ES2927971T3

ES2927971T3 - Composiciones inmunológicas que contienen Histophilus Somni atenuado

Info

Publication number: ES2927971T3
Application number: ES18210524T
Authority: ES
Inventors: Tammy Kolander; Paulraj Lawrence; Russell Bey
Original assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2022-11-14
Anticipated expiration: 2035-03-25
Also published as: JP2017517245A; BR112016021918A2; US20150273045A1; US10098941B2; EP3122374B1; WO2015148687A3; KR101924271B1; CL2016002402A1; KR20160128427A; CA2943786A1; AU2015236052B2; WO2015148687A2; AU2015236052A1; EA038530B1; PH12016501879B1; EP3488862B1; MX2016012372A; PH12016501879A1; CA2943786C; CN107197626A

Abstract

Esta descripción proporciona cepas atenuadas, composiciones que las comprenden y métodos de producción y uso de las mismas. Las cepas atenuadas pueden expresar niveles inferiores o nulos de diversos genes asociados con la virulencia, en relación con las bacterias patógenas correspondientes. Ventajosamente, las cepas atenuadas pueden administrarse por vía oral, intranasal, intratraqueal o subcutánea. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones inmunológicas que contienen Histophilus Somni atenuado

DECLARACIÓN SOBRE LISTADO DE SECUENCIA

[0001] El Listado de Secuencia asociado con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia de papel, y se incorpora por el presente mediante referencia en la memoria. El nombre del documento de texto que contiene el Listado de Secuencia es MER_13_225P_ST25. El archivo de texto es de 17.356 KB; fue creado 20 de febrero de 2014; y fue presentado electrónicamente a través de EFS-Web, simultáneamente con la presentación de la memoria.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere en general a vacunas genéticamente modificadas, bacterianas atenuadas, en particular aquellas que proporcionan protección amplia, segura y eficaz a bovinos frente a infecciones/enfermedad causadas por Histophilus somni (anteriormente Haemophilus somnus). La invención se refiere adicionalmente a procedimientos de la producción de bacterias atenuadas y de la identificación de variaciones de ácido nucleico que se asocian con patogenicidad disminuida de las bacterias atenuadas.

[0003] Por consiguiente, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas o de vacunas que comprenden las bacterias de la invención; por ejemplo, bacterias atenuadas vivas. Las bacterias también deberían estar desactivadas en las composiciones; pero puede ser ventajoso que las bacterias sean Histophilus somni atenuadas vivas. Por consiguiente, la invención se trata adicionalmente de los procedimientos de preparación y/o formulación de tales composiciones; por ejemplo, cultivando o desarrollando o propagando las bacterias sobre o en un medio adecuado, recolectando las bacterias, opcionalmente desactivando las bacterias, y opcionalmente mezclando conjuntamente con un portador, excipiente, diluyente o vehículo y/o un adyuvante y/o estabilizador veterinariamente adecuado o farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, la invención se refiere también al uso de las bacterias en la formulación de tales composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] El complejo de enfermedad respiratoria bovina (BRDC) consiste en múltiples patógenos microbianos y contribuye a la pérdida económica sustancial en la industria ganadera. Se calcula que los costes de tratamiento que incluyen tanto la vacunación preventiva como la medicación después del brote están cerca de $4 mil millones por año (Griffin, 1997). Al impacto económico se le añade la pérdida asociada en el rendimiento observado en los animales diagnosticados con BRDC; con pérdidas cuantificables para la ganancia diaria promedia, peso corporal durante la captura y grado de calidad de carne de vacuno (Babcock, 2010). Los informes sobre la pérdida monetaria específica asociada con el rendimiento disminuido cambian; probablemente debido a diferentes definiciones de casos de BRDC, pero se estiman entre $40 (Fulton, 2002) y casi $300 (Duff y Gaylean 2011) por animal. La pérdida de rendimiento también ha mostrado el aumento importante en el número de veces que un animal necesite un tratamiento contra BRDC (Fulton, 2002).

[0005] Histophilus somni (anteriormente Haemophilus somnus) ha sido identificado como un contribuidor clave en BRDC (Duff yGaylean 2011). Estos cocobacilos pleomórficos gram negativos pertenecen a la familia Pasterellacea (Korczak, 2004) constituyen una parte de la microbiota normal de los tractos respiratorio superior y urogenital en ganado, ovinos y otros rumiantes (Ward, 2006). Se relaciona estrechamente con otros patógenos bovinos que incluyen Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica (ambos de los cuales se asocian con BRDC) así como los patógenos humanos Haemophilus ducreyi y Haemophilus influenzae (Challacombe, 2007).

[0006] Los cálculos sitúan la tasa de aislamiento de H. somni de tracto respiratorio superior de terneros sanos tan alta como 50% sin ninguna manifestación clínica de la enfermedad; sin embargo, los animales diagnosticados con BRDC tienen una tasa de aislamiento incluso mayor para la bacteria (Griffin, 2010). En condiciones estresantes o estados de inmunosupresión, H. somni puede colonizar el tracto respiratorio inferior, endocardio o sistema nervioso central y se ha identificado como un agente etiológico en diferentes enfermedades como neumonía, endocarditis, artritis, aborto, septicemia y meningoencefalitis tromboembólica (TEME) (Ward, 2006).

[0007] En el momento de matanza, menos de 15% de animales que reciben un tratamiento adecuado para BRDC (vacunaciones preventivas y antibióticos apropiados durante el brote) muestran signos de lesiones pulmonares y estas lesione suponen menos de 5% del pulmón total (Griffin, 2010). En cambio, 50% de animales que no reciben cuidados adecuados muestran lesiones pulmonares en el momento de matanza, y estas lesiones pueden suponer 15% o más del pulmón total (Griffin, 2010). En un estudio de campo de más de 10.000 animales, 459 terneros (4.6%) murieron de la enfermedad de una forma o de otra. Acerca de mortalidades en el estudio, 279 (60,8%) mostraron tener relación con enfermedades respiratorias, y de aquellas con infecciones respiratorias, 226 (81,0%) se asociaron con neumonía, pleuresía o abscesos relacionados con H. somni (Ribble, 1988). Mientras que el tratamiento con antibióticos puede ser exitoso frente a una infección con H. somni, preocupa una frecuencia aumentada de cepas de campo resistentes a antibióticos (Duff y Gaylean, 2011). Se preferirían los cuidados preventivos mediante vacunación dado que son proactivos más que reactivos y son mucho más rentables.

[0008] US6770273B1 da a conocer un procedimiento de protección de ganado frente a enfermedades tales como septicemia, neumonía o aborto al inmunizarlo con una vacuna de H. somnus.

[0009] Muchas vacunas de H. somni están actualmente disponibles de diferentes empresas de salud de animales; sin embargo, estas vacunas se componen principalmente de bacterias muertas y se autorizaron hace más de treinta años con el objetivo de prevenir TEME. El uso de estas vacunas bacterianas ha sido eficaz frente a TEME, sin embargo, ha demostrado tener efectos neutrales o incluso negativos sobre enfermedad respiratoria en ganado en granjas de engorde. Los efectos secundarios negativos incluyen choque e interacciones anafilácticos inducidos por IgE, cuando los terneros infectados con el Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV) se vacunan (Griffin, 2010). La disminución en la frecuencia de TEME y la aparición de neumonía relacionada con H. somni en los EE. UU. y miocarditis en Canadá que empezaron a finales de 1980, dio paso a una necesidad de investigación adicional de antígenos eficaces para la producción de vacuna (O'Toole, 2009).

[0010] Neumonía relacionada con H. somni es una condición importante económicamente para las industrias de sector cárnico y lácteo. Existen pocas pruebas de eficacia de campo en vacunas disponibles actualmente, por lo tanto, se justifica la necesidad de investigación en los productos de vacunación de la siguiente generación.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

[0011] En un aspecto, la presente invención es una cepa de Histophilus somni (H. somni) atenuada, que es capaz de proporcionar una respuesta inmunitaria segura y eficaz en un animal bovino frente a H. somni, o enfermedades causadas por H. somni, que tienen al menos los siguientes genes mutados, incluidos completamente eliminados, en relación con una cepa virulenta de H. somni de referencia para eliminar la capacidad del gen a expresar su producto génico afín: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1726, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 y HSM_1793; en la que esta deficiencia relativa de genes que codifican el factor de virulencia hace que la cepa atenuada sea incapaz de causar una infección en el animal bovino; y que conserva además al menos los siguientes genes en comparación con una cepa H. somni altamente virulenta: HSM_0052, HSM_0164, HSM_0268, HSM_0274, HSM 0338, HSM_ 0346, HSM 0377, HSM 0394, HSM 0598, HSM_0695, HSM 0749, HSM 0844, HSM_0938, HSM_0977, HSM 0978, HSM 1022, HSM 1089, HSM 1090, HSM_ 1160, HSM 1212, HSM 1426, HSM_ 1484, HSM_1616, HSM_1647, HSM_ 1651, HSM_1667, HSM_ 1794 y HSM_1889.

[0012] En un aspecto adicional, la presente invención es una cepa H. somni atenuada, no natural, modificada genéticamente, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene al menos los siguientes genes mutados, incluidos completamente eliminados, para eliminar la capacidad del gen para expresar su producto génico de tipo salvaje afín: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1726, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 y HSM_1793; y que conservan además al menos los siguientes genes en comparación con una cepa H. somni altamente virulenta: HSM_0052, HSM_0164, HSM_0268, HSM_0274, HSM 0338, HSM_ 0346, HSM 0377, HSM 0394, HSM 0598, HSM_0695, HSM 0749, HSM 0844, HSM_0938, HSM_0977, HSM 0978, HSM 1022, HSM 1089, HSM 1090, HSM_ 1160, HSM 1212, HSM 1426, HSM_ 1484, HSM_1616, HSM_1647, HSM_ 1651, HSM_1667, HSM_ 1794 y HSM_1889.

[0013] En un aspecto adicional, la presente invención es una composición inmunológica o de vacuna que comprende o consiste esencialmente en la cepa atenuada de la invención.

[0014] En un aspecto adicional, la presente invención es la composición de la presente invención para su uso en un procedimiento para obtener la inmunidad protectora en un animal bovino que la necesita frente a una infección posterior por H. somni virulenta, que comprende la etapa de administración al animal bovina de dicha composición, preferiblemente en donde la composición se administra por la vía intranasal, subcutánea o intramuscular.

[0015] Un objeto de esta invención es proporcionar bacterias atenuadas así como también los procedimiento de tratamiento y profilaxis de la infección por H. somni.

[0016] En una realización, las vacunas comprenden H. somni atenuadas, que son menos patogénicas en comparación con una cepa más virulenta. El análisis completo de secuencia comparativa mostró la ausencia de factores importantes de virulencia en las cepas de H. somni atenuadas con relación a las cepas más virulentas. Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar H. somni atenuado que carecen de factores de virulencia que poseen las cepas de H. somni más virulentas.

[0017] Tal como se define en el presente documento, el término «gen» se utilizará en un sentido amplio y abarcará tanto las secuencias codificadas como no codificadas (es decir, secuencias reguladoras en la dirección 5' y en la dirección 3', promotores, UTR 5/3, intrones y exones). Cuando se dirige solamente a una secuencia codificadora de un gen, se utilizará el término «secuencia codificadora de un gen» o «CDS» de manera intercambiable a lo largo de esta divulgación. Cuando se trata de un ácido nucleico específico, el experto dispondrá al instante de todas las formas derivables de aquella secuencia (ARNm, ARNv, ARNc, ADN, proteína, etc.).

[0018] En el presente documento se describen los procedimientos para inducir una respuesta inmunológica (o inmunogénica) o protectora frente a H. somni, así como también los procedimientos para la prevención o el tratamiento de H. somni, o el(los) estado(s) de enfermedad causado(s) por H. somni, que comprenden la administración de H. somni atenuada, o una composición que comprende la H. somni atenuada para los animales que lo necesitan. Además, los equipos que comprenden al menos la(s) cepa(s) de H. somni debilita(s) y las instrucciones para su uso también se describen en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0019] La divulgación completa y habilitante de la presente invención, incluyendo la mejor forma de la misma, para un experto en la técnica, se expone más particularmente en el resto de la memoria descriptiva, que incluye referencia a las figuras adjuntas, en donde:

Figura 1 muestra el porcentaje promedio de lesiones pulmonares para cada cepa y dosis puestos a prueba en el modelo de exposición (“challenge”). Los grupos con diferentes letras son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba t de Student realizada sobre los datos de transformación con arcoseno;

Figura 2 muestra el porcentaje de lesiones pulmonares observadas para cada ternero en un estudio de vacunaciónexposición, en el que la vacuna se administró por la vía intranasal. Las barras del mismo color representan los resultados para los animales vacunados con la misma cepa. La cepa de vacunación se enumera a continuación en la parte inferior de las barras, y todos los animales se estimularon con la misma cepa de estimulación. Los grupos acompañados con la(s) misma(s) letra(s) son considerablemente diferentes de acuerdo con la prueba t de estudiante realizada sobre los datos de transformación con arcoseno.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0020] La presente invención da a conocer las secuencias de nucleótidos y genes involucrados en la atenuación de un microorganismo, tal como bacterias, por ejemplo, H. somni, productos (por ejemplo, proteínas, antígenos, inmunógenos, epítopos) codificados por las secuencias de nucleótidos, procedimientos de producción de tales secuencias de nucleótidos, productos, microorganismos y los usos de los mismos, tales como preparación de vacunas o composiciones inmunogénicas o provocación de una respuesta inmunológica o inmune o como un vector, por ejemplo, un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión in vitro o in vivo).

[0021] Las mutaciones identificadas en las secuencias de nucleótidos y en los genes de microorganismos producen mutantes debilitados innovadores y no evidentes. Estos mutantes son útiles en la producción de composiciones inmunogénicas atenuadas vivas o vacunas atenuadas vivas que poseen un alto grado de inmunogenicidad.

[0022] La identificación de las mutaciones proporciona productos de secuencias de nucleótidos y genes innovadores y no obvios codificados por las secuencias de nucleótidos y los genes.

[0023] Tal como se describe en el presente documento, la invención da a conocer una cepa H. somni atenuada capaz de proporcionar una respuesta inmunitaria segura y eficaz en ganado frente a H. somni o enfermedades causadas por H. somni.

[0024] En el presente documento se describen las bacterias que contienen una mutación atenuada en una secuencia de nucleótidos o un gen, en el que la mutación modifica la actividad biológica de un polipéptido o una proteína codificado por un gen, que da lugar a virulencia atenuada de la bacteria.

[0025] En el presente documento se describen las cepas de H. somni atenuadas y vacunas que comprenden la misma, que provocan una respuesta inmunogénica en un animal, particularmente, las cepas de H. somni atenuadas que provocan, inducen o estimulan una respuesta en un bovino.

[0026] Las cepas debilitas de H. somni particulares de interés poseen mutaciones en genes relativos a cepas virulentas. Se reconoce que, además de las cepas que tienen las mutaciones divulgadas, las cepas disminuidas que tienen cualquier número de mutaciones en los genes de virulencia divulgados pueden utilizarse en la práctica de esta invención.

[0027] En otro aspecto, las cepas de H. somni atenuadas innovadoras de la invención se formulan en una vacuna segura, eficaz frente a H. somni e infecciones/ enfermedades causadas por H. somni.

[0028] En una realización, la cepa H. somni atenuada de la invención es capaz de proporcionar una respuesta inmunitaria segura y eficaz en un bovino frente a H. somni o enfermedades causadas por H. somni.

[0029] Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada carece de uno o diferentes genes de virulencia que tienen relación con una cepa virulenta similar genéticamente pero diferente. Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada carece y/o no expresa la proteína de familia de glucósido hidrolasa (HSM_1160) y la lipoproteína (HSM_1714). Los genes ausentes que pueden contribuir también al fenotipo debilitado de la cepa incluyen: oxidasa multicobre de tipo 3 (HSM_1726) y un regulador transcripcional de familia TetR (HSM_1734). En una realización incluso más particular, la cepa atenuada es la misma la que se deposita en las ATCC bajo la designación dePTA-121029.

[0030] En una realización, la cepa puede administrarse por la vía intranasal o subcutánea.

[0031] En otro aspecto, la invención abarca una composición inmunológica que comprende las cepas de H. somni debilitas divulgadas de la invención. La composición puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente o veterinariamente.

[0032] En una realización, la composición de la invención puede proporcionar una respuesta inmunitaria segura o protectora en bovinos frente al problema posterior de H. somni virulenta.

[0033] Tal como se describe en el presente documento, la composición puede comprender una cepa H. somni genéticamente modificada, de origen no natural, atenuada, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene al menos los siguientes genes mutados, que incluyen completamente eliminados, para eliminar la capacidad de los genes para expresar su producto génico afín: HSM_0270, HSM_0338, HSM_0377, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0953, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1426, HSM_1616, HSM_1624, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793 y HSM_1889. En una realización particular, la cepa H. somni modificada tiene un fenotipo debilitado idéntico en comparación con TK #4.

[0034] Tal como se describe en el presente documento, la composición puede comprender una cepa H. somni genéticamente modificada, de origen no natural, atenuada, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene un número suficiente de los siguientes genes mutados, que incluyen completamente eliminados, para eliminar la capacidad de los genes para expresar su producto génico afín: HSM_0270, HSM_0338, HSM_0377, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0953, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1426, HSM_1616, HSM_1624, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793 y HSM_1889. Tal como se describe en el presente documento, la cepa H. somni modificada tiene un fenotipo debilitado idéntico en comparación con TK #4.

[0035] Tal como se describe en el presente documento, la composición puede comprender una cepa H. somni genéticamente modificada, de origen no natural, atenuada, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene al menos los siguientes genes mutados, que incluyen completamente eliminados, para eliminar la capacidad del gen para expresar su producto génico afín: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1726, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 y HSM_1793; En una realización particular, la cepa H. somni modificada tiene un fenotipo debilitado idéntico en comparación con TK #42.

[0036] Tal como se describe en el presente documento, la composición puede comprender una cepa H. somni genéticamente modificada, de origen no natural, atenuada, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene un número suficiente de los siguientes genes mutados, que incluyen completamente eliminados, para eliminar la capacidad del gen para expresar su producto génico afín: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1726, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 y HSM_1793; En una realización particular, la cepa H. somni modificada tiene un fenotipo debilitado idéntico en comparación con TK #42.

[0037] Tal como se describe en el presente documento, la composición puede comprender una cepa H. somni genéticamente modificada, de origen no natural, atenuada, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene al menos los siguientes genes mutados, que incluyen completamente eliminados, para eliminar la capacidad del gen para expresar su producto génico afín: HSM_0268, HSM_0270, HSM_0274, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0938, HSM_1022, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1212, HSM_1257, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1667, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793y HSM_1889. Tal como se describe en el presente documento, la cepa H. somni modificada tiene un fenotipo debilitado idéntico en comparación con TK #34.

[0038] En una realización relacionada, la composición puede comprender una cepa H. somni genéticamente modificada, de origen no natural, atenuada, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene un número suficiente de los siguientes genes mutados, que incluyen completamente eliminados, para eliminar la capacidad del gen para expresar su producto génico afín: h Sm_0268, HSM_0270, HSM_0274, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0938, HSM_1022, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1212, HSM_1257, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1667, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793 y HSM_1889. Tal como se describe en el presente documento, la cepa H. somni modificada tiene un fenotipo debilitado idéntico en comparación con TK #34.

[0039] Ahora que los Solicitantes han divulgado estos equipos adecuados de eliminación de genes debilitados, el experto en la técnica apreciará que solamente queda el trabajo no rutinario para determinar cuales subcombinaciones de eliminaciones de estos genes son necesarias para producir de manera comparable o equivalente las cepas vacunales H. somni atenuadas.

[0040] En otra realización, la composición de la invención puede comprender adicionalmente al menos un antígeno adicional asociado con o derivado de un patógeno bovino distinto de H. somni.

[0041] En una realización, el(los) al menos uno o más antígeno(s) adicional(es) es(son) capaz(es) de provocar en ganado una respuesta inmunitaria frente a H. somni, complejo de enfermedad respiratoria bovina (BRDC), virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), diarrea viral bovina (^dV^b), parainfluenza bovina de tipo 3 (PI3), rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR), herpesvirus bovino de tipo1 (BHV-1), virus de enfermedad de la lengua azul (BTV), o cualquier otro patógeno capaz de infectar y causar enfermedad o predisposición a enfermedad en un bovino.

[0042] En el presente documento se describe un procedimiento de vacunación de un animal que comprende la administración de al menos una de las composiciones inmunológicas divulgadas que comprende las cepas de H. somni atenuadas.

[0043] En una realización, las vacunas con H. somni de la invención comprenden adicionalmente un adyuvante. En una realización particular, el adyuvante comprende la bacteria completa y/o bacterias que incluyen clostridium, H. somni, Mannheimia, Pasteurella, Histophilus, Salmonella, Escherichia coli, o combinaciones y/o variaciones de las mismas. En diferentes realizaciones, el adyuvante aumenta la producción de IgM, IgG, IgA y/o combinaciones de los mismos en un animal.

[0044] En el presente documento se describe una cepa Histophilus somni (H. somni) atenuada, que es capaz de proporcionar una respuesta inmunitaria segura y eficaz en un animal bovino frente a H. somni; en donde la cepa atenuada carece, en su secuencia genómica, de un número mínimo de genes que codifican factor de virulencia, que tiene relación con una cepa H. somni virulenta de referencia, para representar a la cepa atenuada incapaz de causar una infección en el animal bovino.

[0045] Tal como se describe en el presente documento, la cepa virulenta de referencia comprende una secuencia de DNA genómico, que codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, la cepa atenuada codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO:1, 3, 4, o 5. En una realización particular, la(s) cepa(s) debilita(s) expresa(n) cualquier gen con factor de virulencia a un nivel aproximadamente igual a, o inferior a que (incluyendo una nivel no detectable), el nivel del gen de virulencia correspondiente expresado mediante una cepa atenuada para su genoma la secuencia como se enuncia en SEQ ID NO:1, 3, 4 o 5.

[0046] Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada carece de al menos aproximadamente 99% de los mismos genes, que tienen relación con la cepa H. somni 2336, como lo hace la cepa H. somni #4. En esta realización, la cepa 2336 comprende una secuencia genómica que codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO:6; y la cepa #4 comprende una secuencia genómica, que codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO:1.

[0047] Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada es la cepa #4 (es decir, TK #4), que se deposita en las ATCC bajo la denominación PTA-121029. En otra realización, la cepa atenuada es la cepa #42 (es decir, TK #42), que se deposita en las ATCC bajo la denominación PTA-121030.

[0048] En el presente documento se describe la invención que proporciona composiciones inmunológicas que comprenden cualquiera de las cepas atenuadas descritas en el presente documento. En una realización, la composición comprende una cepa atenuada que codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO:1, 3, 4 o 5.

[0049] Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 1. Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada codifica todos los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 1.

[0050] En una realización, la cepa atenuada codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 4. En una realización relacionada, la cepa atenuada codifica todos los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 4.

[0051] Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 3. Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada codifica todos los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 3.

[0052] Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada codifica al menos aproximadamente 99% de los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 5. Tal como se describe en el presente documento, la cepa atenuada codifica todos los mismos genes como lo hace la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 5.

[0053] En una realización, la composición inmunológica de la invención comprende adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente o veterinariamente.

[0054] En una realización particular, la composición inmunológica de la invención es capaz de provocar en un animal bovino una respuesta inmunitaria protectora, que protege al bovino frente a una exposición posterior a una cepa H. somni virulenta.

[0055] En otra realización, la composición inmunológica de la invención comprende adicionalmente al menos uno o más antígenos adicionales, que son capaces de provocar en un animal bovino una respuesta inmunitaria específica de patógeno. En una realización particular, el al menos uno o más antígenos adicionales provoca en el bovino una respuesta inmunitaria suficiente para proteger al animal de una exposición posterior al patógeno del cual se deriva el antígeno. Por consiguiente, si un antígeno PI3 bovino se incluye como un componente de la composición inmunológica, la composición debería provocar una respuesta inmunitaria protectora.

[0056] En otra realización, el antígeno adicional es capaz de provocar en un animal bovino una respuesta inmunitaria, que potenciará la respuesta inmunitaria de animal frente a una exposición posterior al Complejo de Enfermedad Respiratoria Bovina, BRSV, BVD, PI3 o cualquier otro patógeno capaz de infectar y causar enfermedad o predisposición a enfermedad en un animal bovino. Por ejemplo, un antígeno BRSV proporcionará la protección frente a una exposición posterior a BRSV virulento.

[0057] En el presente documento se describe un procedimiento de vacunación de un animal bovino que comprende la etapa de administración al animal bovino de al menos una dosis de una composición inmunológica tal como se describe en el presente documento.

[0058] El término «antígeno» o «inmunógeno» significa una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria al presentarse a un animal huésped; un polipéptido, un péptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno el antígeno puede comprender una toxina o una antitoxina.

[0059] Los términos «proteína», «péptido», «polipéptido» y «fragmento del polipéptido» se usan indistintamente en este documento para referirse a los polímeros de los residuos de los aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender los aminoácidos modificados o los análogos de los aminoácidos y puede estar interrumpido mediante partes químicas distintas de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o mediante la intervención; por ejemplo, formación de enlace de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un marcaje o un componente bioactivo.

[0060] El término «polipéptido inmunogénico o antigénico», tal como se utiliza en el presente documento incluye los polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido que cuando se administran al huésped, son capaces de evocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por tanto, un fragmento de proteína según la invención comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o un determinante antigénico. Una proteína o un polipéptido «inmunogénico», tal como se utiliza en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por «fragmento inmunogénico» se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y, por tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Dichos fragmentos pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Volumen 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente un gran número de los péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos que corresponden a las partes de la molécula de proteína, y que hacen reaccionan a los péptidos con los anticuerpos mientras los péptidos todavía están unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. Número 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos tal como, por ejemplo, mediante la cristalografía de los rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Véanse, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen a fondo en PCT/US2004/022605 incorporada en el presente documento mediante referencia en su totalidad.

[0061] Tal como se describe en el presente documento, la invención abarca fragmentos y variantes activos del polipéptido antigénico. Por consiguiente, el término «polipéptido inmunogénico o antigénico» contempla adicionalmente las eliminaciones, las adiciones y las sustituciones de la secuencia, siempre que el polipéptido funciona para producir una respuesta inmunológica tal como se define en el presente documento. El término «variación conservadora» significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo similar biológicamente o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de nucleótidos de tal modo que el residuo de aminoácido codificado no cambie o es otro residuo similar biológicamente. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos -- aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados: glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina a veces se clasifican como los aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrofóbico, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina y similares; o una sustitución conservadora similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente que no tendrá un efecto mayor sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la molécula de referencia pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína se encuentran, por tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término «variación conservadora» también incluye el uso de un aminoácido sustituido en el lugar de una matriz de aminoácido no sustituido a condición de que los anticuerpos elevados hasta el polipéptido sustituido también interactúan con el polipéptido no sustituido.

[0062] El término «epítopo» se refiere al sitio en un antígeno o un hapteno al que las células B y/o las células T responden. El término también se usa indistintamente con «determinante antígeno» o «sitio determinante antigénico». Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0063] Una «respuesta inmunológica» a una composición o una vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por los anticuerpos a una composición o una vacuna de interés. Normalmente, una «respuesta inmunológica» incluye, pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de los anticuerpos, las células B, las células T auxiliares, y/o las células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o los antígenos incluidos en la composición o la vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de tal manera que se potenciará la resistencia frente a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o una ausencia de los síntomas y/o signos clínicos de enfermedad que un huésped infectado presenta normalmente, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral reducido en el huésped infectado.

[0064] Por «animal» se entiende mamíferos, pájaros y similares. Animal o huésped tal como se utiliza en el presente documento incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse entre el grupo que consiste en equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes y otros felinos que incluyen guepardos y linces), ovinos (por ejemplo, ovejas), bovinos (por ejemplo, ganado, terneros, bueyes, toros), porcinos (por ejemplo, cerdos), aviar (por ejemplo, gallinas, patos, gansos, pavos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emús y casuarios), primates (por ejemplo, prosimios, tarseros, monos, gibones, simios), hurones, focas y peces. El término «animal» incluye también a un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo las etapas neonata, embrionaria y fetal.

[0065] A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Los términos singulares «un», «una» y «el/la» incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0066] Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o los párrafos, los términos tales como «comprende», «comprendido», «que comprende» y similares pueden tener el significado atribuido a ellos en la Legislación de patentes de EE. UU.; por ejemplo, pueden significar «incluye», «incluido», «que incluye» y similares; y aquellos términos tales como «que consiste esencialmente en» y «consiste esencialmente en» tienen el significado atribuido a ellos en la Legislación de patentes de EE. UU., por ejemplo, se contemplan elementos no recitados explícitamente, pero se excluyen los elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.

Composiciones

[0067] La presente invención trata de una vacuna o una composición de H. somni que puede comprender una cepa H. somni atenuada de la invención y un portador, excipiente o vehículo aceptable farmacéuticamente o veterinariamente que provoca o estimula una respuesta en un animal.

[0068] El término «ácido nucleico» y «polipéptido» hace referencia a ARN o ADN que es lineal o ramificado, de cadena única o doble o un híbrido del mismo. El término abarca también los híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son los ejemplos no limitativos de los polinucleótidos: un gen o un fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender los nucleótidos modificados, tales como los nucleótidos metilados y los análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de los nucleótidos puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, como mediante conjugación, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son las tapas, la sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo y la introducción de los medios de acoplamiento del polinucleótido a las proteínas, iones metálicos, componentes del marcado, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos pueden obtenerse mediante la síntesis química o derivarse de un microorganismo.

[0069] El término «gen» se utiliza en un sentido amplio para hacer referencia a cualquier segmento de polinucleótido asociado a una función biológica. Por consiguiente, los genes incluyen intrones y exones como en una secuencia genómica o solamente las secuencias de codificación como en ADNc y/o las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Por ejemplo, el gen también hace referencia a fragmento de ácido que expresa ARNm o ARN funcional o codifica una proteína específica y que incluye secuencias reguladoras.

[0070] Un componente biológico «aislado» (tal como un ácido nucleico o proteína o orgánulo) hace referencia a un componente que ha sido sustancialmente separado o purificado a de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que el componente es de origen natural, por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómicos o extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y las proteínas que han sido «aislados» incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas mediante procedimientos estándares de purificación. El término abarca también ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante la tecnología recombinante así como la síntesis química.

[0071] El término «variación conservadora» significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo similar biológicamente o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de nucleótidos de tal modo que el residuo de aminoácido codificado no cambie o es otro residuo similar biológicamente. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán de manera general conservadoras en su origen, tal como se describe anteriormente.

[0072] El término «recombinante» significa un polinucleótido semisintético, o de origen sintético que o no tiene origen natural o está ligado a otro polinucleótido en una disposición que no se encuentra en la naturaleza.

[0073] «Heterólogo» significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de la ingeniería genética en un plásmido o un vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0074] Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, UTR 5', UTR 3', exterminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades adicionales de transcripción bajo control del mismo promotor o diferente, secuencias que permiten clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped y cualquier tal construcción como se pueda desear para proporcionar las realizaciones de esta invención.

Procedimientos del Uso y Artículo de Fabricación

[0075] En el presente documento se describe un procedimiento de vacunación de un animal que comprende la administración de una composición que comprende una cepa H. somni atenuada y un portador, excipiente o vehículo aceptable farmacéuticamente o veterinariamente a un animal que se da a conocer. Tal como se describe en el presente documento, el animal es un bovino.

[0076] Tal como se describe en el presente documento, se puede utilizar un régimen de estimulación-refuerzo, que se consiste en al menos una administración de estimulación y al menos una administración de refuerzo utilizando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. Típicamente, la composición o la vacuna inmunológica utilizada en la administración de estimulación son distintas en su naturaleza de aquellas utilizadas como refuerzo. Sin embargo, se observa que la misma composición puede utilizarse como la administración primaria y la administración de refuerzo. El protocolo de administración se llama «estimulación-refuerzo».

[0077] Un régimen de estimulación-refuerzo comprende al menos una administración de estimulación y al menos una administración de refuerzo utilizando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administración primaria puede ser diferente en su origen de aquellas utilizadas como una vacuna de refuerzo posterior. La administración de estimulación puede comprender una o más administraciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

[0078] El volumen de la dosis de composiciones para especies diana que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de la dosis de composiciones para ganado o bovinos, basándose en antígenos bacterianos, es generalmente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2,0 ml, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0 ml y entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 1,0 ml.

[0079] La eficacia de las vacunas puede ponerse a prueba desde aproximadamente 3 hasta 5 semanas después de la última inmunización en animales en cuestión, tales como bovinos, con una cepa virulenta, heteróloga de H. somni. El animal puede someterse a la prueba de estimulación por la vía intranasal, intratraqueal y/o transtraqueal. Las muestras de conductos nasales, tráquea, pulmones, cerebro y/o boca puede recogerse antes y después de la prueba de exposición y puede analizarse la presencia de anticuerpos específicos de H. somni.

[0080] Las composiciones que comprenden las cepas virales atenuadas de la invención utilizadas en los protocolos de estimulación-refuerzo se contienen en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. Los protocolos de la invención protegen al animal de H. somni y/o impiden la progresión de la enfermedad en un animal infectado.

[0081] Las distintas administraciones preferiblemente son una dosis de una administración, pero se podrían llevar a cabo múltiples dosis con desde 1 hasta 6 semanas de diferencia. Un intervalo de tiempo preferido es desde 2 hasta 3 semanas, y se contempla también una dosis de refuerzo anual. En una realización, las composiciones se administran a terneros que son entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6 semanas de edad. En otra realización, los terneros pueden ser entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4 semanas de edad.

[0082] En el presente documento se describe un equipo para llevar a cabo un procedimiento para provocar o inducir una respuesta inmunológica o protectora frente a H. somni en un animal que comprende una composición o vacuna inmunológica de H. somni atenuada para llevar a cabo el procedimiento de administración de una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en un animal.

[0083] En el presente documento se describe un equipo para llevar a cabo un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica o protectora frente a H. somni en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende una cepa H. somni atenuada de la invención para llevar a cabo el procedimiento de administración de una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en un el animal.

[0084] Los portadores o vehículos o excipientes farmacéuticamente o veterinariamente aceptables se conocen bien por un experto en la técnica. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl de 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón de fosfato. Otro portador o vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable que se puede utilizar en los procedimientos de esta invención incluye, pero no se limita a poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración de las bacterias atenuadas.

[0085] Aunque los resultados divulgados se obtuvieron sin el uso de un adyuvante, las composiciones y las vacunas inmunológicas pueden comprender adicionalmente o consistir esencialmente en un adyuvante adecuado. Los adyuvantes adecuados para su uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, (2) secuencia inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodeoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, d Da (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina o (8) otros adyuvantes tratados en cualquier documento citado o (9) cualquier combinación o mezcla de los mismos.

[0086] En una realización, los adyuvantes incluyen aquellos que facilitan absorción mejorada a través de recubrimiento mucoso. Algunos ejemplos incluyen MPL, LTK63, toxinas, PLG micropartículas y varios otros (Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627). En una realización, el adyuvante puede ser un quitosano (Van der Lubben et al.

2001; Patel et al. 2005; Majithiya et al. 2008; Patente de EE. UU. Número de Serie 5.980.912).

Referencias

[0087]

Alekshun, M. N. y Levy, S. B. 2007. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128(6):1037-1050.

Asgarali, A. Stubbs, K. A., Oliver, A., Vocaldo, D. J., y Mark, B. L. 2009. Inactivation of the Glycoside Hydrolase NagZ Attenuates Antipseudomonal p-Lactam Resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53(6):2274-2282.

Aubry, C et al. 2011. OatA, a peptidoglycan O-acetyltransferase involved in Listeria monocytogenes immune escape, is critical for virulence. J. Infect. Dis. 204(5):731-740.

Babcock, A.H. 2010. Epidemiology of Bovine Respiratory Disease and Mortality in Commercial Feedlots. Kansas State University (tesis doctoral).

Berghaus, L. J., Corbeil, L. B., Berghaus, R. D., Kalina, W. V., Kimball, R. A., y Gershwin, L. J. 2006. Effects of dual vaccination for bovine respiratory syncytial virus and Haemophilus somnus on immune responses. Vaccine. 24:6018-6027.

Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., y Hobman J. L. 2003. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiology Reviews. 27:145-163.

Challacombe et al. 2007. Complete Genome Sequence of Haemophilus somnus (Histophilus somni) strain 129Pt and Comparison to Haemophilus ducreyi 35000HP and Haemophilus influenzae Rd. Journal of Bacteriology 189(5); páginas 1890-1898.

Corbeil, L. B. et. al. 1985. Serum susceptibility of Haemophilus somnus from bovine clinical cases and carriers. Journal of Clinical Microbiology. 22(2):192-198.

Cox, A. D., Howard, M. D., Brisson, J.-R., Van Der Zwan M., Thibault, P., Perry, M. B., y Inzana, T. J. 1998. Structural analysis of the phase-variable lipooligosaccharide from Haemophilus somnus strain 738. European Journal of Biochemistry. 97:253(2):507-516.

Daines D. A. , Jarisch J., y Smith A. L. 2004. Identification and characterization of a nontypeable Haemophilus influenzae putative toxin-antitoxin locus. BMC Microbiol. 26 de julio; 4:30.

Duff y Gaylean 2011. Recent Advances in Management of Highly Stressed, Newly Received Feedlot Cattle. Journal of Animal Science. 85; páginas 823-840.

Garbe, J. y Collin, M. 2012. Bacterial Hydrolysis of Host Glycoproteins - Powerful Protein Modification and Efficient Nutrient Acquisition. Journal of Innate Immunity. 4:121-131.

Fulton, R.W. et al. 2002. Evaluation of Health Status of Calves and the Impact on Feedlot Performances: Assessment of a Retained Ownership Program for Postweaning Calves. Can. J. Vet. Res. 66, 173-180.

Geertsema, R. S., Worby, C., Kruger, R. P., Tagawa, Y., Russo, R., Herdman, D. S., Lo, K. Kimball, R. A., Dixon, J. y Corbeil, L. B. 2008. Protection of mice against H. somni septicemia by vaccination with recombinant immunoglobulin binding protein subunits. Vaccine. 26:4506-4512.

Gershwin, L. J., Berghaus, L. J. Arnold, K., Anderson, M. L. Corbeil, L. B. 2005. Immune mechanisms of pathogenic synergy in concurrent bovine pulmonary infection with Haemophilus somnus and bovine respiratory syncytial virus.

2005. Veterinary Immunology and Immunopathology. 107:119-130.

Griffin, D. 2010, Bovine Pasteurellosis and other Bacterial Infections of the Respiratory Tract. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 26(1); páginas 57-71.

Griffin, D. 1997. Economic Impact Associated with Respiratory Disease in Beef Cattle. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 13; páginas 367-377.

Guzmán-Brambila, C et al. 2012. Two Outer Membrane Lipoproteins from H. somni are Immunogenic in Rabbits and Sheep and Induce Protection against Bacterial Challenge in Mice. Clinical and Vaccine Immunology. 19(11):1826-1832.

Huston, W. M., Jennings, M. P., McEwan, A. G. 2002. The multicopper oxidase of Pseudomonas aeruginosa is a ferroxidase with a central role in iron acquisition. Molecular Microbiology. 45(6):1741-1750.

Kahler, C. et. al. 1996. IgtF and RfaK constitute the lipooligosaccharide ice (inner core extension) biosynthesis operon of N. meningitidis. J. Bacteriology. Dec. 6677-6684.

Kjos, M., Snipen, L., Salehian, Z., Nes, I. F. y Diep, D. B. 2010. The Abi proteins and their involvement in bacteriocin self-immunity. Journal of Bacteriology. 192(8):2068-2076.

Korczak et. al. 2004. Phylogeny of the Family Pasteurellaceae based on rpoB sequences. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology. 54; páginas 1393-1399.

Liu, T. et. al. 2008. Immunological responses against S. enterica serovar Typhimurium Braun lipoprotein and lipid A mutant strains in Swiss-Webster mice: Potential use as live-attenuated vaccines. Microbial Pathogenesis. 44(3):224-237.

Perera, I. C. y Grove, A. 2010. Molecular Mechanisms of Ligand-Mediated Attenuation of DNA Binding by MarR Family Transcriptional Regulators. JMCB. 2(5):243-254.

O'Toole et al. 2009. Diagnostic Exercise: Myocarditis due to Histophilus somni in Feedlot and Backgrounded Cattle. Veterinary Pathology. 46; páginas 1015-1017.

Ramos, J. L., Martinez-Bueno, M., Molina-Henares, A. J., Terán, W., Watanabe, K., Zhang, X., Trinidad Gallegos, M., Brennan, R., y Tobes, R. 2005. The TetR family of Transcriptional Repressors. MMBR. 69:326-356.

Ribble et al. 1988. Efficacy of Immunization of Feedlot Cattle with a Commercial Haemophilus somnus bacterin. Canadian Journal of Veterinary Research. 52; páginas 191-198.

Schafer, A et al. 1994. Cloning and characterization of a DNA region encoding a stress-sensitive restriction system from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and analysis of its role in intergenic conjugation with E. coli. J. Bacteriology. 176(23):7309-7319.

Ward et al. 2006. Haemophilus somnus (Histophilus somni) in Bighorn Sheep. Canadian Journal of Veterinary Research. 70; páginas 34-42.

[0088] A continuación se describirá la invención con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

[0089] En la literatura se presenta una cantidad de factores de virulencia de H. somni. Ningún factor de virulencia único parece estar dominando el papel de patógeno, pero en cambio, varios factores parecen actuar de manera conjunta para hacer que un aislado determinado sea virulento. Se identificaron varios factores de virulencia: DR2 (una repetición directa que contiene un diseño Fic citotóxico conservador con el dominio IbpA involucrado en resistencia a suero), hsst-I (CMP-Neu5Ac-p-Gal-a-(2-3)-sialiltransferasa, donde la sialilación del lipooligosacárido (LOS) ha demostrado inhibir la unión a anticuerpo), lob2b (que codifica una glicotransferasa involucrado en la síntesis de LOS), nan lyase (N-acetilneuraminato liasa, involucrada en el metabolismo de ácido siálico), nan epimerase (N-acetilmannosamina-6-fosfato-2-epimerasa, involucrado en el transporte y el metabolismo de carbohidratos), luxS (involucrado en la detección de quórum de AI-2) y uspE (una proteína de estrés universal necesaria para la movilidad y la agregación celular en la formación de biopelícula). Los cebadores se diseñaron para amplificar cada uno de estos genes y se optimizaron los parámetros de reacción de PCR.

[0090] Se seleccionaron cincuenta aislados para el cribado. Los criterios para la selección de aislados eran que tenían que estar aisladas dentro de aproximadamente un año a partir de inicio del estudio y tenían que provenir de diferentes localizaciones geográficas o de casos de interés particular con alta diversidad genotípica posible. El objetivo de todo esto era observar a los aislados más actuales indicativos de H. somni en el campo y también poner a prueba y cribar tanta diversidad como sea posible. Los aislados se evaluaron por su crecimiento y presencia en colonias, además de realización de reacciones de PCR definidas para cada factor de virulencia de interés. Las reacciones de PCR se visualizaron en un 1% de gel de agarosa. Siguiendo la selección de aislados basándose en su crecimiento, presencia en colonias y resultados de PCR, los modelos de animales se identificaron y se utilizaron para evaluar los aislados de interés.

Ejemplo 1 - Modelo de Desarrollo de Prueba de Exposición de Ratón con H. som ni

[0091] Basándose en crecimiento, diversidad geográfica e información de la secuencia, se seleccionaron 21 aislados para la evaluación en ratones (Tabla 1).

Tabla 1. Se evaluaron los aislados para un candidato de vacuna de H. somni de origen natural.

[0092] Los aislados almacenados a -80 °C se colocaron en rayas en placas de agar Columbia con Sangre de Oveja 5% (CSBA) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Las placas se incubaron a 37 °C con 5% de CO². Después de 18 horas de crecimiento, las placas se lavaron con 2 mL de DPBS y la solución resultante se diluyó con DPBS adicional y se mezcló a una proporción de 1:1 de cultivo y FBS (precalentado hasta la temperatura ambiente) para obtener una concentración final de entre 5 x 108 y 1 x 109 de UFC/dosis. A continuación se añadió FBS, los cultivos se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente para sobrerregular los factores de virulencia H. somni y a continuación, se colocaron sobre hielo.

[0093] Cada grupo de diez ratones de 18-20 g de NSA: CF-1 (Harlan Sprague Dawley)/aislado se inyectó con 0,5 cc por la vía intraperitoneal (IP) con su aislado asignado. A un grupo de control de diez ratones se le administró DPBS FBS. Se colocaron las tapas de filtro sobre la parte superior de cada una de las jaulas de ratones con una jaula equitativa a diez ratones/aislado. Los aislados se diluyeron y se colocaron en placas, las placas se incubaron a 37 °C con 5% de CO²durante dos días. Las placas se contaron y se determinó el UFC/dosis actual para cada aislado. Adicionalmente, cinco ratones se inyectaron por la vía subcutánea con aislados 2336 o TK #33, para determinar si esta vía de administración sería una alternativa viable (para evaluar la virulencia) en comparación con la vía intraperitoneal. Después de la prueba de exposición, los ratones se observaron a diario para la mortalidad.

[0094] La mayoría de aislados produjeron un rendimiento medio hasta superior 8 logs de UFC/dosis. El procedimiento de la vía subcutánea resultó ser un procedimiento sin éxito para la prueba de exposición en ratones. Los aislados TK #4, TK #24, TK #14, los controles y 2336 dieron como resultado al menor porcentaje de mortalidad, mientras que los aislados TK #1, TK #2, TK #21, TK #28 y TK #30 dieron como resultado el mayor porcentaje de mortalidad (Tabla 2).

Tabla 2. Porcentaje de mortalidad cuando los ratones de 18-20 g se sometieron a prueba de exposición con aislados cultivados en placas.

[0095] Modelo de Prueba de Exposición. Se realizaron dos estudios para determinar la UFC/dosis y preparación de cultivo de prueba de exposición ideales para ratones que serían mayores en estudios de vacunación-exposición que en el estudio anterior (es decir, teniendo en cuenta el crecimiento de tres semanas entre la vacunación y la prueba de exposición). Para el primer estudio, se utilizaron cuarenta ratones de 25-30 g de NSA:CF-1 (Harlan Sprague Dawley). El aislados TK #21 de H. somni se colocó en rayas en CSBA. Después de -24 horas de crecimiento a 37 °C con 5% de CO²el aislado se sembró sobre CSBAs adicionales y se cultivó bajo las mismas condiciones durante 18-20 horas. Cada placa se lavó con 2 mL de DPBS y se recogió el líquido. Se crearon las disoluciones del lavado de la placa original para generar dos soluciones adicionales que variaban en UFC/dosis. Cada disolución se mezcló en una proporción de 1:1 con FBS para lograr concentraciones finales de fluidos de la prueba de exposición que oscilaban entre mínimo 8 logs y mínimo 9 logs/dosis. Se crearon los fluidos de control con una proporción de 1:1 de DPBS y FBS. Todos los cultivos con FBS añadidos se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y, a continuación, se colocaron sobre hielo. Todos los ratones se sometieron a prueba de exposición con 0,5 cc por la vía intraperitoneal y se controlaron para la mortalidad después de la prueba de exposición. Los cultivos de prueba de exposición se diluyeron y se colocaron en placas para determinar la UFC/dosis ideal necesaria para la mortalidad máxima.

[0096] Cuando el cultivo de prueba de exposición TK #21 se cultivó en placas y los ratones eran mayores (25-30 g), para contabilizar su tamaño deseado tres semanas después de la vacunación, el porcentaje más alto de mortalidad se logró a 5,7 x 108 UFC/dosis (Tabla 3).

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad cuando los ratones de 25-30 g se sometieron a prueba de exposición con aislados cultivados en placas.

[0097] Se llevó a cabo un estudio final de prueba de exposición con treinta ratones de 25-30 g de NSA: CF-1 (Harlan Sprague Dawley) para comparar la diferencia entre el crecimiento en el cultivo de prueba de exposición sobre las placas (como se realiza de manera común en la literatura) y en caldo. De manera similar tal como se indica anteriormente, el aislado TK #21 se eliminó de almacenaje congelado y se sembró sobre las placas adicionales. Para el cultivo de caldo, se lavó una placa con 2 mL de caldo Columbia y se añadieron 50 pL a 25 mL de caldo Columbia precalentado. El cultivo se agitó vigorosamente después de que se añadió el lavado de cultivo y, a continuación, se colocó en un agitador fijado a 37 °C y 250 rpm. El crecimiento se controló y el cultivó se detuvo, cuando se consideró que el cultivo final de la prueba de exposición, con todos los fluidos añadidos, contendría una media de 8 logs/dosis. También se preparó un cultivo de prueba de exposición mediante el lavado de placas, tal como se indica anteriormente, con el cultivo diluido con DPBS hasta aproximadamente la misma concentración como el cultivo de caldo. Tanto el cultivo de caldo como de placas se mezcló a una proporción de 1:1 con FBS y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de colocarse sobre hielo. Once ratones/procedimiento se sometieron a prueba de exposición con 0,5 cc por la vía intraperitoneal del lavado de placas o el caldo y 10 ratones sirvieron como controles administrándoles una mezcla en partes iguales de caldo Columbia y DPBS, que a continuación se mezclaron a una proporción de 1:1 con FBS. Los ratones se controlaron para la mortalidad después de la prueba de exposición y se terminaron las disoluciones y colocación en placas para determinar UFC/dosis.

[0098] Mayor mortalidad en ratones de 25-30 g tuvo lugar cuando los ratones se sometieron a prueba de exposición con el aislado #21 cultivado en caldo en comparación con el mismo aislado cultivado en placas (Tabla 4). Este resultado era inesperado, particularmente considerando que la literatura alejó al experto del cultivo de H. somni en caldo para su uso en un estudio de prueba de exposición virulenta (Berghaus et. al., 2006; Geertsema et. al., 2008; Gershwin et. al., 2005).

Tabla 4. Porcentaje de mortalidad cuando los ratones de 25-30 g se sometieron a prueba de exposición con aislados liv n l l .

[0099] Se compraron ciento treinta ratones de NSA: CF-1 de 18-20 g de Harlan Sprague Dawley. Se seleccionaron cinco aislados de H. somni (TK #42, TK #14, TK #4, TK #24 y TK #34) de los estudios anteriores como candidatos para la vacuna. Estos aislados se eliminaron del almacenaje y se colocaron en rayas sobre CSBA cuando se incubaron durante -24 horas a 37 °C y 5% de CO². Los aislados se transfirieron a CSBAs nuevos y se sembraron en la superficie de placa donde se dejaron crecer durante ~18 horas. Las placas se lavaron con 2 mL de caldo Columbia. Para los aislados TK #42 y TK #34, se añadieron 100 pL de lavado de placa a 25 mL de caldo Columbia, y para los aislados TK #4, TK #14 y TK #24, se añadieron 50 pL de lavado de placa a 25 mL de caldo Columbia, basándose en los estudios anteriores que involucraban el crecimiento de estos aislados.

[0100] Los cultivos se incubaron a 37 °C y 200 rpm. Se controló el crecimiento de los aislados y se eliminaron los cultivos de la incubación y se diluyeron con caldo Columbia para contener aproximadamente 1 x 108 de UFC/dosis y se realizó una disolución a 1:10 de esto para generar otra vacuna calculada a 1 x 107 de UFC/dosis para cada aislado. Un grupo de control se vacunó con caldo Columbia esteril y otro grupo de control se vacunó con el SOMUBAC® comercialmente disponible (Zoetis, vacuna Histophilus desactivada, complementada con hidróxido de aluminio, Kalamazoo, MI).

[0101] Cada vacuna se mantuvo sobre hielo después de su preparación y cada grupo incluía 10 ratones, con la excepción del grupo de control de Columbia que incluía 6 ratones. La vacuna se administró por la vía subcutánea a 0,5 cc. Después de la vacunación, las vacunas se disolvieron y se colocaron en placas para determinar la UFC/dosis actual y se controlaron a diario los ratones para reacciones adversas y/o muerte. Se determinó la endotoxina involucrada en cada vacuna con el equipo Limulus Amebocyte Lysate (Lonza, Alendale, NJ).

[0102] Diecinueve días después de la vacunación, los ratones se sometieron a prueba de exposición con aislado TK #21 H. somni. El tipo salvaje se preparó para el crecimiento en caldo de manera similar como se mencionó anteriormente, con la excepción de que 150 pL de lavado de placa se utilizaron para inocular cada uno de 2 matraces que contenían 75 mL de caldo Columbia precalentado cada una. Las matraces se incubaron a 37 °C y 250 rpm. El cultivo se elimino de la incubación, se diluyó y se mezcló a una proporción de 1:1 con FBS a temperatura ambiente para contener una media de 8 logs/dosis. El cultivo se incubó con el FBS a temperatura ambiente durante 5 minutos y se colocó sobre hielo. El producto de prueba de exposición era la dilución colocada en placas antes de y después de la prueba de exposición para determinar, si la UFC/dosis coincidía con la estimación. Se administraron 0,5 cc de cultivo de prueba de exposición por la vía intraperitoneal a ratones y se controlaron a diaria para mortalidad.

[0103] Los ratones vacunados con SOMUBAC® (Zoetis, vacuna Histophilus desactivada, complementada con hidróxido de aluminio), y los aislados TK #34 y TK #22 a 8 logs, desarrollaron reacciones rojas en el sitio de inyección. Todos los aislados, a excepción de TK #22, proporcionaron alguna protección a ratones antes de la prueba de exposición, en comparación con el grupo de control. El aislado TK #4 fue eficaz en ambas dosis de vacunas, sin embargo, el aislado TK #34 fue mejor a 8 logs y los aislados TK #24 y TK #42 eran mejores a 7 logs. Con ambas dosis, el aislado TK #14 proporcionó alguna protección, pero menos que los otros (Tabla 5). Los aislados TK #24 a 8 logs y TK #42 a 8 logs provocaron muerte un ratón de 10 después de la vacunación, antes de la prueba de exposición.

Tabla 5. El porcentaje de mortalidad en ratones vacunados con un aislado con virulencia baja y puestos a prueba de exposición con un aislado de virulencia alta.

Ejemplo 2 - Prueba de Exposición en Terneros con H. som ni

[0104] Antes de poner a prueba a los candidatos de vacunas, ha de desarrollarse un modelo de prueba de exposición en terneros. Para este estudio, se utilizaron veinte terneros Holstein. Los terneros se sometieron a prueba de exposición a 54 días de edad utilizando o el aislado TK #21 o 153-3 (desarrollada a partir de terneros con enfermedad crónica confirmada provocada por H. somni). El cultivo de prueba de exposición se preparó en un caldo similar al descrito anteriormente. Para la UFC/dosis del cultivo de prueba de exposición, se utilizó una curva estándar fijada previamente (y = -5 x 10'8x 92.017 (x = UFC/mL e y = %T (540 nm)) para determinar las disoluciones necesarias para lograr una concentración final de la prueba de exposición de -2,5 x 108 y 2,5 x 109 UFC/dosis para cada aislado. El cultivo se diluyó con EBSS seguido de la adición de FBS a una proporción de 1:1 después de la cual los cultivos se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los cultivos de prueba de exposición se colocaron sobre hielo conjuntamente con EBSS adicional para lograr la dosis de la prueba de exposición. Por cada uno de 4 terneros por aislado y dosis, se administraron 20 cc de prueba de exposición por la vía transtraqueal y fue seguido hasta los pulmones con 60 cc de EBSS. Cuatro animales permanecieron como controles sin prueba de exposición, a los que se les administraron EBSS y FBS a una proporción de 1:1. El cultivo de prueba de exposición se diluyó y se puso en pacas antes de y después de la prueba de exposición para determinar la CFU actual administrada. Los signos clínicos se calificaron y se registraron a diario por la misma persona tal como sigue:

T l . ri ri Ev l i n i n líni l Pr Ex ii n n T rn r

[0105] La puntuación clínica total se calculó para cada animal mediante la suma de puntuaciones determinadas para cada categoría. Si un animal apareció muerto o cumplió el criterio de eutanasia, se llevó a cabo una necropsia y se retiraron los pulmones. El veterinario responsable evaluó los pulmones para el % de lesiones de área de superficie, y los tejidos se sometieron a análisis. 4 días después, los animales se sometieron a eutanasia y necropsia tal como se menciona anteriormente. Las lesiones pulmonares se transformaron con arco seno y se analizaron mediante la función «JMP Ajustar Y por X» y se separaron los promedios con la prueba t de estudiante.

[0106] Veinticuatro terneros machos Holstein se dividieron entre cinco rediles que contenían cinco animales cada uno para la vacunación y 4 animales sirvieron como controles sin vacunar. Adicionalmente, cuatro animales del grupo de modelo sin prueba de exposición de prueba de exposición se mantuvieron vivos en consideración de que el estudio de vacunación-prueba de exposición se programó para su realización para la semana siguiente. Se retuvieron en un redil separado. Estos animales, a los que se hace referencia como controles del modelo de prueba de exposición, eran un control experimental adicional para ver si estando en el mismo establo pero no en el mismo redil como los animales de prueba de exposición podrían afectar a los resultados cuando estos animales se sometiesen a la prueba de exposición. Se prepararon las vacunas como para ratones utilizando los aislados TK #28, TK #42, TK #4 y TK #34. Los cultivos de vacunas se prepararon de manera similar al cultivo de prueba de exposición son la adición de FBS. Se calculó que las vacunas contenían 5 x 108 UFC/dosis y una dosis era 2 cc, 1 cc administrado en cada fosa nasal.

[0107] Las vacunas se diluyeron y se colocaron en placas antes de y después de la vacunación para determinar la UFC/dosis actual. Se controló la salud de animal después de la vacunación. Se recogieron frotis nasales y muestras de sangre de animales al día -17 (un día después de llegada), día 0 (fecha de vacunación, edad de ternero = 35 días de edad), día 14, día 21 y día 33 (fecha de prueba de exposición). Los frotis nasales se entregaron a Newport Laboratories Diagnostic Lab para cultivos bacterianos y las muestras de sangre se mantuvieron para la posible serología. Todos los animales con la adición de los 4 animales de control del estudio de modelo de prueba de exposición se sometieron a prueba de exposición del mismo modo como se menciona anteriormente con una 5 x 109 UFC/dosis calculada. Los signos clínicos, lesiones pulmonares, cultivos bacterianos, PCR de Mycoplasma y estadísticas se realizaron tal como se menciona anteriormente con la puntuación clínica total y se analizaron las lesiones pulmonares con JMP Ajustar Y por X.

[0108] Para el estudio de prueba de exposición, la UFC/dosis actual colocada en placas era muy cercana a la 2,5 x 109 o 2,5 x 108 UFC/dosis aproximada que se pronosticó. A los animales sometidos a prueba de exposición con el aislado TK #21 se les administró 3,9 x 109 UFC/dosis para el grupo de 9 log y 2,9 x 108 UFC/dosis para el grupo de 8 log. A los animales sometidos a prueba de exposición con el aislado 153- 3 se les administró 1,8 x 109 UFC/dosis para el grupo de 9 log y 1,7 x 108 UFC/dosis para el grupo de 8 log.

[0109] Se observaron más signos clínicos de enfermedad en los animales sometidos a prueba de exposición con el aislado TK #21 a 9 logs que en cualquier otro grupo de prueba de exposición (Tabla 7). Adicionalmente, se observaron lesiones pulmonares más graves en animales sometidos a prueba de exposición con el aislado TK #21 que en cualquier otro grupo de prueba de exposición (Figura 1). La mayoría de los terneros que tuvieron lesiones neumónicas tuvieron H. somni recuperada del tejido pulmonar. Durante todo el estudio, se recuperó P. multocida de los frotis nasales y el tejido pulmonar, pero no parecía que fuera un factor contribuyente de los síntomas de enfermedad, dado que los animales no mostraron signos clínicos de neumonía hasta después de la prueba de exposición. También, muchos de los animales confirmaron ser positivos o sospechosos de M. bovis en el tejido pulmonar. Tal como se esperaba, no se detectó ninguna M. bovoculi.

Tabla 7. Sum m i i n líni n r n l i l m l r exposición.

[0110] La concentración actual de bacterias utilizada para la vacunación era alrededor de la 5 x 108 UFC/dosis estimada. H. somni se recuperó solamente después de la vacunación con las bacterias vivas de dos de tres animales en cada una de las fechas de recogida de frotis nasales de día 14, día 21 y día 33 después de la vacunación. Los frotis nasales demostraron que H. somni puede permanecer viable en los conductos nasales durante un periodo de 21-33 días si no más (Tabla 8).

Tabla 8. Concentración de bacterias y endotoxinas administradas a terneros vacunados por la vía intranasal con aislados TK #28, TK #42, TK #4 y Tk #34, y el número de aialdos de H. somni recuperados de los animales vacunados a lo lar o del estudio.

[0111] La concentración del aislado TK #21 administrado a cada ternero en el momento de prueba de exposición era de 7,39 x 109 UFC/dosis. La prueba era eficaz para determinar la eficacia de las vacunas y para determinar la vacuna candidata más eficaz. Los signos clínicos y el porcentaje de lesiones pulmonares muestran que el aislado TK #4 era la vacuna más eficaz y el aislado TK #34 era la menos eficaz, mientras que los aislados TK #28 y TK #42 se encuentran en un punto intermedio (Tabla 9; Figura 2). H. somni se recuperó de los pulmones de todos los terneros en el estudio, con la excepción de 3 terneros todos de los cuales fueron vacunados con el aislado TK #4, indicando que la causa de la muerte y/o enfermedad para animales con lesiones pulmonares se atribuía al aislado de prueba de exposición. Durante el estudio se recupero P. multocida de los conductos nasales de algunos terneros, cada vez más mientras el estudio avanzaba. Después de la prueba de exposición, se recuperó P. multocida del tejido pulmonar de 9 de los 28 terneros y se detectó M. bovis en los pulmones de tres de estos animales. La vacunación no parecía tener correlación con la presencia o la ausencia de P. multocida o M. bovis. Adicionalmente, los controles del modelo de prueba de exposición no eran propensos a la prueba de exposición cuando se compararon con los animales de control de este estudio. Dado que los controles de modelos de prueba de exposición permanecieron en el mismo establo como los animales de prueba de exposición, podrían haber desarrollado un poco de inmunidad de la exposición anterior (Tabla 9).

Tabla 9. Puntuaciones clínicas de animales vacunados por la vía intranasal y sometidos a prueba de exposición con i lv H. mni.

Análisis.

[0112] Dado que los datos en el modelo de ratón tenían buena correlación con los resultados obtenidos en terneros, los inventores han proporcionado una nueva y útil herramienta para seleccionar a los candidatos de vacuna/prueba de exposición en bovinos. El aislado TK #21 es un aislado de prueba de exposición excelente debido a su virulencia y la reproducibilidad de los resultados. La dosis de prueba de exposición ideal parece ser alrededor de 9 logs medios hasta superiores por dosis en ganado cuando se administra por la vía transtraqueal.

[0113] Cuando se utilizó como una vacuna intranasal, el aislado TK #4, sirvió como protectora de manera importante contra la prueba de exposición posterior con H. somni (4 de 5 terneros). Los signos clínicos y las lesiones pulmonares se diferenciaban de manera importante de los no vacunados. Los aislados TK #28 y TK #42 indujeron un poco de protección en terneros vacunados, pero la eficacia era inferior (2 de 5 terneros).

Ejemplo 3 - Análisis Genómico Comparativo de aislados de H. som ni Virulentos y Avirulentos

[0114] Tal como se trata anteriormente, diferentes aislados de H. somni tenían diferentes niveles de virulencia en ratones y ganado. Una en particular, TK #4, fue prometedora como una vacuna candidato intranasal para ganado (Ejemplo 2). Adicionalmente, TK #21 resultó ser un aislado de prueba de exposición altamente virulenta para el ganado y ratones, teniendo un fenotipo típico de aislados de prueba de exposición utilizados en la literatura (2336 y HS91). Para entender mejor los factores que afectan a esta virulencia y también para determinar si los aislados adquiridos recientemente siguen siendo similares a aislados anteriores, ocho aislados de H. somni se sometieron a secuenciación genómica completa. Cuatro genes, una proteína de familia glucósido hidrolasas, una lipoproteína, una oxidasa multicobre de tipo 3, y un regulador transcripcional de familia TetR no se encontraron en TK #4, pero estaban presentes en TK #21. También, la H. somni aislada recientemente carecía desde 211 hasta 316 genes presentes en 2336, un tipo salvaje aislado en 1985. HS91, un aislado de 1991, carecía de solamente 15 genes en comparación con 2336. Los datos sugieren que el genotipo de TK #4 contribuye a su fenotipo avirulento, y que produce un cambio genético dentro de la población H. somni con el tiempo. Los resultados demuestran una explicación genética para la atenuación de TK #4 y la necesidad de vacuna y aislados de prueba de exposición actuales para mantener la eficacia de respuesta al cambio genético natural.

[0115] Para entender la base genética y molecular para la virulencia diferente se llevó a cabo un análisis genómico de comparación de 9 formas entre TK #4, TK #21, TK #34, TK #28, TK #42, HS91,2336 (un cepa altamente virulenta, al menos de acuerdo con la literatura), 129PT (una cepa avirulenta conocida en GenBank), y 153-3 (una cepa moderadamente virulenta), frente a aislado 2336 de GenBank. Este análisis mejorará nuestro entendimiento de posible cambio genético y delineará los genes involucrados en el mecanismo de virulencia/avirulencia.

Materiales y Procedimientos

Preparación de Muestras para la Secuenciación

[0116] Ocho aislados de H. somni se identificaron como un conjunto diverso de aislados que podría ser valioso en la secuenciación de genoma completo (Tabla 10). Estos aislados procedían de un número de localizaciones, tenían un rango amplio de virulencia y se aislaron de animales en años diferentes. Todos estos aislados se cultivaron en caldo Columbia (BD Ref# 294420; Lot# 0292713, Franklin Lakes, NJ) y después de crecimiento, se añadieron 10% de glicerol para congelar los cultivos en recipientes criogénicos (Fisher Scientific Cat.# 10-500-26, Waltham, MA) en instalaciones de Newport Laboratories Research and Development (Worthington, MN) en un congelador a -80°C. Las placas se eliminaron del congelador y se colocaron en rayas en placas de agar Columbia con Sangre de Oveja (CSBA) (BD Ref# 22165/221263; Lot# 22271322012 11 13, Franklin Lakes, NJ). Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C con 5% de CO². Después de 24-26 horas, las placas se eliminaron de la incubadora y se utilizaron para sembrar a CSBA adicional para su crecimiento durante la noche a 37 °C y 5% de CO². Después de 16-18 horas de incubación las placas se lavaron con 2 mL de caldo Columbia precalentado con 100 pL o 150 pL utilizados para empezar los cultivos en caldo de 25 mL de caldo Columbia para cada uno de los cultivos, utilizado un matraz para cada cantidad de inóculo. Los cultivos en caldo se agitaron a 200 rpm y se controlo el porcentaje de transmitancia (%T)(540 nm) hasta que los cultivos alcanzaron 15-20%T. Los cultivos en caldo se eliminaron de la incubadora, se tamizaron tres veces en la misma microcentrifugadora girando 1,5 mL de cultivo cada vez durante 2 minutos a 15.000 rpm, y se aisló el ADN genómico mediante el Equipo de Purificación de ADN Genómico Bacteriano (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD), siguiendo la recomendación del fabricante con ligera modificación. El ADN se extrajo por triplicado, de gránulos de centrifugación triple de cada cultivo. Una modificación en el proceso de extracción de ADN recomendado era que el ADN se volvió a suspender en 100 pL de TE y se incubó durante 15 minutos a 37 °C para facilitar la disolución del sedimento de ADN sin cizallar al ADN. A continuación, las tres extracciones se combinaron, se compararon en un gel de agarosa a 1% y se cuantificaron y se comprobó su pureza en un espectrómetro de Nanogotas. Se calcularon las cantidades de ADN para proporcionar el ADN total necesario para la secuenciación en la instalación principal de Universidad de Idaho (Moscú, ID).

T l 1 . Li i l H. mni iliz r l n li i n mi m r iv .

Filtración de lecturas de alta calidad y cobertura de secuencias

[0117] Para comparar 129PT de la base de datos de NCBI, Adhesión #CP000436, con 2336 Adhesión #CP000947, debe utilizarse un enfoque similar en los aislados de campo. Por consiguiente, se generaron pseudolecturas a partir de 129PT con el software de simulación de lecturas de ART (http://www.niehs.nih.gov/research/ resources/software/biostatistics/art/). ART se ejecutó con la siguiente línea de comando: art_illumina -i Hs129PT.fasta -p -1 250 -f 60 -m 500 -s 10 -na -o Hs129PT_sim, que equivale a -p=emparejado, -1=250bp, -f=60x cobertura, -m=tamaño promedio de fragmentos de ADN, -s=10 derivación estándar de tamaño de fragmento de ADN. A continuación, todas las lecturas de aislados se filtraron por calidad con los adaptadores Illumina TruSeq mediante SeqyClean, que es un programa de limpieza de lecturas desarrollado en la Universidad de Idaho (disponible en su página web). Este programa eliminó a los adaptadores de secuenciación y las lecturas de baja calidad que contenían 5 o más bases con un valor Q < 20, eliminando de este modo al error durante las lecturas básicas y aumentando la precisión.

Mapeo de Lecturas

[0118] Los resultados de ADN genómico se mapearon frente a 2336 en la base de datos de NCBI, Adhesión # CP000947 mediante los parámetros bowtie2 default. Se utilizó un filtrado mediante un script personalizado para MAPQ < 10 para eliminar lecturas mapeadas multiplicadas. Se espera que los aislados idénticos tengan una tasa de alineación > 95%.

Cobertura Genética

[0119] Se utilizó Samtools para calcular la cobertura de mapeo para cada posición frente a la 2336 de referencia. Esta se utilizó para calcular el porcentaje de bases que tenían una cobertura para cada gen. Los genes que contenían menos de 80% de bases se denominaron ausente para aquel aislado respectivo. Se realizaron dos análisis en genes ausente en comparación con 2336. El primero comparó HS91 (en un periodo similar a 2336), TK #21, TK #4, 153-3, y 129PT. El segundo comparó TK #34, Tk #42, 2336 (para confirmar que nuestra 2336 coincide con la base de datos), TK #28 y 129PT.

Islas de Patogenicidad (PIs) y Elementos Integrativos y Conjugativos (ICEs)

[0120] Los resultados de la secuenciación genómica completa de HS91, TK #21, TK #4, 153-3 y 129PT se compararon con 2336. Las islas patogénicas (PIs) y los Elementos integrativos conjugativos (ICEs) se examinaron basándose en la presencia de secuencias características complementarias tales como recombinases, integrasas, transposasas, helicasas y repeticiones de fagos. Las regiones genómicas que contienen un grupo de estas secuencias características putativas se identificaron como PIs o ICEs potenciales.

Resultados

[0121] Las secuencias limpias tuvieron una cobertura aproximada de 100x para todos los aislados. El alcance de la cobertura proporciona la seguridad en la calidad de las bases citadas (Tabla 11).

Tabla 11. calidad de las lecturas sin procesar y la cobertura básica aproximada para cada aislado secuenciado.

[0122] La alineación mostró las diferencias entre los aislados y la cepa de referencia. El aislado 2336 de GenBank tenía 99,67% de identidad con el genoma 2336 secuenciado por Newport Labs, indicando la validez y la precisión de nuestra comparación basada en mapeo entre genomas. A partir de ahí se hicieron las comparaciones de similitudes de otras aislados para 2336 con la segunda similitud más alta para HS91. También, la 129PT comensal (Adhesión # CP000436) en la base de datos de NCBI se alineó con 2336 de la base de datos como una referencia de comparación (Tabla 12).

Tabla 12. El porcentaje de los datos de secuenciación que se alinearon con la 2336 de GenBank Adhesión # P 47. L i l n m r n l lin i n n r n m l h m .

[0123] Entre los aislados, 129PT careció de muchos genes de virulencia y asociados a virulencia en comparación con la 2336 de tipo salvaje. Los aislados adquiridos más recientemente carecieron de más genes completos que los aislados más antiguos, cuando se compararon con la 2336 de tipo salvaje (Tabla 13).

Tabla 13. El número de genes aproximado presente o ausente para cada aislado secuenciado en comparación con 2336 Adhesión # CP00947 en la base de datos de NCBI.

**Adhesión # CP000436.

[0124] Cuando se compararon los genes que están ausentes en el primer y el segundo análisis en relación a 2336, 129PT, el comensal careció más de estos genes asociados con la patogenicidad y/o la virulencia que cualquier otro aislado comparado. En total 129PT careció de 44 de los 47 genes ausentes totales recopilados de HS91, TK #21, TK #4, 153-3 y 129PT (Tabla 14). También careció de 44 de los 47 genes ausentes totales recopilados de TK #34, TK #42, 2336 TK# 28 y 129PT (Tabla 15). Se descubrió que el aislado 2336 carecía de solamente un gen identificado asociado a patogenicidad presente en la base de datos de NCBI. Este gen es una proteína que contiene dominio YadA (Tabla 15).

[0125] El candidato para la vacuna, TK #4 careció de un total de 23 de los 47 posibles genes ausentes de los aislados analizados. Este candidato careció de los genes de acoplamiento y adhesión de hemaglutinina/hemolisina, proteínas que contienen dominio YadA (un total de 5 repeticiones ausentes), y una proteína que contiene dominio de hemaglutinina. TK#4 también careció de una proteína de unión a transferrina (para la absorción de hierro) y dos isoformas de oxidasa multicobre de tipo 3 que proporcionan la capacidad de absorción de metales almacenados en el huésped. Genes responsables de la colonización de huésped tales como proteína de familia glicósido hidrolasa (colonización de nasofaringe) y subtilisina kexina sedolisina S8/S53 de peptidasa también estaban ausentes en TK #4. También, estaban ausentes los genes que son responsables de la resistencia a los fármacos o respuesta a factores estresantes que incluyen dos isoformas de un regulador transcripcional de familia TetR, aciltransferasa 3, dos isoformas de un regulador transcripcional de familia MarR, pequeña proteína de resistencia a multifármacos, el regulador transcripcional de familia MarR y una proteína de sistema de restricciones sensible a estrés. Finalmente, TK #4 careció de algunos genes que afectan a la capacidad de patógeno de evadir las defensas de huésped, tales como lipooligosacárido sialiltransferasa, lipoproteína y la proteína de familia Abi (que está involucrada en autoinmunidad de bacteriocinas) (Tabla 14).

[0126] En comparación con 2336, la TK #21 altamente patogénica careció de genes similares de virulencia que estaban ausentes en TK #4 (19 de las 23 genes ausentes de TK #4), con la excepción de proteína de familia glucósido hidrolasa, lipoproteína, una isoforma de oxidasa multicobre de tipo 3 y una isoforma del regulador transcripcional de familia TetR. El único gen que TK #21 careció que TK #4 tubo una repetición de la proteína que contenía dominio YadA (Tabla 14).

[0127] HS91 era altamente similar a 2336 y igualmente virulenta de acuerdo con la literatura publicada. No se encontró que ninguno de los genes de virulencia o asociados a virulencia que potencialmente podrían jugar un papel en la patogénesis estaba ausente en HS91 (Tabla 14).

[0128] El aislado 153-3 careció de muchos de los genes potencialmente virulentos que se encontraron ausentes en Tk#4 (14 de los 23 ausentes en TK #4), pero existieron algunos genes adicionales que estaban ausentes que estaban presentes en TK #4 (23 estaban ausentes de un total de 47 identificados en todos los aislados). Además de TK #4, 153-3 careció de proteína de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa, adhesina, 10 repeticiones de la proteína que contiene dominio YadA (en comparación con 5 de TK #4), proteína de familia glicosiltransferasa y acetiltransferasa. Los genes que TK #4 careció, pero estaban presentes en 153-3 eran proteína de sistema de restricción sensible a estrés, proteína que contiene dominio de hemaglutinina, proteína de familia glicósido hidrolasa, lipooligosacárido sialiltransferasa, proteína de familia Abi, lipoproteína, una isoforma de la oxidasa multicobre de tipo 3, una isoforma del regulador transcripcional de familia TetR y subtilisina kexina sedolisina S8/ S53 de peptidasa (Tabla 14).

[0129] Los tres aislados recientes del segundo análisis tuvieron más genes ausentes que los aislados más antiguos. Tk #34 careció de la mayoría de los genes de los aislados recientes, 22 de 47. Estos genes incluyen proteína de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa, proteína similar a hemaglutinina/hemolisina, adhesina, sistema de restricción sensible a estrés, 6 repeticiones de proteína que contiene dominio YadA, proteína de unión a transferrina, dos isoformas de una proteína que contiene dominio de hemaglutinina, proteína de familia glicósido hidrolasa, regulador transcripcional de familia TetR, proteína lob1, dos isoformas del regulador transcripcional de familia MerR, oxidasa multicobre de tipo 3, pequeña proteína resistente a multifármacos, regulador transcripcional de familia MarR y subtilisina kexina sedolisina S8/S53 de peptidasa. De los 22 genes ausentes en TK #34, se descubrió que TK #42 carecía de 12. Estos incluían: proteína similar a hemaglutinina/hemolisina, 5 repeticiones de la proteína que contiene dominio YadA, una isoforma del regulador transcripcional de familia TetR, dos isoformas del regulador transcripcional de familia MerR, una isoforma de oxidasa multicobre de tipo 3, pequeña proteína de resistencia a multifármaco y regulador transcripcional de familia MarR. Además de los 12 genes también ausentes en TK #34, TK #42 también careció de una repetición de la proteína que contenía dominio YadA, proteína de familia glicosiltransferasa, proteína D asociada a virulencia (VapD), aciltransferasa 3, lipoproteína, otra isoforma de oxidasa multicobre de tipo 3 y otra isoforma del regulador transcripcional de TetR. Todos los genes ausentes en TK #42 estaban también ausentes en TK #28, sin ninguna excepción (Tabla 15).

Tabla 14. Genes implicados en virulencia que están ausentes en uno o más de los genomas analizados de HS91, TK #21, TK #4, 153-3 y 129^pT cuando se compararon con 2336 (Adhesión # CP00947).

Tabla 15. Genes implicados en virulencia que están ausentes en uno o más de los genomas analizados de TK #34, TK #42, #2336, TK# 28 y 129PT cuando se comparan con 2336 (Adhesión # CP00947 en la base de datos de

NCBI .

Siete PIs o ICEs putativos se identificaron a partir de la recopilación genómica completa.

[0130] El primero se encuentra entre HSM_R0009 hasta aproximadamente HSM_0254 (~28kb), pero no parece que estén presentes genes de virulencia importante, asociados a virulencia o resistentes a fármacos en esta localización. HS91 y 2336 contenían todos los genes presentes; sin embargo, TK #21, TK #4, 153-3, 129PT y TK #34 parecen carecer de la mayoría de los genes localizados en este PI o ICE. TK #42 y TK #28 contienen parte de este primer PI o ICE.

[0131] La segunda localización se encontró entre HSM_0319 y HSM_0348 (~41kb), y en esta localización se encontraron dos repeticiones de proteínas que contenían dominio YadA, una de las cuales no existió en TK #21, TK #4, 153-3 y 129PT y la otra estaba ausente en 153-3 y 129PT.

[0132] Una tercera PI se localizó entre HSM_0638 y HSM_0692 (~45kb). Los aislados 153-3, 129PT y TK #34 carecieron de muchos de los genes en esta PI o ICE potencial; sin embargo, ninguno fue identificado como gen de virulencia, asociado a virulencia o resistente a fármacos putativo, dado que muchos de los genes en la PI solamente se identificaron como proteínas hipotéticas.

[0133] Una cuarta localización de PI se encontró entre HSM_0847 y HSM_0923 (~73kb). De nuevo, no se identificó ningún factor de virulencia dentro de este rango; sin embargo, TK #21, TK #4, 153-3, 129PT y TK #34 carecieron de una mayoría de los genes que se encuentran en esta región.

[0134] Una quinta localización de PI se encontró entre HSM_1115 y HSM_1167 (~51kb). TK #4 carece de HSM_1129 hasta HSM_1146 y HSM_1149 hasta HSM_1167, esta región ausente incluye una proteína de familia glucósido hidrolasa. El aislado 129PT carece de HSM_1131 hasta HSM_1167, y TK #34 carece de HSM_1129 hasta HSM_1144 y HSM_1149 hasta HSM_1167, pero los otros aislados contienen la mayoría de estos genes presentes. También existe un regulador de respuesta de dos componentes en HSM_1124 que puede implicarse en la ayuda en la detección bacteriana y responder a una amplia variedad de ambientes. Todos los aislados secuenciados contienen este regulador de respuesta de dos componentes.

[0135] El sexto PI o ICE putativo es desde HSM_1615 hasta HSM_1719 (~101kb). En esta región, existe una proteína de familia Abi, aciltransferasa 3, proteína FhaB, proteína de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa, proteína Lob1, acetiltransferasa y una lipoproteína. TK #21, TK #4, 153-3, 129PT, TK #28, TK #42 y TK #34 carecen de algunos de estos (Tablas 14 & 15), aportando de manera potencial a sus diferentes niveles de virulencia.

[0136] El último PI o ICE potencial se encuentra desde HSM_1860 hasta HSM_R0065 (~38kb). Un gen clave que está ausente en TK #21, TK #4, 129PT y TK #34 en esta región es subtilisina kexina sedolisina S8/S53 de peptidasa, que es importante para la colonización inicial de huésped. Existen otros genes ausentes en TK #21, TK #4, 129PT, TK #34, T^k#42 y TK #28, la mayoría de los cuales se identifican como proteínas o transposasas hipotéticas. HS91, 153 3, TK #42, 2336 y TK #28 parecen contener la mayoría o toda esta región completa intacta.

Análisis

[0137] TK #4 parece ser suficientemente atenuada, mientras que es todavía capaz de provocar una respuesta inmunitaria adecuada, haciendo de la cepa un candidato fuerte para la vacuna. TK #4 carece de algunos genes similares a otros aislados adquiridos aproximadamente en el mismo año; sin embargo, algunos de los genes ausentes son únicos para TK #4, que incluyen: una proteína de familia glucósido hidrolasa (GHFP), una lipoproteína (LP), una oxidas multicobre de tipo 3 y un regulador transcripcional de familia TetR. Algunos genes, que están ausentes tanto en TK #4 como en aislados patogénicos, pueden contribuir al fenotipo atenuado, sin embargo, estos genes no parecen ser necesarios para la avirulencia.

[0138] Por otra parte, dos genes únicamente ausentes en TK #4, mientras estén presentes en cepas patogénicas, proteína de familia glucósido hidrolasa y lipoproteína, parecen ser necesarios y suficientes para el fenotipo atenuado de TK #4.

[0139] Un enlace causal entre la ausencia de expresión de estos dos genes en TK #4-y la virulencia atenuada se respalda por el trabajo previamente publicado, que indica que las proteínas GHFP y LP juegan un papel importante en la colonización y la evasión de defensas en huéspedes (Asgarali et. al. 2009; Garbe yCollin, 2010; Liu et. al. 2008; y Guzmán-Brambila et. al. 2012 ). Es más, los datos indican que mientras que TK #4 no se atenúa como 129PT, las cepas proporcionan protección (de prueba de exposición virulenta posterior) tanto en ganado como en ratones.

[0140] TK #34 también es altamente atenuada similar a TK #4; sin embargo, TK #4 carece de un número mayor de genes involucrados en la evasión de huésped. TK #4 y TK #34 ambas carecen de diferentes isoformas o repeticiones de proteínas que contienen dominio de hemaglutinina y proteínas que contienen dominio YadA, respectivamente. TK #34 carece de una proteína de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa y la proteína lob1, que contiene TK #4. TK #4 carece de una lipooligosacárido sialiltransferasa, proteína de familia Abi, aciltransferasa 3, lipoproteína, multicobre 3 y regulador transcripcional TetR que están presentes en TK #34. Los resultados indican que la combinación de factores ausentes de virulencia contribuyen a una bacteria parcialmente atenuada que es protectora en ratones y ganado (TK #4) o a un aislado altamente atenuado, pero no protectora para ratones y ganado (TK #34). En el presente documento los datos indican que un experto podría predecir con antelación cuales de los genes deberían eliminarse para obtener una cepa de vacuna H. somni suficientemente atenuada, pero todavía suficientemente protectora.

[0141] Finalmente, parece que la transferencia horizontal de genes no superó algunos genes de resistencia a este aislado, y una carencia de otros factores de virulencia parece haber atenuado al aislado suficientemente para hacerlo incapaz de causar enfermedad. Por otra parte, la presencia de más factores de virulencia que en una cepa comensal convierte a TK #4 en un candidato fuerte de vacuna (es decir, la cepa puede sobrevivir un periodo de tiempo suficientemente largo para estimular la respuesta inmunitaria humoral en un huésped y proporcionar la protección a largo plazo).

[0142] Se descubrió que TK #21 era un aislado altamente virulento en ratones y ganado. Sin embargo, genéticamente, era más similar a aislados actuales, TK #4 y 153-3 (menos virulentas en relación con TK #21), mientras que al mismo tiempo más divergente de otras cepas virulentas conocidas, 2336 y HS91. TK #21 tuvo una proteína de familia glucósido hidrolasa, una lipoproteína, una isoforma de oxidas multicobre de tipo 3 y una isoforma del regulador transcripcional de familia TetR que TK #4 careció. Estos 4 genes todos pueden contribuir a la atenuación de TK #4. Se descubrió que los genes más únicos que no lo tenían no estaban ausentes como diferentes isoformas en TK #21, eran glucósido hidrolasa y una lipoproteína. Estos genes in combinación parecen ser necesarios para causar la diferencia suficiente entre una aislado de prueba de exposición (tiene los genes) y un candidato a la vacuna (carece de los genes). TK #21 careció de una proteína que contenía un dominio Yad A que TK #4 tuvo; sin embargo, no parece que contribuya a la carencia de la virulencia. Parece que la virulencia asociada con TK #21 no se debe a su divergencia a partir de 2336, pero en cambio a sus diferencias sutiles a partir de TK #4.

[0143] Los aislados más recientes de TK #21, TK #4, 153-3, TK #34, TK #42 y TK #28 parecen ser similares, pero son notablemente diferentes de 2336 y HS91 (véanse Tabla 15). Los datos sugieren que la población de H. somni se evoluciona con el tiempo y que el aislado de la prueba de exposición aceptado de manera general de 2336 puede ya no ser relevante para terneros del grupo de gen H. somni a la que se enfrentan actualmente. Esto también proporciona evidencias de apoyo para TK #4 como un candidato a la vacuna, dado que su composición genética es altamente relevante para las cepas divulgadas en el complejo de enfermedad respiratoria bovina. La tasa de alineación apoya que HS91 y 2336 se relacionan muy estrechamente y que TK #21, TK #4, 153-3, TK #34, TK #42 y TK #28 se relacionan estrechamente. También muestra que los aislados actuales son diferentes genéticamente de aquellas aisladas en los años 1980-1990s. También, cuando se observa la ausencia de gen, los aislados más actuales carecen de números altos de 2336 genes en comparación con HS91, y los aislados actuales también tienden carecer de genes similares. Esto implica que los genomas están a la deriva de manera natural en H. somni. También, dado que los aislados actuales representan estados diferentes dentro de los EE. UU., esto implica que la deriva genética que se observa en el presente documento es representativa de la población actual de H. somni en los EE. UU.

[0144] En general, este dato indica que una combinación de un número de genes puede ser necesaria para convertir a un aislado en una vacuna o candidato de prueba de exposición eficaz, y la pérdida de solamente unos cuantos genes puede atenuar al candidato de manera suficiente para salvar a un animal frente a quitarle la vida. Este dato sugiere también, que la población de H. somni no está a la deriva a lo largo de tiempo y que la industria necesita evolucionar para mantener las vacunas relevantes. Los datos apoyan firmemente la importancia de vacunas autógena, así como reevaluación periódica de eficacia de vacunas comerciales.

Tabla 16. Las variantes identificadas (con respecto a 2336, adhesión #CP00947) para cada aislado analizado con "SAMTools m ileu ."

[0145] Además de muchos SNPs identificados (Tabla 16), también existieron numerosos genes ausentes (Tablas 17 23). Los aislados más recientes (TK #21, TK #4, 153-3, TK #34, TK #42 y TK #28) y 129PT contenían la mayoría de SNPs, mientras que HS91 de tipo salvaje, mutantes de HS91 y 2336 contenían pocos SNPs para todos los genes asociados a la virulencia. Para la biosíntesis de LOS o la modificación de genes, se encontró el porcentaje más alto de SNPs en los genes de glicosiltransferasa y acetiltransferasa en ambos análisis, y en lob2b del análisis de grupo 2. El aislado 129PT careció de la mayor parte de biosíntesis de LOS o modificación de genes. Para los genes de adhesión, colonización y formación de biopelícula, la mayor parte de SNPs tuvo lugar en las proteínas que contenían dominio YadA y las proteínas que contenían dominio de hemaglutinina. En los aislados recientes estaban ausentes muchos genes de la adhesión, colonización y formación de biopelícula. La glucósido hidrolasa en el grupo 1 y en ambos grupos de los receptores dependientes de TonB tuvieron la mayor parte de SNPs durante la invasión de huésped o absorción de metales. Muchos de los genes de respuesta a estrés, resistencia a antibiótico y genes de descarga de fármacos estaban ausentes en la mayoría de los aislados más nuevos. De aquellos que estaban presentes, el porcentaje de SNPs era bastante bajo con la excepción del regulador transcripcional de familia TetR en el grupo 1.

[0146] Para los genes involucrados en la biosíntesis o la modificación de LOS, todas los aislados con la excepción de 129PT tuvieron 1 indel en proteína P1 para transporte de OMP. TK #21 y TK #34 tuvieron 1 y 2 indeles, respectivamente, para lob2b. Todos los aislados recientes tuvieron 1 indel para pgmB, pero no las cepas más antiguas de HS91 y 2336. TK #42 y TK #28 tuvieron 1 indel en una proteína de familia glicosiltransferasa y tuvieron 1 indel en lob2a. El aislado 129PT tuvo un indel en neuAHS.

[0147] En el análisis del grupo 1 de indeles no sinónimos para los genes asociados a la virulencia implicados en la adhesión, colonización y formación de biopelícula, TK #21 y TK #4 tuvieron la mayoría de indeles. Estos tuvieron lugar en las proteínas que contenían YadA (26 indeles totales para TK #21 y 32 indeles totales para TK #4), proteínas de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa (6 indeles totales para TK #21 y 5 indeles totales para TK #4), y 1 indel para TK #21 en una adhesión. El aislado 153-3 también tuvo algunos indeles en el grupo 1 pero careció de la mayoría de los genes analizados, en cierto modo similares a 129PT. De aquellos genes presentes con indeles no sinónimos eran proteínas que contenían dominio YadA (total de 6 indeles), una proteína de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa (3 indeles), y una proteína que contenía dominio de hemaglutinina (1 indel; Tabla 19). Para el análisis del grupo 2 de la adhesión, colonización y formación de biopelícula, los aislados TK #34, TK #42 y TK #28 tuvieron la mayoría de indeles. Los indeles estaban presentes en las proteínas que contenían dominio YadA (24 indeles totales para ^tK #34, 31 indeles totales para TK #42 y 31 indeles totales para ^tK #28), proteínas de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa (2 indeles totales para TK #34, 4 indeles totales para TK #42 y 4 indeles totales para TK #28), y 1 indel para una proteína que contenía dominio de hemaglutinina para TK #34. También, 129PT tuvo 7 indeles para las proteínas que contenían dominio YadA y1 indel en una proteína que contenía dominio de hemaglutinina, aunque careció de muchos de los genes analizados. Por último, HS91 AaroC y HS91 AnanPU tuvieron 3 y 2 indeles totales, respectivamente, para una proteína de membrana exterior de hemaglutinina filamentosa y 1 cada una para una proteína que contenía dominio YadA (Tabla 20).

Tabla 17. Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 1 de genes asociados a la virulencia implicados en biosíntesis o modificación de lipooligosacáridos (LOS).

Tabla 18. Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 2 de genes asociados a la virulencia im li n i ín i m ifi i n li li ri L .

Tabla 19 (5). Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 1 de genes asociados a la virulencia implicados en adhesión, colonización o formación de biopelícula.

Tabla 20 (6). Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 2 de genes asociados a la virulencia im licados en adhesión colonización o formación de bio elícula.

**Indica cuando se descubrió que un gen estaba ausente para aquel aislado particular.

Tabla 21. Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 1 de genes asociados a la virulencia im licados en la invasión de hués ed o la absorción de metales.

Tabla 22. Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 2 de genes asociados a la virulencia

Tabla 23. Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 1 de genes asociados a la virulencia im licados en res uesta a estrés resistencia a antibióticos eliminación de fármacos.

Tabla 24. Número de indeles presentes en aislados del análisis de grupo 2 de genes asociados a la virulencia im licados en res uesta a estrés resistencia a antibióticos eliminación de fármacos.

[0148] Existieron muchas similitudes para indeles ausentes entre los aislados recientes y 129PT genes asociados a la virulencia implicados en la invasión de huésped y la absorción de metales. Estos genes incluyen receptor dependiente de TonB (2 indeles para cada una de TK #4 y TK #34, 1 indel para TK #42, TK #28 y 129PT), TbpB (1 indel cada uno para HS91, TK #42, 2336, TK #28 y 129PT), TbpA (2 indeles para TK #21, TK #4, 153-3, TK #34 y TK #42, 3 o 4 indeles para 129PT (los dos análisis dieron como resultado diferentes indeles calculados para este aislado), y 1 indel para TK #28), TbpA2 (1 indel para 153-3), proteína similar a proteína de activación/secreción de hemólisis (1 indel cada uno para TK #42 and TK #28), receptor de familia de hemoglobina/transferrina/lactoferrina dependiente de TonB (1 indel para 129Pt) y una proteína de receptor de hemina de membrana exterior (1 indel para TK #21 y TK #4, 2 indeles para TK #34 y 129PT). El único gen entre los genes de respuesta a estrés, resistencia a antibióticos y eliminación de fármacos que tuvo cualquier indel fue aciltransferasa 3. Existió 1 indel no sinónimo en HS91 y 2336, y existieron 2 en TK #34, ^hS91 AarnC, y HS91 AnanPU.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Cepa atenuada de Histophilus somni (H. somni), que es capaz de proporcionar una respuesta inmunitaria segura y eficaz en un animal bovino contra H. somni, o enfermedades causadas por H. somni, que tiene al menos los siguientes genes mutados, incluidos completamente eliminados, en relación con una cepa virulenta de H. somni de referencia, para eliminar la capacidad del gen para expresar su producto génico afín: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1724, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 y HSM_1793; en el que esta deficiencia relativa de genes que codifican el factor de virulencia hace que la cepa atenuada sea incapaz de causar la infección en el animal bovino; y que conserva además al menos los siguientes genes, en comparación con una cepa altamente virulenta de H. somni: HSM_0052, HSM_0164, HSM_0268, HSM_0274, HSM 0338, HSM_ 0346, HSM 0377, HSM 0394, HSM 0598, HSM_0695, HSM 0749, HSM 0844, HSM_0938, HSM_0977, HSM 0978, HSM 1022, HSM 1089, HSM 1090, HSM_ 1160, HSM 1212, HSM 1426, HSM_1484, HSM_1616, HSM_1647, HSM_ 1651, HSM_1667, HSM_ 1794 y HSM_1889.

2. Cepa atenuada de la reivindicación 1, en la que la cepa atenuada codifica al menos el 99% de los mismos genes que la secuencia establecida en SEQ ID NO: 4.

3. Cepa atenuada de la reivindicación 1 o 2, en la que la cepa atenuada codifica y expresa todos los mismos genes que la secuencia establecida en SEQ ID NO: 4.

4. Cepa atenuada de la reivindicación 1, que codifica y expresa al menos el 99% de los mismos genes que la cepa depositada en la ATCC bajo la designación PTA-121030 (TK #42).

5. Cepa atenuada de la reivindicación 1 ó 4, en la que la cepa atenuada es la misma cepa que la depositada en la ATCC bajo la designación PTA-121030 (TK #42).

6. Cepa atenuada de H. somni, no natural, modificada genéticamente, adecuada para su uso en una formulación de vacuna segura y eficaz, y que tiene al menos los siguientes genes mutados, incluidos completamente eliminados, para eliminar la capacidad del gen para expresar su producto génico de tipo salvaje afín: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1726, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 y HSM_1793; y que conserva además al menos los siguientes genes, en comparación con una cepa altamente virulenta de H. somni: HSM_0052, HSM_0164, HSM_0268, HSM_0274, HSM 0338, HSM_ 0346, HSM 0377, HSM 0394, HSM 0598, HSM_0695, HSM 0749, HSM 0844 , HSM_0938, HSM_0977, HSM 0978, HSM 1022, HSM 1089, HSM 1090, HSM_1160, HSM 1212, HSM 1426, HSM_1484, HSM_1616, HSM_1647, HSM_1651, HSM_1667, HSM_1794 y HSM_1889.

7. Composición inmunológica o de vacuna que comprende o consiste esencialmente en la cepa atenuada de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Composición de la reivindicación 7, que comprende además un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.

9. Composición de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que la composición provoca en un animal bovino una respuesta inmunitaria protectora frente a una exposición posterior a al menos una cepa virulenta de H. somni; y en la que la composición no tiene adyuvante.

10. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que comprende además al menos uno o más antígenos adicionales, que es capaz de provocar en un animal bovino una respuesta inmunitaria específica de un patógeno.

11. Composición de la reivindicación 10, en la que el antígeno provoca en el animal bovino una respuesta inmunitaria suficiente para proteger al animal de una exposición posterior al patógeno del que se derivaba el antígeno.

12. Composición de la reivindicación 10 u 11, en la que el al menos uno o más antígenos adicionales son capaces de provocar en un animal bovino una respuesta inmunitaria contra el complejo de enfermedad respiratoria bovina (BRDC), el virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), la diarrea viral bovina (BVD), parainfluenza bovina 3 (PI3), rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR), virus del herpes bovino-1 (BHV-1), virus de la enfermedad de la lengua azul (BTV) o cualquier otro patógeno capaz de infectar y causar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades en un animal bovino.

13. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7-12, para su uso en un procedimiento para provocar inmunidad protectora en un animal bovino que lo necesite contra una infección virulenta por H. somni posterior, que comprende la etapa de administrar al animal bovino dicha composición, preferiblemente en la que la composición se administra por vía intranasal, subcutánea o intramuscular.

14. Composición para su uso de la reivindicación 13, en la que la infección virulenta por H. somni posterior es una infección natural, transmitida al animal bovino por otro animal bovino, que está infectado con al menos una cepa virulenta de H. somni.