ES2824402T3 - Vacunas atenuadas contra Pasteurella multocida y procedimientos de fabricación y uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una cepa atenuada de Pasteurella multocida (P. multocida) para su uso en la provisión de una respuesta inmunitaria segura y eficaz en bovinos contra P. multocida o enfermedades causadas por P. multocida, caracterizada porque la cepa es la cepa depositada en la ATCC bajo la Designación de depósito de patente PTA-120624.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas atenuadas contra Pasteurella multocida y procedimientos de fabricación y uso de las mismas CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere generalmente a vacunas bacterianas atenuadas, particularmente a aquellas que proporcionan una protección amplia, segura y eficaz a los bovinos contra infecciones/enfermedades causadas por Pasteurella Multocida. En esta invención se describen procedimientos para producir las bacterias atenuadas y para la identificación de variaciones de ácido nucleico que están asociadas con una virulencia disminuida de las bacterias atenuadas.

[0002] Por consiguiente, la invención se refiere a composiciones inmunógenas o de vacuna que comprenden las bacterias de la invención; por ejemplo, bacterias vivas atenuadas. Las bacterias también podrían inactivarse en las composiciones; pero puede ser ventajoso que las bacterias sean bacterias P. multocida vivas atenuadas. También se describen en esta invención procedimientos para preparar y/o formular dichas composiciones; por ejemplo, cultivar o hacer crecer o propagar las bacterias sobre o en un medio adecuado, recoger las bacterias, opcionalmente inactivar las bacterias, y opcionalmente mezclar las bacterias con un portador, excipiente, diluyente o vehículo veterinaria o farmacéuticamente aceptable adecuado y/o un adyuvante y/o estabilizador. Por los tanto, también se describe en esta invención el uso de bacterias en la formulación de dichas composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] Pasteurella multocida es un anaerobio facultativo gramnegativo, inmóvil, en forma de bastón, que se aísla de una amplia gama de animales y aves de todo el mundo.

[0004] Los aislados de P. multocida se clasifican en cinco serogrupos (A, B, D, E y F) basándose en antígenos capsulares y 16 serotipos por antígenos somáticos (Rimler y Rhoades, 1989). El serogrupo A se asocia más comúnmente con el cólera aviar en aves, seguido del serogrupo D (Rhoades y Rimler, 1989). Entre los aislados, las cepas del serogrupo F se aíslan predominantemente de aves de corral y pavos, pero rara vez de terneros (Shewen y Conlon, 1993; Catry y col., 2005). En los cerdos, la rinitis atrófica y la neumonía se asocian principalmente con los serogrupos D y A, que expresan la toxina dermonecrotizante (Dungworth, 1985). Por otra parte, los serogrupos B y E de P. multocida suelen estar asociados con septicemia hemorrágica en ganado y búfalos de agua en las regiones tropicales y subtropicales de África y Asia (Carter y de Alwis, 1989; Rimler y Rhoades, 1989; Shewen y Conlon, 1993). Por el contrario, los serogrupos B y E de P. multocida son poblaciones de ganado rara vez aisladas de América del Norte (Confer, 1993). Más del 92% de P. multocida aislada del ganado de EE.UU. que causa bronconeumonía supurativa grave pertenece al serotipo A:3 (Ewers y col., 2006; Confer y col., 1996; Weekley y col., 1998). La infección por P. multocida en terneros da como resultado pérdidas de producción y mortalidad significativas (Ewers y col., 2006; Confer y col., 1996; Dalgleish, 1989; Weekley y col., 1998). Además, P. multocida se asocia a menudo con el complejo de enfermedad respiratoria bovina (BRDC) junto con Mannheima haemolytica e Histophilus somni. Desde 2001, la pasteurelosis neumónica bovina debida a la infección por P. multocida ha aumentado en la población bovina del Reino Unido. En muchos casos del Reino Unido, las infecciones por P. multocida excedieron el número de brotes causados por neumonía bacteriana bovina inducida por M. haemolytica (Veterinary Laboratories Agency, 2007). En todo el mundo, los aislados del serogrupo A de P. multocida son uno de los principales patógenos asociados con BRDC (Frank, 1989; Rimler y Rhoades, 1989).

[0005] Los aislados de P. multocida asociados con BRDC tienen numerosos factores de virulencia o virulencia potencial y asociados a la virulencia como adhesinas y hemaglutinina filamentosa, que ayudan en la adherencia y colonización, proteínas de adquisición de hierro y sistemas de transporte, enzimas extracelulares tales como neuraminidasa, endotoxina (lipopolisacárido, LPS), cápsula de polisacárido y una diversidad de proteínas de la membrana externa (OMP). La inmunidad del ganado contra la pasteurelosis respiratoria es poco conocida; sin embargo, algunos informes indican que los anticuerpos séricos elevados contra las OMP de P. multocida son importantes para aumentar la resistencia contra esta bacteria.

[0006] Actualmente hay algunas vacunas comerciales disponibles contra P. multocida para su uso en ganado. Estas vacunas son predominantemente bacterinas tradicionales y un mutante vivo dependiente de estreptomicina. Sin embargo, la eficacia de campo de estas vacunas es cuestionable y ninguna de las vacunas ofrece una protección fiable. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de vacunas seguras y eficaces para proteger al ganado contra las infecciones por P. multocida.

Revisión del estado de la técnica

[0007] Intervet (Merck Animal Health) produce una vacuna contra P. multocida con el gen hyaE eliminado. Por el contrario, la presente vacuna contra P. multocida descrita es un mutante de deleción del gen hyaD. HyaD es un gen diferente en el mismo locus, y aunque ambas deleciones génicas dan como resultado un fenotipo acapsular, un experto no podría haber predicho antes de esta descripción si la deleción del gen hyaD daría como resultado un fenotipo acapsular viable y estable. Además, según el documento US 7351416 B2 (Ejemplos 3 y 4), la vacuna AhyaE puede administrarse a novillos (que pesen aproximadamente 500 libras), o terneros de 2-3 meses (que pesen más de 150 libras). Por el contrario, el animal objetivo para las vacunas de la presente divulgación son terneros de 4-6 semanas de edad y que pesan significativamente menos. Las respuestas inmunitarias de los animales muy jóvenes son significativamente diferentes a las de los más mayores. Además, la seguridad de la vacuna es de suma importancia cuando se usa en terneros jóvenes.

[0008] El documento EP1831248B1 (de Intervet) describe una P. multocida mutante generada por transposón, que no está dirigida ni es específica de sitio. No es probable que las agencias reguladoras aprueben las bacterias que albergan dichas inserciones de transposones para su uso en vacunas, por lo que la descripción de estos tipos de mutaciones puede considerarse de forma justa como un trabajo preliminar que conduce a la modificación génica dirigida, incluida la deleción. El gen mutante se informa como "ORF 15", que es un inhibidor de lisozima unido a membrana de la lisozima de tipo c. Finalmente, la exposición a la vacunación se realizó en aves de corral en lugar de terneros.

[0009] El documento WO2003086277A2 (de Merial) describe P. multocida 1059 atenuada. Las deleciones génicas se produjeron inicialmente usando mutagénesis etiquetada con firma aleatoria usando el transposón Tn5. Junto con muchos mutantes específicos y no específicos, esta biblioteca tiene mutantes que carecen de los genes PhyA, hyaC y hyaE que están involucrados en la biosíntesis capsular. Sin embargo, estos mutantes se generaron mediante mutagénesis aleatoria y su estabilidad genética no se ha probado durante un largo periodo. Esta es una propiedad crítica para que una vacuna se utilice como producto vivo modificado en condiciones de campo. Además, P. multocida 1059 es una cepa aviar inadecuada para la vacunación de terneros.

[0010] El documento WO2002075507A2 describe la identificación de cepas de P. multocida atenuadas en genes de virulencia y el uso de estas cepas atenuadas para la vacunación de ratones.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0011] La presente invención proporciona una composición que comprende una cepa atenuada de Pasteurella multocida (P. multocida) para su uso en la provisión de una respuesta inmunitaria segura y eficaz en bovinos contra P. multocida o enfermedades causadas por P. multocida, caracterizada porque la cepa es la cepa depositada en la ATCC bajo la Designación de depósito de patente PTA-120624.

[0012] Un objeto de esta descripción es proporcionar bacterias atenuadas, así como procedimientos para el tratamiento y profilaxis de la infección por P. multocida.

[0013] La presente descripción se refiere además a vacunas de campo eficaces que comprenden cepas atenuadas de P. multocida para su uso como vacunas en ganado. Las cepas mutantes según la presente descripción pueden presentar una expresión reducida o nula de los genes hyaD, nanPU, o ambos. Además, en esta invención se describen procedimientos para producir las bacterias atenuadas, así como procedimientos para proporcionar inmunidad al ganado, incluida inmunidad protectora, contra infecciones posteriores. También se proporcionan kits que comprenden al menos la cepa atenuada de P. multocida y las instrucciones de uso.

[0014] Estas y otras realizaciones se describen o son obvias a partir de y están incluidas por la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0015] Una descripción completa y habilitante de la presente invención, incluido el mejor modo de la misma, para un experto en la técnica, se expone más particularmente en el resto de la memoria descriptiva, incluida la referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 es un diagrama de flujo que muestra la construcción del mutante hyaD de P. multocida 1062; la figura 2 es una imagen de gel que muestra los productos de PCR específicos de hyaD amplificados a partir de la cepa de P. multocida 1062 hyaDA-4PKL (carril 2) y la cepa de tipo natural parental virulenta de P. multocida 1062 (carril 3);

la figura 3 es un diagrama de flujo que muestra la construcción del mutante nanPU de P. multocida 1062; la figura 4 es una imagen de gel que muestra los productos de PCR específicos de nanPU amplificados a partir de la cepa nanPU truncada de P. multocida 1062 (carril 2) y la cepa de tipo natural parental virulenta de P. multocida 1062 (carril 3);

la figura 5 es una imagen de gel que muestra 1) el mutante AnanPU/HyaD de P. multocida amplificado con los cebadores nanPUF/nanPUR (1,3 Kb); 2) el mutante AnanPU/HyaD de P. multocida amplificado con los cebadores hyaDF/hyaDR (2,691 Kb); 3) P. multocida 1062 de tipo natural amplificada con los cebadores nanPUF/nanPUR (3,150 Kb); y 4) P. multocida 1062 de tipo natural amplificada con los cebadores hyaDF/hyaDR (2,916 Kb); DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0016] En esta invención se describen secuencias de nucleótidos y genes implicados en la atenuación de un microorganismo, tal como bacterias, por ejemplo, bacterias gramnegativas, por ejemplo, Pasteurella multocida (P. multocida), productos (por ejemplo, proteínas, antígenos, inmunógenos, epítopos) codificado por las secuencias de nucleótidos, procedimientos para producir dichas secuencias de nucleótidos, productos, microorganismos y usos de los mismos, tal como para preparar vacunas o composiciones inmunógenas o para provocar una respuesta inmunológica o inmunitaria o como un vector, por ejemplo, como un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión in vitro o in vivo).

[0017] Con el fin de desarrollar una vacuna de campo de P. multocida eficaz, se genomanipularon tres cepas atenuadas: 1) un mutante de deleción parcial de hyaD, que es incapaz de sintetizar glucosiltransferasa y, por lo tanto, presenta el fenotipo acapsular; 2) una deleción de nanPU, que es incapaz de añadir residuos de ácido siálico a lipooligosacáridos terminales; y 3) un mutante de doble inactivación que carece de los genes hyaD y nanPU.

[0018] Las mutaciones, incluidas las deleciones y deleciones parciales, introducidas en secuencias de nucleótidos y genes de microorganismos producen mutantes atenuados novedosos y no obvios. Estos mutantes son útiles para la producción de composiciones inmunógenas vivas atenuadas o vacunas vivas atenuadas que tienen un alto grado de inmunogenicidad.

[0019] Estos mutantes también son útiles como vectores que pueden ser útiles para la expresión in vitro de productos de expresión, así como para la reproducción o replicación de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, replicación de ADN) y para productos de expresión in vivo.

[0020] La identificación de las mutaciones proporciona secuencias de nucleótidos y genes novedosos y no obvios, así como productos génicos novedosos y no obvios codificados por secuencias de nucleótidos y genes.

[0021] Dichos productos génicos proporcionan antígenos, inmunógenos y epítopos, y son útiles como productos génicos aislados.

[0022] Dichos productos génicos aislados, así como epítopos de los mismos, también son útiles para generar anticuerpos, que son útiles en aplicaciones de diagnóstico.

[0023] Dichos productos génicos, que pueden proporcionar o generar epítopos, antígenos o inmunógenos, también son útiles para composiciones inmunógenas o inmunológicas, así como para vacunas.

[0024] En esta invención se describen bacterias que contienen una mutación atenuante en una secuencia de nucleótidos o un gen en las que la mutación modifica, reduce o anula la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o proteína codificada por un gen, lo que da como resultado una virulencia atenuada de la bacteria.

[0025] No es necesario que la mutación esté ubicada dentro de una secuencia codificante o gen para interrumpir su función, lo que conduce a la atenuación. La mutación también puede realizarse en secuencias de nucleótidos implicadas en la regulación de la expresión del gen, por ejemplo, en regiones que regulan el inicio de la transcripción, la traducción y la terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen los promotores y las regiones de unión a ribosomas (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio de la secuencia codificante o gen; Doree S M y col., J. Bacteriol.

2001, 183(6): 1983-9; Pandher K y col., Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9; Chung J Y y col., FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296), terminadores de transcripción (en general el terminador está ubicado en aproximadamente 50 nucleótidos aguas abajo del codón de terminación de la secuencia codificante o gen; Ward C K y col., Infect. Imm.

1998, 66(7): 3326-36). En el caso de un operón, dichas regiones reguladoras pueden ubicarse en una mayor distancia aguas arriba del gen o secuencia codificante. Una mutación en una región intergénica también puede producir atenuación.

[0026] Una mutación dentro de dichas secuencias reguladoras asociadas con la secuencia codificante o gen de modo que la mutación de esta secuencia de nucleótidos modifique, inhiba o anule la expresión y/o la actividad biológica del polipéptido o la proteína codificada por el gen, dando como resultado la virulencia atenuada de la bacteria, sería equivalente a una mutación dentro de un gen o secuencia codificante identificados en la presente invención.

[0027] La atenuación reduce o anula la patogenicidad de las bacterias y la gravedad de los signos clínicos o lesiones, disminuye la tasa de crecimiento de las bacterias, e impide la muerte de las bacterias.

[0028] En particular, la presente invención incluye una cepa atenuada de P. multocida y vacunas que comprenden la misma, que provocan una respuesta inmunógena en un animal, particularmente una cepa atenuada de P. multocida que provoca, induce o estimula una respuesta en un bovino.

[0029] Las cepas atenuadas de P. multocida particulares de interés tienen mutaciones en genes, en relación con la cepa parental virulenta de tipo natural, que están asociadas con la virulencia. Se reconoce que, además de las cepas que tienen las mutaciones descritas, pueden usarse cepas atenuadas que tienen cualquier número de mutaciones en los genes de virulencia descritos como se describe en esta invención.

[0030] Como se describe en esta invención, las cepas atenuadas comprenden mutaciones en secuencias de ácido nucleico que comprenden los nucleótidos como se expone en las s Eq ID NOs:1, 5 o ambas. Las cepas atenuadas también pueden comprender mutaciones en secuencias que tienen al menos un 70 % de identidad con las secuencias como se expone en las SEQ ID NOs:1, 5, o ambas, con la condición de que las secuencias homólogas deben codificar proteínas homólogas que tengan funciones comparables a las codificadas por la SEQ ID NO:1 o 5. Los ejemplos de funciones comparables incluyen la capacidad de catalizar la misma reacción enzimática y la capacidad de cumplir la misma función estructural. Las cepas atenuadas también pueden comprender mutaciones en secuencias que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con las secuencias como se expone en las SEQ ID NOs: 1, 5 o ambas, con la misma condición.

[0031] Como se describe en esta invención, las cepas atenuadas pueden comprender secuencias que tengan al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con las secuencias como se expone en las SEQ ID NOs:11, 12 o ambas, con la condición de que las secuencias homólogas den como resultado el fenotipo atenuado, en las que las cepas atenuadas son comparablemente capaces de provocar de forma segura una respuesta inmunitaria con respecto a las cepas atenuadas que comprenden las secuencias como se expone en las SEQ ID NOs: 11, 12, o ambas. El experto entenderá bien que las cepas atenuadas comprenden la secuencia o secuencias mutadas en lugar de la secuencia o secuencias de tipo natural. Por lo tanto, no se pretende que la invención deba incluir, por ejemplo, una cepa que comprenda tanto la SEQ ID NO:1 (tipo natural) como la s Eq ID NO:3 (mutada). Sin embargo, los inventores prevén que cualquier deleción/modificación de una o ambas SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:5 pueda transformar una cepa virulenta de P. multocida en una cepa atenuada, según la presente descripción.

[0032] También descritas en esta invención, las cepas atenuadas de P. multocida comprenden ácidos nucleicos que codifican un péptido que tiene la secuencia como se expone en las SEQ ID NOs:4, 13, o un péptido que tiene un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o un 98 % de homología con las mismas, y que tiene una función comparable con las mismas. También descritas en esta invención, las cepas comprenden ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a las secuencias como se expone en las s Eq ID NOs:4, 13, o ambas.

[0033] En el momento de esta descripción, no se sabía que los mutantes descritos en esta invención existieran en ningún genoma de P. multocida de origen natural, y solo se produjeron como resultado de los procedimientos de mutagénesis descritos.

[0034] También descrita en esta invención, la cepa atenuada de P. multocida tiene mutaciones en los mismos genes, con respecto a su cepa parental virulenta, que la cepa depositada en la ATCC bajo la Denominación de depósito de patente PTA-120624 (es decir, Nan de P. mult. 10629/5/2012). Estas mutaciones dan como resultado que la cepa atenuada tenga una virulencia reducida con respecto a su cepa parental virulenta.

[0035] También descrita en esta invención, la cepa atenuada de la invención es la cepa depositada en la ATCC bajo la Designación de depósito de patente PTA-120624 (es decir, Nan de P. mult.10625/9/2012).

[0036] En otro aspecto, las nuevas cepas atenuadas de P. multocida se formulan en una vacuna segura y eficaz contra P. multocida y las infecciones/enfermedades causadas por P. multocida.

[0037] En una realización, las vacunas contra P. multocida comprenden además un adyuvante. En una realización particular, el adyuvante es un adyuvante mucoso, tal como quitosano, quitosano metilado, quitosano trimetilado, o derivados, o combinaciones de los mismos.

[0038] En una realización, el adyuvante comprende bacterias y/o virus completos, incluyendo H. parasuis, clostridium, virus de la influenza porcina (VIS), circovirus bovino (PCV), virus del síndrome respiratorio y reproductivo bovino (PRRSV), Mannheimia, Pasteurella., Histophilus, Salmonella, Escherichia coli, o combinaciones y/o variaciones de los mismos. En varias realizaciones, el adyuvante aumenta la producción del animal de IgM, IgG, IgA, y/o combinaciones de los mismos.

[0039] Por "antígeno" o "inmunógeno" se refiere a una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunógenas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria al presentarse a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Como alternativa, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.

[0040] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en esta invención para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de los aminoácidos. Los términos también incluyen un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un etiquetado o componente bioactivo.

[0041] El término "polipéptido inmunógeno o antigénico", como se usa en esta invención, incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez administrados al huésped, son capaces de provocar una respuesta inmunitaria del tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferentemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína descrito en esta invención comprende o consiste esencialmente en, o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunógeno", como se usa en esta invención, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunógenos de la misma. Por "fragmento inmunógeno" se refiere a un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y, por lo tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Dichos fragmentos pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando simultáneamente un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía están unidos a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 4.708.871; Geysen y col., 1984; Geysen y col., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, anteriormente. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen en su totalidad en el documento PCT/US2004/022605.

[0042] Como se analiza en esta invención, se describen en esta invención fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "polipéptido inmunógeno o antigénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica como se define en esta invención. El término "variación conservadora" representa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polaralanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin cargar: glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina para asparagina, y similares; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en esta invención. El término "variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido con la condición de que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido sin sustituir.

[0043] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al que responden los linfocitos B y/o los linfocitos T específicos. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo con respecto a un antígeno diana.

[0044] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Por lo general, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares y/o linfocitos T citotóxicos, dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped presentará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de manera que se potenciará la resistencia a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o ausencia de síntomas y/o signos de enfermedad clínica normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido, y/o un título viral reducido en el huésped infectado.

[0045] Por "animal" se entiende mamíferos, aves, y similares. Animal o huésped, como se usa en esta invención, incluye mamíferos y seres humanos. El animal se puede seleccionar del grupo que consiste en equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros grandes felinos, y otros felinos, incluidos guepardos y linces), ovinos (por ejemplo, ovejas), bovinos (por ejemplo, ganado), bovinos (por ejemplo, cerdo), aviares (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emú y casuario), primates (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, simio), hurones, focas y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluidas las etapas de recién nacido, embrionario y fetal.

[0046] A menos que se expliquen de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0047] Cabe destacar que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de patentes de EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado adscrito a los mismos en la ley de patentes de EE.UU., por ejemplo, permiten elementos no citados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o nueva de la invención.

Composiciones

[0048] La presente invención se refiere a una vacuna o composición contra P. multocida que puede comprender una cepa atenuada de P. multocida y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal.

[0049] El término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también incluye híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión, tales como fluororribosa y tiolato, y ramificaciones de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación, con un componente de etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son caperuzas, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, e introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de etiquetado, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos pueden obtenerse mediante síntesis química o derivarse de un microorganismo.

[0050] El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o simplemente las secuencias codificantes como en los ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0051] Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico, una proteína u orgánulo) se refiere a un componente que ha sido sustancialmente separado o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que el componente se encuentra naturalmente, por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas por procedimientos de purificación estándar. El término también incluye ácidos nucleicos y proteínas que se preparan mediante tecnología recombinante, así como síntesis química.

[0052] El término "variación conservadora" representa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, como se ha descrito anteriormente.

[0053] El término "recombinante" se refiere a un polinucleótido con origen semisintético o sintético que no se encuentra en la naturaleza o está unido a otro polinucleótido en una disposición que no se encuentra en la naturaleza.

[0054] "Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0055] Los polinucleótidos descritos en esta invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo o de un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier construcción que pueda ser deseable para proporcionar las realizaciones descritas en esta invención.

Procedimientos de uso y artículo de fabricación

[0056] También se describen en esta invención las siguientes realizaciones del procedimiento. Se describe un procedimiento para vacunar a un animal que comprende administrar una composición que comprende una cepa atenuada de P. multocida y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable a un animal. En la presente invención, el animal es un bovino.

[0057] En una realización de la invención, se puede emplear un régimen de sensibilización-refuerzo, que comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. Típicamente, la composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración primaria es de naturaleza diferente a las utilizadas como refuerzo. Sin embargo, se observa que se puede usar la misma composición como administración primaria y administración de refuerzo. Este protocolo de administración se llama "sensibilización-refuerzo".

[0058] Un régimen de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administración de sensibilización puede ser de naturaleza diferente a las utilizadas como vacuna de refuerzo posterior. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

[0059] El volumen de dosis de las composiciones para las especies objetivo que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de dosis de las composiciones para vacas o bovinos, basándose en antígenos bacterianos, es generalmente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2,0 ml, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0 ml, y entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 1,0 ml.

[0060] La eficacia de las vacunas se puede probar aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la última inmunización mediante la exposición de los animales, tales como bovinos, a una cepa virulenta de P. multocida. Tanto las cepas homólogas como las heterólogas se utilizan para la exposición para probar la eficacia de la vacuna. El animal puede exponerse por inyección IM o SC, pulverización, por vía intranasal, intraocular, intratraqueal y/u oral. Se pueden recoger muestras de articulaciones, pulmones, cerebro y/o boca antes y después de la exposición y se pueden analizar para determinar la presencia de anticuerpos específicos de P. multocida.

[0061] Las composiciones que comprenden la cepa bacteriana atenuada de la invención usada en los protocolos de sensibilización-refuerzo están contenidas en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. Los protocolos de la invención protegen al animal de P. multocida y/o previenen la progresión de la enfermedad en un animal infectado.

[0062] Las diversas administraciones se realizan preferentemente con 1 a 6 semanas de diferencia. El intervalo de tiempo preferido es de 3 a 5 semanas y, de manera óptima, 4 semanas según una realización, también se prevé un refuerzo anual. Los animales, por ejemplo, los cerdos, pueden tener al menos 3-4 semanas de edad en el momento de la primera administración.

[0063] Un experto en la técnica debe entender que la descripción en esta invención se proporciona a modo de ejemplo y que la presente invención no se limita a la misma. A partir de la descripción en esta invención y el conocimiento en la técnica, el experto puede determinar el número de administraciones, la vía de administración, y las dosis que se usan para cada protocolo de inyección, sin excesiva experimentación.

[0064] Otra realización descrita en esta invención es un kit para realizar un procedimiento para provocar o inducir una respuesta inmunológica o protectora contra P. multocida en un animal que comprende una composición inmunológica o vacuna atenuada de P. multocida, e instrucciones para realizar el procedimiento de administración en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0065] Otra realización descrita en esta invención es un kit para realizar un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra P. multocida en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende una cepa atenuada de P. multocida de la invención, e instrucciones para realizar el procedimiento de administración en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0066] Otro aspecto más descrito en esta invención se refiere a un kit para vacunación de sensibilizaciónrefuerzo según la presente invención como se ha descrito anteriormente. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de sensibilización según la presente invención, y un segundo vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de refuerzo según la presente invención. El kit puede contener ventajosamente un primer o segundo viales adicionales para vacunaciones de sensibilización adicionales o vacunaciones de refuerzo adicionales.

[0067] Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables se conocen bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0,9 % (por ejemplo, solución salina) o un tampón de fosfato. Otros portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que pueden usarse para los procedimientos de esta invención incluyen, pero sin limitación, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro); ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se analizan en esta invención en la descripción general y también pueden determinarse por el experto en la técnica a partir de esta descripción leída junto con el conocimiento en la técnica, sin demasiada experimentación.

[0068] Las composiciones inmunológicas y vacunas según la invención pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para su uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman y col., 1996; documento WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA, (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes analizados en cualquier documento citado, o (9) cualquier combinación o mezcla de los mismos.

[0069] En una realización, los adyuvantes incluyen aquellos que promueven una absorción mejorada a través de los revestimientos de las mucosas. Algunos ejemplos incluyen MPL, LTK63, toxinas, micropartículas de PLG y varios otros (Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627). En una realización, el adyuvante puede ser un quitosano (Van der Lubben y col. 2001; Patel y col. 2005; Majithiya y col. 2008; Patente de ^e E.UU. N.° de Serie 5.980.912).

[0070] En una realización, el adyuvante pueden ser bacterias inactivadas, un virus inactivado, fracciones de bacterias inactivadas, lipopolisacáridos bacterianos, toxinas bacterianas o derivados o combinaciones de los mismos.

[0071] En una realización, el adyuvante comprende bacterias y/o virus completos, incluyendo H. parasuis, clostridium, virus de inmunodeficiencia porcina (VlS), circovirus bovino (PCV), virus del síndrome respiratorio y reproductivo bovino (PRRSV), Mannheimia, Pasteurella., Histophilus, Salmonella, Escherichia coli, o combinaciones y/o variaciones de los mismos. En varias realizaciones, el adyuvante aumenta la producción del animal de IgM, IgG, IgA, y/o combinaciones de los mismos.

[0072] Bibliografía:

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[0073] La invención se describirá ahora con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Desarrollo de la cepa mutante hyaD de P. multocida y caracterización de la semilla maestra:

[0074] Se construyó un mutante de P. multocida de la cepa 1062, incapaz de sintetizar la cápsula (acapsular), eliminando una porción de la región codificante de hyaD e inactivando así la síntesis de glucosiltransferasa (Chung y col., 1998). El mutante acapsular se creó siguiendo el protocolo publicado (Briggs y Tatum 2005). La mayoría de las regiones codificantes de hyaD de P. multocida 1062 se obtuvo mediante amplificación por PCR, utilizando el cebador directo 5'-ATG ATA TTT GAG AAG TCG GCG G-3' (SEQ ID NO: 14) y el cebador inverso 5'-TGT AAT TTT CGT TCC CAA GGC-3' (SEQ ID NO:15) (Briggs, R.E., Tatum, F.M. 2005). Estos dos cebadores se sintetizaron con un sintetizador de oligonucleótidos (Applied Biosystems Inc., CA) por Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa. Las reacciones de PCR se realizaron utilizando el kit GeneAmp LX PCR (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en un termociclador Perkin Elmer GeneAmp 9600. Las condiciones de reacción fueron 30 ciclos, consistiendo cada uno en 30 segundos a 95 °C, 45 segundos a 54 °C y 90 segundos a 72 °C.

[0075] El fragmento hyaD generado por PCR usado aquí se extendía desde el codón de metionina de partida y terminaba 85 pares de bases aguas arriba del codón de terminación. El fragmento se insertó en pCR2.1 (Invitrogen Inc., LaJolla, CA) y el plásmido recombinante se sometió a electroporación en la cepa de E. coli DH11S (Life Technologies, Rockville, MD), generando así el plásmido, pCR2.1hyaDPm1062. Este plásmido se aisló de E. coli mediante el procedimiento de SDS alcalino y se purificó mediante

centrifugación con CsCl usando procedimientos estándar. Ambas hebras del gen hyaD se secuenciaron usando el kit Dye Terminator Chemistry de PE Applied Biosystems y las muestras se procesaron en un secuenciador de ADN ABI Prism 377 por la Nucleic Acids Facility, Iowa State University, Ames, Iowa.

[0076] La deleción precisa dentro de hyaD se produjo tratando el plásmido, pCR2.1hyaDPm1062 con la enzima de restricción BglII. Este tratamiento produjo una deleción de 225 pb dentro de hyaD que, tras la ligadura, dio como resultado una deleción en marco. El fragmento hyaD eliminado se transfirió al sitio EcoRI dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido pBCSK (Strategene Inc.) para producir pBCSKAhyaDPm1062. A continuación, se insertó el elemento de resistencia a la kanamicina Tn903 (GenBlock) en el sitio SalI adyacente para producir pBCSKAhyaDPml062kanR La construcción del plásmido de reemplazo se completó ligando pBCSKAhyaDPm1062kanR digerido con BssHII al origen de replicación sensible a la temperatura de 1,2 kb del plásmido, pCT109GA189 (Briggs y Tatum, 2005). Debido a que el origen de ColEI es inactivo en P. multocida, solo el plásmido que genera el producto de ligadura, pCT109GA189AhyaDPm1062kanR, fue capaz de replicarse dentro de la cepa 1062 de P. multocida.

[0077] El plásmido de reemplazo, pCT109GA189AhyaDPm1062kanR, se introdujo en la cepa 1062 de P. multocida como se indica a continuación. Las células se cultivaron en caldo Columbia a una densidad de DO600 = 0,5. Las células se enfriaron en hielo durante 10 min y se sedimentaron mediante centrifugación a 5000 xg durante 15 min. Las células se resuspendieron en agua destilada enfriada con hielo y se sedimentaron como se ha descrito anteriormente. Se realizó un segundo lavado y el sedimento celular se resuspendió 1:3 (bacterias:agua) y se colocó en hielo. Las bacterias competentes (100 jl) se mezclaron en una cubeta de electroporación de 0,1 cm (Bio-Rad) con la mezcla de ligadura de plásmido de reemplazo. Inmediatamente después de añadir el ADN, las células se sometieron a electroporación (Gene pulser, Bio-Rad) a 18.000 V/cm, 800 ohmios y 25 mFd, con constantes de tiempo resultantes en el intervalo de 11 a 15 ms.

[0078] Se añadió caldo Columbia enfriado (1 ml) a las células electroporadas, y la suspensión se incubó a 25 °C durante aproximadamente 2 horas. A continuación, las células se sembraron en placas de agar sangre Columbia que contenían 50 jg/ml de kanamicina. Las colonias fueron visibles después de 24 horas de incubación a 30 °C. Las colonias se transfirieron a 2 ml de caldo Columbia que contenía 50 jg/ml de kanamicina y se incubaron durante una noche a 30 °C. Al día siguiente, se extendieron aproximadamente 20 j l del cultivo en placas de agar dextrosa-almidón que contenían 50 jg/ml de kanamicina y se incubaron a 38 °C, la temperatura no permisiva para el plásmido de reemplazo. Las células que poseían plásmido de reemplazo integrado sobrevivieron a la selección de antibióticos a la temperatura no permisiva para la replicación plasmídica (38 °C). Estos mutantes de un solo cruzamiento podían identificarse fenotípicamente fácilmente porque la integración del plásmido de reemplazo en hyaD del huésped dio como resultado la pérdida de la cápsula. Las colonias capsulares de tipo natural de P. multocida 1062 poseen ácido hialurónico, el componente principal de la cápsula, son de apariencia mucoide, y cuando se ven bajo luz transmitida oblicuamente presentan una iridiscencia de tipo perla. Por el contrario, los mutantes acapsulares de un solo cruzamiento no son mucoides ni iridiscentes.

[0079] Se transfirieron varios mutantes de un solo cruzamiento, que poseían un plásmido de reemplazo integrado, a 5 ml de caldo Columbia sin complementación con antibióticos y se incubaron a 30 °C durante una noche. Al día siguiente, se transfirieron aproximadamente 2 j l de crecimiento a 5 ml de caldo Columbia recién preparado (sin antibiótico) y se incubaron durante una noche a 30 °C. Este proceso se repitió varias veces más para permitir la resolución del plásmido y la formación del mutante. Después de 5 de dichos pases, las células se transfirieron a placas de agar dextrosa-almidón sin antibiótico complementario y se incubaron a 38 °C durante 16 horas. Las colonias que surgieron en las placas de no selección consistieron en fenotipos capsulares y acapsulares. Se esperaban estos resultados; dependiendo de dónde se produjo la resolución del plásmido de reemplazo, se generaron colonias de tipo natural o mutantes. La prueba inicial para identificar mutantes de doble cruzamiento (es decir, mutantes acapsulares hyaD) implicó la replicación en placas de colonias acapsulares en placas de agar almidón y dextrosa con y sin antibiótico seguido de incubación durante una noche a 38 °C. Las colonias acapsulares sensibles a la kanamicina se analizaron adicionalmente mediante PCR usando los cebadores hyaD descritos previamente. Los productos de PCR de los supuestos mutantes hyaD se compararon con los del parental de tipo natural usando electroforesis en gel de agarosa. Los productos de PCR que tenían el tamaño esperado se secuenciaron utilizando los cebadores hyaDF (5'-ATG ATA TTT GAG AAG TCG GCG G-3' (SEQ ID NO:14)) y hyaDR (5'-GTA ATT TTC GTT CCC AAG GC-3' (SEQ ID NO: 17)). Además, los supuestos mutantes hyaD se analizaron mediante PCR para determinar la ausencia del origen de replicación del plásmido sensible a la temperatura de pCT109GA189 y la ausencia del elemento de resistencia a la kanamicina Tn903. En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo que muestra la construcción del mutante hyaD de P. multocida 1062 (etapas A-F).

[0080] Se obtuvo un cultivo liofilizado de la P. multocida 1062 mutante (serotipo A:3) en NADC, Ames Iowa. El polvo liofilizado se rehidrató usando agua destilada estéril y se esparció sobre placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 % y se incubó a 37 °C durante una noche. Al día siguiente, se seleccionaron tres colonias individuales y se realizó una PCR de colonias utilizando cebadores hyaDF y hyaDR como se ha descrito anteriormente (Lawrence y col., 2010). Los clones, como se esperaba, amplificaron una banda a 2,691 kb, en comparación con la cepa parental (2,916 kb), lo que indica un gen hyaD truncado. Se inoculó una única colonia de uno de los clones en medio de infusión de cerebro-corazón (BHI) en autoclave y se incubó a 37 °C/200 rpm durante una noche. Al día siguiente, los cultivos se diluyeron a 0,4 DO (densidad óptica a 600 nm) en caldo BHI y se dejaron crecer hasta la fase logarítmica. Una vez que los cultivos alcanzaron la fase logarítmica (DO600 = 0,8), se añadió un volumen igual de glicerol estéril al 50 %, se mezcló y se dividió en alícuotas en crioviales de 2 ml. La semilla maestra se congeló a una concentración de 2,6 x 109 UFC/ml. Los viales se etiquetaron como hyaDA-4PKL de P. multocida 1062 y se almacenaron a -70 °C en Newport Laboratories Research and Development, ubicado en 1810 Oxford Street, Worthington, Mn-56187.

[0081] La siembra en caldo maestra se sembró en placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 %, y se recogió una única colonia para confirmar la presencia de hyaD truncada por PCR (figura 2). La semilla maestra se envió al laboratorio de control de calidad interno (QC) para la prueba de esterilidad según 9CFR 113.27(b), y estaba desprovista de cualquier crecimiento (fúngico) extraño. Se obtuvo una placa TSA que contenía hyaDA-1PKL de P. multocida 1062 del laboratorio de QC y se envió al laboratorio de diagnóstico interno para su identificación/confirmación según 9CFR 113.64(c)4. Después de confirmar que el crecimiento obtenido del laboratorio de QC era hyaDA-1PKL de P. multocida 1062 mutante, se analizó una sola colonia de la placa TSA de nuevo para determinar la presencia del gen hyaD truncado por PCR. Se probó la seguridad de la semilla maestra en ratones consanguíneos [Hsd: ICR (CD-1®), Harlan], según 9CFR 113.33 y se encontró que era segura.

[0082] La siembra en caldo maestra se sembró en placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 %, y se recogió una sola colonia y se realizó la PCR de la colonia como se ha descrito anteriormente (Lawrence y col., 2010) usando cebadores hyaDF y hyaDR. La imagen del gel de agarosa se muestra en la figura. Carriles: 1: marcador de peso molecular; 2: Producto de PCR de hyaDA-4PKL de P. multocida 1062 que muestra el gen hyaD truncado (2,691 kb); 3: Producto de PCR de P. multocida 1062 de tipo natural que muestra el gen hyaD de longitud completa (2,916 kb).

Ejemplo 2: Desarrollo de cepas mutantes nanPU y caracterización de semillas maestras

[0083] Se construyó un mutante de P. multocida de la cepa 1062, incapaz de añadir residuos de ácido siálico a las moléculas de lipooligosacárido (LOS), eliminando una porción de la región codificante de nanPU e inactivando así la síntesis de un complejo de enzima transferasa de ácido siálico (Tatum y col., 2009; Steenbergen y col., 2005). El locus nanP codifica una proteína periplasmática de unión a ácido siálico SiaP y el locus nanU codifica la proteína permeasa transportadora TRAP de ácido siálico SiaT-23. El mutante deficiente en ácido siálico se creó siguiendo el protocolo publicado (Briggs y Tatum 2005). Las regiones codificantes de nanP y nanU de P. multocida 1062 se obtuvieron mediante amplificación por PCR, utilizando los cebadores directo e inverso 1062nanPU_F 5'-TTC CCT AGC TCA CAG TTA GGT GAT-3' (SEQ ID NO:6) / 1062nanPU_delR 5'-GTC ACA CCT TGA CTT TTG AAG AAT TCA-3' (SEQ ID NO:7); y 1062nanPU_delF 5'-AAT TCC AAT TGC GGT TCA CTT TGG CA-3' (SEQ ID NO:8) / 1062nanPU_R 5'-TCT GCA ATT TCT TTC CAT TCT TTT GGA-3' (SEQ ID NO:9), respectivamente (figura 3A). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando el kit GeneAmp LX PCR (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en un termociclador Perkin Elmer GeneAmp 9600. Las condiciones de reacción fueron 30 ciclos, consistiendo cada uno en 30 segundos a 95 °C, 45 segundos a 54 °C y 90 segundos a 72 °C.

[0084] Los fragmentos nanP y nanU generados por PCR se digirieron con EcoRI y MunI respectivamente, se ligaron y clonaron en el vector PCR2.1 (Invitrogen Inc., LaJolla, CA). El plásmido recombinante se sometió a electroporación en la cepa DH11S de E. coli (Life Technologies, Rockville, MD) generando así el plásmido, pCR2.1nanPUPm1062. Este plásmido se aisló de E. coli mediante el procedimiento de SDS alcalino y se purificó mediante centrifugación con CsCI utilizando procedimientos estándar. Ambas hebras del gen nanPU se secuenciaron usando el kit Dye Terminator Chemistry de PE Applied Biosystems y las muestras se procesaron en un secuenciador de ADN ABI Prism 377 por la Nucleic Acids Facility, Iowa State University, Ames, Iowa.

[0085] El fragmento nanPU eliminado se transfirió al sitio EcoRI dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido pBCSK (Strategene Inc.) para producir pBCSKAnanPUPm1062 (figura 1B). A continuación, se insertó el elemento de resistencia a la kanamicina Tn903 (GenBlock) en el sitio SalI adyacente para producir pBCSKAnanPUPm1062kanR. La construcción del plásmido de reemplazo se completó ligando pBCSKAnanPUPm 1062kanR digerido con SssHII al origen de replicación sensible a la temperatura de 1,2 kb del plásmido, pCT109GA1894 (Briggs y Tatum, 2005). Debido a que el origen de ColE1 es inactivo en P. multocida, solo el plásmido que genera el producto de ligadura, pCT109GA189AnanPUPm1062kanR, fue capaz de replicarse dentro de la cepa 1062 de P. multocida (figuras 3C y D).

[0086] El plásmido de reemplazo, pCT109GA189AnanPUPm1062kanR se introdujo en la cepa 1062 de P. multocida como se indica a continuación. Las células se cultivaron en caldo Columbia a una densidad de DO600 = 0,5. Las células se enfriaron en hielo durante 10 min y se sedimentaron mediante centrifugación a 5000 xg durante 15 min. Las células se resuspendieron en agua destilada enfriada con hielo y se sedimentaron como se ha descrito anteriormente. Se realizó un segundo lavado y el sedimento celular se resuspendió 1:3 (bacterias:agua) y se colocó en hielo. Las bacterias competentes (100 jl) se mezclaron en una cubeta de electroporación de 0,1 cm (Bio-Rad) con la mezcla de ligadura de plásmido de reemplazo. Inmediatamente después de añadir el ADN, las células se sometieron a electroporación (Gene pulser, Bio-Rad) a 18.000 V/cm, 800 ohmios y 25 mFd, con constantes de tiempo resultantes en el intervalo de 11 a 15 ms.

[0087] Se añadió caldo Columbia enfriado (1 ml) a las células electroporadas, y la suspensión se incubó a 25 °C durante aproximadamente 2 horas. A continuación, las células se sembraron en placas de agar sangre Columbia que contenían 50 jg/ml de kanamicina. Las colonias fueron visibles después de 24 horas de incubación a 30 °C. Las colonias se transfirieron a 2 ml de caldo Columbia que contenía 50 jg/ml de kanamicina y se incubaron durante una noche a 30 °C. Al día siguiente, se extendieron aproximadamente 20 j l del cultivo en placas de agar dextrosa-almidón que contenían 50 jg/ml de kanamicina y se incubaron a 38 °C, la temperatura no permisiva para el plásmido de reemplazo. Las células que poseían plásmido de reemplazo integrado sobrevivieron a la selección de antibióticos a la temperatura no permisiva para la replicación plasmídica (38 °C).

[0088] Se transfirieron varios mutantes de un solo cruzamiento, que poseían un plásmido de reemplazo integrado, a 5 ml de caldo Columbia sin complementación con antibióticos y se incubaron a 30 °C durante una noche. Al día siguiente, se transfirieron aproximadamente 2 j l de crecimiento a 5 ml de caldo Columbia recién preparado (sin antibiótico) y se incubaron durante una noche a 30 °C. Este proceso se repitió varias veces más para permitir la resolución del plásmido y la formación del mutante. Después de 5 de dichos pases, las células se transfirieron a placas de agar dextrosa-almidón sin antibiótico complementario y se incubaron a 38 °C durante 16 horas. Las colonias que surgieron en las placas de no selección consistieron en fenotipos de tipo natural y mutantes. Se esperaban estos resultados; dependiendo de dónde se produjo la resolución del plásmido de reemplazo, se generaron colonias de tipo natural o mutantes. La prueba inicial para identificar mutantes de doble cruzamiento (es decir, mutantes nanPU) implicó la replicación en placas de colonias acapsulares en placas de agar almidón y dextrosa con y sin antibiótico seguido de incubación durante una noche a 38 °C. Las colonias sensibles a la kanamicina se analizaron adicionalmente mediante PCR usando los cebadores nanPU descritos previamente. Los productos de PCR de los supuestos mutantes nanPU se compararon con los del parental de tipo natural usando electroforesis en gel de agarosa. Los productos de PCR que eran del tamaño esperado se secuenciaron usando los cebadores nanPUF (5'-TTC CCT AGC TCA CAG TTA GGT GAT-3') (SEQ ID NO:6) y nanPUR (5'- TCT GCA ATT TCT TTC CAT TCT TTT GGA TCT-3') (SEQ ID NO:16). Además, los supuestos mutantes nanPU se secuenciaron, se analizaron mediante PCR para determinar la ausencia del origen de replicación del plásmido sensible a la temperatura de pCT109GA189 y la ausencia del elemento de resistencia a la kanamicina Tn903. Los mutantes nanPU se ensayaron para determinar la captación de ácido siálico de los medios de cultivo utilizando el ensayo de ácido tiobarbitúrico5. En la figura 3 se muestra un diagrama de flujo que muestra la construcción del mutante nanPU de P. multocida 1062 (Etapas A-F).

[0089] Se obtuvo un cultivo de placa de agar sangre del mutante nanPU de P. multocida 1062 mutante (serotipo A:3) en NADC, Ames lowa el 4 de mayo de 2012. El polvo liofilizado se rehidrató usando agua destilada estéril y se esparció sobre placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 % y se incubó a 37 °C durante una noche. Al día siguiente, se recogieron tres colonias individuales y se realizó la PCR de colonias utilizando los cebadores nanPUF 5'-TTC CCT AGC TCA CAG TTA GGT GAT-3 '(SEQ ID NO: 6) y nanPUR 5'- TCT GCA ATT TCT TTC CAT TCT TTT GGA TCT-3' (SEQ ID NO: 16) como se ha descrito anteriormente (Lawrence y col., 2010). Los clones, como se esperaba, amplificaron una banda a 1,3 kb, en comparación con la cepa parental (3,150 kb), lo que indica un gen nanPU truncado. Se inoculó una única colonia de uno de los clones en medio de infusión de cerebro-corazón (BHI) en autoclave y se incubó a 37 °C/200 rpm durante una noche. Al día siguiente, los cultivos se diluyeron a 0,4 DO (densidad óptica a 600 nm) en caldo BHI y se dejaron crecer hasta la fase logarítmica. Una vez que los cultivos alcanzaron la fase logarítmica (DO600 = 0,8), se añadió un volumen igual de glicerol estéril al 50 %, se mezcló y se dividió en alícuotas en crioviales de 2 ml (congelados a 6,9 x108 UFC/ml).

[0090] La siembra en caldo maestra se sembró en placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 %, y se recogió una única colonia para confirmar la presencia de nanPU truncada por PCR (figura 4). La semilla maestra se envió al laboratorio de control de calidad interno (QC) para la prueba de esterilidad según 9CFR 113.27(b), y estaba desprovista de cualquier crecimiento (fúngico) extraño. Se probó la seguridad de la semilla maestra en ratones consanguíneos [Hsd: ICR (CD-1®), Harlan], según 9CFR 113.33 y se encontró que tenía un efecto adverso.

[0091] La siembra en caldo maestra se sembró en placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 %, y se recogió una sola colonia y se realizó la PCR de la colonia como se ha descrito anteriormente usando cebadores nanPUF y nanPUR. La figura 4 muestra la imagen de un gel de agarosa: 1: marcador MW; 2: Producto de PCR de P. multocida 1062 Nan de P. mult. 1062 que muestra el gen nanPU truncado (1,3 Kb); 3: Producto de PCR de P. multocida 1062 de tipo natural que muestra el gen nanPU de longitud completa (3,150 kb); ADN plantilla que carece de control negativo.

Ejemplo 3 - Desarrollo de un mutante de doble inactivación nanPU/hyaD de P. multocida

[0092] Para desarrollar un mutante de doble inactivación de P. multocida 1062 A:3, se construyó un solo mutante de deleción en hyaD como se describe en la sección IIa y se usó como base para inactivar el locus nanPU como se describe en la sección IIb.

[0093] Se obtuvo una placa de agar sangre de P. multocida 1062 mutante (serotipo A:3) nanPU/hyaD en NADC, Ames Iowa el 4 de mayo de 2012. El polvo liofilizado se rehidrató usando agua destilada estéril y se esparció sobre placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 % y se incubó a 37 °C durante una noche. Al día siguiente, se recogieron tres colonias individuales y se realizó una PCR de colonias usando los cebadores nanPUF 5'-TTC CCT AGC TCA CAG TTA GGT GAT-3' (SEQ ID NO:6) / nanPUR 5'-TCT GCA ATT TCT TTC CAT TCT TTT GGA TCT-3' (SEQ ID NO: 16) y hyaDF 5'-ATG ATA TTT GAG AAG TCG GCG G-3' (SEQ ID NO:14) / hyaDR 5'-GTA ATT TTC GTT CCC AAG GC-3' (s Eq ID NO: 17), como se ha descrito anteriormente (Lawrence y col., 2010). Los clones, como se esperaba, amplificaron una banda a 1,3 kb, en comparación con la cepa parental (3,150 kb), lo que indica un gen nanPU truncado. Se inoculó una única colonia de uno de los clones en medio de infusión de cerebro-corazón (BHI) en autoclave y se incubó a 37 °C/200 rpm durante una noche. Al día siguiente, los cultivos se diluyeron a 0,4 DO (densidad óptica a 600 nm) en caldo BHI y se dejaron crecer hasta la fase logarítmica. Una vez que los cultivos alcanzaron la fase logarítmica (DO600 = 0,8), se añadió un volumen igual de glicerol estéril al 50 %, se mezcló y se dividió en alícuotas en crioviales de 2 ml. La semilla maestra se congeló a una concentración de 2,64 x 108 UFC/ml.

[0094] La siembra en caldo maestra se sembró en placas TSA complementadas con sangre de oveja al 5 %, y se recogió una única colonia para confirmar la presencia de nanPU y hyaD truncadas por PCR (figura 5). La semilla maestra se envió al laboratorio de control de calidad interno (QC) para la prueba de esterilidad según 9CFR 113.27(b), y estaba desprovista de cualquier crecimiento extraño (fúngico/bacteriano). Se obtuvo una placa TSA que contenía Nan-Hya-05/08/2012 de P. mult 1062 del laboratorio de QC y se envió al laboratorio de diagnóstico interno para su identificación/confirmación según 9CFR 113.64(c)4. Después de confirmar que el crecimiento obtenido del laboratorio de QC era Nan-Hya-05/08/2012 de P. mult 1062 mutante, se analizó una sola colonia de la placa TSA de nuevo para determinar la presencia del gen nanPU y hyaD truncados por PCR. Se probó la seguridad de la semilla maestra en ratones consanguíneos [Hsd: ICR (CD-1®), Harlan], según 9CFR 113.33 y se encontró que no tenía ningún efecto adverso.

111. Evaluar la eficacia de las candidatas a la vacuna contra Pasteurella multocida

Objetivo:

[0095]

1. Vacunar a los terneros con vacuna viva modificada contra P. multocida por vía subcutánea.

2. Exponer a P. multocida 1062 de tipo natural para determinar la eficacia de la vacuna.

Materiales y procedimientos:

[0096] Producto: Cultivos en fase logarítmica de mutantes hyaD de P. multocida, hyaD/nanPU de P. multocida y nanPU de P. multocida.

[0097] Animales y alojamiento: Había un total de 15 terneros, de 4 semanas de edad y alojados en 4 corrales diferentes como se describe en la Tabla 1.

Tabla 1: Gru os de tratamiento

Vacunación:

[0098]

1. Se cultivó una solución madre de glicerol recién preparada de vacuna contra P. multocida durante una noche en medio BHI, se colocó en placas (TSA) al día siguiente y se incubó a 37 °C. Al día siguiente, las placas se rasparon y se diluyeron en medio RPMI complementado con suero fetal bovino inactivado al 2 %. El inóculo se cultivó a 37 °C/200 rpm hasta que se alcanzó la DO600 deseada.

2. El cultivo se diluyó a 109 UFC/dosis de vacuna y se puso en placas de dilución para enumerar las UFC/ml exactas al día siguiente.

3. La vacuna se transportó en hielo y se mantuvo en hielo durante la vacunación.

4. Ruta y dosis: subcutánea, 1 ml por cada lado del cuello.

5. Se observó el lugar de la inyección en busca de reacciones adversas.

6. Los terneros del grupo de control recibieron solo medio RPMI.

[0099] El programa de estudio se describe en la Tabla 2.

Exposición: P. multocida 1062 de tipo natural

[0100]

1. Se cultivó una solución madre de glicerol recién preparada de P. multocida 1062 durante una noche en medio BHI, se colocó en placas (TSA) al día siguiente y se incubó a 37 °C. Al día siguiente, las placas se rasparon y se diluyeron en medio RPMI complementado con suero fetal bovino inactivado al 2 %. El inóculo se cultivó a 37 °C/200 rpm hasta que se alcanzó la DO600 deseada.

2. El cultivo se diluyó a aproximadamente 1010 UFC/exposición de vacuna y se puso en placas de dilución para enumerar las UFC/ml exactas al día siguiente.

3. El inóculo se transportó en hielo y se mantuvo en hielo durante la exposición.

4. Ruta: Transtraqueal usando una aguja de 14G x 1 pulgada.

5. Dosis: 3,78 x 1010 UFC/animal en 20 ml de RPMI, seguido de 60 ml de RPMI.

[0101] Una vez completado, el inóculo restante se puso en placas de dilución inmediatamente en el laboratorio.

[0102] Se monitorizaron los terneros para determinar cambios de comportamiento, incluyendo letargo, tos, secreción nasal, y se puntuaron como se muestra en la Tabla 2. Se monitorizaron las temperaturas rectales para los terneros que mostraron signos clínicos.

Instrucciones para la necropsia:

[0103]

1. Los animales que habían muerto, estaban débiles o que mostraban signos clínicos de neumonía se sacrificaron y se les hizo la autopsia inmediatamente por un veterinario autorizado.

2. Los terneros restantes se sacrificaron de forma humanitaria el día 5 mediante la inyección de pentobarbital (Euthasol, 20-30 ml a discreción del veterinario asignado) por animal.

3. Los pulmones se puntuaron para determinar lesiones neumónicas y se registraron como porcentaje de lesión en cada lóbulo.

4. Los tejidos pulmonares se recogieron para histopatología.

5. Se tomaron hisopos de los pulmones (lesiones) y la tráquea para la recuperación del organismo de exposición.

Tabla 2: Pro rama de estudio

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una cepa atenuada de Pasteurella multocida (P. multocida) para su uso en la provisión de una respuesta inmunitaria segura y eficaz en bovinos contra P. multocida o enfermedades causadas por P. multocida, caracterizada porque la cepa es la cepa depositada en la ATCC bajo la Designación de depósito de patente PTA-120624.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la composición comprende además un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.

3. La composición para su uso según la reivindicación 2, en la que la composición comprende además un adyuvante.

4. La composición para su uso según la reivindicación 3, en la que el adyuvante son bacterias inactivadas, virus inactivados, fracciones de bacterias inactivadas, lipopolisacáridos bacterianos, toxinas bacterianas o combinaciones de los mismos.

5. La composición para su uso según la reivindicación 4, en la que la composición es una composición de vacuna que proporciona una respuesta inmunitaria protectora en bovinos contra la exposición a P. multocida virulenta.

6. La composición para su uso según la reivindicación 4 o 5, en la que la composición comprende además al menos un antígeno adicional asociado con un patógeno bovino distinto de P. multocida.

7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en la que el al menos uno o más antígenos adicionales son capaces de provocar en un bovino una respuesta inmunitaria contra FMDV o BDV.

8. Una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el bovino tiene de aproximadamente 4 semanas a 6 semanas de edad.