DE10027695A1 - Vakzine gegen konformationsabhängige Antigene sowie gegen Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind - Google Patents
Vakzine gegen konformationsabhängige Antigene sowie gegen Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sindInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das es erlaubt, die hocheffektive Technologie der Vakzinierung mittels Desoxyribonukleinsäure (DNA) nicht nur auf Sequenzepitope von Proteinen oder Peptiden, sondern auch auf Konformationsepitope anzuwenden. Dieses Verfahren ermöglicht darüber hinaus die Nutzung der DNA-Vakzinierung auch bei solchen Antigenen, die keine oder nur teilweise Proteine oder Peptide sind. DOLLAR A Die bevorzugte erfindungsgemäße Vakzine enthält als wesentlichen Bestandteil eine Desoxyribonukleinsäure (DNA), die eine Peptidsequenz kodiert, welche ihrerseits die immunologische Imitation (Mimikry) eines konformationsabhängigen Antigens einschließlich Protein-Konformationsepitope oder eines Antigens, das kein oder nur teilweise Protein oder Peptid ist, darstellt. Das Mimikry-Peptid, das ebenfalls Teil der erfindungsgemäßen Vakzine ist oder sein kann, ist entweder ein antiidiotypischer Antikörper, ein Antikörperfragment, ein daraus abgeleitetes Peptid oder ein durch Selektion aus einer Peptid-Genbank erhaltenes spezifisch bindendes Peptid. DOLLAR A Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische und die veterinärmedizinische Immunologie, darunter die adjuvante Therapie von Tumorerkrankungen.
Description
Die Erfindung betrifft Vakzinen gegen konformationsabhängige Antigene sowie gegen
Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind. Desweiteren
betrifft die Erfindung Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung sowie humane
antiidiotypische Antikörperfragmente gegen das MUC1-Konformationsepitop und
Aminosäuresequenzen von Mimikry-Peptiden gegen das MUC1-Konformationsepitop
sowie antiidiotypische Antikörperfragmente gegen das TF-Antigen und
Aminosäuresequenzen von Mimikry-Peptiden gegen das TF-Kohlenhydratepitop.
Zielstrukturen von Vakzinen gegen Erreger infektiöser Erkrankungen und nicht infektiöser
Erkrankungen, einschließlich Tumoren, können Proteine bzw. Peptide, Kohlenhydrate oder
Lipide, sowie Kombinationen aus diesen sein. Bei Proteinen bzw. Peptiden kann die
immunogene Determinante (Epitop) entweder durch die Sequenz der Aminosäuren eines
Abschnitts des Moleküls (Sequenzepitop) oder durch eine bestimmte räumliche Anordnung
von Bindungskräften, die nicht der linearen Anordnung der Aminosäuren entspricht,
bestimmt sein (Konformationsepitop). Konformationsepitope sind häufiger als
Sequenzepitope; Mischformen kommen ebenfalls vor.
Konformationsepitope und Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder
Peptide sind, sind nur schwer in eine wirksame und praktikable Vakzine umzusetzen.
Konformationsepitope bilden sich in der Regel nur im nativen Protein und nicht in kürzeren
Peptiden aus. Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, wie
beispielsweise Glykostrukturen oder Lipide, sind wenig immunogen. Ihre Synthese ist oft
aufwendig. Ein besonders schwerwiegender Umstand ist, daß diese Antigene dem
Immunsystem in vielen Fällen nicht richtig präsentiert werden. Eine effektive
Antigenpräsentation ist aber unter anderem eine Voraussetzung für die Entstehung
zytotoxischer T-Lymphozyten, d. h. für eine wirksame zelluläre Abwehr. Schließlich ist die
sehr wirksame Form der DNA-Vakzinierung auf diese Antigene nicht anwendbar.
Bei der DNA-Vakzinierung (genomischen Vakzinierung) wird anstelle eines Protein- oder
Peptidantigens die kodierende DNA-Sequenz als solche oder in einen Vektor verpackt
intramuskulär oder intradermal als Vakzine injiziert. Auf diese Weise kann eine effektive
humorale Antwort und zelluläre Antwort erreicht werden (Wolff, J. A. et al., Science
247: 1465, 1990; Ulmer, J. B. et al., Vaccine 12: 1541, 1994; Raz, E. et al., Cancer Res.
52: 1954, 1992). Ein besonders erfolgreiches Verfahren ist das sog. "Prime-Boost-Protocol"
(Keystone Symposia: DNA-Vaccines, 12.-17.4.99, Snowbird, Utah, USA, Konferenzband),
bei dem die intradermale, intramuskuläre oder intrarektale Injektion einer DNA (Priming),
von einer Boosterung mit dem korrespondierenden Antigen gefolgt wird. Für die
Boosterung kann auch ein entsprechendes rekombinantes Virus-Vektorpartikel (z. B.
Fowlpox-, Adeno- oder Alphavirus-abgeleitete Konstrukte) erfolgreich eingesetzt werden.
Das "Prime-Boost"-Verfahren führt bekannterweise zu einer starken zellulären
Immunantwort mit der Aktivierung spezifischer zytotoxischer T Zellen, die im Falle von
Tumorvakzinen besonders erwünscht ist. Deutlich verstärkt werden kann die Immunantwort
durch zusätzliche Gabe von geeigneten Cytokinen, ebenfalls in Form einer DNA, von
immunstimulatorischen CpG-DNA-Motiven (nichtmethylierte Cytosin-Guanin-
Dinukleotide) oder von geeigneten Adjuvantien (z. B. Aluminiumphosphaten).
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die oben genannten Nachteile zu umgehen und
eine Vakzine, insbesondere eine DNA-Vakzine, auch für die Fälle zu entwickeln, die einer
entsprechenden Vakzinierung bisher nicht zugänglich sind.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Sie betrifft zum einen ein Verfahren,
mit dem der Anwendungsbereich der Vakzinierung, insbesondere der DNA-Vakzinierung
auf konformationsabhängige Antigene und Mischformen, diese fallen im Sinne der
Erfindung ebenfalls unter den Begriff der Konformationsepitope, sowie Antigene, deren
relevante Epitope keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, z. B.
Kohlenhydrate, kombinierte Kohlenhydrat-Peptidepitope, Lipide, Glykolipide, erweitert
wird und somit die oben aufgeführten Nachteile umgangen werden können. Dies geschieht
erfindungsgemäß auf dem Umweg über ein das ursprüngliche Epitop (die Antigen-
Determinante) immunologisch abbildendes, aber in seiner Aminosäuresequenz
verschiedenes Peptid (Mimikry-Peptid). Dabei wird das Mimikry-Peptid vorzugsweise mit
Hilfe der an sich bekannten Methoden des Phagen-Displays oder Ribosomen-Displays
(Scott, J. K. und Smith, G. P. Science, 249: 386, 1990; Winter, G. et al. Annu Rev Immunol,
12: 433, 1994; Hanes, J. et al. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 14130, 1998) gewonnen, und
zwar entweder als kürzeres Peptid aus Peptid-Genbanken oder in Form eines
antiidiotypischen Antikörperfragments aus entsprechenden Genbanken. Als dritte,
allerdings aufwendigere Methode kommt die Gewinnung antiidiotypischer Antikörper
mittels der Hybridomtechnik in Frage. Das gemeinsame Ziel der drei genannten
methodischen Varianten ist, das ursprüngliche Konformationsepitop oder das Epitop, das
kein oder nicht ausschließlich ein Protein oder Peptid ist, in ein immunologisch
entsprechendes Sequenzepitop "umzuschreiben", das eine bessere immunologische
Präsentation ermöglicht und für eine DNA-Vakzinierung geeignet ist. Erfindungsgemäß
können die Vakzinen, insbesondere die DNA-Vakzinen nicht nur in Form des
beschriebenen Beispiels (Prime-Boost-Protokoll), sondern, auch in vergleichbaren
Varianten und in Form der DNA-Vakzine allein oder der Mimikry-Strukturen allein in
entsprechend geeigneten Formulierungen eingesetzt werden.
Außerdem betrifft die Erfindung Vakzinen gegen konformationsabhängige Antigene
gemäß Anspruch 1. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden dabei die relevanten
Konformationsepitope mit Hilfe der Phagen-Display- oder Ribosomen-Display-Methode in
ein immunologisch entsprechendes und das Konformationsepitop imitierendes
Sequenzepitop "umgeschrieben". Als primäre Reagenzien dienen dabei Moleküle, die das
Zielantigen in seiner gewünschten Konformation spezifisch binden, z. B. Antikörper,
Antikörperfragmente oder Rezeptoren. Aus den verschiedenen Genbibliotheken werden so
Antikörperfragmente (antiidiotypische Antikörperfragmente, Ab2) oder lineare oder
zirkuläre Peptide gewonnen, die die primären Reagenzien spezifisch binden und das
Antigen immunologisch imitieren. Alternativ werden antiidiotypische Antikörper mit Hilfe
der Hybridomtechnik gewonnen und gegebenenfalls Fragmente daraus isoliert. Diese
Mimikry-Peptide werden in eine DNA umgeschrieben und als DNA-Vakzine eingesetzt.
Ein Verfahren ist dabei das sog. "Prime-Boost-Protocol", bei dem die intradermale,
intramuskuläre oder intrarektale Injektion einer DNA (Priming), in Form einer Plasmid-
DNA, linearen DNA oder eines Plasmid-Replikon-Vektors, von einer Boosterung mit dem
korrespondierenden Antigen, alleine, in Form einer chemischen Kopplung an Proteine, in
Form von Bakteriophagen als Fusionsproteine mit Phagenhüllproteinen auf deren
Oberfäche, in Form eines Fusionsproteins auf der Oberfläche anderer Viren oder
attenuierter biologischer Träger oder in Form mit dem Peptid beladener dendritischer
Zellen, gefolgt wird. In diesem Fall werden sowohl die DNA als auch das exprimierte
Mimikry-Peptid benötigt, was bei Anwendung der Phagen-Display- bzw. Ribosomen-
Display-Technik problemlos möglich ist. Alternativ kann für die Boosterung ein
entsprechendes rekombinantes Virus-Vektorpartikel (z. B. Fowlpox-, Adeno- oder
Alphavirus-abgeleitete Konstrukte) erfolgreich eingesetzt werden. Die Immunantwort kann
deutlich durch die zusätzliche Gabe von geeigneten Cytokinen, ebenfalls in Form einer
DNA, von immunstimulatorischen CpG-DNA-Motiven (nichtmethylierte Cytosin-Guanin-
Dinukleotide) oder von geeigneten Adjuvantien (z. B. Aluminiumphosphaten) verstärkt
werden.
Die Erfindung betrifft neben Vakzinen gegen konformationsabhängige Antigene auch
Vakzinen gegen Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind,
gemäß Anspruch 3. Ein Zielantigentyp der Gruppe Antigene die keine oder nicht
ausschließlich Proteine oder Peptide sind, sind Glykostrukturen, weitere, immunogene
Strukturen sind kombinierte Kohlenhydrat-Proteinepitope, Lipide, Glykolipide oder
synthetische Strukturen.
Aus DE 196 27 352 A1 ist ein Verfahren bekannt, mit dem ein monoklonaler
antiidiotypischer Antikörper mit Hilfe der Hybridomtechnik gewonnen wird, der reine
Kohlenhydratstrukturen immunologisch imitiert. Erfindungsgemäß wird ausgehend von
diesem antiidiotypischen Antikörper wird eine Vakzine, bevorzugt eine DNA-Vakzine
dieses Antikörpers oder eines geeigneten Fragmentes davon für die Vakzinierung
verwendet. So erweitert die vorliegende Erfindung dieses Verfahren aus DE 196 27 352 A1
in mehreren Punkten. Es können antiidiotypische Antikörperfragmente direkt aus
Antikörper-Genbibliotheken mittels der Phagen-Display-Technik oder der Ribosomen-
Display-Technik gewonnen werden. Mit Hilfe dieses Verfahrens können direkt auch
humane Antikörperfragmente gewonnen werden. Darüber hinaus können auch kombinierte
Kohlenhydrat-Peptidepitope angewendet werden. Hinzu kommt weiter ein Verfahren, mit
dem kurze lineare oder zirkuläre Peptide, die das Antigen immunologisch imitieren
(sogenannte Mimikry-Peptide), aus Peptid-Genbibliotheken, ebenfalls mittels der Phagen-
Display-Technik oder der Ribosomen-Display-Technik, gewonnen werden können. Dabei
dienen nicht nur spezifische idiotypische Antikörper (Ab1), sondern auch andere
Substanzen, die die Glykostruktur spezifisch erkennen, wie z. B. Lektine oder Rezeptoren,
als primäre Reagenzien zur Selektion dieser imitierenden Strukturen. Das Verfahren
schließt weiterhin die Verwendung dieser gewonnenen Strukturen bevorzugt als DNA-
Vakzine ein, allein oder in Kombination mit den das Antigen immunologisch imitierenden
Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Peptiden in einer geeigneten Formulierung (siehe
oben und Ansprüche), beispielsweise in der Formulierung des Prime-Boost-Protokolls.
Außerdem können gemäß der Erfindung die imitierenden Proteinstrukturen auch alleine zur
Vakzinierung verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch Vakzine, im vollen Umfang wie für konformationsabhängige
Antigene beschrieben, gegen die Antigene Glykopeptide, Glykolipide, Lipide, synthetische
Strukturen oder weitere Antigene, die keine oder lediglich teilweise Proteine oder Peptide
sind, wobei die relevanten Epitope verbesserte immunogene Strukturen aufweisen,
Verfahren ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Der Ansatz einer Immuntherapie bei Tumorerkrankungen geht davon aus, daß es möglich
ist, die natürliche Immunantwort zu verstärken oder zu aktivieren. Die Rationale einer
Vakzinierung besteht in der Bekämpfung der Residualerkrankung (Metastasenprophylaxe)
nach einer konventionellen Therapie (z. B. chirurgischer Entfernung der Hauptmenge der
Tumorzellen). Mimikry-Peptide imitieren definitionsgemäß immunologisch das
ursprüngliche Antigen bzw. Epitop. Sie tun dies weitestgehend, aber nicht hundertprozentig.
Dies ist für den Anwendungsfall im Rahmen einer Vakzine (im besonderen bei einer
Tumorvakzine) eher positiv in dem Sinne zu sehen, daß spezifisch inhibierende Prozesse,
z. B. Toleranzphänomene, umgangen werden.
Voraussetzung für die Entwicklung definierter Tumorvakzinen ist nicht nur das
Vorhandensein tumorspezifischer Antigene, sondern auch ihre Kenntnis. Auf diesem Gebiet
sind in den letzten drei Jahrzehnten große Fortschritte erzielt worden, nicht zuletzt durch die
Entwicklung monoklonaler Antikörper.
Ein weitverbreitetes Karzinomantigen ist das epitheliale Muzin, MUC1, dessen
immundominantes Epitop in vielfacher Wiederholung auf dem extrazellulären Teil des
Moleküls vorkommt. Dieses Epitop bildet im nativen Zustand einen Typ-I-β-Turn aus, an
synthetischen Peptiden allerdings nur unter bestimmten Bedingungen, z. B., wenn das
Threonin der immundominanten Region mit GalNAcα1-0-Thr oder Galβ1-3GalNAcα1-0-
Thr glykosyliert ist (Karsten, U., et al., Cancer Res. 58: 2541-2549, 1998). Dieses Epitop wird
vom Immunsystem in der Regel als typisches Konformationsepitop wahrgenommen, vgl.
Beispiel 1. Erfindungsgemäß wird dieses Konformationsepitop mittels der Phagen-Display-
Technik durch immunologisch identische (oder nahezu identische) Sequenzepitope imitiert,
die in Form einer DNA in einem DNA-Vakzinierungsvektor Bestandteil einer
Tumorvakzine sind (Beispiel 1).
Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch humane antiidiotypische Antikörperfragmente
gegen das MUC1-Konformationsepitop sowie alle DNA Sequenzen, die diese Fragmente
kodieren, und Proteinsequenzen oder DNA- o. Proteinteilsequenzen, die von diesen
abgeleitet werden können und die die entsprechenden Eigenschaften aufweisen.
Bevorzugt handelt es sich um die folgenden humanen antiidiotypischen
Antikörperfragmente gegen das MUC1-Konformationsepitop mit den folgenden Sequenzen
Nr. 1 bis 31.
Fragmente, die die gewünschte DNA der scFv und der Peptide enthalten, wurden mit Hilfe
der PCR vermehrt und anschließend sequenziert.
(Die Bezifferung, z. B. Q33, entspricht einem bestimmten isolierten Klon; die Sequenzen der
verschiedenen scFv sind gegeneinander ausgerichtet (Alignment); die komplette Sequenz
eines Klones ist für jeden Klon durchgehend über die verschiedenen Blöcke zu lesen)
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin auch Aminosäurensequenzen von Mimikry-
Peptiden gegen das MUC1-Konformationsepitop sowie alle DNA Sequenzen, die diese
Aminosäuresequenzen kodieren, DNA und Peptid- sowie Peptidteilsequenzen, die von
diesen abgeleitet werden und die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
Insbesondere handelt es sich um die Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden mit den
folgenden Sequenzen Nr. 32 bis 47.
(Die Bezifferung, z. B. S1, entspricht einem bestimmten isolierten Klon; die Sequenzen der
verschiedenen Peptide sind gegeneinander ausgerichtet)
Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind (z. B.
Kohlenhydrat-Antigene) werden, ähnlich wie Konformationsepitope von Proteinen, vom
Immunsystem als dreidimensionale Muster von Ladungen und anderen molekularen
Wechselwirkungen wahrgenommen und unterliegen wie diese Einschränkungen bei der
Generierung einer zellulären Immunantwort. Auch in diesen Fällen kann die
erfindungsgemäße Selektion von Mimikry-Peptiden mittels der Phagen-Display-Technik zu
einem "Umschreiben" des Antigens in eine Peptid-Sequenz führen, die wiederum die
Anwendung der DNA-Vakzinierungstechnik ermöglicht, vgl. Beispiel 2.
Gegenstand der Erfindung sind auch Protein-Sequenzen antiidiotypischer
Antikörperfragmente gegen TF sowie Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden gegen
das TF-Kohlenhydratepitop sowie alle DNA Sequenzen, die diese Aminosäuresequenzen
kodieren und DNA sowie Protein- bzw. Peptid- sowie -teilsequenzen, die von diesen
abgeleitet werden und die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
Insbesondere handelt es sich um die folgenden Protein-Sequenzen antiidiotypischer
Antikörperfragmente gegen TF mit den Sequenzen Nr. 48 bis 71.
Desweiteren handelt es sich um die Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden gegen
das TF-Kohlenhydratepitop mit den folgenden Sequenzen Nr. 72 bis 96.
(Die Bezifferung, z. B. S1, entspricht einem bestimmten isolierten Klon)
Die Erfindung wird durch Ausführungsbeispiele näher erläutert, soll jedoch auf diese
Beispiele nicht beschränkt werden.
Balb/c-Mäuse wurden mit einer Suspension lebender menschlicher Mammakarzinomzellen
der Zellinie T-47D (Keydar, I., et al., Eur J Cancer, 15: 659, 1979) nach Behandlung mit
Neuraminidase (V. cholerae) ohne Adjuvans i. p. immunisiert. Als Fusionszellinie diente
X63-Ag8.653 (Kearney, J. F., et al., J Immunol 123: 1548, 1979). Die Hybridomtechnik
selbst wurde nach Standardmethoden (z. B. Peters, H. H., et al., "Monoklonale Antikörper,
Herstellung und Charakterisierung", Berlin 1985; Friemel, H., "Immunologische
Arbeitsmethoden", 4. Aufl., Jena 1991) durchgeführt. Die Spezifitätsanalyse der von den
Hydridomzellinien produzierten monoklonalen Antikörper (mAk) basierte auf
Enzymimmunoassays mit natürlichen Glykoproteinen und synthetischen Peptiden und
Glykopeptiden, Immunfluoreszenzanalysen mit diversen Zellinien sowie
immunhistochemischen Untersuchungen an Gewebsschnitten. Für den mAk A76-A/C7
wurde das epitheliale Muzin, MUC1, als spezifisches Antigen eindeutig bestimmt. Als
Isotyp wurde IgG1, k, mit einem kleinen Anteil von IgM der gleichen Spezifität mit Hilfe
eines kommerziellen Isotyping Kit (Pharmingen, San Diego, USA) ermittelt. Ein Epitop-
Mapping im Rahmen des ISOBM TD-4 International Workshop on Monoclonal Antibodies
against MUC1 (Tumor Biol. 19, Suppl. 1, 1998) definierte das Epitop als APDTRPAP.
Weitere Untersuchungen unter Benutzung synthetischer, glykosylierter und nicht
glykosylierter Peptide zeigten, daß das Epitop des mAk A76-A/C7 in starkem Maße durch
seine Konformation bestimmt wird:
- - Der Antikörper bindet nur geringfügig an eine einzelne Einheit (ein Repeat), obgleich diese die Epitopsequenz enthält.
- - Die Bindung an nicht glykosylierte Peptide ist von der Länge des Peptids, genau genommen von der Zahl der aneinandergereihten Repeats, abhängig (Abb. 1a). Aus der Literatur ist bekannt, daß sich die native Konformation des PDTRP-Motivs erst bei einer Peptidlänge von mehr als 3 Repeats ausbildet (Fontenot, J. D., et al., J Biomol Struct Dyn 13: 245, 1995).
- - Die Bindung des mAk A76-A/C7 an eine einzelne MUC1-Einheit (1 Repeat) wird stark erhöht, wenn diese im Bereich des Epitops am Thr mit GalNAc- oder Galβ1- 3GalNAc-glykosyliert ist (Abb. 1b; siehe auch Karsten, U., et al., Cancer Res, 58: 2541, 1998).
Der Antikörper wurde mittels Ammoniumsulfatfällung gefolgt von einer
Affinitätschromatographie an ProteinA-Sepharose gereinigt.
Es wurden zwei verschiedene synthetische Antikörper-Genbibliothek verwendet, die
humane single-chain Antikörperfragmente (scFv) darstellen. Die eine Antikörper-
Genbibliothek (Griffin 1 Library; http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/~phage/) besteht aus mehr
als 109 Phagen mit jeweils verschiedenen Kombinationen der variablen Regionen der
schweren und leichten Ketten humaner Antikörper mit zum Teil randomisierten
hypervariablen Regionen, welche mit einem Peptidstück (Linker) verbunden sind und
kovalent an ein Phagenhüllprotein (pIII) gebunden sind. Sie leitet sich aus einer anderen
Antikörper-Genbibliothek ab (Griffiths, A. et al., 1994, EMBO J., 13: 3245-3260). Die
zweite, kleinere Genbibliothek besteht aus scFv mit dem gleichen Framework (single
framework library), die durch Bindung an Protein L und Protein A auf aktive Faltung der
Antikörperfragmente vorselektioniert wurde (I. Tomlinson, 9th anniverary
conference: "Antibody engineering", IBC-Conferences, San Diego 1998; I. Tomlinson, 10th
anniverary conference: "Antibody engineering", IBC-Conferences, San Diego 1999;
Speaker-Abstract). Die erste Bibliothek stammt aus dem Labor Dr. G. Winter und die zweite
aus dem Labor Dr. I. Tomlinson (jeweils MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge,
UK). Die spezifischen Phagen wurden in 2-3 Runden selektioniert (Phagen-Panning) unter
Verwendung der proteolytischen Selektionsmethode mit dem Helferphagen KM13
(Kristensen, P. und Winter, G., Folding & Design, 3: 321, 1998). Als Antigen diente der
gereinigte monoklonale Antikörpre A76-A/C7 (35 µg/ml in 4 ml), das in einem
Teströhrchen (Immunotube, Nunc, Wiesbaden) über Nacht bei 4°C in PBS immobilisiert
wurde. Alternativ wurde A76-A/C7 mit den Phagen inkubiert; die an die Antikörper
gebundenen Phagen wurden durch Magnetbeads mit immobilisierten anti-IgG Antikörpern
(Deutsche Dynal, Hamburg) gewonnen. Die in den Selektionsrunden spezifisch gebundenen
Phagen (3 h bei RT) wurden nach stringenten Waschschritten (bis zu 20 mal PBS/0.1%
Tween20 und darauffolgend 20 mal PBS) durch das in der PDTR mit GalNAc glykosylierte
Tandem-Repeat (100 µg/ml; Biosynthan, Berlin-Buch) eluiert und anschließend mit
Trypsin (proteolytische Selektionsmethode) behandelt. Zwischen den Selektionsrunden
wurden die eluierten Phagen in den Bakterien mit Helferphagen vermehrt und erneut
selektioniert.
Analog dem Beispiel zur Generierung von antiidiotypischen Antikörpern wurde in
mehreren Selektionsrunden aus einer Peptid-Genbibliothek (Genbibliothek erhalten von
Dr. H. Gollasch; Oligino, L., et al., J Biol Chem 272: 29046, 1997), die 107 verschiedene kurze
Peptide an das Phagenhüllprotein pIII gekoppelt besitzt, spezifisch bindende Peptide
gewonnen. Die exprimierten Peptide sind randomisierte Nonapeptide, die von zwei
Cysteinen flankiert (CX9C) und damit zirkularisiert werden, wodurch die Stabilität und die
Affinität erhöht werden. Die Selektion und Testung erfolgte wie bei der Generierung der
antiidiotypischen Antikörper beschrieben. Analog dazu wurden mit weiteren
Peptidbibliotheken zusätzliche lineare und zirkuläre Mimikry-Peptide gewonnen. Dabei
handelt es sich um Peptid-Bibliotheken, die analog der oben beschriebenen Peptid-
Bibliothek hergestellt wurden. Bei den exprimierten Peptiden handelt es sich um lineare
Peptide mit 7 Aminosäuren und um zirkuläre Peptide mit 7 randomisierten Aminosäuren,
flankiert von zwei Cysteinen (CX7C), um zirkuläre Peptide mit 10 randomisierten
Aminosäuren, flankiert von zwei Cysteinen (CX10C), und um zirkuläre Peptide mit
insgesamt 9 randomisierten Aminosäuren, mit zwei internen und zwei flankierenden
Cysteinen (CX3CX3CX3C).
Die selektionierten Peptide und Antikörperfragmente wurden in ELISA-Tests auf ihre
Bindung an den mAk A76-A/C7 sowie in Form einer Negativ-Kontrolle an andere IgG und
IgM-mAk getestet. Außerdem wurden sie in ELISA-Tests auf ihre Bindung an eine Reihe
von gut charakterisierten MUC1-spezifischen Antikörpern geprüft, die sich in ihrer
Feinspezifität unterscheiden. Für die ELISA-Tests wurde die an Phagen gekoppelte Form
der Peptide und Antikörperfragmente verwendet. Die antiidiotypischen svFv und die
Mimikry-Peptide lassen sich dabei in Gruppen unterteilen, die:
- - ausschließlich an A76-A/C7 binden
- - an A76-A/C7 und an andere MUC1-spezifische Antikörper binden, die entweder nur an das Konformationsepitop (in der PDTR-Region glykosyliertes MUC1-Tandem- Repeat) binden (Typ A) oder deren Bindung durch die PDTR-Glykosylierung des MUC1 Tandem Repeats (Konformationsinduktion) stark erhöht wird (Typ B)
- - an MUC1-spezifische Antikörper, die neben Typ A und B auch MUC1-spezifische Antikörper binden, die in gleichem Maße glykosylierte und unglykosylierte MUC1- Tandem-Repeats binden (Typ D)
- - eine starke Bindung an MUC1-spezifische Antikörper haben, die sich bezüglich der Glykosylierung der PDTR-Region des MUC1-Repeats zu A76-A/C7 umgekehrt verhalten und das glykosylierte MUC1-Peptid nicht oder wesentlich geringer als das nichtglykosylierte MUC1-Peptid binden (Typ C). Dabei können diese Mimikry- Peptide oder antiidiotypischen scFv auch an andere Typen der MUC1-spezifischen Antikörper binden.
Die Mimikry-Peptide und antiidiotypischen Antikörperfragmente wurden außerdem in
ELISA-Inhibitionstests daraufhin untersucht, ob sie, in Form der synthetisierten Peptide
oder gereinigten scFv (allein oder an Phagen gekoppelt) die Bindung des A76-A/C7 an das
glykosylierte MUC1-Peptid (im Epitop PDTR mit Ga1NAc glykosyliertes Tandem-Repeat)
und nichtglykosylierte Oligomere des 20-mer Tandem-Repeats spezifisch und
konzentrationsabhängig hemmen. Diese Versuche wurden mit Streptavidin-beschichteten
Mikrotestplatten (BioTeZ, Berlin-Buch) und biotinylierten MUC1-Peptiden (Biosynthan,
Berlin-Buch; Abb. 1c) sowie mit normalen ELISA-Testplatten, auf denen die MUC1-
Peptide durch Antrocknen immobilisiert wurden, durchgeführt.
Inzuchtmäuse des Stammes Balb/c wurden intraperitoneal mit Mimikry-Peptiden und
antiidiotypischen Antikörperfragmenten in Form der synthetisierten Peptide oder
gereinigten scFv alleine, jeweils gekoppelt an das Protein KLH oder gekoppelt an
Bakteriophagen in PBS, gemischt mit inkomplettem Freundschem Adjuvans, immunisiert.
Dabei wurden Mischungen von antiidiotypischen scFv-Phagen beziehungsweise Mimikry-
Peptid-Phagen aus jeweils den verschiedenen Gruppen (s. o.) verwendet. Drei Wochen
später wurde mit dem gleichen Ansatz jedoch ohne Adjuvans geboostert. Die Boosterung
wurde nach 3 Wochen wiederholt und 10 Tage später den Mäusen Blut entnommen. Das
Serum wurde in ELISA-Tests auf Antikörper getestet, die spezifisch das
konformationsabhängige Epitop des MUC1 erkennen (Versuchsaufbau wie oben). Die
Mischungen der antiidiotypischen scFv sowie der Mimikry-Peptide erzeugen eine starke
Reaktion gegen das konformationsabhängige Epitop des MUC1.
Die antiidiotypischen scFv wurden direktional in einen DNA-Vakzinierungsvektor kloniert.
Dabei wurden die scFv durch SfiI und NotI aus dem Phagemid Vektor ausgeschnitten und
direktional in verschiedene DNA-Vakzinierungsvektoren kloniert die zuvor mit den
gleichen Enzymen gespalten wurden. Ein geeigneter Vektor hierbei ist der Vektor pVAC2
(I. Harmer et al., Keystone Symposium "DNA-Vaccines", Snowbird, USA, 1999; Poster und
Posterabstract), der, nach erfolgter Einfügung des scFv in den DNA-Vakzinierungsvektor,
ein Fusionsprotein aus dem antiidiotypischen scFv mit einem Tetanus-Toxoid kodiert. Das
Tetanustoxoid hat dabei die Eigenschaft eines Adjuvans und verstärkt die Immunreaktion
gegen den fusionierten Proteinanteil C. King et al., 1998, Nat. Medicine 4: 1281-86).
Die Mimikry-Peptide wurden ebenfalls in verschiedene DNA-Vakzinevektoren kloniert.
Die Klonierung erfolgte nach der an sich bekannten Methode der PCR-Klonierung, bei der
mit Hilfe synthetischer Primer die Sequenzen die für die Mimikry-Peptide kodieren, in die
DNA-Vakzinierungsvektoren eingefügt wurden. Dabei wurden ebenfalls DNA-
Vakzinierungsvektoren auf der Basis des pVAC2 hergestellt, die jeweils für ein
Fusionsprotein des Mimikry-Peptides mit dem Tetanustoxoid kodieren.
Die DNA der Vakzinierungsvektoren wurde nach an sich bekannten Methoden vermehrt,
gereinigt und anschließend Mäusen injiziert. Dabei wurden für die Immunisierung
Mischungen von DNA-Vakzinierungsvektoren, die antiidiotypische scFv beziehungsweise
Mimikry-Peptide als Fusionsprotein mit dem Tetanustoxoid kodieren, die jeweils aus den
verschiedenen Gruppen mit unterschiedlichen Bindungsmustern für MUC1-spezifische
Antikörper (s. o.) stammen, verwendet. Als Dosis wurden 50 µg bzw. 200 µg an Gesamt-
DNA verwendet und intra muskulär appliziert. Vier Wochen später wurde mit dem gleichen
Ansatz geboostert und die Boosterung nach 4 Wochen wiederholt und 10 Tage später den
Mäusen Blut entnommen. Das Serum wurde in ELISA-Tests auf Antikörper getestet, die
spezifisch das konformationsabhängige Epitop des MUC1 erkennen (Versuchsaufbau wie
oben).
Die Immuniserung mit den Mischungen der DNA-Vakzinevektoren, ergab sowohl bei den
antiidiotypischen scFv als auch bei den Mimikry-Peptiden die kodierenden DNA-Vektoren
eine starke humorale Immunreaktion gegen das konformationsabhängige Epitop des MUC1
sowie eine starke Reaktion gegen das Tetanustoxoid.
Im Maus Tumor-Challenge Modell wurden verschiedene Maustumorzellinien (3T3 und
P815) verwendet, die mit der cDNA der Transmembran-Form des humanen MUC1 stabil
transfiziert. Die MUC1-positiven Mauszellinien exprimieren das Konformationsepitop des
MUC1, das durch Immunbindungsstudien mit dem A76-A/C7 getestet wurde. Für die
Studien wurden mehrere Mäusestämme verwendet (Balb/c, DBA/2 und C57BL/6). Nach der
Vakzinierung der Mäuse nach dem unten beschriebenen Prime-Boost-Protokoll wurden die
Mäuse mit 106 bis 107 Tumorzellen in 200 µl PBS subkutan in der Nähe des Peritoneum
injiziiert und das Tumorwachstum (Tumorgröße in mm) über 20-30 Tage gemessen.
Es wurden für die Immuniserungen (Priming) eine Kombination aus DNA-
Vakzinierungsvektoren (kodierend für scFv-Tetanustoxoid- bzw. Mimikry-Peptid-
Tetanustoxoid-Fusionsprotein) mit jeweils zwei Kandidaten aus den 4 unterschiedlichen
Gruppen der antiidiotypischen-scFv bzw. Mimikry-Peptide verwendet. Für die Boosterung
wurden die gleichen Kombinationen der antiidiotypischen scFv bzw. Mimikry-Peptide
jedoch in ihrer Proteinform in inkomplettem Freundschem Adjuvans verwendet. Hierfür
wurden die scFv nach an sich bekannten Verfahren durch eine Nickel-Chelat-
Chromatographie gereinigt und die Mimikry-Peptide nach an sich bekannten Vefahren
chemisch an KLH gekoppelt. Für die Immunisierung wurden 50-200 µg gesamt-DNA intra
muskulär appliziert und für die scFv und Mimikry-Peptide 10-200 µg intraperitoneal. Die
zeitlichen Abstände waren 3 Wochen und die Boosterungen erfolgten 2-3 mal.
Als Kontrolle wurden die DNA-Vakzinierungsvektoren für ein scFv mit einer Spezifität
gegen ein irrelevantes bakterielles Protein bzw. für ein irrelevantes Peptid (SSGSSSSGS),
beziehungsweise deren gereinigte scFv oder der Peptid-KLH Komplex verwendet. Für die
verschiedenen Versuchsansätze wurden jeweils 5-10 Tiere untersucht.
Die Versuche zeigen, dass eine Vakzinierung nach dem Prime-Boost-Protokoll das
Wachstum von injiziierten MUC1-positiven Maus-Tumorzellinien verhindert oder auf eine
minimale Größe reduziert (0-20 mm2 nach 20 Tagen). Die gleiche Vakzinierung erreicht bei
darauffolgender Injektion mit den gleichen Tumorzellen ohne transfiziertes MUC1 eine
Tumorgröße von durchschnittlich über 200 mm2 (nach 20 Tagen). Auch die Injektion von
MUC1-positiven Maus-Tumorzellinien in Mäuse ohne vorherige Vakzinierung ergibt eine
starkes Tumorwachstum (< 200 mm2 nach 20 Tagen). Eine Immunisierung und Boosterung
mit den Proteinen der antiidiotypischen-scFv bzw. den Mimikry-Peptiden an KLH
gekoppelt ohne DNA-Vakzinierungsvektoren erbgibt eine Immunantwort gegen die MUC1-
Tumorzellen, die Tumorprotektion ist jedoch um ein vielfaches geringer als bei dem Prime-
Boost Protokoll mit den DNA-Vakzinierungsvektoren.
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Vakzinierung mit DNA-Vakzinierungsvektoren, die für
antiidiotypische scFv bzw Mimikry-Peptide kodieren, eine ausgezeichnete Tumorprotektion
ergibt. Diese Reaktion ist MUC1 spezifisch. Sie ist um ein Vielfaches besser oder überhaupt
möglich im Vergleich zu Vakzinierungsstudien mit den Proteinen der antiidiotypischen-
scFv bzw. Mimikry-Peptiden ohne vorangegangene Immunisierung mit den entsprechenden
DNA-Vakzinierungsvektoren.
Damit ist gezeigt, dass die erfindungsgemäße Vakzine gegen konformationsabhängige
Antigene durch DNA-Vakzinierungsvektoren von Mimikry-Strukturen eine erfolgreiche
Form der Bekämpfung von Tumoren ist, die diese konformationsabhängigen Antigene
tragen.
Balb/c-Mäuse wurden im Fall des A78-G/A7 (siehe auch Karsten, U., et al., Hybridoma
14: 37, 1995), mit 100 µg Asialoglykophorin (Sigma, Deisenhofen) in PBS, gemischt mit
Freundschem Adjuvans, intraperitoneal immunisiert. Nach 24 h wurde 100 µg/kg
Körpergewicht Cyclophosphamid in PBS i. p. verabreicht. Die Boosterung erfolgte nach 2
Wochen mit 100 µg Asialoglykophorin. Als Fusionszellinie diente jeweils X63-Ag8.653
(Kearney, J. F., et al., J Immunol 123: 1548, 1979). Die Hybridomtechnik wurde nach
Standardmethoden (z. B. Peters, H. H., et al., "Monoklonale Antikörper, Herstellung und
Charakterisierung", Berlin 1985; Friemel, H., "Immunologische Arbeitsmethoden", 4. Aufl.,
Jena 1991) durchgeführt. Die Spezifitätsanalyse der von den Hydridomzellinien
produzierten monoklonalen Antikörper basierte auf Enzymimmunoassays mit natürlichen
Glykoproteinen, synthetischen Peptiden und Glykopeptiden, Glykolipiden und
Neoglykolipiden und synthetischen Polyacrylamid-Kohlenhydrat-Konjugaten,
Absorptionsanalysen an synthetischen Kohlenhydratkonjugaten (Synsorb, Chembiomed,
Edmonton, Canada), Immunfluoreszenzanalysen mit diversen Zellinien sowie
immunhistochemischen Untersuchungen an Gewebsschnitten. Für den A78-G/A7 wurde das
tumorassoziierte Kohlenhydratepitop Thomsen-Friedenreich (TF), als spezifisches Antigen
eindeutig bestimmt:
- - A78-G/A7 bindet ausschließlich an das Disaccharid TF in der α-anomeren Konfiguration (TFα; Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr) auf natürlichen und synthetischen Strukturen, wie es natürlich nur auf Glykoproteinen in Form einer direkten O-glykosidischen Bindung an Serine oder Threonine vorkommt. TFβ, das endständig an Glykanketten von Glykolipiden vorkommen kann, sowie andere Kohlenhydratstrukturen, Peptid- oder Lipidanteile werden dagegen nicht gebunden.
- - A78-G/A7 bindet hochspezifisch an verschiedene Karzinomzellinien in Immunfluoreszenzuntersuchungen und an verschiedene Karzinome in histochemischen Untersuchungen. (Cao, Y., et al., Histochem Cell Biol 106: 197, 1996; Cao, Y., et al. Cancer 76: 1700, 1995; Cao, Y., et al., Virchows Arch 431: 159, 1997; Karsten, U., et al., Hybridoma 14: 37, 1995).
- - Als Isotyp wurde für A78-G/A7 der Isotyp IgM, k, mit Hilfe eines kommerziellen Isotyping Kit (Pharmingen, San Diego, USA) ermittelt.
A78-G/A7 wurde aus Zellkulturüberständen mittels einer Ammoniumsulfatfällung,
gefolgt von einer Affinitätschromatographie an einer ProteinG-Affinitätsmatrix zur
Abreinigung von ungewünschten IgG Antikörpern aus dem Kälberserum und schließlich
mit einer Affinitätschromatographie mittels einer Ziege-anti-Maus-Ig-Affinitätsmatrix
(Perzellulose, BioTeZ, Berlin-Buch) gereinigt (Dr. G. Butschak).
Es wurden zwei verschiedene synthetische Antikörper-Genbibliotheken verwendet, die
humane single-chain Antikörperfragmente (scFv) darstellen. Die eine Antikörper-
Genbibliothek besteht aus mehr als 1010 Phagen mit jeweils verschiedenen Kombinationen
der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten humaner Antikörper mit zum Teil
randomisierten hypervariablen Regionen, welche mit einem Peptidstück (Linker) verbunden
sind und kovalent an ein Phagenhüllprotein (pIII) gebunden sind. Sie leitet sich aus einer
anderen Antikörper-Genbibliothek ab (Griffiths, A. et al., 1994, EMBO J., 13: 3245-3260).
Die zweite, kleinere Genbibliothek besteht aus scFv, die auf aktive Faltung der
Antikörperfragmente vorselektioniert wurden. Die erste Bibliothek stammt aus dem Labor
Dr. G. Winter und die zweite aus dem Labor Dr. I. Tomlinson (jeweils MRC Centre for
Protein Engineering, Cambridge, UK). Die spezifischen Phagen wurden in 2-3 Runden
selektioniert (Phagen-Panning) unter Verwendung der proteolytischen Selektionsmethode
mit dem Helferphagen KM13 (Kristensen, P. und Winter, G., Folding & Design, 3: 321,
1998). Als Antigen diente der gereinigte A78-G/A7 (35 µg/ml in 4 ml), das in einem
Teströhrchen (Immunotube, Nunc, Wiesbaden) über Nacht bei 4°C in PBS immobilisiert
wurde. Alternativ wurde der gereinigte Antikörper mit den Phagen inkubiert; die an den
Antikörper gebundenen Phagen durch Magnetbeads mit immobilisierten anti-IgM
Antikörpern (Deutsche Dynal, Hamburg) gewonnen. Die in den Selektionsrunden spezifisch
gebundenen Phagen (3 h bei RT) wurden nach stringenten Waschschritten (bis zu 20 mal
PBS/0.1% Tween20 und darauffolgend 20 mal PBS) durch das das TFα-tragende
Glykoprotein Asialoglykophorin (100-165 µg/ ml) spezifisch eluiert und teilweise
anschließend mit Trypsin (proteolytische Selektionsmethode) behandelt. Zwischen den
Selektionsrunden wurden die eluierten Phagen in den Bakterien mit Helferphagen vermehrt
und erneut selektioniert. Es wurden 2 bis 3 Selektionsrunden durchgeführt.
Analog dem Beispiel zur Generierung von antiidiotypischen Antikörpern wurde in
mehreren Selektionsrunden aus einer Peptid-Genbibliothek (Oligino, L., et al., J Biol Chem
272: 29046, 1997), die 107 verschiedene kurze Peptide an das Phagenhüllprotein pIII
gekoppelt besitzt, spezifisch bindende Peptide gewonnen (in Zusammenarbeit mit
Dr. H. Gollasch, Robert-Rössle-Klinik, Berlin-Buch). Die exprimierten Peptide sind
randomisierte Nonapeptide, die von zwei Cysteinen flankiert und damit zirkularisiert
werden, wodurch die Stabilität und die Affinität erhöht wird. Die Selektion und Testung
erfolgte wie in der Generierung der antiidiotypischen Antikörper beschrieben.
Die selektionierten Peptide und Antikörperfragmente wurden in ELISA-Tests auf ihre
Bindung an TF-spezifische Antikörper und an das Pflanzenlektin PNA (Peanut Agglutinin,
Arachis hypogaea Lektin; Sigma), das auch, wenn auch nicht ausschließlich, das Thomsen-
Friedenreich-Antigen bindet, sowie zur Kontrolle an andere IgM und IgG-Antikörper
getestet. Hierfür wurden die an Phagen gekoppelte Form der Peptide und
Antikörperfragmente verwendet, die zuvor durch eine in 96-Well Platten durchgeführte
Polyethylenglykol-Fällung gereinigt wurden. Die potentiellen Mimikry-Peptide und
antiidiotypischen Antikörperfragmente wurden in ELISA-Inhibitionstests daraufhin
untersucht, ob sie die Bindung des A78-G/A7 und/oder andere TF-erkennender Antikörper
und Lektine an das Disaccharid TFα spezifisch hemmen. Dabei wurde das das TFα
tragende Glykoprotein Asialoglykophorin auf ELISA-Platten durch Antrocknen
immobilisiert, und die Bindung der monoklonalen Antikörper und Lektine durch die
Mimikry-Peptide oder antiidiotypischen Antikörperfragmente in Form der synthetisierten
Peptide oder gereinigten scFv alleine oder gekoppelt an Phagen konzentrationsabhängig
inhibiert (Abb. 2).
Inzuchtmäuse des Stammes Balb/c und des Stammes NMRI wurden intraperitoneal mit
Mimikry-Peptiden und antiidiotypischen Antikörperfragmenten in Form der synthetisierten
Peptide oder gereinigten scFv alleine, jeweils gekoppelt an das Protein KLH oder gekoppelt
an Bakteriophagen in PBS, gemischt mit komplettem Freundschem Adjuvans, immunisiert.
Drei Wochen später wurde mit dem gleichen Ansatz jedoch ohne Adjuvans geboostert. Die
Boosterung wurde nach 3 Wochen wiederholt und 10 Tage später den Mäusen Blut
entnommen. Das Serum wurde in ELISA-Tests auf Antikörperbindungen gegen das
Thomsen-Friedenreich-Antigen untersucht.
Die Maus-Colon-Karzinom-Zellinie C-26 wurde im Medium RPMI 1640 mit
Zusatz von 10% fetalem Kälberserum gehalten.
In Mäuse des Stammes Balb/c wurden 105 Zellen der syngenen Colon-
Karzinom-Zellinie C-26 s. c. transplantiert, und zwar in zwei Varianten: a) unbehandelt und
b) mit Neuraminidase aus V. cholerae (Serva, Heidelberg) vorbehandelt (TF-positiv). In
wöchentlichen Intervallen wurde die Tumorgröße extern ermittelt. Nach 3 Wochen wurden
die Tiere getötet und jeweils die Leber herauspräpariert, um die Zahl der an der Oberfläche
der Leber sichtbaren Metastasen zu ermitteln.
Die Vakzinierung der Mäuse wurde 6 Wochen vor der Tumortransplantation
begonnen. Die Phagenpräparation bzw. die gereinigten scFv (sowie entsprechende
Kontrollen) wurden mit inkomplettem Freund-Adjuvans 1 : 1 emulgiert und i. p. injiziert.
Vier Wochen später wurde geboostert (ohne Adjuvans). Nach weiteren 2 Wochen wurde die
Tumortransplantation (Tumor-Challenge) mit unbehandelten und Neuraminidase-
behandelten C-26-Zellen vorgenommen.
Die vorliegenden Ergebnisse mit drei der genannten antiidiotypischen-scFv
zeigten, daß die Angangsrate der Tumoren bei den Neuraminidase-behandelten C-26-Zellen
durch die Vakzinierung signifikant erniedrigt werden kann (auf 3-16% der Kontrolle;
Kontrolle: 100% Angangsrate). Darüber hinaus entsprach die Zahl der Lebermetastasen bei
den vakzinierten Tieren annähernd der der Tiere, die mit unbehandelten (TF-negativen) C-
26-Zellen transplantiert worden waren (rund 2 pro Leber), während die nichtvakzinierten
Kontrolltiere mit TF-positiven C-26-Zellen 5-9 Metastasen pro Leber aufwiesen.
Inhibition der A76-A/C7 Bindung an das MUC1-Glykopeptid (Biotin-Ahx-
APPAHGVTSAPD-Thr(α-D-GalNAc)-RPAPGSTAPPAHGVTSA) durch scFv-Phagen.
Das MUC1-Glykopeptid wurde an die Streptavidin-ELISA-Platte immobilisiert (5 ng/Well)
und anschließend mit 30% FKS in RPMI blockiert. Kulturüberstand des A76-A/C7 (1 : 80
verdünnt) wurde mit den durch eine Polyethylenglykolfällung gereinigten scFv-Phagen in
den angegebenen Konzentrationen (Volumenprozentanteil von abgeglichenen
Phagenlösungen in PBS) für eine Stunde vorinkubiert und anschließend für 2 Stunden auf
die MUC1-Glykopeptidplatte gegeben. Der Nachweis erfolgte über einen anti-Maus-POD-
Antikörper (Dako). Die scFv-Phagen Q6, Q7 und Q8 sind Beispiele für antiidiotypische
scFv, während Q4 und Q10 Beispiele für Kontrol-scFv sind, die den A78-A/C7 zwar
binden, jedoch keine antiidiotypischen-scFv sind.
Inhibition der A78-G/A7 Bindung an Asialoglykophorin durch scFv-Phagen. Das
Asialoglykophorin (A-GP) wurde an die ELISA-Platte durch Antrocknen immobilsiert
(25 ng/Well) und anschließend mit 30% FKS in RPMI blockiert. Kulturüberstand des A78-
G/A7 (1 : 20 verdünnt) wurde mit den durch eine Polyethylenglykolfällung gereinigten scFv-
Phagen in den angegebenen Konzentrationen (Volumenprozentanteil von abgeglichenen
Phagenlösungen in PBS) für eine Stunde vorinkubiert und anschließend für 2 Stunden auf
die A-GP Platte gegeben. Der Nachweis erfolgte über einen anti-Maus-POD-Antikörper
(Dako). Die scFv-Phagen P9, P13, P16, P3 und K3 sind Beispiele für antiidiotypische scFv,
während P8 und Q1 Beispiele für Kontrol-scFv sind, von denen P8 zwar den A78-G/A7
bindet, jedoch kein antiidiotypischer scFv ist und Q1 ein Phage ist, der nicht den A78-G/A7
bindet.
Claims (26)
1. Vakzine gegen konformationsabhängige Antigene, gekennzeichnet durch
- a) eine DNA, welche diejenige Region eines antiidiotypischen Antikörpers (Ab2), eines antiidiotypischen Antikörperfragmentes oder eines anderen Peptides kodiert, die die Bindungsstelle eines Antikörpers (Ab1) oder eines das Antigen bindende Molekül spezifisch bindet und das ursprüngliche Antigen immunologisch imitiert, wobei das Epitop ganz oder teilweise konformationsabhängig ist und eine immunogene Struktur aufweist, welche nicht durch eine einfache Aufeinanderfolge von Aminosäuren der Primärsequenz des Antigens sondern durch eine bestimmte räumliche Konformation von Aminosäuren definiert ist, und die DNA entweder in Form nackter DNA, linear oder zirkulär, und/oder mit Hilfe eines viralen Vektors mit oder ohne Adjuvantien angewendet wird, oder
- b) durch einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Peptid, die das konformationsabhängige Antigen immunologisch imitieren, oder
- c) durch eine Kombination der Stoffe aus a und b.
2. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunogenen Strukturen
durch eine bestimmte räumliche Konformation von Aminosäuren definiert sind, die
beispielsweise durch die Interaktion von Aminosäuren zustande kommen, welche in der
Primärsequenz des Antigens nicht benachbart sind, oder durch Ausbildung einer Sekundär-
oder höheren Strukturordnung aufgrund einer Interaktion von Aminosäuren aus Proteinen
eines Proteinkomplexes oder durch die Modifikation der Primärstrukturen, beispielsweise
durch Glykosylierung oder Phosphorylierung, bedingt sind.
3. Vakzine gegen Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind,
gekennzeichnet durch
- a) eine DNA, welche diejenige Region eines antiidiotypischen Antikörpers (Ab2), eines antiidiotypischen Antikörperfragmentes oder eines anderen Peptides kodiert, die die Bindungsstelle eines Antikörpers (Ab1) oder eines das Antigen bindende Molekül spezifisch bindet und das ursprüngliche Antigen immunologisch imitiert, wobei es sich bei dem Antigen um Substanzen handelt, deren relevanten Epitope zwar keine Protein- oder Peptidepitope sind, jedoch immunogene Strukturen aufweisen und die DNA entweder in Form nackter DNA, linear oder zirkulär, und/oder mit Hilfe eines viralen Vektors mit oder ohne Adjuvantien angewendet wird, oder
- b) durch einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Peptid, die das Antigen, das kein oder nicht auschließlich ein Protein oder Peptid ist, immunologisch imitieren, oder
- c) durch eine Kombination der Stoffe aus a und b.
4. Vakzine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß immunogene Strukturen der
relevanten Epitope vorzugsweise Glykostrukturen, kombinierte Kohlenhydrat-
Proteinepitope, Lipide, Glykolipide oder synthetische Strukturen darstellen.
5. Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide
linear oder zirkulär, beispielsweise durch Einfügung von Cysteinen an geeigneten Stellen,
vorliegen.
6. Verwendung einer Vakzine nach Anspruch 1 bis 5 zur Immunisierung mittels DNA
und/oder den das Antigen immunologisch imitierenden Antikörpern, Antikörperfragmenten
(antiidiotypische Ak) oder Peptiden (Mimikry-Peptide).
7. Verwendung der Vakzine nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch als Vakzine geeignete
Formulierungen dieser Proteinstrukturen entweder durch Gabe der sie kodierenden DNA
gemäß 1a oder 3a, oder durch Gabe der Strukturen alleine, wie Peptide, inverse Peptide oder
retroinverse Peptide, in Form einer chemischen Kopplung
an Proteine, wie Keyhole limpet hemocyanin (KLH), in Form von Bakteriophagen als
Fusionsproteine mit Phagenhüllproteinen auf deren Oberfäche, in Form eines
Fusionsproteins auf der Oberfläche anderer Viren oder attenuierter biologischer Träger oder
durch Beladung dendritischer Zellen nach an sich bekannten Verfahren, jeweils
gegebenenfalls in Kombination mit geeigneten Adjuvantien oder immunstimulatorischen
Molekülen wie Cytokinen, die auch in Form einer sie kodierenden DNA verabreicht werden
können.
8. Verwendung der Vakzine nach Anspruch 6 und 7, gekennzeichnet durch eine
Kombination der DNA und der Protein-Strukturen in einer geeigneten Formulierung.
9. Verwendung von Vakzinen nach Anspruch 1, 2, 5, 6, 7 oder 8 gegen tumorassoziierte
konformationsabhängige Antigene.
10. Verwendung von Vakzinen nach Anspruch 3 bis 8 gegen tumorassoziierte Antigene, die
keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind.
11. Verwendung von Vakzinen nach Anspruch 1, 2, 5, 6, 7 oder 8 gegen
konformationsabhängige Antigene von Erregern infektiöser Erkrankungen, wie Prionen,
Viren, Bakterien, Parasiten.
12. Verwendung von Vakzinen nach Anspruch 3 bis 8 gegen Antigene von Erregern
infektiöser Erkrankungen, wie Prionen, Viren, Bakterien, Parasiten, die keine oder nicht
ausschließlich Proteine oder Peptide sind.
13. Verwendung von Vakzinen nach Anspruch 1 bis 8 gegen weitere infektiöse oder
nichtinfektiöse Erkrankungen auf dem medizinischen und veterinärmedizinischen Gebiet.
14. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen konformationsabhängige Antigene
gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1, 2 oder 5 auf der Basis immunologisch
imitierender Strukturen in Form antiidiotypischer Antikörper, antiidiotypischer
Antikörperfragmente oder Mimikry-Peptide oder daraus resultierender DNA-Sequenzen,
dadurch gekennzeichnet, daß man:
- a) mit der Hybridomtechnik monoklonale Antikörper (Ab1) gegen konformationsabhängige Antigene nach Anspruch 1 und antiidiotypische Antikörper (Ab2 vom Typ b), die das Antigen nach Anspruch 1 oder 2 immunologisch imitieren,
- b) aus genomischen, Hybrid-, semisynthetischen oder synthetischen Antikörper- Genbibliotheken sowie aus Genbibliotheken immunisierter oder nicht-immunisierter Spender mittels der Phagen-Display-Technik oder der Ribosomen-Display-Technik rekombinante Antikörperfragmente (Ab1) gegen konformationsabhängige Antigene oder mit Hilfe idiotypischer Antikörper oder Antikörperfragmente, die das konformationsabhängige Antigen spezifisch erkennen, rekombinante antiidiotypische Antikörperfragmente (Ab2), die das Antigen nach Anspruch 1, 2 oder 5 immunologisch imitieren,
- c) aus genomischen, Hybrid-, semisynthetischen oder synthetischen Antikörper- Genbibliotheken sowie aus Genbibliotheken immunisierter oder nicht-immunisierter Spender mittels der Phagen-Display-Technik oder der Ribosomen-Display-Technik mit Hilfe von Substanzen (z. B. Rezeptoren), die das konformationsabhängige Antigen spezifisch erkennen, rekombinante Antikörperfragmente, die das konformationsabhängige Antigen nach Anspruch 1, 2 oder 5 immunologisch imitieren,
- d) aus synthetischen Peptid-Genbibliotheken mittels Phagen-Display-Technik oder Ribosomen-Display-Technik mit Hilfe idiotypischer Antikörper oder Antikörperfragmente, die das konformationsabhängige Antigen spezifisch erkennen, lineare oder zirkuläre Peptide, die die antigen-bindende Regionen der konformationsspezifischen Antikörper (Ab1) nach Anspruch 1 binden und somit das Antigen nach Anspruch 1, 2 oder 5 immunologisch imitieren,
- e) aus synthetischen Peptid-Genbibliotheken mittels Phagen-Display-Technik oder Ribosomen-Display-Technik mit Hilfe von Substanzen (z. B. Rezeptoren), die das Zielantigen spezifisch erkennen, lineare oder zirkuläre Peptide, die die antigen-bindende Regionen der konformationsspezifischen Antikörper (Ab1) nach Anspruch 1 binden und somit das Antigen nach Anspruch 1, 2 oder 5 immunologisch imitieren,
15. Verfahren zur Herstellung von Vakzinen gegen Antigene gemäß einem der Ansprüche
3, 4 oder 5 auf der Basis immunologisch imitierender Strukturen in Form antiidiotypischer
Antikörperfragmente oder Mimikry-Peptide oder daraus resultierender DNA-Sequenzen,
dadurch gekennzeichnet, daß man:
- a) aus genomischen, Hybrid-, semisynthetischen oder synthetischen Antikörper- Genbibliotheken sowie aus Genbibliotheken immunisierter oder nicht-immunisierter Spender mittels der Phagen-Display-Technik oder der Ribosomen-Display-Technik rekombinante Antikörperfragmente (Ab1) gegen Antigene, die primär keine Proteine oder Peptide sind, oder mit Hilfe idiotypischer Antikörper oder Antikörperfragmente, die das konformationsabhängige Antigen spezifisch erkennen, rekombinante antiidiotypische Antikörperfragmente (Ab2), die das Antigen nach Anspruch 3, 4 oder 5 immunologisch imitieren,
- b) aus genomischen, Hybrid-, semisynthetischen oder synthetischen Antikörper- Genbibliotheken sowie aus Genbibliotheken immunisierter oder nicht-immunisierter Spender mittels der Phagen-Display-Technik oder der Ribosomen-Display-Technik mit Hilfe von Substanzen, beispielsweise von Lektinen, Rezeptoren, Peptiden, die das Zielantigen spezifisch erkennen, rekombinante Antikörperfragmente, die das Zielantigen nach Anspruch 3, 4 oder 5 immunologisch imitieren,
- c) aus synthetischen Peptid-Genbibliotheken mittels Phagen-Display-Technik oder Ribosomen-Display-Technik lineare oder zirkuläre Peptide, die die antigen-bindende Regionen der Antikörper (Ab1) gegen Antigene, die keine oder nicht ausschließlich Proteine oder Peptide sind, nach Anspruch 3 und 4, binden und somit das Antigen nach Anspruch 3, 4 oder 5 immunologisch imitieren,
- d) aus synthetischen Peptid-Genbibliotheken mittels Phagen-Display-Technik oder Ribosomen-Display-Technik mit Hilfe von Substanzen, beispielsweise Lektine, Rezeptoren, Peptide, die das Zielantigen spezifisch erkennen, lineare oder zirkuläre Peptide, die das Zielantigen nach Anspruch 3, 4 oder 5 immunologisch imitieren,
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Vakzinen nach
einem der Ansprüche 1 bis 5 herstellt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Vakzine gegen das immundominante Epitop (PDTR) des MUC1 herstellt, dessen für die
Immunogenität wichtige Konformation beispielsweise durch die Glykosylierung des Thr im
Epitop PDTR herausgebildet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Vakzine gegen die tumorassoziierten Glykostrukturen
Core-1 Struktur (GalNAcβ1-3-GalNAcα1), Tn oder Sialyl-Tn herstellt.
19. Humane antiidiotypische Antikörperfragmente gegen das MUC1-
Konformationsepitop mit den Sequenzen Nr. 1 bis 31, sowie davon abgeleitete
Proteinsequenzen und -teilsequenzen, die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
20. DNA Sequenzen, die die Fragmente und davon abgeleitete Proteine bzw. Teilsequenzen
mit den gleichen Eigenschaften gemäß Anspruch 19 kodieren.
21. Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden gegen das MUC1-Konformationsepitop
mit den Sequenzen Nr. 32 bis 47, sowie davon abgeleitete Peptidsequenzen und
-teilsequenzen, die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
22. DNA Sequenzen, die die Aminosäurensequenzen und davon abgeleitete Peptide bzw.
Teilsequenzen mit den gleichen Eigenschaften gemäß Anspruch 21 kodieren.
23. Antiidiotypische Antikörperfragmente gegen das TF-Antigen mit den Sequenzen Nr. 48
bis 71, sowie davon abgeleitete Proteinsequenzen und -teilsequenzen, die die gleichen
Eigenschaften aufweisen.
24. DNA Sequenzen, die die Fragmente und davon abgeleitete Proteine bzw. Teilsequenzen
mit den gleichen Eigenschaften gemäß Anspruch 23 kodieren.
25. Aminosäurensequenzen von Mimikry-Peptiden gegen das TF-Kohlenhydratepitop mit
den Sequenzen Nr. 71 bis 96, sowie davon abgeleitete Peptidsequenzen und -teilsequenzen,
die die gleichen Eigenschaften aufweisen.
26. DNA Sequenzen, die die Aminosäurensequenzen und davon abgeleitete Peptide bzw.
Teilsequenzen mit den gleichen Eigenschaften gemäß Anspruch 25 kodieren.
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