JP2001507205A

JP2001507205A - サイトスタチン▲ｉｉ▼

Info

Publication number: JP2001507205A
Application number: JP51337497A
Authority: JP
Inventors: ニ，ジャン; ユ，グオ−リアン; ゲンツ，ライナー
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2001-06-05
Also published as: EP0856006A4; WO1997011970A1; EP0856006A1; AU3733095A

Abstract

(57)【要約】本発明はサイトスタチンII増殖調節ペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、とくに該ポリヌクレオチドを発現することによって、ポリペプチドを製造する方法および該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。本発明はさらに、そのようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、および研究、診断および臨床技術に部分的に関する応用のためのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。

Description

【発明の詳細な説明】サイトスタチンII 本発明は、部分的に新たに同定されたポリヌクレオチド、およびポリペプチドに関する；該ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体および誘導体；該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドおよびその変異体および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト；および該ポリヌクレオチド、ポリペプチド、変異体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。とりわけ、これらおよび他の点において、本発明は、ヒトサイトスタチンIIに関する。発明の背景細胞の増殖および分化および組織および腺の成長は、自己分泌および傍分泌因子、増殖因子などのようにホルモンの作用を調節または媒介し、それ自体でホルモンであるものにより制御される。例えば、局所的に増殖を中止させるシグナルを出し、ついで増殖途中の上皮の細胞の分化を刺激するペプチドは乳腺の発達に非常に有効である。これらの因子は、特にヒトにおいては同定または特徴つけられることはめったにない。組織および腺、特に乳腺中の細胞の増殖の液体培地中で役割を果たす少しの因子は非ヒト生物体中において同定されている。そのような因子は乳腺由来増殖阻害剤（“ＭＤＧＩ”）であり、少なくともマウスとウシにおいては、上皮細胞増殖を抑制し、および上皮細胞の分化を刺激する。ＭＤＧＩは最初にウシの乳および乳腺中において単離されていた。続いて、該ペプチドをマウス中において同定された。ＭＤＧＩは翻訳後の工程の別経路によって少なくとも２つの形態において存在する。元来の形態はＭＤＧＩとして呼ばれて存在し、ついで第２形態はＭＤＧＩ −２と呼ばれるものであるＭＤＧＩは乳脂肪小球膜（“ＭＦＧＭ”）に主に結合し、抗ＭＤＧＩ抗体を用いて免疫学的アッセイにより評価される。類似の時間経過実験はＭＤＧＩが運搬に従い、授乳開始で劇的に乳腺中で増加することを示すＭＤＧＩ−２はこの点においてＭＤＧＩと異なっている。該ＭＤＧＩ−２は授乳期ではなく妊娠期に乳腺において見い出される。ＭＤＧＩの２つの形態の役割および作用の機構は明らかには定義されていない。マウスおよびウシＭＤＧＩは互いに類似しており、低分子量親水性リガンド結合性タンパク質（“低分子量ＨＬＢＰ(ｓ)”）であり、それには、脳、心臓、肝臓および腸由来の脂肪酸結合タンパク質（“ＦＡＢＰ（ｓ）”）ｐ４４２と呼ばれるガストロピンなる脂肪細胞の分化関連タンパク質および細胞性レチノイン酸結合タンパク質（“ＣＲＡＢＰ”）を含む。これらのタンパク質は、長鎖脂肪酸、レチノイドおよびエイコンサノリド（eiconsanolid）などの親水的に結合し、脂肪酸および脂肪酸誘導体の輸送、隔離または代謝において役割を果たすと考えられている。しがしがら、それらは分化において特異的なやり方で乳腺、心臓、肝臓、脳および腸の細胞において発現し、それらは基礎代謝において役割を果たすのみならず、分化および増殖においても重要な役割を有するようである。ＭＤＧＩの低分子量ＨＬＢＰｓに対するホモロジーはＭＤＧＩは少なくともその機能の一部において、親水性リガンドに結合し、ついでこのリガンドへの結合は、ＭＤＧＩが細胞の増殖を抑制し、分化を刺激することによって該メカニズムにとって重要である；ガストロピンを除く他のすべての低分子量ＨＬＢＰｓは細胞内で作用するが、ＭＤＧＩはイン・ビトロで細胞外で作用する。低分子量ＭＬＢＰにおいて、ＭＤＧＩは、脂肪酸結合タンパク質（“ＦＡＢＰ ”）に密接に類似する。ＦＡＢＰは脳、心臓、肝臓および腸において同定されている。心臓ＦＡＢＰはＭＤＧＩのように、天然資源から産生されるかまたは、異種宿主中のクローニングされた遺伝子の発現によって産生され、マウス起源の正常乳腺上皮細胞（“ＭＥＣ”）の増殖を阻害する。さらに、該ＦＡＢＰは乳タンパク質合成を刺激し、それ自身のこれらの細胞中での発現を刺激する。しかしながら、ウシ心臓ＦＡＢＰのようではなく、ウシＭＤＧＩは脂肪酸に結合しなかった。これらの２つのタンパク質は互いに９５％類似であったが結合しなかった。心臓ＦＡＢＰは実際、ＭＤＧＩの形態であってよいことが示唆される。従って、たとえＤＧＩが低分子量ＨＬＢＰであるとしても、その基質アフィニティーがそのファミリー内の密接な関係物とは全く異なるが、それゆえ、それは異なる生理学的役割を果たすようである。イン・ビボにおいてＭＤＧＩは、マウスまたはウシにおける毛細血管内皮細胞および乳腺実質中で見いだされる。ＭＤＧＩは、最初に毛細血管内皮細胞に現れ、後に分泌上皮細胞において現れる。乳腺毛細血管内皮細胞中のＭＦＧＩの局在は、内皮細胞増殖を調節する役割と一致する。多くのＭＤＧＩの関係物は、イン・ビトロで証明されている。例えば、新生児ラット心臓細胞のベータアドレナリン刺激に対するＬ（＋）−酪酸−、アラキドン酸−および１５−Ｓ−ヒドロキシエイコサテラエノイン酸−誘発超感受性が示されてる。その誘発された過剰感受性は、β２−アドレナリン受容体の小集団によって媒介され、それゆえ、ＭＤＧＩがこれらの受容体の成城機能を邪魔することが示唆されている。これらの受容体との相互作用は、ＭＤＧＩが細胞の増殖を阻害することによって、そのメカニズムの一部でもある。この活性はまた、ＭＤＧＩはもともと心臓筋肉細胞のβ−アドレナリン感受性を天然において調節している。乳腺上皮細胞（“ＭＥＣ”）へのＭＤＧＩの効果は、さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いてアンチセンス阻害実験によってさらに示されている。これらの実験はＭＤＧＩアンチセンス分子はβ−カゼインレベルを低減させ、組織培養中の肺胞末端芽（alveolar end buds）の出現を抑圧する。さらに、ＭＤＧＩは上皮増殖因子のマイトジェン効果を抑圧する。ＭＤＧＩは乳腺分化を促進させる最初に公知の増殖阻害剤である。ＭＤＧＩの調節特性は完全に１１−アミノ酸配列によって模擬されることができ、それはＭＤＧＩのカルボキシル末端および低分子量ＨＬＢＰのサブファミリーにおいて代表される。乳腺上皮細胞株すべてではないが、同様にＭＤＧＩに応答する。ＭＤＧＦは、正常ヒトＭＥＣの増殖を抑制し、時間の長さを変化させるよう経過する。それはまたマウス乳癌上皮細胞株ｍＭａＣａ２０１７７の増殖を阻害し、ヒト悪性腫瘍乳腺細胞株ＭａＴｕおよびＴ４７Ｄおよびそれはイン・ビトロの静止エールリッヒ腹水癌細胞（“ＥＡＣ”）の増殖の続行を阻害する。逆に、ＭＤＧＦは、わずかにヒト悪性腫瘍乳腺上皮細胞株ＭＣＦ７の増殖を刺激する。最終的に、ＭＤＧＩはマウス多分化能胎児幹細胞の分化を促進する。ＭＤＧＩの細胞への影響のメカニズムはいまなお知られていない。イン・ビトロにおける静止エールリッヒ腹水癌細胞（“ＥＡＣ”）の増殖の続行は、細胞性ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｒａｓｍＲＮＡにおいて急激に増殖することによって達成される。ＭＤＧＩにさらしたこれらの遺伝子の急激な誘発は増殖調節に対する癌遺伝子の発現ｎｏ重要性をはっきり示し、ついで細胞増殖とｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｒａｓの発現との間に正の相関があることを示している。さらに、これらの遺伝子の発現へのＭＤＧＩの影響はそれが、直接または１またはそれ以上のシグナル経路を介してかまたはその両者であれ、細胞性前癌遺伝子の正のエフェクターであることを示している。ＭＤＧＩは、可能性のある腫瘍抑圧遺伝子として機能することができることも示されている。ＭＤＧＩ発現構築物でトランスフェクションしたヒト乳癌細胞は分化した形態、増殖速度の減少、軟アガーにおける減少したクローン産生度、およびヌードマウス中の減少した腫瘍酸性度を示す。この遺伝子のヒトホモログは染色体１ｐ３３−３５にマッピングされ、以前示された遺伝子座はヒト乳癌(腫瘍の約４０％)の異種性(heterozygosity)の頻繁な損失を示す。ＭＤＧＩのイン・ビボおよびイン・ビトロ腫瘍サプレッサー活性の大きさは、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ＲｂおよびＨ１９に関して以前に観察されたものと比較することができる。ＭＤＧＦの細胞増殖および分化への影響および細胞性前癌遺伝子発現の発現への影響は異常な細胞増殖、機能不全および疾患での細胞、組織、腺および器官ならびにその役割の重要性を繰り返す。明らかに、正常および異常な細胞増殖および分化を調節する因子の必要性がある。それゆえ、正常および疾患状態の両者において細胞増殖および分化を調節するような因子の同定および特徴付けの必要性がある。特に、成長過程および成熟ヒト女性の乳腺などの適切な成長および組織および器官の健康に不可欠である、上皮細胞、特に乳腺上皮細胞などの細胞増殖および分化を調節するサイトスタチンを単離し、同定する必要性がある。発明の要約これらの目的および他の目的のため、特に、ＭＤＧＩなどの公知のサイトスタチンに対するホモロジーにより新規なサイトスタチンであると同定された、図１に示されたアミノ酸配列のポリペプチドを提供することは本発明の目的である。さらに、サイトスタチンをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書においてサイトスタチンIIと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。本発明のこの局面の特に好ましい態様において、該ポリヌクレオチドは図１に示される配列またはＡＴＣＣ受託番号第号におけるｃＤＮＡ（本明細書において寄託したクローンという）におけるヒトサイトスタチンIIをコードする領域を含む。本発明のこの局面により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含むヒトサイトスタチンIIをコードする単離された核酸分子を提供し、本発明のこの局面のさらなる態様において、生物学上、診断上、臨床上または治療上有用な変異体、類似体および誘導体の断片を含む、変異体、類似体またはその誘導体、またはその断片を提供する。本発明のこの局面の特に好ましい態様は、ヒトサイトスタチンIIの天然に存在するアレル変異体である。上皮細胞の増殖活性を調節するサイトスタチンIIポリペプチド、特にヒトサイトスタチンIIポリペプチドを提供することは、本発明の目的である。本発明のこの局面により、本明細書中でサイトスタチンIIというヒト起源の新規ポリペプチドならびに生物学上、診断上または治療上有用な断片、変異体、ホモログ、類似体およびその誘導体を提供する。本明細書の特に好ましい態様はヒトサイトスタチンII遺伝子の天然に存在するアレルによりコードされるヒトサイトスタチンIIの変異体である。上記のポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体、類似体、誘導体およびその断片を調製する方法を提供することが本発明の他の目的である。本発明のこの局面の好ましい態様において、宿主内でヒトサイトスタチンIIの発現の条件下で、外在的に由来するヒトサイトスタチンIIをコードするポリヌクレオチドを発現上組み込ませる宿主細胞を培養し、ついで発現されたポリペプチドを回収することを含む、上記のサイトスタチンIIをポリペプチドを調製する方法を提供する。上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、特に生物学的、臨床上および治療上の目的を利用するための産物、組成物、工程および方法を提供することが他の目的である。本明細書のこの局面の好ましい態様により、他のもの；例えば、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボにおいて細胞増殖を調製すること；タンパク質またはｍＲＮＡを決定することにより細胞中のサイトスタチンII発現を査定する；およびサイトスタチンII遺伝子中の欠失などの遺伝子変異および異常のアッセイ、の方法を提供する。本発明の他の局面のある好ましい態様において、ヒトサイトスタチンIIに特異的にハイブリダイズするプローブを提供する。本発明のさらに好ましい態様において、サイトスタチンIIポリペプチドに対する抗体を提供する。この点で特に好ましい態様において、該抗体はヒトサイトスタチンIIに非常に選択的である。本発明の他の局面において、サイトスタチンII受容体に結合し、かつサイトスタチンII誘発応答を引き出す、サイトスタチンIIを模擬するようなサイトスタチンIIアゴニストを提供する。そのようなアゴニストにおいて、サイトスタチンII または他のモジュレーターまたは受容体と相互作用し、かつそれによってヒトサイトスタチンIIの効果が可能になる、本発明のさらに別の局面により、サイトスタチンII受容体に結合し、しかしサイトスタチンII誘発応答を引き出さず、その効果を阻害するようにヒトサイトスタチンIIと相互作用するものを提供する。該アゴニストおよびアンタゴニストは、例えばそのようなポリペプチドの作用を模擬する、増大するまたは阻害するために使用することができ、ついでそれらはサイトスタチン、特に、サイトスタチンIIによって影響された細胞の異常増殖と関連した障害の治療において使用することができる。本発明の他の目的、特徴、利点および局面は以下の記載から当業者には明らかとなるであろう。しかしながら、以下の記載および具体的な実施例は本発明の好ましい態様を示しているが、それは例示のためにのみであることを理解すべきである。開示された発明の精神および範囲内での多様な変更および改変は、以下の記載を読み、本開示の他の部分を読むことから当業者には容易に明らかとなるであろう。図面の簡単な記載以下の図面は本発明のある態様を述べている。それらは例示的でのみあって、本明細書に開示された本発明を制限するものではない。図１はヒトサイトスタチンIIのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示している。用語集以下の例示的説明は、本明細書で頻繁に使用される、特に実施例中で使用されるある語句の理解を容易にすることを提供する。該説明は便宜を提供するものであって、本発明に制限を加えるものではない。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素で、ＤＮＡを触媒開裂することを示す。本明細書中でいう多様な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に公知でかつ日常的であるように使用した。分析目的には、典型的に、バッファー溶液約２０μｌ中、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に消化する。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的には、正比例的により多量の容積中、一般にＤＮＡ５〜５０μｇを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当なバッファーおよび基質量は、以下に参照する標準実験マニュアルおよび市販の提供者によって明らかにされている。３７℃で１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、その条件は、供給者の指示およびその反応の項目に従って変えてもよい。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動し、分析または所望の断片の単離またはその両方を行う。遺伝子要素は、一般に、ポリペプチドまたは宿主細胞内のポリペプチドの発現に重要な転写または翻訳または他のプロセスを調節する領域またはポリペプチドまたは発現を調節する領域をコードする領域両方を含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝子要素は、エピソーム要素として複製されるベクター内に含まれることができる；すなわち、宿主細胞ゲノムから生理学的に独立した分子である。それらは真核細胞中のメトトレキセート選択によとてトランスフェクションされたＤＮＡの増幅の間に生じる微小染色体内に含まれる。遺伝的要素はまた、宿主細胞ゲノム内に含まれることができる；その天然の状態ではなく、むしろ単離、クローニングおよび精製したＤＮＡまたはベクターなどの形態の宿主細胞への導入などの操作であってよい。「単離された」とは、物質がその元の状態を変えられた；例えば、それが天然に存在するなら、その主との環境から除去されていることをいう。例えば、生存動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはアポリペプチドは「単離されて」いないが、天然の系における共存物質のいくつかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で使用するように「単離されて」いる。単離の一部として、またえは単離後の一部として、そのようなポリヌクレオチドは変異原発生のために、ついで例えば、宿主中の繁殖または発現のために他のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡｓなどと結合して、融合タンパク質を形成することができる。単離されたポリヌクレオチドは、単独またはベクターなどの他のポリヌクレオチドに結合され、培養物または全器官において、宿主中に導入されることができる。培養物または全器官における宿主細胞中に導入された、例えばＤＮＡｓは、本明細書で使用されるように、単離されている。というのは、それらは天然に存在する形態または環境において存在しないであろうからである。同様に、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば培地組織化などの組成物中で存在することができ、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドの細胞への導入用溶液、化学または酵素反応のための組成物または容易、例えばそれらは天然に存在しない組成物であり、そこには、本明細書で使用する語句の意味内での単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドが存在する。「ライゲーション」は、２またはそれ以上の、しばしば二本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチドの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう。ライゲーションの技術は当該技術においてはよく知られており、ライゲーションのプロトコールは標準的な実験マニュアルおよび参考文献、例えば、サンブルック（Sambro ok）ら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ）第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールド・スプリン・ハーバー（Cold Spring Har bor）、ニューヨーク（１９８９）および以下に引用するようにマニアチスら、第１４６ページに記載されている。「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に短いポリヌクレオチドである。この語は最も頻繁には一本鎖デオキシリボヌクレオチドをいうが、短い一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、短いＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび短い二本鎖ＤＮＡなどをいうこともできる。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、しばしば自動化オリゴヌクレオチド合成機にて実施されるように化学的な方法によって合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドはイン・ビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む多様な他の方法によって、および細胞または器官中のＤＮＡの発現によって製造されることができる。最初、化学的合成されたＤＮＡは、典型的には、５'リン酸なしで得られる。そのようなオリゴヌクレオチドの５'末端は組換えＤＮＡ分子を形成するために典型的に使用されるＤＮＡリガーゼを使用するライゲーション反応によるホスホジエステル結合形成のための基質ではない。そのようなオリゴヌクレオチドのライゲーションが望まれるところでは、リン酸は、キナーゼおよびＡＴＰを使用するものなど、標準技術によって付加されることができる。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３'末端は、遊離ヒドロキシル基を有して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼの存在下で他のオリゴヌクレオチドの５'リン酸とホスホジエステル結合を容易に形成する。よく知られているように、および反応は望まれれば、反応中の他のポリヌクレオチドの５'脱リン酸化によって妨害されることができる。プラスミドは、一般に本明細書で、前置きする小文字のｐおよび／または続けて大文字および／または数字にて、当業者によく知られた標準的名付けのしきたりにより示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法によりよく知られた日常的な応用により入手可能なプラスミドから構築できる。本発明により使用することができる多くのプラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、当業者に容易に利用できるものである。さらに、当業者は本発明通の使用により適当な他の任意の数のプラスミドを構築することができる。本発明の特性、構築物およびそのようなプラスミドの使用ならびに他のベクターは、本開示から当業者に容易に明らかであろう。ポリヌクレオチドは、一般に修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾したＲＮＡまたはＤＮＡであってよい、任意のポリヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本明細書で使用するポリヌクレオチドは数ある中で、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、一層典型的には、二本鎖領域または一本鎖および二本鎖領域の混合物をいう。さらに、本明細書で使用するＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含む三本鎖領域をいう。そのような領域の鎖は同一分子または異なる分子由来であってよい。該領域はすべての１またはそれ以上の分子を含むが、一層典型的には、該分子のいくつかの領域のみを含む。３本鎖領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用するように、ポリヌクレオチドなる語は上記のように１またはそれ以上の修飾した塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性のためまたは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で意図する「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常ではない、例えばイノシンなどの塩基、またはトリチル化した塩基などの修飾した塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、ちょうど２つの例を挙げるが、明細書で使用する語句としてのポリヌクレオチドである。非常に多様な修飾は、当業者に公知の多くの有用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡに加えられることが認識されるであろう。本明細書で使用されるポリヌクレオチドなる語は、化学的、酵素的または代謝的に修飾した形態のポリヌクレオチドならびに、特に単細胞および多細胞を含むウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特徴の化学形態を含む。発明の記載本発明は数ある中で、以下に最も詳細に記載されているように、新規のサイトスタチンIIポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、新規ヒトサイトスタチンIIのポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関し、ウシおよびマウス中の乳腺由来増殖インヒビター（“ＭＤＧＦ”）にアミノ酸配列ホモロジーによって関連しているものである。本発明は特に、サイトスタチンIIおよび図１に示されるアミノ酸配列に関する。ポリヌクレオチド本発明の１つの局面により、図１の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたは、本明細書中で以下に「寄託されたクローン」としていうＡＴＣＣ受託番号第号におけるヒトｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離したポリヌクオレオチドを提供する。本明細書中で提供した、例えば、図１に示されたポリヌクレオチド、ヒトサイトスタチンIIポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、出発物質としての上皮細胞のｍＲＮＡを使用するクローニングｃＤＮＡなどの標準的クローニングおよびスクリーニング方法から得た。本発明の例示として、図１に示されたポリヌクレオチドはヒト胎児脳組織由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて見いだされた。本発明のヒトサイトスタチンIIは、ＡＴＣＣ受託番号第号中のヒトサイトスタチンIIをコードするｃＤＮＡをシークエンシングした結果により示されるように、増殖調節因子のサイトスタチンファミリーの他のタンパク質に関係する。このｃＤＮＡ配列は、図１に示されているが、約１４.８kDaの推定分子量を有する約１３２のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを示す。タンパク質は、マウス乳腺由来増殖インヒビター（これも“ＭＤＧＩ” とも呼ばれる）の最も高いホモロジーの程度を示し、それは１３２アミノ酸配列に６４％の同一性および７９％の類似性を示す。本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コーディング鎖または非コーディング(アンチ−センス)鎖であり得る。該ポリヌクレオチドは、例えば天然に存在するアレル変異体である配列を有することができ、イン・ビトロ変異原発生の技術によって変えられる配列を有する天然に存在する配列を有することができる。図１に示されるポリヌクレオチドのコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列に同一であることができるポリヌクレオチドのコーディング配列に同一であってよい。それはまた、遺伝的コードによる縮重（degeneracy ９の結果として、図１のＤＮＡのポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡにポリペプチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレオチドであってよい。図１のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは成熟ポリペプチドのコーディング配列に限るわけではないが、それ自身を含む；プレータンパク質またはプロタンパク質またはプレプロタンパク質配列なおリーダーまたは分泌配列をコードするような成熟ポリペプチドまたは上記のさらなるコーディング配列を有するか有しないかでの成熟ポリペプチドのコーディング配列；転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性に役割を果たす転写されたまたは非転写配列などのイントロンおよび非コーディング５'および３'配列を含むさらなる非コーディング配列とともに、上記のさらなるコーディング配列を有するかまたは有さない成熟ポリペプチドのコーディング配列を含んでよい。前記により、本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語は本発明のポリペプチドをコードする、特に、図１に支援されたアミノ酸配列またはＡＴＣＣ受託番号第号中のｃＤＮＡによってコードされるヒトサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有するヒトサイトスタチンIIをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む。該語は、コーディングおよび／または非コーディング配列を含むこともできるさらなる領域と共にポリペプチドをコードする単一の持続的領域または断続的領域を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードするポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードする本明細書上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。該ポリヌクレオチドの変異体は天然に存在するアレル変異体などの天然に存在する変異体または天然に存在するとは知られていない変異体であってよい。そのような天然に存在しないポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチド、細胞または生物体に応用されるものを含む変異体発生技術によって製造されることができる。本発明は、図１に示されるのと同じ成熟ポリペプチド、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明は図１のポリペプチドまたは寄託されたクドーンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド断片、誘導体または類似体をコードするようなポリヌクレオチドの変異体を含む。この点において変異体は、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって上記のポリヌクレオチドと異なる変異体である。置換、欠失または付加は１またはそれ以上のヌクレオチドに関係することができる。変異体はコーディングまたは非コーディング領域の両者において変化されることができる。コーディング領域中の変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を製造する。本発明の変異体は、天然に存在する配列または天然には存在しない配列を有することができる。本明細書上記に示したように、該ポリヌクレオチドは図１中に示されるコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体であるコーディング配列を有する。当該技術において公知のように、アレル変異体は１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有することができるポリヌクレオチド配列の別形態である。この点において、本発明の特に好ましい態様は図１に示されたサイトスタチン IIのアミノ酸配列または寄託されたクローンまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡのサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである；変異体、類似体、誘導体およびその断片、その変異体の断片、類似体および誘導体である。この点において、さらに特に好ましい態様は、いくつかまたは少しの５〜１０、１〜５、１〜３、２、１のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されているか、またはアミノ酸残基が全く置換、欠失または付加されていないかの図１または寄託されているクローンのサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有している。この中で、特に好ましい態様は、静寂置換、付加および欠失であり、サイトスタチン IIの特性および活性を変化させないものである。またこの点において特に好ましい態様は、保存置換である。最も好ましいのは、図１または寄託されたクローンのアミノ酸配列（置換なし）である。本発明のさらに好ましい態様は、図１に示すアミノ酸配列を有するサイトスタチンIIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに８５％以上同一であるポリヌクレオチドかまたは、上記のように、変異体、密接なホモログ、誘導体および類似体である。かわりに、最も好ましいのは、寄託されたクローンのｃＤＮＡのサイトスタチンIIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチドである。この点において、同ポリヌクレオチドに９０％以上同一であるポリヌクレオチドは特に好ましく、ついでこれらのうちで特に好ましいポリヌクレオチドは、９５％またはそれ以上であるのが特に好ましい。さらに、９７％またはそれ以上の同一性は９５％またはそれ以上の同一性のものの間で非常に好ましく、および９８％またはそれ以上および９９％またはそれ以上の同一性を有するこれらのもののうちでは、９９％またはそれ以上が一層好ましい。また、この点において特に好ましい態様は、図１に示すサイトスタチンのアミノ酸配列または寄託されたクローンのサイトスタチンのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本明細書の任意の場所において示すように、該ポリヌクレオチドは持続的領域におけるポリペプチドまたは２またはそれ以上の複数のエクソンにおけるポリペプチドをコードすることができ、該ポリヌクレオチドはコーディング領域または領域に関連しないさらなる領域も含むことができる。この点において最も好ましいのは図１に示すポリヌクレオチドのサイトスタチンIIコードする部分に８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチドである。別法として、最も好ましいのは、寄託されたクローンのｃＤＮＡの一部をコードするサイトスタチンIIに８５％以上同一である領域を含むポリヌクレオチドである。それらのポリヌクレオチドのうちで、９０％以上同一であるのが特に好ましく、その中でも、９５％またはそれ以上の同一性をもつものが特に好ましい。さらに、９５％またはそれ以上の同一性を有するものの中では９７％またはそれ以上の同一性を有するものが、およびそれらの中でも９８％またはそれ以上および９９％またはそれ以上の同一性を有するものが非常に好ましく、９９％またはそれ以上が、これらのうちで一層好ましい。本発明はまた、成熟ポリペプチドをコードする配列が、別の配列に同じリーディングフレームにおいて融合されるポリヌクレオチドを含む。そのような配列は、シグナル配列を含み、それは小胞体に発生初期のタンパク質を輸送するのを促進し、該ポリペプチドの不活性な前駆体形態と関連したプロ配列、それは細胞内または細胞外のタンパク質のやりとり（trafficking）を促進するか、または細胞内または細胞外コンパートメントのタンパク質の、持続性を改良することができる。そのような配列はまた、製造および精製を容易にするために加えることができ、または本明細書の任意の場所において議論されるさらなる機能的なドメインに加えることができる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、成熟サイトスタチン、特にサイトスタチンIIに加えて、小胞体のルーメンにポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するシグナルペプチドなどの例えばリーダー配列をコードすることができる。該リーター配列は、宿主細胞によって、シグナルペプチドに一般的であるように、除去され、他の前駆体タンパク質または成熟ポリペプチドを産生する。リーダー配列をしばしば有する前駆体タンパク質はプレタンパク質と呼ばれる。該ポリヌクレオチドは、また、成熟タンパク質と別のアミノ酸またはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドの内部のアミノ酸（例えば、成熟形態は１つのポリペプチド以上を有する場合）であるポリペプチドもコードできる。そのような配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセシングにおける役割を演ずることができ、タンパク質のやりとりを容易にすることができ、タンパク質の半減期を延長または短縮することができ、または他のものの間でアッセイのためのタンパク質または製造物の操作を容易にすることができる。イン・サイチュでの場合に一般的なように、別のアミノ酸は細胞性酵素によって成熟タンパク質から離れさせられることができる。前駆体タンパク質は、１またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有するが、これはポリペプチドの不活性形態であることができる。プロ配列が除去されると、そのような不活性前駆体が一般的に活性化される。プロ配列全体のうちのいくつかは、活性化の前に除去される。一般に、そのような前駆体はプロタンパク質という。要するに、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質とリーダー配列（プレタンパク質という）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１またそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはプレプロタンパク質（プロタンパク質の前駆体であって、リーダー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有しており、一般に該ポリペプチドの活性および成熟形態を生み出すプロセシング工程お会い代に除去される）をコードすることができる。本発明のポリヌクレオチドは、上記で議論したとおり、数ある中でも、成熟または前駆体プレ−、プロ−、またはプレプロポリペプチドをコードすることができ、さらに別の機能性（fanctionaloities）を提供するものなどの、別のアミノ酸に融合される。従って、例えば、該ポリペプチドは融合したポリペプチドの精製を容易にするペプチドなどのマーカー配列に融合されてよい。本発明のこの局面のある好ましい態様において、該マーカー配列はヘキサヒスチジンペプチド（中でもｐＱＥ−９ベクターにより与えられるタグなど）の多くは、市販されており、入手可能である。ゲンツ（Gentz）ら、Proc．Natl．Acad．Sci.、ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジは融合タンパク質の便利な精製を提供する。典型的には、それはタンパク質の構造または機能に広範には影響を及ぼさず、ついで金属キレート樹脂、特にニッケルキレート樹脂に効果的に、選択的におよびしっかりと結合する。例えば、よく知られているようにヘキサヒスチジンタグはしばしばニッケル−ＮＴＡ樹脂に特によく結合し、それはよく知られており、容易に入手可能であり、ついで例えばキアゲン（Qiagen）などから市販されている。さらに、ヒスチジン金属相互作用は、非特異的に結合した金属を除去するのに有用な多様な条件に安定でありなお、その融合ポリペプチドが穏やかな非変性条件下で結合および除去することができる。ヘキサヒスチジンタグは、アミノ酸またはサイトスタチンポリペプチドのカルボキシル末端に最も便利に融合することができる。ヘキサヒスチジンのタグは特に最近の発現に有用である。ある他の好ましい態様における有用な他のマーカー配列は赤血球凝集素（“ＨＡ”）タグであり、特に、哺乳動物細胞が発現に使用される場合；例えばＣＯＳ −７細胞である。例えば、ＨＡタグはウィルソン（Wilson）ら、Cell ３７：７６７（１９８４）に記載されるように、インフルエンザ赤血球凝集素由来のエピトープに一致する。プローブ本発明はさらに、本明細書の上記のサイトスタチン配列、特に２つの配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点において好ましいのは、上記の配列に少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチドである。特に好ましい配列は、少なくとも７０％の同一性を有する配列である。この点において本発明は特に上記ポリペプチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクエオチドに特に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」なる語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。この点において、特に好ましい態様は、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはおよび図１のｃＤＮＡまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。寄託した物質ヒトサイトスタチンII ｃＤＮＡを含む寄託は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Amerian Type Culture Collection）（“ＡＴＣＣ”）で寄託された。該寄託は、ＡＴＣＣ−寄託−サイトスタチンIIの番号を付与され、本明細書中では「寄託されたクローン」という。寄託は特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際には、該寄託された物質中の配列が優先する。寄託された物質を製造し、使用しまたは販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾はここでは付与されない。ポリペプチド本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するヒトサイトスタチンIIポリペプチド、に関する。本発明はこれらのポリペプチドの断片、類似体および誘導体にも関する。図１のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、類似体には、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよい。ある好ましい態様において、組換ポリペプチドであってよい。図１のポリペプチドまたは寄託されたクローン中のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。この点において、本発明の特に好ましい態様は図１に示されたサイトスタチン IIのアミノ酸配列または寄託されたクローンまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡのサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである；変異体、類似体、誘導体およびその断片、その変異体の断片、類似体および誘導体である。この点において、さらに特に好ましい態様は、いくつかまたは少しの５〜１０、１〜５、１〜３、２、１のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されているか、またはアミノ酸残基が全く置換、欠失または付加されていない図１または寄託されているクローンのサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有している。この中で、特に好ましい態様は、静寂置換、付加および欠失であり、サイトスタチンIIの特性および活性を変化させないものである。またこの点において特に好ましい態様は、保存置換である。最も好ましいのは、図１または寄託されたクローンのアミノ酸配列（置換なし）である。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」とは、物質がその元の状態を変えられた；例えば、それが天然に存在するなら、その主との環境から除去されていることをいう。例えば、生存動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはアポリペプチドは「単離されて」いないが、天然の系における共存物質のいくつかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で使用するように「単離されて」いる。単離の一部として、またえは単離後の一部として、そのようなポリヌクレオチドは変異原発生のために、ついで例えば、宿主中の繁殖または発現のために他のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡｓなどと結合して、融合タンパク質を形成することができる。単離されたポリヌクレオチドは、単独またはベクターなどの他のポリヌクレオチドに結合され、培養物または全器官において、宿主中に導入されることができる。培養物または全器官における宿主細胞中に導入された、例えばＤＮＡｓは、本明細書で使用されるように、単離されている。というのは、それらは天然に存在する形態または環境において存在しないであろうからである。同様に、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば培地組織化などの組成物中で存在することができ、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドの細胞への導入用溶液、化学または酵素反応のための組成物または容易、例えばそれらは天然に存在しない組成物であり、そこには、本明細書で使用する語句の意味内での単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドが存在する。ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込むようにかつ本発明のポリペプチドを発現するように遺伝的に操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、感染、トランスダクション、またはトランスベクション（transvedction）および形質転換のよくしられた技術を用いて、宿主細胞中に導入されることができる。該ポリヌクレオチドは単独または他のポリヌクレオチドと共に導入されることあできる。そのような他のポリヌクレオチドは独立して導入されるか、同時導入されるかまたは本発明のポリヌクレオチドに結合して導入されることができる。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、他と共に宿主細胞にトランスフェクションされることができ、例えば哺乳動物細胞にコトランスフェクションおよび選択のための標準技術を用いて、選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチド分離することができる。この場合、該ポリヌクレオチドは一般的に、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれることができるであろう。別に、該ポリヌクレオチドは宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに結合されことができる。該ベクター構築物は、前記技術によって宿主細胞に導入されることができる。一般的に、プラスミドベクターは、例えばリン酸カルシウム沈澱などの沈澱物中の、または帯電した液体との錯体中のＤＮＡとして導入される。エレクトロポレーションもまた、宿主にポリヌクレオチドを導入するために使用されることができる。該ベクターがウイルスである場合、それはイン・ビトロにパッケージングされることができるか、またはパッケージング細胞に導入され、ついでパッケージングされたウイルスは細胞中にトランスデュースされることができる。本明細書のこの局面により、ポリヌクレオチドの製造およびポリヌクレオチドを細胞に導入されるに適当な広範囲の多様な技術は当業者によく知られており、日常的である。そのような技術は、本明細書中に引用されているサンブルックら中に十分に概説されており、それらはこれらの技術を詳細に説明している多くの実験マニュアルの例である。本発明の多くの局面により、該ベクターは、例えばプラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡベクターであってよい。そのようなベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとしてＤＮＡおよびＲＮＡを細胞中に導入うための公知の技術によって、導入することができる。該ベクターは、ファージおよびウイルスベクターの場合には、好ましくは、感染およびトランスダクションのよく知られた技術によってパッケージされたまたはキャプシド化されたウイルスとして細胞に導入される。ウイルスベクターは複製要素または複製欠陥（replication defective）であってよい。後者の場合には、ウイルス増殖は一般的に宿主細胞を補足することにおいてのみ起こるであろう。ある点において、好ましいベクターは本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現ベクターである。一般に、そのようなベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に結合された宿主中の発現に有効なシス−作用コントロール領域を含む。適当なトランス−作用因子のいずれかは、宿主によって提供され、補足ベクターによって提供されまたは宿主中に導入されたベクター自身によって提供される。この点におけるある好ましい態様において、該ベクターは特異的発現を提供する。そのような特異的発現は、誘発可能な発現であってよく、またはあるタイプの細胞でのみの発現または誘発可能でありかつ細胞特異的である発現であってよい。誘発可能なベクターのうち、特に好ましいものは、温度または添加栄養素などの操作が容易である環境因子による発現のために誘発されることができるベクターである。本発明のこの局面に適当な多様なベクターは、原核細胞宿主および真核細胞宿主において使用するための構築可能なおよび誘発可能な発現ベクターを含み、当業者によく知られて、日常的に使用される。操作された宿主細胞は、従来的な栄養培地中で培養されることができ、特に、活性化されているプロモーター、トランスフォーマントを選択することまたは遺伝子を増幅するために適当に修飾されることができる。一般的に発現のために選択された宿主細胞で以前に使用した、ｐＨなどの培養条件は、本発明のポリペプチドの発現に適当であり、当業者に明らかであるであろう。発現ベクターの多大な多様性は、本発明のポリペプチドを発現するのに使用することができる。そのようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、酵母染色体要素由来のベクター、バキュロウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのパポバウイルスなどのウイルス由来のベクターおよびそれらの組合せ由来のベクター、例えば、プラスミドとバクテリオファージ遺伝的要素由来のベクター、コスミドとファージミドなどのベクターが含まれ、すべては本発明のこの局面により発現のために使用されることができる。一般的に、宿主細胞中のポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを維持、増殖または発現させるのに適した任意のベクターは、この点において発現に使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクター中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモーター）に作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として挙げられるのは、ファージラムダＰ_Lプロモーター、大腸菌（E．coli）、la c、またはtrpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲｓ、よく知られたプロモーターのたった２、３を挙げるが、これらが含まれる。一般に、発現構築物は転写開始および終結部位を含み、転写された領域、翻訳のためのリボソーム結合部位を含むであろう。該構築物によって発現された成熟転写物のコーディング部位は、翻訳されるべきポリペプチドの開始部位でＡＵＧで翻訳を開始することおよび末端部位で適当に位置する終結コドンを含むであろう。さらに、該構築物は、発現を調節ならびに起こすコントロール領域を含むことができる。一般的に、共通して実施する多くの方法により、そのような領域は転写をコントロールすることによって、例えば、中でもリプレッサー結合部位およびエンハンサーなどは作動する。一般的に、増殖および発現のためのベクターは選択可能なマーカーを含むであろう。そのようなマーカーは増幅に適当であってよく、または該ベクターはこの目的のためさらなるマーカーを含むことができる。この点において、該発現ベクターは好ましくは１またはそれ以上の選択可能なマーカーを含み、形質転換した宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する。好ましいマーカーは、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性および大腸菌またはその他の細菌を培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimu rium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ドロソフィラ（Drosop hila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。該構築物は、本発明のそのような配列が挿入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクターなど）が含まれる。該配列は、順方向または逆方向にて挿入されることができる。ある好ましい態様において、構築物は、本発明の配列が順方向または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい側面では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に連結したプロモーターなどの、調節配列をさらに含む。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターは、市販されており、実施例のために例として挙げる。細菌用で好ましいベクターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲンから入手可能）；ｐＢｓ、ｐＤ１０、phagescript、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、 pbsks、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン(Stratagene)から入手可能）；ptrc９９a、ｐＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３ −３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(ファルマシア（Pharmacia）から入手可能)。真核生物用で好ましいベクターはpＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジーンより入手可能)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファルマシアより入手可能)。これらのベクターは単に、本発明のこの局面により、使用するため、当業者にとって利用可能な、多くの市販されており、よく知られているベクターの例として挙げている。該ベクターは例えば、本発明のこの局面において使用されることができる宿主中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適していると認識されるであろう。プロモーター領域は、クロラムアセチルトランスフェラーゼ（“ｃａｔ”）転写単位、候補プロモーター断片、すなわちプロモーターを含む断片を導入する制限部位の下流にあるプロモーター領域を欠如している任意の所望の遺伝子から選択することができる。よく知られているように、ＣＡＴ活性の産生を起こすｃａｔ遺伝子の上流の制限部位で、プロモーター含有断片のベクターへの導入、それは標準ＣＡＴアッセイによって検出されることができる。この目的に適しているベクターはよく知られており、容易に利用可能である。２つのそのようなベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。従って、本発明のポリヌオチドの発現プロモーターには、よく知られていて容易に入手可能なプロモーターだけでなく、前記技術によってリポーター遺伝子を用いて得ることができるプロモーターも含まれる。本発明によりポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適している公知の細菌プロモーターには、大腸菌lacＩ、lacＺ、およびプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、gptプロモーター、ラムダＰ_R、Ｐ_Lプロモーターおよびtrpプロモーターが含まれる。この点において適当な真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate ear ly)プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーターおよびマウスメタロチオネイン−Ｉなどのメタロチオネインプロモーターが含まれる。宿主内の発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選択は、よく知られた手続であり、かつ発現ベクター構築のための必要技術、宿主へのベクターの導入および宿主中での発現は、当業者にとって日常的である。本発明はまた、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン液体媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染などの方法により行うことができる。そのような方法は例えば、デイビス（Davis,L.）、ディブナー（Dibner,M.）、バッティ（Battey,L.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＢＡＳＩＣＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ）（１９８６）などの多くの標準的実験マニュアルにおいて記載されている。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、(１９８９)により記載されている。通例、組換え発現ベクターには、複製起点並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターおよび該ベクターにさらした後、細胞を含むベクターの単離を可能にする選択可能なマーカーが含まれるであろう。適当なプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖系酵素、α−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードする遺伝子から得ることができる。選択可能なマーカーには例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびサッカロミセス・セレビシエ（S．cerevisiae）ｔｒｐ１遺伝子が含まれる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドのヘテロロガス構造配列をコードし、標準技術を用いてベクターに挿入され、発現のためにプロモーターに作動可能に結合する。該ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結合部位のほぼ５'側に位置するように配置される。該リボソーム結合部位は発現されるべきポリペプチドの翻訳を開始させるＡＵＧの５'側である。一般的に、開始コドン、通例ＡＵＧで開始するオープンリーディングフレームは他になく、リボソーム結合部位と開始コドンＡＵＧの間に存在する。また、一般的に、該ポリペプチドの末端で翻訳停止コドンが存在し、ポリアデニル化シグナルおよび転写された領域の３'末端にほぼ配置された転写終結シグナルが存在するであろう。翻訳されたタンパク質の小胞体のルーメンへの分泌、細胞周辺腔への分泌または細胞外環境への分泌のため、適当な分泌シグナルは、発現したポリペプチドに組み込まれることができる。該シグナルは該ポリペプチドに内在性であるかまたはヘテロロガスシグナルであってもよい。該ポリペプチドは融合タンパク質などの修飾した形態に発現されることができ、ついで分泌シグナルならびにさらに別のヘテロロガス機能的シグナルを含むことができる。従って例えば、別のアミノ酸、特に帯電したアミノ酸は、精製または操作及び保存の間に宿主細胞中の安定性および持続性を改良するための該ポリペプチドのＮ−末端が付加されることができる。また、領域も精製を簡易化するためにペプチドに付加されることができる。そのような領域は該ポリペプチドの採取的な調製の前に取り除くことができる。特に分泌または排泄を起こすため、安定性を改善するためおよび精製を簡易化するために該ポリペプチドにペプチド残基を付加することは当該技術分野においてよく知られかつ日常的な技術である。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、維持、発現に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウムが含まれる。シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属の様々な種はこの点において、適当な宿主である。さらに他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクターpＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。そのような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Prome ga Biotec）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Gluzman）、Cell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、HeLaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’に隣接する非転写配列もまた含むであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。サイトスタチンIIポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれるよく知られた方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用することができる。タンパク質の再折畳みのためのよく知られた技術は、単離または精製の間に該ポリペプチドが変性される場合に、活性化形態を再生するために使用されることができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって）組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。さらに、本発明のポリペプチドにはまた、ある場合には宿主媒介プロセスの結果として、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。さらに例示的な応用サイトスタチンIIポリヌクレオチドおよびポリペプチドは本発明により、多様な応用、特にサイトスタチンIIの化学的および生物学的特性を利用することができるものに使用されることができる。特に、これらは細胞および生物体を特徴付けおよび細胞及び生物の増殖における応用である。さらなる応用は細胞、組織おんよび生物体の診断または治療または障害に関する。従って、とりわけ、サイトスタチンIIの増殖阻害および分化刺激活性はイン・ビトロでの腫瘍細胞などの腫瘍細胞の増殖を抑制することおよび分化を刺激することに、生物学的目的に関して有用である。同じ活性は、腫瘍細胞などの生物体中の異常な細胞増殖の処理に応用することができる。これらの点において、サイトスタチンIIポリペプチドは好ましく、特に、図１に示すアミノ酸配列または寄託されたクローンのｃＤＮＡのサイトスタチンIIのアミノ酸配列を有するサイトスタチンIIが好ましい。同様に、サイトスタチンIIの、静脈（venus）内皮細胞などの内皮細胞の増殖を抑制する能力は、培養中またはイン・サイチュにおける血管形成を妨害、減速または改変に使用することができる。静脈に関連して、転移の部位ならびに元々の部位での腫瘍細胞は新規な血管が増殖するのを引き付けなければならないので、サイトスタチンIIの血管内皮細胞の抑制は、転移能を低減するかまたは転移性疾患の進行を減速させるのに有用であることができる。さらに、乳腺上皮細胞増殖および調整乳腺分化を抑制するサイトスタチンIIはまた、肺胞末端芽の形成を促進し、分化した肺小葉の助力の発展、乳タンパク質の製造の刺激および脂肪小滴の蓄積に使用されることができる。そのような授乳刺激活性は商用乳製造哺乳類において乳の製造を助けることができ、かつ例えばヒト母親による乳製造を助けるのに有用であり得る。関連した応用において、胸の大きさに影響を及ぼすサイトスタチンIIの調節活性は出産後の、拡大した胸を通常の大きさに戻すのを助けるのに有用である。例えばアンチセンスホスホロチオエートまたは抗体によるサイトスタチンII活性の抑制は、肺胞末端芽の出現を抑圧し、ついでβ−カゼインレベルを低下させるための乳腺上皮細胞に内在するサイトスタチンII活性の選択的な抑制に有用であってよい。さらに以下に示すように、サイトスタチンIIポリヌクレオチドおよび本発明のポリペプチドのこれらおよび他の活性および特性は、イン・ビトロでの細胞増殖、乳および乳製品の商業上の製造に関するもの、および腫瘍学、心臓学、免疫学、内分泌学、血液学、代謝障害、骨格筋問題および婦人科学および産科学などの分野に関連する診断および治療に関するものを含む多大な分野において、多様な応用および使用を有する。完全長のサイトスタチンII ｃＤＮＡは、全体または部分的に、完全長ｃＤＮＡの単離およびヒトサイトスタチンII遺伝子に高い配列類似性を有するまたは類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡｓの単離のためのｃＤＮＡライブラリーに関するハイブリダイゼーションプローブとして使用されてよい。そのようなプローブは、一般に少なくとも２０塩基を有する。しかしながら、好ましくは該プローブは少なくとも３０塩基を含み５０塩基は越えない。そのようなプローブは、完全長転写物に対応するさらに別のｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンまたは調節およびプロモーター領域、エクソンおよびイントロンを含む完全なヒトサイトスタチンII遺伝子を含むクローンを同定するのに使用してよい。例えば、サイトスタチンII遺伝子のコーディング領域はオリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニングすることにより遺伝子のコーディング領域を単離することができる。本発明の遺伝子の配列に相補的である配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを、プローブがライブラリーのどの成員にハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、治療の方法およびヒトの疾患の診断のための実験試薬および物質として使用してよい。サイトスタチンII−結合分子本発明はまた受容体分子などのサイトスタチンIIに結合する分子の同定方法をも提供する。受容体タンパク質などのサイトスタチンIIに結合するタンパク質をコードする遺伝子は例えば、リガンドパンニング（panning）およびＦＡＣＳ分離などの当業者によく知られた多くの方法によって同定されることができる。そのような方法は例えば、コリガン（Coligan）ら、カレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー（Current Protocols in Immunoligy）１（２）：第５章（１９９１）。例えば、発現クローニングはこの目的に使用されることができる。この目的のため、ポリアデニル化したＲＮＡがサイトスタチンII応答性の細胞から調製され、ｃＤＮＡライブラリーがこのＲＮＡから作られ、該ライブラリーはプールに分けられ、ついで該プールはサイトスタチンIIに応答性でない細胞に個々にトランスフェクションされる。ついで、トランスフェクションされた細胞は標識されたサイトスタチンIIにさらされる。（サイトスタチンIIは放射性ヨウ素の標準方法まてたは部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の含有などの多様なよく知られた技術によって標識されることができる）。さらされた後、該細胞を固定し、サイトスタチンの結合を決定する。これらの手続は、便利なことにガラススライド上で行われる。プールはサイトスタチンII−結合細胞を産生するｃＤＮＡについて同定される。サブプールはこれらの陽性から調製され、宿主細胞にトランスフェクションされ、ついで上記のようにスクリーニングされる。反復したサブプールおよび再度のスクリーニングを用いて受容体などの推定結合分子をコードする１またはそれ以上の単一クローンを単離することができる。別法として、標識されたリガンドは膜または膜抽出物などの細胞抽出物に光親和的に結合されることができ、受容体分子などの結合する分子を発現する細胞から調製される。架橋した物質はポリアクリルアミドゲル電気泳動（“ＰＡＧＥ” ）により分解され、Ｘ−線フィルムにさらされる。リガンド受容体を含む標識した複合体は切り出され、ペプチド断片に分解され、タンパク質微小シークエンシングにかけられた。マイクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列は、推定受容体をコードする遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため単独または変性したオリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用されることができる。本発明のポリペプチドは、サイトスタチンIIの細胞または無細胞系調製において受容体などのサイトスタチンII結合分子の結合能力を評価するのに使用することができる。アゴニストおよびアンタゴニストおよびそれらのアッセイ本発明はまた、受容体などのサイトスタチンII結合分子との相互作用などの細胞上のサイトスタチンIIの作用を増強または阻害する物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。アゴニストは天然のサイトスタチンIIの生物学的機能を増加させる化合物であり、アンタゴニストはそのような機能を低減または排除する。例えば、膜またはその調製物など、膜調製物などの細胞コンパートメントは、サイトスタチンIIによって調節されたシグナルまたは調節経路の分子などのサイトスタチンIIを結合する分子を発現する細胞から調製される。該調製物はサイトスタチンIIアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の不在下または存在下で標識されたサイトスタチンIIとインキュベートされる。該候補分子の該結合分子への結合能力は標識されたリガンドの低減された結合において反映される。無報酬に結合する、すなわちサイトスタチンII結合分子を結合することへのサイトスタチンIIの効果を誘発することなしに結合する分子は、有能なアンタゴニストである可能性が高い。しっかりと結合し、効果を引き出す分子は同じかまたは密接のものである。可能性のあるアゴニストおよびアンタゴニストのサイトスタチンII−様効果は、例えば、候補分子と細胞または適当な細胞調製物との相互作用ののちの第２メッセンジャー系の活性を決定することにより、およびサイトスタチンIIと同様の効果を引き出すサイトスタチンIIまたは分子の効果とを比較することによって、測定されることができる。この点において有用である第２メッセンジャー系には、制限するものではないが、ＡＭＰグアニレートシクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解第２メッセンジャー系を含む。サイトスタチンIIアンタゴニストのアッセイの他の例には、サイトスタチンII と可能性のあるアンタゴニストを競合的阻害アッセイに適当な条件の下で、膜結合性サイトスタチンII受容体または組換えサイトスタチンII受容体を結合させる競合アッセイである。サイトスタチンIIは、放射能などによって標識されることができ、受容体に結合された複数のサイトスタチンIIは可能性のあるアンタゴニストの有効性を正確に評価するために決定されることができる。可能性のあるアンタゴニストは本発明のポリペプチドに結合する小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を含み、それによってその活性を阻害または消滅させる。可能性のあるアンタゴニストはまた、ペプチド、密接に関連した他ナウ質または受容体などの結合分子上の同じ部位にサイトスタチン誘発活性を含まずに結合する、サイトスタチンIIが結合から排除されることによって、サイトスタチンIIの作用を妨害するポリペプチドである。別の可能性のあるアンタゴニストにはまた、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。アンチセンス技術は、例えばオカノ（Okano）、J.Neurochem .、５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション(Oligodeoxynuc leo tides asAntisense Inhibitors of Gene Expression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Press）、ボカ・レイトン（Boca Raton）、フロリダ（１９８８）)中に議論されている。三重らせん形成については、例えば、リー（Lee）ら、Nucl.Acids Res. 、６：３０７３（１９７９）；クーニー（Cooney）ら、Science、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Dervan）ら、Science、２５１：１３６０（１９９１）において議論される。該方法はポリヌクレオチドを相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのポリヌクレオチド結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し、そのことによって、転写およびサイトスタチンIIの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子サイトスタチンIIポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをイン・ビボにおいて発現させて、サイトスタチンII の産生を阻害することができる。該アンタゴニストは製薬学的に許容し得る担体（例えば、後に記載する）を有する組成物中に使用されることができる。該アゴニストは、例えば心臓筋細胞肥厚または白血病を治療するために使用することができる。組成物本発明のポリペプチドは、適当な製薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および製薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。キット本発明はさらに、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器には、製薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。投与本発明のポリペプチドは、治療化合物などの他の化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、局所、肛門内、膣内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、特定の適応症を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、該組成物は、１日当たり少なくとも約１０μg／kg(体重) の量で投与され、たいていの場合、約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。好ましくはたいていの場合、投与量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg ／kg(体重)である。徴候、重篤度、投与経路および複雑な症状等を考慮に入れて、様式または徴候の各治療のための標準的方法によって、最適投与量は決定されると認識されるであろう。遺伝子療法サイトスタチンIIポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストはまた、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる、そのようなポリペプチドのイン・ビボにおける発現により、本発明に従って使用してよい。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ（ex vivo）においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使用によって、細胞を当該技術分野で公知の方法により操作することができる。そのような方法は当該技術分野でよく知られており、および本発明でのそれらの使用は、本明細書の教示により明らかであるだろう。同様に、細胞を当該技術分野において公知の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは上記で議論されたように、複製欠損レトロウイルスベクター中での発現のために操作されることができる。ついで、該レトロウイルス発現構築物は、単離され、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターでトランスデュースされるパッキング細胞に導入され、結果、パッキング細胞が、関心のある遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞をイン・ビボでの細胞を操作するため、およびイン・ビボで該ポリペプチドの発現のために患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。前記レトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。そのようなベクターは該ポリペプチドを発現するための１つまたはそれ以上のプロモーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターには、以下に限られるものではないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Miller）ら、Biotechniques、Vol．７、No．９、９８０−９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター（例えば、以下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏｌ III およびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物細胞のプロモーターなどの細胞プロモーターが含まれる）が含まれる。使用されてよい他のウイルスプロモーターは、以下に限るものではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は、本明細書中の教示から当業者には明らかであろう。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよい適切なプロモーターには、以下に限られるものではないが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major late promoter）などのアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターであってよい。レトロウイルスプラスミドベクターはプロデューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株を形質導入するのに使用してよい。トランスフェクションしてよいパッケージング細胞の例には、以下に限るものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７ −Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれる（ミラー、Human Gene Therapy、Vol．１、５−１４頁（１９９０）に記載）。該ベクターは当該技術分野において公知の方法によりパッケージング細胞を形質導入する。このような方法には、以下に限るものではないが、エレクトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ₄沈降が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れられてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与されてよい。該プロデューサー細胞株は該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクター粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トランスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。トランスデュースされてよい真核生物細胞には、以下に限られるものではないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれる。ポリヌクレオチドアッセイ本発明はまた、例えば診断用としてなど相補的なポリヌクレオチドを検出するためのサイトスタチンIIポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関するサイトスタチンIIの変異形態の検出により、サイトスタチンIIのの過少発現、過剰発現または変化した発現による疾患（例えば乳癌）の診断または疾患の罹患し易さの診断が可能であろう。本発明の遺伝子における変異を有する個体は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診断のための核酸は、以下に限られるものではないが、血液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細胞から得られる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよいし、分析前にＰＣＲ（サイキ（Saiki）ら、Natur e、３２４：１６３−１６６（１９８６））により酵素的に増幅してもよい。同様の目的のため、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた使用してよい。一例として、サイトスタチンIIをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、サイトスタチン II発現および変異を同定し分析するのに使用することができる。例えば、欠失および挿入は、通常の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさにおける変化によって検出することができる。点突然変異は、増幅したＤＮＡを放射性標識したＲＮＡまたは、別法として放射性標識したアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼＡ消化によるか、または融点における差異によってミスマッチの二本鎖から区別することができる。参照遺伝子と変異を有する遺伝子間の配列の相違は、直接ＤＮＡシークエンシング方法によって明らかにされてよい。加えて、クローニングされたＤＮＡセグメントは特定のＤＮＡセグメントを検出するプローブとして使用してよい。この方法の感度はＰＣＲと組み合わされると非常に増強される。例えば、シークエンシングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾したＰＣＲによって生成した一本鎖鋳型分子とともに使用される。該配列の決定は放射性標識したヌクレオチドによる従来手法または蛍光標識による自動シークエンシング手法によって行われる。ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮＡ断片の電気泳動の移動度における変化の検出によって行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分離（high resolution）ゲル電気泳動によって可視化することができる。異なる配列のＤＮＡ断片は、別々のＤＮＡ断片が、その特異的な融点または部分的な融点に従って別個の位置でゲルにて減速される変性ホルムアミド濃度勾配ゲル上で区別してよい（例えば、マイヤーズ（ Myers）ら、Science、２３０：１２４２（１９８５））。特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコットン（Cotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護アッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングまたは制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（“ＲＦＬＰ”））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットなどの方法により行われてよい。一層従来のゲル電気泳動およびＤＮＡシークエンシングに加えて、変異はまたイン・サイチュ分析により検出することができる。ポリペプチドアッセイ本発明はまた、正常および異常なレベルの決定を含む、細胞および組織中のサイトスタチンIIタンパク質のレベルを検出するための定量および診断アッセイなどの診断アッセイにも関する。従って、例えば、正常コントロール組織サンプルに比較してサイトスタチンIIの過剰発現を検出するための本発明による診断アッセイは、例えば、心筋梗塞の存在を検出するために使用されることができる。タンパク質、例えば、宿主細胞由来のサンプル中の本発明のサイトスタチンIIタンパク質のレベルを決定するために使用されることができるアッセイ技術は、当業者にはよく知られている。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。これらの中ではＥＬＩＳＡが好ましいことが多い。ＥＬＩＳＡアッセイは最初に、サイトスタチンIIに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。加えて、リポーター抗体が該モノクローナル抗体に対して調製される。リポーター抗体には放射線、蛍光またはこの例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素など検出可能な試薬が付着される。ＥＬＩＳＡアッセイを実施するため、サンプルを宿主から除去し、該サンプル中のタンパク質を結合する固相支持体（例えばポリスチレンディッシュ）上でインキュベートする。ついで、該ディッシュ上の遊離タンパク質結合部位をウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質でインキュベートすることによりカバーする。ついで、該モノクローナル抗体を該ディッシュでインキュベートすると、その間に該モノクローナル抗体は、該ポリスチレンディッシュに付着したサイトスタチンIIタンパク質に付着する。すべての結合していないモノクローナル抗体をバッファーで洗い落とす。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を今度はディッシュに置くと、サイトスタチンIIに結合したモノクローナル抗体に該リポーター抗体が結合することになる。ついで、付着していないリポーター抗体を洗い落とす。ペルオキシダーゼ活性（発色性（colorimetric）基質を含む）のための試薬は、ディッシュに添加する。免疫化したペルオキシダーゼ、第１および第２抗体を通してサイトスタチンIIに結合したものは、着色した反応産物を産生する。所定の時間における発色量は、標準カーブに比較して、患者のサンプルの所定量中に存在するサイトスタチンIIタンパク質の量でなる。サイトスタチンIIに特異的な抗体を固相支持体に付着させ、標識したサイトスタチンIIおよび宿主から得たサンプルを該固相支持体に通し、ついで該固相支持体に付着した標識の検出量を該サンプルにおけるサイトスタチンIIの量に相関させることができる、競合アッセイを使用してよい。染色体アッセイ本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５−２５bp ）を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝子の３'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、イン・サイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、少なくとも５００または６００塩基を有するｃＤＮＡで利用することができる；しかしながら、２０００ｂｐを越える大きなクローンは、単一の検出のために十分強いシグナルで独特の染色体の位置に結合する可能性が高い。例えば、２,０００ｂｐは十分であり、４,０００ｂｐは一層よく、４,０００より大きいものは、該時間の合理的なパーセントのよい結果を得るのにはおそらく必要ではない。この技術の概説には、ベルマ（Verma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（ＨＵＭＡＮＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ）：ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニクス（ＡＭＡＮＵＡＬＯＦＢＡＳＩＣＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）、パガモン・プレス（Pergamon Press）、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、マックジック（V.McKusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン（ＭＥＮＤＥＬＩＡＮＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥＩＮＭＡＮ）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Johns Ho pkins University Welch Medical Library）を介してオンラインで利用できる) に見い出される。ついで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの解析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。免疫学的な応用ポリペプチド、それらの断片もしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公知の様々な方法を、そのような抗体および断片の製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。ついで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法（コーラー（Kohler，G.）およびミルシュタイン（Milstein，C.）、１９７５、Nature 、２５６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(コズボール（Kozbor）ら、１９８３、Immunology Today ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Cole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＡＮＤＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ）、アラン・アール・リス、インク（Alan R．Liss,Inc.）、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対するヒト化抗体を発現するのに使用してよい。実施例本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する。実施例は、特定の態様のために参照のために本発明を例示するためにのみ提供される。本発明のある特定の面を例示するのであって、これらの例証は、開示された本発明の制限を意味したり、範囲の限定を行うものではない。本明細書で使用するある語句は、前記の用語集で説明している。以下の実施例において示される部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。特に断らない限り、以下の実施例における断片の大きさの分離は、例えば、ゲッデル（Goeddel）ら、Nucleic Acids Res．８：４０５７（１９８０）によって記載されるように、８％ゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動(“ＰＡＧＥ”) の標準的な技術を用いて行った。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(“リガーゼ”)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。すべての実施例は、特に断って詳細に記載しない限り、当業者によく知られており、かつ日常的である標準的非技術を用いて行った。実施例１細菌を用いたヒトサイトスタチンIIの発現および精製寄託されたポリヌクレオチド中のヒトサイトスタチンIIをコードするＤＮＡ配列を、ヒトサイトスタチンIIタンパク質のカルボキシル末端配列および該遺伝子の３'ベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドをそれぞれ５'および３'配列に加えた。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：を有し、該配列は下線を付したBamHＩ制限酵素部位、続いて、第２コドン；すなわち、推定Ｎ−末端メチオニンのＡＵＧの次のコドンから開始する、１４ヌクレオチドのヒトサイトスタチンコーディング配列を含む。３'プライマーは、配列：を有し、該配列は下線を付したHindIII制限酵素部位を含み、続いて停止コドンを含むサイトスタチンIIの最終の６コドンに相補的な１８ヌクレオチドが続く。該制限部位は、これらの実施例における細菌発現のために使用された、細菌発現ベクターｐＱＥ−７０(キアゲン、インク．９２５９イートン・アベニュー（E ton Avenue）、チャッツワース（Chatsworth）、カリフォルニア、９１３１１) 上の制限酵素部位に都合よい。ｐＱＥ−７０は、抗生物質耐性(Amp^r)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ誘発プロモーター、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６ −Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。 pＱＥ−７０をBamHＩおよびHindIIIで消化し、増幅されたヒトサイトスタチンＤＮＡをBamHＩ／HindIII消化したベクターＤＮＡにライゲーションした。BamH Ｉ／HindIII制限化ベクターへの挿入は、IPTG-誘発可能なプロモーターの下流領域をコードするヒトサイトスタチンIIを配置し、ついで、翻訳のため開始ＡＵＧとインフレームで行った。ライゲーション混合物を使用して、コンピテント大腸菌細胞に、標準技術を用いて形質転換した。そのような方法はサンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）に記載されている。大腸菌株Ｍ１５／rep４は、プラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含み、ｌａｃリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性を与え（“Kan^r”）、これはごん明細よに記載の例示的実施例を実施するのに使用した。この株はキアゲンから市販されていて入手可能であるサイトスタチンIIを発現するのに適した多くのもののうちの１つにすぎない。形質転換体を、アンピシリンの存在下、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定した。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離して、クローニングされたＤＮＡの同定は、制限分析によって確認した。所望の構築物を含むコロニーを、Amp（１００ug／ml）とKan（２５ug／ml）の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞が、０.４〜０.６の光学密度６００(O.D.⁶⁰⁰)まで増殖した。ついで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（“ＩＰＴＧ”）を、最終濃度が１ｍＭとなるまで加えた。引き続き、細胞をさらに３〜４時間増殖させた。ついで、細胞を標準的な方法により、遠心分離および破壊によって収集した。日常的な回収技術を用いて破壊された細胞から、含有体（inclusion bodies ）を精製し、ついでタンパク質を、８Ｍ尿素中の含有体から可溶化した。その８Ｍ尿素を、２×リン酸緩衝食塩水（“ＰＢＳ”）に変え、ついでタンパク質を標準ＰＤ−１０溶液中で再折り畳んだ。そのタンパク質をさらに、サイズ排除クロマトグラフィーによって、ついで、エンドトキシンを除去するために、さらなるクロマトグラフィーの工程によって精製した。滅菌濾過したタンパク質調製物は、９５μｇ／ｍＬの濃度の２×ＰＢＳ中に保存された。標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動方法による調製物の分析は、該調製物が期待された分子量、すなわち約１４ｋＤａを有する約８０％のモノマーサイトスタチンIIを含むことを明らかにした。実施例２寄託されたクローン中の完全長ヒトサイトスタチンIIタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、該遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：５'プライマーは、配列：を有し、該配列は下線を付したBamHＩ制限酵素部位、続いて、２−５コドンおよび図１のサイトスタチンIIの配列のコドン６の２塩基を含む。以下に記載のとおり、発現ベクターに挿入されたヒトサイトスタチンIIをコードする増幅された断片の５'末端は、特に、コザック（Kozak，M.）、J．Mol．Biol.、１９６：９４７−９５０（１９８７）により記載されるように、真核細胞中の翻訳開始の有効なシグナルを提供する。３'プライマーは、配列：を有し、該配列は下線を付したAsp７１８制限部位を含み、続いて停止コドンに相補的であるヌクレオチドおよび図１のサイトスタチンIIｃＤＮＡの最終の５アミノ酸のコドンが続く。増幅された断片は１％アガロースゲルから市販されており入手可能なキット（「ジーン・クリーン（“Geneclean”、バイオ(ＢＩＯ)１０１インク(Inc.)、ラ・ホラ（La Jolla）、カリフォルニア）を用いて単離する。ついで、該断片をBa mHＩおよびAsp７１８で消化し、再度１％アガロースゲル上で精製する。この断片を本明細書ではＦ２と称する。該ベクターｐＡ２−ＧＰを、サマーズ（Summers）ら、ア・マニュアル・オブ・メソッド・フォー・バキュロウイルス・ベクターズ・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロシーデュアーズ（ＡＭＡＮＵＡＬＯＦＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＶＥＣＴＯＲＳＡＮＤＩＮＳＥＣＴＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ）、テキサス・アグリカルチュアル・エクスパーリメンタル・ステーション(TexasAgriculturalExperimentalStation Blletin）第１５５５号（１９８７）に記載されるように標準方法を用いてバキュロウイルス発現系においてサイトスタチンIIタンパク質を発現するのに使用する。この発現ベクターは、便利な制限部位が続く、Autgrapha californica核ポリヘドロシスウイルス(ＡｃＭＮＰＶ)の強ポリヘドリンプロモーターを含む。ＡｃＭＮＰＶgp６７のシグナルペプチドは、Ｎ−末端メチオニンを含むが、BamHＩ部位の上流にちょうど位置する。シミアンウイルス４０（“ＳＶ４０”）は、有効なポリアデニル化に使用される。組換えウイルスの容易な選択のために大腸菌からのβ−ガラクトシド遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同じ方向で挿入し、後にポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。そのポリヘドリン配列はクローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを産生するための野生型ウイルスＤＮＡを有する細胞媒介類似組換え体のウイルス配列によって両側をフランキングする。他の多くのバキュロウイルスがｐＡ２−ＧＰの代わりに、例えばｐＡｃ３７３、ｐＬＶ９４１およびｐＡｃＩＭ１などを使用することができる。そのようなベクターは、とりわけラッコウ（Luckow）ら、Virology １７０：３１−３９に記載されている。そのプラスミドを制限酵素BamHＩおよびAsp７１８で消化し、ついで、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該技術分野において日常的な方法を用いて脱リン酸化する。ついでＤＮＡを１％アガロースゲルから市販されており入手可能なキット（「ジーン・クリーン、バイオ１０１インク、ラ・ホラ、カリフォルニア）を用いて単離する。この断片を本明細書ではＶ２と称する。断片Ｆ２および脱リン酸化したプラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲーションする。大腸菌ＨＢ１０１細胞をライゲーションミックスを用いて形質転換して、培養皿に撒く。細菌をBamHＩおよびAsp７１８を用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化してヒトサイトスタチンIIを有するプラスミドを含むことを確認し、ついでゲル電気泳動によって消化産物を分析する。クローニングされた断片の配列をＤＮＡシークエンシングにより確認する。このプラスミドを本明細ではp BacCytostatin IIと称する。リポフェクション法(フェロナー（Feloner）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミドpBacCstosta tine II ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「BaculoGold^TMバキュロウイルスＤＮＡ」、ファーミンゲン（Pharmingen）、サン・ディエゴ（San Diego）、カリフォルニア)１.０μgと共に同時トランスフェクションする。 BaculoGold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpBacＳＣＧＦ５μg を、無血清グレイス(Grace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・インク（Life Tec hnologies Inc.）、ゲイザーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド)５０μl を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン(Lipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。ついで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したSf９昆虫細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。ついで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。４日後、上清を集めて、サマーズおよびスミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッセイを行う。変法として、「Blue Gal」(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができる)。４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチューブ内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種したSf９細胞を感染させるのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存する。適切に挿入されたサイトスタチンIIを、制限マッピングおよびシークエンシングを含むＤＮＡ分析によって同定する。これを本明細書ではＶ−サイトスタチンと称する。 Sf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−サイトスタチンIIを感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)に替える。４２時間後、５μCiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μCiの³⁵ Ｓシステイン５μCi(アマシャム(Amersham))を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。実施例３ＣＯＳ細胞におけるヒトサイトスタチンIIの発現発現プラスミド、Cytostatin II ＨＡは以下を含むベクターpcＤＮＡＩ／Amp （インビトロゲン（Invitrogen）由来である：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレーション部位が続くＣＭＶプロモーター。サイトスタチンII前駆体全体をコードするＤＮＡ断片および３'端にインフレームで融合するＨＡタグをそのベクターのポリリンカー領域にクローニングし、それゆえ、その組換えタンパク質発現をＣＭＶプロモーターの下で行う。そのＨＡタグは、以前に記載したように（ウィルソン（Wilson）ら、Cell ３７：７６７（１９８４））、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに一致する。ＨＡタグの我々の標的タンパク質への注入によりＨＡエピトープを認識する抗体を有する組換えタンパク質の検出を容易にする。そのプラスミドの構築策は以下に記載するとおりである：寄託されたクローンのサイトスタチンIIをコードするＤＮＡ配列を２つのプライマーを用いて元々のＥＳＴクローニングに関してＰＣＲによって構築する。５ 'プライマーは、であり、下線を付したBamHＩ部位を生み、続いて開始コドンから出発するサイトスタチンIIコーディング配列の８ヌクレオチドを含む。３'配列は、であり、下線を付したXbaＩ部位、翻訳終結コドン、ＨＡタグおよびサイトスタチンIIコーディング配列の最終の１２ヌクレオチド（終止コドンを含まない）を含む。それゆえ、そのＰＣＲ産物はHindIII部位およびインフレームで融合したＨＡタグが続くサイトスタチンIIコーディング配列、ＨＡタグに隣接する翻訳終結コドンおよびXbaＩ部位を含む。そのＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片およびベクターpcＤＮＡＩ／AmpをHindIIIおよびXbaＩ制限酵素で消化してライゲーションする。そのライゲーション混合物を大腸菌株ＳＵＲＥ（ストラタジーン・クローニング・システムズ、１１０９９ノース・トーレイ・パインズ・ロード（North Torrey Pines Roard）、ラ・ホラ、カリフォルニア９２０３７）に形質転換して、その形質転換した培養物をアンピシリン培地プレートにプレーティングし、ついで耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、ついで正確な断片の存在のために制限分析によって試験する。組換えサイトスタチンIIの発現のため、ＣＯＳ細胞を例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サンブルック、フィリッチ（E．Fritsch）、マニアチス（T．Mania tis）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９））に記載されるような方法を用いて発現ベクターでトランスフェクションする。サイトスタチンII ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、ハーロウ（E．Harlow）、レーン（D．Lane）、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、（１９８８）に記載される方法を用いて、放射線標識および免疫沈降法により検出する。２日間のトランスフェクションの後、³⁵Ｓ−システインで８時間標識する。ついで培養培地を回収し、その細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ NaCl、１％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０. ５％ＤＯＣ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７.５）にて溶解する（ウィルソンら、上記）。細胞リゼイトおよび培養培地の両者をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈澱させる。沈澱したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にて分析し、その結果は期待された大きさの発現産物を示す。実施例４ヒト組織におけるサイトスタチンIIの発現のレベルを調べるため、とりわけ、サンブルックら（上記に引用）によって記載される方法を用いてノーザンブロット分析を行った。総細胞ＲＮＡサンプルをＲＮＡzol^TMＢシステム（バイオテックス・ラボラトリーズ・インク（Biotecx Laboratories，Inc.）６０２３サウス・ループ・イースト（South Loop East）、ヒューストン、テキサス７７０３３）で単離した。特定の各ヒト組織から単離した総ＲＮＡの約１０μgを１％アガロースゲル上で分離した。そのゲルをナイロンフィルター完全長サイトスタチン II遺伝子にブロットし、標識されたポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。その標識反応は、５０ｎｇのＤＮＡ断片とともにストラタジーンプライム−イットキット（Stratagene Prime-It kit）に従って行った。標識したＤＮＡをSelect−Ｇ−５０カラムで精製した。（５プライム−３プライム、インク、ブルダー（Boulder）、コロラド）。ついで、フィルターを放射性標識したサイトスタチンII遺伝子の全長と０.５ＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.４および７％ＳＤＳ中で１,０００,０００cpm／mlで６５℃で一夜ハイブリダイズさせた。室温で２回洗浄した後、６０℃で０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで２回洗浄し、ついでフィルターを増感紙で−７０℃で一晩露光させた。サイトスタチンII のｍＲＮＡは脳に豊富である。実施例５遺伝子治療を介する発現線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。その組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く（各フラスコに約１０片の塊を置く）。該フラスコを上下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置する。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む新しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ham's Ｆ１２ media））を添加する。ついでこれを３７℃で約１週間インキュベートする。このとき、新しい培地を添加し引き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液中に線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理しついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。遺伝子療法のためのベクターは発現されるべき断片をクローニングする制限酵素で消化する。消化されたベクターは、自己ライゲーションを防ぐためにウシ腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化され、線形化したベクターをアガロースゲル上で画分して精製する。活性化サイトスタチンIIを発現することができるサイトスタチンｃＤＮＡを単離する。その断片の末端は必要であれば就職されて、ベクターにクローニングされる。例えば、５''オーバーハンギング（overhanging）は、平滑末端をつくるＤＮＡポリメラーゼで処理されることができる。３’オーバーハンギング末端はＳ１ヌクレアーゼを用いて除去することができる。リンカーはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて平滑末端にライゲーションすることができる。モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格およびサイトスタチンII断片の等量を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させる。ライゲーション混合物を大腸菌を形質転換するために使用し、ついで該菌をカナマイシン含有アガー上に播種する。カナマイシン表現型および制限分析は、ベクターが適当に挿入された遺伝子を含むことを確認する。パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagl es Medium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるまで組織培養中で増殖させる。サイトスタチンII伝子を有するベクターを標準技術を用いてパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞は、サイトスタチンII遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。新しい培地を形質導入したプロデューサー細胞に添加し、引き続き培地をプレート全面のプロデューサー細胞から回収する。感染性ウイルス粒子を含む培地をミリポアフィルターで濾過して分離したプロデューサー細胞を除去した。ついで濾過した培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を線維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、濾過した培地とすばやく取り替える。ポリブレン(アルドリッチ（Aldrich）)を培地に導入してトランスダクションを容易にする。適当なインキュベーションの後、その培地を除去し、ついで新鮮培地と取り換える。ウイルス力価が高い場合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は一切必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、拡大のためにトランスデュースされた細胞を選択するため、ｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。操作された線維芽細胞を、単独またはサイトデックス３ミクロキャリアビーズ（cytodex 3 microcarrier beads）などの微小担体上全面に増殖した後に、宿主に注入する。注入された線維芽細胞はサイトスタインIIタンパク質産物を産生し、ついで該タンパク質の生物学的な作用を宿主に付与する。特に前記の明細書および実施例中以外にも、本発明が実施されることができることは明らかである。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、追記する請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ユ，グオ−リアンアメリカ合衆国20878メリーランド州ダーネスタウン、ストロー・ベイル・レイン 13524番 (72)発明者ゲンツ，ライナーアメリカ合衆国20904メリーランド州シルバー・スプリング、フェアランド・パーク・ドライブ13404番

Claims

【特許請求の範囲】１．図１のアミノ酸１−１３２をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列に少なくとも９５％同一である領域を含む単離したポリヌクレオチド。２．該領域が多数の非コンティグエクソンと続くかまたは該エクソンによって形成される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．該領域がゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである請求項２に記載の単離したポリヌクレオチド。４．該領域の配列が図１中のヌクレオチド１６−４１１の配列である請求項３に記載の単離したポリヌクレチド。５．該領域が図１中のアミノ酸１−１３２をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列に少なくとも９５％同一である請求項１に記載の単離したポリヌクレオチオド。６．該領域の配列が図１中のヌクレオチド１６−３９６の配列である請求項５に記載の単離したポリヌクレオチド。７．ＡＴＣＣ受託番号第号のヒトｃＤＮＡインサートのサイトスタチンIIポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの配列に少なくとも９５％同一である領域を含む単離したポリヌクレオチド。８．該ＲＮＡまたはＤＮＡがＡＴＣＣ受託番号第号のヒトｃＤＮＡインサートの成熟ポリペプチドをコードする請求項７に記載の単離したポリヌクレオチド。９．該領域が、ＡＴＣＣ受託番号第号のｃＤＮＡインサートのコーでィング領域である請求項７に記載の単離したポリヌクレオチド。１０．該領域が、ＡＴＣＣ受託番号第号のｃＤＮＡインサートである請求項７に記載の単離したポリヌクレオチド。１１．作動可能に結合したポリヌクレオチドの宿主細胞中の発現に有効なシス −活性化調節要素を含み、該ポリヌクレオチドが請求項１に記載のポリヌクレオチドである発現ベクター。１２．該調節要素が、該宿主細胞中の該ポリヌクオレチドの発現を誘発するのに有効である請求項１１に記載の発現ベクター。１３．作動可能に結合したポリヌクレオチド宿主細胞中の発現に有効であるシス−活性化調節要素を含み、該ポリヌクレオチドが請求項７に記載のポリヌクレオチドである発現ベクター。１４．宿主細胞中に請求項１に記載のポリヌクレオチドを安定に含有する宿主細胞。１５．宿主細胞中に請求項７に記載のｃＤＮＡインサートを安定に含有する宿主細胞。１６．宿主細胞中に請求項１１に記載の発現ベクターを発現可能に含有する宿主細胞。１７．宿主細胞中に請求項１３に記載の発現ベクターを発現可能に含有する宿主細胞。１８．宿主細胞中に請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現する工程を含むポリペプチドの製造方法。１９．宿主細胞中に請求項７に記載のポリヌクレオチドを発現する工程を含むポリペプチドの製造方法。２０．請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。２１．請求項７に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。