JPH11506918A

JPH11506918A - ヒトｃｃｎ−様増殖因子

Info

Publication number: JPH11506918A
Application number: JP9500359A
Authority: JP
Inventors: ヘイスティングス，グレッグ・エイ; アダムス，マーク・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 1999-06-22

Abstract

(57)【要約】ヒト小ＣＣＮ様増殖因子ポリペプチド（ＳＣＧＦ）およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）および組換え技術によりそのようなポリペプチドを製造する方法を開示する。また、傷の治癒または組織の再生、移植片の定着および血管形成のためにそのようなポリペプチドを利用する方法も開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびそのアテローム硬化症、腫瘍および瘢痕を治療するための治療上の使用も開示する。ＳＣＧＦ核酸配列中の変異およびＳＣＧＦポリペプチドのレベルの変化を同定するための診断アッセイもまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＣＣＮ−様増殖因子本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で「ＳＣＧＦ」と呼ぶ、ヒト小ＣＣＮ様増殖因子として推定的に同定されている。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。本発明のポリペプチドは、cef １０／cry ６１、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）およびnovを含む増殖レギュレーターのファミリーに関する。本発明のポリペプチドに対応するｍＲＮＡは腎臓、肺、心臓および脳の順に多く発現する。増殖因子および形質転換している癌遺伝子を含む他のマイトジェンはある種の細胞によって発現される複雑な遺伝子のセットを迅速に含むことができる（ラウ（Ｌau，Ｌ.Ｆ.）およびナタンズ（Ｎathans，Ｄ.）、Ｍolecular Ａspects of Ｃellular Regulation 、６：１６５−２０２（１９９１））。これらの遺伝子は即時初期（immediate early）または初期応答遺伝子と命名されているが、新規のタンパク質合成とは独立して増殖因子またはマイトジェンに接触後数分のうちに転写上活性化される。これらの即時初期遺伝子の群は、増殖および分化、再生および傷の治癒などの複雑な生物学的なプロセスの調節に必要である細胞外分泌タンパク質をコードする（ライセック（Ｒyseck，Ｒ.Ｐ.）ら、Ｃell ＧrowthＤ iffer. 、２：２３５−２３３（１９９１））。この群に属するよく関連したタンパク質はニワトリからのcef１０を含み、ウイルス性の癌遺伝子pp６０^v-arcによる誘導の後検出される（シモンズ（Ｓimons ，Ｄ.Ｌ.）ら、ＰＮＡＳ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１１７８−１１８２（１９８９））。密に関連したタンパク質cry ６１は血清または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）によって迅速に活性化される（オブライエン（Ｏ'Ｂrien，Ｔ.Ｐ.）ら、Ｍol. Ｃell Ｂiol. 、１０：３５６９−３５７７（１９９０））。cef １０およびcyr ６１の間の全体のアミノ酸の同一性はせいぜい８３％である。第３のメンバーはヒト結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）（ブラドハム（Ｂradham．Ｄ．Ｍ.）ら，Ｊ．Ｃell．Ｂiol. 、１１４：１２８５−１２９４（１９９１）である。ＣＴＧＦは、増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を形質転換することによる活性化後の高いレベルにおけるヒト血管内皮細胞により分泌される。システインリッチペプチドであるＣＴＧＦはＰＤＧＦ様の生物学的および免疫学的活性を示し、ついで細胞表面の受容体の特定のものであるとしている。即時初期タンパク質の第４のメンバーはfisp-12であり、血清により誘発されると示されており、レウリン（reurine）ゲノムの領域にマッピングされる（ライセックら、Ｃell Ｇrowth Ｄiffer．２：２３５−２３３（１９９１）。本ファミリーのさらに別のメンバーはニワトリの遺伝子であり、通常は成人の腎臓細胞にて得られるnovであり、腎芽細胞腫を誘発した骨髄芽球症関連ウイルスタイプに過剰発現すると見出されている。さらにニワトリの胎児線維芽細胞におけるアミノ末端平滑化したnov産物の発現は形質転換に十分であった（ジョリオット（Ｊoliot，Ｖ．）ら、Ｍol．Ｃell．Ｂiol、１２：１０−２１（１９９２））。これらの即時初期遺伝子の発現は増殖因子によって集められる事象のカスケードの中で「第三メッセンジャー」として機能する。また、細胞増殖が一般的であるそれらの分化および傷の治癒などの複雑な生物学的プロセスを統合するのに必要であると考えられている。増殖レギュレーターの台頭しつつあるファミリーはＣＴＧＦのＣＣＮファミリーと呼ばれる；cef １０／cyr ６１；およびnovである。本発明のポリペプチドは増殖レギュレーターのこのファミリーのメンバーであると考えられている。本発明の１つの態様により、新規な成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性であり、診断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明の１つの態様により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子、さらにはまた、そのアナログ、ならびに生物学的に活性であって、診断上または治療上有用なそのフラグメントを提供する。本発明のさらに別の他の態様により、該タンパク質の発現を容易にし、連続発見を促進するような条件の下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核生物および／または真核生物宿主細胞を培養することを含む組換え技術によるそのようなポリペプチドの製造方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、例えば筋肉消耗症、骨粗鬆症を処置すること、移植片の定着を補助する、傷害の治癒および組織再生を刺激すること、血管形成を促進させ、血管平滑筋および内皮細胞産生を刺激する。本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供する。該アンタゴニストは、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために使用してよく、例えば、傷の治癒または肺線維症の間の過剰な結合組織の産生を制限する。本発明のさらに別の態様により、本発明のポリヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供する。本発明のさらに別の態様により、本発明のポリペプチドの過少および過剰発現に関する疾患およびそのようなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を検出するための診断アッセイを提供する。本発明のさらに別の態様により、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的のためにそのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。図１は、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を示している。最初の２３アミノ酸残基は推定リーダー配列（下線を付す）を表わす。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。シークエンシングは、３７３シークエンサー(アプライド・バイオシステムズ、インク(Ａpplied Ｂiosys tems,Ｉnc.))を使用して行った。図２は、本発明のポリペプチドと他のＣＣＮファミリーのメンバーのタンパク質との間のアミノ酸配列比較を説明する。本発明の一つの態様により、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年６月２日にＡＴＣＣ受託番号第号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のポリペプチドをコードするポリネクレオチドはヒト９週齢胎児からのｃＤＮＡライブラリー中で発見された。該ポリペプチドはＣＣＮファミリーに構造上関連するその成熟タンパク質は１８３アミノ酸を含む最初の２３アミノ酸残基が推定リーダー配列である２０６のアミノ酸のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。ＣＣＮ増殖因子ファミリーのメンバーとしてのＳＣＧＦの認定は主としてアミノ酸配列の保存に基づく。ＣＣＮファミリーに対するホモロジーはすべてのメンバーで約２７％である。ＣＣＮメンバーに対する最も高いホモロジーはＳＣＧＦの２９を越える長さのアミノ酸で６２％である。本発明のポリペプチドは１０システインを含むシステインリッチである。該ポリペプチドはＣＴＧＦ、cyr ６１およびnovの約５０％の大きさである。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コーディング鎖または非コーディング(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１（配列番号：１）に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。図１（配列番号：２）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的コーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列( また場合により、付加的コーディング配列)、および成熟ポリペプチドのコーディング配列のイントロンまたは非コーディング配列５'および／または３'といったような非コーディング配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コーディングおよび／または非コーディング配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、図１（配列番号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）に示すコーディング配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体であるコーディング配列を有し得る。当該技術分野で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により開裂されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度開裂されると、活性成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコーディング配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であってよく、または、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する（ウイルソン（Ｗilson,Ｉ.）ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４））。本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、また好ましくは少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチド、すなわちＳＣＧＦポリペプチドとして機能するものをコードする。かわりに、該ポリペプチドは本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、および該ポリヌクレオチドに上記に示すように同一性を有し、活性は保有していない少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基およびより好ましくは少なくとも５０塩基を有する。そのようなポリペプチドは配列番号：１のポリヌクレオチドまたはその変異体のポリヌクレオチドの、例えば該ポリヌクレオチドの回収のためのプローブとして、または診断プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用してよい。本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際には該寄託された物質中の配列が優先する。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものまたは（ｖ）あるアミノ酸残基を欠如しているが、しかしなお生物学的活性は保有している成熟ポリペプチドのスプライシング変異体であり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生存動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないという点で、なお単離されている。本発明のポリペプチドは配列番号：２（特に成熟ポリペプチド）のポリペプチドならびに配列番号：２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）およびより好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）およびさらになおより一層好ましくは９５％の類似性（さらになお好ましくは、少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、また、そのようなポリペプチドの部分をも含み、そのようなポリペプチドの部分は一般的には少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。当該技術分野において知られているように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換基を第２のポリペプチドの配列に対して比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは一部はペプチド合成による対応する完全長のポリペプチドを調製するのに使用されてよい；それゆえ、該フラグメントは完全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは一部は本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するために使用してよい。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される（トランスデュースされ、または形質転換され、またはトランスフェクトされる）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＳＣＧＦ遺伝子を増幅するのに適するよう修飾された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌(Ｅ．c oli)、lacまたtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、または大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓalmonella typhi murium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳｆ９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含む組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含む。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られており、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９（キアゲン（Ｑiag en））、pＢＳ、pＤ１０、ファージスクリプト（phagescript）、psiＸ１７４、 pbluescriptＳＫ、pＢＳＫＳ、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Stratagene））；pＴＲＣ９９a、pＫＫ２２３３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐharmacia））。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ（ストラタジーン）、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア）。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２ −８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲＩ、ＰＬおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期（immediate early）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。（デイビス（Ｄavis，Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner，Ｍ.）、バッティー（Ｂattey，Ｉ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology）（１９８６））。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＡＬab oratory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、（１９８９）により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製起点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖系酵素、α−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相（phase）で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製起点を含むであろう。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム、ならびにシュードモナス（Ｐseudomonas）属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカス（Ｓtaphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐromega Ｂiotec）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃell 、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’に隣接する非転写配列もまた含むであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって）組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。本発明のポリペプチドは、傷の治癒および、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺または腎臓などの組織の再増殖に関する治療に使用してよい。本発明のポリペプチドは再狭窄、心臓拡張／肥厚（鬱血性心不全）およびアテローム硬化症などの組織改作（remodeling）に使用してよい。本発明のポリペプチドは血管形成を刺激するためおよび、例えば、血管平滑筋および内皮細胞の増殖を増強するために使用してもよい。血管形成の増加は、虚血組織に対しておよび冠状血管の狭窄に対する心臓中での側枝（collateral）冠状動脈の成長に利益がある。本発明のポリペプチドはまた、移植した周囲の細胞の増殖を刺激するための移植組織定着時に使用してよく、強化部位に接着しやすくする本発明のポリペプチドはまた、ＳＣＧＦポリペプチドの発現パターンが胎児ライブラリーに豊富であるので、胎児の初期の成長を刺激するために使用してよい。本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的のためおよびヒトの疾患の診断薬および治療薬を提供する目的のために利用する方法を提供する。本発明は本発明のポリペプチドの受容体の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は当業者に公知の多数の方法、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（コリガン（Ｃoligan）ら、カレント・プロトコールズ・イン・イムン（Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmun．）、１（２）、第５章、（１９９１））などにより同定することができる。好ましくは、発現クローニングを用い、その際、ポリアデニル化したＲＮＡを該ポリペプチドに応答性の細胞から調製し、ついでこのＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリーをプールに分け、ＣＯＳ細胞またはＳＣＧＦに応答性でない他の細胞にトランスフェクションするために使用する。ガラススライド上で増殖させたトランスフェクションした細胞を標識したＳＣＧＦにさらす。ＳＣＧＦはヨウ素化または部位特異的なプロテインキナーゼの認識部位を含めることを含む多様な手段によって標識することができる。固定およびインキュベーションの後でスライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正のプールを同定し、ついでサブプールを調製し、ついで相互作用性のサブ−プールおよび再スクリーニング方法を用いて再度トランスフェクションし、最終的に推定受容体をコードする単一クローンを産生する。受容体の同定のための別法として、標識したＳＣＧＦを細胞膜または受容体分子を発現する抽出調製物と光親和性結合させることができる。架橋した物質をＰＡＧＥ分析によって分離し、ついでＸ−線フィルムにさらす。ＳＣＧＦの受容体を含む標識した複合体を切り出して、ペプチドフラグメントに分離し、タンパク質マイクロシークエンシングにかける。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列を推定受容体をコードする遺伝子を同定するためｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための縮重したオリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するのに使用する。本発明はまた、ＳＣＧＦ受容体に結合し、該受容体を活性化させるものを同定するための化合物をスクリーニングするための方法にも関する。そのような方法の例はコマイトジェン（comitogen）Ｃon Ａの存在下、内皮細胞の増殖を刺激するＳＣＧＦの能力を利用する。ヒト臍静脈血管内皮細胞を得て、９６ウェルの平らな底の培養皿にて培養し（コスター（Ｃostar）、ケンブリッジ（Ｃambridge ）、マサチューセッツ）、Ｃon-Ａ（カルビオケム（Ｃalbiochem）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア）を含む混合物をおいておく。Ｃon-Ａおよびスクリーニングすべき化合物を加え、３７℃でインキュベーションした後、培養物を³［Ｈ］チミジンで脈打たせ、ガラスファイバーフィルター（ＰhＤ；ケンブリッジ・テクノロジー（Ｃambridge Ｔechnology）、ウォータータウン（Ｗaterto wn）、マサチューセッツ）上に回収する。３つの培養物の平均の³［Ｈ］チミジン取り込み(ｃｐｍ)を液体シンチレーションカウンター(ベックマン・インストルメンツ(Ｂeckman Ｉnstruments)、アルバイン（Ｉrvine）、カリフォルニア) を用いて決定する。有意な³［Ｈ］チミジン取り込みは内皮細胞増殖の刺激を示唆している。アンタゴニストをアッセイするため、上記のアッセイを行うが、このアッセイにおいてＳＣＧＦはスクリーニングすべき化合物と一緒に加え、ＳＣＧＦの存在下での³［Ｈ］チミジン取り込みを抑制する該化合物の能力は、該化合物がＳＣＧＦのアンタゴニストであることを示している。代わりに、ＳＣＧＦアンタゴニストは、競合抑制アッセイのための適切な条件下でＳＣＧＦおよび潜在的なアンタゴニストと膜結合性ＳＣＧＦ受容体または組換え受容体とを合わせることによって検出されてよい。ＳＣＧＦは放射能などで標識化し、それによって該受容体結合したＳＣＧＦ分子の数が潜在的なアンタゴニストの有効性を決定することができる。可能性のあるＳＣＧＦアンタゴニストの例には、該ポリペプチドに結合する抗体、また幾つかの場合にはオリゴヌクレオチドが含まれる。かわりに、可能性のあるアンタゴニストはＳＣＧＦ受容体を認識するが効果的を全く伝達せず、それによってＳＣＧＦの作用を競合的に抑制するという、例えば、成熟形態のＳＣＧＦなどの密接に関連したタンパク質であってよい。別の可能性のあるアンタゴニストにはまた、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−リー（Ｌee）ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃ ooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Ｄervan ）ら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによって、転写およびＳＣＧＦの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＳＣＧＧへの翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ（Ｏkano）、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏligodeoxynucleotides asAntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣＰ ress）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＳＣＧＦの産生を阻害することができる。可能性のあるＳＣＧＦアンタゴニストには、該ペプチドの活性部位、該受容体結合部位または他の増殖因子結合部位に結合し、それによってＳＣＧＦの正常な生物学的活性を妨げる小分子が含まれる。小分子の例には、これらに限定されるものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。該アンタゴニストを腫瘍中の新規血管成長およびアテローム硬化症およびバルーン血管形成術に続く再狭窄においてよくみられる平滑筋細胞の新内膜（neoint imal）増殖を妨害するのに使用してよい。該アンタゴニストをまた、手術後、心筋梗塞後の線繊症または肺線維症に関連した線維外傷を形成するケロイド中に見られる瘢痕（scar）の過剰な生成を抑制するために使用してよい。該アンタゴニストを例えば、以下に記載するような製薬学的に許容し得る担体とともに組成物において使用してよい。本発明のＳＣＧＦポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、適当な製薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量の該ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学上許容され得る担体または賦形剤を含む。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含む医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、該医薬組成物は、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当たり約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。以下に限られるものではないが、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦまたはＴＧＦ−βを含む他の増殖因子と組み合わせたＳＣＧＦは傷の治癒において見られるような生理学的応答を加速してよい。該ＳＣＧＦポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのイン・ビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ（ex vivo）においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分野で公知の方法により操作することができる。同様に、例えば、当該技術分野で公知の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。当該技術分野において知られているように、細胞をイン・ビボにおいて処理してポリペプチドをイン・ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するためのプロデューサー細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をイン・ビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。前記レトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターには、以下に限られるものではないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍiller）ら、Ｂiotechniques、Ｖol．７、Ｎo．９、９８０−９９０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター（例えば、以下に限るものではないが、ヒストン、ｐｏｌ IIIおよびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物細胞のプロモーターなどの細胞プロモーター）が含まれる。使用されてよい他のウイルスプロモーターは、以下に限るものではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は、本明細書中の教示から当業者には明らかであろう。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよい適切なプロモーターには、以下に限られるものではないが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major late promoter）などのアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターであってよい。レトロウイルスプラスミドベクターはプロデューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株をトランスデュースするのに使用してよい。トランスフェクションしてよいパッケージング細胞の例には、以下に限るものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれ（ミラー、Ｈuman Ｇene Ｔherapy、Ｖol．１、５−１４頁（１９９０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引用する）。該ベクターは当該技術分野において公知の方法によりパッケージング細胞をトランスデュースする。このような方法には、以下に限るものではないが、エレクトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ₄沈降が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れられてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与されてよい。該プロデューサー細胞株は該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクター粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トランスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。トランスデュースされてよい真核生物細胞には、以下に限られるものではないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞Ｂ、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれる。本発明はまた、診断用として本発明の遺伝子を使用することにも関する。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列中の変異形態の検出により、疾患、ＳＣＧＦ中の変異は腫瘍を引き起こすので、例えば腫瘍などの診断または疾患の罹患し易さの診断が可能であろう。ヒトＳＣＧＦにおける変異を有する個体は、多様な技術を用いてＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などから得られる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよいし、分析前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６））により酵素的に増幅してもよい。同様の目的のため、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた使用してよい。一例として、ＳＣＧＦをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーはＳＣＧＦの変異を同定し分析するのに使用することができる。例えば、欠失および挿入は、通常の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさにおける変化によって検出することができる。点突然変異は、増幅したＤＮＡを放射性標識したＳＣＧＦＲＮＡまたは別法として放射性標識したＳＣＧＦアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼＡ消化によるかまたは融点における差異によってミスマッチの二本鎖から区別することができる。ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度における変化の検出によって行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分離（high resolution）ゲル電気泳動によって可視化することができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、別々のＤＮＡフラグメントが、その特異的な融点または部分的な融点に従って別個の位置でゲルにて減速される変性ホルムアミド濃度勾配ゲル上で区別してよい（例えば、マイヤーズ（Ｍyers）ら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５））。特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコットン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７− ４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護アッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングまたは制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットなどの方法により行われてよい。さらに従来のゲル電気泳動およびＤＮＡシークエンシングに加えて、変異はまたイン・サイチュ分析により検出することができる。ＳＣＧＦタンパク質の発現は腫瘍形成に関する血管疾患または血管新生に関連する。ＳＣＧＦは腎臓、肺、心臓または脳に及ぼす癌遺伝子効果を有する。胎児の組織は急速に増殖し、およびＳＣＧＦ特異的抗体は、すぐに増殖する腫瘍を検出することができる。ＳＣＧＦはシグナルペプチドを有し、そのｍＲＮＡは内皮細胞に非常に多く、および少しは平滑筋細胞に発現する。従って、抗−ＳＣＧＦ抗体は、血管の疾患または腫瘍形成に関する血管新生の診断に使用できる。というのは、該ポリペプチドのレベルの変化はそのような障害の指標となってよいからである。さらに、ＳＣＧＦタンパク質は再狭窄、高血圧、鬱血性心不全およびアテローム硬化症などの組織改作プロセスに関すると思われる。競合アッセイを使用してよく、その際、ＳＣＧＦに特異的な抗体を固相支持体に結合させ、標識したＳＣＧＦおよび宿主由来のサンプルを該固相支持体を通過させ、検出された固相支持体に結合した標識の量を該サンプル中のＳＣＧＦの量に相関させることができる。「サンドイッチ」アッセイはＥＬＩＳＡアッセイと同様である。「サンドイッチ」アッセイではＳＣＧＦを固相支持体を通過させ、固相支持体に結合した抗体に結合する。第二抗体をついでＳＣＧＦポリペプチドに結合させる。標識されており、第二抗体に特異的である第三抗体をついで固相支持体を通過させて第二抗体に結合させ、ついでその量を定量することができる。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５−２５bp ）を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'未翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、特異的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、イン・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いｃＤＮＡで利用することができる。この技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐe rgamon Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、マックジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversit y Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を介してオンラインで利用できる)に見出される。ついで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。ついで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える任意の技術を使用することができる。例には、ハイブリドーマ法(コーラー（Ｋohler）およびミルシュタイン（Ｍilstein）、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Ｃole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール・リス、インク（Ａlan Ｒ.Liss，Inc.）、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するのに使用してよい。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかしながら、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当該技術分野で公知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、典型的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えてもよい。消化後、その反応物をポリアクリルアミド上で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。開裂したフラグメントのサイズ分離は、ゲッデル（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎuclei c ＡcidsRes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲーションしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲーションするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１４６頁 )。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、形質転換は、グラハム（Ｇraham,Ｆ.）およびファン・デル・エブ（Ｖan der Ｅb,Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。実施例１ＳＣＧＦの細菌発現および精製最初に、ＳＣＧＦをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣを、プロセシングしたＳＣＧＦタンパク質（シグナルペプチド配列を含まない）配列の５'およびＳＣＧＦ遺伝子のベクター配列３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。ＳＣＧＦに対応する別のヌクレオチドをそれぞれ５'および３'配列に加える。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：を有し、該配列はＨind III制限酵素部位（太字）を含み、続いて、プロセシングタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始するＳＣＧＦコーディング配列の２１ヌクレオチドを含む（下線）。３'オリゴヌクレオチドプライマー配列：は、Ｘba Ｉ制限部位（太字）を含み、続いてカルボキシ末端５アミノ酸および翻訳停止コドン（下線）に対応するヌクレオチドの逆相補物を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−９(キアゲン、インク（Ｑiagen Inc.）、チャッツワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア)の制限酵素部位に一致する。p ＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａmp^r)、細菌の複製起点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６− Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードする。ついでpＱＥ−９およびＳＣＧＦＰＣＲ産物をＨind IIIおよびＸba Ｉで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一緒にライゲーションする。所望の組換え体はヒスチジンタグおよびリボソーム結合部位からの下流に挿入する。ついでそのライゲーション混合物を使用して、Ｍ１５［ｐＲＥＰ５］（キアゲン、インク）である大腸菌株をサンブルック（Ｓambrook,Ｊ .）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＡＬaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス(Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress)、（１９８９）に記載された方法によって形質転換した。Ｍ１５［ｐＲＥＰ５］はプラスミドpＲＥＰ５の多重コピーを含み、これは、lacｉリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^r)も与える。トランスフォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを制限分析により単離し確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp（１００μg／ml）およびＫan（２５μg／ml）の両方を補った、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、０. ４〜０.６の間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖させる。ついで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を、最終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacｉリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３− ４時間増殖し、培養物は指数的に増殖する。ついで、細胞を遠心分離により収集した。ＳＣＧＦ／６−ヒスチジン含有Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］細胞を６モルのグアニジンＨＣl、５０mＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ８.０）中で溶解した。細胞溶解物をニッケルキレートカラムにロードし、流して収集した。そのカラムを６モルのグアニジンＨＣl、５０mＭのＮaＰＯ₄（pＨ８.０、６.０、５.０）で洗浄した。ＳＣＧＦ融合タンパク質（＞９０％の純度）をｐＨ２.０で溶出した。また再生の目的には、ｐＨ２.０の溶出物を３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０ミリモルのグルタチオン（還元型）および２ミリモルのグルタチオン（酸化型）に合わせた。この溶液で１２時間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリモルのリン酸ナトリウムで透析した。ゲルを流すため、そのペレットをＳＤＳ／ＮaＯＨおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー、熱変性させたものに再懸濁し、ついで１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。該タンパク質はクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０（Ｃoomassie Ｂrilliant Ｂlue Ｒ−２５０）染色で可視化した。実施例２バキュロウイルス発現システムを用いてのＳＣＧＦのクローニングおよび発現ＳＣＧＦをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣを、ＳＣＧＦコーディング領域の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。ＳＣＧＦに対応する別のヌクレオチドを各々、５'および３'配列に加えた。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：を有し、該配列はＢam ＨＩ制限酵素部位（太字）、続いて、プロセシングしていないタンパク質の推定開始メチオニンから開始する２１ヌクレオチドの、ＳＣＧＦコーディング配列（下線を付す）を含む。３'オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｘba Ｉ制限部位、続いて翻訳停止コドン（下線を付す）の隣にある１６の３'未翻訳ヌクレオチドに対応するヌクレオチドの逆相捕配列を含む。該制限酵素部位は、バキュロウイルス発現ベクターｐＡ２(キアゲン、インク．、チャッツワース、カリフォルニア)上の制限酵素部位に対応する。ＳＣＧＦＰＣＲ産物およびｐＡ２は、ついでＢam ＨＩおよびＸba Ｉで消化して一緒にＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。クローニングされたフラグメントの配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認する。リポフェクション法(フェロナー（Ｆeloner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミド pbacＳＣＧＦ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧold^TMバキュロウイルスＤＮＡ」、ファーミンゲン（Ｐharmingen）、サン・ディエゴ（Ｓan Ｄiego ）、カリフォルニア）１.０μgと共に同時トランスフェクションする。ＢaculoＧold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpＢacＳＣＧＦ５μg を、無血清グレイス(Ｇrace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・インク（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithersburg）、メリーランド）５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。ついで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。ついで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。４日後、上清を集めて、サマーズおよびスミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッセイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テクオロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。 (「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができる)。４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチューブ内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存する。Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＳＣＧＦを感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ )に替える。４２時間後、５μＣiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの³⁵Ｓシステイン５μＣi(アマシャム(Ａmersham))を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。実施例３ＣＨＯ細胞における組換えＳＣＧＦの発現ベクターｐＮ３４６をＳＣＧＦタンパク質の発現に使用する。プラスミドｐＮ３４６はプラスミドのｐＳＶ２−dhfrが［ＡＴＣＣ受託番号第３７１４６号］の誘導体である。両方のプラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの制御下でマウス dhfr遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクションされるチャイニーズハムスターの卵巣またはジヒドロ葉酸活性を欠如している他の細胞を、化学療法剤メトトレキセート（methotrexate）を補った選択培地（αマイナスＭＥＭ、リフト・テクノロジーズ（Ｌift Ｔechnologies）中で細胞を増殖させることによって選択することができる。メトトレキセート（ＭＴＸ）に耐性のある細胞中のＤＨＦＲ遺伝子の増幅はよく証明されている（例えばアルト（Ａlt，Ｆ.Ｗ. ）、ケルムス（Ｋellems，Ｒ.Ｍ.）、ベルチノ（Ｂertino，Ｊ.Ｒ.）およびシムケ（Ｓchimke，Ｒ.Ｔ.）、１９７８、Ｊ．Ｂiol，Ｃhem．２５３：１３５７−１３７０、ハムリン（Ｈamlin，Ｊ．Ｌ.）およびマ（Ｍa，Ｃ.）、１９９０、Ｂio chem．et Ｂiophys．Ａcta、１０９７：１０７−１４３、ページ（Ｐage，Ｍ．i.）およびシデンハム（Ｓydenham，Ｍ．Ａ.）、１９９１、Ｂiotechnology Ｖol．９：６４−６８参照）。ＭＴＸの増大する濃度中で増殖させた細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果、標的酵素、ＤＨＦＲの過剰産生による該薬剤への耐性を高める。第２の遺伝子がdhfr遺伝子に結合するならば、通常は同時増幅（ co-amplified）され、過剰発現する。続いて、メトトレキセートを除去する場合、細胞株は染色体に取り込まれた増幅された遺伝子を含む。プラスミドｐＮ３４６は興味深い遺伝子の発現のため、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）（カレン（Ｃullen）ら、Ｍolecular and Ｃellula r Ｂiology、１９８５年３月、４３８−４４７）プラスヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子のエンハンサー（ボスハルト（Ｂoshart）ら、Ｃ ell４１：５２１−５３０、１９８５）から単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にする単独の制限酵素開裂部位である：Ｂam ＨＩ、Ｐvul１およびＮru１である。これらのクローニング部位を残して該プラスミドは、３'イントロンおよびラットプレプロインシュリン遺伝子のポリアデニレーション部位が続く全部で３つのリーディングフレーム中の翻訳停止コドンを含む。他の高効率なプロモーターをまた、発現のため、例えばヒト β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーターまたは例えばＨＩＶまたはＨＴＬＶなどの他のレトロウイルスからの長い末端反復配列などを使用することができる。mＲＮＡのポリアデニレーションのため、他のシグナル、例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロブリン遺伝子などからのシグナルを同様に使用することができる。染色体に取り込まれる関心のある遺伝子を運搬する安定な細胞株はまた、gpt 、Ｇ４１８またはヒグロマイシン（Ｈygromycin）などの選択可能なマーカーと同時トランスフェクションに関して選択することができる。最初に例えばＧ４１８とメトトレキセートなど、１より多い選択可能なマーカーを使用することには利点がある。プラスミドｐＮ３４６は制限酵素ＢamＨＩで消化され、ついで当該技術分野において公知の方法によってウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化される。ついでそのベクターは１％アガロースゲルから単離される。完全長のＳＣＦＧタンパク質、ＡＴＣＣ受託番号第号をコードするＤＮＡ配列は該遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：を有し、該配列はＢam ＨＩ制限酵素部位（太字）、続いて、真核生物細胞中の翻訳開始有効シグナルに類似した２１ヌクレオチドを有する（コザック（Ｋozak ，Ｍ.）、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１９６：９４７−９５０（１９８７））。残りのヌクレオチドは翻訳開始コドン（下線を付す）を含むアミノ末端の７アミノ酸に対応する。３'プライマーは、Ｂam ＨＩ制限部位（太字）、および続いて翻訳停止コドンから下流にある１６ヌクレオチドから開始する３'未翻訳ＤＮＡの逆相補性である。ＰＣＲ産物をＢamＨＩで消化し、ついで市販の利用可能なキット（「ジーン・クリーン（Ｇ eneclean）」、バイオ１０１・インク（ＢＩＯ１０１Ｉnc．）、ラ・ホラ、カリフォルニア）を用いて１％のアガロースゲル上で精製する。ついで、このフラグメントをＢam ＨＩ消化したリン酸化したｐＮ３４６プラスミドもＴ４ＤＮＡリガーゼとともにライゲーションする。Ｘl１Ｂlue（ストラタジーン）大腸菌を形質転換し、ＬＢ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上にプレーティングする。適切な方向の所望の組換え体を産生するコロニーをラウス肉腫ウイルスプロモーターに対応する５'プライマーおよびＳＣＧＦコドン７３−７９の逆の相補配列に対応する３'プライマーによりスクリーニングする。クローニングされたフラグメントの配列はＤＮＡシークエンシングにより確認される。ＣＨＯ−dhfr−細胞のトランスフェクション活性ＤＨＦＲ酵素を欠如しているチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞をトランスフェクションに使用する。発現プラスミドpＮ３４６ＳＣＧＦ５μｇをリポフェクチン法を用いて０.５μｇのプラスミドpＳＶneoとトランスフェクションする（フェロナー（Ｆeloner）ら、上記）。プラスミドpＳＶ２−neoは優力な選択可能なマーカーを含み、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に耐性を与える酵素をコードするＴn５からの遺伝子neoを含む。細胞を１g／mlＧ４１８を補ったαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、該細胞をトリプシン化し、ついでハイブリドーマクローニングプレート（グライナー（Ｇreiner）、ドイツ）に播種し、ついで１０−１４日間培養する。この時期の後、単一のクローンをトリプシン化し、ついで多様な濃度のメトトレキセート（２５、５０nm、１００nm、２００nm、４００ nm）を用いて６ウェルのペトリ皿に播種する。最も高濃度のメトトレキセートで増殖しているクローンをついでさらに高濃度のメトトレキセートを含む（５００ nＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）新しい６ウェルプレートに移す。同じ手法をクローンの濃度が１００μＭに増殖するまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現をウエスタン・ブロット分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。実施例４ノザン・ブロット分析によるＳＣＧＦ遺伝子発現の組織局在化ヒト成人脳、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓ポリＡ⁺ｍＲＮＡを各１レーンに含む複数組織のノザン・ブロット（クローンテク・ラボラトリーズ・インク（Ｃlonetech Ｌaboratories，Ｉnc.）、４０３０ファビアン・ウェイ（Ｆabian Ｗay）；パロ・アルト（Ｐalo Ａlto）、カリフォルニア９４３０３）をチャーチ・バッファー（Ｃhurch buffer）（チャーチ（Ｃhurch，Ｇ．Ｍ.）ギルバート（Ｇilbert，Ｗ.）Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ８１、１９９１−１９９５（１９８４））中で６０℃で１時間プレハイブリダイゼーションした。ＳＣＧＦをコードするそのＤＮＡ、ＡＴＣＣ受託番号第号をＭ１３フォワードおよび、リバースプライマーを用いたｐＢluescript ＳＫ（−）中にクローニングした全長ｃＤＮＡから増幅した。２５ナノグラムのＰＣＲ産物を³²Ｐ−ｄＣＴＰでランダム・プライマー標識（プライム−イットII(Ｐrime-It II)、ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems）、１１０１１ノース・トーレイ・パインズ・ロード（Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒd.）；ラ・ホラ、カリフォルニア９２０３７）する。熱変性したＳＣＧＦプローブを直接プレハイブリダイゼーションバッファー中に加えて６０℃で１６時間インキュベートする。６０ ℃の０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で２回１０分間の洗浄を行う。オートラジオグラフィーは−８０℃で行う。実施例５遺伝子治療を介する発現線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。その組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコを上下ひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置する。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む新しい培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam'ｓＦ１２ media））を添加する。ついでこれを３７℃で約１週間インキュベートする。このとき、新しい培地を添加し引き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液中に線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理しついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列によりフランキングされたｐＫＶ−７（キルシュメイエル（Ｋirschmeier，Ｐ．Ｔ.）ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８））をＥco ＲＩおよびＨind IIIで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分画化し、ガラスビーズを使用して精製する。本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡをそれぞれ５'端および３'端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅する。５'プライマーはＥco ＲＩ部位を含み３'プライマーはＨind III部位を含む。モロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格およびＥco ＲＩおよびＨind IIIフラグメントの等量をＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加する。得られた混合物を２つのフラグメントのライゲーションに適した条件下で維持する。ライゲーション混合物を細菌ＨＥ１０１を形質転換するのに使用し、ついで該菌をベクターが所望の適切に挿入された遺伝子を有することを確認するためカナマイシン含有寒天上に播種する。両栄養性のｐＡ３１７またはＧp+am１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄulbecco'ｓＭodified Ｅagles Ｍedium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるまで組織培養にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶベクターをついで培地に添加し、パッケージング細胞を該ベクターでトランスデュースする。今度はパッケージング細胞は、該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。新しい培地をトランスデュースしたプロデューサー細胞に添加し、引き続き培地を１０ｃｍプレート全面のプロデューサー細胞から回収する。感染性ウイルス粒子を含む使用し尽くした培地をミリポアフィルターで濾過して分離したプロデューサー細胞を除去し、ついでこの培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を線維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロデューサー細胞からの培地とすばやく取り替える。この培地を除去し、新しい培地で置き換える。ウイルス力価が高い場合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は一切必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、neoまたはhisなどの選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。操作された線維芽細胞を、単独またはサイトデックス・３・ミクロキャリア・ビーズ（cytodex ３ microcarrier beads）上全面に増殖した後に、宿主に注入する。該線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、追記する請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ０７Ｋ 14/475 16/22 16/22 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＨＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＳ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アダムス，マーク・ディアメリカ合衆国20878メリーランド州ノース・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸−２３からアミノ酸１８３までを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸１からアミノ酸１８３までを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、少なくとも７０％一致するポリヌクレオチド；および（ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドフラグメントよりなる群から選択されるメンバーを含む単離したポリヌクレオチド。２．該ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．配列番号：２のアミノ酸−２８から１８３までを含むポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。４．配列番号：２のアミノ酸１から１８３までを含むポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。５．（ａ）ＡＴＣＣ受託番号第号に含まれるＤＮＡによってコードされた成熟ポリペプチドコードするポリヌクレオチド（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第号に含まれるＤＮＡによって発現されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができ、少なくとも７０％一致するポリヌクレオチド（ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドフラグメントよりなる群から選択されたメンバーを含む単離したポリヌクレオチド。６．配列番号：１のヌクレオチド１からヌクレオチド９００までに示す配列を含む請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．配列番号：１のヌクレオチド１１７からヌクレオチド７３５までに示す配列を含む請求項２に記載のポリヌクレオチド。８．配列番号：１のヌクレオチド１８７からヌクレオチド７３５までに示す配列を含む請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。１０．請求項１１に記載のベクターで遺伝的に操作した宿主細胞。１１．請求項１２に記載の宿主細胞から該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現することからなる、ポリペプチドの製造方法。１２．請求項１１に記載のベクターで細胞を遺伝的に操作することからなる、ポリペプチドを発現することができる細胞の製造方法。１３．（ｉ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびそのフラグメント、類似体および誘導体、および（ii）ＡＴＣＣ受託番号第号のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドおよびそのフラグメント、類似体および誘導体よりなる群から選択されるメンバーを含むポリペプチド。１４．該ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸１から１８３までを含む請求項１３に記載のポリペプチド。１５．請求項１３に記載のポリペプチドの活性を模擬している化合物。１６．請求項１３に記載のポリペプチドの活性をアンタゴナイズする化合物。１７．請求項１３に記載のポリペプチドに対する抗体。１８．細胞の表面に、受容体に化合物が結合することに応じて検出可能なシグナルを提供することができる第２の要素と関連しているものであるポリペプチドの受容体を発現している細胞と、該受容体に結合できる条件下でスクリーニングすべき化合物とを接触させ、該化合物が該受容体に結合して該受容体を活性化または阻害するか否かを、該化合物と該受容体の相互作用から産生されるシグナルの存在または不在を検出することによって決定するよりなる請求項１３に記載のポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法。１９．請求項１に記載のポリヌクレオチドにおける変異を決定することからなる、ＳＣＧＦ核酸配列における変異に関連する疾患またはその疾患の罹患し易さを診断するための方法。２０．宿主由来のサンプル中で請求項１３に記載のポリペプチドの存在を分析することよりなる診断方法。