該公報の記載内容は本発明の参考文献である。本発明の一態様により、新規ポリペプチドならびに、そのフラグメントおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。本発明の一態様により、新規成熟受容体ポリペプチドならびに生物学上および診断上あるいは治療上有用なフラグメント、アナログおよびその誘導体を提供する。本発明の受容体ポリペプチドは、ヒト起源である。本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、並びに生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメントを提供する。本発明のさらなる態様により、そのような受容体ポリペプチドを組換え技術により製造する方法であって、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タンパク質の回収を促進する条件下において、本発明の受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのような受容体ポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明の別の態様により、本発明の受容体ポリペプチドに結合して、該ポリペプチド活性化するかまたは活性化を阻害する化合物に関してスクリーニングする方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、健忘症およびアルツハイマー病などの神経細胞死に関連する疾患ならびに他の分泌不足状態に関連する疾患の予防および／または治療に有用な、本発明の受容体ポリペプチドに結合して、該ポリペプチドを活性化する化合物を宿主に投与する方法を提供する。本発明のさらに別の具体例により、ＰＡＣＡＰ過剰分泌状態の予防および／または治療ならびに薬理的健忘症の創成に有用な、本発明の受容体ポリペプチドに結合して、該ポリペプチドの活性化を阻害する化合物を宿主に投与する方法を提供する。本発明の別の態様により、遺伝子治療を介して本発明の受容体ポリペプチドを投与して、該ポリペプチドの発現不足あるいは該受容体ポリペプチドに対するリガンドの発現不足に関連する状態を治療する方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、本発明のポリヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするに充分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提供する。本発明のさらにまた別の態様により、そのようなポリペプチドをコードする核酸配列における突然変異に関連する疾患の検出用および該受容体ポリペプチドの可溶性体の濃度変化の検出用の診断アッセイを提供する。本発明のさらに別の態様により、科学的リサーチ、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの作成に関連するインビトロにおける目的に、そのような受容体ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。第１図は、本発明のＧ−タンパク質結合性受容体のcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な１文字略字を使用する。配列決定は、３７３自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.) を使用して行った。第２図は、Ｇ−タンパク質結合性受容体の二次構造的特徴である。最初の７段は、αヘリックス、βシート、ターン領域またはコイル領域といったようなアミノ酸配列の領域を示す。ボックスエリアが、上記の領域に対応するエリアである。図中、２番目のセットは、細胞内、細胞質に接触しているかまたは膜を貫通しているエリアのアミノ酸配列のエリアを示す。親水性を示すパートでは、膜の脂質２層内に存在し、したがって疎水性であるタンパク質配列のエリア、ならびに親水性であり、脂質２層膜外にあるタンパク質配列のエリアを示す。抗原エリアとは、脂質２層膜外であって、抗原に結合可能なエリアであるために、抗原インデックスは、親水性プロットに対応する。さらに表面確率プロットが抗原インデックスおよび親水性プロットに対応する。両親媒性プロットは、極性および非極性であるタンパク質配列の領域を示す。フレキシブル領域は、フレキシブル領域が膜外領域であり、インフレキシブル領域が膜貫通領域であるという意味において、２番目のセットに対応する。第３図は、本発明のＧ−タンパク質結合性受容体とラットＰＡＣＡＰ様受容体とのアミノ酸アラインメントを示す。本発明の一態様により、第１図の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年４月２８日にＡＴＣＣ寄託番号第９７１３２号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト大脳組織由来のcＤＮＡライブラリーから単離された。それは、構造上、Ｇ−タンパク質結合性受容体ファミリーに関係がある。それは、８７４個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。そのタンパク質は、ラットＰＡＣＡＰ様受容体に対し、２２．９１０％の同一性および４８．６０％の類似性をもって、最も高い程度の相同性を示す。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。第１図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダーまたは分泌配列もしくはプロタンパク質配列などの付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(および場合により付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明は、さらに、第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、第１図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。ポリヌクレオチドはまた、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインのない、本発明ポリペプチドの細胞外部分である、本発明の受容体ポリペプチドの可溶性体をコードする。本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する( Ｗilson,Ｉ.ら、Ce11、３７：７６７(１９８４))。「遺伝子」なる語はポリペプチド鎖の製造に関与するＤＮＡセグメントを意図している；コーディング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）の間の配列（イントロン）も含む。全長の本発明のポリヌクレオチド配列のフラググメントをｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用して他の遺伝子を単離し、これらの遺伝子は本発明のポリヌクレオチド配列と高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する。このタイプのプローブは少なくとも３０塩基を有するのが好ましいが、５０塩基あるいはそれ以上を有してもよい。該プローブはまた、全長の転写物に対応するcＤＮＡクローン、および制御領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全なＨＣＥＧＨ４５の遺伝子を含む単一または複数のゲノムクローンを同定するのに使用してよい。スクリーニングの例にはオリゴヌクレオチドプローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用することによる遺伝子のコーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有している標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに使用する。本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図(配列番号１)のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドをコードする。言い方を替えると、本発明ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、上記の同一性があり、活性を保持するかまたはしない該ポリヌクレオチドは、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、さらに好ましくは少なくとも５０塩基を有する。たとえば、このようなポリヌクレオチドは、たとえば配列番号１のポリヌクレオチドの回収用の該ポリヌクレオチドに対するプローブとして、または診断用プローブとして、あるいはＰＣＲプライマーとして使用できる。したがって、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性があるポリヌクレオチド、ならびに少なくとも２０または３０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基を有する、そのフラグメント、および、このようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載の矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＧ−タンパク質結合性受容体ポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチド、すなわち、Ｇ−タンパク質結合性受容体として機能するか、または、たとえポリペプチドがＧ−タンパク質結合性受容体として機能しなくとも(例えば、可溶性型の受容体)、リガンドまたは受容体を結合する能力を保持するポリペプチドを意味する。アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであってよい。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(ｉ)１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、(ii)１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または(iii)成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または(iv)リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに、配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）、さらにより好ましくは少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは９５％の同一性）をもつポリペプチド、および一般的に少なくとも３０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。当業界で知られているように、２つのポリペプチド間の「類似性」とは、ひとつのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドのアミノ酸配列と比較することによって測定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対応する全長ポリペプチドを生産するのに用いることができる；したがって、該フラグメントは、全長ポリペプチドの製造用中間体として用いることができる。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリペプチドの合成に用いることができる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＨＣＥＧＨ４５遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体;細菌プラスミド;ファージＤＮＡ;バキュロウイルス;酵母プラスミド ;プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター;ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる:ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli lacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる:Ｅ.coli、Ｓtreptomyce s 、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞;酵母のような真菌細胞;Ｄ rosophila およびＳpodoptera Ｓf９といったような昆虫細胞;ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス;植物細胞等。適当な宿主の選択は本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用:pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９ (Ｑiagen)、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、p bluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ( Ｓtratagene);ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、p ＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用:pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、 pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharm acia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。(Ｄavisら、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology(１９８６ ))。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning: ＡＬaborato ry Ｍanual,第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ.co1i、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰse udomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromege Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５( １９８１)により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。Ｇ−タンパク質結合性受容体ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患の治療薬および診断薬を発見するためのリサーチ試薬および物質として用いることができる。本発明のＧ−タンパク質結合性受容体は、該受容体に対するアンタゴニストおよび／またはアゴニストに関してスクリーニングする方法において使用することができる。一般に、そのようなスクリーニング方法は、その表面上に該受容体を発現する適当な細胞を与えることを必要とする。特に、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチドを使用して、細胞をトランスフェトし、そのことによって、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現させる。そのようなトランスフェクションは、上記のような方法により成し遂げることができる。そのようなスクリーニング方法の１つは、本発明のＧ−タンパク質結合性受容体を発現するためにトランスフェクトされる、メラノフォアの使用を必要とする。そのような技術は、１９９２年２月６日に公開されたＰＣＴＷＯ９２／０１８１０に記載されている。従って、例えば、そのようなアッセイは、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードするメラノフォア細胞を、その受容体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物の両方と接触させることにより、受容体アンタゴニストに関してスクリーニングするために利用することができる。該リガンドにより発生される信号の阻害は、化合物が該受容体に対して可能性のあるアンタゴニストであること、すなわち、該受容体の活性化を阻害することを示す。該スクリーニングは、そのような細胞をスクリーニングすべき化合物と接触させることにより、アゴニストを決定するために、またそのような化合物が信号を発生するかどうか、すなわち、該受容体を活性化するかどうかを測定するために利用することができる。他のスクリーニング技術には、例えば、Ｓcience、第２４６巻、１８１−２９６頁(１９８９年１０月)に記載されているような、受容体の活性化により引き起こされる細胞外のpＨ変化を測定するシステムにおいての、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現する細胞(例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞)の使用が含まれる。例えば、可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストを、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現する細胞と接触させて、第二メッセンジャー応答、例えば、信号伝達またはpＨ変化を測定して、可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストが有効であるかどうかを決定することができる。別のそのようなスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードするＲＮＡを、アフリカツメガエル卵母細胞中に導入して該受容体を一時的に発現させることを必要とする。次いで、その受容体卵母細胞を、アンタゴニストをスクリーニングする場合には、その受容体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物と接触させ、続いて、カルシウム信号の阻害を検出することができる。別のスクリーニング技術は、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現させることを必要とし、ここでは、該受容体をホスホリパーゼＣまたはＤに結合させる。そのような細胞の代表例として、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎臓細胞等を挙げることができる。アンタゴニストまたはアゴニストに関してのスクリーニングは、該受容体の活性化または該受容体の活性化の阻害をホスホリパーゼ第二信号から検出することにより、上記のように成し遂げることができる。別の方法は、標識化リガンドの、その表面上に該受容体を有する細胞への結合の阻害を測定することにより、アンタゴニストに関してスクリーニングすることを必要とする。そのような方法は、真核細胞を、Ｇ−タンパク質結合性受容体をコードするＤＮＡと共にトランスフェクトすることから、該細胞がその表面上に該受容体を発現して、標識化型の既知のリガンドの存在下、該細胞を可能性のあるアンタゴニストと接触させることを必要とする。該リガンドは、例えば、放射能により標識化することができる。該受容体に結合した標識化リガンドの量は、例えば、該受容体の放射能により測定する。該受容体に結合する標識化リガンドの減少により測定されるように、可能性のあるアンタゴニストが該受容体に結合するならば、標識化リガンドの該受容体への結合が阻害される。本発明はまた、Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合することが可能であることが知られていないリガンドが、そのような受容体に結合することができるかどうかを測定する方法であって、リガンドのＧ−タンパク質結合性受容体への結合を可能とする条件下、Ｇ−タンパク質結合性受容体を発現する哺乳動物の細胞を該リガンドと接触させ、該受容体に結合するリガンドの存在を検出し、またそのことによって、該リガンドが該Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合するかどうかを測定することを含んでなる方法も提供する。アゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定するための上記のシステムはまた、該受容体に結合するリガンドを決定するために利用することもできる。一般に、スクリーニング方法により決定される、Ｇ−タンパク質結合性受容体に対するアンタゴニストは、様々な治療目的に使用することができる。例えば、そのようなアンタゴニストは、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神病、うつ病、片頭痛(migraine)、嘔吐および良性前立腺肥大の治療に使用されている。Ｇ−タンパク質結合性受容体に対するアゴニストはまた、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、尿うっ滞、および骨粗鬆症の治療といったような、治療目的にも有用である。Ｇ−タンパク質結合性受容体アンタゴニストの例には、Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合するが、第二メッセンジャー応答を引き出さないことから、該Ｇ− タンパク質結合性受容体の活性を妨げる抗体、または幾つかの場合には、オリゴヌクレオチドが含まれる。可能性のあるアンタゴニストにはまた、Ｇ−タンパク質結合性受容体のリガンドと密接に関係のあるタンパク質、すなわち、生物学的機能を失ってしまっており、またＧ−タンパク質結合性受容体に結合しても、応答を全く引き出さないリガンドのフラグメントも含まれる。可能性のあるアンタゴニストにはまた、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl .Ａcids Ｒes.、６:３０７３(１９７９);Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６ (１９８８);およびＤervanら、Ｓciece、２５１：１３６０(１９９１)を参照)、そのことによって、転写およびＧ−タンパク質結合性受容体の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＧ−タンパク質結合性受容体への翻訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６:５６０(１９９１);Ｏligodeo xynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣＰr ess、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ(１９８８))。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、Ｇ−タンパク質結合性受容体の産生を阻害することができる。別の可能性のあるアンタゴニストは、Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合し、リガンドに近づき難くすることから、正常な生物学的活性を妨げる小さな分子である。小さな分子の例には、これらに限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。可能性のあるアンタゴニストにはまた、可溶性型のＧ−タンパク質結合性受容体、例えば、リガンドに結合して、そのリガンドが、膜に結合したＧ−タンパク質結合性受容体と相互作用できないようにする、該受容体のフラグメントも含まれる。本発明のＧ−タンパク質結合性受容体は、ＰＡＣＡＰ様またはセクレチン受容体として推定的に同定されている。この同定は、アミノ酸配列ホモロジーの結果として行われている。該アンタゴニストを用いて、過剰分泌状態を治療し、薬理的健忘症を創成し、または長期記憶を有効にすることができる。後述する医薬的に許容しうる担体とともに組成物として該アンタゴニストを用いることができる。前述のスクリーニング法により同定されたアゴニストは、低分泌状態の治療、記憶の改善、健忘症の治療および神経障害における神経細胞死の予防、ならびにアルツハイマー病などの疾患の予防および/または治療に用いることができる。可溶性の本発明の受容体ポリペプチドおよびアゴニストおよびアンタゴニストは適切な医薬的担体と組み合わせて使用してよい。そのような組成物は、治療上有効な量の可溶性受容体またはアゴニストまたはアンタゴニストおよび医薬的に許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドまたはアゴニシストまたはアンタゴニストは、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、該医薬組成物は、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０ μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。本発明はまた、細胞から全ｍＲＮＡを得、ハイブリッド形成条件下で、そのように得られたｍＲＮＡを、少なくとも１０個のヌクレオチドを含んだ、本発明の受容体をコードする核酸分子の配列に含まれる配列と特異的にハイブリダイズしうる核酸プローブと接触させ、プローブにハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出し、それによって、細胞による受容体の発現を検出することを特徴とする、本発明の受容体をコードするｍＲＮＡの存在を検出することによる、細胞の表面における本発明のＨＣＥＧＨ４５受容体ポリペプチドの発現の検出方法を提供する。本発明はまた、本発明の受容体ポリペプチドに関連する受容体を同定する方法を提供する。これらの関連受容体は、低ストリンジェンシークロスハイブリダイゼーションによる本発明のＨＣＥＧＨ４５受容体に対するホモロジーにより同定するか、または関連する天然または合成リガンドと相互作用するかまたは本発明の神経ペプチド受容体ポリペプチドの遺伝子的または薬理学的封鎖後に類似の挙動を誘発する受容体を同定することにより同定しうる。該ＨＣＥＧＨ４５受容体ポリペプチド、およびポリペプチドであるアンタゴニストまたはアゴニストは、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作することができる。同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ロウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスから誘導することができるが、これらに限定されるものではない。ひとつの具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから誘導される。ベクターには、１種または２種以上のプロモーターが含まれる。適当なプロモーターとしては、ミラー（Miller）らのBiotechniques,Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．９，９８０〜９９０（１９８９）に記載されているレトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、もしくはその他のプロモーター（たとえば、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーターなどの真核細胞性プロモーターといったような細胞性プロモーター；ただし、これらに限定されるものではない）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。適当なプロモーターの選択は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターによって調節される。適当なプロモーターとしては、アデノウイルスメジャーレイトプロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのヘテロロガスプロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＴＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘発プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターといったようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ（前述の修飾レトロウイルスＬＴＲも含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。該プロモーターは、該ポリペプチドをコードする遺伝子を調節する活性（native）プロモーターである。レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞系に形質導入を行い、プロデューサー細胞系を形成する。トランスフェクトされうるパッケージング細胞としては、ミラーのHuman Gene Therapy、Vol.１、５〜１４（１９９０）に記載された、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターによるパッケージング細胞への形質導入は、当業者には既知の方法で行うことができる。このような手段としては、電気穿孔、リポソームの使用およびＣａＰＯ₄沈降が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別法として、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入するか、または、脂質に結合させて宿主に投与してもよい。プロデューサー細胞系は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生産する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボのいずれかにて真核細胞に形質導入することができる。形質導入された真核細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入されうる真核細胞としては、胚幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明はまた、遺伝的に欠陥のある遺伝子に起因する疾患などの診断剤としての本発明の遺伝子の使用も企図している。これらの遺伝子は、欠陥遺伝子と正常遺伝子の配列を比較することにより検出することができる。続いて、“突然変異 ”遺伝子が異常な受容体活性に関連することを実証することができる。さらに、依然として突然変異を実証あるいは同定することができない場合は、突然変異受容体遺伝子を適当なベクターに挿入し、機能アッセイシステム（たとえば、受容体欠失菌株ＨＥＫ２９３細胞における、カラリメトリーアッセイ、マコーニープレートにおける発現、相補性試験）において発現させる。突然変異遺伝子が同定されれば、次いで突然変異受容体遺伝子のキャリヤーについて集団をスクリーニングすることができる。本発明の遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６(１９８６))を利用することにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができる。例としては、Ｇ−タンパク質結合性受容体タンパク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、Ｇ−タンパク質結合性受容体変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化Ｇ−タンパク質結合性受容体のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化Ｇ−タンパク質結合性受容体のアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全に対合している配列は、ＲＮアーゼＡ消化により、または融解温度の相違により、対合していない複式物(duplexes)と区別することができる。参照遺伝子と「変異体」の間の配列の相違は直接のＤＮＡシークエンシニグ方法によって明らかになる。さらに、クローニングしたＤＮＡセグメントは特異的なＤＮＡセグメントを検出するプローブとして使用する。この方法の感度はＰＣＲと組み合わされる場合に非常に増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子とともに使用したシークエンシング法は修飾したＰＣＲ産物によって産生される。配列決定は放射線標識したヌクレオチドを使用する従来の方法によって、または蛍光標識タグを有する自動シークエンシング方法によって行われる。ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げることができる。特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）)。さらに、幾つかの疾患は、ｍＲＮＡにおける変化によって検出することができる、遺伝子発現における変化に起因するかまたは変化を特徴とする。言い方を変えると、本発明の遺伝子は、このタイプの受容体に関連する機能の低下を発現している個体を同定するための対照として用いることができる。本発明はさらに、宿主由来のサンプルにおいてレベルが上昇することがある疾患の指標であるところのＨＣＥＧＨ４５受容体ポリペプチドの可溶性体のレベルが変化していることを検出する診断アッセイに関する。可溶性受容体ポリペプチドの検出に利用することができるアッセイは当業者によく知られており、例えば、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが使用される。ＥＬＩＳＡアッセイは最初にＨＣＥＧＨ４５受容体ポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体をモノクローナル抗体に対して調製する。該リポーター抗体に放射能、蛍光または本実施例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような検出可能な薬剤を結合させる。サンプルを直ちに宿主から取り除いて、サンプル中のタンパク質と結合する固相支持体、例えばポリスチレンの皿の上でインキュベートする。ついでウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質と共にインキュベートすることにより、その皿の空いているタンパク質結合部位を全て覆う。つぎに、モノクローナル抗体を皿においてインキュベートするが、その間に、そのモノクローナル抗体はポリスチレン皿に結合したのＨＣＥＧＨ４５受容体タンパク質に結合する。結合しなかったモノクローナル抗体を全てバッファーで洗い流す。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に直ちに置くと、リポーター抗体の、本発明のポリペプチドに結合した任意のモノクローナル抗体への結合が起こる。ついで結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。ついでペルオキシダーゼ基質を皿に加え、一定時間の発色量を標準曲線に対して比較する場合、患者のサンプルの一定体積中に存在する本発明のタンパク質の量の測定値である。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'の翻訳されていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマーキング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５０または６０塩基という短いcＤＮＡで利用することができる。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂas ic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク(１９８８)を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全ておいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm unology Ｔoday４:７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃ ancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４，９４６，７７８号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する;しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列により作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す、本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒe s.、８:４０５７(１９８０)により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる。一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す、そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶa n der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２:４５６−４５７(１９７３)の方法に記載されているようにして行った。実施例１ＣＯＳ−７細胞における組換えＨＣＥＧＨ４５の発現プラスミド、ＨＣＥＧＨ４５−ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベクター pcＤＮＡＩ／Ａmp(インビトロゲン(Ｉnvitrogen))から得られる。完全なＨＣＥＧＨ４５の前駆体およびその３'末端にイン・フレームで融合したＨＡタグをコードするＤＮＡ断片を、そのベクターのポリリンカー領域にクローニングすることから、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(ウィルソン（Ｉ．Ｗilson）、ニマン（Ｈ.Ｎiman ）、ハイテン（Ｒ.Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ.Ｃherenson）、コノリー（Ｍ．Ｃonnolly）、およびラーナー（Ｒ.Lerner）、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタグを我々の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。プラスミド構築方法を以下に記載する：ＨＣＥＧＨ４５をコードするＡＴＣＣ受託番号第９７１３２号のＤＮＡ配列を、２つのプライマーを用いてのＰＣＲにより構築する：５'プライマー配列：はＥcoＲＩ部位、続いて開始コドンから出発するＨＣＥＧＨ４５のコーディング配列の９ヌクレオチドを含む；３'配列：は、ＸhoＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグ、およびＨＣＥＧＨ４５コーディング配列の最後の１１ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。従って、ＰＣＲ産物は、ＥcoＲＩ部位、ＨＣＥＧＨ４５コーディング配列、続いて、イン・フレームで融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終結コドン、およびＸhoＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片およびベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＥcoＲＩおよびＸhoＩ制限酵素で消化して、ライゲーションする。そのライゲーション混合物を大腸菌株ＳＵＲＥ（Ｓtra tagene Ｃloning Ｓystems、１１０９９・ノース・トリー・パインズ・ロード、ラ・ホヤ、ＣＡ９２０３７から入手）にトランスフォームし、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正しい断片の存在に関してＰＣＲおよび制限分析により試験する。組換えＨＣＥＧＨ４５の発現のために、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により、ＣＯＳ−７細胞を発現ベクターでトランスフェクションする。(サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９）)。ＨＣＥＧＨ４５−ＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する(ハーロゥ（Ｅ.Ｈarlow）およびレーン（Ｄ.La ne）、アンチボディーズ（Ａntibodies）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＡＬaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８８）)。トランスフェクションから２日後、タンパク質を³⁵Ｓ−システインで８時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡバッファー(１５０mＭＮaＣl、１％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ −４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭトリス、pＨ７.５))で溶菌する(ウィルソンら、同上３７：７６７（１９８４）)。細胞ライゼートおよび培養培地の両方を、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降させる。沈降したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。実施例２バキュロウイルス発現システムを用いてのＨＣＥＧＨ４５のクローニングおよび発現全長のＨＣＥＧＨ４５タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第９７１３２号を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。その５'プライマーは、配列：を有し、またＳmaＩ制限酵素部位(太字)、続いて、真核細胞における翻訳の開始に有効な信号に似ている１７ヌクレオチド(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１９８７、１９６、９４７−９５０、Ｋozak,Ｍ.)を含み、またこの直ぐ後は、ＨＣＥＧＨ４５遺伝子の最初の9ヌクレオチド(翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)である。その３'プライマーは、配列：を有し、また制限エンドヌクレアーゼＡsp７１８の切断部位、およびＨＣＥＧＨ４５遺伝子の３'の翻訳されていない配列に対して相補的な１３ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ１０１Ｉnc.、ラ・ホヤ、Ｃa.)を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントをエンドヌクレアーゼＳmaＩおよびＡsp７１８で消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製した。このフラグメントをＦ２と名付ける。ベクターpＡ２(pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システムを用いてのＨＣＥＧＨ４５タンパク質の発現に使用する(レビューには、サマーズ（Ｓummers）,Ｍ.Ｄ.およびスミス（Ｓmith）,Ｇ.Ｅ．１９８７、Ａ manual of methods for baculovirus vectors and insect cell cultu re procedures、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo ．１５５５を参照)。この発現ベクターは、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニアニュクリアポリヘドロシスウイルス(ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼＳmaＩおよびＡsp７１８の認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するため、Ｅ.coli由来の β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化信号が続くポリヘドリンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした (cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、例えば、pＡc３７３、pＶＬ９４１およびpＡcＩＭ１などのｐＲＧ１を、pＡ２の代わりに使用することができるであろう(ラッコー（Ｌ uckow）,Ｖ.Ａ.およびサマーズ（Ｓummers）,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１ −３９)。プラスミドを制限酵素ＳmaＩおよびＡsp７１８で消化した後、当業界で既知の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、前記と同様にしてＤＮＡを１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡをＶ２と名付ける。フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートさせた。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォームして、ＨＣＥＧＨ４５遺伝子を有するプラスミド(pＢac−ＨＣＥＧＨ４５)を含む細菌を、酵素ＳmaＩおよびＡsp７１８を使用して同定した。クローン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。リポフェクション法(フェルグナー（Felgner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７(１９８７))を利用して、プラスミドpＢacＨＣＥＧＨ４５５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧold^TMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１．０μgと共に同時トランスフェクトした。ＢaculoＧold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpＢac−ＨＣＥＧＨ４５５μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaith ersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１)に滴加した。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合した。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１ml を加えた。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続けた。４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith(上記)により記載されたようにして、プラークアッセイを行った。変法として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔechnolo gies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見い出すことができる)。４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させた。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用した。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存した。Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させた。その細胞に、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−ＨＣＥＧＨ４５を感染させた。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００II培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替えた。４２時間後、５μＣiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの³⁵Ｓシステイン５μＣi(Ａmersham)を加えた。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、細胞膜を遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化した。実施例３ヒト組織におけるＨＣＥＧＨ４５受容体の発現パターンノーザンブロット分析を行って、ヒト組織におけるＴＮＦ受容体の発現レベルを分析する。ＲＮＡzol^TMＢシステム（バイオテクス・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Biotecx Laboratories，Inc.）、６０２３サウス・ループ・イースト、ヒューストン、テキサス７７０３３）全細胞ＲＮＡサンプルを単離する。特定のヒト組織それそれから単離された全ＲＮＡの約１０μgを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルターにブロットする。（サンブルック、フリッチ、マニアチス、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９）)。ストラタジーンＰrime-Ｉｔキットを使用し、ＤＮＡ５０ngに標識付加反応を行う。標識したＤＮＡをＳelect-Ｇ-５０カラムにて精製する。（５Ｐrime-３Ｐrime，インコーポレイテッド、５６０３アラパホー・ロード、ボールダー、ＣＯ８０３０３）。次いで、０．５ＭＮａＰＯ₄ 中，１００００００cpm／ml，ｐＨ７．４，および７％ＳＤＳ，６５℃にて一夜という条件下、フィルターを放射標識した全長ＴＮＦ受容体遺伝子とハイブリダイズする。０．５ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで室温にて２回および６０℃にて２回洗浄後、−７０℃にて一夜フィルターを強化スクリーンに曝す。ＨＣＥＧＨ４５に対するメッセージＲＮＡは、ヒト大脳組織内に豊富である。実施例４遺伝子治療における発現皮膚生検により被験者から線維芽細胞を得る。得られる組織を組織培養培地に置き、小片に分ける。組織小片を組織培養フラスコの湿った表面に置く（約１０個の小片をそれぞれ別のフラスコ内に置く）。フラスコを逆さまにし、きつく閉じて室温にて一夜放置する。室温にて２４時間後、フラスコを逆に戻し、組織小片をフラスコの底に置いたまま新鮮な培養培地（たとえば、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたもの）を加える。次いで、これを３７℃にて約１週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を加え、続いて数日毎に培地を取り換える。さらなる２週間の培養後、単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコに塗り付ける。モロニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲにてフランキングされているｐＭＶ−７（カーシュマイヤー，Ｐ．Ｔ．らのＤＮＡ、７：２１９〜２５（１９８８））をＥcoＲＩおよびＨindＩＩＩで切断し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分画し、ガラスビーズを用いて精製する。それぞれ５'および３'末端配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅する。５'プライマーはＥcoＲＩ部位を含み、３'プライマーはさらにＨindＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下に、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線形バックボーンおよび増幅したＥcoＲＩ断片ならびにＨindＩＩＩ断片を一緒に加える。得られる混合物を２つの断片のライゲーションに適当な条件下に維持する。ライゲーション混合物を用いて細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いで、正しく挿入されている該遺伝子をベクターが含んでいることを確認するためにカナマイシン含有寒天上に置く。１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたダルベッコの調整イーグル培地(ＤＭＥＭ)中、両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を組織培養物中で増殖させて集密的密度にする。次いで、該遺伝子を含むＭＳＶベクターを該培地に加え、パッケージング細胞にベクターで形質導入する。パッケージング細胞はただちに該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する(パッケージング細胞は今後プロデューサー細胞と称する)。形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を加え、続いて、集密的プロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから培地を収穫する。感染性ウイルス粒子を含む消費された培地をミリポアフィルターで濾過して脱離したプロデューサー細胞を除去し、次いで、この培地を用いて線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞の亜集密的プレートから培地を除去し、プロデューサー細胞から得た培地と素早く交換する。この培地を除去し、新鮮な培地と交換する。もし、ウイルスの力価が高ければ、すべての線維芽細胞が実質的に感染していることになり、選択の必要はない。もし、力価が非常に低ければ、neoまたはhisなどの選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベクターの使用が必要である。次いで、それ単独で、あるいはサイトデックス３マイクロキャリアービーズ上で集密的になるまで増殖させた後に、遺伝的に操作された線維芽細胞を宿主に注入する。線維芽細胞はただちにタンパク質産物を産生する。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法によって本発明を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＦＣ１２Ｐ 21/02 ＣＡＢＪＣ１２Ｑ 1/68 ＡＡＢＶＧ０１Ｎ 33/15 ＺＡＣＢ 33/53 ＤＡＣＬＣ１２Ｎ 5/00 ＢＡＣＶＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＬＡＤＦＡＣＢＡＤＴＡＢＦ 45/00 ＡＢＵＡＡＮ 48/00 ＡＢＳＡＡＫＣ０７Ｋ 14/705 ＡＡＨ 16/28 ＡＡＢＣ１２Ｎ 5/10 ＡＢＶＣ１２Ｐ 21/02 ＡＣＶＣ１２Ｑ 1/68 ＡＤＴＧ０１Ｎ 33/15 ＡＢＪ 33/53 ＡＤＦ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リ，イアメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイザーズバーグ、ハワード・ランディング・ドライブ16125番 (72)発明者ローゼン，クレイグ・エイアメリカ合衆国20882メリーランド州レイトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 (72)発明者ルーベン，スティーブン・エムアメリカ合衆国20882メリーランド州オルネー、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）第１図に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第９７１３２号に含まれるＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であって、少なくとも７０％が該ポリヌクレオチドと同一であるポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント；よりなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．第１図の１番から４５６８番のヌクレオチドを有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．第１図に記載のポリペプチドの可溶性体をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。６．請求項５に記載のベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞。７．該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項８に記載の宿主細胞から発現させることを含む、ポリペプチドの製造方法。８．細胞を請求項５に記載のベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトすることを含む、ポリペプチドを発現させることが可能な細胞の製造方法。９．（ｉ）第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ受託番号第９７１３２号のcＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；よりなる群から選択される受容体ポリペプチド。１０．請求項９に記載のポリペプチドに対する抗体。１１．請求項９に記載のポリペプチドを活性化する化合物。１２．請求項９に記載のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。１３．受容体を活性化する必要がある患者の治療方法であって、請求項１１に記載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。１４．受容体を阻害する必要がある患者の治療方法であって、請求項１２に記載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。１５．該化合物がポリペプチドであって、該アゴニストをコードするＤＮＡを該患者に与えて、該アゴニストをイン・ビボで発現させることによって、該化合物の治療上有効な量を投与する、請求項１３に記載の方法。１６．請求項９に記載のポリペプチドの発現不足に関連のある疾患または該疾患の罹患し易さを診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を決定することを特徴とする方法。１７．該ポリペプチドがポリペプチドの可溶性フラグメントであって、該受容体に対するリガンドに結合可能である請求項９に記載のポリペプチド。１８．宿主由来のサンプル中に請求項１７に記載のポリペプチドの存在を分析することを特徴とする、診断方法。１９．Ｇ−タンパク質結合性受容体に結合して活性化する化合物および結合して活性化を阻害する化合物の同定方法であって、該受容体ポリペプチドに化合物を結合させるに十分な条件下で、細胞表面上に該ポリペプチドを発現している細胞に該化合物を接触させ、該ポリペプチドに化合物が結合することに応答する、検出可能なシグナルを提供しうる第２成分と混合し；次いで該第２成分によって生成されるシグナルの存在または不在を検出することにより、該化合物が有効なアゴニストまたはアンタゴニストであることを同定することを特徴とする方法。２０．請求項９に記載のポリペプチドの発現不足に関連のある疾患または該疾患の罹患し易さを診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を決定することを特徴とする方法。