MXPA00002975A

MXPA00002975A - Mutante de supresion de lkta de p. haemolytica

Info

Publication number: MXPA00002975A
Application number: MXPA/A/2000/002975A
Authority: MX
Inventors: Robert E Briggs; Fred M Tatum
Original assignee: Biotechnology Research And Development Corporation; Robert E Briggs; Fred M Tatum
Priority date: 1997-09-25
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2002-03-26

Abstract

Los mutantes de P. Haemolytica proporcionan una excelente seguridad y eficacia cuando se usan como vacunas en rumiantes, por ejemplo, reses, borregos y cabras, sometidos a pasteurelosis neumónica. Pueden administrarse mediante una variedad de rutas. Se prefiere especialmente el uso en alimentos para animales. Los mutantes no se revierten y no contienen DNA extraño y no introducen genes de resistencia a antibióticos.

Description

M UTANTE DE SU PRESIÓN DE LKTA DE P. HAEMOLYTICA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional co-dependiente serial no 60/060,060, presentada el 25 de septiembre de1997, la cual es incorporada en la presente por referencia CAM PO TÉC N ICO DE LA INVENCIÓN Esta invención está relacionada con el campo de la genética bacteriana y más particlarmente al campo de patógenos respiratorios de animales de granja ANTEC EDENTES DE LA I NVENCIÓN La P haemolytica es un patógeno que provoca serios daños económicos a la industria en las g ranjas de animales Las vacunas que han sido desarrolladas en un esfuerzo para controlar la enfermedad han cumplido con éxito variable pero limitado Debido a que la enfermedad es provocada en parte significativa por la propia reacción de los animales a la infección con P haemolytica, las vacunas mapropiadamente diseñadas pueden empeorar en realidad l a condición cl ínica de los vacunados infectados Así , existe una necesidad continua en la técn ica para vacunas seguras y efectivas , las cuales pueden red ucir la morbidez y/o mortalidad de rumiantes debido a P haemolytica BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar una bacteria de P haemolytica útil como una cepa de vacuna Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para i nducir inmunidad a pasteurelosis nemón ica en rumiantes Un objetivo de la presente invención es proporcionar una cepa de vacuna contra pasteurelosis nemónica Otro objetivo de la invención es proporcionar un alimento para rumiante Otro objetivo de la invención es proporcionar un plásmido sensible a la tem peratura para la manipulación de P haemolytica Estos y otros objetivos de la invención serán logrados por una o más de las modalidades descritas mas adelante Una modalidad de la invención proporciona una bacteria de P haemolytica, la cual expresa leucotoxma no biológicamente activa, expresa una forma de molécula de leucotoxina que induce anticuerpos que se unen específicamente a leucotoxina, y no contiene DNA extraño Otra modalidad de la invención proporciona un método para inducir inmunidad a pasteurelosis neumónica en rumiantes Una bacteria es admin istrada a un rum iante La inmunidad a la bacteria es inducida con el lo La bacteria expresa leucotoxina no biológicamente activa, expresa una forma de molécula de leucotoxina que induce anticuerpos q ue se unen especificamene a leucotoxina, y no contiene DNA extraño Todavía otra modalidad de la invención proporciona un alimento para rum ia ntes El alimento comprend e una bacteria q ue expresa leucotoxma no biológicamente activa , expresa una forma de molécula de leucotoxina que induce anticuerpos que se unen específicamente a leucotoxina, y no contiene DNA extraño. Todavía otra modalidad de la invención proporciona un plásmido sensible a la temperatura. El plásmido replica a 30°C pero no a 40°C en P. haemolytica. Más aún, es del mismo grupo de incompatiblidad que el plásmido que ha sido depositado en ATCC con Acceso No. . La presente invención proporciona de esta manera la técnica con herramientas para manipular genéticamente un patógeno agrícolamente importante. También proporciona cepas muantes útiles, las cuales pueden ser usadas de manera efectiva para reducir la morbidez entre rumiantes, tales como, reses, borregos y cabras, debido a Pasteurella haemolytica.

BREVE DESC RIPCIÓN DE LOS DI BUJOS Figu ra 1 . Destino de plásmido sensible a la temperatura en Pasteurella hemolytica después del paso a 30°C y 40°C . Figu ra 2. El operón de leucotoxina de pasteurella hemolytica con frag mento EcoRV de 3. 1 5 kb. IktC acila el gene estructural de leucotoxina para activarse; LktA, gene estructural de leucotoxina; IktB/D, involucrado en la exportación de leucotoxina independiente del l íder. Figura 3. Supresión en-marco del frag mento EcoRV de 3. 1 5 kb de IktCA usando ?/ael . Fig u ra 4. I nteg ración del plásm ido de reemplazo en el cromosoma.

Fig u ra 5. Resolución del pl ásmido de reem plazo del cromosoma .

Figu ra 6. Western blot de leucotoxma natural y ?lktA usando anticuerpo monoclonal anti Lkt DESC RI PCIÓN DETALLADA Es un descubrimiento de la presente invención que un mutante no-revertible de P. haemolytica, que expresa una forma mutante de leucotoxina es tul como una vacuna Más aún , se ha encontrado que este mutante es útil cuando se administra a las am ígdalas, vía la ruta oral, y vía la ruta nasal De esta manera, pueden lograrse métodos extremadamente no costosos y fáciles de vacunar animales, simplemente al aderezar por enzim a el alimento del animal De preferencia, el mutante es un mutante de supresión Una de tales proteínas de leucotoxi na mutante hecha es de aproximadamente 66 kD, aunq ue pueden usarse otros de tales mutantes, siempre y cuando la proteína sea suficientemente larga para ser inmunogénica, de preferencia al menos 1 0 1 5 o 20 aminoácidos de largo Se cree que se prefiere una molécula suprimida más larga para log rar una respuesta inmune fuerte Se prefiere que la bacteria mutante no contenga genes exógenos, tales como, genes de resistencia a medicamentos, los cuales pueden provocar problemas ambientales y de salud si no están contenidos Además, se prefiere q ue la mutación sea una mutación no-revertible, tal como una mutación de supresión Las formas mutantes de leucotoxina de la presente invención ind ucen anticuerpos , los cuales se unen específicamente a la leucotoxina Los a nticuerpos , que se unen específicamente a leucotoxi na, proporcionan una señal de detección de al menos 2-, 5-, 10- o 20-veces mayor que una señal de detección proporcionada con proteínas diferentes a leucotoxina cuando se usan en Western blots u otros ensayos mmunoqu ímicos De preferencia, los anticuerpos que se unen de manera específica a la leucotoxina no detectan otras proteínas en ensayos inmunoqu ím icos y puede inmunoprecipitar leucotoxina de la solución Más preferiblemente, los anticuerpos pueden ser detectados en un ensayo de hemaglutinación indirecta y pueden neutralizar leucotoxma Aunque la ruta oral es preferida por facilidad de la entrega, también pueden usarse otras rutas para la vacunación Estas incluyen sin li m itación , subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal , mtrabronquial , etc La vacuna puede ser administrada sola o como un componente de u na vacuna polivalente, es decir, en combinación con otras vacunas También se proporciona mediante la presente invención , un plásm ido sensible a la temperatura, el cual replica a 30°C pero no a 40°C en P haemolytica De preferencia, el plásm ido es del m ismo g rupo de incom pati bilidad como pD80, es decir, comparte el mismo origen de rep cación Uno de tales plásmidos se ha depositado en ATCC con Acceso No La vacu nación con com binación viva modificada de serotipos 5 y 6 de P haemolytica contra homólogos combinados virulentos reta extremadamente bien, con base en los signos clínicos, lesiones postm ortem y resultados de cultivo bacteriano Los animales que han sido vacun ados as i permanecen activos , alertas, afebples y alimentándose La vacuna puede no solo prevenir la muerte debido a P. haemolytica, sino también puede reducir los síntomas de pasteurelosis neumónica, tal como, vol umen de lesión pulmonar, fiebre, apetito disminuido , pérdida de capacidad de ventilación pulmonar, efusión pleural fibrinosa y/o adhesiones, carga bacteriana y depresión. La divulgación anterior describe de manera general la presente invención . Un entendimiento más completo puede ser obtenido mediante referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales son proporcionados en la presente para fines de ilustración solamente, y no pretenden limitar el alcance de la invención.

EJ EM PLO 1 Vacu nas parenterales y orales vivas-modificadas contra fiebre de embarque y pasteurelosis neumónica de reses, borregos y cabras con base en supresiones limpias en-marco del gene estructural de leucotoxina de Pasteurella haemolytica Métodos y materiales Mutagénesis de origen de replicación de plásmido. Se amplificó un frag mento de DNA de 1 .2 kb conteniendo el origen de replicación pD80 putativo por PCR, usando el plásm ido de resistencia a ampicilina de 4.3 kb aislado de P. haemolytica serotipo 1 , cepa NADC-D80 como plantilla ( 1 ) . Se usaron el iniciador hacia delante 5'-CCG GAT CCC CAÁ TTC GTA GAG GTT TC-3' (SEQ I D NO: 1 ) y el in iciador inverso 5'-CCG GAT CCG CTG AAA GCG GTC GGG GG-3' (SEQ I D NO: 2). El producto fue clonado en el vector pCR2 1 (I nvitrogen , San Diego CA) usando las direcciones del fabricante Se preparó un cassette de canamicina mediante paso de pBC SK (Stratagene, La Jolla CA) conteniendo un derivado del gene de canamicina Tn903 (Pharmacia Biotech , Piscataway NJ) , se clonó en el sitio EcoRI único a través de E co cepa P/ial rntasa para proteger contra el corte de Pha\ La inserción de 1 2 kb clonada (1 µg) se cortó de pCR2 1 por digestión con EcoRI y se l igó durante la noche al cassette de canamicina Phal-metilado, digerido con EcoRI (0 25 µg) La mezcla de ligación se concentró por precipitación con EtOH y se sometió a electroporosis (Gene-pulser, Bio-Rad, Redfield CA) en P haemolytica, serotipo 1 , cepa NADC-D 1 53 usando 1 8 kv / cm y 1 000 W Se obtuvo el DNA de plásmido de un transformante resistente a canam icina , el cual fue de 2 5 kb de tamaño y se cortó en fragmentos de 1 2 y 1 3 kb cuando se sometió a EcoRI Un µg del plásmido fue sometido a m utagénesis con hidroxilam ina durante 1 hora a 65°C como se describió previamente (2) Selección de origen de replicación de plásmido sensible a la temperatura El plásmido mutagenizado fue sometido a diálisis durante la noche a 4°C contra TE, se concentró por precipitación con etanol , y se electropopzo en NADC-D 1 53 fresco , como se describió antes Después de 2 h de recuperación en caldo Columbia (Difco Laboratories, Detroit M l) , las cél ul as se platinaron en 1 0 placas de base de ag ar de sangre Columbia conten iendo 50 ug/ml de canamicina y sem incubaron a 30°C Después de 20 h las pl acas se movieron a 40° C d u rante u n as 6 horas adicionales Se seleccionaron las colonias que fueron atípicamente pequeñas y se clonaron a placas de canamicina frescas y se incubaron durante la noche a 30°C. El crecimiento de los clones se duplicó sobre las placas con y sin canamicina, y se incubaron durante la noche a 40°C. Se asumió que los clones que fallaron en el crecimiento en medio selectivo a 40°C, pero que crecieron sin selección , son sensibles a la temperatura ya sea para mantenimiento de plásmido o para expresión de canam icina. El crecimiento de placas sin selección antibiótica a 40°C se pasó a placas selectivas, las cuales se incubaron durante la noche a 30°C. Se asumió que los clones que exhibieron crecimiento ligero o ningún crecim iento en este paso, contienen orígenes de replicación sensibles a la temperatura. Estos clones se pasaron de la placa selectiva de 30°C original a placas selectivas frescas y a caldo selectivo. Los clones fueron reverificados mediante paso con y sin selección a 40°C y 30°C. Aunque cada clon exhibió el fenotipo correcto, las mini-preps de plásmido de los cultivos de caldo produjeron pequeñas cantidades de un plásmido de 2.5 kb solamente de uno de los cultivos. Los clones restantes no fueron exami nados adicionalmente. Construcción del vector de lanzadera, sensible a la temperatura, de origen dual. El origen de replicación sensible a la temperatura fue cortado del plásmido anterior mediante digestión con EcoRI y entonces se hizo romo mediante tratamiento con el frag mento Klenow de DNA polimerasa I y los cuatro dNTPs. El fragmento se ligó durante la noche a 4°C con pBC SK digerido con Smal . La mezcla de ligación se usó para transformar D H 1 0-B de E. coli (Life Technolog ies, Gaithersburg M D) .

El plásmido conteniendo una inserción de 1 2 kb fue recuperado de una colonia resistente a cloranfenicol El plásmido fue digerido con Sa/I y se ligó a un cassette de canam icina digerido con Sa/l durante la noche a 4°C La mezcla de ligación fue electropopzada en DH 1 0-B de E coli y se platinó sobre canamicina 50 µg/ml El plásmido recuperado de una colonia resistente a canamicina fue digerido con SssH I l , se hizo romo como antes, se trató con fosfatasa alcalina de ternera para remover los fosfatos term inales, y se ligó durante la noche a 4°C con un fragmento romo de aproximadamente 900 bp conteniendo el origen de replicaci?n de plásmido ColEI La mezcla de ligación fue electropopzada en P/ialmtasa de E. coli (1 ) y se platinó sobre placas conteniendo canamicina El plásmido fue recuperado de una colonia resistente a canamicina, que produjo un fragmento simple de aproximadamente 3 5 kb con digestión con EcoRI y fragmentos de 2 2 y 1 3 kb con digestión con Sa/l Al plásmido se le dio la designación pBB80C El plásmido fue electropopzado en P haemolytica para confirmar el origen de replicación sensible a la temperatura , todavía soportó crecim iento bacteriano en canamicma a 30°C, pero no a 40°C Clonación y manipulación de IktA Un fragmento de EcoRV de 3 1 5 kb de DNA genómico de P haemolytica conteniendo IktC y aproximadamente 75% de la región de codificación de IktA se ligó en el sitio EcoRV de pBB80C El plásmido resultante se amplificó en DH 1 0-B de E coli y se le d io la designación pBB80ClktA El plasmido pBC SK (0 25 µg , usado para proporcionar sitios ?/ael ad icio nales en trans) se usó con 0 25 µg de pB B80ClktA y se d igirió con ?/ael durante 1 8 h a 37°C. El DNA de plásmido parcialmente digerido, resultante, se extrajo con alcohol fenol-cloroformo-isoamílico (PCI), se precipitó con etanol , se ligó a 4°C durante la noche, entonces se re-extrajo y se precipitó. La mezcla de ligación se digirió con PvuW , que corta tanto pBC SK como el fragmento de ?/ael de 1 035 bp interno a LktA. Cinco ng del DNA digerido se electroporizaron en P/ialmtasa de E. coli y se platinaron en placas de base de agar de sangre Columbia conteniendo 50 µg/ml de canamicina. El DNA de plásmido de transformantes seleccionados fue clasificado por digestión de minipreps de plásmido con EcoRV solo o junto con ?/goMI (un isoesquizómero de ?/ael). Se seleccionó un clon conteniendo una supresión de 1 035 bp y se le dio la designación pBB80C?// f/ . Recuperación de mutantes de leucotoxina. El plásm ído pBB80C?//cf/4 se electroporizó en P. haemolytica fresca cepa NADC-D1 53 a 18 kv/cm y 1 000 W. Se permitió que las células se recuperaran 2 horas a 30°C en 1 ml de caldo Columbia, entonces se colocaron 100 µl/placa en placas de agar Columbia conteniendo 50 µg/ml de canamicin a. Después de 48 h de incubación a 30°C, se pasaron cuatro colonias a placas de canamicina conteniendo 5% de sangre bovina defibrinada y se incubaron durante la noche a 37°C para seleccionar m utantes de cruzamiento simple. Cuatro colon ias del paso a 37°C , 2 hemol íticas y 2 no hemol íticas de cada transformante original (16 en total), se pasaron a caldo Columbia sin selección y se incubaron durante la noche a 30°C para resolver las mutaciones de cruzamiento simple.

El crecimiento del caldo Columbia a 30°C fue afectado por aislamiento en placas de base de agar de sangre conteniendo 5% de sangre bovina defibrinada y se incubó durante la noche a 37°C. El crecimiento también se pasó a caldo Columbia fresco sucesivamente para un total de 4 pasos a 30°C para investigar adicionalmente la proporción a la cual se perdía a 30°C sin selección . Las colonias aisladas del primer paso a 30°C fueron duplicadas en un arreglo en placas selectivas y en no selectivas conteniendo 5% de sangre bovina defibrinada. Se seleccionó para estudio adicional un clon sensible a la canamicina, el cual no demostró actividad hemolítica alguna en la placa no selectiva. Cepas adicionales de P. haemolytica obtenidas del depositario en el National Animal Disease Center, fueron sometidas posteriormente a tratamiento similar como antes. Estas cepas se aislaron de pulmón neumónico e incluyeron: NADC D632, serotipo ovino 1 ; NADC D121 , serotipo ovino 2; NADC D1 1 0, serotipo ovino 5, NADC D 1 74, serotipo bovino 6; NADC D 102, serotipo ovino 7; NADC D844, serotipo ovino 8; NADC D 1 22, serotipo ovino 9; y NADC D71 2, serotipo ovino 1 2. Caracterización del mutante de leucotoxina putativo. Para definir la supresión cromosómica, se amplificó DNA de células completas del m utante de leucotoxina putativo y de su cepa padre NADC-D1 53 por PCR, usando iniciadores anidados dentro de los extremos EcoRV del fragmento genómico de EcoRV, de 3. 1 5 kb, original . Los productos fueron electroporizados en un gel de agarosa 1 .2% tanto intactos como después de la digestión con ?/goM I .

Para determinar la actividad leucotóxica, se prepararon sobrenadantes de cultivo de fase log del mutante putativo y su padre a partir de cultivos de 3 horas de caldo Columbia. Se ensayaron diluciones de dos veces de los sobrenadantes usando células objetivo BL-3 y colorante MTT (7). Para determinar la expresión del producto de leucotoxina alterado putativo, los sobrenadantes de cultivo, así como un tercer sobrenadante de cultivo de nuestro mutante de superesión de leucotoxina, que no produce leucotoxina detectable, se concentraron aproximadamente 1 5 veces usando ultrafiltros de 30,000 mw (Centriprep, Amicon, Beverly, MA) . El retenido fue electroporizado por duplicado en SDS-PAGE y se manchó un gel usando azul Coomasie. El segundo gel fue manchado sobre una membrana de nylon para análisis Western blot. La membrana se lavó, se sondeó con anticuerpo monoclonal anti-leucotoxina 601 (proporcionado por el Dr. S. Srikumaran, Lincoln NE), se marcó con anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina de IgG anti-ratón (Sigma) y se manchó con nitro azul tetrazolio (Sigma) . Los mutantes de Pasteurella haemolytica diferentes a NADC D 1 53?lktA, serotipo 1 , fueron caracterizados por análisis PCR y características de crecimiento en placas de agar de sangre solamente. Su produ cción de proteína de leucotoxi na alterada no se confirmó.

Res u ltados El origen de replicación sensible a la temperatura derivado del plásm ido de resistencia a am picil ina, de P. haemolytica, endógeno, probó ser una herram ienta útil para la construcción de mutantes de supresión en ese organismo. Se asumió que el origen de replicación residía dentro de una región de no codificación de los nucleótidos 31 04 a 4293 del plásmido natural . El producto de PCR de 1 .2 kb de esa región, ligado a un cassette de canamicina Tn903 de 1 .3 kb, resultó en un producto de 2.5 kb capaz de la transformación estable de P. haemolytica, como es evidenciado por menos de 1 % de pérdida del plásmido después de 100 generaciones en cultivo de caldo a 37°C. Estos datos indican que las funciones de replicación esenciales residen dentro de esa región de 1 .2 kb del plásmido natural . La eficiencia de la transformación de P. haemolytica cayó aproximadamente 1 0 veces después de la mutagénesis de hidroxilamina, indicando quizás que el DNA no se dañó particularmente. No obstante, 10 colonias que fueron atípicamente pequeñas fueron recuperadas después de 20 horas a 30°C y 6 horas a 40°C. Dos de estas colonias crecieron en selección a 40°C y se desecharon. De las 8 colonias restantes, se encontró que cuatro retenían la resistencia a la canamicina después del paso sin selección a 40°C. Se presume que estas 4 colonias contienen plásmido, que fue sensible a la temperatura para la expresión de resistencia a canamicina y también se desecharon . Las 4 colonias restantes, que se presume que contienen plásmido, que fue sensible a la temperatura para mantenimiento, fueron recuperadas de la placa a 30°C orig inal y se pasaron nuevamente a 40°C y 30°C. Aunque cada una creció bien sin selección a ambas temperaturas, fallaron para crecer con selección a 40°C , y fallaron para retener la resistenci a a canam icina después del paso a 40°C, solo un clon produjo suficiente plásmido para estudio adicional mediante un procedimiento de lisis alcalina rápida Se asumió que las otras 3 colonias también contenían plásmido, pero el procedimiento de purificación de plásm ido rápido falló en recuperar cantidades suficientes para visualizarse en geles de agarosa El rend imiento de plásmido del clon positivo fue muy bajo Para facilitar el aislamiento subsecuente y clonación , se agregó un sitio de clonación múltiple y un origen de replicación Col EI al origen pD80 sensible a la temperatura El origen sensible a la temperatura y un cassette de canamicina fresco se colocaron dentro del sitio de clonación m últiple de pBC-SK, entonces se reemplazó el esqueleto del vector con una copia de <1 kb del origen ColEI Este plásmido de aproximadamente 3 5 kb, pBB80C, retiene la mayoría de los sitios de restricción únicos de pBC-S K, replica de manera eficiente en E coli y transforma P haemolytica a 30°C con eficiencia moderada En P haemolytica, el origen ColEI falla para soportar la replicación, y el mantenimiento del plásmido es dependiente del origen pD80 con mutación En esta situación, pBB80C fracasa en soportar el crecimiento en medio selectivo tanto a 37°C como 40°C pero soporta crecimiento moderado a 30°C (Figura 1 ) Para i ntrod uci r u na supresión en ma rco dentro de la región de cod ifi cación de IktA de P haemolytica por i nterca m bio alélico , se clonó un fragmento de EcoRV conteniendo parte del operon de leucotoxina en pBB80C, produciendo pBB80ClktA El clon se extendió aproximadamente 500 bp corriente arriba desde el codon de inicio IktC e incluyó aproxi madame nte 75% de IktA (Figura 2) Dentro del fragmento EcoRV se encuentran dos sitios ?/ael que cortan entre los codones dentro de IktA, dejando extremos romos (Figura 3). Los sitios ?/ael están situados casi de manera uniforme 1 kb aparte dentro del fragmento EcoRV. La digestión de pBB80ClktA con ?/ael se complicó por el hecho de que ?/ael está entre un grupo de endonucleasas de restricción , las cuales muestran una preferencia de sitio dramática para corte (4) . Esta enzima requiere una interacción simultánea con dos copias de su secuencia de reconocimiento antes de cortar DNA. Con ciertas enzimas de este tipo, la segunda copia puede ser sum inistrada en trans, de manera que se eligió en este experimento para suministrar sitios de reconocimiento adiconales para la mezcla de digestión al adicionar pBC SK, que contiene un sitio . Aunque esta estrategia resultó en un corte incompleto después de la digestión durante la noche, fue evidente en la mezcla un fragmento de 1 kb, indicando que ambos sitios ?/ael habían cortado en alguna de las moléculas de pBB80ClktA. El corte después de la ligación con Pvul l , el cual está contenido tanto en pBC S K como dentro del fragmento ?/ael de 1 kb a ser suprimido, aparentemente eliminó la mayoría de los productos no deseados, debido a q ue todos los transformantes clasificados para pBB80CAlktA contenían la supresión de 1 035 bp deseada. Cada uno de éstos volvió a cortar con ?/goM I , indicando que el nuevo sitio ?/ael estaba intacto y que el producto debería estar en-marco para al codón de inicio de IktA . La Pasteurella haemolytica transformada con pBBd0C?//cf/4 requirió casi 48 horas para lograr un buen tamaño de colonia a 30°C . El paso a 37 °C s im pleme nte al rayar de manera pesada en una placa conteniendo canam icina, resultó en numerosas colonias aisladas, algunas hemol íticas y otras no . Estos resultados son consistentes con la integración específica del plásmido en el operón de leucotoxina (Figura 4). Debido a que el plásmido de reemplazo contenía secuencia de operón intacta corriente arriba de la supresión, incluyendo el promotor, se esperaba que los productos de cruza simple corriente arriba expresaran el operón completo de manera normal . Sin embargo, se esperaba que los productos de cruza simple corriente abajo contuvieran dos copias defectuosas de IktA, debido a que C-terminal conteniendo 25% de IktA no estaba presente en el plásmido de reemplazo. Por lo tanto, se esperaría que una copia del gene de leucotoxina contuviera la supresión de 1 kb y la otra copia un extremo C truncado. Se ha mostrado previamente que la actividad hemolítica se correl aciona con la expresión de LktA activa (3 , 5, 6) . El paso de productos de cruza simple a 30°C resultó en una proporción inesperadamente baja de resolución de plásmido del cromosoma. Trabajo previo con pBB 1 92C, un plásmido condicional de temperatura derivado del plásmido de resistencia a estreptomicina, de P. haemolytica, exhibió 90 a 99% de reversión a sensibilidad a la canamicina después de un paso simple a 37 o 30°C, respectivamente. En este experi mento, de 60 colonias aisladas probadas después de un paso a 30°C . solo dos se volvieron sensibles a la canamicina . U na de las dos fue no hemol ítica y posteriormente se mostró que era un m utante de doble cruza (Figura 5) . Un paso adicional aumentó el porcentaje de CFU sensibles a canamicina en cultivos no selectivos a casi 50% después de 4 pasos . Muchas de estas colonias exhibieron un fenoti po no hemol ítico y probablemente fueron productos de doble cruza. Para generar mutantes de los otros serotipos, se seleccionaron 4-d productos hemol íticos de cruza simple y se pasaron a 30°C por uno o más pasos en caldo. El crecimiento fue detenido por aislamiento en cada paso, y las colonias no hemol íticas fueron seleccionadas por prueba mediante PCR y crecimiento en medio conteniendo canamicina. En cada caso, colon ias no hemolíticas que fueron sensibles a la canamicina fueron confirmadas por PCR por ser mutantes de supresión conteniendo sitios Nael simples. Asumimos que pBB192C contiene un origen de replicación más robusto que pBBdOC , como es evidenciado por las cantidades relativas de plásm ido recu perado de los cultivos respectivos. S'i la actividad de un origen de plásmido integrado desestabiliza la replicación cromosómica, se esperaría que se lograría mayor inestabilidad conforme aumenta la actividad del origen del plásmido. Esto podría responder tanto por proporciones de resolución mayores de pBB 1 92C a 30°C que a 37°C, y por las proporciones menores de resolución de pB BdOC comparadas con pBB 1 92. Durante la construcción de nuestro primer mutante de supresión de leucotoxina, se obtuvo un gran número de productos de cruza sim ple usand o plásm ido de reemplazo suicida (3), el cual conten ía selección de ampicilina. Aunque ambos brazos homólogos fueron similiares en longitud a aq uéllos del experimento actual , el paso de más de 1 00 generación no resultó en reversión a un fenoti po hemolítico o pérdida de la resistencia a ampicilina. Estos datos indican además que la actividad del origen del plásmido es la que desestabiliza los productos de cruza simple. Se encontró que los productos de PCR de los mutantes de leucotoxina putativos y sus cepas padres eran de 2 kb y 3 kb en tamaño, respectivamente, indicando que se había introducido una supresión en su IktA respectiva. La digestión de los productos de PCR con ?/goMI reveló 2 bandas de aproximadamente 1 kb de los mutantes y 3 bandas de aproximadamente 1 kb de las cepas padre, indicando que las supresiones deberían estar en-marco para LktA. La actividad de leucotoxina en los sobrenadantes de cultivo contra células BL-3 objetivo del mutante de serotipo 1 fue <1 : 2 comparado con 1 : 1 024 de la cepa padre, no indicando actividad detectable alguna. Se detectó una nueva proteína de aproximadamente 65 kDa en el sobrenadante de cultivo de este mutante por SDS-PAG E, consistente con el peso molecular predicho del producto suprimido. Mediante manchado con Coomasie, el nuevo producto excedió la concentración de la proteína LktA natural producida por la cepa padre que creció y se recolectó al lado del mutante. El tamaño más pequeño de este producto puede permitir una expresión más rápida o económica del gene. El producto reaccionó con el a nticuerpo monoclonal neutralizante 601 a un peso molecular aparente de 66 kDa (Figura 6) . No se observó reacción alguna a 1 01 -1 04 kDa, el peso molecul ar aparente del producto n atural observado en el sobrenadante de cultivo de la cepa padre.

EJEMPLO 2 Valoración de la eficacia de vacuna en pequeños rumiantes después de inyección intramuscular de una combinación de P. haemolytica serotipos 5 y 6 Materiales y métodos Vacunación de animales Cuatro borregos (Columbia, aproximadamente 25 kg) y seis cabras (Toggenburg, aproximadamente 15 kg) fueron privadas de calostro y se criaron en el National Animal Disease Center, Ames, IA Se seleccionaron y vacunaron al azar dos borregos y tres cabras con 4 x 107 CFU cada uno de NADC D110?lktA y NADC D174?lkta de P haemolytica (serotipos 5 y 6, respectivamente) en 1 ml de Solución de Sal Balanceada de Earles (EBSS), pH 74 La suspensión fue entregada intramuscularmente en la región media-cervical Después de tres semanas, los animales fueron revacunados de manera similar Diez días después de la segunda vacunación se retaron los diez animales con d 5 x 107 CFU, cada uno de las cepas padre NADC D110 y NADC D174 mezcladas en un volumen total de 5 ml de EBSS, instilados mtratraquealmente en la bifurcación de la tráquea con un catéter El inoculo fue seguido con 5 ml de EBSS estéril Cinco días después del reto todos los animales sobrevivientes fueron sometidos a eutanasia y necropsia Bacteria Las cepas de Pasteurella haemolytica NADC D110 (serotipo 5, aislado de pulmón bovino) y NADC D174 (serotipo 6, aislado de pulmón bovino) se hicieron crecer por separado en caldo Columbia (Difco Laboratories, Detroit Ml) aproximadamente 3 horas a fase log tard ía, aproximadamente 2 x 1 09 CFU/ml . El crecimiento se diluyó en EBSS 1 :50 para la dosis de vacuna o 1 : 100 para la dosis de reto. Las dos cepas se mezclaron en igual volumen y se mantuvieron en hielo antes de la inoculación al animal. Muestras y recolección de datos. Se recolectaron los sueros el día de la primera vacunación , 2 semanas después, el d ía de la exposición al reto, y el día de la necropsia. Se registraron las temperaturas rectales durante 3 días después de cada vacunación y dos veces por d ía desde la exposición al reto hasta la necropsia. Los sig nos clínicos fueron valorados subjetivamente en el mismo programa que las temperatuas rectales, con base en el grado de depresión y apetito. En la necropsia , los especímenes de pulmón de 1 a 3 gramos en peso fueron obtenidos de áreas conteniendo anormalidades, cuando fue posible, de la enumeración bacteriana. Se obtuvieron especímenes de torunda de la traquea, riñon e hígado para aislamiento. Se estimaron los volúmenes de lesión al pulmón para cada lóbulo del pulmón, incluyendo tanto áreas consolidadas como aquéllas que parecían meramente ateléticas. Las marcas de lesión al pulmón totales fueron expresadas como un porcentaje donde cada lóbulo se ajustó para una aproximación de su co ntri bución a intercam bio de aire como sigue: lóbulo cranial derecho , 6% ; mitad cranial derecha del lóbulo central , 5%; mitad de caudal derecha del lóbulo central, 7%; lóbulo de caudal derecha 35%; lóbulo accesorio, 4%; lóbulo cranial izquierdo, 4%: lóbulo central izquierdo, 6%; y lóbulo cauda l izquierdo , 32% .

Procesamiento de la muestra. Se probaron sueros para anticuerpo de P. haemolytica por hemaglutinación indirecta (IHA) contra serotipos 5 y 6 (todos animales) y por neutralización de leucotoxina (vacunas solamente) usando células BL-3 y colorante MTT (7, 8). Se pesaron los especímenes de pulmón y se adicionó EBSS para llevar el volumen de tejido más fluido a 10 veces el peso. Los especímenes fueron molidos paa producir una suspensión homogénea y se hicieron diluciones de diez veces en EBSS. Las diluciones (100 µl) se esparcieron sobre placas de base de agar de sangre conteniendo 5% de sangre bovina defibrinada y se incubaron durante la noche a 37°C. Se enumeraron las colonias exhibiendo morfología normal de P. haemolytica, y 20 colonias representativas (donde estaban disponibles) fueron serotipificadas usando antisueros específicos (9). Las torundas se rodaron sobre un tercio de placas de agar de sangre fresco y entonces se usó cada lado de un rizo estéril para rayar semi-cuantitativamente para aislamiento sobre los tercios restante de manera consecutiva.

Resultados No hubo reacción local palpable o visible siguiendo cualquier vacunación en cualquier vacunado. La primer dosis de vacuna produjo una respuesta febril, particulamente en los borregos, los cuales tuvieron fiebre en el día 2 y 3 que llegó a 40.3°C en el día 3. La segunda inyección no produjo respuesta clínica.

Antes de la vacunación, los animales tenían un título de I HA bajo contra ambos serotipos 5 y 6 de P haemolytica (Tabla 1 ) Después de la primera vacunación, el título de los vacunados aumentó sobre 8 veces contra ambos serotipos No hubo respuesta evidente después de la segunda dosificación Solo ocurrió un ligero incremento en el título de anticuerpo, aproximadamente 50%, después de la exposición al reto El título de los animales de control aumentó ligeramente, cerca del doble, antes de la exposición al reto Entre el tiempo de exposición al reto y la necropsia, el borrego de control sobreviviente aumentó su título contra ambos serotipos por aproximadamente 32 veces Los títulos de neutralización de leucotoxina en los vacunados aumentó variablemente Tanto borregos como dos cabras se seroconvirtieron (incrementaron al menos 4 veces) después de la primera vacun ación , uno de los animales también se seroconvirtio para la segunda dosis Una cabra permaneció seronegativa a lo largo del estudio Siguiendo el reto, ninguno de los vacunados tuvo fiebre en ningún momento Permanecieron alertas y comiendo todo su alimento hasta ia necropsia Los animales de control tuvieron fiebre el día de la exposición , promediando 40 7°C Todas las cabras de control y 1 borrego de control murieron durante la noche entre el primer y segundo d ía después de la exposición El borrego de control restante permaneció con fiebre, anorexico y deprimido hasta la necropsia La inspección del sitio de inyección de vacuna en la necropsia no revelo reacción detectable alguna en el músculo Se detectó una decoloración subcutánea ligera aproximadamente 1 cm en diámetro debido a la hemorragia en ambos borregos y dos de las tres cabras. El volumen de lesión al pulmón de los vacunados, corregido por la capacidad de ventilación de cada lóbulo, promedió 3.5% (Tabla 2) . Una cabra tuvo 95% de su lóbulo accesorio con consolidación moderadamente firme de la cual se recuperaron 1 .3 x 1 06 CFU/g (igualmente de serotipos 5 y 6) . Las lesiones al pulmón restantes fueron suaves, consistentes con atelectasis. De los 1 9 especímenes de pulmón cuantitativamente cultivados , 5 produjeron P. haemolytica. Dos animales no produjeron P. haemolytica de su pu l món . Dos produjeron de 2 x 1 03 a 7 x 1 03 CFU/g de sus lóbulos craniales derechos o mitad cranial del lóbulo central solamente. El animal con envolvimiento de lóbulo accesorio también produjo 1 x 103 CFU/g de la mitad de caudal derecha de su lóbulo central y crecimiento moderado de su torunda traqueal. Todas las demás torundas traqueales de los vacunados fueron negativas al cultivo, como lo fueron las torundas de h ígado y riñon . Un borrego tuvo adhesiones fuertes de pleura visceral a parietal y a perica rdio ventralmente en ambos lados derecho e izquierdo involucrando todos los lóbulos . Este borrego conten ía solo lesiones menores de atelectasis y prod ujo solo 2 x 1 03 CFU/g de su lóbulo cranial derecho; los otros dos lóbulos cultivados fueron negativos. El volumen de lesión al pulmón de los controles (corregido por capacidad de ventil aci ón de cada lóbulo) promedió 52% (Tabla 2) . Los cuatro animales que murieron conten ían gra ndes cantidades de efusión pleural fibpnosa y adhesiones pleurales fibpnosas Las lesiones al pulmón fueron firmes o moderadamente firmes, y fueron evidentes áreas enfisematosas y/o crepitosas El borrego que sobrevivió hasta el momento de la necropsia contenía aproximadamente 1 00 ce de efusión pleural y una gran masa fibrosa (aproximadamente 250 ce) ocupando el espacio pleural sobre los lóbulos central y cranial derecho Las lesiones al pulmón consistieron principalmente de consolidación fibpnosa firme en este animal De los 1 7 especímenes de pulmón cultivados, todos produjeron P haemolytica de tan poco como 2 5 x 104 CFU/g a 4 x 1 09 CFU/g La cuenta promedio geométrica para los cuatro anima les, que murieron agudamente fue 2 5 x 1 08 CFU/g , el borrego sobreviviente tuvo una cuenta promedio de 2 5 x 1 05 CFU/g Las torundas traqueales de los cuatro animales que murieron prod ujeron crecimiento pesado de P haemolytica El borrego sobreviviente produjo crecimiento ligero de su traquea Las torundas de h ígado de los cuatro animales y las torundas de riñon de dos de los an imales que murieron produjeron P haemolytica El borrego sobreviviente fue negativo en cultivo tanto en h ígado como riñon La serotipificación de aislados de pulmón reveló que las pocas colon ias recuperadas de vacunados eran de serotipo 5, excepto por el lóbulo accesorio activamente infectado de una cabré, que produjo cantidades ig uales de am bos seroti pos 5 y 6 Los animales de control tendieron a producir una mezcla de serotipos de cada lóbu lo, pero la mezcla vario ampliamente de lóbulo a lóbulo en los animales que murieron ag udamente (por ejem plo, 95% de serotipo 5 en el lóbulo cranial derecho a solo 5% de serotipo 5 en el lóbulo de caudal derecho) Los aislados recuperados de riñon o hígado tendieron a ser homogéneos con respecto al serotipo en cualquier animal dado, pero dos animales contenían serotipo 5 en estos tejidos y los otros dos contenían serotipo 6 La primera dosis de vacuna puede inducir una respuesta febril La carencia de una respuesta febril y respuesta inmune de ia segunda dosis impl ica que la inmunidad substancial es conferida por la primera dosis La seg unda dosis fue tratada aparentemente de forma rápida por el sistema inmu ne y no desarrolló suficiente masa antigén ica para provocar una respuesa anemnéstica La dosificación de organismos entretados en la vacun a (cerca de 1 08 CFU) puede haber excedido aquélla necesaria para conferi r suficiente inmunidad Normalmente, las vacunas vivas modificadas serían entregadas a una dosis menor, quizás 105 a 1 07 CFU La falla de la segunda dosificación de vacuna para estimular anticuerpo adicional , según se midió por IHA, puede indicar que dos dosis fueron innecesarias y que una dosis simple hubiera sido suficiente Las reacciones observadas en los sitios de inyección de vacuna fueron extremadamente menores y no involucraron tejido muscular, consistente con los hallazgos usando m utantes negativos de leucotoxina de serotipo 1 en reses Esto constrasta enormemente con ia resuesta de cepas positivas de leucotoxma suministradas mtramuscularmente a reses, que evidenci an grandes hinchazones y necrosis en el área , frecuentemente descu biertas a través de la piel subyacente Es probable que ocurrirá poca o ninguna reacción adversa local con una vacunación subcutánea o intradérmica, una alternativa que también puede tender a reducir la respuesta febril a la vacunación. De esta manera, la vacuna intramuscular polivalente provocó inmunidad marcada en borregos y cabras contra el reto polivalente. Las reacciones adversas se limitaron a respuesta febril después de la inyección , la cual podría controlarse por dosificación de vacuna reducida o una ruta alternativa de administración.

EJ EMPLO 3 Valoración de eficacia de vacuna en reses después de la administración oral y después de la inyección intramuscular Materiales y métodos Vacunación de animales. Se obtuvieron dieciséis terneras tipo lechería , aproximadamente 1 50 kg , de una lechería local y se alojaron en el National Animal Disease Center, Ames, IA. Las terneras fueron asig nadas aleatoriam iente a un g rupo de control de seis y dos grupos de vacu nados de 5. Cada grupo se alojó por separado bajo condiciones similares para prevenir el esparcimiento del organismo de vacuna entre grupos. A cada ternera en un grupo de vacunados se le administró de manera subcutánea en la región cervical media 1 ml de EBSS conteniendo 1 x 1 0' CFU de P. haemolytica serotipo 1 , m utante de supresión en-marco NADC D 1 53?lktA en el d ía 0 Estas terneras fueron revacunadas de m anera si m i lar con 7 0 x 1 06 CFU en 1 ml de EBSS en el d ía 21 . El otro grupo de vacunados fue alimentado con una ración peletizada (Growena, Ralston Purina, St. Louis MO) sobre la cual se vaciaron 50 ml de volumen total de un cultivo de caldo fresco conteniendo 1 x 109 CFU/ml de mutante de supresión en-marco NADC D 1 53?lktA en el d ía 0. Las terneras se alimentaron de manera similar con 50 ml de 7 x 108 CFU/ml en el día 21 . En el día 28 todas las terneras fueron retadas intratraquealmente con 25 ml de P. haemolytica padre en EBSS a 2 x 1 07 CFU/ml, usando un catéter colocado en la bifurcación traqueal. El reto fue seguido con 25 ml de EBSS estéril. A las terneras que sobrevivieron el reto se les aplicó la eutanasia 4 o 5 d ías después del reto y se sometieron a necropsia. Bacteria. Se hicieron crecer Pasteurella haemolytica cepa NADC D 1 53 y su mutante de leucotoxina en caldo Columbi a aproximadamente 2.5 horas a fase log media, aproximadamente 1 x 1 09 CFU/ml. El crecimiento fue diluido 1 00-veces en EBSS para inyección o 50 veces para reto. El crecim iento fue usado sin lavar y sin diluir para administración oral. Todas las preparaciones fueron mantenidas en hielo antes de la inoculación al anim al . Muestras y recolección de datos. Los sueros fueron recolectados 3 días antes del día de la primera vacunación , 3 sem anas después , el día de exposición al reto, y el día de la necropsia . Se registraron las temperaturas rectales durante 3 días después de cada vacunación y dos veces al d ía desde la exposición a reto hasta la necropsia . Las marcas clínicas fueron valoradas subjetivamente en el mismo programa que las temperaturas rectales, con base al grado de depresión y apetito.

En la necropsia, se obtuvieron especímenes de pulmón y se trató como se describió en el Ejemplo 2 anterior. Procesamiento de la muestra. Los sueros fueron probados por anticuerpo de P. haemolytica por IHA contra serotipo 1 y por neutralización de leucotoxina usando células BL-3 y colorante MTT. Los especímenes de pulmón fueron pesados y se adicionó EBSS para llevar el volumen de tejido más fluido a 1 0 veces el peso. Los especímenes fueron molidos para producir una suspensión homogénea y se hicieron diluciones de diez veces en EBSS. Las diluciones (100 ml) se esparcieron sobre placas de base de agar en sangre conteniendo 5% de sangre bovina defibrinada, que fueron incubadas durante la noche a 37°C. Las colonias exhibiendo morfolog ía normal de P. haemolytica fueron enumeradas y, donde estaban disponibles , 1 0 colonias representativas fueron serotipificadas usando antisuerpos específicos. Las torundas se rodaron sobre una mitad de las placas de agar de sangre fresca y entonces cada lado de un rizo estéril fue usado para rayar semi-cuantitativamente para aislamiento sobre los dos cuartos restantes de manera consecutiva.

Res u ltados N o h u bo reacción local pal pable o vis i ble sig u iendo cualq u ier vacu nación parenteral. Ninguna de las terneras exhibió una respuesta febril después de la primera vacunación parenteral u oral. Una ternera parenteralmente vacunada exhibió fiebre transiente (1 día) de 40.4°C después de la segunda dosis, no se notó reacción adversa alguna con cualq uiera de las terneras restantes.

Antes de la vacunación , los animales tuvieron un título de I HA bajo contra P haemolytica serotipo 1 (Tabla 3) Después de la primera vacunación, el título de anticuerpo en las terneras alimentadas con la vacuna aumentó al menos 8 veces sobre sus títulos de prevacunación La segunda dosis oral no aumentó, y en algunos casos los títulos cayeron 2-veces Los títulos de terneras parenteralmente vacunadas aumentó solo aproximadamente 2-veces después de la primera dosis de vacuna, durante la cual ocurrieron incrementos de tiempo similares a título en las terneras de control La segunda dosis de la vacuna parenteral provocó respuesta de anticuerpo adicional en los vacunados parenterales, seroconvirtiendo (incremento de 4-veces) 3 de estas 5 terneras Los títulos de neutralización de leucotoxina fueron relativamente altos en la mayoría de las terneras antes de la vacunación (Tabla 3) Dos terneras oralmente vacunadas se seroconviertieron después de la primera dosis de vacuna En total , los títulos de antileucotoxina se incrementaron en ambos grupos vacunados en sangrados sucesivos Los títulos de antileucotoxina de terneras de control tendieron a disminuir en sangrados sucesivos Siguiendo el reto, algunos, pero no todos, los vacunados parenterales mostraron fiebre por debajo de 41 °C , los vacunados orales s iguieron siendo afebples Todos los vacunados permanecieron alertas y alimentándose Un animal de control murió el tercer d ía después del reto Otro fue sometido a eutanasia en el d ía 3 casi moribundo Dos de las terneras de control restantes estaban deprimidas y no se alimentaban, y siguieron con fiebre hasta la eutanasia en el d ía 4 o 5 Una de estas terneras estaba echada y apaleada en el momento de la eutanasia. Las dos terneras de control restantes se volvieron afebriles el tercer d ía después del reto. Recuperaron el hambre y se consideraron alertas. El volumen de lesión al pulmón , corregido por capacidad de ventilación de cada lóbulo, promedió 4.4% para animales vacunados oralmente, 7% para aquéllas vacunadas de manera subcutánea , y 32% para controles sin vacunar (Tabla 4). Las lesiones de ambos grupos vacun ados fueron predominantemente suaves, consistentes con atelectasis. Se notaron áreas localizadas de consolidación firme en 2 de las terneras vacunadas oralmente y 4 de los vacunados parenterales, con pleurilitis limitada y adhesiones pleurales moderadas en dos animales de cada grupo. Estas áreas firmes estaban confinadas a fracciones de lóbulos de pulmón simples en cada caso. Los controles sin vacunar tuvieron lóbulos de pulmón múltiples, los cuales conten ían un porcentaje substancialmente mayor de envolvimiento con consolidación firme, fibrinosa, asociada con edema y pleuritis fibrinosa extensa. Tres de los seis animales de control contenían una gran cantidad de efusión pleural. El cultivo bacteriano de especímenes mostró que 2 terneras vacun adas oralmente y una ternera vacunad a parenteralmente fueron de cultivo negativo en todos los lóbulos probados. Los vacunados restantes tendieron a tener uno o dos especímenes, los cuales produjeron cantidades substanciales de P. haemolytica, hasta 5 x 1 07 CFU/g. Los lóbulos restantes fueron ya sea negativos en cultivo o contenían bajas cantidades de P. haemolytica, aproximadamente 1 03 CFU/g. Los animales de control sin vacunar produjeron especímenes múltiples con altos números de P. haemolytica sobre 107 CFU/g con muchos entre 1 09 y 1 010 CFU/g . Las torundas nasales produjeron P. haemolytica de 1 ternera vacunadas parenteralmente y 4 terneras de control . Las torundas traqueales fueron de cultivo positivo para P. haemolytica en 4 terneras de control , 1 de las cuales fue de cultivo nasal negativo. El fluido pleural fue de cultivo positivo en 3 terneras de control . Todos los vacunados fueron de cultivo negativo de traquea y fluido pleural. No se recuperó nada de P. haemolytica de hígado o riñon de cualquiera ternera. Todas las P. haemolytica fueron ß-hemol ítica y aquéllas probadas fueron serotipo 1 . De esta manera, la vacunación con la P. haemolytica viva modificada contra reto vi rulento, ya sea q ue la vacu na haya sido administrada de manera sucbutánea u oral después de aderezar el alimento. Las reacciones adversas a la vacunación se limitaron a un animal exhibiendo u na fiebre transiente después de la segunda inyección subcutánea de vacuna. No hubo irritación local o hinchazón evidentes ni anormalidades postmortem en el sitio de inyección y no se notaron anormalidades clínicas en ning ún an imal, ya sea de vacuna inyectada o al imentad a . La dosificación de vacuna usada para inyección fue aproximadamente 4-veces menor que la usada en el Ejemplo 2, anterior. La seroconversión por I HA fue impresionante para animales oral mente vacunados. El título de todos los animales aumentó al menos 8-veces después de la primera exposición . Fue menos impresionante la seroconversión después de la inyección subcutánea. Ningún animal se seroconvirtió después de la pri mera dosis y solamente 3 de 5 se seroconvirtieron después de la seg unda dosis . Se encontró que el proced imiento de I HA fue útil como una medida para animales antes de la experiencia con P haemolytica de serotipos específicos (10-1 3) Sin embargo, su utilidad para predecir la resistencia a la enfermedad no está clara ( 1 4-16) Aunque algunos investigadores encuentran una correlación entre los títulos IHA y la enfermedad, otros no encuentran ninguna Si uno asume que los antígenos específicos de serotipo empleados en el procedimiento de IHA no son aquéllos involucrados en la protección humoral, puede explicarse la discrepancia La vacunación podría producir una respuesta a I HA sin protección significativa o, a la inversa, producir poca respuesta a IHA pero protección substancial En cualquier caso, no es sorprendente que la exposición oral produciría una buena respuesta, asumiendo que tal exposición es suficiente para calificar como "experiencia previa" La vacunación subcutánea, mientras que es aparentemente efectiva, produjo una respuesta de I HA relativamente menor Nuestro experimento anterior en pequeños rum iantes usando inyección I M resultó en respuestas de IHA substanciales a ambos serotipos 5 y 6 de P haemolytica Tal vez la ruta de exposición dirigió lo anterior a una respuesta principalmente mediada por células y lo último a una respuesta más humoral Los títu los de anti leucotoxina no fueron notables en cu alqu ier g ru po, ya que solo 3 de 10 animales vacunados se seroconvirtieron después de la vacunación Sin embargo, los títulos de antileucotoxina fueron substanciales antes de la vacunación , y pueden haber contribuido a una respuesta disminuida Estos títulos pre-existentes pueden haberse debido a una colonización previa por el serotipo 2 de P haemolytica, el comensal más com ún de P haemolytica en pasos nasales de terneras De manera alternativa, es posible que la replicación de P haemolytica después de la vacunación no fuera grande, quizás debido a que las bacterias fueron manejadas fácilmente por el sistema inmune, y en consecuencia se elaboró poca masa antigénica de leucotoxina Finalmente, existe la posibilidad de que la prote ma de leucotoxina alterada, aunque diseñada para dejar epitopes inmunodominantes, no es particularmente experta en estimular una respuesta neutralizante aún si es inmunogénica Sin embargo hay un poco de duda de que algo de anticuerpo neutralizante de leocutoxina fue producido en respuesta a la vacunación Las áreas grandes múltiples de consolidación de pulmón firme en animales sin vacunar en necropsia y la concentración relativamente grande de P haemolytica en aquéllas áreas, indican una infección activa que se esparce desde el sitio inicial de inoculación En contraste, los vacunados (excepto los 3 con pulmones esencialmente limpios, de cultivo negativo) tuvieron áreas relativamente más pequeñas de consolidación confinadas a lóbulos de pulmón simples, que contenían cantidades moderadamente altas de P haemolytica Otros lóbulos de estos animales fueron ya sea de cultivo negativo o conten ían cantidades bajas a moderadas de bacterias Estos datos pueden indicar que la infección fue principalmente activa en el sitio de inocul ación y las bacterias estaban teniendo dificultad para establecerse en otras porciones del pulmón Los resultados de cultivos de especí menes traqueales podrían soportar esa conclusión , ya q ue 4 de los 6 an i males de control pero n inguno de los vacunados produjeron P haemolytica de esta fuente, lo cual indica que la infección no estaba bien contenida en la mayoría de los controles A partir de los datos está claro q ue tanto la administración subcutánea como la administración oral de la vacuna viva modificada fueron de beneficio significativo para los animales retados intratraquealmente con P haemolytica tipo natural, serotipo 1 La manipulación de la dosificación o uso de inyecciones intramusculares pud ieran mejorar adicionalmente la eficacia de las vacunas administradas parenteralmente La vacuna adm inistrada oralmente fue marcadamente eficaz La dosis necesaria en este caso es probablemente algo de nivel de umbral , que es suficiente para provocar una colonización del tracto respiratorio superior o am ígdalas palatinas Aunque concebible , es poco probable que la dosificación fuera efectiva debido al paso hacia el sistema gastrointestinal Aun 1 01 0 CFU de P haemolytica que pasa hacia el rumen seri a un número relativamente pequeño de organismos, y la posibilidad de que estas bacterias pudieran competir contra el rumen o flora intestinal y se m ultiplicaran es remota Aún asi, si el intestino fuera a responder y existiera u na enlace del sistema inmune de la mucosa en las reses, uno podrí a esperar que la respuesta fuera benéfica Estas posibilidades pudie ran ser investigadas usando P haemolytica genéticamente marcada, tal como una cepa resistente a la pfampicina para la cual se puede detectar la colon ización con gran sensibilidad (7 1 1 ) La teoría detras de la vacu na oral es q ue los animales naturalmente infectados con P haemolytica serotipo 1 , desarrollan resistencia a la colonización nasal subsecuente por organismos de serotipo 1 Tam bién desarrollan anticuerpos sistémicos contra P haemolytica y, de manera variable, contra leucotoxina U n organismo avirulento, el cual es hábil en la colonización de pasos nasales o am ígdalas palatinas , podría provocar resistencia similar o resistencia a reto pulmonar sin la posibilidad de provocar pasteurelosis neumónica Incluso es posible que pudiera ocurrir la protección pasiva en algunos casos por exclusión competitiva de P haemolytica virulenta La entrega por transporte en alimentos es posible debido a que las amígdalas palatinas sostienen colonización de largo plazo por P haemolytica (1 d, 1 9) Estos sitios también están en la trayectoria del alimento que entra Frecuentemente los al imentos en curso, tales como, tallos de heno, son encontrados dentro de los senos mayores de las am ígdalas palatinas, ind icando que la exposición al alimento es significativa Conducimos experimentos preliminares para probar la capacidad del al imento para entregar P haemolytica a am ígdalas palatinas o pasos nasales usando una cepa resistente a la pfampicina de P haemolytica Las terneras administradas con alimento infectado fueron colonizadas en am bas am ígdalas y en los pasos nasales En resumen , la protección contra el reto virulento fue conferido por admi n istración subcutánea u oral de una vacuna de P haemolytica viva m od ifi cad a En este experimento , la administración oral provocó mayores respuestas de anticuerpos y protección ligeramente mayor Un beneficio de potencial adicional de vacunación vía alimentación es que las terneras no necesitarí an ser atrapadas para ser vacunadas , reduciendo con ello la tensión tanto para la ternera como para el operador. Una advertencia potencial es que al menos algunas terneras deben comer o al menos pacer a través del alimento inoculado para ser colonizadas. Las terneras que no consumen el alimento pueden volverse inmunes posteriormente después de la exposición a terneras que si lo consumieron .

EJEMPLO 4 Valoración preliminar de seguridad y eficacia de vacuna administrada oralmente para terneras que ya están en los canales de comercialización normales Este experimento fue diseñado para probar la eficiencia de una vacuna pulmonar experimental producida por personal en Texas A & M U niversity. Dentro de ese experimento, y balanceado entre los grupos de terneras utilizadas por Texas A & M, estaba nuestro experimento más peq ueño involucrando 1 d cabezas de ganado . Nuestro experimento fue diseñado para ver si alimentar nuestra cepa de vacuna a terneras en las etapas tempranas de los canales de comercialización normales resultaría en colonización, produciría una respuesta inmune y posiblemente reduciría la incidencia de fiebre de embarque. Se condujo un experimento de campo en el otoño de 1 997 con 1 05 terneras 'steer' (promedio 207 kg) proporcionadas de establos de venta local por un 'Order-Buyer' en el este de Tennesse. Aunque el objetivo princi pal del experimento era probar una vacuna experimental por Texas A&M U niversity, 1 d terneras fueron alimentad as con el m utante de leucotoxina en-marco 4 d ías antes del embarque a un 'feedlot' en Texas a aproximadamente 1 600 km de distancia. El d ía después de la compra, las terneras llegaron a un establo order-buyer donde fueron marcadas en las orejas , se vacunaron contra clostridia, rinotraqueitis bovina infecciosa y virus de parainfluenza-3, se desparasitaron con ¡vermectina y se caparon mediante fajado. Se recolectó sangre para suero, se registraron las temperaturas rectales y se recolectaron especímenes de mucosa nasal. Las terneras con números nones fueron vacunadas con la preparación experimental de Texas A&M . Las terneras con número nueve non y nueve par se separaron en un corral de aproximadamente 6.096 m por 1 2. 1 9 m , que contenían litera de alimento de 3.65m y una fuente de agua fresca. Se vació una suspensión de NAD-CD 1 53?lktA de P. haemolytica (100 ml) sobre 35 kg de una ración para ternera comercial (Growena, Ralson Puri na, St. Louis MO) y 1 5 kg de heno fresco. La bacterias se hicieron crecer en 10 placas de agar Columbia durante la noche a 37°C después de esparcir inoculo para crecimiento confluente. El crecimiento fue recolectado en EBSS a una densidad de aproximadamente 2 x 1 09 CFU/ml y la suspensión resultante fue colocada en hielo hasta que las terneras fueron introducidas al corral , sobre lo cual se aderezó el alimento anterior con 1 50 ml. Cuatro d ías después de la administración de la vacuna , las terneras fueron cargadas en un camión y se transportaron a Bushland, Texas, donde un campo de alimentación experimental está operando conj u ntamente por la USDA Agricultural Research Service y por Texas A&M University. Sobre la lleg ada , al siguiente día las terneras parecían exha ustas, como es normal con un embarque de esta distancia. Las terneras se hicieron correr a través del conducto y se registraron las temperaturas rectales. Las terneras fueron sorteadas en 6 grupos y se permitió que descansaran durante la noche. Al siguiente día, las terneras se hicieron correr nuevamente a través del conducto. Se recolectaron sangre y mucosa nasal, se registraron las temperaturas rectas y se tomaron los pesos. Muchas de las terneras tenían fiebre (sobre 40°C) con descarga nasal y deposiciones sueltas. Se usó el protocolo para tratar terneras con fiebre de embarque con antibiótico en el segundo día consecutivo de fiebre usando tilmicosin (Micotil , Eli Lilly, Indianapolis, IN). Las terneras que no respondieron dentro de 2 días de tratamiento tuvieron que ser tratadas con tetraciclina de larga actuación (LA-200, Pfizer I nc. , Nueva York NY) . Se estimó conveniente, considerando el número de terneras calientes, hacer correr todas las terneras a través del conducto diario durante 4 días para reg istrar todas las temperaturas rectales Entonces se recolectaron seman almente suero, mucosa nasal , peso y temperaturas rectales (conta ndo desde día después de la llegada) por 4 semanas, como se describió antes. El segundo d ía después de la lleg ada , se trataron 55 terneras usand o tilmicosin. Las terneras adicionales fueron tratadas subsecuentemente hasta 22 días después de la llegada, llevando el número total tratado a 64% de animales sobrevivientes. Diez animales totales murieron dentro de 4 días de llegada , 6 con producto de Texas A&M y 4 no vacunados No murió ningún animal proporcionado con la vacun a oral Las observaciones postmortem revelaron neumon ía fibrinosa en los diez animales muertos, y P. haemolytica se recuperó de todos los pulmones junto con P. multocida en unos cuantos pulmones. La serotipificación de aislados pulmonares reveló que 9 terneras murieron de pasteurelosis por serotipo 1 y 1 ternera por serotipo 6. No hubo diferencias estadísticamente significativas en morbidez (como es juzgada por tratamiento) entre los animales vacunados oralmente, los vacunados con Texas A&M, o de control (78%, 84% y 87%, respectivamente), ni fue la diferencia en mortalidad significativa (1 1 .5% de terneras no vacunadas oralmente versus 0% de terneras vacunadas oralmente, p>0.05) . Los títulos de anticuerpos (medidos por IHA contra serotipo 1 de P. haemolytica. ) aumentó significativamente (p<0.01 ) entre las muestras tomadas en el establo order-buyer y aquéllas tomadas en la llegada en el cam po tanto para terneras vacunadas oralmente y vacunadas con Texas A&M y se compararon con no vacunados. En total, las terneras ganaron 29 kg entre la compra y la terminación del experimento después de 28 d ías en el campo. Un grupo, terneras oralmente vacunadas que no recibieron la vacuna de Texas A&M, ganaron significativamente más peso que cualquier otro grupo (p<0.01 , n=o) a 40.2 kg. Todos los demás grupos no difirieron sig nificativamente en este parámetro. Se recuperaron P. haemolytica serotipo 1 y, a un menor g rado, serotipo 6 de mucosa nasal de la mayoría de las terneras una o más veces en el campo. Los grupos no difirieron significativamente para alojar el organismo . Alg unas terneras, pero no todas , que recibieron la vacuna oral alojaron el organismo mutante en uno o más especímenes de mucosa nasal durante la primera semana en el estable, indicando que el inoculo fue suficiente para colonizar sus tractos respiratorios superiores bajo estas condiciones Este experimento demostró que nuestra vacuna oral experimental puede entregarse en el alimento en un estable order-buyer antes del em bargo al campo y por lo tanto, puede colonizar y provocar una respuesta in m une dentro de 1 semana La morbidez y mortalidad en el presente experimento fueron inusualmente altas Además de los frecuentes aislamientos de P haemolytica, fueron comunes los aislamientos de coronavirus respiratorio y P multocida El número de terneras que requirieron retratamiento también fue inusual , sugiriendo que las bacterias diferentes a P haemolytica jugaron un papel significativo en el rom pim iento Tilmicosin es un antibiótico con un espectro estrecho de actividad, enfocado y recomendado principalmente para combatir P haemolytica Dado q ue son frecuentes las bacterias diferentes a P haemolytica y virus, tales como coronavirus respiratoria, no es particularmente sorprendente q ue las vacunas monovalentes contra P haemolytica no reduzcan significativamente la morbidez Sin embargo, ninguna de las terneras vacu n adas oralmente sucumbió a pasteurelosis neumónica comparada con 1 1 5% de las demás, sugiriendo que la vacuna jugo un papel en la reducción de la mortalidad La ganancia de peso substancialmente mayor de terneras a las que se les proporciono la vacuna oral, soporta ademas la conclusión de que la vacuna red ujo la enfermed ad en estas terneras La ad m i n istración del producto de Texas A&M ju nto con la vacuna oral puede haber resultado en una reducción en la respuesta de uno o ambos productos o en respuestas perjudiciales para la resistencia a la enfermedad y con ello, reducir el beneficio conferido por la vacuna oral sola.

EJEMPLO 5 Capacidad de la supresión en-marco de leucotoxina de seroti po 1 de P. haemolytica para colonizar los pasos nasales de terneras tensionadas por infección con virus de herpes bovino tipo 1 concu rrente La Pasteurella haemolytica serotipo 1 es recuperada esporádicamente en cantidades relativamente bajas de especímenes de mucosa nasal de terneras saludables normales. Después de la tensión o infección viral respiratoria, la P. haemolytica serotipo 1 puede proliferar de manera explosiva en los pasos nasales para volverse la flora predominante. Cantidades muy altas de bacterias son alojadas en la mucosa nasal de tales terneras. Se cree que estos números altos de bacterias son in haladas o aspiradas hacia el pulmón susceptible para resultar en pasteurelosis neumónica . Así, este experimento fue diseñado para obtener datos preliminares ya sea en mutantes de supresión de leucotoxina de P. haemolytica pueden colon izar pasos nasales bajo estas condiciones y, si es así , si pud ieran excluir competitivamente la colon ización por P. haemolytica tipo natural. Se usaron ambos organismos de serotipo 1 y serotipo 6 debido a q ue se sabe que ambos provocan neum on ía fibrinosa fatal en terneras .

Materiales y métodos Vacunación de animales Ocho terneras tipo lechería, cruzadas, aproximadamente 150 kg , se compraron a una lechería local y se mantuvieron en NADC Las terneras se separaron aleatoriamente en 2 grupos de 5 cada uno, de manera que no ocurriera contacto alguno entre los grupos Se permitió que las terneras se aclimataran durante 1 0 días antes de la iniciación del experimento Se convirtió en aerosol virus de pnotraqueitis bovina infeccioso (cepa Coopers , amablemente proporcionado por National Vetepnary Services Laboratories) en cada fosa nasal de la ternera en inspiración, de acuerdo con instrucciones porporcionadas por NVSL para reto, resultando en una dosificación final de 109 4 TCID50/fosa nasal Después de la exposición a virus, un g rupo de 4 terneras fue alimentado con un concentrado de alimento apetitoso sobre el cual se vaciaron 1 0 ml/ternera de una suspensión mezclada de P haemolytica D 1 53?lktA y D 1 74?lktA (serotipos 1 y 6, respectivamente) a 2 x 1 09 CFU total/ml Ei otro grupo fue alimentado con una ración sin inocular Cinco días después de la exposición al virus, el grupo alimentado fue expuesto por inyección mtranasal a 1 5 ml/fosa nasal de P haemolytica (mezcla como la anterior) a 2 7 x 1 08 CFU total/ml Seis días después de la exposición al virus , todos los grupos fueron expuestos por inyección intranasal a una mezcla de P haemolytica D 1 53 y D 174 tipo natural a 5 x 1 08 CFU total/ml Recolección y análisis de muestras Se recolectaron especímenes de m ucosa nasal en el d í a de la exposición al virus y los días 3, 4, 5, 6, 7 y 1 0 después de la exposición al virus Se recolectó suero el d ía de la exposición y 10 d ías después En el día 10 después de la exposición al virus , todas las terneras fueron sometidas a eutanasia y los pulmones fueron examinados groseramente Las temperaturas rectales fueron registradas diario desde el día de la exposición al virus hasta la eutanasia Se probó el suero por anticuerpo tanto contra P haemolytica serotipo 1 como serotipo 6 por IHA Se diluyó la mucosa nasal en incrementos de 1 0-veces y se esparció sobre placas de base de agar de sangre conteniendo 5% de sang re bovina defibpnada Después de la incubación durante la noche Se identificaron y se enumeraron P haemolytica y se serotipificaron 20 colonias representativas mediante un procedimiento de aglutinación de placa rápido Res u ltados La mayoría de las terneras ten ían fibre dentro de 3 d ías de la expos ición al virus y las fiebres pico ocurrieron el día 4 a 40 5°C Solamente 3 terneras permanecieron febriles más de una semana y todas se volvieron afebples por 1 0 días después de la exposición al virus Todas las terneras fueron de cultivo negativo para P haemolytica en la mucosa nasal el día de la exposición al virus Una ternera alimentada con mutantes de leucotoxina de P haemolytica alojo organismos de seroti po 1 no hemol íticos en sus especímenes de mucos nasal i niciando 3 d ías después de la exposición al virus y continuó alojando mutantes de leucotoxina hasta la eutanasia Las 3 terneras alimentadas restantes siguieron siendo de cultivo negativo para P haemolytica hasta el día 6, un d ía después de la exposición intranasal a la mezcla de mutantes de leucotoxina Estas terneras alojaron P haemolytica no hemol ítica en los días 6, 7 y, con una excepción, el día 10 (Tabla 5) Las terneras no expuestas deliberadamente a P haemolytica hasta el d ía 6 siguieron siendo de cultivo negativo para el organismo hasta el día 7, sobre el cual alojaron mezclas, con una excepción el d ía 1 0 , de P haemolytica hemol itica serotipo 1 y serotipo 6 Tres animales expuestos a P haemolytica mutante se seroconvirtieron (4-veces o aumento mayor en título) a ambos serotipos 1 y 6 entre el tiempo de la exposición al virus y la eutanasia El cuarto animal tuvo un incremento de título de dos veces contra ambos serotipos Los animales restantes incrementaron 2 veces o mantuvieron un título constante durante ese periodo Los pulmones a postmortem fueron en su mayoría no notables La ternera 30, no expuesta a mutantes de leucotoxina, tuvo consolidación firme a lo largo de su mitad de caudal derecho del lóbulo central con 5% de envolvimiento de la mitad cranial Las terneras 1 7 y 1 8 tuvieron lesiones menores de consolidación involcurando 5% o menos de 2 y 3 lóbulos pulmonares respectivamente No se notaron anormal idades en las terneras restantes Los mutantes de leucotoxi na de Pasteurella haemolytica fueron capaces de colonizar los pasos nasales de terneras que fueron infectadas concurrentemente con virus I BR Tal colonización no evitó o incluso redujo la su pepnfeccion experimental con P haemolytica tipo natural J uzgando por cifras de P haemolytica alojadas en la mucosa nasal , parece que los mutantes de leucotoxina fueron menos fuertes en la colonización nasal Las bacterias de tipo natural colonizaron a niveles de aproximadamente 1 0-veces mayores que los mutantes, ya sea por sí mismos o juntos No obstante, los m utantes de leucotoxina fueron capaces de mantener un nivel substancial de colonización aún en la presencia de P haemolytica tipo natural , indicando que las bacterias todavía eran bastante fuertes De hecho, mezclas de cepas padre tipo natural y mutantes de leucotoxina pasadas m vitro en caldo Columbia por 1 00 generaciones, resultaron en una población ligeramente enriquecida por mutantes de leucotoxina, indicando que los mutantes de leucotoxina compiten muy bien con el tipo narual bajo aquellas condiciones No se sabe si es posible superponer infección con mutantes de leucotoxina en la cara de colonización substancial por P haemolytica tipo natural Tal vez los mutantes de leucotoxina mantuvieron su infección debido a que ya tenían un apoyo en la nasofapnge N uestro trabajo previo con infecciones de P haemolytica usando un modelo de virus I BR indica que la infección bacteriana de la nasofapnge (específicamente, las am ígdalas palatinas) no se traduce necesariamente en colon ización explosiva de los pasos nasales Algunas terneras, que son portadores conocidos de P haemolytica serotipo 1 en las am ígdalas palatinas fallaron en volverse colonizadas en los pasos nasales aún cuando los pasos nasales fuera susceptibles, como se demostró por la inocu lación i ntranasal Otras terneras similares de estado portador probable pero no confirmado, se volvieron colonizadas bajo condiciones similares Esta supuesta paradoja la infección en la faringe que puede extenderse o no en pasos nasales susceptibles, adyacentes, no es fácil de explicar Quizás el flujo ciliar de los pasos nasales porta material tanto hacia delante, fuera de los orificios de la nariz, como hacia atrás hacia la 5 orofapnge Los títulos de anticuerpo de suero tanto contra serotipo 1 como serotipo 6 aumentaron substancialmente en tres de las terneras alimentadas con mutantes de leucotoxina Debido a que las terneras fueron sometidas a eutanasia en el d ía 10, hubo poco tiempo disponible para una respuesta inmune en las 7 terneras que no colonizaron hasta el día 6 o 7 Por lo tanto, es probable que alimentar el organismo provocara o al menos facilitara u na respuesta inmune antes de la colonización nasal detectada Ambos serotipos 1 y 6 fueron recuperados de la mucosa nasal en ? > altas cantidades de cada ternera, muy frecuentemente como una infección mezclada con ambos serotipos En los dos casos, por el día 1 0, el seroti po 1 había crecido más que el serotipo 6 para volverse la flora predominante En un caso, el serotipo 6 se volvió la flora predom inante Estos resultados sugieren que el serotipo 6 es casi igual en su capacidad 0 para colonizar bajo las condiciones elegidas Dadas las observaciones de que esta cepa NADC D174 serotipo 6 provoca neumonía severa en terneras después de la inoculación intratraqueal, uno esperaría que la enfermedad respiratoria ocurriría en terneras bajo condiciones en el cam po De hecho, la P haemolytica serotipo 6 ha sido recuperada previ amente de pasos nasales de terneras en pruebas de campo y de pulmones de terneras que sucumbieron a pasteurelosis neumónica. Mientras que el serotipo 1 sigue siendo el aislado más común en tambos pasos nasales de terneras tensionadas y de pulmón neumónico, el serotipo 6 completa un porcentaje sig nificativo de aislamientos de P. haemolytica de la mucosa nasal o pulmón (aproximadamente 1 0%) bajo estas condiciones. De esta manera, los mutantes de supresión de leucotoxina en-marco de P. haemolytica son capaces de colonizar la nasofaringe de terneras hechas susceptibles con infección de virus I BR concurrente. Tal infección no fue suficiente para prevenir la colonización por P. haemolytica tipo natural. Alimentar los mutantes de leucotoxina a terneras concurrentemente con exposición a virus I BR permitió a una ternera a volverse colonizada a un alto nivel en sus pasos nasales y pareció resultar en la seroconversión a P. haemolytica en 3 de 4 terneras. Ambos serotipos 1 y 6 de P. haemolytica son capaces de colonización explosiva d urante la infección de virus respiratorio y cada uno lo hace en presencia del otro.

Tabla 1. Títulos de anticuerpo IHA contra Pasteurella haemolytica serotipos 5 y 6 y títulos de neutralización de leuctoxina antes y después de la vacunación. Primera dosis de vacuna en el día 0, 2a dosis en el día 21. Todos los animales fueron retados de manera intratraqueal con serotípos 5 y 6 tipo natural en el día 2d. n=5 por grupo. Día 0 Día 14 Día 28 Día 33 Serotipo 5 Vacunado 2.4 6.0 6.2 6.8 Control 1.2 1.8 2.6 8* Serotipo 6 Vacunado 1.4 6.2 6.2 6.8 Control O.d 1.4 1.4 6* Leucotoxina** Vacunado 0.4 3.0 3.4 -- *Un borrego sobreviviente, 4 animales murieron 2 días después del reto y no se evaluaron. **Los animales de control no se evaluaron Tabla 2. Registros de lesiones de pulmón y resultados de cultivos bacterianos pulmonares postmortem 5 días después del reto intratraqueal con Pasteurella haemolytica serotipos 5 y 6. (n = 5 para cada grupo, cifras expresadas ± 95% de intervalo de confianza) Porcentaje de lesiones de P. haemolytica promedio pulmón' geométrico en pulmón Vacunados 3.5 ± 2.8* 1 .2x1 01 ± 0.9x1 01 * Controles 52. 1 ± 21 .7 6.3x 1 07 ± 2.5x 1 01 *Significativamente diferente de los valores de control , p<0.001 **Porcentaje de envolvimiento de cada lóbulo estimado y multiplicado por la contribución de los lóbulos al intercambio de aire g lobal .

Tabla 3. Títulos de anticuerpo I HA contra Pasteurella haemolytica serotipo 1 y títulos de neutralización de leucotoxina antes y después de la vacunación. La primera dosis de la vacuna en el día 0, 2a dosis en el día 21 . Todos los animlaes fueron retados de manera intratraqueal con serotipo 1 tío natural en el d ía 23. (n=6 para controles y 5 para cada uno de los grupos vacunados) Día 3 Día 21 Día 28 Día 32 o 33 Títu lo I HA Vacunado I M 2.6 3.4 4.8 5.8 Vacunado oral 3.0 7.6 7.0 7.6 Control 2.2 3.3 3.5 5.8* Leucotoxina** Vacunado I M 6.8 6.8 7.4 7.8 Vacunado oral 6.6 7.8 7.4 8.0 Control 6.8 6.3 6.2 6.8* *Cuatro ternera sobrevivientes, 2 animales m urieron 3 d ías después del reto y no fueron evaluados.

Tabla 4. Registros de lesiones de pulmón y resultados de cultivo bacteriano pulmonar postmortem 4 o 5 días después del reto ¡ntratraqueal con Pasteurella haemolytica serotipo 1. (n=6 para controles y 5 para cada uno de los grupos vacunados, cifras expresadas ± 95% de intervalo de confianza) Porcentaje de lesiones P. haemolytica promedio pulmonares*** geométrico en pulmón Vacunado IM 7.0 ± 7.3* 1.8x102 ± 0.7x102 * Vacunado oral 4.4 ± 4.5** 1.4x102 ± 0.6x102 * Controles 32.0 ± 13.4 1.6x106 ± 1.0x1 O2 *Significativamente diferente de los valores de control, p<0.01 ^Significativamente diferente de los valores de control, p>0.02 ***Porcentaje de envolvimiento para cada lóbulo estimado y multiplicado por la contribución de los lóbulos al intercambio de aire global.

Tabla 5. Derrame de P. haemolytica en mucosa nasal de terneras infectadas con virus IBR en el día 0 Día 6 Día 6 Día 10 Ternera* Fenotipo** CFU/ml %St-1| CFU/ml %St-1 CFU/ml %St-1 Mutante 4.0x107 >95 4.0x106 50 1.0x108 >95 Tipo natural Ninguna -- 1.5x108 >95 2.0x108 80 19 Mutante 5.6x107 65 1.1x107 65 Ninguna -- Tipo natural Ninguna — 1.1x108 10 5.0x108 <5 28 Mutante 4.3x107 do 2.5x107 70 1.2x107 60 Tipo natural Ninguna -- 1.2x108 55 1.9x108 20 29 Mutante 1.6x107 >95 2.0x106 >95 4.0x106 >95 Tipo natural Ninguna — 6.0x107 15 1.3x108 >95 Tipo natural Ninguna -- 2.0x108 60 1.5x108 60 17 Tipo natural Ninguna -- 1.5x108 50 4.1x107 40 18 Tipo natural Ninguna — 2.0x108 10 2.0x108 >95 Tipo natural Ninguna — 2.8x108 30 6.0x108 30 *Las terneras 15, 19, 28 y 29 fueron expuestas a mutantes de leucotoxina de P. haemolytica de serotipo 5 y 6 intranasalmente en el día 5. Todas las terneras fueron expuestas a P. haemolytica serotipo 5 y 6, tipo natural, en el día 6. **Los mutantes de leucotoxina son no hemolíticos; el tipo natural exhibe ß-hemólisis. |20 colonias representativas serotipadas, cuando estuvieron disponibles.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Briggs, Robert E. Tatum, Fred M. <120> Mutante de supresión de LKTA de P. haemolytica <130>00295.75997 <140> <141> <150> 60/060,060 <151> 1997-09-25 <160> 2 <170> Patentln Ver.2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Pasteurella cf. haemolytica <400> 1 ccggatcccc aattcgtaga ggtttc 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Pasteurella cf. haemolytica <400> 2 ccggatccgc tgaaagcggt cggggg 26

Claims

REIVI N DICACION ES 1 Una bacteria P haemolytica, la cual a) expresa leucotoxina no biológicamente activa, b) expresa una forma de molécula de leucotoxina que induce anticuerpos, los cuales se unen específicamente a leucotoxina, y c) no contiene DNA extraño 2 La bacteria P haemolytica de la reivindicación 1 , en donde la forma de la molécula de leucotoxma expresada es un mutante de supresión 3 La bacteria P haemolytica de la reivindicación 2, en donde el mutante de supresión es aproxim adamente 66 kD 4 La bacteria P haemolytica de la reivindicación 2, en donde el mutante de supresión carece de los am inoácidos 34 a 378 5 La bacteria P haemolytica de la reivindicación 1 , en donde la bacteria es Ikt C+ 6 La bacteria P haemolytica de la reivindicación 1 , en donde el operón de leucotoxina no comprende genes de resistencia a antibióticos 7 La bacteria P haemolytica de la reivindicación 1 , la cual comprende una m utación en el gene estructural IktA', el cual codifica leucotoxina 8 La bacteria P haemolytica de la reivindicación 1 , en donde la bacteria com prende una mutación la cual es no-revertible, resultando dicha m utación en la inca pacid ad de la bacteria para expresar leucotoxina biológ i camente activa 9 U n método para inducir inm un idad a pasteurelosis neumónica en rum iantes com prendiendo el paso de administrar la bacteria de la reivindicación 1 a un rumiante, por lo cual se induce inmunidad. 1 0. El método de la reivindicación 9, en donde el paso de administración es vía la ruta oral. 1 1 . El método de la reivindicación 1 0, en donde la bacteria es aderezada en la parte superior del alimento del rumiante. 1 2. El método de la reivind icación 9, en donde el paso de adm inistración comprende inyectar la bacteria de manera subcutánea. 1 3. El método de la reivindicción 9, en donde el paso de administración comprende inyectar la bacteria de manera intradérmica. 14. El método de la reivindicación 9, en donde el paso de administración com prende inyectar la bacteria de manera intramuscular. 1 5. El método de la reivindicación 9, en donde el paso de adm inistración es vía la nariz. 1 6. Un alimento para rumiantes, el cual comprende la bacteria de la reivind icación 1 . 1 7. Una vacuna para reducir la m orbidez en rum iantes, comprendiendo: una bacteria P. haemolytica, la cual : a) expresa leucotoxina no biológicamente activa , b) expresa una forma de molécula de leucotoxina que induce anticuerpos, los cuales se unen específicamente a leucotoxina , y c) no contiene DNA extra ño. 1 8. U n plásm ido sensible a la tem peratura , el cual replica a 30°C pero no a 40°C en P. haemolytica y el cual tiene u n origen de repl icación del mismo grupo de incompatibilidad que el plásmido que ha sido depositado en ATCC con Acceso No. . 1 9. El plásmido sensible a la tem peratura de la reivindicación 1 6, el cual es el plásmido que ha sido depositado en ATCC con Acceso No. .