ES2279582T3 - Mutante de delecion de lkta de p. hemolitica. - Google Patents

Abstract

Una bacteria P. haemolytica que: a) expresa leucotoxina no biológicamente activa; b) comprende una mutación en el gen estructural IkA- que codifica leucotoxina; c) expresa una molécula de leucotoxina mutante por deleción que induce anticuerpos que se unen específicamente a leucotoxina, y d) no contiene ADN extraño.

Description

Mutante de deleción de LtkA de P. haemolytica.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere al campo de la genética bacteriana y, más en particular, al campo de patógenos respiratorios de los animales de granja.

Antecedentes de la invención

P. haemolytica como patógeno, causa graves daños económicos a la industria de la cría animal. Las vacunas que se han desarrollado en un esfuerzo por controlar la enfermedad, han tenido un éxito variable a la vez que limitado. Debido a que la enfermedad está causada en una parte significativa por la propia reacción de los animales a la infección por P. haemolytica, las vacunas diseñadas de forma inadecuada realmente pueden empeorar las condiciones clínicas de los vacunados infectados. De este modo, hay una necesidad continuada en la técnica de vacunas seguras y eficaces que puedan reducir la morbilidad y/o mortalidad de los rumiantes debidas a P. haemolytica.

Resumen de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una bacteria P. haemolytica útil como cepa para vacuna.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para inducir en los rumiantes inmunidad a pasteurelosis neumónica.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una cepa para vacuna frente a pasteurelosis neumónica.

Otro objeto de la invención es proporcionar un pienso para rumiantes.

Estos y otros objetivos de la invención se logran mediante una o más de las realizaciones descritas a continuación. Una realización de la invención proporciona una bacteria de P. haemolytica que:

a)

expresa una leucotoxina no biológicamente activa;

b)

comprende una mutación en el gen estructural IkA^{-} que codifica la leucotoxina;

c)

expresa una molécula de leucotoxina mutante por deleción que induce anticuerpos que se unen específicamente a la leucotoxina y

d)

no contiene ADN extraño.

Otra realización de la invención proporciona un procedimiento para inducir inmunidad frente a pasteurelosis neumónica en rumiantes. Según la presente invención, se administra una bacteria a un rumiante. De este modo se induce la inmunidad de la bacteria.

Otra realización más de la invención proporciona un pienso para rumiantes. El pienso comprende una bacteria según la presente invención.

Incluso otra realización de la invención proporciona una vacuna para reducir la morbilidad en rumiantes. La vacuna comprende una bacteria P. haemolytica según la presente invención.

La presente descripción proporciona un plásmido termosensible. El plásmido se replica en P. haemolytica a 30ºC pero no a 40ºC.

De este modo, la presente descripción proporciona a la técnica herramientas para la manipulación genética de un patógeno importante para la agricultura. También se proporcionan cepas mutantes útiles que pueden usarse de forma eficaz para reducir la morbilidad debida a Pasteurella haemolytica entre rumiantes, tales como ganado vacuno, ovejas y cabras.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Destino del plásmido termosensible en Pasteurella haemolytica después del pase a 30ºC y 40ºC.

Figura 2. El operón de la leucotoxina de Pasteurella haemolytica con el fragmento EcoRV de 3,15 kb. lktC, gen estructural de la leucotoxina acetilada que se va a activar; LtkA, gen estructural de la leucotoxina; lktB/D, implicado en la exportación de leucotoxina independiente del líder.

Figura 3. Deleción en fase del fragmento EcoRV de 3,15 kb de lktCA usando Nael.

Figura 4. Integración del plásmido de sustitución en el cromosoma.

Figura 5. Resolución del plásmido de sustitución del cromosoma.

Figura 6. Inmunotransferencia tipo Western blot de la leucotoxina nativa y \DeltalktA usando un anticuerpo monoclonal anti Lkt.

Descripción detallada

Es un descubrimiento de la presente invención que un mutante no reversible de P. haemolytica, que expresa una forma mutante de leucotoxina, es útil para una vacuna. Además, se han encontrado que este mutante es útil cuando se administra en las amígdalas, a través de la vía oral y a través de la vía nasal. De este modo, pueden lograrse procedimientos extremadamente baratos y fáciles para vacunar a los animales, simplemente vertiéndola sobre el pienso del animal.

Preferiblemente, el mutante es un mutante por deleción. Uno de estos mutantes de la proteína leucotoxina obtenida tiene aproximadamente 66 kD, aunque pueden usarse otros mutantes, siempre que la proteína sea suficientemente larga como para ser inmunogénica, preferiblemente de al menos 10, 15 ó 20 aminoácidos de longitud. Se cree que es preferible una molécula delecionada más larga para lograr una respuesta inmune potente. Es preferible que la bacteria mutante no contenga genes exógenos, tales como genes de resistencia a fármacos, que pueden causar problemas medioambientales y sanitarios si no se contienen. Además, se prefiere que la mutación sea una mutación no reversible, tal como una mutación por deleción.

Las formas mutantes de leucotoxina de la presente invención inducen anticuerpos que se unen específicamente a la leucotoxina. Cuando se usan en inmunotransferencias tipo Western blots o en otros ensayos inmunoquímicos, los anticuerpos que se unen específicamente a la leucotoxina proporcionan una señal de detección al menos 2, 5, 10 ó 20 veces mayor que una señal de detección proporcionada por proteínas distintas de la leucotoxina. Preferiblemente, los anticuerpos que se unen específicamente a la leucotoxina no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y éstos pueden inmunoprecipitar la leucotoxina de una solución. Más preferiblemente, los anticuerpos pueden detectarse en un ensayo de hemaglutinación indirecta y pueden neutralizar la leucotoxina.

Aunque se prefiere la vía oral por su facilidad de administración, también pueden usarse otras vías de vacunación. Estas incluyen sin limitaciones, las vías subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, intrabronquial, etc. La vacuna puede administrarse sola o como componente de una vacuna polivalente, es decir, en combinación con otras vacunas.

También la presente invención proporciona un plásmido termosensible que se replica en P. haemolytica a 30ºC pero no a 40ºC. Preferiblemente, el plásmido es del mismo grupo de incompatibilidad que pD80, es decir, comparte el mismo origen de replicación.

La vacunación con una combinación viva modificada de P. haemolytica de serotipos 5 y 6 protege extremadamente bien frente a la estimulación virulenta combinada homóloga, basándose en signos clínicos, lesiones post mortem y los resultados del cultivo bacteriano. Los animales que se han vacunado de este modo permanecen activos, alerta, sin fiebre y siguen comiendo. La vacuna no sólo previene de la muerte debida a P. haemolytica, sino que también puede reducir los síntomas de pasteurelosis neumónica, tales como el volumen de lesiones pulmonares, fiebre, pérdida de apetito, pérdida de capacidad de ventilación pulmonar, efusión pleural fibrinosa y/o adhesiones, carga bacteriana y depresión.

La descripción anterior describe en general la presente invención. Puede obtenerse un entendimiento más completo en referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Vacunas orales y parenterales vivas modificadas frente a la fiebre del transporte y a la pasteurelosis neumónica del ganado vacuno, ovejas y cabras basándose en deleciones limpias en fase del gen estructural de la leucotoxina de Pasteurella haemolytica Materiales y procedimientos

Mutagénesis del origen de replicación del plásmido. Un fragmento de ADN de 1,2 kb que contenía el probable origen de replicación de pD80 se amplificó mediante PCR usando como molde el plásmido de resistencia a ampicilina de 4,3 kb aislado de la cepa de P. haemolytica de serotipo 1, NADC-D80 (1). Se usaron el cebador sentido 5'-CCG GAT CCC CAA TTC GTA GAG GTT TC-3' (SEC ID NO 1) y el cebador complementario 5'-CCG GAT CCG CTG AAA GCG GTC GGG GG-3' (SEC ID NO 2). El producto se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) usando las indicaciones del fabricante. Se preparó un casete de kanamicina mediante un pase de pBC SK (Stratagene, La Jolla CA) que contenía un derivado del gen de la kanamicina Tn903 (Pharmacia Biotech, Piscataway NJ) clonado en el único sitio EcoR1, a través de la cepa de E. coli Phalmtasa para protegerlo frente a la escisión con PhaI.

La inserción clonada de 1,2 kb (1 \mug) se escindió de pCR2.1 mediante la digestión con EcoR1 y se ligó durante toda la noche al casete de kanamicina metilada en PhaI digerida con EcoR1 (0,25 \mug). La mezcla de ligamiento se concentró mediante precipitación con EtOH y se electroporó (Gene-pulser, Bio-Rad, Redfield, CA) en la cepa P. haemolytica de serotipo 1, NADC-D153 usando 18 kv/cm y 1.000 W.

El ADN plasmídico se obtuvo de un transformante resistente a la kanamicina que tenía una longitud de 2,5 kb y se escindió en fragmentos de 1,2 y 1,3 kb cuando se sometió a digestión con EcoR1. Un \mug del plásmido se sometió a mutagénesis con hidroxilamina durante 1 hora a 65ºC como se describió previamente (2).

Selección del origen de replicación del plásmido termosensible. El plásmido sometido a mutagénesis se dializó durante toda la noche a 4ºC frente a TE, se concentró mediante precipitación con etanol y se electroporó en NADC-D153 fresco como se describe anteriormente. Tras 2 h de recuperación en medio de cultivo Columbia (Difco Laboratories, Detroit MI), las células se pusieron en placas de agar sangre Columbia 10 que contenían kanamicina a 50 \mug/ml y se incubaron a 30ºC. Después de 20 h, las placas se pasaron a 40ºC durante 6 h más.

Se seleccionaron colonias que eran atípicamente pequeñas y se clonaron en placas de kanamicina recién preparadas que se incubaron durante toda la noche a 30ºC. El cultivo de los clones se duplicó en placas con y sin kanamicina y se incubaron durante toda la noche a 40ºC.

Se supuso que los clones que eran incapaces de crecer en medios selectivos a 40ºC pero crecían sin selección eran termosensibles para el mantenimiento del plásmido o para la expresión de kanamicina. El cultivo de las placas sin selección de antibiótico a 40ºC se pasó a placas selectivas que se incubaron durante toda la noche a 30ºC. Se supuso que los clones que no mostraban crecimiento o lo hacían ligeramente en este pase contenían orígenes de replicación termosensibles. Estos clones se pasaron de la placa selectiva original a 30ºC a placas selectivas recién preparadas y a medio de cultivo selectivo. Los clones se analizaron de nuevo mediante su pase con y sin selección a 40ºC y a 30ºC. Aunque cada clon mostraba el fenotipo correcto, los plásmidos obtenidos por mini-preps a partir de los medios de cultivo produjeron pequeñas cantidades de un plásmido de 2,5 kb de sólo uno de los cultivos. Los clones restantes no se siguieron examinando.

Construcción de un vector lanzadera termosensible de doble origen. El origen de replicación termosensible se escindió del plásmido anterior mediante la digestión con EcoR1 y, a continuación, se convirtió en romo mediante el tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y los cuatro dNTP. El fragmento se ligó durante toda la noche a 4ºC con pBC SK digerido con SmaI. La mezcla de ligamiento se usó para transformar E. coli DH10-B (Life-Tecnologies, Gaithersburg, MD).

El plásmido que contenía una inserción de 1,2 kb se recuperó a partir de una colonia resistente a cloranfenicol. El plásmido se digirió con SalI y se ligó en un casete de kanamicina digerido con SalI durante toda la noche a 4ºC. La mezcla de ligamiento se electroporó en E. coli DH10-B y se puso en placas con kanamicina a 50 \mug/ml. El plásmido recuperado de una colonia resistente a kanamicina se digirió con BssHII, se convirtió en romo como anteriormente, se trató con fosfatasa alcalina de ternera para eliminar los fosfatos terminales y se ligó durante toda la noche a 4ºC con un fragmento romo de aproximadamente 900 pb que contenía el origen de replicación del plásmido ColE1.

La mezcla de ligamiento se electroporó en E. coli Phalmtasa (1) y se puso en placas que contenían kanamicina. El plásmido se recuperó a partir de una colonia resistente a la kanamicina que producía un fragmento de aproximadamente 3,5 kb tras la digestión con EcoR1 y fragmentos de 2,2, y 1,3 kb tras la digestión con SalI. El plásmido se denominó pBB80C. El plásmido se electroporó en P. haemolytica para confirmar el origen de replicación termosensible; seguía manteniendo el crecimiento bacteriano en kanamicina a 30ºC pero no a 40ºC.

Clonación y manipulación de lktA. Un fragmento EcoRV de 3,1 kb del ADN genómico de P. haemolytica que contenía lktC y aproximadamente el 75% de la región que codifica lktA se ligó en el sitio EcoRV de pBB80C. El plásmido resultante se amplificó en E. coli DH10-B y se denominó pBB80ClktA.

El plásmido pBC SK (0,25 \mug, usado para proporcionar sitios NaeI adicionales en trans) se mezcló con 0,25 \mug de pBB80ClktA y se digirió con NaeI durante 18 h a 37ºC. El ADN plasmídico parcialmente digerido resultante se extrajo con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (FCI), se precipitó con etanol, se ligó a 4ºC durante toda la noche, luego se extrajo de nuevo y se precipitó. La mezcla de ligamiento se digirió con PvuII, que escindió tanto pBC SK como el fragmento interno NaeI de 1.035 pb de LktA.

Se electroporaron cinco ng del ADN digerido en E. coli PhaImtasa y se pusieron en placas de agar sangre Columbia que contenían kanamicina a 50 \mug/ml. El ADN plasmídico de los transformantes seleccionados se analizó mediante la digestión del plásmido obtenido por mini-preps con EcoRV sólo o junto con NgoM1 (un isoesquizómero de NaeI). Se seleccionó un clon que contenía una deleción de 1.035 pb y se denominó pBB80C\DeltalktA.

Recuperación de mutantes de leucotoxina. El plásmido pBB80C\DeltalktA se electroporó en la cepa NADC-D153 de P. haemolytica fresca a 18 kv/cm y 1.000 W. Se permitió que las células se recuperaran durante 2 horas a 30ºC en 1 ml de medio de cultivo Columbia, a continuación, se pusieron 100 \mul/placa en placas de agar Columbia que contenía kanamicina a 50 \mug/ml. Tras 48 h de incubación a 30ºC, se pasaron cuatro colonias a placas de kanamicina que contenían sangre bovina desfibrinada al 5% y se incubaron durante toda la noche a 37ºC para seleccionar mutantes de entrecruzamiento sencillo. Cuatro colonias del pase a 37ºC, 2 hemolíticas y 2 no hemolíticas de cada transformante original (16 en total), se pasaron a medio de cultivo Columbia sin selección y se incubaron durante toda la noche a 30ºC para resolver las mutaciones de entrecruzamiento sencillo.

El cultivo del medio de cultivo Columbia a 30ºC se picó para su aislamiento a placas de agar sangre que contenían sangre bovina desfibrinada al 5% que se incubaron durante toda la noche a 37ºC. El cultivo también se pasó a medio de cultivo Columbia recién preparado sucesivamente hasta un total de 4 pases a 30ºC para determinar adicionalmente la tasa a la que se perdía la resistencia a kanamicina a 30ºC sin selección. Las colonias aisladas del primer pase a 30ºC se duplicaron en una matriz de placas selectivas y no selectivas que contenían sangre bovina desfibrinada al 5%.

Se seleccionó para un estudio adicional un clon resistente a la kanamicina que demostró no tener actividad hemolítica detectable en la placa no selectiva. Cepas adicionales de P. haemolytica obtenidas del depósito del Centro Nacional de Enfermedades Animales se sometieron más tarde a un tratamiento similar al anterior. Estas cepas se aislaron de un pulmón con neumonía e incluían: NADC D632 de serotipo ovino 1; NADC D121, de serotipo ovino 2; NADC D110, de serotipo ovino 5; NADC D174 de serotipo bovino 6; NADC D102, de serotipo ovino 7; NADC D844, de serotipo ovino 8; NADC D122, de serotipo ovino 9 y NADC D712, de serotipo ovino 12.

Caracterización del posible mutante de leucotoxina. Para definir la deleción cromosómica, se amplificó mediante PCR el ADN de las células completas del posible mutante de leucotoxina y de su cepa parental NADC-D153, usando cebadores anidados dentro de los extremos EcoRV del fragmento genómico original EcoRV de 3,15 kb. Los productos tanto intactos como tras la digestión con NgoM1 se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,2%.

Para determinar la actividad leucotóxica, se prepararon sobrenadantes de cultivos en fase logarítmica del posible mutante y de su parental a partir de cultivos en medio Columbia de 3 horas. Se ensayaron diluciones dobles de los sobrenadantes usando células diana BL-3 y colorante MTT (7).

Para determinar la expresión del posible producto de leucotoxina alterado, los sobrenadantes de los cultivos así como el sobrenadante de un tercer cultivo de nuestro mutante por deleción de leucotoxina original que no producía leucotoxina detectable, se concentraron aproximadamente 15 veces usando filtros para ultrafiltración de 30.000 de peso molecular (Centriprep, Amicon, Beverly, MA). El material retenido se sometió a electroforesis por duplicado en SDS-PAGE y un gel se tiñó usando azul de Coomassie.

El segundo gel se transfirió a una membrana de nailon para un análisis por inmunotransferencia. La membrana se lavó, se incubó con un anticuerpo monoclonal anti-leucotoxina 601 (proporcionado por el Dr. S. Srikumaran, Lincoln NE), se marcó con un anticuerpo anti IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma) y se tiñó con azul de nitrotetrazolio (Sigma).

Los mutantes de Pasteurella haemolytica distintos de NADC D153\DeltalktA de serotipo 1 se caracterizaron mediante el análisis por PCR y de las características de crecimiento en placas sólo de agar sangre. No se confirmó la producción de proteína leucotoxina alterada.

Resultados

Se comprobó que el origen de replicación termosensible derivado del plásmido endógeno de P. haemolytica resistente a ampicilina era una herramienta útil para la construcción de mutantes de deleción en este organismo. Se asumió que el origen de replicación radica en una región no codificadora del nucleótido 3.104 al 4.293 del plásmido nativo. El producto de PCR de 1,2 kb de esta región ligada a un casete de kanamicina de Tn903 de 1,3 kb daba lugar a un producto de 2,5 kb capaz de la transformación estable de P. haemolytica como se evidenciaba en una pérdida de plásmido menor del 1% después de 100 generaciones en medio de cultivo a 37ºC. Estos datos indican que las funciones de replicación esenciales radican en esta región de 1,2 kb del plásmido nativo.

La eficiencia de transformación de P. haemolytica descendía aproximadamente 10 veces tras la mutagénesis con hidroxilamina, lo que indicaba que probablemente el ADN no estaba especialmente dañado. Sin embargo, se recuperaron 10 colonias que eran atípicamente pequeñas después de 20 horas a 30ºC y 6 horas a 40ºC. Dos de estas colonias crecieron en la selección a 40ºC y se descartaron. De las 8 colonias restantes, se encontró que cuatro retenían la resistencia a kanamicina después de un pase sin selección a 40ºC. Se supuso que estas 4 colonias contenían un plásmido que era termosensible para la expresión de resistencia a la kanamicina y también se descartaron.

Se supuso que las 4 colonias restantes contenían un plásmido que era termosensible para el mantenimiento, se recuperaron de la placa original a 30ºC y se pasaron de nuevo a 40ºC y 30ºC. Aunque cada una crecía bien sin selección a ambas temperaturas, eran incapaces de crecer con la selección a 40ºC y eran incapaces de mantener la resistencia a kanamicina tras el pase a 40ºC, sólo un clon producía plásmido suficiente para un estudio adicional mediante un procedimiento de lisis alcalina rápida. Se asumió que las otras 3 colonias también contenían el plásmido, pero que el procedimiento de purificación rápida del plásmido no conseguía recuperar cantidades suficientes para su visualización en geles de agarosa. El rendimiento plasmídico a partir del clon positivo era muy bajo.

Para facilitar el aislamiento posterior y la clonación, se añadieron al origen pD80 termosensible un sitio de clonación múltiple y un origen de replicación ColE1. El origen termosensible y un casete de kanamicina recién preparado se colocaron en el sitio de clonación múltiple de pBC-SK, a continuación el esqueleto del vector se sustituyó por una copia de < 1 kb del origen ColE1. Este plásmido de aproximadamente 3,5 kb, pBB80C, mantiene la mayoría de los sitios de restricción únicos de pBC-SK, se replica de forma eficaz en E. coli y transforma a P. haemolytica a 30ºC con eficiencia moderada. En P. haemolytica, el origen ColE1 es incapaz de mantener la replicación y el mantenimiento del plásmido depende del origen pD80 mutado. En esta situación, pBB80C no podría seguir creciendo en medios selectivos tanto a 37 como a 40ºC pero mantiene un crecimiento moderado a 30ºC (Figura 1).

Para introducir una deleción en fase en la región codificadora de lktA de P. haemolytica mediante intercambio alélico, se clonó un fragmento EcoRV, que contenía parte del operón de la leucotoxina, en pBB80C produciendo pBB80ClktA. El clon se extendía aproximadamente 500 pb antes del extremo 5’ de codón de inicio de lktC e incluía aproximadamente el 75% de lktA (Figura 2).

En el fragmento EcoRV hay dos sitios NaeI que escinden entre codones dentro de lktA produciendo extremos terminales romos (Figura 3). Los sitios NaeI se sitúan uniformemente a aproximadamente 1 kb de distancia en el fragmento EcoRV. La digestión de pBB80ClktA con NaeI era complicada debido al hecho de que NaeI está entre el grupo de endonucleasas de restricción que muestran una extraordinaria preferencia de sitio para la escisión (4). Esta enzima requiere interacción simultánea con dos copias de su secuencia de reconocimiento antes de escindir el ADN. Con ciertas enzimas de este tipo, la segunda copia puede proporcionar en trans, de modo que se incluyó en este experimento para proporcionar sitios de reconocimiento adicionales a la mezcla de digestión añadiendo pBC SK, que contiene un sitio. Aunque esta estrategia daba lugar a una escisión incompleta tras la digestión durante toda la noche, era evidente en la mezcla un fragmento de 1 kb, que indicaba que se habían escindido ambos sitios NaeI en algunas de las moléculas pBB80ClktA.

La escisión tras el ligamiento con PvuII, contenidos tanto en pBC SK como en el fragmento NaeI de 1 kb que se iba a delecionar, eliminaba aparentemente la mayoría de los productos no deseados, ya que todos los transformantes analizados para pBB80C\DeltalktA contenían la deleción de 1.035 pb deseada. Cada uno de estos se escindió de nuevo con NgoM1, lo que indicaba que el nuevo sitio NaeI estaba intacto y el producto debería estar en fase con el codón de inicio de lktA.

La Pasteurella haemolytica transformada con pBB80C\DeltalktA requería aproximadamente 48 horas para alcanzar un buen tamaño de colonia a 30ºC. El pase a 37ºC simplemente rayando con fuerza en una placa que contenía kanamicina daba lugar a numerosas colonias aisladas, algunas hemolíticas y otras no. Estos resultados son coherentes con la integración específica del plásmido en el operón de leucotoxina (Figura 4). Puesto que el plásmido de sustitución contenía la secuencia del operón intacta antes del extremo 5’ de la deleción, incluyendo el promotor, se esperaba que los productos con entrecruzamiento sencillo antes del extremo 5’ expresaran normalmente el operón completo. Sin embargo, se esperaba que los productos con un entrecruzamiento sencillo después del extremo 3’ contuvieran dos copias defectuosas de lktA, ya que el extremo C-terminal que codificada el 25% de lktA no estaba presente en el plásmido de sustitución. Por tanto, se podría esperar que una copia del gen de la leucotoxina contuviera la deleción de 1 kb y la otra copia un extremo C-terminal truncado. Previamente se ha demostrado que la actividad hemolítica estaba correlacionada con la expresión de LktA activo (3, 5, 6).

El pase de productos con entrecruzamiento sencillo a 30ºC daba lugar a una tasa inesperadamente baja de resolución del plásmido a partir del cromosoma. Trabajos previos con pBB 192C, un plásmido condicionado por la temperatura derivado del plásmido de resistencia a estreptomicina de P. haemolytica, mostraba una reversión de la sensibilidad a kanamicina del 90 al 99% tras un único pase a 37 ó 30ºC, respectivamente. En este experimento, de las 80 colonias aisladas ensayadas después de un pase a 30ºC, sólo dos se convirtieron en sensibles a la kanamicina. Una de las dos era no hemolítica y más tarde se demostró que era un mutante de entrecruzamiento doble (Figura 5). Pases adicionales aumentaban el porcentaje de UFC sensibles a la kanamicina en cultivos no selectivos a aproximadamente el 50% después de 4 pases. Muchas de estas colonias mostraban un fenotipo no hemolítico y probablemente eran productos de entrecruzamiento doble.

Para generar mutantes de los otros serotipos, se seleccionaron 4-8 productos hemolíticos con entrecruzamiento sencillo y se pasaron a 30ºC durante uno o más pases en medio de cultivo. El cultivo se picó para su aislamiento en cada pase y se seleccionaron colonias no hemolíticas para su análisis mediante PCR y se cultivaron en medios que contenían kanamicina. En cada caso, se confirmó mediante PCR que las colonias no hemolíticas que eran sensibles a kanamicina tenían mutaciones de deleción que contenían sitios NaeI únicos.

Se asumió que pBB192C contiene un origen de replicación más robusto que pBB80C, como evidenciaban las cantidades relativas de plásmido recuperadas de los respectivos cultivos. Si la actividad de un origen plasmídico integrado desestabiliza la replicación cromosómica, podría esperarse que una mayor inestabilidad hiciera que aumentara la actividad del origen plasmídico. Esto podría justificar tanto las mayores tasas de resolución de pBB192C a 30ºC que a 37ºC como de las tasas menores de resolución de pBB80C en comparación con pBB192. Durante la construcción de nuestro primer mutante por deleción de leucotoxina, se obtuvo un gran número mayor de productos de entrecruzamiento sencillo usando un plásmido de sustitución suicida (3), que contenía selección por ampicilina. Aunque los dos brazos homólogos tenían una longitud similar a los del experimento actual, el pase durante incluso 100 generaciones no daba lugar a reversión del fenotipo hemolítico o a la pérdida de resistencia a ampicilina. Estos datos además indican que es la actividad del origen plasmídico lo que desestabiliza a los productos de entrecruzamiento sencillo.

Se encontró que los productos de PCR de los supuestos mutantes de leucotoxina y sus cepas parentales tenían un tamaño de 2 kb y 3 kb, respectivamente, lo que indicaba que se había introducido una deleción en sus respectivos lktA. La digestión de los productos de PCR con NgoM1 mostraba 2 bandas de aproximadamente 1 kb a partir de los mutantes y 3 bandas de aproximadamente 1 kb a partir de las cepas parentales, lo que indicaba que las deleciones podrían estar en fase con LktA. La actividad leucotoxina frente a células diana BL-3 de los sobrenadantes de cultivos del mutante de serotipo 1 era < 1:2 en comparación con 1:1.024 de la cepa parental, lo que indicaba una actividad no detectable.

Se detectó una nueva proteína de aproximadamente 65 kDa en el sobrenadante de cultivo de este mutante mediante SDS-PAGE, que coincide con el peso molecular predicho del producto delecionado. Mediante la tinción con Coomassie, el nuevo producto excedía la concentración de la proteína LktA nativa producida por el cultivo de la cepa parental y recogida junto con el mutante. El tamaño más pequeño de este producto podía permitir una expresión más rápida o económica del gen. El producto reaccionaba con el anticuerpo monoclonal neutralizante 601 con un peso molecular aparente de 66 kDa (figura 6). No se observó reacción a 101-104 kDa, el peso molecular aparente del producto nativo observado en el sobrenadante del cultivo de la cepa parental.

Ejemplo 2 Valoración de la eficacia de la vacuna en pequeños rumiantes tras la inyección intramuscular de una combinación polivalente de los serotipos 5 y 6 de P. haemolytica Materiales y procedimientos

Vacunación de los animales. Cuatro corderos (Columbia, de aproximadamente 25 kg) y seis cabras (Toggenburg, de aproximadamente 15 kg) fueron privados del calostro y se criaron en el Centro Nacional de Enfermedades Animales, Ames, IA. Se seleccionaron de forma aleatoria dos corderos y tres cabras y se vacunaron cada uno con 4 x 10^{7} UFC de NADC D110\DeltalktA y NADC D174\DeltalktA de P. haemolytica (serotipos 5 y 6, respectivamente) en 1 ml de solución salina equilibrada de Earles (EBSS), pH 7,4. La suspensión se administró por vía intramuscular en la región cervical media. Después de tres semanas, los animales se vacunaron de nuevo de forma similar.

Diez días después de la segunda vacunación, los diez animales se estimularon con 8,5 x 10^{7} UFC de cada una de las cepas parentales NADC D110 y NADC D174 mezcladas en un volumen total de 5 ml de EBSS instilado por vía intratraqueal con un catéter en la bifurcación traqueal. El inóculo fue seguido de 5 ml de EBSS estéril. Cinco días después de la estimulación, se sacrificaron todos los animales que habían sobrevivido y se les practicó la autopsia.

Bacterias. Las cepas de Pasterurella haemolytica NADC D110 (serotipo 5, aislado de pulmón ovino) y NADC D174 (serotipo 6, aislado de pulmón bovino) se cultivaron independientemente en medio de cultivo Columbia (Difco Laboratories, Detroit MI) aproximadamente 3 h hasta la fase logarítmica tardía, aproximadamente 2 x 10^{9} UFC/ml. El cultivo se diluyó en EBSS 1:50 para la dosis de vacuna ó 1:100 para la dosis de estimulación. Las dos cepas se mezclaron a volúmenes iguales y se mantuvieron en hielo hasta la inoculación al animal.

Recogida de muestras y de datos. Los sueros se recogieron el día de la primera vacunación, 2 semanas después, el día de la exposición a la estimulación y el día de la autopsia. Las temperaturas rectales se registraron durante 3 días después de cada vacunación y dos veces al día desde la exposición a la estimulación a la autopsia. Las puntuaciones clínicas se valoraron subjetivamente según el mismo esquema que las temperaturas rectales, basándose en el grado de depresión y apetito.

En la autopsia, se obtuvieron muestras pulmonares de 1 a 3 gramos de peso de las áreas que contenían anomalías, cuando fue posible, para el recuento de bacterias. Se obtuvieron muestras de frotis de la traquea, riñones e hígado para el aislamiento de bacterias. Los volúmenes de las lesiones pulmonares se estimaron para cada lóbulo del pulmón, incluyendo áreas consolidadas y aquellas que aparecían simplemente atelectásicas. El recuento de las lesiones pulmonares totales se expresó como porcentaje en el que cada lóbulo se ajustaba con una aproximación de su contribución al intercambio gaseoso como sigue: lóbulo craneal derecho, 6%; mitad craneal derecho del lóbulo medio, 5%; mitad caudal derecha del lóbulo medio, 7%; lóbulo caudal derecho, 35%; lóbulo accesorio, 4%; lóbulo craneal izquierdo, 4%; lóbulo medio izquierdo, 6% y lóbulo caudal izquierdo, 32%.

Procesamiento de las muestras. Se ensayó la presencia de anticuerpos frente a P. haemolytica en los sueros mediante hemaglutinación indirecta (HAI) frente a los serotipos 5 y 6 (todos los animales) y mediante neutralización de leucotoxina (sólo vacunados) usando células BL-3 y colorante MTT (7,8). Las muestras pulmonares se pesaron y se añadió EBSS hasta llevar el volumen del tejido más el fluido hasta 10 veces el peso. Las muestras se trituraron para obtener una suspensión homogénea y se diluyeron diez veces en EBSS.

Las diluciones (100 \mul) se extendieron sobre placas de agar sangre que contenían sangre bovina desfibrinada al 5% y se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Las colonias que mostraban una morfología típica de P. haemolytica se numeraron y se determinó el serotipo de 20 colonias representativas, cuando se dispuso de ellas, usando antisueros específicos (9). Se pasó un algodón sobre un tercio de las placas de agar sangre recién preparadas y, a continuación, se usó cada lado de un asa de siembre estéril para un sembrado en estrías semicuantitativo para el aislamiento en los dos tercios restantes, consecutivamente.

Resultados

Ninguna reacción local era palpable o visible tras las vacunaciones en ningún animal vacunado. La primera dosis de vacuna provocaba una respuesta febril, especialmente en la oveja que tuvo fiebre durante los días 2 y 3 con un pico de 40,3ºC el día 3. La segunda inyección no provocaba respuesta clínica.

Antes de la vacunación, los animales tenían un valor de HAI bajo frente a ambos serotipos 5 y 6 de P. haemolytica (Tabla 1). Después de la primera vacunación, los valores de los vacunados frente a ambos serotipos aumentaban más de 8 veces. No se observó respuesta evidente tras la segunda dosis. Sólo tuvo lugar un ligero aumento del valor del anticuerpo, aproximadamente el 50%, tras la exposición de estimulación. El valor de los animales control aumentó ligeramente, aproximadamente el doble, antes de la exposición de estimulación. Entre el tiempo de exposición de estimulación y la autopsia, la única oveja control superviviente aumentaba su título frente a ambos serotipos aproximadamente 32 veces.

Los valores de neutralización de leucotoxina en los vacunados aumentan de forma variable. Tanto los corderos como las dos cabras sufrían seroconversión (que aumentaban al menos 4 veces) tras la primera vacunación; uno de los animales también se seroconvirtió con la segunda dosis. Una cabra permaneció seronegativa a lo largo del estudio.

Tras la estimulación, ninguno de los vacunados tuvo fiebre en ningún momento. Permanecieron alerta y comiendo todo su pienso hasta la autopsia. Los animales control tenían fiebre el día después de la exposición con un promedio de 40,7ºC. Todas las cabras control y 1 oveja control murieron durante la noche entre el primer y el segundo día tras la exposición. La oveja control restante permaneció febril, anoréxica y deprimida hasta la autopsia.

La inspección del sitio de inyección de la vacuna en la autopsia no reveló reacción detectable en el músculo. Se detecto tanto en la oveja como en dos de las tres cabras una ligera decoloración subcutánea de aproximadamente 1 cm de diámetro debida a la hemorragia.

El volumen de lesión pulmonar de los vacunados, corregido para la capacidad de ventilación de cada lóbulo, presentaba un promedio de 3,5% (Tabla 2). Una cabra tenía el 95% de su lóbulo accesorio con consolidación moderadamente firme del que se recuperaban 1,3 x 10^{6} UFC/g (equivalente para los serotipos 5 y 6). Las lesiones pulmonares restantes eran blandas y consistentes con atelectasis.

De las 19 muestras pulmonares cuantitativamente cultivadas, 5 produjeron P. haemolytica. Las muestras pulmonares de dos animales no produjeron P. haemolytica. Dos produjeron de 2 x 10^{3} a 7 x 10^{3} UFC/g de sus lóbulos craneales derechos o sólo de la mitad craneal del lóbulo medio. El animal con el lóbulo accesorio afectado también produjo 1 x 10^{3} UFC/g de la mitad caudal derecha de su lóbulo medio y crecimiento moderado de su frotis traqueal. Todos los demás frotis traqueales de los vacunados presentaron cultivos negativos, así como los frotis del hígado y del riñón.

Una oveja tenía estrechas adherencias a la pleura visceral y parietal y al pericardio ventralmente en ambos lados derecho e izquierdo que implicaban a todos los lóbulos. Esta oveja contenía sólo lesiones menores de atelectasis y producía sólo 2 x 10^{3} UFC/g de su lóbulo craneal derecho, los cultivos de los otros lóbulos eran negativos.

El volumen de lesión pulmonar de los controles (corregido para la capacidad de ventilación de cada lóbulo) presentaba un promedio del 52% (Tabla 2). Los cuatro animales que murieron contenían grandes cantidades de efusión pleural fibrinosa y adherencias pleurales fibrinosas. Las lesiones pulmonares eran firmes o moderadamente firmes y eran evidentes las áreas enfisematosas y/o crepitantes. La cabra que sobrevivió hasta el momento de la autopsia contenía aproximadamente 100 cc de efusión pleural y una gran masa fibrosa (aproximadamente 250 cc) que ocupaba el espacio pleural sobre los lóbulos craneal derecho y medio.

Las lesiones pulmonares estaban principalmente compuestas de consolidación firme fibrosa en este animal. Las 17 muestras pulmonares cultivadas, produjeron todas P. haemolytica de menos de 2,5 x 10^{4} UFC/g a 4 x 10^{9} UFC/g. El recuento medio geométrico para los cuatro animales que murieron graves 2,5 x 10^{8} UFC/g; la cabra superviviente tenía un recuento medio de 2,5 x 10^{5} UFC/g. Los frotis de la traquea de los cuatro animales que murieron produjeron un fuerte crecimiento de P. haemolytica. La muestra de la traquea de la oveja superviviente producía un crecimiento leve. Los frotis de hígado de los cuatro y los frotis de riñón de dos de los animales que murieron produjeron P. haemolytica. La oveja superviviente presentaba cultivo negativo tanto en hígado como en riñón.

La determinación del serotipo de los pulmones reveló que las pocas colonias recuperadas de los vacunados eran de serotipo 5, excepto para el lóbulo accesorio activamente infectado de una de las cabras que producían cantidades iguales de ambos serotipos 5 y 6. Los animales control tendieron a producir una mezcla de serotipos de cada lóbulo, pero la mezcla variaba ampliamente de un lóbulo a otro en los animales que mueren graves (por ejemplo, del 95% del serotipo 5 en el lóbulo craneal derecho a sólo el 5% del serotipo 5 en el lóbulo caudal derecho). Los aislados recuperados de riñón o hígado tendían a ser homogéneos con respecto al serotipo en cualquier animal determinado, pero dos animales contenían serotipo 5 en estos tejidos y los otros dos contenían serotipo 6.

La primera dosis de vacuna puede inducir una respuesta febril. La carencia de una respuesta febril y de respuesta inmune de la segunda dosis implica que se confiere una inmunidad sustancial mediante la primera dosis. Aparentemente el sistema inmune se encarga rápidamente de la segunda dosis y no desarrollaba masa antigénica suficiente para provocar una respuesta anamnésica. Puede que la dosis de organismos administrada en la vacuna (aproximadamente 10^{8} UFC) excediera la necesaria para conferir inmunidad suficiente. Las vacunas vivas modificadas típicamente podrían suministrarse a una dosis menor, quizás de 10^{5} a 10^{7} UFC. El fallo de la segunda dosis de vacuna para estimular adicionalmente el anticuerpo, según se mide por HAI, puede indicar que no serían necesarias dos dosis y que una única dosis podría haber sido suficiente.

Las reacciones observadas en los sitios de inyección de la vacuna eran extremadamente leves y no afectaban al tejido muscular, de acuerdo con los hallazgos usando mutantes negativos para leucotoxina de serotipo 1 en ganado vacuno. Esto contrasta mucho con la respuesta de cepas positivas a leucotoxina administradas por vía intramuscular al ganado vacuno, que evidencia grandes hinchazones y necrosis en el área, que a menudo se abren a través de la piel de recubrimiento. Es probable que no se dé ninguna reacción o se de una pequeña reacción local adversa con la vacunación subcutánea o intradérmica, una alternativa que también puede tender a reducir la respuesta febril a la vacunación.

De este modo, la vacuna polivalente intramuscular provocaba una marcada inmunidad en ovejas y en cabras frente a la estimulación polivalente. Las reacciones adversas se limitaban a una respuesta febril tras la inyección que podría controlarse mediante la reducción de la dosis de vacuna o una vía alternativa de administración.

Ejemplo 3 Valoración de la eficacia de la vacuna en ganado vacuno tras la administración por vía oral y tras la inyección por vía intramuscular Materiales y procedimientos

Vacunación de los animales. Se obtuvieron dieciséis terneros de tipo lechero, de aproximadamente 150 kg, de una vaquería local y se alojaron en el Centro Nacional de Enfermedades Animales, Ames, IA. Los terneros se asignaron de forma aleatoria a un grupo control de seis y dos grupos de vacunación de 5. Cada grupo se alojó por separado en condiciones similares para prevenir la dispersión de los organismos de la vacuna entre grupos.

A cada ternero de uno grupo de vacunados se le administró por vía subcutánea en la región cervical media 1ml de EBSS que contenía 1 x 10^{6} UFC del mutante por deleción en fase de P. haemolytica de serotipo 1, NADC D153\DeltalktA,. Estos terneros se vacunaron de nuevo de forma similar con 7,0 x 10^{6} UFC en 1 ml EBSS el día 21. El otro grupo de vacunados se alimentó con una ración en gránulos (Growena, Ralston Purina, St. Louis MO), en la que el día 0 se habían vertido 50 ml de volumen total de un medio de cultivo recién preparado que contenía 1 x 10^{9} UFC/ml de mutante por deleción en fase NADC D153\DeltalktA. Los terneros se alimentaron de forma similar con 50 ml de 7 x 10^{8} UFC/ml el día 21.

El día 28, todos los terneros fueron estimulados por vía intratraqueal con 25 ml de P. haemolytica parental en EBSS a 2 x 10^{7} UFC/ml usando un catéter colocado en la bifurcación de la traquea. La estimulación se siguió de 25 ml de EBSS estéril. Los terneros que sobrevivieron a la estimulación fueron sacrificados 4 ó 5 días después de la estimulación y se les realizó la autopsia.

Bacteria. La cepa NADC D153 de Pasteurella haemolytica y sus mutantes para leucotoxina se cultivaron en medio de cultivo Columbia aproximadamente 2,5 horas hasta la fase semilogarítmica, aproximadamente 1 x 10^{9} UFC/ml. El cultivo se diluyó 100 veces en EBSS para la inyección o 50 veces para la estimulación. Para la administración por vía oral se usó el cultivo sin lavar y sin diluir. Todas las preparaciones se mantuvieron en hielo antes de su inoculación al animal.

Recogida de muestras y de datos. Los sueros se recogieron 3 días antes del día de la primera vacunación, 3 semanas después, el día de la exposición a la estimulación y el día de la autopsia. Las temperaturas rectales se registraron durante 3 días después de cada vacunación y dos veces al día desde la exposición de estimulación a la autopsia. Las puntuaciones clínicas se valoraron subjetivamente según el mismo esquema que las temperaturas rectales, basándose en el grado de depresión y al apetito.

En la autopsia, se obtuvieron muestras pulmonares y se trataron como se describe en el Ejemplo 2, anteriormente.

Procesamiento de las muestras. Los anticuerpos para P. haemolytica se ensayaron en los sueros mediante HAI frente al serotipo 1 y mediante neutralización de la leucotoxina usando células BL-3 y colorante MTT. Las muestras pulmonares se pesaron y se añadió EBSS hasta llevar el volumen del tejido más el fluido hasta 10 veces el peso. Las muestras se trituraron para obtener una suspensión homogénea y se diluyeron diez veces en EBSS. Las diluciones (100 ml) se extendieron sobre placas de agar sangre que contenían sangre bovina desfibrinada al 5% que se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Las colonias que mostraban una morfología típica de P. haemolytica se numeraron y, cuando se disponía de ellas, se determinó el serotipo de 10 colonias representativas usando antisueros específicos. Se pasó un algodón sobre la mitad de las placas de agar sangre recién preparadas y, a continuación, se usó cada lado de un asa de siembra estéril para un sembrado en estrías semicuantitativo para el aislamiento en los dos cuartos restantes, consecutivamente.

Resultados

No se observó ninguna reacción local palpable o visible tras la vacunación parenteral. Ninguno de los terneros mostraba respuesta febril tras la primera vacunación parenteral u oral. Un ternero vacunado por vía parenteral mostró fiebre transitoria (1 día) de 40,4ºC tras la segunda dosis; no se observaron reacciones adversas en ninguno de los terneros restantes.

Antes de la vacunación, los animales tenían un valor de HAI bajo frente al serotipo 1 de P. haemolytica (Tabla 3). Tras la primera vacunación, el valor de anticuerpo en los terneros que comieron la vacuna aumentaba al menos 8 veces sobre sus valores previos a la vacunación. La segunda dosis oral no aumentaba los valores y, en algunos casos, disminuían 2 veces. Los valores de los terneros vacunados por vía parenteral aumentaban sólo aproximadamente 2 veces después de la primera dosis, durante cuyo tiempo tenía lugar un aumento similar del valor en los terneros control. La segunda dosis de vacuna parenteral provocaba una respuesta anticorpal adicional en los vacunados por vía parenteral, con la seroconversión (aumento de 4 veces) de 3 de estos 5 terneros.

Los valores de neutralización de leucotoxina eran relativamente elevados en la mayoría de los terneros antes de la vacunación (Tabla 3). Dos de los terneros vacunados por vía oral se seroconvirtieron después de la primera dosis de vacuna. Uno de los terneros vacunados por vía parenteral se seroconvirtió después de la segunda dosis de vacuna. En general, los valores antileucotoxina aumentaban en ambos grupos de vacunados en los sangrados sucesivos. Los valores antileucotoxina de los terneros control tendían a disminuir en sangrados sucesivos.

Tras la estimulación, algunos de los vacunados por vía parenteral, pero no todos, mostraban fiebre por debajo de los 41ºC; los vacunados por vía oral permanecían afebriles. Todos los vacunados permanecían alerta y seguían comiendo. Un animal control murió el tercer día después de la estimulación. Otro fue sacrificado el día 3 prácticamente moribundo. Dos de los terneros control restantes estaban deprimidos y dejaron de comer y siguieron teniendo fiebre hasta el sacrificio el día 4 ó 5. Uno de estos terneros estaba tumbado y en mal estado en el momento del sacrificio. En los 2 terneros controles restantes la fiebre desapareció el tercer día después de la estimulación. Volvieron a comer y se consideraban alerta.

El volumen de la lesión pulmonar, corregido para la capacidad de ventilación de cada lóbulo, tenía un promedio de 4,4% para los animales vacunados por vía oral, 7% para aquellos vacunados por vía subcutánea y 32% para los controles no vacunados (Tabla 4). Las lesiones pulmonares de ambos grupos vacunados eran predominantemente blandas, en consistencia con la atelectasis. Se detectaron áreas localizadas de consolidación firme en 2 de los terneros vacunados por vía oral y en 4 de los vacunados por vía parenteral, con pleuritis limitada y adherencias pleurales moderadas en dos animales de cada grupo. Estas áreas firmes estaban confinadas a fracciones de lóbulos pulmonares individuales en cada caso. Los controles no vacunados tenían múltiples lóbulos pulmonares que contenían un porcentaje sustancialmente más alto afectado por consolidación firme fibrinosa asociada con edema y pleuritis fibrinosa extensiva. Tres de los seis animales control contenían una cantidad grande de efusión pleural.

Los cultivos bacterianos de muestras pulmonares mostraron que 2 terneros vacunados por vía oral y 1 ternero vacunado por vía parenteral eran negativos en todos los lóbulos ensayados. Los vacunados restantes tendían a tener una o dos muestras que producían cantidades sustanciales de P. haemolytica, hasta 5 x 10^{7} UCF/g. Los lóbulos restantes presentaban cultivos negativos o contenían cantidades menores de P. haemolytica, aproximadamente 10^{3} UFC/g. Los animales control sin vacunar producían múltiples muestras con cantidades mayores de P. haemolytica, por encima de 10^{7} UFC/g con muchas entre 10^{9} y 10^{10} UFC/g. Los frotis nasales de 1 ternero vacunado por vía parenteral y 4 terneros control produjeron P. haemolytica. Los frotis traqueales dieron cultivos positivos para P. haemolytica en 4 terneros control, 1 de los cuales presentó un cultivo nasal negativo. El cultivo del líquido pleural fue positivo en 3 terneros control. Todos los cultivos de la tráquea y de líquido pleural de los vacunados fueron negativos. No se recuperó P. haemolytica del hígado o del riñón de ninguno de los terneros. Todas las P. haemolytica eran \beta-hemolíticas y las que se ensayaron eran serotipo 1.

De este modo, la vacunación con la P. haemolytica viva modificada protegía frente una estimulación virulenta, aunque la vacuna se administrara por vía subcutánea o por vía oral tras aplicarlo sobre el pienso.

Las reacciones adversas a la vacunación fueron limitadas en un animal que mostraba una fiebre transitoria tras la segunda inyección subcutánea de la vacuna. No se presentó irritación local o hinchazón ni tampoco ninguna anomalía post mortem en el lugar de inyección y no se observaron anomalías clínicas en ningún animal tanto los inyectados como los que comieron la vacuna. La dosis de vacuna usada para la inyección era aproximadamente 4 veces menor que la usada anteriormente en el Ejemplo 2.

La seroconversión determinada por HAI era impresionante en los animales vacunados por vía oral. Todos los valores de los animales aumentaban al menos 8 veces después de la primera exposición. Menos impresionante fue la seroconversión tras la inyección subcutánea. Ningún animal sufrió seroconversión tras la primera dosis y sólo 3 de 5 se seroconvirtieron después de la segunda dosis. Se encontró que el procedimiento de HAI era útil como medida de los animales antes de la exposición con P. haemolytica de serotipos específicos (10-13). Sin embargo, su utilidad para predecir la resistencia a la enfermedad no está clara (14-16). Mientras algunos investigadores encuentran una correlación entre los valores de HAI y la enfermedad, otros no encuentran ninguna. La discrepancia puede explicarse si se asume que los antígenos específicos de serotipo empleados en el procedimiento de HAI no son los implicados en la protección humoral. La vacunación podría provocar una respuesta HAI sin protección significativa o, por el contrario, provocar una respuesta HAI pequeña pero una protección sustancial. En cualquier caso, no sorprende que la exposición oral pudiera provocar una buena respuesta, si se asume que esta exposición es suficiente para calificarla como "experiencia previa". La vacunación por vía subcutánea, aunque aparentemente eficaz, provocaba una respuesta HAI relativamente menor. Nuestro experimento previo en pequeños rumiantes, usando inyección 1 M dio lugar a respuestas HAI sustanciales para ambos serotipos 5 y 6 de P. haemolytica. Quizás la vía de exposición dirige a los primeros a una respuesta principalmente mediada por células y a los segundos a una respuesta más humoral.

Los valores antileucotoxina no eran impresionantes en ningún grupo, ya que sólo 3 de 10 animales vacunados sufrían seroconversión tras la vacunación. Los valores antileucotoxina eran sustancialmente los previos a la vacunación, sin embargo, y puede que contribuyan a una disminución de la respuesta. Estos títulos preexistentes pueden ser debidos a colonización previa por P. haemolytica de serotipo 2, el comensal más común de P. haemolytica en los pases nasales de los terneros. Alternativamente, es posible que la replicación de P. haemolytica tras la vacunación no fuera buena, quizás porque la bacteria era fácilmente controlada por el sistema inmune y, por tanto, se elaboraba poca masa antigénica de leucotoxina. Finalmente, existe la posibilidad de que la proteína leucotoxina alterada, aunque diseñada para dejar epítopos inmunodominantes, no esté especialmente adaptada para estimular una respuesta neutralizante incluso aunque sea inmunogénica. Sin embargo, no hay duda de que se produce algún anticuerpo neutralizante de la leucotoxina en respuesta a la vacunación.

Las múltiples grandes áreas de consolidación firme del pulmón en animales no vacunados en la autopsia y la concentración relativamente grande de P. haemolytica en estas áreas indica una infección activa que se extiende desde el sitio inicial de inoculación. Por el contrario, los vacunados (excepto los 3 con cultivos pulmonares negativos esencialmente limpios) tenían áreas relativamente más pequeñas de consolidación confinadas a lóbulos pulmonares individuales que contenían valores moderadamente elevados de P. haemolytica. Otros lóbulos de estos animales presentaban cultivos negativos o contenían unos valores de bacterias de bajos a moderados. Estos datos pueden indicar que la infección era activa principalmente en el sitio de la inoculación y las bacterias tenían dificultades para establecerse en otras porciones del pulmón. El cultivo resultante de las muestras traqueales podría apoyar esta conclusión, ya que 4 de los 6 animales control, pero ninguno de los vacunados, producían P. haemolytica de esta fuente, lo que indica que la infección no estaba bien contenida en la mayoría de los controles.

Los datos dejan claro que tanto la administración por vía subcutánea como la administración oral de la vacuna viva modificada tenían un beneficio significativo para los animales estimulados por vía intratraqueal con el serotipo 1 de P. haemolytica de tipo natural. La manipulación de la dosis o el uso de inyecciones intramusculares podrían mejorar adicionalmente la eficacia de vacunas administradas por vía parenteral.

La vacuna administrada por vía oral era notablemente eficaz. Probablemente, la dosis necesaria en este caso es un nivel umbral que es suficiente para causar la colonización de las vías respiratorias superiores o las amígdalas del paladar. Aunque concebible, es poco probable que la dosis sea eficaz debido al pase por el sistema gastrointestinal. Incluso 10^{10} UFC de P. haemolytica que pasen al rumen podrían ser un número relativamente pequeño de organismos y la posibilidad de que estas bacterias pudieran competir frente a la flora intestinal o del rumen y su multiplicación es poco probable. Aún, si el intestino responde y hay un sistema inmune mucoso ligado en terneros, puede espesarse que la respuesta sea beneficiosa. Estas posibilidades deberían investigarse usando P. haemolytica genéticamente marcada, tal como una cepa resistente a rifampicina, cuya colonización puede detectarse con una gran sensibilidad (7, 11).

La teoría detrás de la vacuna oral es que estos animales infectados de forma natural con P. haemolytica de serotipo 1 desarrollan resistencia tras la posterior colonización nasal por organismos de serotipo 1. También desarrollan anticuerpos sistémicos frente a P. haemolytica y, variablemente, frente a la leucotoxina. Un organismo avirulento que es competente para la colonización de las fosas nasales o de las amígdalas del paladar, podría provocar una resistencia similar o resistencia a la estimulación pulmonar sin la posibilidad de causar pasteurelosis neumónica.

Incluso es posible que pudiera darse protección pasiva en algunos casos mediante la exclusión competitiva de P. haemolytica virulenta. La administración mediante un vehículo en los alimentos es posible debido a que las amígdalas del paladar mantienen una colonización por P. haemolytica a largo plazo (18, 19). Estos sitios también están en la trayectoria de la ingestión de alimento. A menudo se encuentra restos de alimentos, tales como tallos de heno, en los senos mayores de las amígdalas del paladar, lo que indica que la exposición a la comida es significativa.

Se realizaron experimentos preliminares para probar la capacidad del pienso para suministrar P. haemolytica a las amígdalas del paladar o a las fosas nasales usando una cepa resistente a rifampicina de P. haemolytica. Los terneros que comían pienso infectado resultaban colonizados tanto en las amígdalas del paladar como en las fosas nasales.

En resumen, la protección frente a la estimulación virulenta se confería mediante administración subcutánea u oral de una vacuna de P. haemolytica viva modificada. En este experimento, la administración oral provocaba respuestas anticorpales mayores y protección ligeramente mayor. Un beneficio potencial adicional de la vacunación mediante el pienso es que no sería necesario capturar a los terneros para vacunarlos, reduciendo de este modo el estrés tanto para el ternero como para el operador. Una posible advertencia es que al menos algunos terneros deberán comer o al menos entrar en contacto con la comida inoculada para resultar colonizado. Los terneros que no comen el pienso puede inmunizarse más tarde tras la exposición con los ternero que sí comieron.

Ejemplo 4 Valoración preliminar de seguridad y eficacia de la vacuna administrada por vía oral para terneros ya en los circuitos comerciales típicos

Este experimento se diseñó para probar la eficacia de una vacuna pulmonar experimental producida por el personal de la Universidad de Texas A&M. Dentro de este experimento, y equilibrado entre los grupos de terneros utilizados por Texas A&M, se encontraba nuestro experimento más pequeño que contaba con 18 cabezas de terneros. Nuestro experimento se diseñó para comprobar si alimentando con nuestra cepa de vacuna a terneros en las etapas tempranas de los circuitos comerciales típicos podría dar lugar a la colonización, provocar una respuesta inmune y posiblemente reducir la incidencia de la fiebre del transporte.

Se realizó un experimento de campo en el otoño de 1997 con 105 terneros castrados (media de 207 kg) obtenidos de los establos de venta locales mediante un comprador en el este de Tennessee. Aunque el objetivo principal del experimento era probar una vacuna experimental de la Universidad de Texas A&M, se alimentó a 18 terneros con la leucotoxina mutante en fase, 4 días antes de su traslado a un cebadero de Texas, aproximadamente a 1.600 km de distancia. El día después de su compra, los terneros llegaron al establo del comprador donde fueron marcados en la oreja, vacunados frente a clorstridios, rinotraqueitis infecciosa bovina y virus de la parainfluenza-3, desparasitados con ivermectina y castrados mediante cintas de goma. Se recogió sangre para obtener el suero, se registraron las temperaturas rectales y se recogieron muestras de moco nasal.

Los terneros impares se vacunaron con la preparación experimental de Texas A&M. Los nueve terneros impares y los nueve pares se separaron en una jaula de aproximadamente 20 pulgadas por 40 pulgadas que contenía un comedero de 12 pulgadas y una fuente de agua fresca. Se vertió una suspensión de P. haemolytica NADC-D153\DeltalktA (100 ml) en 35 kg de una ración de pienso comercial (Growena, Ralson Purina, St. Louis, MO) y 15 kg de heno reciente. Las bacterias se cultivaron en placas de agar Columbia al 10% durante toda la noche a 37ºC tras extender el inóculo para un crecimiento confluente. El cultivo se recogió en EBSS a una densidad de aproximadamente 2 x 10^{9} UFC/ml y la suspensión resultante se colocó en hielo hasta que los terneros fueron llevados al corral, con lo cual se colocaron 150 ml sobre el pienso anterior.

Cuatro días después de comer la vacuna, los terneros se cargaron en un camión y se transportaron a Bushland, Texas, donde había un criadero experimental dirigido conjuntamente por el Servicio de Investigación Agrícola de USDA y la Universidad de Texas A&M. El día siguiente a su llegada, los terneros parecían exhaustos, como es típico debido al viaje tan largo. Los terneros fueron examinados y se registraron las temperaturas rectales. A continuación, los terneros se distribuyeron en 6 grupos y se les dejó descansar durante toda la noche. Al día siguiente, los terneros volvieron a ser examinados. Se recogió sangre y moco nasal, se registraron las temperaturas rectales y se pesó a los animales. Muchos de los terneros presentaban fiebre (por encima de 40ºC) con rinorrea y heces sueltas.

El protocolo requerido para el tratamiento de terneros para la fiebre del transporte con antibióticos el segundo día consecutivo de fiebre indica el uso de tilmicosina (Micotil, Eli Lilly, Indianápolis, IN). Los terneros que no respondían en 2 días de tratamiento fueron tratados con tetraciclina de acción prolongada (LA-200, Pfizer Inc., Nueva York NY). Se consideró oportuno, considerando el número de teneros con fiebre, pasar a todos los terneros por la rampa diariamente durante 4 días para registrar todas las temperaturas rectales. A continuación, se recogieron semanalmente sueros, moco nasal, pesos y temperaturas réctales (contando a partir del día después de la llegada) durante 4 semanas, como se describe anteriormente.

El segundo día después de la llegada, se trataron 55 terneros usando tilmicosina. Otros terneros se trataron posteriormente hasta 22 días después de la llegada, llevando el número total de tratados al 84% de los animales supervivientes. Murieron un total de diez animales durante los 4 días tras la llegada, 6 que recibieron el producto de Texas A&M y 4 no vacunados. No murió ninguno de los animales que recibió vacuna oral.

Las observaciones post mortem revelaron neumonía fibrinosa en los diez animales muertos y se recuperó P. haemolytica de todos los pulmones junto con P. multocida en algunos pulmones. La determinación del serotipo de los aislados pulmonares reveló que 9 terneros murieron por pasteurelosis de serotipo 1 y 1 ternero por serotipo 6. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la morbilidad (según se consideró mediante el tratamiento) entre los vacunados por vía oral, los vacunados por Texas A&M o los animales control (78%, 84% y 87%, respectivamente). Tampoco era significativa la diferencia en la mortalidad (11,5% de vacunados no por vía oral frente al 0% de los terneros vacunados por vía oral, p > 0,05).

Los valores de anticuerpo (medidos mediante HAI frente a P. haemolytica de serotipo 1) aumentaban significativamente (p<0,01) entre las muestras tomadas en el establo del comprador y las tomados a la llegada al criadero en ambos terneros vacunados por vía oral y vacunados por Texas A&M en comparación con los no vacunados. En general, los terneros ganaron 29 kg entre la compra y el final del experimento después de 28 días en el criadero. Un grupo, los terneros vacunados por vía oral, que no recibieron la vacuna Texas A&M, ganaron significativamente más peso que cualquier otro grupo (p<0,01, n=9) con 40,2 kg. Los otros dos grupos no diferían significativamente en este parámetro.

Del moco nasal de la mayoría de los terneros se recuperó una o más veces en el cebadero Pasteurella haemolytica de serotipo 1 y, en menor grado, de serotipo 6. Los grupos no diferían significativamente en la excreción del organismo. Algunos, pero no todos los terneros, que recibieron la vacuna oral excretaban el organismo mutante en uno o más muestras de moco nasal durante la primera semana en el cebadero, lo que indicaba que el inóculo era suficiente para colonizar sus vías respiratorias superiores en estas condiciones.

Este experimento demostró que nuestra vacuna oral experimental puede administrarse con el pienso en el establo del comprador antes del traslado al cebadero y, de este modo, colonizar al animal y provocar una respuesta inmune en 1 semana. La morbilidad y la mortalidad en el experimento actual eran inusualmente altas. Además de los frecuentes aislados de P. haemolytica, eran comunes los aislados de coranovirus respiratorio y de P. multocida. El número de terneros de los que se aisló coranovirus era generalmente alto y puede ser responsable de la morbilidad inusualmente alta y de la frecuencia de diarrea observada. El número de terneros que necesitaron volver a ser tratados también era inusual, lo que sugería que otras bacterias, además de P. haemolytica, tenía un papel importante en el brote.

Tilmicosina es un antibiótico con un reducido espectro de actividad, dirigido y aconsejado principalmente para combatir P. haemolytica. Dado que otras bacterias que no eran P. haemolytica y virus, tal como coranovirus respiratorio eran prevalentes, no es especialmente sorprendente que las vacunas monovalentes contra P. haemolytica no redujeran significativamente la morbilidad. Sin embargo, ninguno de los terneros vacunados por vía oral sucumbió a la pasteurelosis neumónica, en comparación con el 11,5% del resto, lo que sugería que la vacuna estaba implicada en la reducción de la mortalidad. La ganancia de peso sustancialmente mayor de los terneros a los que sólo se les administró la vacuna por vía oral, apoya además la conclusión de que la vacuna reducía la enfermedad en estos terneros. La administración del producto de Texas A&M junto con la vacuna oral también puede dar lugar a una reducción en la respuesta a uno o a ambos productos o a respuestas nocivas en la resistencia a enfermedades y, por consiguiente, reducir el beneficio conferido por la vacuna oral sola.

Ejemplo 5 Capacidad de la deleción de leucotoxina en fase de P. haemolytica de serotipo 1 para colonizar las fosas nasales de terneros estresados por infección concurrente con el virus del herpes bovino de tipo 1

La Pasteurella haemolytica de serotipo 1 se recupera esporádicamente en cantidades relativamente pequeñas de las muestras de moco nasal de terneros normales sanos. Después del estrés o la infección viral respiratoria, P. haemolytica de serotipo 1 puede proliferar de forma explosiva en las fosas nasales hasta resultar la flora predominante. Se excretan cantidades muy grandes de bacterias en el moco nasal de estos terneros. Se cree que estas elevadas cantidades de bacterias son inhaladas o aspiradas dentro de pulmones susceptibles de desarrollar pasteurelosis neumónica. De este modo, este experimento se diseñó para obtener datos preliminares sobre si los mutantes de P. haemolytica de deleción de leucotoxina podían colonizar las fosas nasales en este condiciones y, si así era, como podrían excluir de forma competitiva la colonización por P. haemolytica de tipo natural. Se usaron tanto los organismos de serotipo 1 como de serotipo 6 ya que se sabía que ambos causan neumonía fibrinosa mortal en terneros.

Materiales y procedimientos

Vacunación de los animales. Se compraron 8 terneros de cruces de tipo lechero, de aproximadamente 150 kg, de una vaquería local y se mantuvieron en el NADC. Los terneros se separaron aleatoriamente en 2 grupos de 4 cada uno de modo que no pudiera haber contacto entre los grupos. Se permitió a los terneros que se aclimataran durante 10 días antes de iniciar el experimento.

El virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa (cepa Coopers, amablemente cedida por los Laboratorios del Servicio Nacional Veterinario) se aplicó mediante aerosol dentro de cada ventana nasal del ternero por inspiración según las instrucciones proporcionadas por NVSL para la estimulación, dando una dosis final de 10^{9,4} TCID_{50}/ventana. Tras la exposición al virus, un grupo de 4 terneros comió un pienso apetecible concentrado en el que se vertieron 10 ml/ternero de una mezcla en suspensión de P. haemolytica D153\DeltalktA y D174\DeltalktA (serotipos 1 y 6 respectivamente) a 2 x 10^{9} UFC totales/ml. El otro grupo se alimentó con una ración no inoculada.

Cinco días después de la exposición al virus, el grupo alimentado se expuso por inyección intranasal a 1,5 ml/ventana de P. haemolytica (mezclada como anteriormente) a 2,7 x 10^{8} UFC totales/ml. Seis días después de la exposición al virus, se expuso a todos los grupos mediante inyección intranasal a una mezcla de P. haemolytica D153 y D174 de tipo natural a 5 x 10^{8} UFC totales/ml.

Recogida y análisis de las muestras. Las muestras de moco nasal se recogieron el día de exposición al virus y los días 3, 4, 5, 6, 7 y 10 después de la exposición al virus. El suero se recogió el día de la exposición y 10 días después.

El décimo día tras de la exposición al virus, se sacrificaron todos los terneros y los pulmones se examinaron macroscópicamente. Las temperaturas rectales se registraron diariamente desde el día de la exposición al virus hasta el sacrificio. Se ensayó en el suero por HAI la presencia de anticuerpos tanto frente al serotipo 1 como al serotipo 6 de P. haemolytica.

El moco nasal se diluyó 1:10 de forma seriada y se extendió en placas de agar sangre que contenían sangre bovina desfibrinada al 5%. Después de la incubación durante toda la noche, se identificó y se hizo recuento de P. haemolytica y se determinó el serotipo de 20 colonias representativas mediante un procedimiento rápido de aglutinación en placa.

Resultados

La mayoría de los terneros no tuvieron fiebre durante los 3 días tras la exposición al virus y aparecieron picos de fiebre de 40,5ºC el día 4. Sólo 3 terneros permanecieron con fiebre durante más de una semana y todos volvían a no tener fiebre 10 días después de la exposición al virus.

Los cultivos del moco nasal de todos los terneros fueron negativos para P. haemolytica el día de la exposición al virus. Un ternero que se alimentó de mutantes de leucotoxina de P. haemolytica excretaba organismos no hemolíticos de serotipo 1 en las muestras de moco nasal a partir del día 3 tras la exposición al virus y continuó excretando mutantes de leucotoxina hasta el sacrificio. Los cultivos de los 3 terneros alimentados restantes fueron negativos para P. haemolytica hasta el día 6, un día después de la exposición intranasal a la mezcla de mutantes de leucotoxina. Estos terneros excretaban grandes cantidades de P. haemolytica no hemolítica los días 6, 7 y con una excepción, el día 10 (Tabla 5). Los cultivos de los terneros no expuestos de forma deliberada a P. haemolytica hasta el día 6, permanecían negativos para el organismo hasta el día 7, después de lo cual excretaban mezclas, con una excepción el día 10, de P. haemolytica de serotipo 1 y serotipo 6 hemolíticos.

Tres animales expuestos al mutante P. haemolytica se seroconvirtieron (aumento de 4 veces o más en el valor) para ambos serotipos 1 y 6 entre el momento de la exposición al virus y el sacrificio. El cuarto animal tenía un valor aumentado dos veces frente a ambos serotipos. Los animales restantes aumentaban su valor 2 veces o se mantenían a valor constante durante este periodo.

Los pulmones en el post mortem en su mayoría no presentaban nada especial. El ternero 30, sin exponer a los mutantes de leucotoxina presentaba consolidación firme a través de la mitad caudal derecha del lóbulo medio con el 5% de la mitad craneal afectada. Los terneros 17 y 18 tenían lesiones menores de consolidación que afectaban al 5% o menos de los lóbulos 2 y 3 del pulmón, respectivamente. No se observaron anomalías en los terneros restantes.

Los mutantes de leucotoxina de Pasteurella haemolytica eran capaces de colonizar las fosas nasales de los terneros que estaban infectados de forma concurrente con el virus IBR. Esta colonización no previene, o incluso la reduce, la superinfección experimental con P. haemolytica de tipo natural. A juzgar por las cantidades de P. haemolytica excretadas en el moco nasal, parece que los mutantes de leucotoxina eran menos fuertes en la colonización nasal. La bacteria de tipo natural colonizaba a niveles aproximadamente 10 veces más alto que lo hacían los mutantes bien por si mismos o en conjunto. Sin embargo, los mutantes de leucotoxina eran capaces de mantener un nivel sustancial de colonización incluso en presencia de P. haemolytica de tipo natural, lo que indicaba que la bacteria seguía siendo bastante fuerte. De hecho, las mezclas de cepas parentales de tipo natural y los mutantes de leucotoxina pasados in vitro durante 100 generaciones por medio de cultivo Columbia daban lugar a una población ligeramente enriquecida en mutantes de leucotoxina, lo que indicaba que los mutantes de leucotoxina competían muy bien con los de tipo natural en estas condiciones. No se sabe si es posible superponer una infección con mutantes de leucotoxina en la faz de colonización sustancial con P. haemolytica de tipo natural. Quizás los mutantes de leucotoxina mantenían su infección debido a que ya tenían un punto de apoyo en la nasofaringe.

Nuestro trabajo previo con infecciones por P. haemolytica usando un modelo de virus IBR indica que la infección bacteriana de la nasofaringe (especialmente, las amígdalas del paladar) no se traslada necesariamente a la colonización explosiva de las fosas nasales. Algunos terneros que se sabía que eran portadores de P. haemolytica de serotipo 1 en las amígdalas del paladar eran incapaces de ver colonizadas las fosas nasales incluso aunque las fosas nasales fueran susceptibles, como se ha demostrado por inoculación intranasal. Otros terneros similares de probable pero no confirmado estado portador no resultaban colonizados en condiciones similares. Aunque esto parezca una paradoja, no es fácil explicar si la infección de la faringe puede o no extenderse a las fosas nasales susceptibles adyacentes. Quizás el flujo ciliar lleva el material desde las fosas nasales hacia adelante, hacia los orificios nasales y hacia atrás en la orofaringe.

Los valores de anticuerpo en el suero tanto frente al serotipo 1 como al serotipo 6 aumentaban sustancialmente en tres de los terneros alimentados con mutantes de leucotoxina. Puesto que los terneros se sacrificaron el día 10, se disponía de poco tiempo para una respuesta inmune en los 7 terneros que no se colonizaron hasta el día 6 ó 7. Por tanto, es probable que alimentando al organismo se provoque o al menos se facilite una respuesta inmune previa a la detección de la colonización nasal.

Se recuperaron del moco nasal de cada ternero tanto el serotipo 1 como el 6 en cantidades elevadas, más a menudo como una infección mixta con ambos serotipos. En los dos casos, el día 10 el serotipo 1 sobrepasó en crecimiento al serotipo 6 para convertirse en la flora predominante. En un caso, el serotipo 6 se convertía en la flora predominante. Estos resultados sugerían que el serotipo 6 es prácticamente igual en su capacidad para colonizar en las condiciones elegidas. Dado las observaciones de que la cepa NADC D174 de serotipo 6 provoca neumonía grave en terneros tras la inoculación intratraqueal, cabría esperar que la enfermedad respiratoria apareciera en los terneros bajo las condiciones de campo. De hecho, P. haemolytica de serotipo 6 se había recuperado previamente de las fosas nasales de terneros en ensayos de campo y de los pulmones de terneros que murieron debido a pasteurelosis neumónica. Mientras que el serotipo 1 permanecía como el que se aislaba más normalmente tanto de las fosas nasales de terneros estresados como del pulmón con neumonía, el serotipo 6 representaba un porcentaje significativo de los aislados de P. haemolytica a partir del moco nasal o del pulmón (aproximadamente el 10%) en estas condiciones.

De este modo, los mutantes de P. haemolytica de deleción de leucotoxina en fase son capaces de colonizar la nasofaringe de terneros convertidos susceptibles con la infección concurrente del virus IBR. Esta infección no era suficiente para prevenir la colonización por P. haemolytica de tipo natural. La alimentación con mutantes de leucotoxina de los terneros concurrentemente con la exposición al virus IBR permitía que el ternero resultara colonizado a alto nivel en sus fosas nasales y apareciera como resultado la seroconversión para P. haemolytica en 3 de los 4 terneros. Ambos P. haemolytica de serotipos 1 y 6 de son capaces de colonización explosiva durante la infección del virus respiratorio y cada uno puede hacerlo en presencia del otro.

TABLA 1 Valores de anticuerpo por HAI frente a Pasteurella haemolytica de serotipos 5 y 6 y valores de neutralización de leucotoxina antes y después de la vacunación. La primera dosis de vacuna el día 0, 2ª dosis el día 21. Todos los animales fueron estimulados por vía intratraqueal con serotipos 5 y 6 de tipo natural el día 28. n=5 por grupo

1

	* \hskip0,2cm Sobrevivió una oveja, 4 animales murieron 2 días después de la estimulación y no se analizaron.
	** No se analizaron los animales control

TABLA 2 Puntuaciones de las lesiones pulmonares y resultados de los cultivos bacterianos de pulmón post mortem 5 días después de la estimulación intratraqueal con Pasteurella haemolytica de serotipos 5 y 6. (n=5 para cada grupo, los números se expresan como \pm intervalo de confianza del 95%)

2

	* \hskip0,2cm Diferencia significativa con respecto a los valores control, p < 0,001
	** Porcentaje afectado de cada lóbulo estimado y multiplicado por la contribución del lóbulo al
	\hskip0,5cmintercambio gaseoso total.

TABLA 3 Valores de anticuerpo por HAI frente a Pasteurella haemolytica de serotipo 1 y valores de neutralización de leucotoxina antes y después de la vacunación. La primera dosis de vacuna el día 0, 2ª dosis el día 21. Todos los animales fueron estimulados por vía intratraqueal con serotipo 1 de tipo natural el día 28. (n=6 para los controles y 5 para cada grupo vacunado)

3

* Sobrevivieron cuatro ovejas, 2 animales murieron 3 días después de la estimulación y no se analizaron.

TABLA 4 Valores de las lesiones pulmonares y resultados de los cultivos bacterianos de pulmón post mortem 4 ó 5 días después de la estimulación intratraqueal con Pasteurella haemolytica de serotipo 1. (n=6 para los controles y 5 para cada grupo de vacunados, los números se expresan como \pm intervalo de confianza del 95%)

4

	* \hskip0,4cm Diferencia significativa con respecto a los valores control, p < 0,01
	** \hskip0,2cm Diferencia significativa con respecto a los valores control, p < 0,02
	*** Porcentaje afectado de cada lóbulo estimado y multiplicado por la contribución del lóbulo al
	\hskip0,7cmintercambio gaseoso total.

TABLA 5 Excreción de P. haemolytica en el moco nasal de terneros infectados con el virus IBR el día 0

5

	* \hskip0,2cm Los terneros 15, 19, 28 y 29 se expusieron a mutantes para leucotoxina de P. haemolytica de seroti-
	\hskip0,5cm pos 5 y 6 por vía intranasal el día 5. Todos los terneros se expusieron a P. haemolitica de tipo natu-
	\hskip0,5cm ral de serotipos 5 y 6 el día 6.
	** Los mutantes de leucotoxina eran de tipo natural no hemolíticos que mostraban \beta-hemólisis.
	\dagger\hskip0,2cm Cuando se disponía de ellas, se determinó el serotipo de 20 colonias representativas.

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Bibliografía

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<110> Briggs, Robert E.

\hskip1cm Tatum, Fred M.

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<120> Mutante por deleción de LKTA de P. haemolytica

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<130> 00295.75997

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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<150> 60/060,060

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<151> 25-09-1997

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Pasteurella haemolytica

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatcccc aattcgtaga ggtttc

\hfill

26

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<210> 2

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Pasteurella haemolytica

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<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatccgc tgaaagcggt cggggg

\hfill

26

Claims (16)

1. Una bacteria P. haemolytica que:

a)

expresa leucotoxina no biológicamente activa;

b)

comprende una mutación en el gen estructural IkA^{-} que codifica leucotoxina;

c)

expresa una molécula de leucotoxina mutante por deleción que induce anticuerpos que se unen específicamente a leucotoxina, y

d)

no contiene ADN extraño.

2. La bacteria P. haemolytica de la reivindicación 1 en la que el mutante por deleción es de aproximadamente 66 kD.

3. La bacteria P. haemolytica de la reivindicación 1 en la que el mutante por deleción carece de los aminoácidos 34 a 378 de la leucotoxina.

4. La bacteria P. haemolytica de la reivindicación 1 en la que la bacteria es lkt C^{+}.

5. La bacteria P. haemolytica de la reivindicación 1, en la que el operón de leucotoxina no comprende genes de resistencia a antibióticos.

6. La bacteria P. haemolytica de la reivindicación 1 en la que la bacteria comprende una mutación que no es reversible, dando lugar dicha mutación a la incapacidad de la bacteria para expresar una leucotoxina biológicamente activa.

7. Uso de la bacteria de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para inducir inmunidad frente a pasteurelosis neumónica en rumiantes.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que el medicamento es para la administración a través de la vía oral.

9. El uso de la reivindicación 8 en el que el medicamento es para añadirse al pienso del rumiante.

10. El uso de la reivindicación 7, en el que el medicamento es para inyección por vía subcutánea.

11. El uso de la reivindicación 7, en el que el medicamento es para inyección por vía intradérmica.

12. El uso de la reivindicación 7, en el que el medicamento es para inyección por vía intramuscular.

13. El uso de la reivindicación 7, en el que el medicamento es para administración a través de la nariz.

14. Un pienso para rumiantes que comprende la bacteria de la reivindicación 1.

15. Una vacuna para reducir la morbilidad en rumiantes, que comprende:

\hskip0,5cm una bacteria P. haemolytica que:

a)

expresa leucotoxina no biológicamente activa;

b)

comprende una mutación en el gen estructural IkA^{-} que codifica leucotoxina;

c)

expresa una molécula de leucotoxina mutante por deleción que induce anticuerpos que se unen específicamente a leucotoxina, y

d)

no contiene ADN extraño.

16. La bacteria P. haemolytica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en terapia.