JPH11507504A

JPH11507504A - 線維芽細胞増殖因子１３

Info

Publication number: JPH11507504A
Application number: JP9500361A
Authority: JP
Inventors: グリーン，ジョン・エム; グルーバー，ヨアヒム・アール; ローゼン，クレイグ・エイ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 1999-07-06
Also published as: AU702682B2; AU2697995A; KR19990022315A; WO1996039508A1; EP0857209A1; EP0857209A4

Abstract

(57)【要約】ヒト線維芽細胞増殖因子−１３ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)を開示する。そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法もまた提供する。そのようなポリペプチドを、例えば、熱傷および潰瘍の結果としての、創傷の治癒を促進するために、発作と関連のある、またニューロン障害によるニューロン損傷を防いで、ニューロン増殖を促進するために、また皮膚の老化および毛髪の喪失を防ぐために、初期胚および肢再生における脈管形成、中胚葉誘導を刺激するために利用する方法もまた開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、および異常細胞増殖、血管過多疾患、並びに上皮レンズ細胞増殖を防ぐための治療法としてのそれらの使用もまた開示する。コード配列における変異、および宿主から得られた試料中のポリペプチドの濃度における変化を検出するための診断方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】線維芽細胞増殖因子１３本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子／ヘパリン結合増殖因子として推定的に同定され、以下で「ＦＧＦ−１３」と呼ぶ。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。線維芽細胞増殖因子は、ヘパリンに結合することを特徴とするタンパク質のファミリーの１つであり、従って、ヘパリン結合増殖因子(ＨＢＧＦ)ともまた呼ばれる。これらのタンパク質の異なったメンバーの発現は、様々な組織において見い出され、また特定の時間的および空間的制御下にある。これらのタンパク質は、線維芽細胞、角膜並びに血管内皮細胞、顆粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋原細胞、血管平滑筋細胞、レンズ上皮細胞、メラニン細胞、角化細胞、乏突起神経膠細胞、星状膠細胞、骨芽細胞、および造血細胞を含め、中胚葉、外胚葉、および内胚葉起源の様々な細胞に対する強力なマイトジェンである。各々のメンバーは、他のメンバーと重複した機能を有し、その独自の機能スペクトルもまた有する。血管内皮細胞の増殖を刺激する能力の他に、ＦＧＦ−１および２は両方とも、内皮細胞に対して走化性であり、またＦＧＦ−２は、内皮細胞が基底膜を貫通するのを可能とすることが示された。これらの性質と一致して、ＦＧＦ−１および２は両方とも、脈管形成を刺激する能力を有する。これらの増殖因子の別の重要な特徴は、創傷の治癒を促進する、それらの能力である。ＦＧＦファミリーの多くの他のメンバーは、脈管形成および創傷の治癒を促進するといったような、ＦＧＦ−１および２と同様の活性を共有する。ＦＧＦファミリーの幾つかのメンバーは、中胚葉形成を誘導して、ニューロン細胞、脂肪細胞、および骨格筋細胞の分化を変化させることが示された。正常な組織における、これらの生物学的活性以外に、ＦＧＦタンパク質は、腫瘍血管新生を促進することにより、またそれらの発現が脱調節されている場合には、トランスフォーミングタンパク質として、癌腫および肉腫での腫瘍形成を促進することと関係している。ＦＧＦファミリーは現在、８つの構造上関係のあるポリペプチド：塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、int ２、hst １／k−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、角化細胞増殖因子、ＡＩＧＦ(ＦＧＦ−８)からなっており、最近、神経膠活性化因子は、ヒト神経膠腫細胞系の培養上清から精製された新規ヘパリン結合増殖因子であることが示された(Ｍiyamoto，Ｍ.ら、Ｍol．and Ｃell．Ｂiol.、１３（７）：４２５１−４２５９（１９９３）)。各々の遺伝子がクローン化されて、配列決定されている。そのメンバーの２つ、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、多くの名称で、しかし、最も多くは、各々、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子として特徴付けられている。正常な遺伝子産物は、大部分の中胚葉および神経外胚葉由来の細胞の一般的な増殖能力に影響を及ぼす。それらは、インビボにおいて脈管形成を誘導することができ、また初期発生において重要な役割を果たし得る( Ｂurgess，Ｗ．Ｈ.およびＭaciag，Ｔ.、Ａnnu．Ｒev．Ｂiochem.、５８：５７５−６０６（１９８９）)。先に同定したＦＧＦファミリーのメンバーの多くはまた、同じ受容体にも結合し、これらの受容体に結合することによって、第二メッセージを誘起する。分泌型のＦＧＦ−１をコードする真核発現ベクターは、ブタ動脈中への遺伝子移入により導入された。このモデルは、インビボにおける動脈壁での遺伝子機能を明らかにする。ＦＧＦ−１発現は、遺伝子移入から２１日後、ブタ動脈における内膜肥厚を誘導した(Ｎabel，Ｅ．Ｇ.ら、Ｎature、３６２：８４４−６（１９９３）)。塩基性線維芽細胞増殖因子は、腫瘍脈管形成における、その役割とは無関係に、神経膠腫増殖および進行を調節し得ること、また塩基性線維芽細胞増殖因子の放出または分泌は、これらの作用に必要とされ得ることがさらに実証されている(Ｍorrison，Ｒ．Ｓ.ら、Ｊ．Ｎeurosci．Ｒes.、３４：５０２−９（１９９３）)。塩基性ＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子はさらに、インビトロにおけるカポジ肉腫細胞の増殖と関係している(Ｈuang，Ｙ．Ｑ.ら、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest.、９１：１１９１−７（１９９３）)。そしてまた、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をコードするcＤＮＡ配列は、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写プロモーターの下流にクローン化された。そのようにして得られた塩基性線維芽細胞増殖因子は、分裂誘発性、プラスミノーゲンアクチベーターの合成、および脈管形成アッセイにおいて、ヒト胎盤線維芽細胞増殖因子とは区別できない生物学的活性を有することが示された(Ｓquires，Ｃ．Ｈ.ら、Ｊ．Ｂiol．Chem.、２６３：１６２９７−３０２（１９８８）)。米国特許第５,１５５,２１４号は、実質的に純粋な哺乳動物塩基性線維芽細胞増殖因子、およびそれらの製造を開示している。ウシおよびヒト塩基性線維芽細胞増殖因子のアミノ酸配列、さらにはまた、ウシ種の該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が開示されている。新たに発見されたＦＧＦ−９は、ＦＧＦファミリーの他のメンバーに対して約３０％の配列類似性を有する。ファミリーメンバーにおける２つのシステイン残基および他の共通配列もまた、ＦＧＦ−９配列において十分保存された。ＦＧＦ −９は、酸性および塩基性ＦＧＦでのように、そのＮ末端に典型的なシグナル配列を全く有していないことが見い出された。しかし、ＦＧＦ−９は、その典型的なシグナル配列ＦＧＦの欠損にもかかわらず、合成後の細胞から分泌されることが見い出された(Ｍiyamoto，Ｍ.ら、Ｍol．and Ｃell．Ｂiol.、１３（７）：４２５１−４２５９（１９９３）)。さらに、ＦＧＦ−９は、乏突起神経膠細胞２型星状膠細胞の始原細胞、ＢＡＬＢ／c３Ｔ３、およびＰＣ−１２細胞の細胞増殖を刺激するが、ヒト臍静脈内皮細胞の細胞増殖は刺激しないことが見い出された(Ｎaruo，Ｋ.ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.、２６８：２８５７−２８６４（１９９３）)。塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦは、細胞増殖、細胞運動、分化、および生存の強力なモジュレーターであり、外胚葉、中胚葉、および内胚葉由来の細胞タイプに対して作用する。これらの２つのＦＧＦは、ＫＧＦおよびＡＩＧＦと共に、タンパク質精製により同定された。しかし、他の４つのメンバーは、腫瘍遺伝子として単離され、この発現は、胚形成およびあるタイプの癌に制限された。ＦＧＦ −９は、神経膠細胞に対するマイトジェンであることが実証された。ＦＧＦファミリーのメンバーは、腫瘍形成能力を有することが報告されている。ＦＧＦ−９は、ＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞へとトランスフォームした場合には、トランスフォームする能力を示した(Ｍiyamoto，Ｍ.ら、Ｍol．Ｃell．Ｂiol.、１３（７）：４２５１−４２５９（１９９３）)。ＦＧＦ−８としてもまた知られているアンドロゲン誘導増殖因子(ＡＩＧＦ)は、テストステロンで刺激されたマウス乳癌細胞(ＳＣ−３)のコンディションド培地から精製された。ＡＩＧＦは、特徴のあるＦＧＦ様増殖因子であり、推定されるシグナルペプチドを有し、またＦＧＦファミリーの既知のメンバーと３０−４０％の相同性を共有する。ＡＩＧＦでトランスフォームされた哺乳動物細胞は、アンドロゲンの不存在下、ＳＣ−３細胞の増殖に対して著しい刺激効果を示す。従って、ＡＩＧＦは、それが腫瘍細胞自体により分泌されることから、ＳＣ−３細胞、およびことによると他の細胞のアンドロゲン誘導増殖を媒介する。本発明のポリペプチドは、ＦＧＦファミリーの他のメンバーとのアミノ酸配列の相同性の結果として、ＦＧＦファミリーのメンバーとして推定的に同定されている。本発明の一態様により、新規成熟ポリペプチド、さらにはまた、生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメント、アナログ、および誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメントを提供する。本発明のさらに別の態様により、本発明のポリペプチドの組換え製造における試薬として有用な、クーロニングおよび発現プラスミドといったような組換えベクター、さらにはまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる組換え原核および／または真核宿主細胞の使用によって、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を提供する。本発明のさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それに対するアゴニストおよびアンタゴニストに関してスクリーニングするために、また治療目的に、例えば、熱傷および潰瘍の結果としての、例えば、創傷の治癒を促進するために、発作と関連のある、またニューロン障害によるニューロン損傷を防いで、ニューロン増殖を促進するために、また皮膚の老化および毛髪喪失を防ぐために、初期胚および肢再生における脈管形成および中胚葉誘導を刺激するために利用する方法を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のまた別の態様により、例えば、細胞トランスフォーメーション、例えば、腫瘍の処置において、そのようなポリペプチドの作用を阻害するための、瘢痕形成(scarring)を減少させて、血管過多疾患を処置するための、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、およびそれらの使用方法を提供する。本発明の別の態様により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提供する。本発明のまた別の態様により、本発明の核酸配列における変異に関係のある疾患、または疾患に対する感受率を検出するための、またそのような配列によりコードされるポリペプチドの過剰発現を検出するための診断アッセイを提供する。本発明の別の態様により、科学調査、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関係のあるインビトロにおける目的に、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。次の図面は、本発明の具体的な態様の説明としてのみ記載するものであって、いかようにも限定として記載するものではない。第１図は、ＦＧＦ−１３のcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。最初の２１個のアミノ酸残基は、推定されるリーダー配列を表す。本発明の一態様により、第１図(配列番号２)の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年５月１２日にＡＴＣＣ寄託番号第９７１４７号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のＦＧＦ−１３をコードするポリヌクレオチドは、ヒト卵巣癌組織から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見された。該ＦＧＦ−１３ポリペプチドは、構造上、線維芽細胞増殖因子ファミリーの全てのメンバーに関係があり、また２１２個のアミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、このうち、最初の２１個のアミノ酸は推定されるリーダー配列を表すことから、成熟ポリペプチドは１９１個のアミノ酸を含んでなる。トップのうち、適合は、１）マウスＡＩＧＦに対して、１８５個のアミノ酸範囲にわたり、６９％の同一性および８１％の類似性；２）ニワトリ由来のＦＧＦ−４と、８２個のアミノ酸の領域で、３０％の同一性および５６％の類似性；３）ヒトＫＧＦと、７８個のアミノ酸範囲にわたり、４１％の同一性および６４％の類似性である。ＦＧＦ／ＨＢＧＦファミリーのサイン(signature)、ＧＸＬＸ(Ｓ,Ｔ,Ａ,Ｇ)Ｘ６(Ｄ,Ｅ)ＣＸＦＸＥは、本発明のポリペプチドにおいて保存される(Ｘはいずれかのアミノ酸残基を意味し；(Ｄ,Ｅ)はＤまたはＥ残基のいずれかを意味し；Ｘ６はいずれかの６つのアミノ酸残基を意味する)。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１図(配列番号１)に示すコード配列もしくは寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、または遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図(配列番号１)のＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。第１図(配列番号２)の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、第１図(配列番号２)の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、第１図(配列番号２)に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図(配列番号１)に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する( Ｗilson，Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の製造に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；それには、コード領域より前および後の領域(リーダーおよびトレーラー)、さらにはまた、個々のコードセグメント(エキソン)間の介在配列(イントロン)が含まれる。完全な長さのＦＧＦ−１３遺伝子のフラグメントは、完全な長さの遺伝子を単離するために、また該遺伝子に対して高い配列類似性、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、例えば、５０またはそれ以上の塩基を含むのがよい。該プローブはまた、完全な長さの転写物、およびゲノムクローン、または調節並びにプロモーター領域、エキソン、およびイントロンが含まれる、完全なＦＧＦ−１３遺伝子を含むクローンに対応するcＤＮＡクローンを同定するのに使用することもできる。スクリーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、ＦＧＦ−１３遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトのcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図(配列番号１)のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的にはいずれか保有するポリペプチドをコードする。あるいはまた、該ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、また上記のように、それに対して同一性を有し、また活性を保有し得るか、または保有し得ない、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、またさらに好ましくは少なくとも５０塩基を有するのがよい。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの回収のための、配列番号１のポリヌクレオチドに対するプローブとして、または診断プローブとして、またはＰＣＲプライマーとして使用することができる。従って、本発明は、配列番号２のポリペプチド、さらにはまた、そのフラグメント(このフラグメントは、少なくとも３０塩基、また好ましくは少なくとも５０塩基を有する)をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、第１図(配列番号２)の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＦＧＦポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。第１図(配列番号２)のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。本発明のポリペプチドには、配列番号２のポリペプチド(特に、成熟ポリペプチド)、さらにはまた、配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性(好ましくは少なくとも７０％の同一性)、またさらに好ましくは配列番号２のポリペプチドに対して９０％の類似性(さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性)、またなおさらに好ましくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性(なおさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性)を有するポリペプチドが含まれ、通例、少なくとも３０個のアミノ酸、またさらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含む、そのようなポリペプチドの部分をもつ、そのようなポリペプチドの部分もまた含まれる。当業界で知られているように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその同類的アミノ酸置換物を、もう１つのポリペプチドの配列と比較することにより測定する。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、対応する完全な長さのポリペプチドをペプチド合成により製造するために使用することができ；従って、そのフラグメントは、完全な長さのポリペプチドを製造するための中間体として使用することができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を使用して、本発明の完全な長さのポリヌクレオチドを合成することができる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作することができる(トランスデュースし、またはトランスフォームし、またはトランスフェクトすることができる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＦＧＦ遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチド配列を、ポリペプチドを発現するための様々な発現ビヒクル、特にベクターまたはプラスミドのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターまたはプラスミドも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．coli．lac またはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ．coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つの遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ．coli、Ｓalmonella typhimurium、Ｓtreptomyces といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。次のベクターを例として挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９( Ｑiagen)、pＢＳ、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pＢluescr ipt ＳＫ、pＢsＫＳ、pＮＨ８a、pＮＨ１６a、pＮＨ１８a、pＮＨ４６a(Ｓtrata gene)；pＴＲＣ９９Ａ、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用：pＷＬneo、pＳＶ２cat、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。(Ｄavis，Ｌ.、Ｄibner，Ｍ.、Ｂattey，Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaborato ry Ｍanual、第２版（Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、１９８９）により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー(bp １００〜２７０)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ．coliのアンピシリン耐性遺伝子並びにＳ．cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ．coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、およびＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、並びにＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン)およびpＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により抑制解除して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊することができる。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のウイルスゲノム、例えば、ＳＶ４０の開始点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含め、現在まで使用されている方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、血栓症、動脈硬化症、および他の心臓血管状態といったような、様々な疾患状態による虚血組織の脈管再生を刺激するための処置において使用することができる。これらのポリペプチドはまた、脈管形成および肢再生を刺激するために使用することもできる。該ポリペプチドはまた、それらが線維芽細胞および骨格筋細胞といったような、異なった起源の様々な細胞に対して分裂誘発性であり、従って、損傷を受けた、または疾患に罹った組織の修復または置換を促進することから、負傷、熱傷、手術後の組織修復、および潰瘍による創傷を処置するために使用することもできる。本発明のポリペプチドはまた、ニューロン増殖を刺激するために、また発作と関連のある、またアルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関係コンプレックスといったような、あるニューロン障害または神経変性状態において起こるニューロン損傷を処置する、また防ぐために使用することもできる。ＦＧＦ −１３は、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し、従って、それらは、骨および歯周再生を高めて、組織移植片または骨移植片を補助するために使用することができる。本発明のポリペプチドはまた、角化細胞増殖を刺激することにより、日焼けによる皮膚の老化を防ぐために使用することもできる。該ＦＧＦ−１３ポリペプチドはまた、ＦＧＦファミリーメンバーが毛髪形成細胞を活性化して、メラニン細胞増殖を促進することから、毛髪の喪失を防ぐために使用することもできる。同じ観点から(along the same lines)、本発明のポリペプチドは、他のサイトカインと組み合わせて使用する場合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激するために使用することができる。該ＦＧＦ−１３ポリペプチドはまた、移植前に臓器を保持するために、または一次組織の細胞培養を支持するために使用することもできる。本発明のポリペプチドはまた、初期胚において中胚葉起源の組織を誘導して分化するために使用することもできる。本発明のまたさらなる態様により、科学調査、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの製造に関係のあるインビトロにおける目的に、またヒト疾患の処置に対する診断法および治療法を提供する目的に、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドの受容体の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳ選別により同定することができる(Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmun.、１（２）、第５章、（１９９１）)。好ましくは、発現クローニングを使用し、ここでは、ポリアデニル化ＲＮＡを該ポリペプチドに応答する細胞、例えば、ＦＧＦファミリータンパク質の複合受容体を含むことが知られているＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＳＣ−３細胞から調製して、このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリーをプールに分けて、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェクトされた細胞を、標識化した後の本発明のポリペプチドにさらす。該ポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法により標識化することができる。固定およびインキュベーションに続いて、そのスライドをオートラジオグラフ分析にかける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング方法を使用して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定される受容体をコードする単一クローンを得る。受容体を同定するための他の方法として、標識化ポリペプチドを細胞膜と光親和性により結合させるか、または受容体分子を発現する調製物を抽出することができる。橋かけ(cross-linked)物質をＰＡＧＥ分析により分けて、Ｘ線フィルムにさらす。該ポリペプチドの受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグメントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけることができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定される受容体をコードする遺伝子が同定されるであろう。本発明は、化合物をスクリーニングして、本発明のポリペプチドの作用を変化させる化合物を同定する方法を提供する。そのようなアッセイの例は、線維芽細胞が正常に増殖するであろう細胞培養条件下、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングすべき化合物、および³[Ｈ]チミジンを混合することを含んでなる。対照アッセイをスクリーニングすべき化合物の不存在下に行い、該化合物の存在下における線維芽細胞増殖の量と比較して、各々の場合における³[Ｈ]チミジンの摂取を測定することにより、該化合物が増殖を刺激するかどうかを決定することができる。線維芽細胞増殖の量は、³[Ｈ]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定する。アゴニストおよびアンタゴニスト化合物は両方とも、この方法により同定することができる。別の方法では、該化合物の存在下、本発明のポリペプチドの受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を標識化した本発明のポリペプチドと共にインキュベートする。次いで、この相互反応を高める、またはブロックする化合物の能力を測定することができる。あるいはまた、スクリーニングすべき化合物とＦＧＦ −１３受容体との相互反応後の、既知の第二メッセンジャーシステムの応答を測定し、該受容体に結合して、第二メッセンジャー応答を誘起する該化合物の能力を測定して、該化合物が可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する。そのような第二メッセンジャーシステムには、限定されるものではないが、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解が含まれる。アンタゴニスト化合物の例には、抗体、また幾つかの場合には、本発明のポリペプチドの受容体に結合するが、第二メッセンジャー応答は全く誘起せず、またはＦＧＦ−１３ポリペプチド自体に結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。あるいはまた、可能性のあるアンタゴニストは、該受容体に結合するが、第二メッセンジャー応答は全く誘起せず、従って、該ポリペプチドの作用を有効にブロックする変異型のポリペプチドであり得る。ＦＧＦ−１３遺伝子および遺伝子産物に対する別のアンタゴニスト化合物は、アンチセンス技術を使用して製造されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を使用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し (三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl．Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；Ｃoo neyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによって、転写および本発明のポリペプチドの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする(Ａntisense−Ｏkano、Ｊ．Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxp ression、ＣＲＣＰress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、該ポリペプチドの産生を阻害することができる。可能性のあるアンタゴニスト化合物にはまた、該受容体の結合部位に結合して占有し、そのことによって、該受容体をそのポリペプチドに近づき難くすることから、正常な生物学的活性を妨げる小さな分子も含まれる。小さな分子の例には、限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。アンタゴニスト化合物は、本発明のポリペプチドの、新生細胞および組織に及ぼす細胞成長および増殖効果、すなわち、腫瘍の脈管形成の刺激を阻害し、従って、例えば、腫瘍形成または増殖における、異常細胞成長および増殖を遅延する、または妨げるために使用することができる。該アンタゴニストはまた、血管過多疾患を防いで、嚢外白内障手術後の上皮レンズ細胞の増殖を防ぐために使用することもできる。本発明のポリペプチドの分裂誘発活性の防止はまた、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合にも望ましい。該アンタゴニストはまた、創傷の治癒の間の瘢痕組織の増殖を防ぐために使用することもできる。該アンタゴニストはまた、薬学上許容され得る担体、例えば、以下に記載するような担体と共に、組成物中で使用することもできる。本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、非経口投与のための医薬組成物をなすために、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニスト、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を処置および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０ μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。局所投与の具体的な場合には、用量は、１c m²当り約０.１μg〜９mgを投与するのが好ましい。本発明のポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニスト並びにアンタゴニスト化合物はまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することもできる。従って、例えば、細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作することができる。同様に、例えば、当業界で既知の方法により、該ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をインビボにおいて処理して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。上述のレトロウイルスプラスミドベクターを得ることができるレトロウイルスには、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスといったようなレトロウイルスが含まれる。一態様では、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。該ベクターには、１つまたはそれ以上のプロモーターが含まれる。使用することができる適当なプロモーターには、限定されるものではないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭillerら、Ｂiotechniques、第７巻、第９号、９８０−９９０（１９８９）に記載されているヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、またはいずれかの他のプロモーター(例えば、限定されるものではないが、ヒストン、pol III、およびβ−アクチンプロモーターが含まれる、真核細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター)が含まれる。使用することができる他のウイルスプロモーターには、限定されるものではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが含まれる。適当なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかであろう。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下にある。使用することができる適当なプロモーターには、限定されるものではないが、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターのようなヘテロロガスプロモーター；呼吸合胞体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターといったような誘導可能なプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ(上記の修飾されたレトロウイルスＬＴＲが含まれる)；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、プロデューサー細胞系を形成するためにパッケージング細胞系をトランスデュースする。トランスフェクトすることができるパッケージング細胞の例には、限定されるものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＲＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋envＡm１２、およびＭiller、Ｈuman Ｇene Ｔherapy、第１巻、５−１４頁（１９９０）（これに記載されている内容は全て、本発明の一部を構成する）に記載されているＤＡＮ細胞系が含まれる。該ベクターは、当業界で知られている方法のいずれかによって、パッケージング細胞をトランスデュースすることができる。そのような方法には、限定されるものではないが、電気穿孔、リポソームの使用、およびＣ aＰＯ₄沈降が含まれる。１つの他の方法では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームに封入する、または脂質に結合させた後、宿主に与えることができる。該プロデューサー細胞系は、該ポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる感染性レトロウイルスベクター粒子を発生させる。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、真核細胞をインビトロまたはインビボのいずれかにおいてトランスデュースすることができる。トランスデュースされた真核細胞は、該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。トランスデュースすることができる真核細胞には、限定されるものではないが、胚幹細胞、胚癌細胞、さらにはまた、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角質細胞、内皮細胞、および気管支上皮細胞が含まれる。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列における変異の存在に関係がある疾患、または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部としての、本発明の遺伝子の使用にも関する。本発明の遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６）)を使用することにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができる。例としては、本発明のポリペプチドをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化したＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化したアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全に対合している配列は、ＲＮアーゼＡ消化により、または融解温度の相違により、対合していない複式物(dup lexes)と区別することができる。ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラジエントゲルを変性することで区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）)。従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用( 例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およびサザンブロッティングといったような方法により成し遂げることができる。さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in situ 分析により検出することもできる。本発明はまた、正常な対照の組織試料と比較しての該タンパク質の過剰発現が、異常細胞増殖、例えば、腫瘍の存在を検出することができることから、様々な組織におけるＦＧＦ−１３タンパク質レベルの変化を検出するための診断アッセイにも関する。宿主から得られた試料中のタンパク質レベルを検出するために使用されるアッセイは当業者に周知であって、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ(Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmunology、１（２）、第６章、（１９９１）)は、まず最初に、本発明のポリペプチドに対する抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含んでなる。さらに、リポーター抗体を、そのモノクローナル抗体に対して調製する。そのリポーター抗体に、放射能、蛍光、または本実施例では、ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような、検出可能な試薬を結合させる。試料を宿主から取り除いて、試料中のタンパク質を結合する固形保持体、例えば、ポリスチレン皿の上でインキュベートする。次いで、ウシ血清アルブミンのような、非特異的なタンパク質と共にインキュベートすることにより、その皿の上の空いているタンパク質結合部位を全て覆う。次に、モノクローナル抗体を皿においてインキュベートするが、その間に、そのモノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合した全ての本発明のポリペプチドに結合する。結合しなかったモノクローナル抗体を全て、緩衝液で洗い流す。ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を直ちに皿に置くと、リポーター抗体の、問題のタンパク質に結合した全てのモノクローナル抗体への結合が起こる。次いで、結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。次いで、ペルオキシダーゼ基質を皿に加えて、一定時間に発生した色の量は、標準曲線に対して比較する場合、患者の試料の一定体積中に存在する本発明のポリペプチドの量の測定値である。競合アッセイを使用することができ、ここでは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を固形保持体に結合させて、標識化したＦＧＦ−１３および宿主から得られた試料を固形保持体上に通過させて、例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出される標識の量を、試料中の本発明のポリペプチドの量に関連づけることができる。「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイに似ている。「サンドイッチ」アッセイでは、本発明のポリペプチドを固形保持体上に通過させて、固形保持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第二抗体を、問題のポリペプチドに結合させる。標識化され、また第二抗体に特異的な第三抗体を固形保持体上に通過させて、第二抗体に結合させた後、量を定量することができる。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性の)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエクソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を使用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に使用することができる他のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を使用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５０または６０塩基という短いcＤＮＡで使用することができる。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂas ic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕni versity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm unology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ．Ｌiss，Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。それにまた、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることができる。本発明をさらに、次の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。次の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel，Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒ es.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis，Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham，Ｆ.およびＶ an der Ｅb，Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。実施例１ＦＧＦ−１３タンパク質の細菌発現および精製最初に、ＦＧＦ−１３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第９７１４７号を、プロセシングされたタンパク質の５'配列(シグナルペプチド配列なし)およびその遺伝子の３'側のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。その遺伝子に対応する付加的ヌクレオチドを各々、５' および３'配列に付加する。５'オリゴヌクレオチドプライマー：は、Ｎco制限酵素部位を含む。３'配列：は、ＢglII部位に対する相補的配列を含み、その後に１８ヌクレオチドのＦＧＦ −１３コード配列が続く。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−６０(Ｑiagen,Ｉnc．Ｃhatsw orth、ＣＡ９１３１１)上の制限酵素部位に対応する。pＱＥ−６０は、抗生物質耐性(Ａmp^r)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、pＱＥ−６０をＮcoＩおよびＢglIIで消化した。増幅された配列をpＱＥ−６０にライゲートして、ヒスチジンタグおよびリボソーム結合部位(ＲＢＳ)をコードする配列と共に枠内に挿入する。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８９）に記載されている手順により、Ｅ.coli.株Ｍ１５／rep４(Ｑiagen,Ｉnc.)をトランスフォームする。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^r)も与える。トランスフォーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認する。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１００u g／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させる(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養系に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞を、０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰) まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加える。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏのクリアリングを誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣ l中で可溶化する。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＦＧＦ−１３を精製する(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｊ. Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４（１９８４）)。６モルのグアニジンＨＣl pＨ５.０中、そのタンパク質をカラムから溶出し、また再生の目的に、３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０ミリモルのグルタチオン(還元した)、および２ミリモルのグルタチオン(酸化した)に調節する。この溶液中で１２時間インキュベーションした後、そのタンパク質を１０ミリモルのリン酸ナトリウムに対して透析する。実施例２バキュロウイルス発現システムを用いてのＦＧＦ−１３のクローニングおよび発現完全な長さのＦＧＦ−１３タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第９７１４７号を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。そのＦＧＦ−１３５'プライマーは、配列：を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)を含むことから、この部位でのクローニングは、推定されるＦＧＦ−１３シグナルペプチド切断部位の下流でＦＧＦ−１３遺伝子の１８ヌクレオチドと共に、バキュロウイルスシグナル配列を枠内に置くであろう。その３'プライマーは、配列：を有し、また制限エンドヌクレアーゼＸbaＩの切断部位、およびその遺伝子の３'非翻訳配列に対して相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ１０１Ｉnc.、Ｌ a Ｊolla、Ｃa.)を使用して、１％アガロースゲルから単離する。次いで、そのフラグメントを各々のエンドヌクレアーゼで消化して、１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントをＦ２と名付ける。ベクター pＡ２gp(pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システムを用いてのタンパク質の発現に使用する(レビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ．１９８７、Ａ manual of methods for ba culovirus vectors and insect cell culture procedures、Ｔexas Ａgricultur al Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照)。この発現ベクターは、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニア核多角体病ウイルス群(Ａc ＭＮＰＶ)の強力な多角体(polyhedrin)プロモーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＸbaＩの認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するには、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、多角体( polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く多角体プロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列を多角体配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、pＲＧ１、pＡc３７３、pＶＬ９４１、およびpＡcＩＭ１といったようなpＡ２の代わりに使用することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳummers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３９)。プラスミドを制限酵素で消化して、当業界で既知の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次いで、ＤＮＡを、市販のキット(「Ｇe neclean」、ＢＩＯ１０１Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と名付ける。フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートさせる。次いで、Ｅ.coli ＤＨ５α細胞をトランスフォームして、プラスミド(pＢacＦＧＦ−１３)を含む細菌を、各々の制限酵素を使用して同定する。クローン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。リポフェクション法を使用して、プラスミド pＢacＦＧＦ−１３５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧold^TMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐha rmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時トランスフェクトする(Ｆelgn erら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）)。各々の場合において、ＢaculoＧold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミド５μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇai thersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μl を加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１m lを加える。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith(上記)により記載されたようにして、プラークアッセイを行う。変更として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔechnolo gies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用するが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する使用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見い出すことができる)。連続希釈してから４日後に、ウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種した昆虫Ｓf９細胞を感染させるのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存する。Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−ＦＧＦ−１３を感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II 培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替える。４２時間後、５μＣiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの³⁵Ｓシステイン５μＣi(Ａmersham)を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。実施例３ＣＯＳ細胞における組換えＦＧＦ−１３の発現プラスミド、ＦＧＦ−１３−ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.coli 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベクターpcＤＮＡ３／Ａmp(Ｉnvitrogen)から得た。完全なＦＧＦ−１３前駆体およびその３'末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮＡフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化することから、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、およびＲ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７：７６７（１９８４）)。ＨＡタグを標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクター、pcＤＮＡ３／Ａ mpを、各々の制限酵素で消化して、ライゲートさせる。そのライゲーション混合物をＥ.coli株ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems、Ｌa Ｊolla、ＣＡ) にトランスフォームし、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在に関して制限分析により試験する。組換えＦＧＦ−１３ＣＯＳ細胞の発現には、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクトする(Ｊ.Ｓambroo k、Ｅ.Ｆritsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanua l、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８９）)。ＦＧＦ−１３−ＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する(Ｅ.Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８８）)。トランスフェクションから２日後、細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０mＭＮaＣl、１％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭトリス、pＨ７．５))で溶菌する。(Ｗils on,Ｉ.ら、同上３７：７６７（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地は両方とも、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降する。沈降したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。実施例５遺伝子治療による発現線維芽細胞を皮膚生体組織検査により被験者から得る。その結果得られた組織を組織培養培地に入れて、小片に分離させる。組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面上に置き、約１０片を各々のフラスコに入れる。そのフラスコを上下にひっくり返し、密閉して、室温で一晩放置する。室温で２４時間放置した後、そのフラスコをひっくり返し、その組織の塊はフラスコの底に固定されたままにしておいて、新たな培地(例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＨamのＦ１２培地)を加える。次いで、これを３７℃で約１週間インキュベートする。この時点で、新たな培地を加えた後、数日毎に変える。さらに２週間培養した後、単層の線維芽細胞が現れる。その単層をトリプシン処理して、より大きなフラスコへと剥がし取る(scaled)。モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列の隣接したpＭＶ−７(Ｋirsc hmeier，Ｐ．Ｔ.ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８）)をＥcoＲＩおよびＨindIIIで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分別し、ガラスビーズを使用して精製する。本発明のポリペプチドをコードするcＤＮＡを、５'および３'末端配列に各々対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅する。ＥcoＲＩ部位を含む５'プライマーおよび３'プライマーは、ＨindIII部位を含む。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線形バックボーンおよびＥcoＲＩ並びにＨindIIIフラグメントを一緒に加える。その結果得られた混合物を、２つのフラグメントのライゲーションに適当な条件下に維持する。そのライゲーション混合物を使用して、細菌ＨＢ１０１をトランスフォームした後、そのベクターが正しく挿入された問題の遺伝子を有していることを確認する目的で、これを、カナマイシンを含む寒天上に置く。１０％仔ウシ血清(ＣＳ)、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾されたイーグル培地(ＤＭＥＭ)中、両種指向性pＡ３１７またはＧＰ＋am１２パッキング細胞を集密的密度まで組織培養で増殖させる。次いで、その遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加えて、パッキング細胞をベクターでトランスデュースする。ここで、そのパッキング細胞は、その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を製造する(ここで、そのパッキング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる)。新たな培地をトランスデュースされたプロデューサー細胞に加えた後、培地を１０cmのプレートの集密的プロデューサー細胞から収集する。感染性ウイルス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポアフィルターを通して濾過して、脱離したプロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。培地を線維芽細胞の副次(sub)集密的プレートから除去して、プロデューサー細胞から得られた培地に素早く置き替える。この培地を除去して、新たな培地に置き替える。ウイルスの力価が高いならば、実質的には全ての線維芽細胞が感染されるであろし、また選択の必要は全くない。力価が非常に低いならば、neoまたはhisといったような選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。次いで、操作された線維芽細胞を単独で、またはサイトデックス(cytodex)３微担体ビーズ上で密集するまで増殖させた後、宿主に注入する。ここで、その線維芽細胞は、タンパク質産物を製造する。上記の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/22 Ｃ０７Ｋ 16/22 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｔ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者グルーバー，ヨアヒム・アールアメリカ合衆国02167マサチューセッツ州チェスナット・ヒル、ゲリー・ロード47 番 (72)発明者ローゼン，クレイグ・エイアメリカ合衆国20882メリーランド州レイトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸−２１〜アミノ酸１９１を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸１〜アミノ酸１９１を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、また（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント；よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．配列番号１で示されるヌクレオチド６５〜ヌクレオチド６４１を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１４７号に含まれるＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１４７号に含まれるＤＮＡにより発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、また（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント；よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。５．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。６．請求項５に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。７．ポリペプチドを製造する方法であって、該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項６に記載の宿主細胞から発現させることを含んでなる方法。８．ポリペプチドを発現させることができる細胞を製造する方法であって、細胞を請求項５に記載のベクターで遺伝的に操作することを含んでなる方法。９．（ｉ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびそのフラグメント、アナログ、並びに誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１４７号のcＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、並びに誘導体；よりなる群から選択されるメンバーを含んでなるポリペプチド。１０．請求項９に記載のポリペプチドに対する抗体。１１．請求項９に記載のポリペプチドの生物学的作用を阻害する化合物。１２．請求項９に記載のポリペプチドを模倣したアゴニスト。１３．ＦＧＦ−１３ポリペプチドが必要である患者を処置する方法であって、治療上有効な量の、請求項９に記載のポリペプチドを患者に投与することを含んでなる方法。１４．ＦＧＦ−１３ポリペプチドを阻害する必要がある患者を処置する方法であって、治療上有効な量の、請求項１１に記載の化合物を患者に投与することを含んでなる方法。１５．該ポリペプチドをコードするＤＮＡを患者に与えて、該ポリペプチドをインビボにおいて発現させることにより、治療上有効な量の該ポリペプチドを投与する、請求項１３に記載の方法。１６．該化合物がポリペプチドであって、該アンタゴニストをコードするＤＮＡを患者に与えて、該アンタゴニストをインビボにおいて発現させることにより、治療上有効な量の該化合物を投与する、請求項１４に記載の方法。１７．請求項９に記載のポリペプチドに対するアゴニストとして活性な化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞が該ポリペプチドにより正常に刺激される条件下、スクリーニングすべき化合物、および細胞を含む反応混合物(該反応混合物は、細胞が増殖するにつれて細胞へと取り込まれる標識を含む)を混合し；および（ｂ）細胞の増殖の程度を測定して、その化合物が有効なアゴニストであるかどうかを同定することを含んでなる方法。１８．請求項９に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストとして活性な化合物を同定する方法であって、（ａ）細胞が該ポリペプチドにより正常に刺激される条件下、スクリーニングすべき化合物、ポリペプチド、および細胞を含む反応混合物(該反応混合物は、細胞が増殖するにつれて細胞へと取り込まれる標識を含む)を混合し；および（ｂ）細胞の増殖の程度を測定して、その化合物が有効なアンタゴニストであるかどうかを同定することを含んでなる方法。１９．請求項９に記載のポリペプチドの発現不足に関係のある疾患、または疾患に対する感受率を診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を測定することを含んでなる方法。２０．宿主から得られた試料中の請求項９に記載のポリペプチドの存在に関して分析することを含んでなる診断方法。