DE69836341T2

DE69836341T2 - Lkta deletionsmutanten in p. haemolytica

Info

Publication number: DE69836341T2
Application number: DE69836341T
Authority: DE
Inventors: E. Robert Boone BRIGGS; M. Fred Ames TATUM
Original assignee: Biotechnology Research and Development Corp
Current assignee: Biotechnology Research and Development Corp
Priority date: 1997-09-25
Filing date: 1998-09-25
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2018-09-26
Also published as: ATE344326T1; PT1017822E; DE69836341D1; US6573093B2; ES2279582T3; US20020039589A1; US20020086413A1; US6331303B1; DK1017822T3; NZ503463A; CA2303390C; US6495145B2; AU743654B2; EP1017822B1; AU9581798A; NZ514103A; CA2303390A1; WO1999015670A1; EP1017822A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Bakteriengenetik und insbesondere das Gebiet der respiratorischen Pathogene landwirtschaftlicher Nutztiere.
Technischer Hintergrund der Erfindung
P. haemolytica verursacht als Pathogen in der landwirtschaftlichen Nutztierhaltung ernste wirtschaftliche Schäden. Zur Beherrschung dieser Erkrankung entwickelte Impfstoffe hatten unterschiedlichen, jedoch begrenzten Erfolg. Weil die Erkrankung zum beträchtlichen Teil durch die Reaktion des Tiers auf die Infektion mit P. haemolytica verursacht wird, können unangemessen gestaltete Impfstoffe den klinischen Zustand der infizierten Impflinge tatsächlich verschlechtern. Daher besteht in der Technik ein ständiger Bedarf an sicheren und wirksamen Impfstoffen, welche die Morbidität und/oder Mortalität von Wiederkäuern durch P-haemolytica vermindern können.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein P. haemolytica-Bakterium bereitzustellen, das als Impfstamm brauchbar ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um in Wiederkäuern Immunität gegen Lungenpasteurellose hervorzurufen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Impfstamm gegen Lungenpasteurellose bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Wiederkäuerfutters.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden von einer oder mehreren der unten beschriebenen Ausführungsformen gelöst. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein P. haemolytica-Bakterium bereit, das

a) kein biologisch aktives Leukotoxin exprimiert,
b) im Strukturgen lkA^- eine Mutation umfasst, welche Leukotoxin kodiert,
c) ein deletionsmutantes Leukotoxinmolekül exprimiert, welches spezifisch an Leukotoxin bindende Antikörper hervorruft und
d) keine fremde DNA enthält.

Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren bereit, um in Wiederkäuern Immunität gegen Lungenpasteurellose hervorzurufen. Dem Wiederkäuer wird ein erfindungsgemäßes Bakterium verabreicht. Dadurch wird Immunität gegenüber dem Bakterium hervorgerufen.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Futter für Wiederkäuer bereit. Das Futter enthält ein erfindungsgemäßes Bakterium.
Noch eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt einen Impfstoff zur Verminderung der Morbidität bei Wiederkäuern bereit. Der Impfstoff enthält ein erfindungsgemäßes P. haemolytica-Bakterium.
Die vorliegende Offenbarung stellt ein temperaturempfindliches Plasmid bereit. Das Plasmid repliziert in P. haemolytica bei 30 °C, aber nicht bei 40 °C.
So stellt die vorliegende Offenbarung die Technik mit Mitteln zur genetischen Manipulation eines landwirtschaftlich wichtigen Pathogens dar. Sie liefert auch nützliche Mutantenstämme, welche wirksam angewendet werden können, um die Morbidität unter Wiederkäuern, wie Rinder, Schafe und Ziegen, durch Pasteurella haemolytica zu vermindern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Schicksal des temperaturempfindlichen Plasmids in Pasteurella haemolytica nach Durchlaufen von 30 °C und 40 °C.
2. Das Operon von Pasteurella haemolytica-Leukotoxin mit dem 3,15 kB-EcoRV-Fragment. lktC acyliert das Leukotoxin-Strukturgen zur Aktivierung; lktA ist das Leukotoxin-Strukturgen; lktB/D sind beim von der Leader-Sequenz unabhängigen Leukotoxinexport beteiligt.
3. In-frame-Deletion des 3,15 kB EcoRV-Fragments von lktCA mit NaeI.
4. Integration des Austauschplasmids ins Chromosom.
5. Herauslösen des Austauschplasmids aus dem Chromosom.
6. Western Blot des nativen Leukotoxins und des ΔlktA mittels monoklonalem Antikörper anti-Lkt.
Eingehende Beschreibung
Bei der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass eine nicht revertierende Mutante des P. haemolytica, welche eine mutante Form des Leukotoxins exprimiert, als Impfstoff brauchbar ist. Außerdem wurde gefunden, dass diese Mutante nützlich ist, wenn sie durch Auftragen auf die Tonsillen, über den oralen oder über den nasalen Weg verabreicht wird. Daher können zur Impfung der Tiere äußerst billige und einfache Verfahren durch Auftragen auf das Tierfutter durchgeführt werden.
Die Mutante ist bevorzugt eine Deletionsmutante. Ein solches hergestelltes mutantes Leukotoxinprotein hat etwa 66 kDa, jedoch können auch andere Mutanten verwendet werden, solange das Protein lang genug ist, um immunogen zu sein, bevorzugt mindestens 10, 15 oder 20 Aminosäuren. Man nimmt an, daß ein Molekül mit längerer Deletion für die Erzielung einer starken Immunreaktion bevorzugt ist. Bevorzugt enthält das Bakterium keine exogenen Gene, wie Resistenzgene gegen Arzneistoffe, welche Probleme für die Umwelt und die Gesundheit verursachen können, wenn sie nicht zurückgehalten werden. Außerdem ist bevorzugt, dass die Mutation eine nicht revertierende Mutation, wie eine Deletionsmutation, ist.
Mutante Formen des erfindungsgemäßen Leukotoxins induzieren Antikörper, welche spezifisch an Leukotoxin binden. Im Western Blot oder in anderen immunochemischen Assays ergeben spezifisch an Leukotoxin bindende Antikörper ein Detektionssignal, das mindestens zwei-, fünf-, zehn- oder zwanzigmal größer als ein mit anderen Proteinen erhaltenes Detektionssignal ist. Bevorzugt weisen spezifisch an Leukotoxin bindende Antikörper bei immunochemischen Assays keine anderen Proteine nach und können Leukotoxin aus Lösung immunfällen. Mehr bevorzugt können die Antikörper in einem indirekten Hämagglutinations-Assay nachgewiesen werden und Leukotoxin neutralisieren.
Obwohl für die Zuführung der orale Weg bevorzugt wird, können auch andere Wege zur Impfung angewendet werden. Dazu gehören ohne Beschränkung subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intranasale, intrabronchiale usw. Verabreichung. Der Impfstoff kann allein oder als Bestandteil eines Mehrfachimpfstoffs, d. h. in Kombination mit anderen Impfstoffen, gegeben werden.
Es wird auch ein temperaturempfindliches Plasmid bereitgestellt, welches in P. haemolytica bei 30 °C, jedoch nicht bei 40 °C, repliziert. Bevorzugt gehört das Plasmid zur gleichen Inkompatibilitätsgruppe wie pD80, d. h. es hat den Replikations-Startpunkt gemeinsam.
Impfung mit einer modifizierten lebenden Kombination von P. haemolytica Serotyp 5 und 6 schützt sehr gut gegen kombinierte homologe virulente Infektion, wie aus klinischen Zeichen, postmortalen Läsionen und den Ergebnissen von Bakterienkulturen hervorgeht. So geimpfte Tiere bleiben aktiv, lebhaft, fieberfrei und nehmen Futter. Der Impfstoff kann nicht nur den Tod durch P. haemolytica verhindern, sondern auch die Symptome der Lungenpasteurellose vermindern, wie Lungenläsionsvolumen, Fieber, verminderten Appetit, Verlust an Lungenkapazität, fibrinösen Pleuraerguß und/oder Verwachsungen, bakterielle Belastung und Depression.
Obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis erhält man durch Bezugnahme auf die folgenden speziellen Beispiele, die hier nur zur Veranschaulichung und nicht mit der Absicht, den Erfindungsbereich zu beschränken, angeführt sind.
Beispiel 1
Orale und parenterale Lebendimpfstoffe gegen Transportpneumonie und Lungenpasteurellose von Rindern, Schafen und Zieen durch reine in frame-Deletionen des Leukotoxin- Strukturgens von Pasteurella haemolytica Materialien und Verfahren
Mutagenese des Plasmid-Replikationsstartpunkts. Ein 1,2 kB-DNA-Fragment mit dem putativen pD80-Replikationsstartpunkt wurde durch PCR unter Verwendung des aus P. haemolytica Serotyp 1, Stamm NADC -D80 isolierten ampicillinresistenten 4,3 kB-Plasmids als Schablone vermehrt (1). Es wurden der Vorwärtsprimer 5'-CCG GAT CCC CAA TTC GTA GAG GTT TC-3' (SEQ ID Nr. 1) und der Reversprimer 5'-CCG GAT CCG CTG AAA GCG GTC GGG GG-3' (SEQ ID Nr. 2) verwendet. Das Produkt wurde in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) unter Anwendung der Herstelleranweisungen kloniert. Durch Passage von pBC SK (Stratagene, La Jolla, CA) mit einem in die einzige EcoRI-Spaltstelle klonierten Derivat des Kanamycingens Tn903 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) durch den E. coli-Stamm PhaImtase wurde eine Kanamycin-Kassette hergestellt, um gegen PhaI-Spaltung zu schützen.
Das geklonte 1,2 kB-Insert (1 μg) wurde durch EcoRI-Abbau aus dem pCR2.1 herausgeschnitten und über Nacht mit der EcoRI-abgebauten PhaI-methylierten Kanamycin-Kassette (0,25 μg) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde durch Fällung mit EtOH konzentriert und in den P. haemolytica Serotyp 1-Stamm NADC-D153 mit 18 kV/cm und 1000 W elektroporiert (Gene-pulser, Bio-Rad, Redfield, CA).
Plasmid-DNA wurde aus einem kanamycinresistenten Transformanten erhalten, der eine Größe von 2,5 kB hatte und bei Behandlung mit EcoRI in Fragmente von 1,2 und 1,3 kB gespalten wurde. Ein μg des Plasmids wurde mit Hydroxylamin eine Stunde bei 65 °C mutagenisiert, wie früher beschrieben (2).
Selektion des temperaturempfindlichen Plasmid-Replikationsstartpunkts. Das mutagenisierte Plasmid wurde über Nacht bei 4 °C gegen TE dialysiert, durch Ethanolfällung konzentriert und in frisches NADC-D153 elektroporiert, wie oben beschrieben. Nach 2 h Erholung in Columbia-Nährlösung (Difco Laboratories, Detroit, MI) wurden die Zellen auf 10 Columbia-Blut-Agar-Platten plattiert, die 50 μg/ml Kanamycin enthielten, und bei 30 °C inkubiert. Nach 20 h wurden die Platten für weitere 6 h auf 40 °C gebracht.
Atypisch kleine Kolonien wurden ausgewählt und auf frische Kanamycinplatten kloniert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Der Zuwachs der Klone wurde auf Platten mit und ohne Kanamycin dupliziert und über Nacht bei 40 °C inkubiert.
Bei Klonen, die auf selektiven Medien bei 40 °C nicht wuchsen, jedoch ohne Selektion wuchsen, wurde vermutet, daß sie entweder für die Plasmiderhaltung oder die Kanamycinexpression temperaturempfindlich seien. Der Zuwachs von Platten ohne antibiotische Selektion bei 40 °C wurde auf selektive Platten übertragen, die über Nacht bei 30 °C inkubiert wurden. Für Klone, die bei dieser Übertragung nur geringes oder kein Wachstum zeigten, wurde angenommen, daß sie temperaturempfindliche Replikationsstartpunkte enthielten. Diese Klone wurden von der ursprünglichen bei 30 °C selektiven Platte auf frische selektive Platten und selektive Nährlösung übertragen. Die Klone wurden durch Übertragung mit und ohne Selektion bei 30 °C und 40 °C nachgeprüft. Obwohl jeder Klon den richtigen Phänotyp zeigte, ergaben Minipreps der Plasmide aus den Nährlösungskulturen kleine Mengen eines 2,5 kB-Plasmids aus nur einer der Kulturen. Die übrigen Klone wurden nicht weiter geprüft.
Aufbau eines temperaturempfindlichen Shuttlevektors mit zwei Startpunkten. Aus dem obigen Plasmid wurde der temperatur empfindliche Replikationsstartpunkt durch EcoRI-Abbau herausgeschnitten und durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und allen vier dNTPs abgestumpft. Das Fragment wurde über Nacht bei 4 °C mit SmaI-abgebautem pBC SK ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli DH10-B (Life Technologies, Gaitherburg, MD) verwendet.
Aus einer chloramphenicolresistenten Kolonie wurde Plasmid mit einem 1,2 kB-Insert gewonnen. Das Plasmid wurde mit SalI abgebaut und in die SalI-abgebaute Kanamycin-Kassette über Nacht bei 4 °C ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli DH10-B elektroporiert und auf Kanamycin 50 μg/ml plattiert. Das aus einer kanamycinresistenten Kolonie gewonnene Plasmid wurde mit BssHII abgebaut, wie oben abgestumpft, zur Entfernung der terminalen Phosphate mit alkalischer Kalbsphosphatase behandelt und über Nacht bei 4 °C mit einem stumpfen Fragment von ungefähr 900 Bp, das den Replikationsstartpunkt des ColE1-Plasmids enthielt, ligiert.
Das Ligationsgemisch wurde in E. coli PhaImtase (1) elektroporiert und auf kanamycinhaltige Platten aufgetragen. Aus einer kanamycinresistenten Kolonie wurde das Plasmid aufgenommen, welches bei EcoRI-Abbau ein einziges Fragment von etwa 3,5 kB und bei SalI-Abbau Fragmente von 2,2 und 1,3 kB ergab. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pBB80C. Das Plasmid wurde in P. haemolytica elektroporiert, um den temperaturempfindlichen Replikationsstartpunkt zu bestätigen; es unterstützte das Bakterienwachstum auf Kanamycin noch bei 30 °C, aber nicht bei 40 °C.
Klonen und Bearbeiten von lktA. Ein 3,15 kB-EcoRV-Fragment der Genom-DNA von P. haemolytica mit lktC und etwa 75 des lktA kodierenden Bereichs wurde in die EcoRV-Restriktionsstelle von pBB80C ligiert. Das resultierende Plasmid wurde in E. coli DH10-B vermehrt und als pBB80ClktA be zeichnet.
Das Plasmid pBC SK (0,25 μg, verwendet, um zusätzliche NaeI-Stellen in trans bereitzustellen) wurde mit 0,25 μg pBB80ClktA gemischt und mit NaeI 18 h bei 37 °C abgebaut. Die resultierende teilverdaute Plasmid-DNA wurde mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI) extrahiert, mit Ethanol gefällt, bei 4 °C über Nacht ligiert, dann wieder extrahiert und gefällt. Das Ligationsgemisch wurde mit PvuII abgebaut, welches sowohl pBC SK als auch das im lktA vorhandene 1035 Bp-NaeI-Fragment spaltet.
Fünf ng der verdauten DNA wurden in E. coli-PhaImtase elektroporiert auf Columbia-Blut-Agar-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin plattiert. Die Plasmid-DNA von ausgewählten Transformanten wurde durch Digerieren von Plasmid-Micropreps mit EcoRV allein oder zusammen mit NgoMI (ein Isoschizomer von NaeI) durchsucht. Ein Klon mit einer 1035 Bp-Deletion wurde ausgewählt und als pBB80CΔlktA bezeichnet.
Gewinnung von Leukotoxinmutanten. Das Plasmid pBB80CΔlktA wurde in frisches P. haemolytica Stamm NADC-D153 bei 18 kV/cm und 1000W elektroporiert. Man ließ die Zellen 2 h bei 30 °C in Columbia-Nährlösung ruhen und plattierte sie dann mit 100 μl/Platte auf Columbia-Agar-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin. Nach 48 h Inkubieren bei 30 °C wurden vier Kolonien auf Kanamycinplatten mit 5 % entfibriniertem Rinderblut übertragen und über Nacht bei 37 °C inkubiert, um Einzel-Kreuzmutanten auszusondern. Vier Kolonien aus dem 37 °C-Durchlauf, 2 hämolytische und 2 nichthämolytische (insgesamt 16), wurden ohne Selektion in Columbia-Nährlösung übertragen und über Nacht bei 30 °C inkubiert, um die Einzel-Kreuzmutationen zu beheben.
Der Zuwachs aus der 30 °C-Columbia-Nährlösung wurde zur Isolierung auf Blut-Agar-Platten mit 5 % entfibriniertem Rin derblut ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Auch wurde der Zuwachs nacheinander insgesamt viermal ohne Selektion in frische Columbia-Nährlösung bei 30 °C übertragen, um die Geschwindigkeit, mit der die Kanamycinresistenz bei 30 °C verlorengeht, weiter abzusichern. Die aus dem ersten 30 °C-Durchgang isolierten Kolonien wurden auf eine Anordnung von selektiven und nichtselektiven Platten dupliziert, die 5 entfibriniertes Rinderblut enthielten.
Für die weitere Untersuchung wurde ein kanamycinempfindlicher Klon ausgewählt, der auf der nichtselektiven Platte keine nachweisbare hämolytische Aktivität zeigte. Später wurden weitere P. haemolytica-Stämme aus dem Depot des National Animal Disease Center der gleichen Behandlung wie oben unterworfen. Diese Stämme waren aus Pneumonie-Lungen isoliert worden und umfassten: NADC D632, Schafsserotyp 1; NADC D121, Schafsserotyp 2; NADC D110, Schafsserotyp 5; NADC D174, Rinderserotyp 6; NADC D102, Schafsserotyp 7; NADC D844, Schafsserotyp 8; NADC D122, Schafsserotyp 9 und NADC D172, Schafsserotyp 12.
Charakterisierung der putativen Leukotoxinmutante. Um die Chromosomendeletion zu bestimmen, wurde DNA aus den ganzen Zellen der putativen Leukotoxinmutante und ihres Mutterstamms NADC D153 durch PCR vermehrt, wobei Primer verwendet wurden, die in den EcoRV-Enden des ursprünglichen 3,15 kB-EcoRV-Genomfragments enthalten waren. Die Produkte wurden sowohl intakt als auch nach NgoMI-Abbau der Elektrophorese auf 1,2 %-Agarosegel unterworfen.
Um die leukotoxische Aktivität zu bestimmen, wurden Überstände aus der logarithmischen Kulturphase der putativen Mutante und ihrer Mutter aus 3 h-Kulturen in Columbia-Nährlösung hergestellt. Zweifache Verdünnungen der Überstände wurden mit BL-3-Targetzellen und MTT-Farbstoff gemessen (7).
Um die Expression des putativen veränderten Leukotoxinprodukts und auch eines dritten Kulturüberstands aus unserer ursprünglichen Leukotoxin-Deletionsmutante, die kein nachweisbares Leukotoxin erzeugt, zu bestimmen, wurden die Kulturüberstände mittels 30000 MW-Ultrafiltern (Centriprep, Amicon, Beverly, MA) etwa 15-fach konzentriert. Der Rückstand wurde zweifach der Elektrophorese auf SDS-PAGE unterworfen und eines der Gele wurde mit Coomasieblau gefärbt.
Das zweite Gel wurde zur Western-Blot-Analyse auf eine Nylonmembran abgeklatscht. Die Membran wurde gewaschen, mit dem Antileukotoxin-Antikörper 601 (bereitgestellt von Dr. S. Srikumaran, Lincoln, NE) sondiert, mit Antimaus-IgG-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Sigma) markiert und mit Nitroblautetrazol (Sigma) gefärbt.
Andere Pasteurella haemolytica-Mutanten als NADC D153ΔlktA Serotyp 1 wurden nur durch PCR-Analyse und Wachstumseigenschaften auf Blut-Agar-Platten charakterisiert. Bei diesen wurde die Erzeugung von verändertem Leukotoxinprotein nicht bestätigt.
Ergebnisse
Der aus dem endogenen ampicillinresistenten P. haemolytica-Plasmid abgeleitete temperaturempfindliche Replikationsstartpunkt erwies sich als nützliches Werkzeug für den Aufbau von Deletionsmutanten in diesem Organismus. Es wurde angenommen, daß sich der Replikationsstartpunkt in einem nichtkodierenden Bereich zwischen den Nukleotiden 3104 und 4293 des nativen Plasmids befindet. Das in eine 1,3 kB-Tn903-Kanamycin-Kassette ligierte 1,2 kB-PCR-Produkt dieses Bereichs führte zu einem 2,5 kB-Produkt, das P. haemolytica stabil transformieren konnte, wie durch einen Verlust von weniger als 1 % Plasmid nach 100 Generationen in Nährlösungskultur bewiesen wurde.
Diese Daten deuten darauf hin, dass sich in diesem 1,2 kB-Bereich des nativen Plasmids essentielle Replikationsfunktionen befinden.
Nach Mutagenese mit Hydroxylamin sank die Wirksamkeit der Transformation etwa 10-fach, was andeutet, daß die DNA vielleicht nicht besonders beschädigt war. Trotzdem wurden nach 20 h bei 30 °C und 6 h bei 40 °C 10 atypisch kleine Kolonien gewonnen. Zwei dieser Kolonien wuchsen bei der Selektion bei 40 °C und wurden verworfen. Vier der verbleibenden acht Kolonien behielten die Kanamycinresistenz nach einem Durchgang ohne Selektion bei 40 °C. Für diese 4 Kolonien wurde angenommen, daß sie für die Expression von Kanamycinresistenz temperaturempfindliches Plasmid enthielten und sie wurden ebenfalls verworfen.
Die übrigen 4 Kolonien, von denen angenommen wurde, dass sie für die Erhaltung temperaturempfindliches Plasmid enthielten, wurden von der ursprünglichen 30 °C-Platte gewonnen und erneut bei 40 °C und 30 °C durchgeführt. Obwohl beide ohne Selektion bei beiden Temperaturen gut wuchsen, wuchsen sie mit Selektion bei 40 °C nicht und konnten auch nach Durchlauf bei 40 °C die Kanamycinresistenz nicht behalten; nur ein Klon ergab ausreichend Plasmid für die weitere Untersuchung durch einen schnellen alkalischen Lyseprozess. Vermutlich enthielten die anderen 3 Kolonien ebenfalls Plasmid; durch die schnelle Plasmidreinigung konnte jedoch keine zur Visualisierung auf Agarosegelen ausreichende Menge gewonnen werden. Die Plasmidausbeute vom positiven Klon war sehr niedrig.
Um die nachfolgende Isolierung und Klonierung zu erleichtern, wurden dem temperaturempfindlichen pD80-Startpunkt eine Mehrfachklonierungsstelle und ein ColEI-Replikationsstartpunkt angefügt. Der temperaturempfindliche Startpunkt und eine frische Kanamycin-Kassette wurden in die Mehrfachklonie rungsstelle von pBC-SK eingefügt, dann wurde das Vektorgerüst durch eine < 1 kB-Kopie des ColEI-Startpunkts ersetzt. Dieses Plasmid von etwa 3,5 kB, pBB80C, behält die meisten der Einzelrestriktionsstellen von pBC-SK, repliziert gut in E. coli und transformiert P. haemolytica bei 30 °C mit mäßiger Wirksamkeit. In P. haemolytica unterstützt der ColEI-Startpunkt die Replikation nicht und die Erhaltung des Plasmids hängt vom mutierten pD80-Startpunkt ab. In dieser Lage unterstützte pBB80C das Wachstum auf selektivem Medium bei 37 und 40 °C nicht, unterstützte jedoch ein mäßiges Wachstum bei 30 °C (1).
Um im kodierenden Bereich von P. haemolytica lktA eine in frame-Deletion durch Allelaustausch einzuführen, wurde ein ein Teil des Leukotoxin-Operons enthaltendes EcoRV-Fragment in pBB80C kloniert und ergab pBB80ClktA. Der Klon erstreckte sich etwa 500 Bp stromauf vom lktC-Startkodon und enthielt etwa 75 des lktA (2).
Innerhalb des EcoRV-Fragments gibt es zwei NaeI-Restriktionsstellen, welche zwischen Kodons im lktA spalten und stumpfe Enden hinterlassen (3). Die NaeI-Stellen liegen im EcoRV-Fragment fast gleichmäßig 1 kB auseinander. Digerieren von pBB80ClktA mit NaeI war dadurch kompliziert, daß NaeI zu einer Gruppe von Restriktionsendonukleasen gehört, die eine dramatische Stellenbevorzugung für die Restriktion zeigen (4). Dieses Enzym benötigt die simultane Wechselwirkung mit zwei Kopien seiner Erkennungssequenz, um DNA zu spalten. Bei gewissen Enzymen dieses Typs kann die zweite Kopie als trans zugeführt werden, daher wurden bei diesem Versuch dem Abbaugemisch zusätzliche Erkennungsstellen durch Zufügen von pBC SK, welches eine Stelle enthält, zugeführt. Obwohl diese Strategie zu unvollständiger Spaltung nach Digerieren über Nacht führte, fiel im Gemisch ein 1 kB-Fragment auf, was anzeigte, dass bei einigen der pBB80ClktA-Moleküle beide NaeI-Stellen gespalten worden waren.
Die Spaltung nach Ligation mit PvuII, das sowohl in pBC SK als auch im zu entfernenden 1 kB-Fragment enthalten ist, beseitigte anscheinend die meisten unerwünschten Produkte, denn alle nach pBB80CΔlktA durchsuchten Transformanten enthielten die gewünschte 1035 Bp-Deletion. Jeder wurde durch NgoMI wieder gespalten, was zeigt, dass die neue NaeI-Stelle intakt war und das Produkt im Raster mit dem lktA-Startkodon sein sollte.
Mit pBB80CΔlktA transformiertes Pasteurella haemolytica benötigte etwa 48 h, um bei 30 °C eine gute Koloniegröße zu erreichen. Ein Durchlauf bei 37 °C mit einfachem heftigem Ausstreichen auf einer kanamycinhaltigen Platte führte zu zahlreichen isolierten Kolonien, einige hämolytisch und andere nicht. Diese Ergebnisse sind mit der spezifischen Integration des Plasmids in das Leukotoxin-Operon vereinbar (4). Da das Austauschplasmid stromauf von der Deletion eine intakte Operonsequenz einschließlich des Promotors enthielt, war von Einfachkreuzprodukten stromauf zu erwarten, dass sie das gesamte Operon normal exprimieren. Von Einfachkreuzprodukten stromab war dagegen zu erwarten, daß sie zwei fehlerhafte lktA-Kopien enthalten, weil das 25 % des lktA kodierende C-Ende auf dem Ersatzplasmid nicht vorhanden war. Eine Kopie des Leukotoxingens müsste daher die 1 kB-Deletion und die andere einen stumpfen C-Terminus enthalten. Schon früher wurde gezeigt, dass die hämolytische Aktivität mit der Expression aktiven Leukotoxins korreliert (3, 5, 6).
Der Durchlauf von Einfachkreuzprodukten bei 30 °C führte zu Ablösung des Plasmids vom Chromosom mit unerwartet niedriger Geschwindigkeit. Frühere Arbeiten mit pBB192C, einem von streptomycinresistentem P. haemolytica abgeleiteten temperaturabhängigen Plasmid, zeigten 90 bis 99 % Wiederherstellung der Kanamycinresistenz nach einem einzigen Durchlauf bei 37 bzw. 30 °C. Bei diesem Versuch wurden nur zwei der 80 nach einem Durchlauf bei 30 °C isolierten und geprüften Kolonien kanamycinempfindlich. Eine der beiden war nicht hämolytisch und erwies sich später als Doppelkreuzmutant (5). Weiterer Durchlauf in nichtselektiver Kultur erhöhte den Prozentsatz der kanamycinempfindlichen koloniebildenden Einheiten auf fast 50 % nach 4 Durchläufen. Viele dieser Kolonien zeigten einen nichthämolytischen Phänotyp und waren wahrscheinlich Doppelkreuzprodukte.
Um Mutanten der anderen Serotypen zu erzeugen, wurden 4–8 hämolytische Einfachkreuzprodukte ausgewählt und bei 30 °C einem oder mehreren Durchläufen in Nährlösung unterworfen. Der Zuwachs wurde bei jedem Durchlauf zur Abtrennung abgenommen und nichthämolytische Kolonien zur Prüfung mit PCR und Züchtung auf kanamycinhaltigen Medien ausgewählt. In jedem Fall wurde durch PCR bestätigt, dass die nichthämolytischen kanamycinempfindlichen Kolonien Deletionsmutanten mit einzelnen NaeI-Stellen sind.
Wir nehmen an, dass pBB192C einen robusteren Replikationsstartpunkt als pBB80C enthält, wie durch die relativen Mengen des aus den entsprechenden Kulturen gewonnenen Plasmids belegt wird. Wenn die Aktivität eines integrierten Plasmidstartpunkts die chromosomale Replikation destabilisiert, dann müsste mit größerer Aktivität des Plasmidstartpunkts die Instabilität zunehmen. Dies könnte sowohl der Grund für größere Ablösungsgeschwindigkeit des pBB192C bei 30 °C gegenüber 37 °C als auch für die im Vergleich zu pBB192 geringere Ablösungsgeschwindigkeit des pBB80C sein. Beim Aufbau unserer ersten Leukotoxindeletionsmutante erhielten wir bei Verwendung des Suizid-Ersatzplasmids (3), das die Ampicillinselektion enthielt, eine große Zahl von Einfachkreuzprodukten. Obwohl beide homologen Arme denen im vorliegenden Versuch gleich waren, führte sogar der Durchlauf von 100 Generationen nicht zur Reversion des hämolytischen Phänotyps oder zum Verlust der Ampicillinresistenz. Diese Daten zeigen weiter, dass die Aktivität des Plasmidstartpunkts die Einfachkreuzprodukte destabilisiert.
PCR-Produkte der putativen Leukotoxinmutanten und ihrer Mutterstämme hatten eine Größe von 2 bzw. 3 kB, was zeigt, dass im entsprechenden lktA eine Deletion eingebaut worden war. Digerieren des PCR-Produkts mit NgoMI ergab 2 Banden von etwa 1 kB aus den Mutanten und 3 Banden von etwa 1 kB aus den Mutterstämmen, was zeigt, dass die Deletion im Raster mit LktA sein sollte. Die Leukotoxinaktivität in den Kulturüberständen gegen BL-3-Targetzellen der Serotyp 1-Mutante war < 1:2 im Vergleich zu 1:1024 beim Mutterstamm, was keine nachweisbare Aktivität anzeigt.
Im Kulturüberstand dieser Mutante wurde ein neues Protein von etwa 65 kDa durch SDS-PAGE nachgewiesen, was mit dem vorhergesagten Molekulargewicht des deletierten Produkts übereinstimmt. Nach der Coomasie-Färbung übertraf das neue Produkt die Konzentration des vom Mutterstamm, der gemeinsam mit dem Mutanten gezüchtet und geerntet worden war, erzeugten nativen LktA-Proteins. Die kleinere Größe dieses Produkts könnte eine schnellere oder wirtschaftlichere Expression des Gens ermöglichen. Das Produkt reagierte mit dem neutralisierenden monoklonalen Antikörper 601 bei einem scheinbaren Molekulargewicht von 66 kDa (6). Bei 101-104 kDa, dem scheinbaren Molekulargewicht des im Kulturüberstand des Mutterstamms beobachteten nativen Produkts, wurde keine Reaktion beobachtet.
Beispiel 2
Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit bei kleinen Wiederkäuern nach intramuskulärer Injektion einer polyvalenten Kombination der P. haemolytica Serotypen 5 und 6
Materialien und Verfahren
Impfung der Tiere. Vier Lämmer (Columbia, etwa 25 kg) und sechs Ziegen (Toggenburg, etwa 15 kg) wurden am National Animal Disease Center, Ames, IA, vom Kolostrum entwöhnt und aufgezogen. Zwei Lämmer und drei Ziegen wurden zufällig ausgewählt und mit jeweils 4 × 10⁷ CFU (koloniebildenden Einheiten) von P. haemolytica NADC D110ΔlktA und NADC D174ΔlktA (Serotypen 5 bzw. 6) in 1 ml Earle's ausgewogener Salzlösung (EBSS), pH 7,4, geimpft. Die Lösung wurde intramuskulär in die mittlere Halsregion verabreicht. Nach drei Wochen wurden die Tiere in gleicher Weise nachgeimpft.
Zehn Tage nach der zweiten Impfung wurden alle zehn Tiere mit jeweils 8,5 × 10⁷ CFU der Mutterstämme NADC D110 und NADC D174 infiziert, die in einem Gesamtvolumen von 5 ml EBSS gemischt waren, das intratracheal mit einem Katheter an der Tracheabifurkation eingeflößt wurde. Das Inokulum wurde mit 5 ml steriler EBSS nachgespült. Fünf Tage nach der Infektion wurden alle überlebenden Tiere getötet und seziert.
Bakterien. Die Pasteurella haemolytica-Stämme NADC D110 (Serotyp 5, Isolat aus Schafslunge) und NADC D174 (Serotyp 6, Isolat aus Rinderlunge) wurden getrennt in Columbia-Nährlösung (Difco Laboratories, Detroit, MI) etwa 3 h bis zur späten logarithmischen Phase, etwa 2 × 10⁹ CFU/ml, gezüchtet. Der Zuwachs wurde in EBSS 1:50 für die Impfstoffdosis oder 1:100 für die Infektionsdosis verdünnt. Beide Stämme wurden mit gleichen Volumina gemischt und vor der Impfung der Tiere auf Eis gelagert.
Proben und Datenerfassung. Am Tag der ersten Impfung, 2 Wochen später, am Tag der Infektion und am Tag der Sektion wurden Sera entnommen. Die rektale Temperatur wurde nach jeder Impfung 3 Tage lang und von der Infektion bis zur Sektion zweimal täglich erfasst. Der klinische Zuzstand wurde subjektiv nach dem gleichen Zeitplan wie die rektale Temperatur auf der Basis von Depression und Appetit beurteilt.
Bei der Sektion wurden Lungenproben von 1 bis 3 g Gewicht soweit möglich aus den Bereichen mit Abnormitäten entnommen, um die Bakterien zu zählen. Aus Luftröhre, Niere und Leber wurden zur Isolierung der Bakterien Abstriche genommen. Für jeden Lungenlappen wurde das Volumen der Läsion abgeschätzt, einschließlich der konsolidierten Bereiche und jener, die nur atelektisch erschienen. Der Wert der gesamten Lungenläsion wurde als Prozentsatz ausgedrückt, wobei jeder Lappen zur Näherung seines Beitrags zum Luftaustausch wie folgt angepasst wurde: rechter oberer Lappen 6 %, rechte obere Hälfte des Mittellappens 5 %, rechte untere Hälfte des Mittellappens 7 %, rechter unterer Lappen 35 %, akzessorischer Lappen 4 %, linker oberer Lappen 4 %, linker Mittellappen 6 % und linker unterer Lappen 32 %.
Probenverarbeitung. Die Sera wurden durch indirekte Hämagglutination (IHA) gegen die Serotypen 5 und 6 (alle Tiere) und durch Leukotoxinneutralisation (nur geimpfte Tiere) mit BL-3-Zellen und MTT-Farbstoff (7, 8) auf P. haemolytica-Antikörper getestet. Die Lungenproben wurden gewogen und EBSS bis zum zehnfachen Gewicht von Gewebe- plus Flüssigkeitsvolumen zugesetzt. Die Proben wurden zu homogenen Suspensionen gemahlen und zehnfache Verdünnungen in EBSS hergestellt.
Die Verdünnungen (100 μl) wurden auf Blut-Agar-Basisplatten mit 5 % entfibriniertem Rinderblut ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien mit typischer Morphologie des P. haemolytica wurden gezählt und (falls verfügbar) 20 repräsentative Kolonien mittels spezifischer Antisera (9) serotypiert. Auf ein Drittel der frischen Blut-Agarplatten wurden Abstriche abgerollt und dann wurde mit jeder Seite einer sterilen Schlinge nacheinander ein halbquantitativer Ausstrich auf die verbliebenen Drittel zur Isolation gemacht.
Ergebnisse
Nach keiner der Impfungen war bei keinem der Impflinge eine lokale Reaktion palpabel oder sichtbar. Die erste Impfdosis rief eine fiebrige Reaktion hervor, insbesondere bei den Schafen, die an den Tagen 2 und 3 Fieber mit einem Gipfel von 40,3 °C am Tag 3 hatten. Die zweite Injektion rief keine klinische Reaktion hervor.
Vor der Impfung hatten die Tiere einen niedrigen Titer gegen beide Serotypen 5 und 6 von P. haemolytica (Tabelle 1). Nach der ersten Impfung stieg der Titer bei den Impflingen gegen beide Serotypen über das Achtfache an. Nach der zweiten Dosierung war keine Reaktion sichtbar. Nach der Infektion trat nur ein geringer Anstieg des Antikörpertiters um etwa 50 % auf. Zwischen den Zeitpunkten der Infektion und der Sektion stieg bei dem einzigen überlebenden Schaf der Titer gegen beide Serotypen um etwa das 32-fache.
Die Neutralisationstiter für Leukotoxin stiegen bei den Impflingen unterschiedlich an. Beide Lämmer und zwei Ziegen zeigten nach der ersten Impfung Serokonversion (nahmen mindestens vierfach zu), eines der Tiere zeigte dies auch nach der zweiten Dosis. Eine Ziege blieb über die ganze Untersuchung seronegativ.
Nach der Belastungsinfektion hatte keiner der Impflinge zu keiner Zeit Fieber. Sie blieben lebhaft und fraßen bis zur Sektion ihr ganzes Futter. Die Vergleichstiere hatten am Tag nach der Exposition im Mittel 40,7 °C Fieber. Alle Vergleichsziegen und ein Schaf starben in der Nacht zwischen dem ersten und dem zweiten Tag nach der Exposition. Das verbliebene Schaf blieb bis zur Sektion fiebrig, anorektisch und depressiv.
Die Untersuchung der Impfstelle bei der Sektion ergab keine nachweisbare Reaktion im Muskel. Bei beiden Schafen und zwei Ziegen wurde eine geringe Verfärbung von etwa 1 cm Durchmesser infolge Hämorrhagie entdeckt.
Das Lungenläsionsvolumen der Impflinge, korrigiert auf die Luftwechselkapazität für jeden Lappen, war im Mittel 3,5 (Tabelle 2). Eine Ziege hatte 95 % des akzessorischen Lappens mit mäßig harter Verfestigung, aus der 1,3 × 10⁶ CFU/g (gleichermaßen Serotypen 5 und 6) gewonnen wurden. Die übrigen Lungenläsionen waren, passend zu Atelektase, weich.
Von den 19 quantitativ kultivierten Lungenproben ergaben 5 P. haemolytica. Zwei Tiere lieferten aus der Lunge kein P. haemolytica. Zwei ergaben 2 × 10³ bis 7 × 10³ CFU/g nur aus dem rechten oberen Lappen oder der oberen Hälfte des Mittellappens. Das Tier mit befallenem akzessorischem Lappen lieferte auch 1 × 10³ CFU/g aus der rechten unteren Hälfte des Mittellappens und mäßigen Zuwachs aus dem Luftröhrenabstrich. Alle anderen Luftröhrenabstriche der Impflinge waren in der Kultur negativ, wie auch die Abstriche von Leber und Niere.
Ein Schaf hatte feste Adhäsionen der viszeralen mit der parietalen Pleura und ventral mit dem Perikard sowohl auf der rechten als auch auf der linken Seite unter Beteiligung aller Lappen. Dieses Schaf hatte nur geringe atelaktische Läsionen und lieferte nur 2 × 10³ CFU/g aus dem rechten Oberlappen; die beiden anderen kultivierten Lappen waren negativ.
Das Lungenläsionsvolumen der Vergleichstiere (korrigiert auf die Luftwechselkapazität eines jeden Lappens) war im Mittel 52 % (Tabelle 2). Die vier gestorbenen Tiere enthielten große Mengen fibrinösen Pleuraergusses und fibrinöse Pleuraadhäsionen. Die Lungenläsionen waren hart oder mäßig hart, und emphysematöse und/oder krepitöse Bereiche waren offensichtlich. Das bis zur Sektion überlebende Schaf enthielt etwa 100 ml Pleu raerguss und eine große fibröse Masse (etwa 250 ccm), welche den Pleuraraum über dem rechten Ober- und Mittellappen einnahm.
Die Lungenläsionen bestanden bei diesem Tier hauptsächlich aus harten fibrinösen Verfestigungen. Von den 17 kultivierten Lungenproben ergaben alle P. haemolytica von nur 2,5 × 10⁴ bis zu 4 × 10⁹ CFU/g. Das geometrische Mittel für alle akut gestorbenen Tiere war 2,5 × 10⁸ CFU/g; das überlebende Schaf hatte im Mittel 2,5 × 10⁵ CFU/g. Luftröhrenabstriche der vier gestorbenen Tiere ergaben starkes Wachstum von P. haemolytica. Das überlebende Schaf lieferte aus der Luftröhre geringes Wachstum. Leberabstriche von allen vier und Nierenabstriche von zwei der gestorbenen Tiere ergaben P. haemolytica. Das überlebende Schaf war sowohl bei der Leber als auch bei der Niere in der Kultur negativ.
Die Bestimmung des Serotyps an Isolaten aus der Lunge zeigte, dass die wenigen aus den Impflingen gewonnenen Kolonien vom Serotyp 5 waren, ausgenommen der aktiv infizierte akzessorische Lappen der einen Ziege, der gleiche Mengen Serotyp 5 und 6 ergab. Bei den Vergleichstieren ging die Tendenz zu einem Gemisch der Serotypen in jedem Lappen, das jedoch bei den akut gestorbenen Tieren von Lappen zu Lappen sehr unterschiedlich war (z. B. 95 % Serotyp 5 im rechten Oberlappen gegenüber nur 5 Serotyp 5 im rechten Unterlappen). Die aus Leber und Niere gewonnenen Isolate waren tendenziell hinsichtlich des Serotyps bei jedem Tier homogen, jedoch enthielten zwei Tiere in diesen Geweben Serotyp 5 und die anderen beiden Serotyp 6.
Die erste Impfstoffdosis kann eine fiebrige Reaktion verursachen. Das Ausbleiben der fiebrigen Reaktion und der Immunantwort nach der zweiten Dosis bedeutet, dass die erste Dosis eine wesentliche Immunisierung herbeiführt. Die zweite Dosis wurde anscheinend vom Immunsystem rasch bewältigt und erzeugte keine ausreichende Antigenmasse, um eine anämnestische Reaktion herbeizuführen. Die im Impfstoff verabreichte Dosis an Organismen (fast 10⁸ CFU) könnte die zur Verleihung ausreichender Immunität erforderliche Dosis überschritten haben. Lebendimpfstoffe würden typischerweise mit geringerer Dosis verabreicht werden, vielleicht 10⁵ bis 10⁷ CFU. Das Ausbleiben einer weiteren Antikörperstimulation durch die zweite Dosis, gemessen als IHA, könnte andeuten, dass zwei Dosen unnötig sind und eine Dosis ausreichend gewesen wäre.
Die an den Impfstoff-Injektionsstellen beobachteten Reaktionen waren äußerst gering und betrafen nicht das Muskelgewebe, übereinstimmend mit Befunden unter Verwendung von leukotoxinnegativen Mutanten des Serotyps 1 bei Rindern. Dies steht in starkem Gegensatz zur Reaktion von leukotoxinpositiven Stämmen, die Rindern intramuskulär verabreicht wurden, welche starke Schwellung und Nekrose in diesem Bereich zeigen, die sich häufig durch die darüber liegende Haut öffnen. Wahrscheinlich würde bei subkutaner oder intradermaler Impfung nur geringe oder keine lokale Reaktion auftreten, eine Alternative, die auch zur Verminderung der fiebrigen Reaktion auf die Impfung tendieren könnte.
So führt polyvalente intramuskuläre Impfung eine ausgeprägte Immunität bei Ziegen und Schafen gegen polyvalente Infektion herbei. Die Nebenwirkungen beschränkten sich auf eine fiebrige Reaktion nach der Injektion, die durch eine verminderte Impfstoffdosis oder einen alternativen Verabreichungsweg beschränkt werden könnte.
Beispiel 3
Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit bei Rindern nach oraler Verabreichung und nach intramuskulärer Injektion
Materialien und Verfahren
Impfung der Tiere. Sechzehn Milchkälber von etwa 150 kg wurden von einem örtlichen Milchhof bezogen und im National Animal Disease Center, Ames, IA, untergebracht. Die Kälber wurden zufällig einer Vergleichsgruppe von 6 und zwei Impflingsgruppen von je 5 zugeordnet. Jede Gruppe wurde unter gleichen Bedingungen getrennt untergebracht, um die Ausbreitung von Impfstofforganismen zwischen den Gruppen zu vermeiden.
Jedem Kalb in einer Impflingsgruppe wurde am Tag 0 1 ml EBSS mit 1 × 10⁷ CFU P. haemolytica Serotyp 1, in frame-Deletionsmutante NADC D153ΔlktA, subkutan verabreicht. Diese Kälber wurden in gleicher Weise am Tag 21 mit 7,0 × 10⁶ CFU in 1 ml EBSS wiedergeimpft. Die andere Impflingsgruppe wurde am Tag 0 mit einer pelletierten Futterzuteilung (Growena, Ralston Purina, St. Louis, MO) gefüttert, auf die ein Gesamtvolumen von 50 ml einer frischen Nährlösungskultur mit 1 × 10⁹ CFU/ml der in frame-Deletionsmutante NADC D153ΔlktA aufgegossen worden war. Am Tag 21 wurden die Kälber in gleicher Weise mit 50 ml von 7 × 10⁸ CFU/ml gefüttert.
Am Tag 28 wurden alle Kälber unter Verwendung eines an der Tracheabifurkation angebrachten Katheters intratracheal mit 25 ml des Mutterstamms P. haemolytica in EBSS, 2 × 10⁷ CFU/ml, infiziert. Diese Gabe wurde mit 25 ml sterilem EBSS nachgespült. Kälber, welche die Infektion überlebten, wurden 4 oder 5 Tage nach der Infektion getötet und seziert.
Bakterien. Der Pasteurella haemolytica-Stamm NADC D153 und dessen Leukotoxinmutante wurden in Columbia-Nährlösung etwa 2,5 h zur mittleren logarithmischen Phase, etwa 1 × 10⁹ CFU/ml, gezüchtet. Der Zuwachs wurde zur Injektion 100fach und zur Infektion 50fach mit EBSS verdünnt. Zur oralen Verabreichung wurde der Zuwachs ungewaschen und unverdünnt verwendet. Alle Präparate wurden vor der Impfung der Tiere auf Eis gelagert.
Proben und Datenerfassung. Drei Tage vor dem Tag der ersten Impfung, 3 Wochen später, am Tag der Belastungsinfektion und am Tag der Sektion wurden Sera entnommen. Die rektale Temperatur wurde nach jeder Impfung 3 Tage lang und von der Infektion bis zur Sektion zweimal täglich erfasst. Der klinische Zustand wurde subjektiv nach dem gleichen Zeitplan wie die rektale Temperatur auf der Basis von Depression und Appetit beurteilt.
Bei der Sektion wurden Lungenproben genommen und wie oben im Beispiel 2 beschrieben behandelt.
Probenverarbeitung. Die Sera wurden durch IHA gegen den Serotyp 1 und durch Leukotoxinneutralisation mit BL-3-Zellen und MTT-Farbstoff auf P. haemolytica-Antikörper getestet. Die Lungenproben wurden gewogen und EBSS bis zum zehnfachen Gewicht von Gewebe- plus Flüssigkeitsvolumen zugesetzt. Die Proben wurden zu homogenen Suspensionen gemahlen und zehnfache Verdünnungen in EBSS hergestellt. Die Verdünnungen (100 μl) wurden auf Blut-Agar-Basisplatten mit 5 % entfibriniertem Rinderblut ausgebreitet und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien mit typischer Morphologie des P. haemolytica wurden gelistet und, falls verfügbar, 10 repräsentative Kolonien mittels spezifischer Antisera serotypiert. Auf die Hälfte der frischen Blut-Agar-Platten wurden Abstriche abgerollt und dann wurde mit jeder Seite einer sterilen Schlinge nacheinander ein halbquantitativer Ausstrich auf die verbliebenen Viertel zur Isolation gemacht.
Ergebnisse
Nach keiner parenteralen Impfung war eine lokale Reaktion palpabel oder sichtbar. Keines der Kälber zeigte nach der ersten parenteralen oder oralen Impfung eine fiebrige Reaktion. Ein parenteral geimpftes Kalb zeigte nach der zweiten Dosis ein vorübergehendes (1 Tag) Fieber von 40,4 °C, bei keinem der übrigen Kälber wurde eine nachteilige Reaktion bemerkt.
Vor der Impfung hatten die Tiere einen niedrigen IHA-Titer gegen Serotyp 1 P. haemolytica (Tabelle 3). Nach der ersten Impfung war der Antikörpertiter bei den mit Impfstoff gefütterten Tieren mindestes 8fach höher als der Titer vor der Impfung. Die zweite orale Dosis führte zu keinem Anstieg und in einigen Fällen fiel der Titer zweifach. Titer von parenteral geimpften Kälbern stiegen nach der ersten Impfstoffdosis nur zweifach; während dieser Zeit traten ähnliche Titeranstiege bei den Vergleichskälbern auf. Die zweite Dosis der parenteralen Impfung führte eine weitere Antikörperreaktion bei den parenteralen Impflingen herbei, wobei 3 dieser 5 Kälber serokonvertierten (4facher Anstieg).
Die Leukotoxinneutralisationstiter waren bei den meisten Kälbern vor der Impfung vergleichsweise hoch (Tabelle 3). Zwei oral geimpfte Kälber serokonvertierten nach der ersten Impfstoffdosis. Ein parenteral geimpftes Kalb serokonvertierte nach der zweiten Impfstoffdosis. Insgesamt stiegen die Antileukotoxintiter bei beiden geimpften Gruppen bei aufeinanderfolgenden Blutentnahmen an. Die Antileukotoxintiter der Vergleichskälber neigten dazu, bei aufeinander folgenden Blutentnahmen abzunehmen.
Nach der Belastungsinfektion zeigten einige, aber nicht alle der parenteral Geimpften Fieber unter 41 °C, die oral Geimpften blieben fieberfrei. Alle Impflinge blieben lebhaft und fraßen. Ein Vergleichstier starb am dritten Tag nach der Infektion. Ein anderes wurde am dritten Tag, fast moribund, getötet. Zwei der übrigen Vergleichskälber waren depressiv, fraßen nicht und behielten bis zur Tötung am Tag 4 oder 5 Fieber. Eines dieser Kälber lag und schlug zum Zeitpunkt der Tö tung. Die übrigen beiden Kälber wurden am dritten Tag nach Infektion fieberfrei. Sie fraßen wieder und wurden als lebhaft angesehen.
Das Lungenläsionsvolumen, hinsichtlich der Luftwechselkapazität der Lappen korrigiert, war bei den oral geimpften Tieren 4,4 %, bei den subkutan geimpften 7 % und bei den ungeimpften Vergleichstieren 32 % (Tabelle 4). Die Lungenläsionen beider geimpfter Gruppen waren vorwiegend weich, in Übereinstimmung mit Atelektase. Bei 2 der oral und 4 der parenteral Geimpften wurden begrenzte Bereiche harter Verfestigung bemerkt, dazu begrenzte Pleuritis und mäßige Pleuraadhäsion bei zwei Tieren jeder Gruppe. Diese harten Bereiche waren in jedem Fall auf Teile einzelner Lungenlappen beschränkt. Die ungeimpften Vergleichstiere hatten in mehreren Lungenlappen einen wesentlich höheren Befall mit harten fibrösen Verfestigungen, begleitet von Ödem und ausgedehnter fibröser Pleuritis. Drei der sechs Vergleichstiere enthielten eine große Menge Pleuraerguss.
Bakterienkulturen von Lungenproben zeigten, dass zwei oral und ein parenteral geimpftes Kalb in allen geprüften Lappen in der Kultur negativ waren. Die übrigen Impflinge hatten tendenziell eine oder zwei Proben, die wesentliche Mengen P. haemolytica ergaben, bis zu 5 × 10⁷ CFU/g. Die übrigen Lappen waren entweder kulturnegativ oder enthielten geringe Mengen P. haemolytica, etwa 10³ CFU/g. Die ungeimpften Vergleichstiere zeigten mehrere Proben mit hoher Anzahl von P. haemolytica, über 10⁷ CFU/g, dabei viele zwischen 10⁹ und 10¹⁰ CFU/g. Die Nasenabstriche zeigten P. haemolytica bei einem parenteral geimpften und vier Vergleichskälbern. Die Luftröhrenabstriche waren bei 4 Vergleichskälbern kulturpositiv für P. haemolytica, darunter eins, das nasal kulturnegativ war. Die Pleuraflüssigkeit war bei drei Vergleichskälbern kulturpositiv. Alle Impflinge waren in Luftröhre und Pleuraflüssigkeit kulturnegativ.
Bei keinem Kalb wurde aus Leber oder Niere P. haemolytica gewonnen. Alle P. haemolytica waren β-hämolytisch und die geprüften waren Serotyp 1.
Daher schützt die Impfung mit Lebendimpfstoff P. haemolytica gegen virulente Infektion, sei der Impfstoff subkutan oder oral durch Auftragen auf das Futter verabreicht.
Nebenwirkungen der Impfung waren auf ein Tier, das nach der zweiten subkutanen Impfstoffinjektion vorübergehend Fieber zeigte, beschränkt. An der Injektionsstelle traten keine lokalen Reizungen oder Schwellungen hervor, noch gab es Abnormitäten post mortem, und bei keinem Tier wurden klinische Abnormitäten bemerkt, sie es mit Impfstoff gefüttert oder injiziert. Die zur Injektion verwendete Impfstoffdosis war etwa vierfach geringer als die oben in Beispiel 2 angewandte.
Bei allen oral geimpften Tieren war die Serokonversion durch IHA beeindruckend. Der Titer der Tiere stieg nach der ersten Exposition mindestens achtfach. Weniger eindrucksvoll war die Serokonversion nach subkutaner Injektion. Nach der ersten Dosis serokonvertierte keines der Tiere, und nur 3 von 5 serokonvertierten nach der zweiten Dosis. Das IHA-Verfahren wurde als Maß für die vorausgegangene Erfahrung des Tieres mit spezifischen Serotypen von P. haemolytica als brauchbar befunden (10-13). Seine Nützlichkeit für die Voraussage der Resistenz gegen die Krankheit ist jedoch unklar (14-16). Während einige Forscher eine Korrelation zwischen IHA-Titer und Krankheit finden, tun dies andere nicht. Die Diskrepanz ist erklärbar, wenn man annimmt, dass die beim IHA-Verfahren benutzten serotypspezifischen Antigene nicht diejenigen sind, die am humoralen Schutz beteiligt sind. Die Impfung kann eine IHA-Reaktion ohne wesentlichen Schutz, oder umgekehrt, eine geringe IHA-Reaktion bei beträchtlichem Schutz herbeiführen. Jedenfalls ist nicht überraschend, dass die orale Exposition eine gute Reaktion hervorruft, wenn man annimmt, dass eine solche Exposition ausreicht, um als "vorausgegangene Erfahrung" zu gelten. Die subkutane Impfung brachte, obwohl scheinbar wirksam, eine relativ geringe IHA-Reaktion hervor. Unser vorstehender Versuch mit kleinen Wiederkäuern und i.m.-Injektion führte zu beträchtlichen IHA-Reaktionen gegenüber beiden Serotypen 5 und 6. Vielleicht führt der Verabreichungsweg die ersteren zu einer hauptsächlich zellvermittelten Reaktion und die letzteren zu einer mehr humoralen Reaktion.
Die Antileukotoxintiter waren in keiner Gruppe beeindruckend, da nur 3 der 10 geimpften Tiere nach der Impfung serokonvertierten. Die Antileukotoxintiter waren vor der Impfung jedoch beträchtlich und könnten zu einer verminderten Reaktion beigetragen haben. Diese bereits vorhandenen Titer könnten auf eine vorausgegangene Kolonisierung mit Serotyp 2 P. haemolytica zurückzuführen sein, das verbreitetste parasitische P. haemolytica im Nasengang der Kälber. Alternativ wäre möglich, daß die Replikation von P. haemolytica nach der Impfung nicht groß war, vielleicht weil die Bakterien leicht vom Immunsystem bewältigt wurden und daher wenig Leukotoxin-Antigenmasse gebildet wurde. Schließlich besteht die Möglichkeit, dass das veränderte Leukotoxinprotein, obwohl es gestaltet wurde, um immundominante Epitope zu hinterlassen, nicht besonders geeignet zur Anregung einer Neutralisierungsreaktion ist, selbst wenn es immunogen ist. Es gibt jedoch wenig Zweifel, daß als Reaktion auf die Impfung etwas leukotoxinneutralisierender Antikörper erzeugt wurde.
Die vielen großen Bereiche harter Verfestigungen in der Lunge bei der Sektion von ungeimpften Tieren und die relativ hohe Konzentration von P. haemolytica in diesen Bereichen deuten auf eine aktive Infektion hin, die sich von der ursprünglichen Auftragungsstelle ausbreitete. Dagegen hatten die Impflinge (außer jene 3 mit im wesentlichen sauberen kulturnegativen Lungen) relativ kleinere verfestigte Bereiche, die sich auf einzelne Lappen, die eine mäßig hohe Zahl von P. haemolytica enthielten, beschränkte. Die anderen Lappen dieser Tiere waren entweder kulturnegativ oder enthielten eine niedrige oder mäßige Zahl von Bakterien. Diese Daten können andeuten, dass die Infektion hauptsächlich an der Auftragungsstelle aktiv war, und dass die Bakterien Schwierigkeiten hatten, sich in anderen Teilen der Lunge anzusiedeln. Die Ergebnisse der Kulturen von Luftröhrenproben könnten diese Schlussfolgerung stützen, da 4 von 6 Vergleichstieren, aber keiner der Impflinge aus dieser Quelle P. haemolytica lieferten, was andeutet, dass die Infektion bei den meisten Vergleichstieren nicht gut umschlossen war.
Die Daten zeigen klar, dass sowohl subkutane als auch orale Verabreichung des Lebendimpfstoffs einen beträchtlichen Vorteil für Tiere bedeutet, die intratracheal mit dem Wildtyp P. haemolytica Serotyp 1 infiziert werden. Die Handhabung der Dosis oder die Anwendung von intramuskulären Injektionen könnte die Wirksamkeit von parenteral verabreichten Impfstoffen weiter verbessern.
Der oral verabreichte Impfstoff war auffallend wirksam. In diesem Fall hat die notwendige Dosis wahrscheinlich einen gewissen Schwellenwert, der zur Besiedlung der oberen Atemwege oder der Gaumenmandeln ausreicht. Obwohl vorstellbar ist es unwahrscheinlich, dass die Dosis über den Eintritt in das Magen-Darm-System wirkte. Selbst wenn 10¹⁰ CFU P. haemolytica in den Pansen gelangen würden, wäre dies eine relativ kleine Anzahl von Organismen, und die Möglichkeit ist entfernt, dass diese Bakterien mit der Flora des Pansens oder Darms konkurrieren und sich vermehren könnten. Selbst wenn der Darm reagieren sollte und es eine Verbindung zum mukosalen Immunsystem beim Rind gibt, würde man die Reaktion für vorteilhaft halten. Diese Möglichkeiten könnten unter Verwendung eines genetisch markier ten P. haemolytica, etwa eines rifampicinresistenten Stamms, untersucht werden, für den die Besiedlung mit großer Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann (7, 11).
Die Theorie hinter dem oralen Impfstoff ist, dass natürlich mit P. haemolytica Serotyp 1 infizierte Tiere eine Resistenz gegenüber nachfolgender nasaler Besiedlung durch Serotyp 1-Organismen entwickeln. Sie entwickeln auch systemische Antikörper gegen P. haemolytica und – unterschiedlich – gegen Leukotoxin. Ein avirulenter Organismus, der zur Besiedlung des Nasengangs oder der Gaumenmandeln fähig ist, könnte eine ähnliche Resistenz oder eine solche gegen Lungeninfektion ohne die Möglichkeit einer Lungenpasteurellose hervorbringen.
Es ist sogar möglich, dass in einigen Fällen durch konkurrierenden Ausschluß von virulentem P. haemolytica ein passiver Schutz auftritt. Die Abgabe vom Fuhrwerk auf Futter ist möglich, weil die Gaumenmandeln eine lang dauernde Besiedlung mit P. haemolytica aufrechterhalten (18, 19). Diese Stellen sind auch im Pfad für das eintretende Futter. Häufig werden grobe Futterteile wie Heustengel in den größeren Buchten der Gaumenmandeln gefunden, was anzeigt, dass die Exposition gegenüber Futter wesentlich ist.
Wir führten Vorversuche aus, um die Fähigkeit von Futtermitteln zur Abgabe von P. haemolytica an die Gaumenmandeln oder den Nasengang zu untersuchen, wobei ein rifampicinresistenter Stamm von P. haemolytica verwendet wurde. Mit infiziertem Futter ernährte Kälber wurden sowohl auf den Gaumenmandeln als auch im Nasenraum besiedelt.
Zusammengefasst wurde der Schutz gegen virulente Infektion durch subkutane oder orale Verabreichung von P. haemolytica-Lebendimpfstoff herbeigeführt. In diesem Versuch löste orale Verabreichung eine größere Antikörperreaktion und etwas mehr Schutz aus. Ein zusätzlicher möglicher Vorteil der Impfung über Futter ist, dass man die Kälber für die Impfung nicht einzufangen braucht, wodurch der Stress für Kalb und Mensch vermindert wird. Ein möglicher Einwand ist, dass zumindest einige Kälber das geimpfte Futter fressen oder mindestens durchwühlen müssen, um besiedelt zu werden. Kälber, die am Futter nicht teilhaben, können später nach Berührung mit teilhabenden Kälbern immun werden.
Beispiel 4
Vorläufige Beurteilung der Sicherheit und Wirksamkeit von oral verabreichtem Impfstoff für Kälber, die schon in typischen Vermarktungswegen sind
Dieser Versuch wurde zur Prüfung der Wirksamkeit eines experimentellen Lungenimpfstoffs geplant, der von Mitarbeitern der Texas A & M University hergestellt worden war. Innerhalb dieses Versuchs wurde unser kleinerer Versuch mit 18 Kälbern durchgeführt, die ausgeglichen auf die von Texas A & M verwendeten Kälbergruppen verteilt waren. Unser Versuch sollte klären, ob das Verfüttern unseres Impfstoffstamms an Kälber in frühen Stadien typischer Vermarktungswege zur Besiedlung führt, eine Immunantwort herbeiführt und möglicherweise das Auftreten der Transportpneumonie reduziert.
Im Herbst 1997 wurde ein Feldversuch mit 105 Stierkälbern (im Mittel 207 kg) durchgeführt, die von einem Aufkäufer von örtlichen Verkaufsställen im östlichen Tennessee beschafft wurden. Obwohl der Hauptzweck des Versuchs war, einen experimentellen Impfstoff der Texas A & M University zu prüfen, wurden 18 Kälber 4 Tage vor dem Transport über etwa 1600 km zu einer Weide in Texas mit der in frame-Leukotoxinmutante gefüttert. Am Tag nach dem Kauf kamen die Kälber in einem Stall des Aufkäufers an, wurden dort mit Ohrmarken versehen, gegen Clostridium, infektiöse Rinderrhinotrachitis und Parainfluenza- 3-virus geimpft, mit Ivermectin entwurmt und durch Banding kastriert. Es wurde Blut für Serum entnommen, die Rektaltemperatur erfasst und Nasenschleimproben genommen.
Kälber mit ungeraden Nummern wurden mit der experimentellen Zubereitung von Texas A & M geimpft. Je neun Kälber mit ungeraden bzw. geraden Nummern wurden in einen Pferch von etwa 20' × 40' (6 m × 12 m) abgetrennt, der eine Futterkrippe von 12' (3,6 m) und eine Frischwasserversorgung besaß. Eine Suspension von P. haemolytica NADC-D153ΔlktA (100 ml) wurde auf 35 kg der handelsüblichen Kälberdiät (Growena, Ralson Purina, St. Louis, MO) und 15 kg frisches Heu aufgegossen. Die Bakterien waren auf 10 Columbia-Agar-Platten über Nacht bei 37 °C nach Ausbreiten des Inokulats zwecks zusammenfließenden Wachstums gezüchtet worden. Der Zuwachs wurde in EBSS zu einer Konzentration von etwa 2 × 10⁹ CFU/ml geerntet, und die resultierende Suspension wurde bis zur Einpferchung der Kälber auf Eis gelagert, wonach 150 ml auf das genannte Futter aufgetragen wurden.
Vier Tage nach Verfütterung des Impfstoffs wurden die Kälber auf einen Transporter geladen und nach Bushland, Texas, gebracht, wo ein Versuchsmasthof vom USDA Agricultural Research Service und von der Texas A & M University gemeinsam betrieben wird. Bei der Ankunft am nächsten Tag schienen die Kälber erschöpft, was für den Transport über eine solche Entfernung typisch ist. Die Kälber wurden über die Rutsche (chute) geführt und die Rektaltemperatur wurde aufgenommen. Die Kälber wurden dann in 6 Gruppen sortiert und durften über Nacht ruhen. Am nächsten Tag wurden die Kälber erneut über die Rutsche geführt. Es wurden Blut und Nasenschleim entnommen sowie Rektaltemperatur und Gewicht erfasst. Viele der Kälber hatten Fieber (über 40 °C) bei Nasenausfluss und dünnem Stuhl.
Der Versuchsplan erforderte am zweiten aufeinander folgenden Fiebertag eine Behandlung der Kälber wegen Transport pneumonie mit Antibiotikum unter Verwendung von Tilmicosin (Micotil, Eli Lilly, Indianapolis, IN). Kälber, die nach zwei Tagen Behandlung nicht ansprachen, sollten mit Langzeit-Tetrazyklin (LA-200, Pfizer inc., New York, NY) behandelt werden. Es schien im Hinblick auf die der fiebrigen Kälber ratsam, alle Kälber über 4 Tage täglich durch die Rutsche zu führen und bei allen die Rektaltemperatur zu messen. Danach wurden Serum, Nasenschleim, Gewicht und Rektaltemperatur über 4 Wochen wöchentlich wie oben beschrieben erfasst (gezählt vom Ankunftstag).
Am zweiten Tag nach der Ankunft wurden 55 Kälber mit Tilmicosin behandelt. Danach wurden weitere Kälber bis zu 22 Tage nach Ankunft behandelt, wodurch die Gesamtzahl der behandelten Kälber auf 84 % der überlebenden Tiere anstieg. Insgesamt 10 Tiere starben innerhalb von 4 Tagen nach der Ankunft, wovon 6 das Texas-Produkt erhalten hatten und 4 nicht geimpft waren. Oral geimpfte Tiere starben nicht.
Post mortem-Beobachtungen ergaben fibröse Pneumonie bei allen 10 toten Tieren, und aus allen Lungen wurde P. haemolytica und gleichzeitig aus wenigen Lungen P. multocida gewonnen. Die Serotypisierung der Lungenproben ergab, daß 9 Kälber an Pasteurellose durch Serotyp 1 und 1 Kalb durch Serotyp 6 gestorben war. Hinsichtlich der Morbidität (beurteilt anhand der Behandlung) war kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den oral geimpften, den Texas A & M-geimpften und den Vergleichstieren zu bemerken (78 %, 84 % bzw. 87 %). Auch der Unterschied der Mortalität (11,5 % der nicht oral geimpften gegenüber 0 % der oral geimpften Kälber, p > 0,05) war nicht signifikant.
Die Antikörpertiter (gemessen durch IHA gegen Serotyp 1 P. haemolytica) stiegen von den im Aufkäuferstall zu den bei der Ankunft im Masthof genommenen Proben sowohl für die oral als auch für die Texas A & M-geimpften Kälber im Vergleich zu den ungeimpften signifikant (p < 0,01) an. Insgesamt nahmen die Kälber zwischen Aufkauf und Versuchsende nach 28 Tagen im Masthof 29 kg zu. Eine Gruppe, die oral geimpften Kälber, die keinen Texas A & M-Impfstoff erhalten hatten, nahmen mit 40,2 kg signifikant (p < 0,01, n = 9) mehr als jede andere Gruppe zu. Alle anderen Gruppen unterschieden sich in diesem Parameter nicht signifikant.
Pasteurella haemolytica Serotyp 1 und in geringerem Ausmaß Serotyp 6 wurden einmal oder mehrfach im Nasenschleim der meisten Kälber im Masthof gefunden. In Bezug auf das Ausscheiden des Organismus unterschieden die Gruppen sich nicht signifikant. Einige, aber nicht alle oral geimpften Kälber schieden während der ersten Woche im Masthof in einer oder mehreren Nasenschleimproben den mutanten Organismus, was anzeigt, dass der Impfstoff unter diesen Bedingungen zur Besiedlung der oberen Atemwege ausreichte.
Dieser Versuch zeigt, dass unser experimenteller oraler Impfstoff im Aufkäuferstall vor dem Transport zum Mastbetrieb mit dem Futter verabreicht werden und sich dadurch innerhalb einer Woche ansiedeln und eine Immunreaktion hervorrufen kann. Morbidität und Mortalität waren im vorliegenden Versuch ungewöhnlich hoch. Außer dem häufigen Nachweis von P. haemolytica waren das Atemwegs-Coronavirus und P. multocida verbreitet nachweisbar. Die Anzahl der Kälber, aus denen das Coronavirus isoliert wurde, war ungewöhnlich hoch und könnte für die ungewöhnlich hohe Morbidität und die häufigen Durchfälle verantwortlich sein. Auch die Anzahl der Kälber, die behandelt werden mussten, war ungewöhnlich, was darauf hinweist, dass andere Bakterien als P. haemolytica eine wesentliche Rolle beim Ausbruch spielten.
Tilmicosin ist ein Antibiotikum mit schmalem Wirkungs- Spektrum, hauptsächlich zielend und beworben auf die Bekämpfung von P. haemolytica. Angenommen, dass andere Bakterien als P. haemolytica und Viren wie das Atemwegs-Coronavirus vorherrschend waren, ist es nicht besonders überraschend, dass der monovalente Impfstoff gegen P. haemolytica die Morbidität nicht signifikant verminderte. Jedoch erlag keines der oral geimpften Kälber der Lungenpasteurellose, verglichen mit 11,5 % der anderen, was darauf hinweist, dass der Impfstoff bei der Verminderung der Mortalität eine Rolle spielt. Die wesentlich größere Gewichtszunahme der Kälber, die nur den oralen Impfstoff erhielten, stützt auch die Schlussfolgerung, dass der Impfstoff die Erkrankung dieser Tiere reduzierte. Die Verabreichung des Texas A & M-Produkts zusammen mit dem oralen Impfstoff könnte zu einer Verminderung der Reaktion auf eines oder beide Produkte oder zu Reaktionen, welche die Erkrankungsresistenz auslöschen, geführt und so den Vorteil durch den oralen Impfstoff verkleinert haben.
Beispiel 5
Fähigkeit des P. haemolytica Serotyp 1-Leukotoxin-in frame-Deletion zur Besiedlung der Nasengänge von Kälbern, die durch eine gleichzeitige Infektion mit Rinderherpesvirus Typ 1 belastet sind
Pasteurella haemolytica Serotyp 1 wird sporadisch in relativ kleinen Mengen in Nasenschleimproben von normalen gesunden Kälbern gefunden. Nach Stress oder viraler Atemwegsinfektion kann P. haemolytica im Nasengang explosionsartig proliferieren und zur vorherrschenden Flora werden. Im Nasenschleim solcher Kälber werden sehr große Mengen der Bakterien ausgeschieden. Man nimmt an, dass diese zahlreichen Bakterien in empfindliche Lungen inhaliert oder aspiriert werden und zu Lungenpasteurellose führen. Daher wurde dieser Versuch entworfen, um vorläufige Daten darüber zu erhalten, ob Leukotoxin- Deletionsmutanten von P. haemolytica unter diesen Bedingungen die Nasengange besiedeln können und, wenn ja, ob sie die Besiedlung durch Wildtyp-P. haemolytica konkurrierend beseitigen können. Es wurden Organismen sowohl vom Serotyp 1 als auch vom Serotyp 6 verwendet, weil von beiden bekannt ist, dass sie bei Kälbern tödliche fibröse Pneumonie verursachen.
Materialien und Verfahren
Impfung der Tiere. Acht Milchkalb-Mischlinge, etwa 150 kg, wurden von einem örtlichen Milchhof gekauft und am NADC gehalten. Die Kälber wurden zufällig in zwei Gruppen von je vier so eingeteilt, dass kein Kontakt zwischen den Gruppen möglich war. Vor Versuchsbeginn konnten die Kälber sich 10 Tage akklimatisieren.
Das infektiöse Rinderrhinotracheitisvirus (Coopers Stamm, freundlicherweise von National Veterinary Services Laboratories geliefert) wurde in die Nasenlöcher aller Kälber beim Einatmen nach den von NVSL gegebenen Anweisungen für die Infektion eingesprüht, sodass sich eine Enddosis von 10^9,4 TCID₅₀/Nasenloch ergab. Nach der Exposition mit Virus wurde eine Gruppe von 4 Kälber mit einem wohlschmeckenden Futterkonzentrat gefüttert, auf das 10 ml/Kalb einer gemischten Suspension von P. haemolytica D153ΔlktA und D174ΔlktA (Serotypen 1 bzw. 6) mit insgesamt 2 × 10⁹ CFU/ml aufgegossen worden war. Die andere Gruppe erhielt eine unbeimpfte Ration.
Fünf Tage nach der Virusexposition wurde die geimpfte Gruppe durch intranasale Injektion 1,5 ml/Nasenloch P. haemolytica (Mischung wie oben) mit insgesamt 2,7 × 10⁸ CFU/ml ausgesetzt. Sechs Tage nach der Virusexposition wurden alle Gruppen durch intranasale Injektion einer Mischung von Wildtyp-P. haemolytica D153 und D174 mit insgesamt 5 × 10⁸ CFU/ml ausgesetzt.
Probenerfassung und -analyse. Am Tag der Virusexposition und 3, 4, 5, 6, 7 und 10 Tage danach wurden Nasenschleimproben genommen. Am Tag der Exposition und 10 Tage später wurde Serum entnommen.
Am zehnten Tag nach der Virusexposition wurden alle Kälber getötet und die Lungen grob untersucht. Vom Tag der Virusexposition bis zur Tötung wurde tägliche die Rektaltemperatur erfasst. Das Serum wurde mittels IHA auf Antikörper gegen Serotyp 1 und Serotyp 6 P. haemolytica untersucht.
Der Nasenschleim wurde in Zehnfachstufen verdünnt und auf Blut-Agar-Basisplatten mit 5 % entfibriniertem Rinderblut ausgestrichen. Nach Inkubieren über Nacht wurde P. haemolytica identifiziert und gezählt und 20 repräsentative Kolonien wurden durch ein Plattenagglutinierungs-Schnellverfahren serotypisiert.
Ergebnisse
Die meisten Kälber hatten innerhalb von 3 Tagen nach der Virusexposition Fieber. Der Fiebergipfel trat am vierten Tag mit 40,5 °C auf. Nur 3 Kälber blieben mehr als eine Woche fiebrig und alle waren 10 Tage nach der Virusexposition fieberfrei.
Alle Kälber waren am Tag der Virusexposition kulturnegativ für P. haemolytica. Ein mit P. haemolytica-Leukotoxinmutanten gefüttertes Kalb schied vom Tag 3 an im Nasenschleim nichthämolytische Serotyp 1-Organismen aus und schied bis zur Tötung fortgesetzt Leukotoxinmutanten aus. Die übrigen 3 geimpften Kälber blieben bis zum Tag 6, einen Tag nach der intranasalen Exposition mit dem Gemisch von Leukotoxinmutanten, kulturnegativ für P. haemolytica. Diese Kälber schieden am Tag 6, 7 und mit einer Ausnahme 10 nichthämolytisches P. haemolytica aus (Tabelle 5). Die bis zum Tag 6 nicht absichtlich dem P. haemolytica ausgesetzten Kälber blieben bis zum Tag 7 kulturnegativ für den Organismus, wonach sie mit einer Ausnahme am Tag 10, Mischungen von hämolytischem P. haemolytica Serotyp 1 und 6 ausschieden.
Drei dem mutanten P. haemolytica exponierte Tiere serokonvertierten (vierfache oder größere Titerzunahme) zwischen dem Zeitpunkt der Virusexposition und der Tötung sowohl nach Serotyp 1 als auch 6. Das vierte Tier hatte eine zweifache Titerzunahme gegen beide Serotypen. Die übrigen Tiere erhöhten sich entweder zweifach oder behielten während dieses Zeitraums einen konstanten Titer.
Die Lungen waren post mortem meist unauffällig. Kalb 30 ohne Exposition mit Leukotoxinmutanten hatte eine harte Verfestigung über die rechte untere Hälfte des Mittellappens mit 5 Beteiligung der oberen Hälfte. Die Kälber 17 und 18 hatten kleine Verfestigungsläsionen mit Beteiligung von 5 % oder weniger von 2 bzw. 3 Lappen. Bei den übrigen Kälbern wurden keine Abnormitäten bemerkt.
Pasteurella haemolytica-Leukotoxinmutanten konnten die Nasengänge von Kälbern besiedeln, welche konkurrierend mit IBR-Virus infiziert waren. Eine solche Besiedlung verhinderte die experimentelle Superinfektion mit Wildtyp-P. haemolytica nicht und verminderte sie nicht einmal. Beurteilt nach den im Nasenschleim ausgeschiedenen Anzahlen von P. haemolytica scheint es, dass die Leukotoxinmutanten bei der Besiedelung der Nase weniger robust sind. Die Wildtypbakterien siedelten in etwa zehnmal größeren Mengen als die Mutanten, sei es für sich allein oder gemeinsam. Trotzdem konnten die Leukotoxinmutanten selbst in Gegenwart von Wildtyp-P. haemolytica einen beträchtlichen Besiedlungsgrad aufrechterhalten, was andeutet, dass die Bakterien noch sehr robust waren. In vitro in Columbia-Nährlösung über 100 Generationen gezüchtete Gemische von Wildtyp-Mutterstämmen und Leukotoxinmutanten ergaben eine Population, die etwas mit Leukotoxinmutanten angereichert war, ein Hinweis, dass unter diesen Bedingungen die Leukotoxinmutanten sehr gut mit dem Wildtyp konkurrieren. Ob man eine Infektion mit Leukotoxinmutanten trotz beträchtlicher Besiedlung mit Wildtyp-P. haemolytica überlagern kann ist unbekannt. Vielleicht hielten die Leukotoxinmutanten die Infektion aufrecht, weil sie bereits eine Stütze im Nasenrachenraum hatten.
Unsere früheren Arbeiten mit P. haemolytica-Infektionen unter Verwendung eines IBR-Virusmodells zeigt, dass bakterielle Infektion des Nasenrachenraums (speziell der Gaumenmandeln) nicht notwendigerweise in explosionsartige Besiedlung der Nasengange übergeht. Einige als Träger von P. haemolytica Serotyp 1 in den Gaumenmandeln bekannte Kälber wurden in den Nasengängen nicht besiedelt, selbst wenn die Nasengänge, wie durch intranasale Beimpfung gezeigt, empfindlich waren. Andere gleichartige Kälber mit möglichem aber nicht bestätigtem Trägerstatus wurden unter gleichen Bedingungen besiedelt. Da dies paradox erscheint, ist eine Infektion des Rachens, die sich auf die angrenzenden empfindlichen Nasengänge erstreckt oder auch nicht, nicht leicht zu erklären. Vielleicht trägt der Ziliarstrom aus den Nasengängen Material sowohl vorwärts aus der Nase als auch rückwärts in den Mundrachenraum.
Die Antikörpertiter im Serum sowohl gegen Serotyp 1 wie 6 stiegen bei drei der mit Leukotoxinmutanten gefütterten Kälber beträchtlich an. Da die Kälber am Tag 10 getötet wurden, blieb bei den 7 Kälbern, die bis zum Tag 6 oder 7 nicht besiedelt waren, wenig Zeit für einen Immunreaktion. Daher ist wahrscheinlich, dass das Verfüttern der Organismen eine Immunreaktion vor der nachgewiesenen nasalen Besiedlung hervorbrachte oder zumindest begünstigte.
Sowohl Serotyp 1 als auch 6 wurden in hohen Mengen im Nasenschleim eines jeden Kalbs gefunden, meist als Mischinfektion mit beiden Serotypen. In zwei Fällen hatte Serotyp 1 am Tag 10 den Serotyp 6 beim Wachsen überholt und war zur vorherrschenden Flora geworden. In einem Fall war Serotyp 6 die vorherrschende Flora. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Serotyp 6 unter den gewählten Bedingungen in seiner Besiedlungsfähigkeit fast gleich ist. Aus der Beobachtung, dass der Serotyp 6-Stamm NADC D174 bei Kälbern nach intratrachealer Beimpfung schwere Pneumonie hervorruft, könnte man erwarten, dass bei Kälbern unter Feldbedingungen Atemwegserkrankung auftreten würde. Tatsächlich wurde Serotyp 6-P. haemolytica schon früher in Feldversuchen aus Nasengängen von Kälbern und aus Lungen von Kälbern, die der Lungenpasteurellose erlegen waren, gewonnen. Während Serotyp 1 das üblichste Isolat sowohl aus Nasengängen gestresster Kälber als auch aus pneumoniebefallenen Lungen bleibt, nimmt Serotyp 6 unter diesen Bedingungen einen beträchtlichen Prozentsatz (etwa 10 %) der P. haemolytica-Isolate aus Nasenschleim oder Lunge ein.
Daher können in frame-Leukotoxindeletionsmutanten von P. haemolytica im Nasenrachenraum von Kälbern siedeln, die mit einer gleichzeitigen IBR-Virusinfektion empfindlich gemacht wurden. Eine solche Infektion war nicht ausreichend, um eine Besiedlung mit Wildtyp-P. haemolytica zu verhindern. Das Verfüttern von Leukotoxinmutanten an Kälber zusammen mit einer IBR-Virusexposition ermöglichte bei einem Kalb eine Besiedlung im Nasengang auf hohem Niveau und schien bei 3 von 4 Kälbern zu Serokonversion nach P. haemolytica zu führen. Sowohl P. haemolytica Serotyp 1 als auch 6 können während einer Virusinfektion der Atemwege explosionsartig besiedeln, und jeder Typ kann dies in Gegenwart des anderen.
Tabelle 1. IHA-Antikörpertiter gegen Pasteurella haemolytica Serotypen 5 und 6 und Leukotoxinneutralisationstiter vor und nach der Impfung. Erste Impfstoffdosis am Tag 0, zweite Dosis am Tag 21. Alle Tiere wurden intratracheal am Tag 28 mit Wildtyp Serotyp 5 und 6 infiziert. N = 5 je Gruppe

* Ein überlebendes Schaf, 4 Tiere starben 2 Tage nach Infektion und wurden nicht geprüft
** Vergleichstiere wurden nicht geprüft

Tabelle 2. Beurteilung der Lungenläsionen und Ergebnis der post mortem-Bakterienkultur der Lungen 5 Tage nach intratrachealer Infektion mit Pasteurella haemolytica Serotypen 5 und 6 (n = 5 in jeder Gruppe, Zahlen mit ± 95 % Vertrauensbereich)

* Signifikant verschieden vom Vergleichswert, p < 0,001
** Geschätzte Prozent Beteiligung jedes Lappens und multipliziert mit dem Beitrag des Lappens zum gesamten Luftaustausch

Tabelle 3. IHA-Antikörpertiter gegen Pasteurella haemolytica Serotypl und Leukotoxinneutralisationstiter vor und nach der Impfung. Erste Impfstoffdosis am Tag 0, zweite Dosis am Tag 21. Alle Tiere wurden intratracheal am Tag 28 mit Wildtyp Serotyp 1 infiziert. (N = 6 bei den Vergleichen und 5 in jeder geimpften Gruppe)

* Vier uperlebende Kalber, 2 Tiere starben 3 Tage nach Infektion und wurden nicht geprüft

Tabelle 4. Beurteilung der Lungenläsionen und Ergebnis der post mortem-Bakterienkultur der Lungen 4 oder 5 Tage nach intratrachealer Infektion mit Pasteurella haemolytica Serotyp 1 (N = 6 bei den Vergleichen und 5 in jeder geimpften Gruppe, Zahlen mit ± 95 % Vertrauensbereich)

* Signifikant verschieden vom Vergleichswert, p < 0,01
** Signifikant verschieden vom Vergleichswert, p < 0,02
*** Geschätzte Prozent Beteiligung jedes Lappens und multipliziert mit dem Beitrag des Lappens zum gesamten Luftaustausch

Tabelle 5. Ausscheidung von P. haemolytica im Nasenschleim von Kälbern, die am Tag 0 mit IBR-Virus infiziert waren

* Kälber 15, 19, 28 und 29 wurden am Tag 5 intranasal den P. haemolytica-Leukotoxinmutanten Serotypen 5 und 6 ausgesetzt.
** Die Leukotoxinmutanten sind nichthämolytisch; der Wildtyp zeigt β-Hämolyse.
✝20 repräsentative Kolonien wurden serotypisiert, soweit verfügbar.

Zitierte Literatur

1. Briggs R.E., Tatum F.M., Casey T.A., Frank G.H. Characterization of a restriction endonuclease, PhaI, from Pasteurella haemolytica serotype A1 and protection of heterologous DNA by a cloned PhaI methyltransferase gene, Appl. Environ. Microbiol. 60:2006-2010. 1994.
2. Thomas C.M. Plasmid replication. In: PLASMIDS: A PRACTI-CAL APPROACH. K.G. Hardy, ed. IRL Press Limited, Oxford, England. 1987.
3. Tatum F.M., Briggs R.E., Sreevatsan S. S., Zehr E.S., Ling Hsuan S., Whiteley L.O., Ames T.R., Maheswaran S.K. Construction of an isogenic leukotoxin deletion mutant of Pasteurella haemolytica serotype 1: characterization and virulence. Microb. Pathog. 24: 37-46, 1998.
4. Conrad M., Topal M.D. Modified DNA fragments activate NaeI cleavage of refractory DNA sites. Nucleic Acids Res; 20:5127-5130. 1992.
5. Murphy G.L., Whitworth L.C., Clinkenbeard K.D., Clinkenbeard P.A. Hemolytic activity of the Pasteurella haemolytica leukotoxin. Infect. Immun. 63:3209-3212.1995.
6. Fedorova N.D., Highlander SK. Generation of targeted nonpolar gene insertions and operon fusions in Pasteurella haemolytica and creation of a strain that produces and secretes inactive leukotoxin. Infect. Immun. 65:2593-2598. 1997.
7. Briggs R.E., Frank G.H., Zehr E.S. Development and testing of a selectable challenge strain of Pasteurella haemolytica for studies of upper-respiratory colonization of cattle. Am. J. Vet. Res. 59: 401-405, 1998.
8. Frank G.H., Smith P.C. Prevalence of Pasteurella haemolytica in transported calves. Am. J. Vet. Res. 44: 981-985. 1983.
9. Frank G.H., Wessman G.E. Rapid plate agglutination procedure for serotyping Pasteurella haemolytica. J. Clin. Microbiol. 7: 142-145. 1978.
10. Frank G.H., Briggs R.E., Loan R.L., Purdy C.W., Zehr E.S. Serotype-specific inhibition of colonization of the tonsils and nasopharynx of calves by Pasteurella haemolytica serotype A1 after vaccination with the organism. Am. J. Vet. Res. 55: 1107-1110. 1994.
11. Frank G.H., Briggs R.E., Zehr E.S. Colonization of the tonsils and nasopharynx of calves by a rifampicin-resistant Pasteurella haemolytica and its inhibition by vaccination. Am. J. Vet. Res. 56: 866-869. 1995.
12. Frank G.H., Briggs R E., Loan R.W., Purdy C.W., Zehr E.S. Respiratory tract disease and mucosal colonization by Pasteurella haemolytica in transported cattle. Am. J. Vet. Res. 57: 1317-1320. 1996.
13. Purdy C.W., Cooley J.D., Straus D.C. Cross-protection studies with three serotypes of Pasteurella haemolytica in the goat model. Curr. Microbiol. 36: 207-211. 1998.
14. McVey D.S., Loan R.W., Purdy C.W., Richards A.E. Antibodies to Pasteurella haemolytica somatic antigens in two models of the bovine respiratory disease complex. Am. J. Vet. Res. 50:443-447. 1989.
15. Jones G.E., Donachie D.W., Sutherland A.D., Knox D.P., Gilmour J.S. Protection of lambs against experimental pneumonic pasteurellosis by transfer of immune serum. Vet. Microbiol, 20:59-71. 1989.
16. Schimmel D., Erler W., Diller R. [The significance of antibodies to Pasteurella haemolytica A1 in the colostrum of cows and blood serum of calves]. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 105:87-89. 1992.
17. Frank G.H., Briggs R.E. Colonization of the tonsils of calves with Pasteurella haemolytica Am. J. Vet. Res 53: 481-484. 1992.
18. Frank G.H., Briggs R.E., and Debey B.M. Bovine tonsils as reservoirs for Pasteurella haemolytica: Colonisation, immune response, and infection of the nasopharynx. In: Pasteurellosis in Production Animals {Workshop Proceedings, Australian Centre for International Agricultural Research.} pp 83-88. 1992.

SEQUENZLISTING

Claims

P. haemolytica-Bakterium, welches a) kein biologisch aktives Leukotoxin exprimiert, b) im Strukturgen lkA^- eine Mutation umfasst, welche Leukotoxin kodiert, c) ein deletionsmutantes Leukotoxinmolekül exprimiert, welches spezifisch an Leukotoxin bindende Antikörper hervorruft und d) keine fremde DNA enthält.
P. haemolytica-Bakterium nach Anspruch 1, worin die Deletionsmutante etwa 66 kD ist.
P. haemolytica-Bakterium nach Anspruch 1, worin der Deletionsmutante die Aminosäuren 34 bis 378 des Leukotoxins fehlen.
P. haemolytica-Bakterium nach Anspruch 1, worin das Bakterium lkt C* ist
P. haemolytica-Bakterium nach Anspruch 1, worin das Leukotoxin-Operon keine antibiotischen Resistenzgene enthält.
P. haemolytica-Bakterium nach Anspruch 1, worin das Bakterium eine nicht reversible Mutation umfaßt, welche zur Unfähigkeit des Bakteriums zur Expression von biologisch aktivem Leukotoxin führt.
Verwendung des P. haemolytica-Bakterium nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels, das Immunität gegen Pasteurellose der Lunge bei Wiederkäuern induziert.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel zur oralen Verabreichung ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel auf das Futter des Wiederkäuers aufgetragen werden soll.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel zur subkutanen Injektion ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel zur intradermalen Injektion ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel zur intramuskulären Injektion ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung über die Nase ist.
Futter für Wiederkäuer, enthaltend das Bakterium nach Anspruch 1.
Impfstoff zur Verminderung der Morbidität bei Wiederkäuern, umfassend ein P. haemolytica-Bakterium, welches a) kein biologisch aktives Leukotoxin exprimiert, b) im Strukturgen lkA^- eine Mutation umfasst, welche Leukotoxin kodiert, c) ein deletionsmutantes Leukotoxinmolekül exprimiert, welches spezifisch an Leukotoxin bindende Antikörper induziert und d) keine fremde DNA enthält.
P. haemolytica-Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Therapie.