DE69333560T2

DE69333560T2 - Transport und expression eines hybriden oberflächenproteins an der oberfläche von grampositiven bakterien

Info

Publication number: DE69333560T2
Application number: DE69333560T
Authority: DE
Inventors: A. Vincent FISCHETTI; Gianni Pozzi; Olaf Schneewind
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1992-03-13
Filing date: 1993-03-12
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2013-03-13
Also published as: AU3919993A; ES2224097T3; EP0646176A1; DE69333560D1; HUT70306A; WO1993018163A2; AU674311B2; EP0646176B1; JP2002509421A; DK0646176T3; WO1993018163A3; HU220420B; HU9402575D0; ATE269904T1; JP3626181B2; CA2131995A1

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung ist eine teilweise Fortführung der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/851,082, die am 13. März 1992 eingereicht wurde, welche eine teilweise Fortführung der Anmeldung mit der Seriennummer 07/814,823 ist, die am 23. Dezember 1991 eingereicht wurde, welche eine Fortführung der Anmeldung mit der Seriennummer 07/742,199 ist, die am 5. August 1991 eingereicht wurde, welche wiederum eine Fortführung der Anmeldung mit der Seriennummer 07/522,440 ist, die am 11. Mai 1990 eingereicht wurde. Die letzteren zwei Anmeldungen wurden mittlerweile fallengelassen.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft allgemein Produkte und Verfahren, die nützlich dafür sind, Proteine einschließlich Proteinantigene auf die Oberfläche von grampositiven Bakterien zu übertragen und sie fest an die Zelle anzubringen. Insbesondere betrifft sie die Produktion eines Fusionsproteins, enthaltend wenigstens die Ankerregion der zellassoziierten Region eines grampositiven Oberflächenproteins und jedes Protein, Peptid oder Polypeptid, das nützlicherweise einem tierischen Wirt verabreicht werden könnte. Die erfindungsgemäßen Produkte, welche Proteine, Peptide oder Polypeptide umfassen, wie weiterführend hierunter diskutiert, angeordnet auf der Oberfläche eines grampositiven Bakteriums, können verwendet werden, um solche Materialien dem tierischen Wirt zu übertragen, um eine immunogene Antwort hervorzurufen, beispielsweise die Produktion von schützenden Antikörpern oder zu einem anderen sinnvollen Zweck. Das Protein, Peptid oder Polypeptid kann beispielsweise ein Enzym sein oder ein anderes funktionales Protein, das zu einem bestimmten Zweck nützlich ist. Es kann eine antigene Determinante eines Bakteriums, eines Virus, eines Parasiten oder eines Fungus sein. Es kann ein Oberflächenantigen aus einer Säugetiertumorzelle oder aus männlichem Sperma sein. Es kann ein Allergen sein, so wie ein Vespidvenom. Die Erfindung betrifft ebenso neue Plasmide, Gene, Chromosomen und transformierte Bakterien, die bei der Herstellung solcher Fusionsproteine verwendet werden. Die Erfindung stellt zusätzlich neue Impfstoffe zur Verfügung, welche grampositive Bakterien verwenden, die so entworfen sind, daß sie einem tierischen Wirt ein fremdes Antigen übertragen, das normalerweise auf einem pathogenen Mikroorganismus vorhanden ist, welcher mit der Virulenz des Pathogens in Verbindung steht und welcher Antigene hervorrufen wird, um den Wirt gegen die Infektion oder die Krankheit zu schützen, die durch den pathogenen Mikroorganismus verursacht wird.
Die Produkte der Erfindung sind ebenso nützlich als diagnostische Mittel.
Die Erfindung stellt ebenso ein Mittel zum Übertragen von Enzymen, die auf der bakteriellen Oberfläche angeordnet sind, an spezifische Gebiete von Interesse zur Verfügung.
Der Begriff "Tier", wie hierin verwendet, betrifft Lebewesen einschließlich Säugetiere, so wie Menschen; Rinder, insbesondere Fleischvieh; Schafe und Ziegen; Geflügel, insbesondere Hühner, Enten und Truthähne; ebenso wie Fisch, insbesondere diejenigen, die in Fischfarmen aufgezogen werden, so wie Lachs, Forelle und Katzenwels. Diese Erfindung ist von besonderer Wichtigkeit für Säugetiere.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das wesentliche an dieser Erfindung ist es, daß sie ein Verfahren für die Herstellung von neuen pathogenen grampositiven Bakterien zur Verfügung stellt, die ein Hybridoberflächenprotein exprimieren, welches ein Hybridoberflächenantigen sein kann, umfassend zwei wesentliche Teile, ein Ankersegment, welches Aminosäurereste umfaßt, und ein N-terminales aktives Polypeptidsegment, von denen beide hierunter genauer definiert und diskutiert werden.
Diese Erfindung wird durch In-Erwägung-Ziehen des M-Proteins und dessen Struktur besser verstanden werden. Das M-Protein ist ein coiled-coil-Oberflächenantigen, welches ein Virulenzfaktor der Gruppe A-Streptokokken ist, grampositive Bakterien. Das M-Protein von Streptococcus pyogenes des M-Typs 6 enthält 441 Aminosäurereste.
Dessen Struktur wird genauer später diskutiert werden, aber es wird nützlich sein, die zellassoziierten Bereiche an diesem Punkt zu diskutieren. Unter Verwendung der Standard-Einbuchstaben-Darstellung von Aminosäuren kann die Struktur des Ankerbereichs der zellassoziierten Region des M6-Proteins von Aminosäurerest 407 bis Rest 441 dargestellt werden als:
LPSTGETANPFFTAAALTVMATAGVAAVVKRKEEN
Beginnend von dem ersten Leucinrest (L) an dem N-Terminus der Ankerregion beinhaltet die Region ein LPSTGE-Segment; ein Spacersegment, enthaltend drei Aminosäurereste TAN; ein hydrophobes Segment aus zwanzig Aminosäuren, PFFTAAALTVMATAGVAAVV: gefolgt von einem stark geladenen Schwanzsegment, KRKEEN.
Als ein Ergebnis von strukturellen Studien an einer größeren Anzahl von Oberflächenproteinen von grampositiven Bakterien wurde beobachtet, daß die oben beschriebene Ankerregion des M6-Proteins unter allen bekannten Oberflächenproteinen von grampositiven Bakterien hochkonserviert ist. Viele von ihnen sind gezeigt durch Fischetti et al. (Referenz 1). Im allgemeinen enthält das hydrophobe Segment etwa 15 bis 20 Aminosäurereste, das geladene Schwanzsegment etwa 4 bis 6 Aminosäurereste und das Spacersegment von etwa 3 bis zu 6 Aminosäurereste. Am meisten bemerkenswert ist jedoch der hohe Grad an Homologie, praktisch 100 in dem LPSTGE-Segment der bekannten Oberflächenproteine. Die Variationen, die auftreten, befinden sich fast ausschließlich an den 3- und 6-Positionen. Daher kann die Region allgemein als LPXTGX dargestellt werden.
Die folgende Tabelle 1 zeigt das bemerkenswerte Ausmaß dieser Homologie, die bis jetzt unter vierzig verschiedenen Oberflächenproteinen von grampositiven Bakterien etabliert wurde.
TABELLE 1 SEQUENZIERTE OBERFLÄCHENPROTEINE AUS GRAMPOSITIVEN BAKTERIEN
Es ist offensichtlich, daß diese hochhomologe Region der Oberflächenproteine von grampositiven Bakterien wesentlich für das Ankern der bakteriellen Oberflächenproteine an die Zelle ist (28). Dieses Segment, welches hierin das LPXTGX-Segment genannt wird, ist das wesentliche Segment des zellassoziierten Bereichs des Oberflächenproteins zum Ankern der Proteine an der Oberfläche von grampositiven Bakterien.
Diese Entdeckung wurde bestätigt durch Schneewind et al. (65). Unter Verwendung des Protein A-Moleküls von Staphlococcus aureus haben diese Forscher etabliert, daß der vollständige Komplex (LPXTGX-Motif, hydrophobe Domäne und geladener Schwanz) erforderlich ist, um das Protein A-Molekül an die Zelloberfläche zu übertragen, und daß Änderungen in dem LPXTGX-Motif oder dessen Deletion nicht die Expression des Moleküls verhindern werden, aber verhindern werden, daß das Molekül an der Oberfläche ankert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt die Ausrichtung der Aminosäuren in dem C-terminalen Bereich einer Vielfalt von Oberflächenantigenen aus grampositiven Bakterien und der Gensegmente, welche verwendet werden, um diese zu exprimieren. Das LPSTGE-Motif ist schattiert, und die Proteine wurden entlang dieser Konsenssequenz ausgerichtet. In 10 von 11 Proteinen wurde ein konservierter Lysinrest 2 oder 3 Reste vor der Konsens-LPSTGE-Sequenz gefunden (im Kästchen). Die homologen carboxyterminalen hydrophoben Regionen sind ebenso eingerahmt. Abkürzungen, die in der linken Spalte verwendet werden, sind dieselben wie diejenigen in Tabelle 1.
2 ist ein Modell des M-Proteins.
3 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des M6-Proteins.
4 zeigt das Wirtsvektorsystem GP232-pVMB20.
5 zeigt die Konstruktion und chromosomale Integration der M6:E7-Translationsfusion in GP246.
6 zeigt die Resultate der Studien, die entworfen wurden, um zu demonstrieren, daß das M6:E7-Fusionsprotein, das in Streptococcus gordonii GP246 exprimiert wird, auf dessen Oberfläche angeordnet ist.
7 zeigt, daß Zellextrakte aus rekombinanten Streptococcus gordonii 296 das M6:E7-Fusionsprotein exprimieren.
8 zeigt, daß Tiere, die mit dem rekombinanten GP246 immunisiert wurden, Antikörper produzieren, die reaktiv gegenüber dem E7-Protein sind.
9 zeigt ein universelles Plasmid der Erfindung.
10 zeigt ein typisches Hybridprotein der Erfindung.
11 und 12 zeigen die Resultate von Studien, in welchen Mäuse mit dem Hybridprotein der Erfindung behandelt wurden.
Das gründliche Studium der 2 und 3 wird beim Verständnis der Erfindung helfen. 2 stellt ein Modell des M-Proteins dar, wobei einige der Positionen und Segmente identifiziert sind. 3 identifiziert jeden Aminosäurerest in der vollständigen Struktur des M6-Proteins.
Es wird aus der vorangegangenen Diskussion verstanden werden, daß das Segment des M-Proteins, das als die zellassoziierte Region in 2 identifiziert ist, analog zu Regionen für Oberflächenproteine ist, die auf anderen grampositiven Bakterien gefunden werden, so wie diejenigen, die in Tabelle 1 aufgeführt sind. Wie hierüber diskutiert, gibt es einen hohen Grad an Homologie insbesondere innerhalb der Ankersequenz, insbesondere dem LPXTGX-Segment, das in allen grampositiven Oberflächenproteinen gefunden wird. Wie hierunter und zum Zwecke des Illustrierens der Erfindung beschrieben werden wird, wird die Gensegmentüberspannende Region 122 bis 300 des Gens, welches das M-Protein exprimiert, genetisch entfernt und durch ein neues Gensegment ersetzt, das ein Fremdprotein exprimiert, beispielsweise ein Antigen, welches nützliche Antikörper generieren wird und dadurch ein neues Hybridoberflächenprotein produziert. Aufgrund des großen Grades an Homologie innerhalb der zellassoziierten Regionen der gesamten grampositiven Bakterien kann das Hybridgen in jeglichen grampositiven Bakterien verwendet werden. Das ausgewählte Bakterium wird das entworfene Hybridprotein unter Verwendung der Ankerregion exprimieren, um das Molekül an die Zelle anzuhaften und das insertierte aktive Segment an der Zelloberfläche anzuordnen. Das insertierte aktive Segment wird hiernach das "aktive Polypeptid" genannt.
Der Begriff "aktives Polypeptid" wird hierin in dem breitestmöglichen Sinn verwendet. Er betrifft jedes Peptid, Polypeptid oder Protein, welches an einen tierischen Wirt für irgendeinen nützlichen Zweck übertragen werden kann. Beispielsweise, wie hiernach detailliert ausgeführt, kann die zellassoziierte Region eines Proteins aus grampositiven Bakterien mit einem Segment eines viralen Proteins aus einem Pathogen fusioniert werden, um ein Hybridoberflächenprotein zu produzieren, welches durch nichtpathogene Bakterien exprimiert wird. Die Bakterien können einen tierischen Wirt kolonisieren und als Impfstoff wirken. Sie werden Antikörper in einem tierischen Wirt hervorrufen, um gegen anschließende Infektion durch das Virus zu schützen oder dies zu inhibieren. Das fusionierte virale Segment ist das "aktive Polypeptid" dieser bestimmten Ausführungsform der Erfindung.
Aus Bequemlichkeitsgründen wird der Begriff "Polypeptid" hiernach verwendet, um Moleküle, welche ein ausreichend hohes Molekulargewicht haben, um Proteine genannt zu werden, Produkte mit niedrigerem Molekulargewicht, die normalerweise Polypeptide genannt werden, und Produkte von sogar noch geringerem Molekulargewicht, die normalerweise als Peptide bezeichnet werden, zu bezeichnen.
Das "aktive Polypeptid" kann jedes Polypeptid sein, welches einem tierischen Wirt zu einem nützlichen Zweck übertragen werden kann. Es könnte beispielsweise das virale Segment sein, auf das oben Bezug genommen wurde. Es könnte ebenso ein Antigen aus einem pathogenen Virus oder aus einem Bakterium, Parasit oder Fungi sein. In solchen Fällen kann das aktive Polypeptid das vollständige Antigen, die antigene Determinante des Antigens oder ein Segment des Antigens sein, welches die antigene Determinante beinhaltet. Der nützliche Zweck wird sein, eine schützende Immunantwort durch die Produktion von Antikörpern hervorzurufen oder eine zelluläre Immunantwort gegen das Antigen hervorzurufen.
Der Begriff "zellassoziierte Region", wie in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, wird unter Bezugnahme auf die Figuren, insbesondere 2, 3 und 10, leicht verstanden werden. Es wird gesehen werden, daß die zellassoziierte Region eine zellwandüberspannende Sequenz von Aminosäureresten und ein kohlenhydratüberbrückendes Segment enthält. Die wandüberbrückende Sequenz kann in den Hybridproteinen dieser Erfindung ausgelassen werden, auch wenn es gegenwärtig bevorzugt ist, dies nicht zu tun.
Die zellassoziierte Region beinhaltet ebenso die Ankerregion, welche das Ankersegment (LPXTGX), das Spacersegment, das hydrophobe Segment und das Segment des geladenen Schwanzes enthält. Die Ankersequenz ist wesentlich für die Hybridproteine dieser Erfindung. Ohne diese Sequenz wird das Hybridprotein nicht an der Oberfläche des grampositiven bakteriellen Trägers gehalten werden.
10 zeigt eine graphische Darstellung eines typischen Hybridproteins der Erfindung, welches, wie gezeigt, das aktive Polypeptid fusioniert mit der zellassoziierten Region enthält. Die Figur zeigt ebenso ein Leadersegment und ein kleines N-terminates Segment am Aminoterminus des aktiven Polypeptids. Diese Segmente kooperieren bei der korrekten Anordnung des Hybridproteins auf der Oberfläche des grampositiven Bakteriums. Die Funktion des Leadersegments ist es, das korrekte Prozessieren des Hybridproteins innerhalb der Zelle zu erlauben. Das N-terminale Segment in Kooperation mit dem Leadersegment ermöglicht dem Leaderpeptidaseenzym, das Leadersegment von dem N-terminalen Segment zu trennen, und erlaubt es dem Hybridprotein, dessen korrekte Position auf der Oberfläche des Bakteriums anzunehmen. Das Leadersegment und das N-terminale Segment stammen von demselben Oberflächenprotein wie das Protein der zellassoziierten Region. Das N-terminale Segment enthält geeigneterweise die ersten paar Aminosäurereste, die von dem Aminoende des Proteins abgeleitet sind, das in der zellassoziierten Region des Hybridproteins verwendet wurde. Etwa zehn solche Reste sind normalerweise für die korrekte Verarbeitung ausreichend, aber Segmente, die bis zu zwanzig oder mehr Aminosäurereste enthalten, können verwendet werden.
Das aktive Polypeptid ist nicht notwendigerweise ein Antigen eines pathogenen Organismus. Es kann beispielsweise ebenso ein Enzym sein. In diesem Fall wird es der nützliche Zweck sein, das Enzym auf der Oberfläche eines nichtpathogenen Bakteriums an einen spezifischen Ort in dem tierischen Wirt zu übertragen, der durch das nichtpathogene Bakterium kolonisiert ist.
Das aktive Polypeptid kann das vollständige Molekül sein, welches das Enzym umfaßt. Alternativ kann es nur das Segment des Polypeptids sein, welches erforderlich ist, um den nützlichen Zweck zu realisieren.
Das aktive Polypeptid kann ein Antigen sein, welches mit Antikörpern reagieren wird, die durch pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden. Bakterien der Erfindung, die solche aktiven Polypeptidantigene tragen, sind als diagnostische Reagenzien nützlich.
Wenn hierin auf nichtpathogene Bakterien Bezug genommen wird, sollte verstanden werden, daß dies grampositive symbiotische Bakterien ebenso wie pathogene Bakterien beinhaltet, welche durch gewöhnliche Verfahren so modifiziert oder abgeschwächt worden sind, daß deren Pathogenität abgeschwächt oder zerstört wurde, und welche Hybridproteine in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das hierin beschrieben ist, exprimieren, wobei die Hybridproteine eine C-terminale Region einschließlich der LPXTGX-Region enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt nichtpathogene grampositive Bakterien zur Verfügung, welche wenigstens ein Hybridoberflächenprotein exprimieren, dessen C-terminale Region an das Bakterium angehaftet ist. Die C-terminale Region beinhaltet, aber ist nicht limitiert auf die zellassoziierte Region eines Oberflächenproteins, das normalerweise durch grampositive Bakterien exprimiert wird, welche pathogen oder nichtpathogen sein können. Die Bilanz des Hybridoberflächenproteins beinhaltet ein aktives Polypeptid, welches einem tierischen Wirt zu irgendeinem nützlichen Zweck übertragen werden kann. Das Oberflächenprotein, das durch das Bakterium der Erfindung "normalerweise produziert wird", betrifft das gesamte Protein, das durch die Bakterien produziert wird, bevor es genetisch in Übereinstimmung mit dem Verfahren dieser Erfindung verändert wird.
Wie aus vorherigen Studien (29) bekannt ist und wie es in den 2 und 3 angezeigt ist, befinden sich die Aminosäuren 298–441 des M-Proteins innerhalb der Zelle, während die Reste 1–297 auf der Oberfläche der bakteriellen Zelle exprimiert sind. In Übereinstimmung mit der Erfindung können durch das Anwenden von genetischen Manipulationen, die hierin beschrieben und illustriert sind, nahezu alle der oberflächenexponierten Regionen des M-Proteins entfernt und durch ein aktives Polypeptid ersetzt werden, das mit der C-terminalen zellassoziierten Region des M-Proteins verbunden ist, um ein Hybridoberflächenprotein der Erfindung herzustellen. Da die zellassoziierte Region im wesentlichen die gleiche für sämtliche grampositiven Oberflächenmoleküle (10) ist, kann eine ähnliche Strategie verwendet werden, wobei die zellassoziierte Region von irgendeinem dieser Moleküle als ein Übertragungsträger oder Vehikel verwendet werden kann, um ein aktives Polypeptid aus einer anderen Quelle zu übertragen. Das neue Gen, das verwendet wird, um das Hybridoberflächenprotein zu exprimieren, kann in ein Plasmid durch Standardverfahren insertiert werden, und das Plasmid wird verwendet, um Escherichia coli oder einen anderen Vektor zu transformieren. Die E. coli werden hiernach das neue Fusionsprotein exprimieren, d.h. das Hybridprotein dieser Erfindung. Das E. coli-Verfahren ist nützlich für die Produktion von großen Mengen Hybridprotein, welches aus dem Periplasma dieses gramnegativen Organismus isoliert werden kann. Jedoch ist es für die meisten Verwendungen dieser Erfindung bevorzugt, einen grampositiven Organismus für die Produktion des Hybridproteins auf der Oberfläche des grampositiven Bakteriums zu transformieren. Die rekombinanten Gene, die in Übereinstimmung mit der Erfindung produziert werden, können durch irgendein grampositives Bakterium prozessiert werden.
Alternativ kann das neu konstruierte Plasmid, welches das Fusionsgen enthält, verwendet werden, um das Fusionsgen in das Chromosom eines grampositiven Bakteriums zu integrieren, beispielsweise das Chromosom von Streptococus mutans. Der neu produzierte Stamm von Streptococcus mutans wird danach das Hybridprotein der Erfindung dadurch produzieren, daß er es auf der Zelloberfläche exprimiert. Dies ist das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zum Herstellen der Proteine dieser Erfindung.
Antigene Polypeptide aus einer breiten Vielzahl von Mikroorganismen können als aktive Polypeptide der Erfindung verwendet werden. Diese beinhalten pathogene Mikroorganismen, welche Menschen und Tiere infizieren. Es folgt eine repräsentative Liste von typischen Mikroorganismen, welche Polypeptide exprimieren, die bei der Praxis der Erfindung nützlich sind. Die transformierten Bakterien der Erfindung können verwendet werden, um die Krankheiten, die mit den Infektionen durch die Mikroorganismen in Verbindung stehen, zu heilen oder ihnen vorzubeugen.
Fungi: Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum (alle verursachen sich verbreitende Krankheiten), Microsporum canis (tierischer Ringwurm)
Parasitische Protozoen: Plasmodium falciparum (Malaria), Trypanosoma cruzi (Schlafkrankheit)
Spirocheten: Borrelia bergdorferi (Borreliose), Treponema pallidum (Syphilis), Borrelia recurrentis (periodisch wiederkehrendes Fieber), Leptospira icterohaemorrhagiae (Leptospirose)
Bakterien: Neisseria gonorrhoeae (Gonorrhoea), Staphylococcus aureus (Endocarditis), Streptococcus pyogenes (Rheumafieber), Salmonella typhosa (Salmonellenerkrankung), Hemophilus influenzae (Grippe), Bordetella pertussis (Keuchhusten), Actinomyces israelii (Aktinomykose), Streptococcus mutans (Dentalkaries)
Streptococcus equi – Würger (Strangles) (Pferde), Streptococcus agalactiae (Rinderbrustdrüsenentzündung), Streptococcus anginosus (genitale Infektionen bei Hunden)
Viren: Human immunodeficiency virus (HIV), Poliovirus, Influenzavirus, Rabiesvirus, Herpesvirus, Maul- und Klauenseuchevirus, Psittacosisvirus, Paramyxovirus, Myxovirus, Coronavirus
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein nichtpathogenes grampositives Bakterium, das ein symbiotischer Organismus für das Wirtstier ist, verwendet werden, um das Hybridprotein auf seiner Oberfläche durch Insertieren des Gens, das für das Hybridprotein codiert, in das nichtpathogene grampositive Bakterium zu exprimieren. Wenn die Fusion mit einem aktiven Polypeptid stattfindet, das ein Antigen aus einem pathogenen Organismus ist (bakteriell, viral, parasitisch oder fungal), und das resultierende symbiotische Bakterium, welches das Hybridantigen exprimiert, einem tierischen Wirt verabreicht wird, wird es eine immunologische Antwort sowohl auf dem humoralen als auch auf dem zellvermittelten Wege geben. Eine mögliche immunologische Antwort ist die Produktion von Antikörpern, wodurch ein Schutz gegen Infektion durch das Pathogen bewirkt wird. Wenn die Fusion mit einem Enzym stattfindet, wird das Enzym auf der Oberfläche des Symbionten exprimiert. Eine breite Vielfalt von aktiven Polypeptiden kann an die Oberfläche von grampositiven Bakterien übertragen werden, wie dem Fachmann durch das Studium dieser Offenbarung klar werden wird.
Die Gene, Plasmide, Chromosomen und transformierten Bakterien dieser Patentanmeldung werden durch die Anwendung von rekombinanten Standard-Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt. Beispielsweise kann ein Oligonucleotid oder ein Restriktionsfragment, das für ein virales Mantelprotein codiert, der Virulenzfaktor eines bakteriellen Oberflächenantigens (oder tatsächlich das vollständige Antigen), ein Enzym oder ein gewünschter Progenitor eines Hybridoberflächenproteins der Erfindung an das Gen ligiert werden, welches die zellassoziierte Region des M-Proteins oder ein anderes bekanntes Oberflächenprotein aus einem grampositiven Bakterium, so wie denjenigen, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, exprimiert. Das resultierende Hybridgen wird verwendet werden, um ein grampositives Bakterium zu transformieren, um die Produktion eines Oberflächenhybridproteins der Erfindung zu bewirken.
Diese Erfindung wird weiter in Verbindung mit der Expression des Hybridproteins M6:E7 durch den GP246-Stamm von Streptococus gordonii erklärt werden. Dieses Hybridantigen enthält das C-terminale zellassoziierte Segment des M6-Proteins. Das Antikörper-hervorrufende Polypeptid, E7, ist ein frühes Protein des Papillomavirus-Stammes.
Streptococcus gordonii ist ein symbiotisches Bakterium der Mundhöhle. E7 ist ein 98-Aminosäuren-langes frühes Protein, hergestellt während der viralen Replikation des humanen Papillomavirus-Typs 16 (HPV16). Es ist ein Onkoprotein, zu welchem Antikörper in Patienten gefunden werden, die zervikalen Krebs haben. Es wird als ein Hauptkandidat für ein Antigen für Impfstoffe gegen HPV-induzierte maligne Neoplasien in Erwägung gezogen.
Die neuen Bakterien dieser Erfindung können durch homologe Standard-Rekombination produziert werden, die in den 4 und 5 gezeigt ist. Wie illustriert, wurde ein neuer Stamm von Streptococcus gordonii, GP232, welcher große Mengen des M6-Proteins exprimiert, als Wirt verwendet, um einen neuen Stamm GP246 zu produzieren.
Das Verfahren, das verwendet wurde, wie in den 4 und 5 abgebildet, ist ein Standardverfahren und wird durch den begabten Praktiker häufig verwendet. Die Technologie, wie illustiert, ist es, einen grampositiven Empfängerorganismus für die Insertion des Fusionsgens an einem zufälligen Ort in dem Chromosom zu konstruieren, der in einer starken Expression des Fusionsgens resultiert. Der Insertionsort kann von Organismus zu Organismus und sogar innerhalb desselben Organismus variieren. Der Vorteil dieses Verfahrens ist es, daß es sicherstellt, daß das insertierte Gen sich an einem Ort befindet, welcher in einer starken Expression des Fusionsgens resultieren wird, eher als sich auf die Expression als ein Ergebnis eines fremden Promotors zu verlassen. Somit stellt das Verfahren sicher, daß eine Region mit einem starken Promotor ausgewählt wird.
Bei dem Verfahren zum Herstellen des neuen GP246-Stammes wurde das 538-Basenpaarsegment zwischen den Orten KpnI und HindIII des M6-Proteins aus dem neuen Plasmid pVMB20 ausgeschnitten, der wie hierunter beschrieben hergestellt wurde, und das 294-Basenpaar, das für E7 codiert, wurde statt dessen insertiert, um das neue Gen zu produzieren, welches für die Herstellung des neuen Plasmids pVMB21 verwendet wurde. Der Bereich des M-Proteins, der ausgeschnitten wurde, resultiert in der Anordnung des E7-Moleküls an der Zelloberfläche mit einem 120-Aminosäuresegment des M6 N-Terminus, einschließlich des Leadersegments, das an den N-Terminus von E7 fusioniert ist. Das Konstrukt wurde in E. coli hergestellt und das rekombinante Plasmid wurde verwendet, um S. gordonii durch das Standarddoppelüberkreuzungsverfahren mit GP232 zu transformieren, um eine chromosomale Integration des Gens zu erreichen, welche das M6:E7-Protein durch den neuen Stamm GP246 exprimiert.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Rekombinante DNA-Techniken.
Genfusionen in Escherichia coli-Vektoren wurden durch Standardverfahren (30) erhalten und konstruiert.
Streptokokkentransformation.
Gefrorene Zellen von natürlicherweise kompetentem S. gordonii Challis wurden hergestellt und durch bekannte Verfahren (31) transformiert. Ausplattieren und Bewerten der Transformanten auf mehrschichtigen Platten wurde unter Verwendung von Erythromycin mit einer Konzentration von 5 μg/ml bei der Übereinanderlagerung unter Verwendung von bekannten Verfahren (32) ausgeführt.
Genetische Analyse der Transformanten.
Die Transformanten wurden auf die Oberfläche von 3 Blutagarplatten durch Zahnstochertransfer von Kolonien aus der Auswahlplatte aufgestrichen. Die erste Platte enthielt Erythromycin (5 μg/ml), die zweite Chloramphenicol (5 μg/ml), und die dritte enthielt kein Antibiotikum. Die Platten wurden bei 37°C 36 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine Nitrocellulosemembran auf der Oberfläche der Platte, die kein Antibiotikum enthielt, angeordnet und 20 min bei Raumtemperatur dort belassen. Die Membran wurde dann 30 min bei 37°C und 15 min bei 80°C in einem Vakuumofen inkubiert. Die Gegenwart des E7-Proteins, gebunden an die Nitrocellulose, wurde detektiert unter Verwendung von anti-E7 polyklonalen Antikörpern (1:5000 Verdünnung), erhalten aus Kaninchen, die mit einem MS2:E7-Fusionsprotein immunisiert wurden, das durch E. coli (33) produziert wurde.
Immunofluoreszenz.
Bakterien, die in Todd-Hewitt-Nährlösung (Difco) wachsen gelassen wurden, wurden in der späten exponentiellen Phase geerntet, auf einen Glasobjektträger angewendet und mit Methanol fixiert. Die Objektträger wurden mit M6- oder E7-spezifischen Antikörpern (1:50-Verdünnung) behandelt, gründlich gewaschen und dann mit Ziegen-anti-Kaninchen (oder anti-Maus)-IgG-Antiserum (1:100-Verdünnung) umgesetzt, konjugiert mit Rhodamin. Die Resultate wurden unter einem konfokalen Fluorescence Imaging System MRC-500 Bio-Rad-Mikroskop beobachtet.
Western blot-Analyse der Zellextrakte.
Streptokokken wurden bis zur späten stationären Phase in Todd-Hewitt-Nährlösung (Difco) wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM MgCl₂, 30% Sucrose resuspendiert. Protoplasten wurden durch Behandeln der Zellsuspension mit Lysozym (100 μg/ml) 30 min lang bei 0°C erhalten. Die Protoplasten wurden dann zentrifugiert und in 50 mM Tris (pH 8,0) resuspendiert. Gründliche Lysis wurde durch fünf schnelle Einfrieren/Auftauen-Zyklen der Suspension erreicht. Zellen, die nicht lysierten, und grober Rückstand wurden durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation bei 1000 rpm 15 min lang verworfen, während der Überstand, enthaltend Membranen und Zytoplasma, für die Western blot-Analyse verwendet wurde. Der Extrakt, der aus etwa 5 × 10⁸ streptokokkalen Zellen erhalten wurde, wurde auf einem Gel laufen gelassen, und Western blot wurde durch konventionelle Verfahren ausgeführt.
Immunisierung von Mäusen.
Balb/c-Mäuse wurden subkutan mit 5 × 108 lebenden GP246 streptokokkalen Zellen (5 × 10⁷ koloniebildenden Einheiten), emulgiert in vollständigem Freund's Adjuvans, immunisiert. Zwei und drei Wochen nach der primären Immunisierung wurden den Tieren subkutane Boosts mit derselben bakteriellen Dosis verabreicht, emulgiert in unvollständigem Freund's Adjuvans. Eine Woche nach dem letzten Boost wurden die Tiere ausgeblutet.
RESULTATE
Produktion des Plasmids pVMB3:
Ein Konstrukt wurde hergestellt, in dem ermC, ein Gen, das die Resistenz gegenüber Erythromycin verleiht (34), benachbart zu emm-6.1 kloniert wurde, so daß beide Gene innerhalb desselben ClaI-Fragments angeordnet waren. In diesem Konstrukt war das Initiierungscodon von emm-6.1 19 bp downstream von einem der ClaI-Orte angeordnet, so daß eine Spaltung mit ClaI emm-6.1 promotorlos zurücklassen würde. Plasmid pVV3:M6 (35), enthaltend diesen ClaI-Ort upstream von der emm-6.1-codierenden Sequenz, wurde in den Experimenten verwendet. Das 2,0 kb MspI-Fragment von pE194, enthaltend ermC, wurde mit einem teilweisen ClaI-Verdau von pVV3:M6 ligiert. Nach der Transformation des E. coli DH5 wurde ein Klon mit einem Plasmid, pVMB3, der das ClaI-Fragment enthielt, isoliert.
Produktion des Stammes GP230:
Das 3.4-kb ClaI-Fragment aus pVMB3, enthaltend ermC und das promotorlose emm6.1, wurde mit chromosomaler DNA aus S. gordonii, die ebenso mit ClaI geschnitten wurde, ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um den natürlicherweise transformierbaren S. gordonii "Challis", Stamm V288, zu transformieren. Durch dieses Verfahren wurde das emm-6.1/ermC ClaI-Fragment zufällig in das Chromosom integriert. Die chromosomale DNA, die an das ClaI-Fragment ligiert wurde, stellte die Homologie für die Integration während der Transformation zur Verfügung. Erythromycin-resistente (Em-r) Transformanten wurden ausgewählt und hinsichtlich der Produktion des M6-Proteins durch "streak blot" analysiert. Von 700 Em-r-Transformanten produzierten 196 (28%) M6-Protein. Basierend auf der halbquantitativen dot blot-Analyse schien GP230 der beste M6-Produzent zu sein.
Produktion des Stammes GP232:
S. gordonii GP230 wurde mit der chromosomalen DNA des pneumonokokkalen Stammes GP69 transformiert. Dieser pneumonokokkale Stamm ist resistent gegenüber Chloramphenicol, aber empfänglich für Erythromycin, hergestellt gemäß dem Verfahren von Pozzi und Guild (36). Wenn GP69-chromosomale DNA verwendet wird, um GP230 zu transformieren, tritt die Rekombination auf dem Niveau der ermC-Sequenz auf, was zur Insertion der CAT-Sequenz in die Kopie des ermC, integriert in das GP230-Chromosom, führt. Diese Insertion ergibt GP232, welche, wie oben definiert und in den Figuren gezeigt, M6 auf dessen Oberfläche exprimiert und ebenso resistent gegenüber Chloramphenicol und empfindlich gegenüber Erythromycin ist.
Expression des E7-Proteins aus HPV16 in S. gordonii:
Der Integrationsvektor, pVMB20, wurde so konstruiert, daß er die Insertion von heterologen DNA-Sequenzen in das emm-6.1-Gen, das auf dem Chromosom von GP232 vorhanden ist, erlaubt. pVMB20 ist ein neues Escherichia coli-Plasmid, das in Streptococcus nicht repliziert und emm-6.1 und den Erythromycinresistenzmarker ermC trägt.
Das Wirtsvektorsystem GP232-pVMB20 ist detailliert in den 4 und 5 gezeigt. Insbesondere wurde das neue Plasmid pVMB20 und die neuen Bakterien S. gordonii GP246 gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt.
Wirtsvektorsystem für die heterologe Genexpression:

[A] In das Chromosom des neuen Wirtsstammes S. gordonii GP232 wurde eine Kopie des M6-Proteingens (emm-6.1) (37), promotorlos, aber mit dessem eigenen ribosomalen Bindeort, downstream von einem starken chromosomalen Promotor integriert. Benachbart zu emm-6.1 wird ermC (34) gefunden, dessen codierende Sequenz durch die Insertion des 1.8-kb MboI-Fragments von pC221, enthaltend ein cat-Gen (38), in dessen BcII-Ort unterbrochen wird. GP232 exprimiert M6 auf dessen Oberfläche und ist resistent gegenüber Chloramphenicol und empfindlich gegenüber Erythromycin. Es wurde erhalten unter Verwendung von Transformation, um heterologe DNA in das streptokokkale Chromosom zu integrieren. Die Struktur ist in der Figur gezeigt. Die Größe (5.2-kb) der heterologen DNA, die in das Chromosom in GP232 integriert wurde, wurde durch Southern blot-Analyse bestimmt. Der Integrationsvektor pVMB20 ist ein 6.3-kb E. coli-Plasmid, das in Streptococcus nicht repliziert. Es wurde durch Subklonieren eines 3.4-kb ClaI-Fragments aus Plasmid pVMB3, enthaltend emm-6.1 und ermC, in pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) durch das Verfahren, das hierunter beschrieben ist, erhalten. Dies ist das gleiche ClaI-Fragment, welches in das Chromosom von GP232 integriert wird, wobei der einzige Unterschied ist, daß in GP232 ermC durch cat unterbrochen ist. Wenn pVMB20 als Donor-DNA bei der Transformation von kompetenten Zellen aus S. gordonii GP232 verwendet wird, werden Erythromycin-resistente Transformanten durch die Rekombination zwischen dem Integrationsvektor und den homologen chromosomalen Sequenzen erhalten. Das DNA- Fragment, enthaltend das cat-Gen, wird in dem Chromosom dieser Transformanten deletiert, wohingegen ein intaktes ermC-Gen wiederhergestellt wird. (5)
(B) Das E7-Proteingen aus HPV16 (39) wurde in die emm-6.1-Sequenz von pVMB20 kloniert, um pVMB21 zu ergeben. pVMB20 wurde mit KpnI und HindIII verdaut und mit einem KpnI/HindIII-Segment, enthaltend die E7-Sequenzen, die durch in vitro DNA-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion), ausgeführt mit Plasmid pMBS21L/E7 (33), erhalten wurde, ligiert. Die Amplifikationsprimer wurden entworfen, um eine "in frame"-Insertion der 294 bp, codierend für E7, in emm-6.1 zu erhalten. Eine Nucleotidsequenzanalyse von pVMB21 bestätigte die erwartete Struktur der M6:E7-translationalen Fusion. pVMB21 wurde linearisiert und verwendet, um GP232 zu transformieren. Es wurde gefunden, daß E7 in 6% der Erythromycin-resistenten Transformanten exprimiert wurde. Bei diesen Transformanten produzierte die Integration der pVMB21-Sequenzen eine Deletion, die das cat-Gen involvierte. Die Struktur von GP246, einem representativen Transformanten, wurde durch Southern blot-Analyse bestätigt. Die Nucleotidsequenz der Kreuzungsfragmente der M6:E7-Genfusion, die auf dem Chromosom von GP246 vorhanden war, wurde ebenso nach dem Klonieren des ClaI-Fragments, enthaltend die M6:E7-Fusion, in pBLUESCRIPT bestimmt.

Oberflächenexpression des E7-Proteins:
Die Expression des E7-Proteins aus HPV16 in S. gordonii auf der Oberfläche des Stammes GP246 wurde durch Immunofluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern verifiziert, die entweder für den Träger des M6-Proteins oder das E7-Insert spezifisch sind. GP246, enthaltend die M6:E7-Genfusion, zeigte eine positive Fluoreszenz, wenn sie mit entweder M6-spezifischen oder E7-spezifischen polyklonalen Antikörpern (6) umgesetzt wurden, was die Oberflächenanordnung des E7-Moleküls und des M-Proteins auf der Oberfläche von S. gordonii bestätigt. Keine Fluoreszenz wurde beobachtet, wenn GP246 mit dem bekannten monoklonalen Antikörper 10A11 umgesetzt wurde, welcher spezifisch für ein Epitop des M6 ist, dessen codierende Region in dem KpnI/HindIII-Fragment enthalten war, das bei der Konstruktion der M6:E7-Genfusion deletiert wurde (6).
Um zu demonstrieren, daß die E7-exprimierenden rekombinanten Streptokokken tatsächlich ein M6:E7-Fusionsprotein produzieren, wurden S. gordonii-Zellextrakte durch Western blot analysiert (7). Bei den Zellextrakten aus GP246 wurden dieselben Banden mit E7- und M6-spezifischen Antikörpern umgesetzt, während keine E7-spezifische Reaktivität bei dem Empfänger GP232 gefunden wurde, dessen Extrakte M6-spezifische Reaktivität zeigten (7).
Im wesentlichen die gleichen Verfahren wurden verwendet, um ein M6:E7-Hybridprotein, enthaltend die C-terminale Region des M6-Moleküls, zu produzieren, und Allergen-5 wurde erfolgreich auf der Oberfläche von S. gordonii exprimiert. Western blots der Zellwandextrakte unter Verwendung von Allergen-5-spezifischen Antikörpern etablierten (wie mit M6:E7), daß Allergen-5 tatsächlich in der Zellwandfraktion der gordonii exprimiert wurde. Allergen-5 wurde erhalten, wie durch Fang, et al. (66) beschrieben.
Immunantwort auf das Fusionsprotein auf der streptokokkalen Oberfläche:
Die Immunogenität des M6:E7-Fusionsproteins wurde durch Immunisieren von Mäusen mit rekombinanten S. gordonii GP246, die das M6:E7-Fusionsprotein exprimieren, bestimmt. Kontrollmäuse wurden mit dem isogenen Stamm GP232 immunisiert, welcher das M6-Protein exprimiert. Seren von drei Tieren, die mit jedem Stamm immunisiert wurden, wurden gesammelt und durch Western blot hinsichtlich deren Reaktivität mit aufgereinigtem E7-Protein, das in Schizosaccharomyces pombe produziert wurde, getestet. 8 zeigt, daß Tiere, die mit dem Stamm GP246 immunisiert wurden, Oberflächen-M6:E7-produzierte Antikörper, die zu dem E7-Protein reaktiv waren, enthielten, was anzeigte, daß das E7-Protein immunogen ist, wenn es als Fusionsprotein auf der streptokokkalen Oberfläche exprimiert wird. Keine Antikörper auf das E7-Protein wurden in den Seren von Mäusen gesehen, die mit GP232 immunisiert wurden, die nur M6 enthielten.
Das Verfahren, welches beschrieben wurde, erlaubt die Produktion der nichtpathogenen Bakterien S. gordonii GP246 oder anderer transformierter grampositiver Bakterien, welche ein Hybridoberflächenprotein exprimieren, so wie das neue Hybridoberflächenantigen M6:E7. Dieses neue Antigen ist ein Hybridprotein, dessen Carboxyterminus an das Bakterium angehaftet ist und im wesentlichen dieselbe C-terminale Region ist, die normalerweise bei anderen grampositiven Oberflächenproteinen gefunden wird, wie oben erklärt wurde. Das aktive Polypeptid dieses Hybridoberflächenproteins ist das Antigen E7 von HPV 16. Wenn das Bakterium verabreicht wird, z.B. durch Kolonisierung, an einen tierischen Wirt, der einen Bedarf für einen Schutz hat, wird das aktive Polypeptid sowohl humorale als auch zellvermittelte Antworten hervorrufen, die in der Produktion einer schützenden Immunantwort gegen die Infektion durch Papillomavirus resultieren.
Es wird bemerkt werden, daß das heterologe Antigen des Hybridoberflächenproteins der Erfindung, das wie oben beschrieben hergestellt wird, ein virales Antigen ist, das während viraler Replikation produziert wird. Damit macht das Verfahren der Erfindung die Produktion von neuen grampositiven Bakterien zum Übertragen von viralen Antigenen an ein Tier in ausreichenden Mengen möglich, um eine schützende immunogene Antwort auf die Infektion durch einen Virus hervorzurufen.
Das neue M6:E7 und neue Zwischenprodukte der Erfindung werden aus zwei Ausgangsmaterialien hergestellt. Diese sind pVV3:M6 und GP69. Sie können durch die Verfahren hergestellt werden, die in den zitierten Referenzen beschrieben sind. Daher können die neuen Produkte alle aus bekannten Materialien unter Verwendung der Verfahren, die hierin beschrieben sind, erhalten werden. Um jedoch bei der Praxis der Erfindung zu assistieren und ohne irgendeine Notwendigkeit zuzugestehen, daß dies erforderlich ist, wurden pVV3:M6 und GP69 bei der American Type Culture Collection unter den Zugangsnummern ATCC 68003 bzw. ATCC ______ hinterlegt.
Das vorangehende M6:E7-Beispiel illustriert die Verwendung eines nichtpathogenen symbiotischen grampositiven Bakteriums, das normalerweise in der menschlichen Mundhöhle vorhanden ist, um den gesamten Körper gegen virale Infektion zu schützen. Analog hergestellte nichtpathogene Bakterien können verwendet werden, um andere nützliche Antigene durch die Verfahren, die hierin beschrieben und illustriert sind, zu exprimieren und zu übertragen. Beispielsweise können Proteinantigene auf der Oberfläche von menschlichen Tumoren mit der zellwandassoziierten Region eines Oberflächenantigens von irgendeinem grampositiven Bakterium fusioniert werden, wobei das Fusionsgen in einem grampositiven Symbionten inseriert ist, und das resultierende Bakterium kann als Impfstoff verwendet werden, um tumorspezifische Immunantworten hervorzurufen, die bei der Tumortherapie nützlich sind.
Diese Beispiele illustrieren nur einen Aspekt der Erfindung. Die Erfindung stellt tatsächlich ein Übertragungssystem für jede Art von Polypeptid zur Verfügung, welches nützlich sein kann, um eine Immunantwort in einem Tier herzurufen, oder für andere nützliche Zwecke.
Bei der Verwendung als Impfstoff wird der ausgewählte transformierte Symbiont verwendet werden, um ein Säugetier zu kolonisieren. Es wird das ausgewählte Hybridoberflächenprotein produzieren, dessen aktives Polypeptidsegment die Produktion von schützenden Antikörpern hervorrufen wird.
Grampositive nichtpathogene Bakterien, die normalerweise auf der Vaginalschleimhaut gefunden werden, können als Verhütungsmittel verwendet werden. Zu diesem Zweck können Oberflächenantigene von männlichen Spermien als das aktive Polypeptid auf dem Hybridoberflächenprotein des Bakteriums Lactobacillus acidophilus verwendet werden, das normalerweise auf der Oberfläche der Vaginal- oder der Uterusschleimhaut gefunden wird. Wenn die transformierten Bakterien verwendet werden, um solch eine Mukosa zu kolonisieren, werden die Hybridproteine die Produktion von Antikörpern gegen die Oberflächenantigene des Spermas hervorrufen und die Inaktivierung des Spermas mit sich bringen. Hieraus resultiert, daß das Sperma von dem weiblichen Körper als fremde Substanz gesehen werden wird, und die vorgeformten Antikörper werden mit den Spermazellen reagieren und sie inaktivieren.
Es gibt zwei wichtige Vorteile für diese Art von Empfängnisverhütung. Einer ist, daß, da das Sperma inaktiviert werden wird, die Ova nicht befruchtet werden. Der andere Vorteil ist, daß die empfängnisverhütende Wirkung einfach durch das Behandeln des immunisierten weiblichen Wesens mit einem Antibiotikum neutralisiert werden kann, um die grampositiven Bakterien zu entfernen, die das Hybridantigen exprimieren.
Noch eine weitere Anwendbarkeit der transformierten Bakterien dieser Erfindung ist die Übertragung eines Oberflächenantigens aus einem HIV-Virus auf die Oberfläche eines grampositiven symbiotischen Organismus, um einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, welcher verwendet werden kann, um AIDS vorzubeugen. Zu diesem Zweck können das Polypeptid GP120, der V3-Loop von GP120, GP160 oder ein verwandtes Oberflächenantigen oder Segmente solcher Antigene, so wie die Sequenz 735 bis 752 von GP16, oder RP135, ein 24-Aminosäuresegment von GP120 aus dem HIV-Virus, verwendet werden.
Diese Polypeptide werden mit dem Leader und mit wenigstens einem Teil der N-terminalen Sequenz eines grampositiven Oberflächenproteins und dessen Ankerregion für die Übertragung auf die Oberfläche des symbiotischen Bakteriums fusioniert. Wenn der transformierte Symbiont, der die HIV-Antigene auf dessen Oberfläche exprimiert, an ein empfängliches Säugetier übertragen wird, wird eine Immunantwort erhoben, um gegen die Infektion durch den HIV-Virus zu schützen. Weiterhin sind durch die Verwendung eines rekombinanten vaginalen Symbionten, um ein HIV-Antigen, so wie GP120, an die Vagina zu übertragen, die IgA-Antikörper, die gegen dieses Antigen produziert werden, schützend gegen die Infektion an diesem Ort. IgA-Antikörper in vaginalen Sekretionen werden die Anzahl von HIV-Partikeln in den Sekretionen eines HIV-positiven weiblichen Wesens reduzieren und somit die Ausbreitung von AIDS reduzieren.
Die Produkte dieser Erfindung sind bei der Desensibilisierungstherapie nützlich. Diese Art Therapie wird breit verwendet, um das Unbehagen von atopischen Individuen zu erleichtern, die verstärkte IgE-Antworten auf Antigene (genannt Allergene auf dem Allergiegebiet) entwickeln. Die erhöhte Produktion von IgE-Antikörpern wird als Hauptgrund der allergischen Antworten, so wie Heuschnupfen, Asthma und anaphylaktischem Schock, angesehen.
Die Allergene können aus irgendeiner aus einer Vielzahl von Quellen stammen, einschließlich Nahrungsmitteln, Schimmel, Staub und Tierfell. Flora, so wie Rosen oder Ambrosiapflanzen, sind eine Hauptquelle von Allergenen. Der "Stich" von wespenartigen Wesen, so wie Wespen, Paravespula und Hornissen, enthält allergene Proteine.
Die konventionelle Therapie, die verwendet wurde, um die Immunantworten durch das Aussetzen gegenüber Allergenen zu erleichtern, war die Hyposensibilisierungsbehandlung, welche wiederholte Injektionen von erhöhten Dosen des Allergens beinhaltet. Dies verursacht einen Anstieg der allergenspezifischen IgG-Antikörper, der das Binden des allergenspezifischen IgE an Mastzellen blockiert.
Eine Anzahl von allergenspezifischen Peptiden und Proteinen wurde identifiziert, isoliert und kloniert. Diese beinhalten beispielsweise Allergen-5, ein Vespidvenomprotein. Diese Allergene können als das aktive Polypeptid des Hybridoberflächenproteins der Erfindung mit eingeschlossen werden. Symbiotische Bakterien, welche solche Hybridproteine generieren, können verwendet werden, um einen allergischen Patienten zu kolonisieren. Das Ergebnis wird eine konstante Quelle von Allergenen sein, welche die gleiche schützende Immunantwort hervorrufen wird, wie sie durch die Desensibilisierungstherapie erzielt wird.
Die Bildung und Expression des Hybridproteins M6:Allergen-5 wurde vorher beschrieben. 11 und 12 zeigen die Ergebnisse von Immunisierungsstudien, die dieses Hybridoberflächenantigen verwenden.
11 illustriert die Serum IgG-Antwort von Maus-Seren gegenüber aufgereinigtem Allergen-5 in dem Hybridoberflächenprotein. Mäuse wurden entweder intradermal mit S. gordonii, die das Hybridoberflächenallergen-5 (10⁷ CFU) exprimieren, in Freund's Adjuvans oder intranasal mit denselben Organismen immunisiert. Die Tiere wurden 4, 6, 8 und 10 Wochen nach der Immunisierung ausgeblutet, und das Serum wurde durch ELISA hinsichtlich IgG gegenüber aufgereinigtem Allergen-5 überprüft. Sowohl die Mäuse, die intradermal immunisiert wurden (V1–V4, gestrichelte Balken), als auch die Tiere, die intranasal immunisiert wurden (V5–V8, einfarbige Balken), exprimierten Antikörper gegen das Allergen. Kontrolltiere, die mit gordonii ohne oberflächenexponiertes Allergen-5 immunisiert wurden, zeigten keine Antwort auf das Allergen. Alle Tiere, die intranasal mit dem rekombinanten gordonii immunisiert wurden, verblieben wenigstens 12 Wochen kolonisiert, wie bestimmt durch Abschabungen, und exprimierten immer noch das Allergen-5 im Laufe dieser Periode. Alle Assays wurden mit einer 1:50-Verdünnung der Seren durchgeführt.
12 zeigt die IgA-Antwort auf Allergen-5 bei intranasal und intradermal immunisierten Tieren. Zwölf Wochen nach der Immunisierung (intradermal oder intranasal) mit gordonii, exprimierend Allergen-5 (siehe 11), wurde Speichel entnommen und die Tiere wurden geopfert, um Lungen- und Innereienwaschungen zu erhalten. Der Speichel und die Waschungen wurden hinsichtlich der Gegenwart von IgA, das spezifisch für Allergen-5 ist, durch ELISA analysiert. Die Resultate ergaben, daß Speichel-IgA in den intradermal und intranasal immunisierten Tieren vorhanden war, wobei eine bessere Antwort bei den intranasal kolonisierten Tieren vorlag. Die beste IgA-Antwort wurde bei den Lungenwaschungen der intranasal kolonisierten Tiere gesehen. Während eine IgA-Antwort in dem Dünndarm der Innereien (S. I.) gesehen wurde, waren sie niedriger als in den Lungenwaschungen. Alle Assays wurden mit einer 1:1-Verdünnung der Proben ausgeführt.
Ein besonderer Vorteil der Systeme für die Übertragung der Hybridoberflächenproteine dieser Erfindung ist es, daß, da die transformierten Organismen normale Symbionten sind, sie mit der Kolonisierung fortfahren und als konstanter Stimulus für eine schützende Immunantwort agieren werden, wodurch sie den Bedarf an kontinuierlicher Immunisierung vermeiden.
Der begabte Fachmann kann sich leicht eine Vielzahl anderer Anwendungen der neuen Produkte dieser Erfindung vorstellen. Beispielsweise können nichtpathogene grampositive Bakterien produziert werden, um Oberflächenantigene zu übertragen, welche schützende Antikörper gegen eine breite Vielfalt von Krankheitsstadien hervorrufen werden, einschließlich Malaria, Masern, Keuchhusten und retroviraler Infektionen, so wie AIDS, Kokzidiose, Staupe, Geflügelpocken und Brucellose.
Ein weiterer bestimmter Vorteil des Übertragungssystems dieser Erfindung, wenn es als Impfstoff verwendet wird, ist es, daß lebende Bakterien verwendet werden. Wie bekannt ist, stimulieren lebende Bakterien eine viel stärkere Immunantwort als abgeschwächte oder tote Bakterien. Ein weiterer Vorteil ist es, daß, da nichtpathogene Bakterien verwendet werden, der Impfstoff sicher ist. Ein weiterer Vorteil ist es, daß verschiedene Verfahren der Verabreichung möglich sind.
Die Erfindung ist nicht limitiert auf S. gordonii als Trägerbakterium oder sogar auf Streptokokken, tatsächlich können andere nichtpathogene grampositive Bakterien oft bevorzugt sein. Beispielsweise können Bakterien, die normalerweise auf der Darmschleimhaut (Enterococcus fecalis) vorhanden sind, bevorzugt sein, um ein aktives Polypeptid an den Darm zu übertragen.
Darüber hinaus ist die Erfindung nicht limitiert auf die Oberflächenexpression eines Hybridoberflächenproteins, enthaltend nur ein Epitop. Der Trägerorganismus kann durch gut bekannte Verfahren transformiert werden, um eine Vielzahl von Hybridoberflächenproteinen mit unterschiedlichen aktiven Polypeptiden zu exprimieren oder alternativ, um ein Hybridoberflächenprotein zu exprimieren, wobei das aktive Polypeptid mehr als ein Epitop enthält.
Bis jetzt wurde die Erfindung im wesentlichen in Bezug auf die Übertragung von Antigenen beschrieben und illustriert, um schützende Antikörper hervorzurufen, aber, wie oben angezeigt, ist die Erfindung darauf nicht limitiert. Beispielsweise kann die Erfindung verwendet werden, um Enzyme zu übertragen.
Menschen, denen das Enzym Lactase fehlt, welches in dem Dünndarm sekretiert wird, sind nicht in der Lage, Lactose ordentlich in seine Bestandteile, D-Glucose und D-Galactose, zu hydrolysieren. Ein Ergebnis ist, daß sie nicht in der Lage sind, Milch oder Milchprodukte ordentlich zu verdauen. Bis jetzt war die Behandlung eine lebenslange Aufnahme von Tabletten oder von anderen therapeutischen Dosierungsformen, die das fehlende Enzym enthalten. In Übereinstimmung mit der Praxis dieser Erfindung werden symbiotische Darmbakterien zur Verfügung gestellt, welche so kloniert sind, daß sie ein Hybridprotein produzieren, dessen aktives Polypeptid Lactase ist. Die Bakterien können verwendet werden, um die Darmschleimhaut für die kontinuierliche Produktion des erforderlichen Enzyms zu kolonisieren.
Streptococcus mutans sind die Hauptorganismen, die für den Zahnverfall verantwortlich sind. Sie scheiden Glucosyltransferasen aus, welche Sucrose hydrolysieren, um Glucose zu produzieren. Die Glucose wiederum wird zu Glucanpolymeren umgeformt, welche an der Zahnoberfläche anhaften und an den Zerfallprozessen teilnehmen. Unter Verwendung der Verfahren, die hierin beschrieben und beansprucht sind, kann S. mutans transformiert werden, um Hybridoberflächenproteine zu exprimieren, die Glucanaseenzyme enthalten. Die transformierten Bakterien können dann verwendet werden, um die Mundhöhle zu kolonisieren und die Bildung von Glucanpolymeren zu inhibieren, wodurch gegen Zahnverfall geschützt wird. Alternativ kann Streptococcus mutans transformiert werden, um Enzyme zu produzieren, die dentalen Plaque verdauen und somit die Initiierung des Verfalls vermeiden.
Das Verfahren dieser Erfindung, im wesentlichen wie oben beschrieben, wurde verwendet unter Verwendung von Staphylococcus aureus als das Bakterium für die Expression des Oberflächenproteins. Wenn die Ankerregion (enthaltend das LPXTGX-Segment, das hydrophobe Segment und das geladene Schwanzsegment) des Proteins A, einem Oberflächenmolekül dieses Bakteriums, mit dem Enzym alkalische Phosphatase fusioniert wurde (ein dimeres periplasmatisches Protin aus E. coli) und das Gen für diese Fusion zurück in S. aureus angeordnet wurde, wurde gefunden, daß das Molekül an der Außenseite der Zelle angeordnet und mit dessen Oberfläche verankert war. Die Details dieses Verfahrens können in Referenz 65 gefunden werden.
Der begabte Fachmann wird erkennen, daß verschiedene Variationen dieser Erfindung möglich sind.
Eine Variation, welche besonders nützlich ist, insbesondere für die Produktion von Impfstoffen, ist es, einen Hilfsstoff in das Hybridprotein und die erforderliche Nucleotidsequenz für die Expression des gewünschten Proteins in dasm Gen, das verwendet wird, um das Protein zu generieren, mit einzubeziehen. Typischerweise könnte ein Plasmid produziert werden, in welchem das Gen zum Exprimieren der Choleratoxin B-Untereinheit, welche ein bekanntes mukosales Adjuvans ist, zwischen dem C-Region-Polypeptid und dem aktiven Polypeptid inseriert ist. Alternativ könnte das Gen für die Untereinheit upstream des aktiven Polypeptids inseriert sein. Diese Orientierung kann eine verstärkte IgA-Antwort hervorrufen, da bei der normalen Interaktion des CTB und der Zelle, welche Antikörper produziert, das CTB direkt die Zelle kontaktiert und die Produktion von Antikörpern für das Antigen stimuliert, für welches CTB als Adjuvans agiert. Das Plasmid kann bei den Doppelüberkreuzungstechniken verwendet werden, die in den 4 und 5 illustriert sind, um das Hybridgen in das Chromosom eines grampositiven Bakteriums für die Expression eines Hybridproteins der Erfindung auf der bakteriellen Oberfläche mit einzubeziehen. Andere immunverstärkende Proteine können anstelle der Choleratoxin B-Untereinheit verwendet werden, um die Immunantwort auf ein aktives Polypeptid zu verstärken.
Die transformierten Bakterien dieser Erfindung sind in diagnostischen Tests nützlich. Sie können beispielsweise verwendet werden, um die Gegenwart von Antikörpern zu überprüfen, die charakteristisch für eine spezifische Infektion im Plasma von infizierten Tieren sind.
Konventionell erfordert das Verfahren zum Testen für eine Infektion, die beispielsweise durch Neisseria gonorrhoeae hervorgerufen wurde, die Isolation und Aufreinigung eines Antigens, welches mit einem spezifischen Antikörper reagieren wird, welcher charakteristisch für die infizierenden Mikroorganismen ist und von welchem vermutet wird, daß er in dem Plasma vorhanden ist. Das Antigen wird dann mit Plasma oder einer anderen Körperflüssigkeit inkubiert. Wenn eine Reaktion stattfindet, kann sie durch irgendeinen einer Vielzahl von bekannten Tests erkannt werden.
Bei dem Enzym-verbundenen Standard-Immunoassayverfahren wird das isolierte und aufgereinigte Antigen an ein Festphasenglas- oder Plastiksubstrat angehaftet. Es wird dann der Körperflüssigkeit, so wie Plasma oder Serum, ausgesetzt. Wenn das Fluid einen Antikörper enthält, der charakteristisch für den infizierenden Organismus ist, wird eine Antigen/Antikörperreaktion stattfinden. Das Reaktionsprodukt wird auf der festen Phase verbleiben, welche dann mit einem anti-Antikörper inkubiert wird, der mit einem detektierbaren Enzym, so wie Meerrettichperoxidase, markiert ist.
Die transformierten Bakterien dieser Erfindung können als Quelle für das Antigen verwendet werden, das bei dem diagnostischen Test verwendet wird. Bei solchen Tests wird das transformierte Bakterium als ein Antigen verwendet. Der begabte Fachmann wird mit verschiedenen diagnostischen Tests dieser Art gut vertraut sein. Solche eine Verwendung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung elimiert die Erfordernis des Isolierens und des Aufreinigens des Antigens, wie es im bisherigen Stand der Technik erforderlich ist.
Für das diagnostische Testen wird ein transformiertes Bakterium gemäß der Erfindung hergestellt, in welchem das aktive Polypeptid ein Epitop für einen spezifischen Antikörper enthält, welcher für den Mikroorganismus charakteristisch ist, der die Infektion verursacht. Das Bakterium wird an die Festphase angehaftet und die Bilanz des diagnostischen Tests wird auf die übliche Art und Weise ausgeführt. Natürlich ist der Test nicht auf die Verwendung von Enzymen limitiert, um die Gegenwart eines Antikörpers unter Verwendung von beispielsweise dem ELISA-Assay zu detektieren. Andere Labels, so wie radioaktive Isotope, können verwendet werden.
Diagnostische Kits, welche die transformierten Bakterien enthalten, können typischerweise in einer lyophilisierten Form zur Verfügung gestellt werden, um rekonstituiert zu werden, gemeinsam mit den anderen Reagenzien, die normalerweise mit solchen Kits zur Verfügung gestellt werden. Diese können einen wäßrigen Puffer, einen markierten anti-Antikörper, sterilisiertes Wasser und möglicherweise andere Reagenzien enthalten. Alternativ können die transformierten Bakterien entweder in wäßriger Suspension oder lyophilisiert für die Verwendung bei dem diagnostischen Test gemeinsam mit anderen Reagenzien, die durch das Labor zur Verfügung gestellt zu werden, das die diagnostischen Tests ausführt, zur Verfügung gestellt werden.
Die verschiedenen Segmente des Hybridoberflächenproteins der Erfindung sind nicht notwendigerweise in dem Protein oder in dem Gen, das verwendet wird, um es zu produzieren, aneinander angrenzend angeordnet. Es kann aufgrund von irgendeinem einer Anzahl von Gründen, die dem begabten Fachmann klar sind, bequem sein, die Nucleotide auf dem Hybridgen, das verwendet wird, um das Protein zu exprimieren, durch Insertion von anderen Nucleotiden zu trennen und dadurch Hybridproteine zu exprimieren, wobei das aktive Polypeptid und das zellassoziierte Polypeptid durch einen ausgewählten Spacer getrennt sind. Es ist nicht notwendig, daß das vollständige Segment aus dem zellassoziierten Bereich des Oberflächenantigens bei der Konstruktion des Hybridoberflächenproteins der Erfindung verwendet wird, solange eine Ankerregion beginnend mit dem LPXTGX-Segment und endend bei dem geladenen Schwanzsegment vorhanden ist, um das Hybridpolypeptid an dem Bakterium, das es exprimiert, anzubringen.
9 zeigt eine insbesondere nützliche Ausführungsform dieser Erfindung. Sie illustriert ein universelles Plasmid, das einen Polylinkerort enthält. Ein Polylinker ist ein Oligonucleotid oder eine DNA-Sequenz, welche verschiedene Restriktionsorte enthält und deshalb für die Insertion von Genen verwendet werden kann, die durch eine Vielzahl von Restriktionsenzymen ausgeschnitten wurden. Beispielsweise kann das Plasmid mit einem Polylinkerinsert konstruiert werden, das einige Restriktionsorte, so wie EcoRI, ClaI, HindIII, XboI, PstI, BamHI oder irgendwelche von verschiedenen anderen enthält. Solche Polylinker sind entweder kommerziell erhältlich oder können leicht durch den Fachmann konstruiert werden.
Um ein erfindungsgemäßes Plasmid zu produzieren, wird das Polylinkerinsert in ein Plasmid ligiert, welches bereits das ausgewählte Gensegment zum Exprimieren des gewünschten zellassoziierten Segments des Hybridproteins enthält, das produziert werden soll. Das Plasmid wird so gezeigt, daß es die Leadersequenz für das Hybridantigen enthält, aber solch eine Sequenz ist in dem Plasmid nicht unbedingt erforderlich. Sie kann in der Oligonucleotidsequenz enthalten sein, die verwendet wird, um das aktive Polypeptid zu exprimieren. Auch wenn die verschiedenen Gensegmente in dem Plasmid als aneinander angrenzend gezeigt werden, können sie auch durch Spacer getrennt sein.
Das Plasmid ist so gezeigt, daß es zwei unterschiedliche Antibiotikaresistenzregionen enthält, um bei der Auswahl zu assistieren. Eine, welche innerhalb des Polylinkerortes angeordnet ist, trennt ihn in zwei Bereiche und wird entfernt werden, wenn er durch ein Insert ersetzt wird. Andere Marker, so wie diejenigen, die in einer Farbe resultieren, können verwendet werden. Andere Formulierungen eines Plasmids mit Polylinkerorten können konstruiert werden, wenn erforderlich.
Das Plasmid ohne den Marker, welcher den Linker trennt, aber mit einem effektiven Promotor, kann verwendet werden, um ein grampositives Bakterium zu transformieren. Das gezeigte Plasmid kann sich mit einem Chromosom, wie oben beschrieben, überkreuzen. Ein transformiertes Bakterium, welches das Plasmid oder das Chromosom enthält, wird das gewünschte Oberflächenhybridprotein exprimieren.
Das Plasmid M6.1 367–441, welches in der oben identifizierten Stammanmeldung beschrieben und beansprucht ist, ist in der Praxis dieser Erfindung insbesondere nützlich. Die Herstellung dieses Plasmids ist in der Stammanmeldung beschrieben. Es wurde bei der American Type Culture Collection in dem E. coli-Stamm K561 unter der Zugangsnummer ATCC68235 hinterlegt.
Wie in den Stammanmeldungen erklärt, kann dieses Plasmid mit einer entsprechenden DNA-Sequenz und dem Hybridgen, das in einem entsprechenden Träger inseriert ist, so wie E. coli oder einem ausgewählten nichtpathogenen grampositiven Bakterium, fusioniert werden. Das resultierende transformierte Bakterium wird ein Polypeptid dieser Erfindung exprimieren. Das transformierte grampositive Bakterium kann direkt als ein Impfstoff verwendet werden. Alternativ kann es in einer Überkreuzungsreaktion, wie oben erklärt, verwendet werden, um ein weiteres transformiertes Bakterium zu produzieren, welches das gewünschte Polypeptid effizienter exprimieren wird. Das Plasmid kann ebenso für die Herstellung eines universellen Peptids durch die Insertion eines Polylinkers verwendet werden.
Ein spezieller Vorteil der Erfindung ist es, daß das rekombinante grampositive Bakterium dem Tier mit einem entsprechenden Bedarf an dem mukosalen Ort übertragen werden kann, bei welchem das Pathogen normalerweise in den Körper eintritt. Diese beinhalten orale ebenso wie nasale, intestinale und vaginale Orte. Solch eine Übertragung wird eine lokale Immunantwort an dem Ort stimulieren und ein effektives Mittel sein, um eine schützende Immunantwort gegen das Pathogen hervorzurufen. Da die verwendeten Bakterien nichtpathogene normale Organismen für den bestimmten Ort sein werden, können sie ohne die Gefahr von toxischen Wirkungen verwendet werden. Die ausgewählten Bakterien können an Fisch oder wilde Tiere durch das Vermischen mit den Nahrungsmitteln, die sie essen, oder dem Wasser, in dem sie leben, verabreicht werden.
Unter Verwendung derselben Verfahren, die oben beschrieben sind, können Hybridproteine, welche die Antikörper-hervorrufenden Antigene enthalten, die in der folgenden Tabelle 2 als aktive Polypeptide gezeigt sind, hergestellt werden. Die Tabelle zeigt das Polypeptid, welches Antikörper produzieren wird, die schützend gegen die Infektion durch ein Pathogen sind, die Krankheit, gegen die geschützt werden soll, und die Publikation, welche das Polypeptid beschreibt. In einigen Fällen wird das Gen, das verwendet wird, um das Oligonucleotid, das für ein Peptid codiert, hervorzurufen, präpariert und in ein Plasmid inseriert werden müssen. Die Verfahren sind vollständig parallel zu den Verfahren, die oben beschrieben sind. Die C-terminale Ankerregion kann irgendeine derjenigen sein, die spezifisch oben vorgeschlagen sind, oder irgendein anderes Ankersegment eines Oberflächenproteins aus einem grampositiven Bakterium, das in Tabelle 1 beschrieben ist. Das aktive Polypeptid der transformierten Bakterien wird das gezeigte Peptid enthalten, fusioniert mit der Leadersequenz und einem kleinen Segment des N-Terminus eines Oberflächenproteins, um eine ordentliche Translokation an die Zelloberfläche zu erlauben.
TABELLE 2 PEPTIDSEQUENZEN, DIE FÜR DIE ENTWICKLUNG VON VAKZINEN AUS HYBRIDANTIGENEN GEEIGNET SIND
Die transformierten Bakterien der Erfindung sind im Ergebnis therapeutische Mittel und werden als solche behandelt werden. Sie können allein oder in Verbindung mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern des Typs verwendet werden, die normalerweise mit solchen therapeutischen Mitteln verwendet werden. Für die orale oder nasale Verabreichung können sie in wäßrigen isotonischen Salzlösungen suspendiert werden, welche aromatisiert oder gefärbt werden können. Für die intestinale Übertragung können sie in einer Kapsel angeordnet werden, um die transformierten Bakterien oral zu übertragen. Andere Verabreichungsverfahren werden dem Fachmann offensichtlich sein und befinden sich innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Da die erfindungsgemäßen Produkte als lebende transformierte Bakterien verwendet werden, um den ausgewählten Ort der Verabreichung zu kolonisieren, ist keine spezifische Dosierung erforderlich. Typischerweise wird die ausgewählte Dosierungsform von etwa 106 bis 10¹⁰ Organismen pro Dosierungseinheit enthalten.
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Claims

Ein Oberflächenhybridprotein, enthaltend die Ankersequenz LPXTGX eines Oberflächenantigens, das normalerweise durch ein grampositives Bakterium exprimiert wird, gebunden an ein aktives Polypeptid, welches einem menschlichen Wirt zu einem nützlichen Zweck übertragen werden kann.
Das Oberflächenhybridprotein nach Anspruch 1, wobei das aktive Polypeptid ein Enzym ist.
Ein Oberflächenhybridprotein nach Anspruch 1, wobei das aktive Polypeptid ein Oberflächenantigen einer menschlichen Tumorzelle ist.
Ein Oberflächenhybridprotein nach Anspruch 1, wobei das aktive Polypeptid ein Oberflächenantigen eines männlichen Spermiums ist.
Ein Oberflächenhybridprotein nach Anspruch 1, wobei das aktive Polypeptid ein Allergen ist.
Ein Oberflächenhybridprotein nach Anspruch 1, wobei das aktive Polypeptid eine antigene Determinante eines Oberflächenantigens eines Bakteriums, eines Virus, eines Parasiten oder eines Fungus beinhaltet.
Ein Oberflächenhybridprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Ankersequenz die Ankersequenz des streptokokkalen M-Proteins ist.
Eine Gensequenz, welche für ein Oberflächenhybridprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.
Ein Plasmid, der die Gensequenz umfaßt, die in Anspruch 8 beansprucht ist.
Ein Chromosom, das die Gensequenz umfaßt, die in Anspruch 8 beansprucht ist.
Ein nicht-pathogenes grampositives Bakterium, welches ein Oberflächenhybridprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimiert, wobei die Ankersequenz des Proteins an dem Bakterium anhaftet.
Ein nicht-patogenes grampositives Bakterium gemäß Anspruch 11, wobei das Oberflächenhybridprotein durch einen Plasmid nach Anspruch 9 exprimiert wird.
Ein nicht-pathogenes grampositives Bakterium gemäß Anspruch 11, wobei das Oberflächenhybridprotein durch ein chromosomales Gen exprimiert wird.
Ein Impfstoff, zum Schutz eines tierischen Wirts gegen die Infektion durch ein pathogenes Bakterium, welcher ein Bakterium gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Ein Plasmid, das ein Gensegment zum Exprimieren der Ankersequenz LPXTGX eines Oberflächenantigens, welches normalerweise durch ein grampositives Bakterium exprimiert wird, gemeinsam mit einem Polylinkersegment umfaßt, welches durch einen Marker in zwei Abschnitte geteilt wird.
Ein in-vitro-Verfahren zum Testen, ob eine Infektion vorliegt, welche gekennzeichnet ist durch die Gegenwart von Antikörpern in einer Körperflüssigkeit eines Tieres, wobei die Antikörper charakteristisch für den infizierenden Organismus sind, wobei der Test das Inkubieren der Körperflüssigkeit mit einem nicht-pathogenen grampositiven Bakterium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, welche mit den Antikörpern reagieren werden und danach das Bestimmen, ob eine Reaktion stattgefunden hat, umfaßt.
Ein Kit, das nützlich für einen Test zum Bestimmen der Gegenwart einer Infektion ist, wobei die Infektion dadurch gekennzeichnet ist, daß Antikörper in einer Körperflüssigkeit eines Tieres vorhanden sind, wobei das Kit ein nicht-pathogenes grampositives Bakterium umfaßt, welches ein Oberflächenhybridprotein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 exprimiert, welches mit den Antikörpern reagieren wird.