JPH11506341A

JPH11506341A - Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９

Info

Publication number: JPH11506341A
Application number: JP9500379A
Authority: JP
Inventors: リ，イ; エイ．フルドナー，レベッカ
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1999-06-08
Also published as: AU714642B2; WO1996039442A1; CN1193980A; KR19990022531A; AU2820495A; EP0832126A4; CN1147505C; CA2221706A1; EP0832126A1

Abstract

(57)【要約】ヒトＧタンパク質PAFレセプターポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)、ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するための手順を開示する。このようなポリペプチドを利用して、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための方法、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストを治療的に用いて、PAFレセプターポリペプチドの過小発現および過剰発現に関連する症状を処置するための方法もまた開示する。PAFレセプター核酸配列における変異を検出するための診断方法および宿主由来のサンプル中の可溶性形態のレセプターのレベルを検出するための診断方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｇタンパク質レセプターHTNAD29 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトの７-膜貫通型レセプターである。この膜貫通レセプターは、時々本明細書以下で「Ｇタンパク質PAFレセプター」といわれる血小板活性化因子レセプターとして推定的に同定されている。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。多数の医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および/またはセカンドメッセンジャー（例えば、cAMP）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質により媒介されることは、十分に確立されている（Lefkowitz，Nature，351 :353-354(1991)）。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク質のいくつかの例としては、GPCレセプター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミンに対するGPCレセプター（Kobilka，B.K.ら，PNAS，84:46-50(1 987); Kobilka，B.K.ら，Science，238:650-656(1987); Bunzow，J.R.ら，Natur e，336:783-787(1988)））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュエータータンパク質（actuator protein）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）(Simon，M.I.ら，Science，252 :802-8(1991))が挙げられる。例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPを結合型G DPに変換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。Ｇタンパク質共役型レセプターの膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫通ドメインを有するものとして特徴づけられている。これらのドメインは、細胞外または細胞質ループにより結合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられる。Ｇタンパク質共役型レセプターは、ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経レセプターのような広範囲の生物学的に活性なレセプターを含む。Ｇタンパク質共役型レセプターは、少なくとも８つの分岐した親水性ループを結合する、約20〜30アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲を含むものとして特徴づけられている。共役型レセプターのＧタンパク質ファミリーの例として、ドーパミンレセプターが挙げられる。これは、精神病的および神経学的障害を処置するために使用される神経弛緩性薬物に結合する。このファミリーのメンバーの他の例としては、カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、cAMP、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子-1レセプター、およびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルスレセプターなどが挙げられる。大部分のＧタンパク質共役型レセプターは、機能的なタンパク質構造を安定化させると考えられるジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ループの各々に単一の保存されたシステイン残基を有する。７つの膜貫通領域はTM1、TM2、 TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と命名されている。TM3は、シグナル伝達に関連付けられている。システイン残基のリン酸化および脂質化(パルミチル化またはファルネシル化) は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターのシグナル伝達に影響を与え得る。大部分のＧタンパク質共役型レセプターは、第３の細胞質ループおよび/ またはカルボキシ末端内に潜在的なリン酸化部位を含有する。いくつかのＧタンパク質共役型レセプター（例えば、β-アドレノレセプター）について、プロテインキナーゼＡおよび/または特異的なレセプターキナーゼによるリン酸化は、レセプター脱感作を媒介する。Ｇタンパク質共役型レセプターのリガンド結合部位は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプター膜貫通ドメインにより形成される親水性受口(socket)を含有すると考えられ、この受口はＧタンパク質共役型レセプターの疎水性残基により囲まれている。各Ｇタンパク質共役型レセプター膜貫通ヘリックスの親水性側は内側に向いており、そして極性リガンド結合部位を形成すると仮定されている。 TM3は、リガンド結合部位（例えば、TM3のアスパラギン酸残基を含む）を有するとして、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターにおいて関連付けられている。さらに、TM5のセリン、TM6のアスパラギン、およびTM6またはTM7のフェニルアラニンまたはチロシンはまた、リガンド結合に関連する。Ｇタンパク質共役型レセプターは、ヘテロ三量体のＧタンパク質により種々の細胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（Johnsonら、Endoc.,Rev.,10:317-331(1989)を参照のこと）。異なるＧタンパク質のαサブユニットは、細胞内で種々の生物学的機能を調節するための特定のエフェクターを優先的に刺激する。Ｇタンパク質共役型レセプターの細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターのＧタンパク質結合の調節のための重要な機構として同定されている。Ｇタンパク質共役型レセプターは、哺乳動物宿主内の多数の部位において見出されている。本発明の１つの局面によれば、新規の成熟レセプターポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源である。本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、この核酸分子は、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびにそれらのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそれらのフラグメントを含む。本発明のさらなる局面によれば、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記ポリペプチドの回収を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および/または組換え真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する組換え技術によって、このようなレセプターポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてそれを活性化するか、またはその活性化を阻害する化合物をスクリーニングする方法が提供される。本発明のなお別の実施態様によれば、血小板凝集による血友病の防止および／または処置において、ならびに創傷治癒を促進することにおいて有用である本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてそれを活性化する化合物を宿主に投与するプロセスが提供される。本発明のなお別の実施態様によれば、アレルギー、炎症、血管形成後の再狭窄、不安定狭心症、心筋梗塞、および血栓卒中(thrombotic stroke)または血栓塞栓卒中(thromboembolytic stroke)の防止および／または処置において有用である、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてその活性化を阻害する化合物を宿主に投与するプロセスが提供される。本発明のなお別の局面によれば、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関連する疾患を検出するための、およびレセプターポリペプチドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための診断的アッセイが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DN Aの合成およびDNAベクターの製造に関するインビトロの目的のために利用するためのプロセスが提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包囲されるような本発明の範囲を限定することを意味しない。図１は、血小板活性化因子レセプターとして推定的に同定されている本発明のＧタンパク質レセプターのcDNA配列、および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決定を、373自動DNAシーケンサー(A pplied Biosystcms,Inc.)を用いて行った。図３は、本発明のＧタンパク質レセプター（上の行）とヒトPAFレセプター（下の行）との間のアミノ酸アラインメントを例示する。本発明の１つの局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチド、または1995年６月１日にATCC受託番号第号として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、白血球、肺、および腎臓において見出され得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト甲状腺由来のcD NAライブラリーで発見された。これは構造的にＧタンパク質PAFレセプターファミリーに関連する。これは、337アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒトPAFレセプターに最も高い程度の相同性を示し、334アミノ酸の領域にわたって29.375％の同一性および53.438％の類似性を有する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。従って、本発明は、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を含む。この改変体は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンの cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を含む。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。ポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドのTMおよび細胞内ドメインから切断されたポリペプチドの細胞外部分であるPAFレセプターポリペプチドの可溶性形態をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合は、赤血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37:7 67(1984)）。本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する（すなわち、ポリペプチドは、例えば、セカンドメッセンジャー応答を誘発することにより膜結合性PAFレセプターとして機能しなくても、レセプターに対するリガンドを結合する能力を保持することにより可溶性PAFレセプターとして機能する）。あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中上記したように、それに対して同一性を有し、そして活性を保持してもよく、または保持しなくてもよい、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有し得る。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの回収用の配列番号１のポリヌクレオチドに対するプローブ、またはその改変体のプローブ、あるいは診断プローブ、またはPCRプライマーとして用いられ得る。従って、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチドならびにそのフラグメント（このフラグメントは、少なくとも30塩基、および好ましくは少なくとも50 塩基を有する）ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するPAFレセプターポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性（すなわち、 PAFレセプターとしての機能）を保持するか、あるいは、ポリペプチドがＧタンパク質PAFレセプター（例えば、このレセプターの可溶性形態）として機能しなくても、レセプターに対するリガンドを結合する能力を保持するか、のいずれかであるポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、もしくはアナログは、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基は遺伝的コードによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは(iv)その中にさらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために使用される成熟ポリペプチドに融合されているもの、あるいは(v)ポリペプチドのフラグメントが可溶性であり（すなわち膜結合性ではない）、さらにリガンドを膜結合性レセプターに結合させるものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくとも70％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてより好ましくは少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なくとも95％の類似性（なおより好ましくは少なくとも95％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有するポリペプチドを含み、そして一般に少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。当該分野において公知なように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するDNAのセグメントを意味する；これは、コード領域の前および後（リーダーおよびトレイラー）の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され得る。本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくとも70％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてより好ましくは90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なくとも95％の類似性（なおより好ましくは少なくとも95％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。当該分野において公知なように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このようなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指示する適切な発現制制配列（プロモーター）に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはt rp 、λファージP_Lプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば、CH O、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pblues cript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK 223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG4 4、pXT1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。特によく知られた細菌性プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびtrpを含む。真核生物プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインIを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.，Dibner,M.，Battey,I.，B asic Methods in Molecular Biology,(1986))。宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側のSV 40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、中でも解糖酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質をペリプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望される場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimur ium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp sala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を含む。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により回収され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列をまた含有する。SV40スプライス部位に由来するDNA配列、およびポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され得る。本発明のＧタンパク質PAFレセプターポリペプチドは、以下を含む方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refold ing）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化されないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のための試験試薬および試験物質として使用され得る。本発明のＧタンパク質PAFレセプターは、本発明のレセプターポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）、または本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）をスクリーニングするためのプロセスにおいて使用され得る。一般的に、このようなスクリーニング手順は、その表面で本発明のレセプターポリペプチドを発現する適切な細胞を提供することを含む。このような細胞としては、哺乳動物、酵母、drosophila、またはE.coli由来の細胞が挙げられる。特に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトし、それにより、Gタンパク質PAFレセプターを発現させるのに用いられる。次いで、発現されたレセプターを、試験化合物と接触させて、結合、機能的反応の刺激または阻害を観察する。１つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のＧタンパク質PAFレセプターを発現するためにトランスフェクトされるメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスクリーニング技術は、PCT WO 92/01810（1992年２月６日公開）に記載されている。従って、例えば、このようなアッセイは、レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細胞とを接触させることにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングするために使用され得る。リガンドにより生じるシグナルの阻害は、化合物がこのレセプターの潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、レセプターの活性化を阻害することを示す。このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされるべき化合物とを接触させ、そしてそのような化合物がシグナルを生じるか、すなわち、このような化合物がレセプターを活性化するかを決定することによりレセプターを活性化する化合物を決定するために用いられ得る。他のスクリーニング技術は、例えば、Science、第246巻、181〜296頁（1989年 10月）に記載されるように、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外の pH変化を測定する系において、Ｇタンパク質PAFレセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトCHO細胞）の使用を含む。例えば、化合物は、本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）は、潜在的な化合物がレセプターを活性化するか、または阻害するかを決定するために測定され得る。別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇタンパク質PAFレセプターをコードするRNAをXenopus卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させることを含む。次いでそのレセプター卵母細胞は、レセプターの活性化を阻害すると考えられている化合物をスクリーニングする場合にはレセプターリガンドおよびスクリーニングされる化合物と接触され得、続いて、カルシウムシグナルの阻害または活性化の検出が行われる。別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているＧタンパク質PAFレセプターの発現を包含する。このような細胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ得る。スクリーニングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパーゼの２次シグナルに由来するレセプターの活性化の阻害の検出により達成され得る。別の方法は、細胞表面にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することによる、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物、アンタゴニストのスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにＧタンパク質PAFレセプターをコードするDNAで真核細胞をトランスフェクトする工程、および標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞と化合物とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、放射能により標識され得る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例えば、レセプターの放射能の測定により測定される。レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定されるようにこの化合物がレセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。Ｇタンパク質PAFレセプターは、哺乳動物宿主において遍在性であり、そして多くの病的な状態を含む、多くの生物学的機能を担う。従って、一方でＧタンパク質PAFレセプターを刺激し、そして他方でＧタンパク質PAFレセプターをの機能を阻害し得る化合物および薬物を見出すことが望ましい。例えば、Ｇタンパク質PAFレセプターを活性化する化合物は、治療目的（例えば、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、尿停留（urinary retention ）、および骨粗鬆症の処置）に用いられ得る。一般に、Ｇタンパク質PAFレセプターの活性化を阻害する化合物は、種々の治療目的（例えば、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病および神経性疾患（精神分裂病、躁病性興奮、うつ病、譫妄、痴呆、またはハンチントン舞踏病またはGilles dila Tourett症候群のような重篤な精神遅滞、ジスキネジーなどを含む）の処置）に用いられ得る。Ｇタンパク質PAFレセプターを阻害する化合物はまた、内因性食欲不振を逆転することおよび過食症の制御において有用である。抗体は本発明のＧタンパク質PAFレセプター、またはいくつかの場合には、オリゴヌクレオチドをアンタゴナイズし得る。これらは、Ｇタンパク質PAFレセプターに結合するが、Ｇタンパク質PAFレセプターの活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を惹起しない。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に会合する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体を包含する。潜在的なアンタゴニスト化合物もまた、Ｇタンパク質PAFレセプターのリガンドに密接に関連するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的機能を欠失しており、そしてＧタンパク質PAFレセプターに結合するときに応答を惹起しない。アンチセンス技術の使用によって調製されたアンチセンス構築物は、アンチセンス技術は、三重らせん形成もしくはアンチセンスDNAまたはRNAを介して遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979); Cooneyら、Science， 241:456(1988);およびDervanら、Science，251: 1360(1991)を参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質PAFレセプターの産生を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のＧタンパク質PAFレセプターへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Okano 、J．Neurochem.，56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibi tors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、アンチセンスRNAまたはDNAが、Ｇタンパク質PAFレセプターの産生を阻害するためにインビボで発現され得る。Ｇタンパク質PAFレセプターに結合する小分子は、リガンドのレセプターへの接近を不可能にし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる。例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子はまた、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害するために使用され得る。可溶性形態のＧタンパク質PAFレセプター（例えば、このレセプターのフラグメント）は、本発明のポリペプチドに対するリガンドに結合し、そしてこのリガンドが、膜結合性Ｇタンパク質PAFレセプターと相互作用するのを妨げることによりレセプターの活性化を阻害するために使用され得る。本発明はまた、Ｇタンパク質PAFレセプターに結合し得ることが知られていないリガンドが、このようなレセプターに結合し得るか否かを決定するための方法を提供する。この方法は、リガンドのＧタンパク質PAFレセプターに対する結合を許容する条件下で、Ｇタンパク質PAFレセプターを発現する哺乳動物細胞とリガンドとを接触させる工程、レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工程、これによりリガンドがＧタンパク質PAFレセプターに結合するか否かを決定する工程を包含する。アゴニストおよび/またはアンタゴニストを決定するための上記の系はまた、レセプターに結合するリガンドを決定するために使用され得る。本発明はまた、レセプターをコードするmRNAの存在を検出することにより、細胞表面上に本発明のＧタンパク質PAFレセプターポリペプチドの発現を検出する方法を提供する。この方法は、細胞から全RNAを得る工程、ハイブリダイズ条件下で、そのように得られたmRNAと、レセプターをコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも10ヌクレオチドの核酸分子を含む核酸プローブとを接触させる工程、プローブにハイブリダイズしたmR NAの存在を検出する工程、およびそれにより細胞によるレセプターの発現を検出する工程を包含する。本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドに関連するレセプターを同定する方法を提供する。これらの関連するレセプターは、低ストリンジェンシークロスハイブリダイゼーションにより、本発明のＧタンパク質PAFレセプターポリペプチドに対する相同性により、あるいは関連する天然のリガンドまたは合成のリガンドと相互作用するレセプターおよび/または本発明のＧタンパク質PAFレセプターポリペプチドの遺伝子的または薬理学的遮断後に類似の挙動を誘発するレセプターを同定することにより同定され得る。上記のスクリーニング法により同定されるアゴニストは、血小板凝集を誘導することによる血友病を処置し、そして創傷治癒を刺激するために使用され得る。Ｇタンパク質PAFレセプターに対するアンタゴニスト化合物は、血管形成後の再狭窄、不安定狭心症、血栓卒中または血栓塞栓卒中、アレルギー、炎症および心筋梗塞を予防および/または処置するために使用され得る。アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書上記に記載のもの）を有する組成物において使用され得る。アンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の様式に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と併用して用いられ得る。薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路による便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の症状の処置および／または予防に有効な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約10μg /kg体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。Ｇタンパク質PAFレセプターポリペプチド、およびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらはポリペプチドである）はまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。本明細書中上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。ベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Millerら、Biotechniques、第７巻、第９号、980-990(1989)に記載のレトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス(CM V)プロモーター、または他の任意のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター（ヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない）のような細胞プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター）；RSウイルス(RSV)プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；ヒートショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAI プロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスLTR（本明細書上記に記載の改変レトロウイルスLTRを含む）；βアクチンプロモーター：およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、Miller、Human Gene Therapy、第１巻、5-14 頁(1990)（その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のPE501 PA31 7、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP-e nvAm12、およびDAN細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCa PO₄沈澱が挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替として、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され得るか、またはPAF を脂質に結合し得、次いで宿主に投与され得る。プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚芽幹細胞、胚芽肉腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、診断としての本発明の遺伝子の使用を意図する。例えば、いくつかの疾患は、遺伝性欠損遺伝子から生じる。これらの遺伝子は、正常な遺伝子の配列と欠損遺伝子の配列とを比較することにより検出され得る。その後に、「変異体」遺伝子は、異常なレセプター活性に関連することが確認され得る。さらに、変異体レセプター遺伝子は、変異を確認するか、または同定するためのなお別の手段としての機能的アッセイ系（例えば、比色定量アッセイ、MacConkey プレート上での発現、HEK293細胞のレセプター損株における相補性実験）における発現に適切なベクターに挿入され得る。一旦「変異体」遺伝子が同定されると、「変異体」レセプター遺伝子のキャリアのための集団がスクリーニングされ得る。本発明の遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断のために用いられる核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組織生検物質、および剖検物質由来のものを含むが、これらに限定されない）より得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析前にPCRを用いることにより酵素的に増幅され得る（Saikiら、Nature、32 4:163-166(1986)）。RNAあるいはcDNAはまた、同じ目的のために使用され得る。例として、本発明の核酸に相補的なPCRプライマーが、本発明の遺伝子における変異を同定および解析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、放射性標識された本発明のRNAまたは、あるいは、放射性標識された本発明のアンチセンスDNA配列に、増幅されたDNAをハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全に対合した配列は、RNaseＡ消化または融解温度の差により、誤対合した二本鎖と区別され得る。このような診断は、出生前の試験または新生児の試験のためにも特に有用である。対照遺伝子と「変異体」遺伝子との間の配列差異は、直接DNA配列決定法により明らかにされ得る。さらに、クローニングされたDNAセグメントは、特異的なD NAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の感度は、PCRと組み合わせた場合、非常に増強される。例えば、プライマー配列は、二本鎖PCR産物または改変PCRより作製された一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いた従来の手順によるか、または蛍光タグを用いた自動配列決定手順により行われる。 DNA配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され得る。特異的な位置での配列変化はまた、核保護アッセイ（例えば、RNaseおよびS1保護）または化学切断法(例えば、cottonら、PNAS,USA,85:4397-4401 198 5)により明らかにされ得る。さらに、いくつかの疾患は、mRNAにおける変化により検出され得る遺伝子発現の変化の結果であり、すなわち遺伝子発現の変化によって特徴づけられる。あるいは、本発明の遺伝子は、この型のレセプターに関連する機能の減少を示す個体を同定するための参照として使用され得る。本発明はまた、種々の組織における本発明のPAFレセプターポリペプチドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来するサンプル中の可溶性レセプターポリペプチドのレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、および好ましくはELISAアッセイを含む。 ELISAアッセイは、PAFレセプターポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を最初に含む。さらに、このモノクローナル抗体に対するレセプター抗体が調製される。放射能、蛍光、またはこの実施例において西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬がレセプター抗体に付着される。ここでサンプルは、宿主から取り出され、そして固体支持体（例えば、サンプル中のタンパク質に結合するポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることにより被覆される。次いで、モノクローナル抗体は、ディッシュ内でインキュベートされ、この間、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに付着された任意のＧタンパク質PAFレセプタータンパク質に付着する。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液により洗い流される。ここで西洋ワサビペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体はディッシュ内に入れられ、これにより PAFレセプタータンパク質に結合した任意のモノクローナル抗体へレポーター抗体が結合する。次いで、付着されなかったレポーター抗体は洗い流される。次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュに添加され、そして所定の期間における発色量が、標準曲線と比較した場合の所定容量の患者サンプルに存在するPAF レセプタータンパク質の測定値である。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的局在性の決定(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング計画は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した(flow-sorted )染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、50または60塩基という短いcDNAで使用され得る。この技術の総説としては、Vermaら，Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、 V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Uni versity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA配列またはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるがいずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度で、そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられる。単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使用され得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部分または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載される。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／またはそれに続く大文字および／または数字を示すことにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントには、約２単位の酵素が約20μlの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜5 0μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８: 4 057(1980)により記載される８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。別に記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb，A.，Virology ，52:456-457(1973)の方法に記載のように実施された。実施例１Ｇタンパク質共役型レセプターHTNAD29(PAFレセプター)の細菌発現および精製 PAFレセプターをコードするDNA配列（ATCC受託番号第号）を、プロセスされたＧタンパク質の５'配列（シグナルペプチド配列を除く）およびPAFレセプター遺伝子に対して３'のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。PAFレセプターに対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５'および３'配列に添加する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５'CGAATTCCTCCATGAACAGCACATGTATT３'を有し、これはEcoRI制限酵素部位、それに続くプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まる 18ヌクレオチドのＧタンパク質PAFレセプターコード配列を含む。３'配列、５'C GGAAGCTTCGTCAAGGACCTCTAATTCC３'は、HindIII部位に相補的な配列を含み、そして続いてPAFレセプターをコードするの18ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc．Chatsworth，CA）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9を、EcoRIおよびHindIII で消化する。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli株 M1 5/rep 4(Qiagen，Inc.)をSambrook，J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory M anual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4はプラスミドpREP4の多数のコピーを含有する。これは、lacIリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Kan^r）を付与する。形質転換体をLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、そして制限酵素分析により確認する。所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）とKa n（25μg/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させる。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大規模な培養物に接種する。細胞を、600の光学密度（O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にする。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化することにより、P/Oを解放（clear）し遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により収集する。細胞ペレットをカオトロピック薬剤６ＭグアニジンHCl中で可溶化する。明澄化後、可溶化Ｇタンパク質PAFレセプターを、6-Hisタグを含有するタンパク質により堅く結合し得る条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製する（Ho chuli，Eら、J．Chromatography 411: 177-184(1984)）。PAFレセプターを６MグアニジンHCl(pH5.0)でカラムから溶出し、そして再生の目的で、３MグアニジンH Cl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整する。この溶液中での12時間のインキュベーションの後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。実施例２ COS 細胞中での組換えPAFレセプターの発現プラスミド、PAFレセプターHAの発現を、ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）から誘導する。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含有する：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40 イントロン、およびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。PAFレセプター前駆体全体およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするD NAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現はCMVプロモーター下に支配される。HAタグは、先に記載された（I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 37，767）ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する。本発明者らの標的タンパク質へのHAタグの融合により、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する： PAFレセプターをコードするDNA配列（ATCC受託番号第号）を、以下の２つのプライマーを用いてクローン化された最初のESTにおけるPCRにより構築した：５'プライマー（５'GTCCAAGCTTGCCACCATGAACAGCACATGTATT３'）は、HindIII部位、それに続く開始コドンから始まるPAFレセプターコード配列の18ヌクレオチドを含む；３'配列、５'CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAAGGACCT CTAATTCCATA３'は、XhoI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびPAFレセプターコード配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、部位、インフレームで融合したHAタグが続くレセプターコード配列、HAタグに隣接する翻訳終結停止コドン、およびXhoI部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDNAI/Amp）を、HindIIIおよび XhoI制限酵素を用いて消化し、そして連結した。連結混合物を、E．coli SURE株（Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，C A 92037より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限酵素分析で調べた。組換えPA Fレセプターの発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法（J．Sambrook、E．Frit sch，T．Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring La boratory Press，(1989)）により発現ベクターでトランスフェクトした。PAF レセプターHAタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した（E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbo r Laboratory Press，(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S- システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC 、50mM Tris(pH7.5)）で溶解した(Wilson，I.ら、同上37:767(1984))。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈降したタンパク質を15％ SDS-PAGEゲルにおいて分析した。実施例３バキュロウイルス発現系を用いるＧタンパク質共役型レセプター(PAFレセプター )のクローニングおよび発現全長のPAFレセプタータンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第号）を、この遺伝子の５'配列および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した：５'プライマーは、配列５'CGGGATCCCTCCATGAACAGCACATGTATT３' を有し、そしてBamHI制限酵素部位（太字）と、それに続く真核生物細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４つのヌクレオチド（J．Mol．Biol．1987，196 ，947-950，Kozak，M.）、およびすぐ後ろにこのPAFレセプター遺伝子の最初の1 8ヌクレオチド（翻訳の開始コドン「ATG」に下線を付する）を含有する。３'プライマーは、配列５'CGGGATCCCGCTCAAGGACCTCTAATTCCATA３'を有し、そして制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位およびこのPAFレセプター遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅した配列を、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIで消化し、そして上記のように精製した。このフラグメントを、F2と呼ぶ。ベクターpRG1（pVL941ベクターの改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いるPAFレセプタータンパク質の発現のために用いる（総説について、Summe rs，M.D.およびSmith，G.E．1987，Amanual of methods for baculovirus vect ors and insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに続くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクトした野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列に両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSumm ers，M.D.、Virology，170:31-39）。プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを、上記のように、１％アガロースゲルから単離した。このベクターDNAをV2と呼ぶ。フラグメントF2および脱リン酸化したプラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIを用いて、PAFレセプター遺伝子を有するプラスミド（pBacPAF receptor）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。５μgのプラスミドpBacPAF receptorを、リポフェクション法（Felgnerら Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウイルス（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharmingen， San Diego，CA.）とともにコトランスフェクトした。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacPAF receptorを、50μlの無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清を含まないGrace培地１mlを含有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ AT CC CRL 1711）に滴下して加えた。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振動させた。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのGrace昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburgが配布する昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、 200μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブ中で再懸濁した。寒天を、短かい遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mm ディッシュに播種されたSf9細胞に感染させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させた。細胞を、感染多重度（M0I）２で、組換えバキュロウイルスV-PAFレセプターで感染させた。６時間後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Llfe Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５ μCiの³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細胞をさらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により収集し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。実施例４遺伝子療法を介しての発現線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を、組織培養培地中に置き、そして小片に分ける。組織の小塊（small chunk）を、組織培養フラスコの湿潤表面に置き、およそ10片をそれぞれのフラスコ中に置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉し、そして室温にて一晩置く。室温にて24時間後、フラスコを逆さにし、そして組織の塊をフラスコの底に固着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、10％FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するH amのF12培地）を添加する。次いで、これを37℃にておよそ１週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加し、その後数日毎に取り替える。さらに２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコ中に掻き落とす。モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接するpMV-7（Kirschmeier，P. T.ら，DNA，7: 219-25(1988)）を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、その後仔ウシ腸ホスファターゼを用いて処理する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを用いて精製する。本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ５'末端配列および３'末端配列に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。５'プライマーはEcoRI部位を含み、そして３'プライマーはさらにHindIII部位を含む。T4 DNAリガーゼの存在下で、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状骨格ならびにEcoRIおよびHin dIIIフラグメントを一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を用いて細菌HB101を形質転換し、次いでこれを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナマイシンを含有する寒天上にプレーティングする。アンホトロピックなpA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％仔ウシ血清（CS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するDulbecco改変Eagle 培地（DMEM）中でコンフルエントな密度になるまで組織培養物中で増殖させる。次いで、遺伝子を含むMSVベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターを用いて形質導入する。この時、パッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産生する（この時、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる）。新鮮な培地を、形質導入したプロデューサー細胞に添加し、その後、培地を、コンフルエントなプロデューサー細胞の10cmプレートから収集する。感染性のウイルス粒子を含有する使用済みの培地を、ミリポアフィルターを通して濾過して、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、サブコンフルエントな線維芽細胞のプレートから除去し、そして迅速にプロデューサー細胞からの培地と置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地で置き換える。ウイルスの力価が高い場合、実質的に全ての線維芽細胞が感染し、そして選択は必要ない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、neoまたはhis）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。次いで、操作された線維芽細胞を、単独で、またはcytodex3マイクロキャリアービーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれかで宿主に注入する。この時、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。本発明の多数の改変および変更が、上記の教示を参照して可能であり、従って、添付する請求の範囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 ＡＥＤＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 48/00 ＡＣＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ０７Ｋ 14/705 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 16/28 33/50 ＴＣ１２Ｎ 5/10 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ 33/53 ＡＢＦ // Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＢＥ (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＢＳＣ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 39/395 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フルドナー，レベッカエイ. アメリカ合衆国バージニア 20838，バーネスビル，バーネスビルロード 18040，ピー．オー．ボックス 306

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたポリヌクレオチドであって、 (a) 図１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b) ATCC受託番号において含まれるDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (c) (a)または(b)の該ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、そして(a)または(b)の該ポリヌクレオチドと少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド；および (d) (a)または(b)の該ポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント、からなる群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．図１に記載のヌクレオチド523〜ヌクレオチド1533を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．図１のポリペプチドの可溶性形態をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．請求項２に記載のDNAを含むベクター。６．請求項５に記載のベクターで形質転換されたか、またはトランスフェクトされた宿主細胞。７．ポリペプチドを産生するためのプロセスであって、請求項８に記載の宿主細胞から、前記DNAによりコードされる前記ポリペプチドを発現する工程を包含する、プロセス。８．ポリペプチドを発現し得る細胞を産生するためのプロセスであって、請求項５に記載のベクターで細胞を形質転換するか、またはトランスフェクトする工程を包含する、プロセス。９．レセプターポリペプチドであって、 (i) 図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；および (ii) ATCC受託番号のcDNAによりコードされるポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体、からなる群から選択されるメンバーを含む、ポリペプチド１０．請求項９に記載のポリペプチドに対する抗体。１１．請求項９に記載のポリペプチドを活性化する化合物。１２．請求項９に記載のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。１３．Ｇタンパク質PAFレセプターを活性化する必要性を有する患者を処置するための方法であって、請求項１１に記載の化合物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。１４．Ｇタンパク質PAFレセプターを阻害する必要性を有する患者を処置するための方法であって、請求項１２に記載の化合物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。１５．前記化合物がポリペプチドであり、そして該化合物の治療有効量が、前記患者にアゴニストをコードするDNAを提供し、そしてインビボで該アゴニストを発現することにより投与される、請求項１３に記載の方法。１６．請求項９に記載のポリペプチドの過小発現に関連する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプロセスであって、該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を決定する工程を包含する、プロセス。１７．前記ポリペプチドが該ポリペプチドの可溶性フラグメントであり、そして前記レセプターのリガンドを結合し得る、請求項９に記載のポリペプチド。１８．診断プロセスであって、宿主由来のサンプル中の請求項９に記載のポリペプチドの存在を分析する工程を包含する、診断プロセス。１９．請求項９に記載のレセプターポリペプチドに結合して活性化する化合物、および該レセプターポリペプチドに結合して阻害する化合物を同定するための方法であって：細胞表面上で該レセプターポリペプチドを発現する細胞と化合物とを、該化合物の該レセプターポリペプチドへの結合を許容するのに十分な条件下で接触させる工程であって、該レセプターは、該化合物の該レセプターポリペプチドへの結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合される、工程；および該化合物が、該第２の成分により生成される該シグナルの存在または非存在を検出することにより、有効なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを同定する工程、を包含する、方法。２０．請求項９に記載のポリペプチドの過小発現に関連する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプロセスであって、該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を決定する工程を包含する、プロセス。