JPH11507504A - 線維芽細胞増殖因子13 - Google Patents
線維芽細胞増殖因子13Info
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Abstract
(57)【要約】
ヒト線維芽細胞増殖因子−13ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)を開示する。そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法もまた提供する。そのようなポリペプチドを、例えば、熱傷および潰瘍の結果としての、創傷の治癒を促進するために、発作と関連のある、またニューロン障害によるニューロン損傷を防いで、ニューロン増殖を促進するために、また皮膚の老化および毛髪の喪失を防ぐために、初期胚および肢再生における脈管形成、中胚葉誘導を刺激するために利用する方法もまた開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、および異常細胞増殖、血管過多疾患、並びに上皮レンズ細胞増殖を防ぐための治療法としてのそれらの使用もまた開示する。コード配列における変異、および宿主から得られた試料中のポリペプチドの濃度における変化を検出するための診断方法もまた開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
線維芽細胞増殖因子13
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子/ヘパ
リン結合増殖因子として推定的に同定され、以下で「FGF−13」と呼ぶ。本
発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。
線維芽細胞増殖因子は、ヘパリンに結合することを特徴とするタンパク質のフ
ァミリーの1つであり、従って、ヘパリン結合増殖因子(HBGF)ともまた呼ば
れる。これらのタンパク質の異なったメンバーの発現は、様々な組織において見
い出され、また特定の時間的および空間的制御下にある。これらのタンパク質は
、線維芽細胞、角膜並びに血管内皮細胞、顆粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋
原細胞、血管平滑筋細胞、レンズ上皮細胞、メラニン細胞、角化細胞、乏突起神
経膠細胞、星状膠細胞、骨芽細胞、および造血細胞を含め、中胚葉、外胚葉、お
よび内胚葉起源の様々な細胞に対する強力なマイトジェンである。
各々のメンバーは、他のメンバーと重複した機能を有し、その独自の機能スペ
クトルもまた有する。血管内皮細胞の増殖を刺激する能力の他に、FGF−1お
よび2は両方とも、内皮細胞に対して走化性であり、またFGF−2は、内皮細
胞が基底膜を貫通するのを可能とすることが示された。これらの性質と一致して
、FGF−1および2は両方とも、脈管形成を刺激する能力を有する。これらの
増殖因子の別の重要な特徴は、創傷の治癒を促進する、それらの能力である。F
GFファミリーの多くの他のメンバーは、脈管形成および創傷の治癒を促進する
といったような、FGF−1および2と同様の活性を共有する。FGFファミリ
ーの幾つかのメンバーは、中胚葉形成を誘導して、ニューロン細胞、脂肪細胞、
および骨格筋細胞の分化を変化させることが示された。
正常な組織における、これらの生物学的活性以外に、FGFタンパク質は、腫
瘍血管新生を促進することにより、またそれらの発現が脱調節されている場合に
は、トランスフォーミングタンパク質として、癌腫および肉腫での腫瘍形成を促
進することと関係している。
FGFファミリーは現在、8つの構造上関係のあるポリペプチド:塩基性FG
F、酸性FGF、int 2、hst 1/k−FGF、FGF−5、FGF−6、角化
細胞増殖因子、AIGF(FGF−8)からなっており、最近、神経膠活性化因子
は、ヒト神経膠腫細胞系の培養上清から精製された新規ヘパリン結合増殖因子で
あることが示された(Miyamoto,M.ら、Mol.and Cell.Biol.、13(7)
:4251−4259(1993))。各々の遺伝子がクローン化されて、配列
決定されている。そのメンバーの2つ、FGF−1およびFGF−2は、多くの
名称で、しかし、最も多くは、各々、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子とし
て特徴付けられている。正常な遺伝子産物は、大部分の中胚葉および神経外胚葉
由来の細胞の一般的な増殖能力に影響を及ぼす。それらは、インビボにおいて脈
管形成を誘導することができ、また初期発生において重要な役割を果たし得る(
Burgess,W.H.およびMaciag,T.、Annu.Rev.Biochem.、58:57
5−606(1989))。
先に同定したFGFファミリーのメンバーの多くはまた、同じ受容体にも結合
し、これらの受容体に結合することによって、第二メッセージを誘起する。
分泌型のFGF−1をコードする真核発現ベクターは、ブタ動脈中への遺伝子
移入により導入された。このモデルは、インビボにおける動脈壁での遺伝子機能
を明らかにする。FGF−1発現は、遺伝子移入から21日後、ブタ動脈におけ
る内膜肥厚を誘導した(Nabel,E.G.ら、Nature、362:844−6(1
993))。塩基性線維芽細胞増殖因子は、腫瘍脈管形成における、その役割と
は無関係に、神経膠腫増殖および進行を調節し得ること、また塩基性線維芽細胞
増殖因子の放出または分泌は、これらの作用に必要とされ得ることがさらに実証
されている(Morrison,R.S.ら、J.Neurosci.Res.、34:502−9
(1993))。
塩基性FGFのような線維芽細胞増殖因子はさらに、インビトロにおけるカポ
ジ肉腫細胞の増殖と関係している(Huang,Y.Q.ら、J.Clin.Invest.、
91:1191−7(1993))。そしてまた、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因
子をコードするcDNA配列は、バクテリオファージ T7 RNAポリメラーゼ
により認識される転写プロモーターの下流にクローン化された。そのようにして
得られた塩基性線維芽細胞増殖因子は、分裂誘発性、プラスミノーゲンアクチベ
ーターの合成、および脈管形成アッセイにおいて、ヒト胎盤線維芽細胞増殖因子
とは区別できない生物学的活性を有することが示された(Squires,C.H.ら、
J.Biol.Chem.、263:16297−302(1988))。
米国特許第5,155,214号は、実質的に純粋な哺乳動物塩基性線維芽細胞
増殖因子、およびそれらの製造を開示している。ウシおよびヒト塩基性線維芽細
胞増殖因子のアミノ酸配列、さらにはまた、ウシ種の該ポリペプチドをコードす
るDNA配列が開示されている。
新たに発見されたFGF−9は、FGFファミリーの他のメンバーに対して約
30%の配列類似性を有する。ファミリーメンバーにおける2つのシステイン残
基および他の共通配列もまた、FGF−9配列において十分保存された。FGF
−9は、酸性および塩基性FGFでのように、そのN末端に典型的なシグナル配
列を全く有していないことが見い出された。しかし、FGF−9は、その典型的
なシグナル配列 FGFの欠損にもかかわらず、合成後の細胞から分泌されるこ
とが見い出された(Miyamoto,M.ら、Mol.and Cell.Biol.、13(7):
4251−4259(1993))。さらに、FGF−9は、乏突起神経膠細胞
2型 星状膠細胞の始原細胞、BALB/c3T3、およびPC−12細胞の細胞
増殖を刺激するが、ヒト臍静脈内皮細胞の細胞増殖は刺激しないことが見い出さ
れた(Naruo,K.ら、J.Biol.Chem.、268:2857−2864(19
93))。
塩基性FGFおよび酸性FGFは、細胞増殖、細胞運動、分化、および生存の
強力なモジュレーターであり、外胚葉、中胚葉、および内胚葉由来の細胞タイプ
に対して作用する。これらの2つのFGFは、KGFおよびAIGFと共に、タ
ンパク質精製により同定された。しかし、他の4つのメンバーは、腫瘍遺伝子と
して単離され、この発現は、胚形成およびあるタイプの癌に制限された。FGF
−9は、神経膠細胞に対するマイトジェンであることが実証された。FGFファ
ミリーのメンバーは、腫瘍形成能力を有することが報告されている。FGF−9
は、BALB/c3T3細胞へとトランスフォームした場合には、トランスフォ
ームする能力を示した(Miyamoto,M.ら、Mol.Cell.Biol.、13(7):
4251−4259(1993))。
FGF−8としてもまた知られているアンドロゲン誘導増殖因子(AIGF)は
、テストステロンで刺激されたマウス乳癌細胞(SC−3)のコンディションド培
地から精製された。AIGFは、特徴のあるFGF様増殖因子であり、推定され
るシグナルペプチドを有し、またFGFファミリーの既知のメンバーと30−4
0%の相同性を共有する。AIGFでトランスフォームされた哺乳動物細胞は、
アンドロゲンの不存在下、SC−3細胞の増殖に対して著しい刺激効果を示す。
従って、AIGFは、それが腫瘍細胞自体により分泌されることから、SC−3
細胞、およびことによると他の細胞のアンドロゲン誘導増殖を媒介する。
本発明のポリペプチドは、FGFファミリーの他のメンバーとのアミノ酸配列
の相同性の結果として、FGFファミリーのメンバーとして推定的に同定されて
いる。
本発明の一態様により、新規成熟ポリペプチド、さらにはまた、生物学的に活
性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメント、アナログ、および
誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。
本発明の別の態様により、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含め、
本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、さらにはまた、その
アンチセンスアナログ、および生物学的に活性であって、診断上または治療上有
用な、そのフラグメントを提供する。
本発明のさらに別の態様により、本発明のポリペプチドの組換え製造における
試薬として有用な、クーロニングおよび発現プラスミドといったような組換えベ
クター、さらにはまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでな
る組換え原核および/または真核宿主細胞の使用によって、そのようなポリペプ
チドを組換え技術により製造する方法を提供する。
本発明のさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それに対するアゴニストおよびア
ンタゴニストに関してスクリーニングするために、また治療目的に、例えば、熱
傷および潰瘍の結果としての、例えば、創傷の治癒を促進するために、発作と関
連のある、またニューロン障害によるニューロン損傷を防いで、ニューロン増殖
を促進するために、また皮膚の老化および毛髪喪失を防ぐために、初期胚および
肢再生における脈管形成および中胚葉誘導を刺激するために利用する方法を提供
する。
本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提
供する。
本発明のまた別の態様により、例えば、細胞トランスフォーメーション、例え
ば、腫瘍の処置において、そのようなポリペプチドの作用を阻害するための、瘢
痕形成(scarring)を減少させて、血管過多疾患を処置するための、そのようなポ
リペプチドに対するアンタゴニスト、およびそれらの使用方法を提供する。
本発明の別の態様により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プ
ローブを提供する。
本発明のまた別の態様により、本発明の核酸配列における変異に関係のある疾
患、または疾患に対する感受率を検出するための、またそのような配列によりコ
ードされるポリペプチドの過剰発現を検出するための診断アッセイを提供する。
本発明の別の態様により、科学調査、DNAの合成、およびDNAベクターの
製造に関係のあるインビトロにおける目的に、そのようなポリペプチド、または
そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供す
る。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら
かであろう。
次の図面は、本発明の具体的な態様の説明としてのみ記載するものであって、
いかようにも限定として記載するものではない。
第1図は、FGF−13のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示
す。最初の21個のアミノ酸残基は、推定されるリーダー配列を表す。
本発明の一態様により、第1図(配列番号2)の推定アミノ酸配列を有する成熟
ポリペプチド、または1995年5月12日にATCC寄託番号第97147号
として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコ
ードする、単離された核酸分子(ポリヌクレオチド)を提供する。
本発明のFGF−13をコードするポリヌクレオチドは、ヒト卵巣癌組織から
得られたcDNAライブラリー中で発見された。該FGF−13ポリペプチドは
、構造上、線維芽細胞増殖因子ファミリーの全てのメンバーに関係があり、また
212個のアミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム
を含み、このうち、最初の21個のアミノ酸は推定されるリーダー配列を表すこ
とから、成熟ポリペプチドは191個のアミノ酸を含んでなる。トップのうち、
適合は、1)マウスAIGFに対して、185個のアミノ酸範囲にわたり、69
%の同一性および81%の類似性;2)ニワトリ由来のFGF−4と、82個の
アミノ酸の領域で、30%の同一性および56%の類似性;3)ヒトKGFと、
78個のアミノ酸範囲にわたり、41%の同一性および64%の類似性である。
FGF/HBGFファミリーのサイン(signature)、GXLX(S,T,A,G)X
6(D,E)CXFXEは、本発明のポリペプチドにおいて保存される(Xはいずれ
かのアミノ酸残基を意味し;(D,E)はDまたはE残基のいずれかを意味し;X
6はいずれかの6つのアミノ酸残基を意味する)。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形で、またはDNAの形であり得、こ
のDNAには、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれる。該DN
Aは、二本鎖または一本鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配
列は、第1図(配列番号1)に示すコード配列もしくは寄託されたクローンのコー
ド配列と同じであってよく、または遺伝コードの重複または縮重の結果として、
第1図(配列番号1)のDNAもしくは寄託されたcDNAと同じ成熟ポリペプチ
ドをコードする異なったコード配列であってもよい。
第1図(配列番号2)の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcDNAによりコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含
まれ得る:成熟ポリペプチドのコード配列のみ;成熟ポリペプチドのコード配列
、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付
加的コード配列;成熟ポリペプチドのコード配列(また場合により、付加的コー
ド配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配
列5'および/または3'といったような非コード配列。
従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリ
ペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的
コードおよび/または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、第1図(配列番号2)の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドまたは寄託されたクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラ
グメント、アナログ、および誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変
異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在す
るアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る
。
従って、本発明には、第1図(配列番号2)に示すのと同じ成熟ポリペプチドま
たは寄託されたクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変
異体が含まれ、これらの変異体は、第1図(配列番号2)のポリペプチドまたは寄
託されたクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、
誘導体、またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠
失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。
先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第1図(配列番号1)に示すコード
配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天
然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られている
ように、アレル変異体は、1つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失また
は付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされる
ポリペプチドの機能を実質的には変えない。
本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプ
チドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリ
ペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ
読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリ
ペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポ
リペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドは
また、付加的5'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質も
コードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また
不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク
質が残る。
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ
配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方
を有するタンパク質をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする
マーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そ
のマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するため
の、pQE−9ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であって
よく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、COS−7細胞を使用する場合
には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(HA)タグであってよい。HAタグは
、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(
Wilson,I.ら、Cell、37:767(1984))。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の製造に関与するDNAのセグメン
トを意味し;それには、コード領域より前および後の領域(リーダーおよびトレ
ーラー)、さらにはまた、個々のコードセグメント(エキソン)間の介在配列(イン
トロン)が含まれる。
完全な長さのFGF−13遺伝子のフラグメントは、完全な長さの遺伝子を単
離するために、また該遺伝子に対して高い配列類似性、または類似の生物学的活
性を有する他の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリーに対するハイブ
リダイゼーションプローブとして使用することができる。このタイプのプローブ
は、好ましくは少なくとも30塩基を有し、例えば、50またはそれ以上の塩基
を含むのがよい。該プローブはまた、完全な長さの転写物、およびゲノムクロー
ン、または調節並びにプロモーター領域、エキソン、およびイントロンが含まれ
る、完全なFGF−13遺伝子を含むクローンに対応するcDNAクローンを同
定するのに使用することもできる。スクリーニングの例は、既知のDNA配列を
使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、FGF−13遺伝
子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補的な
配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトのcDNA、ゲノムDNAまた
はmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラリー
のどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。
本発明はさらに、配列間に少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、
またさらに好ましくは少なくとも95%の同一性がある場合に、上記の配列にハ
イブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント
条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列
間に少なくとも95%、また好ましくは少なくとも97%の同一性がある場合に
のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様
では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第1
図(配列番号1)のcDNAまたは寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポリ
ペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的にはいずれか保有するポリペプ
チドをコードする。
あるいはまた、該ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズし、また上記のように、それに対して同一性を有し、また活性を保有し得
るか、または保有し得ない、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩
基、またさらに好ましくは少なくとも50塩基を有するのがよい。例えば、その
ようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの回収のための、配列番
号1のポリヌクレオチドに対するプローブとして、または診断プローブとして、
またはPCRプライマーとして使用することができる。
従って、本発明は、配列番号2のポリペプチド、さらにはまた、そのフラグメ
ント(このフラグメントは、少なくとも30塩基、また好ましくは少なくとも5
0塩基を有する)をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同
一性、好ましくは少なくとも90%、またさらに好ましくは少なくとも95%の
同一性を有するポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドに関する。
本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダ
ペスト条約の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に便宜として与えら
れるものであって、寄託が35 U.S.C.§112下に要求されることを承認
するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さら
にはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の
一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照
合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾
が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。
本発明はさらに、第1図(配列番号2)の推定アミノ酸配列を有する、または寄
託されたcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するFGFポリペプチド
、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘
導体に関する。
第1図(配列番号2)のポリペプチドまたは寄託されたcDNAによりコードさ
れるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ
」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活
性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン
部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造すること
ができるプロプロテインが含まれる。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成
ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。
第1図(配列番号2)のポリペプチドまたは寄託されたcDNAによりコードさ
れるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)1つまた
はそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型
アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コー
ドによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくても
よいもの、(ii)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、
または(iii)成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合
物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの
、または(iv)リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使
用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成
熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導
体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供される
のが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。
「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存
在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きて
いる動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離され
ていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同
じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは単離されている。そのよ
うなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および/またはそのようなポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベ
クターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離され
ている。
本発明のポリペプチドには、配列番号2のポリペプチド(特に、成熟ポリペプ
チド)、さらにはまた、配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも70%の
類似性(好ましくは少なくとも70%の同一性)、またさらに好ましくは配列番号
2のポリペプチドに対して90%の類似性(さらに好ましくは少なくとも90%
の同一性)、またなおさらに好ましくは配列番号2のポリペプチドに対して少な
くとも95%の類似性(なおさらに好ましくは少なくとも95%の同一性)を有す
るポリペプチドが含まれ、通例、少なくとも30個のアミノ酸、またさらに好ま
しくは少なくとも50個のアミノ酸を含む、そのようなポリペプチドの部分をも
つ、そのようなポリペプチドの部分もまた含まれる。
当業界で知られているように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、1つの
ポリペプチドのアミノ酸配列およびその同類的アミノ酸置換物を、もう1つのポ
リペプチドの配列と比較することにより測定する。
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、対応する完全な長さのポ
リペプチドをペプチド合成により製造するために使用することができ;従って、
そのフラグメントは、完全な長さのポリペプチドを製造するための中間体として
使用することができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を
使用して、本発明の完全な長さのポリヌクレオチドを合成することができる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベク
ターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術
による製造にも関する。
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本
発明のベクターで遺伝的に操作することができる(トランスデュースし、または
トランスフォームし、またはトランスフェクトすることができる)。該ベクター
は、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作され
た宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、また
はFGF遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養する
ことができる。温度、pH等といったような培養条件は、発現用に選択された宿
主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。
本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用
することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチド配列を、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ビヒクル、特にベクターまたはプラスミドのいずれ
か1つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体お
よび合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体;細菌プラスミド;ファージD
NA;酵母プラスミド;プラスミドとファージDNAとの組合せから得られるベ
クター;ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったよう
なウイルスDNAが含まれる。しかし、他のいずれのベクターまたはプラスミド
も、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することが
できる。
適当なDNA配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般
には、DNA配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思わ
れる。
発現ベクターのDNA配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能
に結合し、mRNA合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、
以下のものが挙げられる:LTRまたはSV40プロモーター、E.coli.lac
またはtrp、ファージラムダPLプロモーター、および原核もしくは真核細胞また
はそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモ
ーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写
終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。
さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダク
ターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはE.coliではテトラサイ
クリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細
胞の選択のための表現型特性を与えるために、1つの遺伝子を含むのが好ましい
。
上記のような適当なDNA配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制
御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、
その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代
表例として、以下のものが挙げられる:E.coli、Salmonella typhimurium、Streptomyces
といったような細菌細胞;酵母のような真菌細胞;Drosophila S2
およびSpodoptera Sf9といったような昆虫細胞;CHO、COS、また
はBowesメラノーマといったような動物細胞;アデノウイルス;植物細胞等。適
当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を1つまたはそれ以上含ん
でなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向
で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクター
を含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、
該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当
なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている
。次のベクターを例として挙げる。細菌用:pQE70、pQE60、pQE−9(
Qiagen)、pBS、ファージスクリプト(phagescript)、psiX174、pBluescr
ipt SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Strata
gene);pTRC99A、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pR
IT5(Pharmacia)。真核生物用:pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1
、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。
しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能
であって、生存可能である限り、使用することができる。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝
子から選択することができる。2つの適当なベクターは、PKK232−8およ
びPCM7である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacI、lacZ、
T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには
、CMV即時初期(immediate early)、HSVチミジンキナーゼ、初期および後
期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスのメタロチオネイン−
Iが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレ
ベルの範囲内である。
さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿
主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞
であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物
の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デ
キストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行う
ことができる。(Davis,L.、Dibner,M.、Battey,L.、Basic Methods
in Molecular Biology(1986))。
宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる
遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌
、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発
明のDNA構築物から得られるRNAを用いて製造するために、無細胞翻訳系も
また使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual、第2版(Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989)によ
り記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、エン
ハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロ
モーターに作用してその転写を増加させる、通常、約10〜300bpの、DNA
のシス作用性要素である。例には、複製開始点の後期側にあるSV40エンハン
サー(bp 100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ
ー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが含まれる。
通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォ
ーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、E.coliのアンピシリ
ン耐性遺伝子並びにS.cerevisiae TRP1遺伝子、および下流の構造配列の
転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含ま
れるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、3−ホスホグリセリン酸
キナーゼ(PGK)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱
ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス
構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質
の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と
共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、
所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与
えるN−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる
。
細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構
造DNA配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモー
ターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。その
ベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、1つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカー
および複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原
核宿主には、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、およ
びPseudomonas属、Streptomyces属、並びにStaphylococcus属の範囲内の様々
な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。
代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは
、周知のクローニングベクター pBR322(ATCC 37017)の遺伝要素
を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の
複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pKK
223−3(Pharmacia Fine Chemicals、Uppsala、スウェーデン)およびpG
EM1(Promega Biotec、Madison、WI、米国)が含まれる。これらのpBR
322「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合
わせる。
適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度
まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフト
または化学誘導)により抑制解除して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により
破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理
、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊
することができる。
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用
することができる。哺乳動物発現系の例には、Gluzman、Cell、23:175
(1981)により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のCOS−7系、お
よび適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、C12
7、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベク
ターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの
必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアク
セプター部位、転写終結配列、および5'に隣接する非転写配列もまた含んでな
るであろう。SV40のウイルスゲノム、例えば、SV40の開始点、初期プロ
モーター、エンハンサー、スプライシングから得られるDNA配列、およびポリ
アデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる
。
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグ
ラフィーを含め、現在まで使用されている方法により、組換え細胞培養物から回
収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟
タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液
体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製工程に使用することができる。
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物
であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造するこ
とができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、
哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化され得るか、またはグ
ルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミ
ノ酸残基が含まれ得る。
本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、血
栓症、動脈硬化症、および他の心臓血管状態といったような、様々な疾患状態に
よる虚血組織の脈管再生を刺激するための処置において使用することができる。
これらのポリペプチドはまた、脈管形成および肢再生を刺激するために使用する
こともできる。
該ポリペプチドはまた、それらが線維芽細胞および骨格筋細胞といったような
、異なった起源の様々な細胞に対して分裂誘発性であり、従って、損傷を受けた
、または疾患に罹った組織の修復または置換を促進することから、負傷、熱傷、
手術後の組織修復、および潰瘍による創傷を処置するために使用することもでき
る。
本発明のポリペプチドはまた、ニューロン増殖を刺激するために、また発作と
関連のある、またアルツハイマー病、パーキンソン病、およびAIDS関係コン
プレックスといったような、あるニューロン障害または神経変性状態において起
こるニューロン損傷を処置する、また防ぐために使用することもできる。FGF
−13は、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し、従って、それらは、骨および歯
周再生を高めて、組織移植片または骨移植片を補助するために使用することがで
きる。
本発明のポリペプチドはまた、角化細胞増殖を刺激することにより、日焼けに
よる皮膚の老化を防ぐために使用することもできる。
該FGF−13ポリペプチドはまた、FGFファミリーメンバーが毛髪形成細
胞を活性化して、メラニン細胞増殖を促進することから、毛髪の喪失を防ぐため
に使用することもできる。同じ観点から(along the same lines)、本発明のポリ
ペプチドは、他のサイトカインと組み合わせて使用する場合、造血細胞および骨
髄細胞の増殖および分化を刺激するために使用することができる。
該FGF−13ポリペプチドはまた、移植前に臓器を保持するために、または
一次組織の細胞培養を支持するために使用することもできる。
本発明のポリペプチドはまた、初期胚において中胚葉起源の組織を誘導して分
化するために使用することもできる。
本発明のまたさらなる態様により、科学調査、DNAの合成、DNAベクター
の製造に関係のあるインビトロにおける目的に、またヒト疾患の処置に対する診
断法および治療法を提供する目的に、そのようなポリペプチド、またはそのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。
本発明は、本発明のポリペプチドの受容体の同定方法を提供する。該受容体を
コードする遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リガンドパン
ニングおよびFACS選別により同定することができる(Coliganら、Current
Protocols in Immun.、1(2)、第5章、(1991))。好ましくは、発現
クローニングを使用し、ここでは、ポリアデニル化RNAを該ポリペプチドに応
答する細胞、例えば、FGFファミリータンパク質の複合受容体を含むことが知
られているNIH3T3細胞、およびSC−3細胞から調製して、このRNAか
ら作られるcDNAライブラリーをプールに分けて、COS細胞または該ポリペ
プチドに応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラスス
ライド上で増殖させた、トランスフェクトされた細胞を、標識化した後の本発明
のポリペプチドにさらす。該ポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的プロテ
インキナーゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法により標識化すること
ができる。
固定およびインキュベーションに続いて、そのスライドをオートラジオグラフ
分析にかける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製し、反復サブプーリ
ングおよび再スクリーニング方法を使用して、再びトランスフェクトし、最終的
には、推定される受容体をコードする単一クローンを得る。
受容体を同定するための他の方法として、標識化ポリペプチドを細胞膜と光親
和性により結合させるか、または受容体分子を発現する調製物を抽出することが
できる。橋かけ(cross-linked)物質をPAGE分析により分けて、X線フィルム
にさらす。該ポリペプチドの受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラ
グメントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけることができる。ミクロ配
列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプ
ローブを設計し、cDNAライブラリーをスクリーニングして、推定される受容
体をコードする遺伝子が同定されるであろう。
本発明は、化合物をスクリーニングして、本発明のポリペプチドの作用を変化
させる化合物を同定する方法を提供する。そのようなアッセイの例は、線維芽細
胞が正常に増殖するであろう細胞培養条件下、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポ
リペプチド、スクリーニングすべき化合物、および3[H]チミジンを混合するこ
とを含んでなる。対照アッセイをスクリーニングすべき化合物の不存在下に行い
、該化合物の存在下における線維芽細胞増殖の量と比較して、各々の場合におけ
る3[H]チミジンの摂取を測定することにより、該化合物が増殖を刺激するかど
うかを決定することができる。線維芽細胞増殖の量は、3[H]チミジンの取り込
みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定する。アゴニ
ストおよびアンタゴニスト化合物は両方とも、この方法により同定することがで
きる。
別の方法では、該化合物の存在下、本発明のポリペプチドの受容体を発現する
哺乳動物細胞または膜調製物を標識化した本発明のポリペプチドと共にインキュ
ベートする。次いで、この相互反応を高める、またはブロックする化合物の能力
を測定することができる。あるいはまた、スクリーニングすべき化合物とFGF
−13受容体との相互反応後の、既知の第二メッセンジャーシステムの応答を測
定し、該受容体に結合して、第二メッセンジャー応答を誘起する該化合物の能力
を測定して、該化合物が可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストであるか
どうかを決定する。そのような第二メッセンジャーシステムには、限定されるも
のではないが、cAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホス
ホイノシチド加水分解が含まれる。
アンタゴニスト化合物の例には、抗体、また幾つかの場合には、本発明のポリ
ペプチドの受容体に結合するが、第二メッセンジャー応答は全く誘起せず、また
はFGF−13ポリペプチド自体に結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。あ
るいはまた、可能性のあるアンタゴニストは、該受容体に結合するが、第二メッ
センジャー応答は全く誘起せず、従って、該ポリペプチドの作用を有効にブロッ
クする変異型のポリペプチドであり得る。
FGF−13遺伝子および遺伝子産物に対する別のアンタゴニスト化合物は、
アンチセンス技術を使用して製造されたアンチセンス構築物である。アンチセン
ス技術を使用して、三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAに
よって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチ
ドのDNAまたはRNAへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチド
をコードする、ポリヌクレオチド配列の5'コード部分を使用して、長さ約10
〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリ
ゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し
(三重らせん−Leeら、Nucl.Acids Res.、6:3073(1979);Coo
neyら、Science、241:456(1988);およびDervanら、Science、
251:1360(1991)を参照)、そのことによって、転写および本発明
のポリペプチドの産生を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、イ
ンビボにおいてmRNAにハイブリダイズして、mRNA分子のポリペプチドへの
翻訳をブロックする(Antisense−Okano、J.Neurochem.、56:560(1
991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Exp
ression、CRC Press、Boca Raton、FL(1988))。上記のオリゴヌ
クレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスRNAまたはDNA
をインビボにおいて発現させて、該ポリペプチドの産生を阻害することができる
。
可能性のあるアンタゴニスト化合物にはまた、該受容体の結合部位に結合して
占有し、そのことによって、該受容体をそのポリペプチドに近づき難くすること
から、正常な生物学的活性を妨げる小さな分子も含まれる。小さな分子の例には
、限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる
。
アンタゴニスト化合物は、本発明のポリペプチドの、新生細胞および組織に及
ぼす細胞成長および増殖効果、すなわち、腫瘍の脈管形成の刺激を阻害し、従っ
て、例えば、腫瘍形成または増殖における、異常細胞成長および増殖を遅延する
、または妨げるために使用することができる。
該アンタゴニストはまた、血管過多疾患を防いで、嚢外白内障手術後の上皮レ
ンズ細胞の増殖を防ぐために使用することもできる。本発明のポリペプチドの分
裂誘発活性の防止はまた、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合にも望ま
しい。
該アンタゴニストはまた、創傷の治癒の間の瘢痕組織の増殖を防ぐために使用
することもできる。
該アンタゴニストはまた、薬学上許容され得る担体、例えば、以下に記載する
ような担体と共に、組成物中で使用することもできる。
本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、非経口投与の
ための医薬組成物をなすために、適当な薬学的担体と組み合わせて使用すること
ができる。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、アゴニスト、
またはアンタゴニスト、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでな
る。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝
化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれら
の組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を1つまたはそれ以上充填した、1
つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ
のような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を
規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに
、本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、他の治療化合
物と共に使用することができる。
該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または
皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は
、具体的な徴候を処置および/または予防するのに有効な量で投与される。一般
に、それらは、少なくとも約10μg/kg(体重)の量で投与され、最も多くの場
合、それらは、1日当り約8mg/kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。
最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約10
μg/kg〜約1mg/kg(体重)である。局所投与の具体的な場合には、用量は、1c
m2当り約0.1μg〜9mgを投与するのが好ましい。
本発明のポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニスト並びにアンタゴ
ニスト化合物はまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペ
プチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することもできる。
従って、例えば、細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド(DNAまたはRNA)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで
処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本
発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子の使用によっ
て、細胞を当業界で既知の方法により操作することができる。
同様に、例えば、当業界で既知の方法により、該ポリペプチドのインビボにお
ける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知
られているように、細胞をインビボにおいて処理して、ポリペプチドをインビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そ
のような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および
他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以外のもの、例えば、適当な運搬
ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用するこ
とができるアデノウイルスであってもよい。
上述のレトロウイルスプラスミドベクターを得ることができるレトロウイルス
には、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイ
ルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、
テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖
性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスといったようなレトロウイルスが含まれる
。一態様では、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウ
イルスから得られる。
該ベクターには、1つまたはそれ以上のプロモーターが含まれる。使用するこ
とができる適当なプロモーターには、限定されるものではないが、レトロウイル
スLTR;SV40プロモーター;およびMillerら、Biotechniques、第7巻
、第9号、980−990(1989)に記載されているヒトサイトメガロウイ
ル
ス(CMV)プロモーター、またはいずれかの他のプロモーター(例えば、限定さ
れるものではないが、ヒストン、pol III、およびβ−アクチンプロモーターが
含まれる、真核細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター)が含まれる。
使用することができる他のウイルスプロモーターには、限定されるものではない
が、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およ
びB19パルボウイルスプロモーターが含まれる。適当なプロモーターの選択は
、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかであろう。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下
にある。使用することができる適当なプロモーターには、限定されるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモータ
ー;またはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのようなヘテロロガスプ
ロモーター;呼吸合胞体ウイルス(RSV)プロモーター;MMTプロモーター、
メタロチオネインプロモーターといったような誘導可能なプロモーター;熱ショ
ックプロモーター;アルブミンプロモーター;ApoAIプロモーター;ヒトグロ
ビンプロモーター;単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイル
スチミジンキナーゼプロモーター;レトロウイルスLTR(上記の修飾されたレ
トロウイルスLTRが含まれる);β−アクチンプロモーター;およびヒト成長
ホルモンプロモーターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。
レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、プロデューサー細胞系を形成
するためにパッケージング細胞系をトランスデュースする。トランスフェクトす
ることができるパッケージング細胞の例には、限定されるものではないが、PE
501、PA317、ψ−2、ψ−AM、RA12、T19−14X、VT−1
9−17−H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E−86、GP+envAm12、
およびMiller、Human Gene Therapy、第1巻、5−14頁(1990)(こ
れに記載されている内容は全て、本発明の一部を構成する)に記載されているD
AN細胞系が含まれる。該ベクターは、当業界で知られている方法のいずれかに
よって、パッケージング細胞をトランスデュースすることができる。そのような
方法には、限定されるものではないが、電気穿孔、リポソームの使用、およびC
aPO4沈降が含まれる。1つの他の方法では、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーをリポソームに封入する、または脂質に結合させた後、宿主に与えることがで
きる。
該プロデューサー細胞系は、該ポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる
感染性レトロウイルスベクター粒子を発生させる。次いで、そのようなレトロウ
イルスベクター粒子を使用して、真核細胞をインビトロまたはインビボのいずれ
かにおいてトランスデュースすることができる。トランスデュースされた真核細
胞は、該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。トランスデュ
ースすることができる真核細胞には、限定されるものではないが、胚幹細胞、胚
癌細胞、さらにはまた、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角質細胞
、内皮細胞、および気管支上皮細胞が含まれる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列における変異の存
在に関係がある疾患、または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイ
の一部としての、本発明の遺伝子の使用にも関する。
本発明の遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、DN
Aレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、
血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムDNA
は、検出のために直接使用することができ、または分析前にPCR(Saikiら、
Nature、324:163−166(1986))を使用することにより、酵素的
に増幅することができる。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的に使用するこ
とができる。例としては、本発明のポリペプチドをコードする核酸に相補的なP
CRプライマーを使用して、変異を同定して分析することができる。例えば、欠
失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化に
より検出することができる。点変異は、増幅されたDNAが、放射能標識化した
RNA、あるいはまた、放射能標識化したアンチセンスDNA配列にハイブリダ
イズすることにより同定することができる。完全に対合している配列は、RNア
ーゼ A 消化により、または融解温度の相違により、対合していない複式物(dup
lexes)と区別することができる。
DNA配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲル
でのDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げる
ことができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視
覚化することができる。DNAフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジング
ラジエントゲルを変性することで区別することができ、ここでは、様々なDNA
フラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により
、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Myersら、Science、230
:1242(1985)を参照)。
特定の位置での配列変化もまた、RNアーゼおよびS1保護といったようなヌ
クレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、
Cottonら、PNAS、USA、85:4397−4401(1985))。
従って、特異的なDNA配列の検出は、ゲノムDNAのハイブリダイゼーショ
ン、RNアーゼ保護、化学切断、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用(
例えば、制限酵素断片長多型(RFLP))、およびサザンブロッティングとい
ったような方法により成し遂げることができる。
さらに従来的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、in
situ 分析により検出することもできる。
本発明はまた、正常な対照の組織試料と比較しての該タンパク質の過剰発現が
、異常細胞増殖、例えば、腫瘍の存在を検出することができることから、様々な
組織におけるFGF−13タンパク質レベルの変化を検出するための診断アッセ
イにも関する。宿主から得られた試料中のタンパク質レベルを検出するために使
用されるアッセイは当業者に周知であって、ラジオイムノアッセイ、競合結合ア
ッセイ、ウェスタンブロット分析、ELISAアッセイ、および「サンドイッチ
」アッセイが含まれる。ELISAアッセイ(Coliganら、Current Protocols
in Immunology、1(2)、第6章、(1991))は、まず最初に、本発明の
ポリペプチドに対する抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調
製することを含んでなる。さらに、リポーター抗体を、そのモノクローナル抗体
に
対して調製する。そのリポーター抗体に、放射能、蛍光、または本実施例では、
ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような、検出可能な試薬を結合させる。試
料を宿主から取り除いて、試料中のタンパク質を結合する固形保持体、例えば、
ポリスチレン皿の上でインキュベートする。次いで、ウシ血清アルブミンのよう
な、非特異的なタンパク質と共にインキュベートすることにより、その皿の上の
空いているタンパク質結合部位を全て覆う。次に、モノクローナル抗体を皿にお
いてインキュベートするが、その間に、そのモノクローナル抗体は、ポリスチレ
ン皿に結合した全ての本発明のポリペプチドに結合する。結合しなかったモノク
ローナル抗体を全て、緩衝液で洗い流す。ワサビペルオキシダーゼに結合したリ
ポーター抗体を直ちに皿に置くと、リポーター抗体の、問題のタンパク質に結合
した全てのモノクローナル抗体への結合が起こる。
次いで、結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。次いで、ペルオキシダー
ゼ基質を皿に加えて、一定時間に発生した色の量は、標準曲線に対して比較する
場合、患者の試料の一定体積中に存在する本発明のポリペプチドの量の測定値で
ある。
競合アッセイを使用することができ、ここでは、本発明のポリペプチドに特異
的な抗体を固形保持体に結合させて、標識化したFGF−13および宿主から得
られた試料を固形保持体上に通過させて、例えば、液体シンチレーションクロマ
トグラフィーにより検出される標識の量を、試料中の本発明のポリペプチドの量
に関連づけることができる。
「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに似ている。「サンドイッ
チ」アッセイでは、本発明のポリペプチドを固形保持体上に通過させて、固形保
持体に結合した抗体に結合させる。次いで、第二抗体を、問題のポリペプチドに
結合させる。標識化され、また第二抗体に特異的な第三抗体を固形保持体上に通
過させて、第二抗体に結合させた後、量を定量することができる。
本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色
体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで
きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配
列データ(反復多型性の)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置
をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるDNAの染色体へのマ
ッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階
である。
簡単に言えば、cDNA由来のPCRプライマー(好ましくは、15−25bp)
を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。3'非翻訳領
域のコンピューター分析を使用して、ゲノムDNA中の1つ以上のエクソンをス
パン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なもの
とする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブ
リッドのPCRスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を
含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう
。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に帰
属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
の本発明を使用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい
ゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成
することができる。その染色体へマップするのに同様に使用することができる他
のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソー
ティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特
異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
セレクションが含まれる。
cDNAクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼ
ーション(FISH)を使用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができ
る。この技術は、50または60塩基という短いcDNAで使用することができ
る。この技術の復習には、Vermaら、Human Chromosomes:a Manual of Bas
ic Techniques、Pergamon Press、ニューヨーク(1988)を参照。
ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的
位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え
ば、V.McKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins Uni
versity Welch Medical Libraryを介してオンラインで利用できる)に見い出
される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係
を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認す
る。
次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcDNAまたはゲノ
ム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全
てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、そ
の変異は疾患の原因となるものであるらしい。
現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の分析から、疾患と関連
する染色体領域に正確に局在化したcDNAは、50〜500の可能な原因とな
る遺伝子の1つとなり得るであろう。(これは、1メガベースのマッピング分析
および20kb当り1つの遺伝子を仮定する)。
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらの
アナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対す
る抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト
化抗体、さらにはまた、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの生成
物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメン
トの製造に使用することができる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチ
ドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒ
トでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして
得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ
リペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプ
チドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような
抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離する
ことができる。
モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗
体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ko
hlerおよびMilstein、1975、Nature、256:495−497)、トリオ
ーマ(trioma)技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983、Imm
unology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのE
BV−ハイブリドーマ技術(Coleら、1985、Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77−96頁において)が含まれ
る。
単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第4,946,778号)
は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し
得る。それにまた、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポ
リペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることができる。
本発明をさらに、次の実施例に関して記載する;しかし、本発明は、そのよう
な実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこと
わらない限り、重量単位である。
次の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および/
または用語を記載する。
「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび/または続けて大文字および
/または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限
定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手
可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。
DNAの「消化」は、DNAのある配列にのみ作用する制限酵素でDNAを触
媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており
、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているよう
に使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約20μl中、1μgのプラスミ
ドまたはDNAフラグメントを約2単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築
のためのDNAフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中
、DNA5〜50μgを20〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に
適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。37℃で約1時間
のイン
キュベーション時間が通常使用されるが、供給者の指示に従って変えることがで
きる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望
のフラグメントを単離する。
切断したフラグメントのサイズ分離は、Goeddel,Dら、Nucleic Acids R
es.、8:4057(1980)により記載されている8%ポリアクリルアミド
ゲルを用いて行う。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチド、または2つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような
合成オリゴヌクレオチドは5'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存
在下、ATPでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドに
ライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていな
いフラグメントにライゲートするであろう。
「ライゲーション」は、2つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ
ル結合を形成する過程をいう(Maniatis,T.ら、同上、146頁)。特にことわ
らない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきDNAフラグメントのほ
ぼ等モル量の0.5μg当り10単位のT4DNAリガーゼ(「リガーゼ」)と共に
、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。
特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Graham,F.およびV
an der Eb,A.、Virology、52:456−457(1973)の方法に記載
されているようにして行った。
実施例 1
FGF−13タンパク質の細菌発現および精製
最初に、FGF−13をコードするDNA配列、ATCC第97147号を、
プロセシングされたタンパク質の5'配列(シグナルペプチド配列なし)およびそ
の遺伝子の3'側のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用して増幅する。その遺伝子に対応する付加的ヌクレオチドを各々、5'
および3'配列に付加する。5'オリゴヌクレオチドプライマー:
は、Nco制限酵素部位を含む。3'配列:
は、BglII部位に対する相補的配列を含み、その後に18ヌクレオチドのFGF
−13コード配列が続く。
その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pQE−60(Qiagen,Inc.Chatsw
orth、CA 91311)上の制限酵素部位に対応する。pQE−60は、抗生物
質耐性(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IPTG−調節可能なプロモーターオ
ペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6−Hisタグおよび制限酵
素部位をコードする。次いで、pQE−60をNcoIおよびBglIIで消化した。
増幅された配列をpQE−60にライゲートして、ヒスチジンタグおよびリボソ
ーム結合部位(RBS)をコードする配列と共に枠内に挿入する。次いで、そのラ
イゲーション混合物を使用して、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press(1989)に記載
されている手順により、E.coli.株 M15/rep4(Qiagen,Inc.)をトランス
フォームする。M15/rep4はプラスミドpREP4の多重コピーを含み、これ
は、lacIリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Kanr)も与える。ト
ランスフォーマントを、それらがLBプレートで増殖する能力により同定して、
アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離
して、制限分析により確認する。所望の構築物を含むコロニーを、Amp(100u
g/ml)とKan(25ug/ml)の両方を補ったLB培地中での液体培養で一晩増殖さ
せる(O/N)。そのO/N培養物を使用して、大きな培養系に1:100〜1:
250の割合で播種する。細胞を、0.4〜0.6の光学密度600(O.D.600)
まで増殖させる。次いで、IPTG(「イソプロピル−B−D−チオガラクトピ
ラノシド」)を、最終濃度が1mMとなるまで加える。IPTGは、lacIリプレ
ッサーを不活性化することにより、P/Oのクリアリングを誘導し、遺伝子発現
を増加させる。細胞をさらに3〜4時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離に
より収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤である6モルのグアニジンHC
l中で可溶化する。清澄後、この溶液から、6−ヒスチジンタグを含むタンパク
質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマ
トグラフィーにより、可溶化したFGF−13を精製する(Hochuli,E.ら、J.
Chromatography 411:177−184(1984))。6モルのグアニジン
HCl pH 5.0中、そのタンパク質をカラムから溶出し、また再生の目的に、
3モルのグアニジンHCl、100mMのリン酸ナトリウム、10ミリモルのグル
タチオン(還元した)、および2ミリモルのグルタチオン(酸化した)に調節する。
この溶液中で12時間インキュベーションした後、そのタンパク質を10ミリモ
ルのリン酸ナトリウムに対して透析する。
実施例 2
バキュロウイルス発現システムを用いての
FGF−13のクローニングおよび発現
完全な長さのFGF−13タンパク質をコードするDNA配列、ATCC第9
7147号を、遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅する。
そのFGF−13 5'プライマーは、配列:
を有し、またBamHI制限酵素部位(肉太の活字)を含むことから、この部位での
クローニングは、推定されるFGF−13シグナルペプチド切断部位の下流でF
GF−13遺伝子の18ヌクレオチドと共に、バキュロウイルスシグナル配列を
枠内に置くであろう。
その3'プライマーは、配列:
を有し、また制限エンドヌクレアーゼ XbaIの切断部位、およびその遺伝子の
3'非翻訳配列に対して相補的な18ヌクレオチドを含む。
増幅された配列を、市販のキット(「Geneclean」、BIO 101 Inc.、L
a Jolla、Ca.)を使用して、1% アガロースゲルから単離する。次いで、その
フラグメントを各々のエンドヌクレアーゼで消化して、1% アガロースゲル上
で精製する。このフラグメントをF2と名付ける。
ベクター pA2gp(pVL941ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロ
ウイルス発現システムを用いてのタンパク質の発現に使用する(レビューには、
Summers,M.D.およびSmith,G.E.1987、A manual of methods for ba
culovirus vectors and insect cell culture procedures、Texas Agricultur
al Experimental Station Bulletin No.1555を参照)。この発現ベクタ
ーは、オートグラファ(Autographa)カリフォルニア核多角体病ウイルス群(Ac
MNPV)の強力な多角体(polyhedrin)プロモーター、続いて、制限エンドヌク
レアーゼ BamHIおよびXbaIの認識部位を含む。シミアンウイルス(SV)4
0のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウイルス
を容易に選択するには、E.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、多角体(
polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く多角体プロモーターと同じ
向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野生型ウイルスD
NAの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列を多角体配列の
両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、pRG1、pAc3
73、pVL941、およびpAcIM1といったようなpA2の代わりに使用する
ことができるであろう(Luckow,V.A.およびSummers,M.D.、Virology、1
70:31−39)。
プラスミドを制限酵素で消化して、当業界で既知の方法により、仔ウシ腸ホス
ファターゼを使用して脱リン酸化する。次いで、DNAを、市販のキット(「Ge
neclean」、BIO 101 Inc.、La Jolla、Ca.)を使用して、1% アガロ
ースゲルから単離する。このベクター DNAをV2と名付ける。
フラグメント F2および脱リン酸化プラスミド V2をT4 DNAリガーゼ
でライゲートさせる。次いで、E.coli DH5α細胞をトランスフォームして、
プラスミド(pBacFGF−13)を含む細菌を、各々の制限酵素を使用して同定
する。クローン化されたフラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する
。
リポフェクション法を使用して、プラスミド pBacFGF−13 5μgを市販
の線形化バキュロウイルス(「BaculoGoldTMバキュロウイルス DNA」、Pha
rmingen、San Diego、CA)1.0μgと共に同時トランスフェクトする(Felgn
erら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413−7417(1987
))。
各々の場合において、BaculoGoldTMウイルス DNA 1μgおよびプラスミ
ド 5μgを、無血清グレイス(Grace's)培地(Life Technologies Inc.、Gai
thersburg、MD)50μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混
合する。その後、リポフェクチン(Lipofectin)10μlとグレイス培地90μl
を加え、混合して、室温で15分間インキュベートする。次いで、トランスフェ
クション混合物を、無血清グレイス培地1mlを含む、35mmの組織培養プレート
に播種したSf9昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴加する。そのプレー
トを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレート
を27℃で5時間インキュベートする。5時間後、そのトランスフェクション溶
液をプレートから除去して、10% ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地1m
lを加える。そのプレートをインキュベーターに戻して、27℃で4日間培養し
続ける。
4日後、上清を集めて、SummersおよびSmith(上記)により記載されたように
して、プラークアッセイを行う。変更として、「Blue Gal」(Life Technolo
gies Inc.、Gaithersburg)を含むアガロースゲルを使用するが、このことによ
り、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラー
クアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する使用者のガイド、およ
びLife Technologies Inc.、Gaithersburgにより配布されたバキュロウイル
ス学、9−10頁にも見い出すことができる)。
連続希釈してから4日後に、ウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラ
ークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含
む寒天を、グレイス培地200μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる
。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む
上清を、35mmの皿に播種した昆虫Sf9細胞を感染させるのに使用する。4日
後、これらの培養皿の上清を収集した後、4℃で保存する。
Sf9細胞を、10% 熱不活性化FBSを補ったグレイス培地で増殖させる。
その細胞に、感染多重度(MOI)2で組換えバキュロウイルス V−FGF−1
3を感染させる。6時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステイン
を含まないSF900 II 培地(Life Technologies Inc.、Gaithersburg)に
替える。42時間後、5μCiの35S−メチオニンおよび5μCiの35S システ
イン5μCi(Amersham)を加える。その細胞をさらに16時間インキュベートし
た後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、SDS−PAG
Eおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。
実施例 3
COS細胞における組換えFGF−13の発現
プラスミド、FGF−13−HAの発現は、1)SV40 複製開始点、2)
アンピリシン耐性遺伝子、3)E.coli 複製開始点、4)ポリリンカー領域、S
V40 イントロンおよびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーターを含む
、ベクターpcDNA3/Amp(Invitrogen)から得た。完全なFGF−13前駆
体およびその3'末端に枠内で融合したHAタグ(tag)をコードするDNAフラグ
メントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化することから、組換え
タンパク質発現は、CMVプロモーターの下に指示される。HAタグは、前記の
ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応す
る(I.Wilson、H.Niman、R.Heighten、A.Cherenson、M.Connolly、お
よびR.Lerner、1984、Cell 37:767(1984))。HAタグを標
的
タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を、HAエピトープを認
識する抗体で容易に検出することが可能となる。
PCRにより増幅されたDNAフラグメントおよびベクター、pcDNA3/A
mpを、各々の制限酵素で消化して、ライゲートさせる。そのライゲーション混合
物をE.coli株 SURE(Stratagene Cloning Systems、La Jolla、CA)
にトランスフォームし、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地
プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAをトランスフ
ォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在に関して制限分析により試
験する。組換えFGF−13 COS細胞の発現には、DEAE−DEXTRA
N方法により、COS細胞を発現ベクターでトランスフェクトする(J.Sambroo
k、E.Fritsch、T.Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、Cold Spring Laboratory Press、(1989))。FGF−13−HAタ
ンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する(E.Harlow、
D.Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory
Press、(1988))。トランスフェクションから2日後、細胞を35S−シス
テインで8時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(R
IPA緩衝液(150mM NaCl、1% NP−40、0.1% SDS、1% N
P−40、0.5% DOC、50mM トリス、pH 7.5))で溶菌する。(Wils
on,I.ら、同上 37:767(1984))。細胞溶菌液および培養培地は両方
とも、HAに特異的なモノクローナル抗体で沈降する。沈降したタンパク質を1
5% SDS−PAGEゲルで分析する。
実施例 5
遺伝子治療による発現
線維芽細胞を皮膚生体組織検査により被験者から得る。その結果得られた組織
を組織培養培地に入れて、小片に分離させる。組織の小塊を組織培養フラスコの
湿った表面上に置き、約10片を各々のフラスコに入れる。そのフラスコを上下
にひっくり返し、密閉して、室温で一晩放置する。室温で24時間放置した後、
そのフラスコをひっくり返し、その組織の塊はフラスコの底に固定されたままに
しておいて、新たな培地(例えば、10% FBS、ペニシリン、およびストレプ
トマイシンを含むHamのF12培地)を加える。次いで、これを37℃で約1週
間インキュベートする。この時点で、新たな培地を加えた後、数日毎に変える。
さらに2週間培養した後、単層の線維芽細胞が現れる。その単層をトリプシン処
理して、より大きなフラスコへと剥がし取る(scaled)。
モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列の隣接したpMV−7(Kirsc
hmeier,P.T.ら、DNA、7:219−25(1988))をEcoRIおよび
HindIIIで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをア
ガロースゲル上で分別し、ガラスビーズを使用して精製する。
本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、5'および3'末端配列に各々
対応するPCRプライマーを使用して増幅する。EcoRI部位を含む5'プライ
マーおよび3'プライマーは、HindIII部位を含む。T4 DNAリガーゼの存在
下、等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線形バックボーンおよびEcoRI並びに
HindIIIフラグメントを一緒に加える。その結果得られた混合物を、2つのフラ
グメントのライゲーションに適当な条件下に維持する。そのライゲーション混合
物を使用して、細菌HB101をトランスフォームした後、そのベクターが正し
く挿入された問題の遺伝子を有していることを確認する目的で、これを、カナマ
イシンを含む寒天上に置く。
10% 仔ウシ血清(CS)、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むダ
ルベッコの修飾されたイーグル培地(DMEM)中、両種指向性pA317または
GP+am12パッキング細胞を集密的密度まで組織培養で増殖させる。次いで、
その遺伝子を含むMSVベクターを培地に加えて、パッキング細胞をベクターで
トランスデュースする。ここで、そのパッキング細胞は、その遺伝子を含む感染
性ウイルス粒子を製造する(ここで、そのパッキング細胞は、プロデューサー細
胞と呼ばれる)。
新たな培地をトランスデュースされたプロデューサー細胞に加えた後、培地を
10cmのプレートの集密的プロデューサー細胞から収集する。感染性ウイルス粒
子を含む使用済みの培地を、ミリポアフィルターを通して濾過して、脱離したプ
ロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる
。培地を線維芽細胞の副次(sub)集密的プレートから除去して、プロデューサー
細胞から得られた培地に素早く置き替える。この培地を除去して、新たな培地に
置き替える。ウイルスの力価が高いならば、実質的には全ての線維芽細胞が感染
されるであろし、また選択の必要は全くない。力価が非常に低いならば、neoま
たはhisといったような選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベクターを
使用する必要がある。
次いで、操作された線維芽細胞を単独で、またはサイトデックス(cytodex)3
微担体ビーズ上で密集するまで増殖させた後、宿主に注入する。ここで、その線
維芽細胞は、タンパク質産物を製造する。
上記の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、
後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C07K 16/22 C07K 16/22
C12N 5/10 C12P 21/08
C12P 21/08 G01N 33/15 Z
G01N 33/15 33/50 T
33/50 C12N 5/00 B
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C
H,CN,CZ,DE,DK,ES,FI,GB,GE
,HU,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK,
LT,LU,LV,MD,MG,MN,MW,MX,N
O,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SI
,SK,TJ,TT,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 グルーバー,ヨアヒム・アール
アメリカ合衆国02167マサチューセッツ州
チェスナット・ヒル、ゲリー・ロード47
番
(72)発明者 ローゼン,クレイグ・エイ
アメリカ合衆国20882メリーランド州 レ
イトンズビル、ローリング・ヒル・ロード
22400番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.(a)配列番号2で示されるアミノ酸−21〜アミノ酸191を含んでな るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; (b)配列番号2で示されるアミノ酸1〜アミノ酸191を含んでなるポリペプ チドをコードするポリヌクレオチド; (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ 、また(a)または(b)のポリヌクレオチドに対して少なくとも70%が同一 であるポリヌクレオチド;および (d)(a)、(b)、または(c)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフ ラグメント; よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる、単離されたポリヌクレオチド 。 2.ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 3.配列番号1で示されるヌクレオチド65〜ヌクレオチド641を含んでな る、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 4.(a)ATCC寄託番号第97147号に含まれるDNAによりコードさ れる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; (b)ATCC寄託番号第97147号に含まれるDNAにより発現されるポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド; (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ 、また(a)または(b)のポリヌクレオチドに対して少なくとも70%が同一 であるポリヌクレオチド;および (d)(a)、(b)、または(c)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフ ラグメント; よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる、単離されたポリヌクレオチド 。 5.請求項2に記載のDNAを含むベクター。 6.請求項5に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。 7.ポリペプチドを製造する方法であって、該DNAによりコードされるポリ ペプチドを請求項6に記載の宿主細胞から発現させることを含んでなる方法。 8.ポリペプチドを発現させることができる細胞を製造する方法であって、細 胞を請求項5に記載のベクターで遺伝的に操作することを含んでなる方法。 9.(i)配列番号2の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびその フラグメント、アナログ、並びに誘導体;および (ii)ATCC寄託番号第97147号のcDNAによりコードされるポリペプ チド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、並びに誘導体; よりなる群から選択されるメンバーを含んでなるポリペプチド。 10.請求項9に記載のポリペプチドに対する抗体。 11.請求項9に記載のポリペプチドの生物学的作用を阻害する化合物。 12.請求項9に記載のポリペプチドを模倣したアゴニスト。 13.FGF−13ポリペプチドが必要である患者を処置する方法であって、 治療上有効な量の、請求項9に記載のポリペプチドを患者に投与することを含ん でなる方法。 14.FGF−13ポリペプチドを阻害する必要がある患者を処置する方法で あって、治療上有効な量の、請求項11に記載の化合物を患者に投与することを 含んでなる方法。 15.該ポリペプチドをコードするDNAを患者に与えて、該ポリペプチドを インビボにおいて発現させることにより、治療上有効な量の該ポリペプチドを投 与する、請求項13に記載の方法。 16.該化合物がポリペプチドであって、該アンタゴニストをコードするDN Aを患者に与えて、該アンタゴニストをインビボにおいて発現させることにより 、治療上有効な量の該化合物を投与する、請求項14に記載の方法。 17.請求項9に記載のポリペプチドに対するアゴニストとして活性な化合物 を同定する方法であって、 (a)細胞が該ポリペプチドにより正常に刺激される条件下、スクリーニングす べき化合物、および細胞を含む反応混合物(該反応混合物は、細胞が増殖するに つれて細胞へと取り込まれる標識を含む)を混合し;および (b)細胞の増殖の程度を測定して、その化合物が有効なアゴニストであるかど うかを同定する ことを含んでなる方法。 18.請求項9に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストとして活性な化 合物を同定する方法であって、 (a)細胞が該ポリペプチドにより正常に刺激される条件下、スクリーニングす べき化合物、ポリペプチド、および細胞を含む反応混合物(該反応混合物は、細 胞が増殖するにつれて細胞へと取り込まれる標識を含む)を混合し;および (b)細胞の増殖の程度を測定して、その化合物が有効なアンタゴニストである かどうかを同定する ことを含んでなる方法。 19.請求項9に記載のポリペプチドの発現不足に関係のある疾患、または疾 患に対する感受率を診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配 列における変異を測定することを含んでなる方法。 20.宿主から得られた試料中の請求項9に記載のポリペプチドの存在に関し て分析することを含んでなる診断方法。
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