CN107197626A - 含有减毒睡眠嗜组织菌的免疫组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了减毒睡眠嗜组织菌株、包含其的组合物以及其产生和使用的方法。减毒株相对于对应的致病菌可表达较低水平或无水平的各种毒力相关基因。有利地，可口服、鼻内、气管内或皮下施用减毒睡眠嗜组织菌株。

Description

含有减毒睡眠嗜组织菌的免疫组合物
通过引用并入
本申请要求2014年3月25日提交的美国临时申请USSN 61/970,195的优先权，并且所述临时申请通过引用整体并入本文。本文中引用的所有其它参考文献也通过引用整体并入本文。
关于序列表的申明
以文本格式替代纸质拷贝提供与本申请相关的序列表，并且将所述序列表在此通过引用并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称为MER_13_225P_ST25。该文本文件为17,356KB；其创建于2014年2月20日；并在提交本说明书的同时将其通过EFS-Web电子提交。
发明领域
本发明总的来说涉及经遗传工程化的减毒细菌疫苗，特别地为牛类提供免受由睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)(以前称为睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus))引起的感染/疾病的广泛、安全和有效的保护的那些疫苗。本发明还涉及产生该减毒细菌的方法，以及与该减毒细菌的减弱的致病性相关的核酸变异的鉴定。
本发明因而涉及包含本发明的细菌(例如活的减毒细菌)的免疫原性或疫苗组合物。也可在组合物中灭活细菌；但可有利的是，所述细菌是活的减毒睡眠嗜组织菌。本发明因此还涉及用于制备和/或配制此类组合物的方法；例如，在合适的培养基上或中培养或生长或繁殖所述细菌，收获所述细菌，任选灭活所述细菌，以及任选将其与合适的兽医学上或药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂混合。因此，本发明还涉及细菌在配制此类组合物中的用途。
发明背景
牛呼吸道疾病综合征(BRDC)由多种微生物病原体组成，并对养牛业造成重大经济损失。据估计治疗成本(包括预防接种疫苗和暴发后药物治疗)将近每年40亿美元(Griffin,1997)。造成经济影响的还有在诊断为BRDC的动物中所观察到的性能相关损失；平均日增重、收获时的体重以及牛肉质量等级的可测量的损失(Babcock,2010)。关于与性能降低相关的具体货币损失的报道不一；可能是由于对BRDC的不同情况下的定义，但据估计在每只动物$40(Fulton,2002)与几乎$300(Duff和Gaylean 2011)之间。还已显示性能损失随动物需要BRDC治疗的次数增加而显著增加(Fulton,2002)。
睡眠嗜组织菌(以前称为睡眠嗜血杆菌)已被鉴定为BRDC的关键影响因素(Duff和Gaylean 2011)。属于巴氏杆菌(Pasterellacea)科的该革兰阴性多形球杆菌(pleomorphiccoccobacillus)(Korczak,2004)构成牛、羊和其它反刍动物中的上呼吸道和泌尿生殖道的正常菌群的一部分(Ward,2006)。它与其它牛病原体包括多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)和溶血曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)(这两者也与BRDC相关联)，以及人病原体杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)密切相关(Challacombe,2007)。
从健康小牛的上呼吸道睡眠嗜组织菌的分离率估计高达无疾病临床表现的50％；然而诊断为BRDC的动物对于所述细菌具有甚至更高的分离率(Griffin,2010)。在应激条件或免疫抑制状态下，睡眠嗜组织菌可定殖在下呼吸道、心内膜或中枢神经系统，并且已被鉴定为多种疾病，诸如肺炎、心内膜炎、关节炎、流产、败血症和血栓栓塞性脑膜脑炎(TEME)的病原体(Ward,2006)。
在屠宰时，少于15％的接受针对BRDC的适当治疗(预防接种疫苗和在爆发期间的适当抗生素)的动物显示肺部病变的体征，并且这些病变牵涉不到总肺的5％(Griffin,2010)。相反，50％的未接受适当护理的动物在屠宰时显示肺部病变，并且这些病变可牵涉总肺的15％或更多(Griffin,2010)。在超过10,000只动物的一个现场研究中，459头小牛(4.6％)死于一种或另一种形式的疾病。在该研究的死亡中，279头(60.8％)经显示与呼吸系统疾病相关，并且在那些患有呼吸道感染的动物中，226头(81.0％)与睡眠嗜组织菌相关肺炎、胸膜炎或脓肿相关(Ribble,1988)。虽然抗生素治疗可成功地响应于睡眠嗜组织菌感染，但日益增加的抗生素抗性现场分离株的流行令人关注(Duff和Gaylean,2011)。通过接种疫苗进行的预防护理将是优选的，因为其是积极主动的而非被动的，并且更具成本效益。
目前可从不同动物保健公司获得许多睡眠嗜组织菌疫苗；然而，这些疫苗主要由死菌苗组成，而且是在超过三十年前获得许可的，目的在于预防TEME。这些菌苗疫苗的使用已经有效对抗TEME，然而已显示其对育肥牛(feedlot cattle)的呼吸道疾病具有中性或甚至消极作用。消极副作用包括当对感染了牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的小牛接种疫苗时IgE诱导的过敏性休克和相互作用(Griffin,2010)。TEME的流行性的减少以及始于80年代末的睡眠嗜组织菌相关肺炎(在美国)和心肌炎(在加拿大)的出现，已经导致对用于疫苗生产的有效抗原的进一步研究的需要(O'Toole,2009)。
睡眠嗜组织菌相关肺炎对于牛肉和乳制品行业是经济上重大的病况。在目前可用的疫苗中很少存在现场药效的证据，因此对于得到下一代疫苗产品的研究的需要是完全正当合理的。
发明概述
本发明的目的是提供用于治疗和预防由睡眠嗜组织菌引起的感染的减毒细菌以及方法。
在实施方案中，疫苗包含减毒睡眠嗜组织菌，其相较于更具毒力的株致病性较弱。全面的比较序列分析显示相对于毒力更强的株，在减毒睡眠嗜组织菌株中不存在重要的毒力因子。因此，本发明的目的是提供减毒睡眠嗜组织菌，其缺乏由毒力更强的睡眠嗜组织菌株所具有的毒力因子。
如本文所定义的，术语“基因”将在广泛的意义上使用，并应包括编码和非编码序列(即上游和下游调控序列、启动子、5'/3'UTR、内含子和外显子)。当旨在只提及基因的编码序列时，术语“基因的编码序列”或“CDS”在本发明的整个说明书中可互换使用。当论述特定的核酸时，本领域技术人员将即刻拥有该序列的所有可衍生的形式(mRNA、vRNA、cRNA、DNA、蛋白质等)。
本发明还提供用于诱导抗睡眠嗜组织菌的免疫(或免疫原性)或保护性应答的方法，以及用于预防或治疗睡眠嗜组织菌，或由睡眠嗜组织菌引起的疾病状态的方法，包括向有此需要的动物施用所述减毒睡眠嗜组织菌，或包含该减毒睡眠嗜组织菌的组合物。此外，还提供了包含至少减毒睡眠嗜组织菌株和使用说明书的试剂盒。
这些和其它实施方案已被公开的，或根据以下详述是显而易见的，并且被以下详述所涵盖。
附图简述
本发明的完整且可行的公开内容，包括本领域普通技术人员知晓的其最佳模式，更具体地示于本说明书的其余部分，包括参考附图，其中：
图1显示在攻击模型中测试的每一株分离株和剂量的平均肺部病变百分比。根据对反正弦变换数据进行的学生氏t检验，具有不同字母的组是显著不同的；
图2显示其中鼻内施用疫苗的接种攻击研究中对于每一小牛观察到的肺部病变百分比。相同颜色的条块代表利用同一分离株接种的动物的结果。接种分离株列于条块下方，利用同一攻击分离株攻击所有动物。根据对反正弦变换数据进行的学生氏t检验，后跟相同字母的组是无显著差异的。
发明详述
本发明提供了参与微生物诸如细菌，例如，睡眠嗜组织菌的减毒的核苷酸序列和基因、由所述核苷酸序列编码的产物(例如，蛋白质、抗原、免疫原、表位)，用于产生此类核苷酸序列、产物、微生物的方法，及其用途，诸如用于制备疫苗或免疫原性组合物或用于引发免疫或免疫应答或作为载体，例如，作为表达载体(例如，体外或体内表达载体)。
在核苷酸序列和微生物的基因中鉴定的突变产生新型且非显而易见的减毒突变体。这些突变体用于生产具有高度免疫原性的活的减毒免疫原性组合物或活的减毒疫苗。
突变的鉴定提供了新型且非显而易见的核苷酸序列和基因，以及由该核苷酸序列和基因编码的新型且非显而易见的基因产物。
在实施方案中，本发明提供了能够在牛中提供抗睡眠嗜组织菌或由睡眠嗜组织菌引起的疾病的安全有效的免疫应答的减毒睡眠嗜组织菌株。
在一个方面，本发明提供了在核苷酸序列或基因中含有减毒突变的细菌，其中所述突变改变由基因编码的多肽或蛋白质的生物活性，导致减毒的细菌毒力。
具体地，本发明包括在动物中引发免疫原性应答的减毒睡眠嗜组织菌株和包含其的疫苗，特别是在牛中引发、诱导或刺激应答的减毒睡眠嗜组织菌株。
特定的目标睡眠嗜组织菌减毒株相对于强毒株在基因中具有突变。应当认识到，除了具有所公开的突变的株以外，具有任意数量的在公开的毒力基因中的突变的减毒株也可用于本发明的实施。
在另一个方面，将该新型减毒睡眠嗜组织菌株配制成抗睡眠嗜组织菌和由睡眠嗜组织菌引起的感染/疾病的安全有效的疫苗。
在实施方案中，所述减毒睡眠嗜组织菌株能够在牛中提供抗睡眠嗜组织菌或由睡眠嗜组织菌引起的疾病的安全有效的免疫应答。
在具体的实施方案中，减毒株相对于另外的遗传上相似的强毒株缺少一个或若干个毒力基因。在实施方案中，减毒株缺乏和/或不表达糖苷水解酶家族蛋白(HSM_1160)和脂蛋白(HSM_1714)。其缺失也可促成菌株的减毒表型的基因包括：多铜氧化酶3型(HSM_1726)和TetR家族转录调节剂(HSM_1734)。在甚至更具体的实施方案中，所述减毒株与在名称PTA-121029下保藏在ATCC中的菌株相同。
在实施方案中，可鼻内或皮下施用所述菌株。
在另一个方面，本发明包括包含所公开的减毒睡眠嗜组织菌株的免疫组合物。所述组合物还可包含药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。
在实施方案中，所述组合物可在牛中提供抗随后的强毒睡眠嗜组织菌攻击的安全和保护性免疫应答。
在另一个实施方案中，所述组合物可包含遗传工程化的非天然存在的减毒睡眠嗜组织菌株，该菌株适合用于安全有效的疫苗制剂，并且具有至少以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源基因产物的能力：HSM_0270、HSM_0338、HSM_0377、HSM_0598、HSM_0708、HSM_0749、HSM_0953、HSM_1160、HSM_1191、HSM_1257、HSM_1426、HSM_1616、HSM_1624、HSM_1728、HSM_1730、HSM_1734、HSM_1736、HSM_1737、HSM_1741、HSM_1793和HSM_1889。在具体的实施方案中，工程化的睡眠嗜组织菌株相较于TK#4具有相同的减毒表型。
在相关实施方案中，所述组合物可包含遗传工程化的非天然存在的减毒睡眠嗜组织菌株，该菌株适合用于安全有效的疫苗制剂，并且具有足够数量的以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源基因产物的能力：HSM_0270、HSM_0338、HSM_0377、HSM_0598、HSM_0708、HSM_0749、HSM_0953、HSM_1160、HSM_1191、HSM_1257、HSM_1426、HSM_1616、HSM_1624、HSM_1728、HSM_1730、HSM_1734、HSM_1736、HSM_1737、HSM_1741、HSM_1793和HSM_1889。在具体的实施方案中，工程化的睡眠嗜组织菌株相较于TK#4具有相同的减毒表型。
在另一个实施方案中，所述组合物可包含遗传工程化的非天然存在的减毒睡眠嗜组织菌株，该菌株适合用于安全有效的疫苗制剂，并且具有至少以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源基因产物的能力：HSM_0077、HSM_0270、HSM_0708、HSM_0975、HSM_1191、HSM_1257、HSM_1448、HSM_1542、HSM_1571、HSM_1624、HSM_1714、HSM_1726、HSM_1728、HSM_1730、HSM_1734、HSM_1736、HSM_1737、HSM_1741和HSM_1793。在具体的实施方案中，工程化的睡眠嗜组织菌株相较于TK#42具有相同的减毒表型。
在相关实施方案中，所述组合物可包含遗传工程化的非天然存在的减毒睡眠嗜组织菌株，该菌株适合用于安全有效的疫苗制剂，并且具有足够数量的以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源基因产物的能力：HSM_0077、HSM_0270、HSM_0708、HSM_0975、HSM_1191、HSM_1257、HSM_1448、HSM_1542、HSM_1571、HSM_1624、HSM_1714、HSM_1726、HSM_1728、HSM_1730、HSM_1734、HSM_1736、HSM_1737、HSM_1741和HSM_1793。在具体的实施方案中，工程化的睡眠嗜组织菌株相较于TK#42具有相同的减毒表型。
在另一个实施方案中，所述组合物可包含遗传工程化的非天然存在的减毒睡眠嗜组织菌株，该菌株适合用于安全有效的疫苗制剂，并且具有至少以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源基因产物的能力：HSM_0268、HSM_0270、HSM_0274、HSM_0598、HSM_0708、HSM_0749、HSM_0938、HSM_1022、HSM_1160、HSM_1191、HSM_1212、HSM_1257、HSM_1542、HSM_1571、HSM_1667、HSM_1728、HSM_1730、HSM_1736、HSM_1737、HSM_1741、HSM_1793和HSM_1889。在具体的实施方案中，工程化的睡眠嗜组织菌株相较于TK#34具有相同的减毒表型。
在相关实施方案中，所述组合物可包含遗传工程化的非天然存在的减毒睡眠嗜组织菌株，该菌株适合用于安全有效的疫苗制剂，并且具有足够数量的以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源基因产物的能力：HSM_0268、HSM_0270、HSM_0274、HSM_0598、HSM_0708、HSM_0749、HSM_0938、HSM_1022、HSM_1160、HSM_1191、HSM_1212、HSM_1257、HSM_1542、HSM_1571、HSM_1667、HSM_1728、HSM_1730、HSM_1736、HSM_1737、HSM_1741、HSM_1793和HSM_1889。在具体的实施方案中，工程化的睡眠嗜组织菌株相较于TK#34具有相同的减毒表型。
现在，本申请人已公开这些充足组的减毒基因缺失，本领域技术人员将理解，只有非常规工作才仍然需确定这些基因缺失的哪个亚组合是产生可比较的或等效的减毒睡眠嗜组织菌疫苗株所必需的。
在另一个实施方案中，所述组合物还可包含至少一种与除睡眠嗜组织菌外的牛病原体相关的或来源于其的另外的抗原。
在实施方案中，至少一种或多种另外的抗原能够在牛中引发抗睡眠嗜组织菌、牛呼吸道疾病综合征(BRDC)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻(BVD)、牛副流感3(PI3)、牛传染性鼻气管炎(IBR)、牛疱疹病毒-1(BHV-1)、蓝舌病病毒(BTV)或能够在牛中感染和引起疾病或对疾病的易感性的任何其它病原体的免疫应答。
在另一个方面，本发明提供了对动物接种疫苗的方法，其包括施用公开的包含减毒睡眠嗜组织菌株的免疫组合物的至少一种。
在实施方案中，所述睡眠嗜组织菌疫苗还包含佐剂。在具体的实施方案中，所述佐剂包含全细菌和/或细菌，包括梭菌属(clostridium)、睡眠嗜组织菌、曼氏杆菌属(Mannheimia)、巴氏杆菌属(Pasteurella)，嗜组织菌(Histophilus)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)或其组合和/或变异。在几个实施方案中，所述佐剂增加动物的IgM、IgG、IgA和/或其组合的产生。
在另一个实施方案中，本发明提供了减毒睡眠嗜组织菌(H.somni)株，其能够在牛类动物中提供抗睡眠嗜组织菌，或由睡眠嗜组织菌引起的疾病的安全有效的免疫应答；其中所述减毒株相对于参照毒睡眠嗜组织菌株在其基因组序列中缺乏最少数量的毒力因子编码基因，以使减毒株不能在牛类动物中引发感染。
在实施方案中，参照强毒株包含基因组DNA序列，其编码至少约99％的与如SEQ IDNO:2中所示的序列所编码的基因相同的基因。在其它实施方案中，所述减毒株编码编码至少约99％的与如SEQ ID NO:1、3、4或5中所示的序列所编码的基因相同的基因。在具体的实施方案中，所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQID NO:1、3、4或5中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平，表达任何毒力因子基因。
在具体的实施方案中，所述减毒株相对于睡眠嗜组织菌株2336，缺乏至少约99％的与睡眠嗜组织菌株#4相同的基因。在该实施方案中，菌株2336包含基因组序列，其编码至少约99％的与如SEQ ID NO:6中所示的序列所编码的基因相同的基因；以及菌株#4包含基因组序列，其编码至少约99％的与如SEQ ID NO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因。
在具体的实施方案中，减毒株是#4分离株(即，TK#4)，其在名称PTA-121029下被保藏在ATCC中。在另一个实施方案中，减毒株是#42分离株(即，TK#42)，其在名称PTA-121030下被保藏在ATCC中。
在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的减毒株中的任一种的免疫组合物。在实施方案中，所述组合物包含减毒株，其编码至少约99％的与如SEQ ID NO:1、3、4或5中所示的序列所编码的基因相同的基因。
在一个具体的实施方案中，所述减毒株编码至少约99％的与如SEQ ID NO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因。在相关实施方案中，所述减毒株编码所有与如SEQ IDNO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因。
在一个实施方案中，所述减毒株编码至少约99％的与如SEQ ID NO:4中所示的序列所编码的基因相同的基因。在相关实施方案中，所述减毒株编码所有与如SEQ ID NO:4中所示的序列所编码的基因相同的基因。
在另一个实施方案中，所述减毒株编码至少约99％的与如SEQ ID NO:3中所示的序列所编码的基因相同的基因。在相关实施方案中，所述减毒株编码所有与如SEQ ID NO:3中所示的序列所编码的基因相同的基因。
在另一个实施方案中，所述减毒株编码至少约99％的与如SEQ ID NO:5中所示的序列所编码的基因相同的基因。在相关实施方案中，所述减毒株编码所有与如SEQ ID NO:5中所示的序列所编码的基因相同的基因。
在实施方案中，所述免疫组合物还包含药学和兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。
在具体的实施方案中，免疫组合物能够在牛类动物中引发保护性免疫应答，这可保护牛免受随后对强毒睡眠嗜组织菌株的暴露的侵害。
在另一个实施方案中，所述免疫组合物还包含至少一种或多种另外的抗原，其能够在牛类动物中引发病原体特异性免疫应答。在具体的实施方案中，所述至少一种或多种另外的抗原在牛中引发足以保护动物免受随后对所述抗原所源自的病原体的暴露的侵害的免疫应答。因此，如果牛PI3抗原被包含作为免疫组合物的组分，则所述组合物应引发保护性免疫应答。
在另一个实施方案中，所述另外的抗原能够在牛类动物中引发免疫应答，这将增强动物的抗随后对牛呼吸道疾病综合征、BRSV、BVD、PI3或能够在牛类动物中感染和引起疾病或对疾病的易感性的任何其它病原体的暴露的免疫应答。例如，BRSV抗原将提供抗随后对强毒BRSV的暴露的保护。
在另一个方面，本发明提供了对牛类动物接种疫苗的方法，其包括对所述牛类动物施用至少一个剂量的如本文所述的免疫学组合物的步骤。
“抗原”或“免疫原”是指诱导宿主动物的特异性免疫应答的物质。抗原可包括整个生物体(被杀死的、减毒的或活的)；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递至宿主动物后诱导免疫应答的DNA的碎片或片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，所述免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，是指具有任何长度的氨基酸残基的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且其可被除氨基酸外的化学部分中断。该术语还包括已被天然修饰或通过人工干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分或生物活性组分的缀合。
如本文中所用，术语“免疫原性或抗原性多肽”包括在一旦向宿主施用，其就能够激发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答的意义上具有免疫活性的多肽。优选地，所述蛋白质片段是这样的蛋白质片段，其具有与总蛋白质基本相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文中所使用，“免疫原性”蛋白质或多肽，包括该蛋白质的全长序列，其类似物，或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包括一个或多个表位，从而引起上述免疫应答的蛋白质的片段。此类片段可使用许多本领域中众所周知的表位作图技术来鉴定。见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris，编辑，1996)。例如，线性表位可通过例如以下过程来确定：在固相载体上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的部分，将所述肽与抗体反应，同时所述肽仍然附接于所述载体。此类技术在本领域中已知的，并描述于，例如，美国专利号4,708,871；Geysen等，1984；Geysen等，1986。类似地，构象表位可通过测定氨基酸的空间构象(诸如通过，例如x-射线晶体学和二维核磁共振)来容易地鉴定。见，例如，Epitope Mapping Protocols，同上。在PCT/US2004/022605(通过引用整体并入本文)中全面地描述了特别适用于T.parva的蛋白质的方法。
如本文中所讨论的，本发明涵盖抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性或抗原性多肽”还设想了针对序列的缺失、添加和取代，只要所述多肽有效发挥产生如本文所定义的免疫应答的功能。术语“保守变异”意指另一种生物学类似的残基对氨基酸残基的替代，或使得编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学类似的残基的核酸序列中的核苷酸的替代。在这方面，特别优选的取代在性质上通常是保守的，即在氨基酸的家族内发生的那些取代。例如，氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，或者一个极性残基取代另一个极性残基，诸如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺等；或对生物活性不会具有重大影响的结构上相关的氨基酸对氨基酸的类似保守替代。基本上不影响蛋白质的免疫原性，具有与参照分子基本上相同的氨基酸序列，但具有最小氨基酸取代的蛋白质因而在参照多肽的定义之内。所有由通过这些修饰所产生的多肽均包括在本文中。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲代氨基酸，只要针对所述取代的多肽产生的抗体也与所述未取代的多肽免疫反应。
术语“表位”是指特异性B细胞和/或T细胞对其作出响应的抗原或半抗原上的部位。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定位点”互换地用。可以在显示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定识别相同表位的抗体。
针对组合物或疫苗的“免疫应答”针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答在宿主中的产生。通常，“免疫应答”包括但不限于以下效应的一种或多种：特异性地针对目标组合物或疫苗中包含的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将表现出治疗性或保护性免疫学应答，以使得针对新感染的抗性将得以增强和/或疾病的临床严重度被减轻。此类保护将通过通常由受感染的宿主所表现出的症状和/或临床疾病体征的减轻或不存在、更快的恢复时间和/或受感染的宿主中降低的病毒滴度来有证明。
“动物”是指哺乳动物、鸟类等。如本文中所用的动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可以选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、丛林狼、豺)，猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫，其它大型猫科动物，和其它猫科动物，包括猎豹和山猫)、羊(ovine)(例如，绵羊)、牛类动物(例如，牛、小牛、公牛(steers)、公牛(bulls))、猪(procine)(例如、猪(pig))、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类动物(例如，狐猴、眼镜猴、猴、长臂猿、猿)、雪貂、海豹和鱼。术语“动物”还包括在各个发育阶段(包括新生儿、胚胎和胎儿阶段)的个体动物。
除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。
应指出的是，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，术语诸如“包含(comprises)”、“包括(comprised)”，“含有(comprising)”等可具有在美国专利法中归于其的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”，“含有(included)”，“包含(including)”等；并且术语诸如“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“基本上由...组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中规定它们的含义，例如，它们允许未明确列举的元素，但排除在现有技术中发现的元素或影响本发明的基本或新型特性的元素。
组合物
本发明涉及睡眠嗜组织菌疫苗或组合物，其可包含减毒睡眠嗜组织菌株和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物，其引发、诱导或刺激动物的应答。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指RNA或DNA，其是直链或支链的，单链或双链的，或其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。以下是多核苷酸的非限定性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA，重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其它糖和连接基团诸如氟代核糖(fluororibose)和硫醇盐，以及核苷酸支链。核苷酸的序列可以在聚合后诸如通过缀合用标记组分进一步修饰。包括在此定义内的其它类型的修饰是加帽、类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代，以及用于将多核苷酸附接于蛋白质的装置的引入、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固相载体。所述多核苷酸可以通过化学合成获得或源自微生物。
术语“基因”被广泛地用于指与生物学功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因包括内含子和外显子(如在基因组序列中)，或者仅仅编码序列(如在cDNA中)和/或它们的表达所需的调控序列。例如，基因也指表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质，以及包括调控序列的核酸片段。
“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质或细胞器)是指已被基本上与所述组分天然存在于其中的生物体的细胞中的其它生物组分(例如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)分离或纯化出来的组分。已被“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。
术语“保守变异”意指另一个生物学上类似的残基对氨基酸残基的替代，或核酸序列中的核苷酸的替代，使得所编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上类似的残基。在这方面，特别优选的取代通常在性质上是保守的，如上文中所述的。
术语“重组”意指非天然存在的或以在自然界中未被发现的排列连接于另一个多核苷酸的半合成或合成来源的多核苷酸。
“异源的”意指来源于与将与其比较的实体的其余部分遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可通过基因工程技术被置于来源于不同来源的质粒或载体中，从而为异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并可操作地连接于除所述天然序列外的编码序列的启动子是异源启动子。
本发明的多核苷酸可以包括另外的序列，诸如同一转录单位内的另外的编码序列、控制元件诸如启动子、核糖体结合位点、5'UTR、3'UTR、转录终止子、多腺苷酸化位点、在同一或不同启动子控制之下的另外的转录单位、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞的转化的序列，以及可期望提供本发明的实施方案的任何此类构建体。
使用方法和制品
本发明包括以下方法实施方案。在实施方案中，公开了对动物接种疫苗的方法，其包括向动物施用包含减毒睡眠嗜组织菌株和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物的组合物。在该实施方案的一个方面，所述动物是牛。
在本发明的一个实施方案中，可使用初免-加强方案，其由至少一次初始施用和至少一次使用至少一种共同的多肽、抗原、表位或免疫原的加强施用组成。通常，初始施用中使用的免疫学组合物或疫苗在性质上与用作加强剂的那些组合物或疫苗不同。然而，要指出的是，可将相同的组合物用作初始施用和加强施用。该施用操作方案被称为“初免-加强”。
初免-加强方案包括至少一个初始施用和至少一次使用至少一种共同的多肽和/或其变体或片段的加强施用。初始施用中使用的疫苗在性质上可与用作较后的加强疫苗的那些疫苗不同。初始施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。
基于细菌抗原的用于为哺乳动物的目标物种的组合物的剂量体积，例如，牛(cattle)或牛类(bovine)组合物的剂量体积，通常为约0.1至约2.0ml、约0.1至约1.0ml和约0.5ml至约1.0ml。
可在最后一次免疫后约3-5周，通过用睡眠嗜组织菌的异源强毒株攻击动物诸如牛来测试疫苗的功效。可鼻内、气管内和/或经气管攻击动物。可在攻击前和攻击后收集来自鼻腔、气管、肺、脑和/或口的样品，并可分析所述样品中睡眠嗜组织菌特异性抗体的存在。
用于初免-加强操作方案的包含本发明的减毒病毒株的组合物包含在药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂中。本发明的操作方案保护动物免受睡眠嗜组织菌的侵害和/或阻止受感染的动物的疾病进展。
各种施用优选为一次注射剂量(one-shot dosage)，但可间隔1至6周进行多个剂量。优选的时间间隔是2至3周，并且还设想了每年一次的加强。在实施方案中，向约5至约6周龄的小牛施用组合物。在另一个实施例中，小牛可以是约3至4周龄。
本领域技术人员应理解的是，本文中的公开内容通过举例的方式提供，并且本发明不限于此。根据本文中的公开内容和本领域的知识，本领域技术人员能够确定施用次数、施用途径，和待用于每个注射操作方案的剂量，而无需任何过度实验。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中引发或诱导针对睡眠嗜组织菌的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包含减毒睡眠嗜组织菌株的组合物或疫苗，以及用于以在动物中引发免疫应答的有效量进行递送的方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中诱导针对睡眠嗜组织菌的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包括包含本发明的减毒睡眠嗜组织菌株的组合物或疫苗，以及用于以在动物中引发免疫应答的有效量进行递送的方法的说明书。
药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂对于本领域技术人员来说是众所周知的。例如，药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其它药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括、但不限于聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是有利于施用减毒细菌的任何化合物或化合物的组合。剂量和剂量体积在本文中在一般性描述中进行了论述，并且还由本领域技术人员结合本领域的知识根据本公开内容的阅读来决定，而无需任何过度实验。
虽然在不使用佐剂的情况下获得所公开的结果，但免疫组合物和疫苗还可包含适当的佐剂或基本上由其组成。用于本发明的实施的合适的佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、马来酸酐的聚合物和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，诸如具有一个或多个非甲基化的CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等,1996；WO98/16247)，(3)水包油乳液，诸如在由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,TheSubunit and Adjuvant Approach”的第147页中描述的SPT乳液，和同一著作的第183页中描述的乳液MF59，(4)含季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)任何引用的以及通过引用并入本申请的文件中论述的其它佐剂，或(9)其任意组合或混合物。
在实施方案中，佐剂包括促进通过粘膜衬里的提高的吸收的那些佐剂。一些实例包括MPL、LTK63、毒素、PLG微粒和若干其它佐剂(Vajdy,M.Immunology and Cell Biology(2004)82,617–627)。在实施方案中，佐剂可以是壳聚糖(Van der Lubben等2001；Patel等2005；Majithiya等2008；美国专利系列号5,980.912)。
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现通过以下非限定性实施例进一步描述本发明。
实施例
文献已报道了许多睡眠嗜组织菌毒力因子。单一毒力因子似乎不能主导病原体的作用，而是若干因子表现出协同作用以产生给定的分离株毒力。已鉴定了7个毒力因子：DR2(在涉及对血清的抗性的IbpA结构域内含有保守的细胞毒性Fic基序的同向重复)、hsst-I(CMP-Neu5Ac-β-Gal-α-(2-3)-唾液酰基转移酶，其中脂寡糖(LOS)的唾液酸化已被证明能够抑制抗体结合)、lob2b(编码参与LOS合成的糖基转移酶)、nan裂合酶(N-乙酰神经氨酸裂合酶，涉及唾液酸代谢)、nan差向异构酶(N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸-2-差向异构酶，涉及碳水化合物的运输和代谢)、luxS(涉及AI-2群体感应)和uspE(在生物膜形成中细胞运动和聚集所必需的通用应激蛋白)。引物被设计来扩增这些基因中的每一个基因，并且优化PCR反应参数。
选择50个分离株用于筛选。分离株选择的标准是它们必须在本研究开始的大约一年内被分离，并且必须来自多样化的地理位置或来自具有高度可能的基因型多样性的特别有意义的病例。这样做的目的是为了寻找指示现场中睡眠嗜组织菌的最新菌株，并且还尝试和筛选尽可能多的多样性。除了进行针对每一个目标毒力因子确定的PCR反应以外，还基于它们的生长和菌落外观评价菌株。在1％琼脂糖凝胶使PCR反应可视化。在基于生长、菌落外观和PCR结果选择分离株后，鉴定动物模型并将其用于评价目标分离株。
实施例1-睡眠嗜组织菌小鼠攻击模型的开发
基于生长、地理多样性和序列信息，选择21个分离株用于在小鼠中进行评价(表1)。
表1.针对天然存在的睡眠嗜组织菌疫苗候选物进行评价的分离株
将于-80℃下保存的分离株划线铺板于Columbia+5％绵羊血琼脂板(CSBA)(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)上。将板于37℃在5％CO2下进行温育。在18小时的生长后，将板用2mL DPBS洗涤，并用另外的DPBS稀释所得的溶液，并将培养物与FBS(预温热至RT)以1:1混合以获得5x108与1x109CFU/剂量之间的终浓度。在添加FBS后，将培养物在RT下温育5分钟来上调睡眠嗜组织菌毒力因子，然后将其置于冰上
利用其指定的分离株以0.5cc经腹膜内(IP)途径注射每组10只18-20g NSA:CF-1小鼠(Harlan Sprague Dawley)/分离株。给予10只小鼠的对照组DPBS+FBS。将过滤器顶部(filter-top)置于各小鼠笼的顶部，一个笼等于10只小鼠/分离株。将所述分离物稀释并铺板，将板于37℃在5％CO2下温育两天。对板进行计数并测定每一个分离株的实际CFU/剂量。另外，利用分离株2336或TK#33SQ注射5只小鼠，以确定该施用药途径是否是对IP途径的可行选择(用于评估毒力)。在攻击后，每天观察小鼠的死亡率。
大多数菌株产生中等至偏上的8logs CFU/剂量。SQ法被证明是不成功的用于攻击小鼠的方法。分离株TK#4、TK#24、TK#14、对照和2336导致最小百分比的死亡率，而分离株TK#1、TK#2、TK#21、TK#28和TK#30导致最大百分比的死亡率(表2)。
表2.当用板上生长(plate-grown)的分离株攻击18-20g小鼠时的死亡率百分比
分离株编号 途径 CFU/剂量 死亡％
TK#33 SQ 3.7x108 0
对照 IP 0 0
2336 IP 1.7x109 0
2336 SQ 1.7x109 0
TK#4 IP 7.6x108 10
TK#14 IP 8.7x108 10
TK#24 IP 5.5x108 10
TK#34 IP 7.2x108 20
TK#42 IP 5.9x108 20
TK#5 IP 6.2x108 30
TK#15 IP 7.5x108 30
TK#33 IP 3.7x108 30
TK#37 IP 7.3x108 30
TK#41 IP 9.9x108 30
TK#3 IP 8.6x108 40
TK#22 IP 8.0x108 40
TK#40 IP 9.9x108 40
TK#44 IP 9.0x108 40
TK#47 IP 7.0x108 40
TK#1 IP 8.0x108 50
TK#2 IP 8.7x108 50
TK#28 IP 7.1x108 50
TK#30 IP 4.8x108 50
TK#21 IP 5.1X108 80
攻击模型。进行两项研究来确定用于小鼠的理想CFU/剂量和攻击培养物制剂，所述小鼠在接种-攻击研究中比在先前的研究中更大(即，考虑到接种疫苗与攻击之间3周的生长)。对于第一项研究，使用40只25-30g NSA：CF-1小鼠(Harlan Sprague Dawley)。将睡眠嗜组织菌分离株TK#21划线铺板于CSBA上。于37℃在5％CO2下生长约24小时后，将所述分离株铺在另外的CSBA上并在相同的条件下生长18-20小时。各板用2mL DPBS洗涤，并收集液体。产生来自原始板洗涤物的稀释液以建立在CFU/剂量上不同的两份另外的溶液。将各稀释液与FBS以1:1混合，以获得在低8logs/剂量至低9logs/剂量的范围内的攻击液体的最终浓度。利用1:1的DPBS和FBS生成对照液体。将所有添加的FBS培养物在室温下温育5分钟，随后置于冰上。利用0.5cc IP攻击小鼠，并在攻击后监测其死亡率。将攻击培养物稀释并铺板，以确定最大死亡率所需的理想CFU/剂量。
当将攻击培养物TK#21在平板上生长并且小鼠更大(25-30克)(以解释接种后3周它们的预期尺寸)时，在5.7x108CFU/剂量上获得了最大的死亡率百分比(表3)。
表3.当用板上生长的分离株攻击25-30g小鼠时的死亡率百分比
组 分离株 CFU/剂量 死亡％
1 TK#21 1.6x109 9.1
2 TK#21 5.7x108 27.3
3 TK#21 4.2x108 20
4 对照 0 0
利用30只25-30g NSA:CF-1小鼠(Harlan Sprague Dawley)进行最终的攻击研究，以比较在平板上(如在文献中通常进行的)或在肉汤中生长攻击培养物之间的差异。如上类似地，从冷冻贮藏中取出分离物TK#21，将其铺在另外的板上。对于肉汤培养，用2mLColumbia肉汤洗涤板，并将50μL添加至25mL预温热的Columbia肉汤中。在添加培养洗剂后剧烈振荡培养物，然后置于设定为37℃和250rpm的摇床上。监测生长，并且当我们估计最终的攻击培养物对于所有添加的液体将包含中等8logs/剂量时停止培养。同样，通过如上进行板洗涤来制备攻击培养物，利用DPBS稀释培养物至约与肉汤培养物相同的浓度。将肉汤和板培养物均以1:1与FBS混合，并在室温下温育5分钟，随后置于冰上。利用0.5cc IP的板洗涤物或肉汤攻击11只小鼠/方法，将10只小鼠用作对照，所述对照被给予混合物，所述混合物为等比例的Columbia肉汤与DPBS的混合物并且随后该混合物以1:1与FBS混合得到的混合物。监测小鼠的攻击后死亡率，完成稀释和铺板以测定CFU/剂量。
当用在肉汤中生长的分离株#21攻击小鼠时，相较于在平板上生长的相同分离株，25-30g的小鼠发生更大的死亡率(表4)。该结果是预料不到的，特别是考虑到文献反向指导本领域技术人员在肉汤中生长睡眠嗜组织菌以用于毒力攻击研究(Berghaus等，2006；Geertsema等，2008；Gershwin等，2005)。
表4.当用平板/肉汤生长的分离株攻击25-30g小鼠时的死亡率百分比
生长方法 分离株 CFU/剂量 死亡％
平板 TK#21 5.3x108 36.4
肉汤 TK#21 4.8x108 54.5
---- 对照 ---- 0
130只18-20g的NSA：CF-1小鼠购自Harlan Sprague Dawley。从先前的研究选择5个睡眠嗜组织菌分离株(TK#42、TK#14、TK#4、TK#24和TK#34)作为疫苗候选物。从贮藏取出这些分离株，将其划线至CSBA上，将它们在所述CSBA上于37℃和5％CO2下培养约24小时。将所述分离株转移至新的CSBA，并铺在平板表面上，使它们在所述平板表面上生长～18小时。将板用2mL Columbia肉汤洗涤。基于涉及这些分离株的生长的先前的研究，对于分离株TK#42和TK#34，将100μL板洗涤物添加至25mL Columbia肉汤，对于分离株TK#4、TK#14和TK#24，将50μL板洗涤物添加至25mL Columbia肉汤。
将培养物在37℃和200rpm下进行培养。监测分离株的生长，从培养中取出培养物，并用Columbia肉汤稀释至含有约1x108CFU/剂量，以及对于每一个分离株，制备该培养物的1:10稀释物以产生以1×107CFU/剂量进行评估的另一疫苗。用无菌Columbia肉汤接种对照组，并用商购可得的(Zoetis，用氢氧化铝作为佐剂的灭活的嗜组织菌疫苗，Kalamazoo,MI)接种另一对照组。
在每一种疫苗被制备后，将其保持在冰上，每一个组包括10只小鼠，包括6只小鼠的Columbia对照组例外。将疫苗以0.5cc进行SQ递送。接种疫苗后，将疫苗稀释并铺板，以测定实际CFU/剂量，并且每日监测小鼠的不良反应和/或死亡。利用Limulus AmebocyteLysate试剂盒(Lonza,Allendale,NJ)测定每一种疫苗中包含的内毒素。
接种疫苗后19天，用睡眠嗜组织菌分离株TK#21攻击小鼠。如上类似地制备野生型以用于在肉汤中生长，不同的是将150μL板洗涤物用于接种2个各自装有75mL预温热的Columbia肉汤的培养瓶中的每一个培养瓶。将所述培养瓶在37℃和250rpm下进行培养。从培养中取出培养物，稀释，并以1:1与室温FBS混合以含有中等8logs/剂量。将培养物在室温下与FBS一起温育5分钟并置于冰上。攻击产物是在攻击前和攻击后被涂板以确定CFU/剂量稀释物是否符合我们的估计。向小鼠施用0.5cc IP的攻击培养物，并每日监测其死亡。
利用(Zoetis,用氢氧化铝佐剂化的灭活的嗜组织菌疫苗)以及8logs的分离株TK#34和TK#22接种的小鼠，产生红色注射部位反应。除TK#22外，所有分离株相较于对照组均在攻击前为小鼠提供一定的保护。分离株TK#4在两个疫苗剂量上都是有效的，然而，分离株TK#34在8logs上最好，分离株TK#24和TK#42在7logs上最好。在两种剂量上，分离株TK#14提供了一定保护，但低于其他分离株(表5)。8logs的分离株TK#24和TK#42在接种疫苗后，在攻击之前已使10只小鼠中的1只死亡。
表5.利用低毒力分离株接种并用高毒力分离株攻击的小鼠中的死亡率百分比
*EU/剂量＝内毒素单位/剂量；仅对8log疫苗测量EU/剂量。
实施例2-睡眠嗜组织菌小牛攻击
在测试疫苗候选物之前，必须开发小牛攻击模型。为进行该研究，使用20头Holstein小公牛。使用分离株TK#21或153-3(获自具有确诊的因睡眠嗜组织菌而导致的临床疾病的小牛)攻击54日龄的小牛。与上述类似地在肉汤中制备攻击培养物。为了评估攻击培养物的CFU/剂量，将先前建立的标准曲线(y＝-5x10-8x+92.017(x＝CFU/mL和y＝％T(540nm))用于确定对于每一个分离株获得～2.5x108和2.5x109CFU/剂量的最终攻击浓度所需的稀释度。用EBSS稀释培养物，随后添加1:1比率的FBS，之后将培养物在室温温育5分钟。将攻击培养物置于冰上并追加另外的EBSS以得到攻击剂量。对于每分离株和剂量的4头小牛中的每一头，经气管施用20cc的攻击物，并追加(chase)60cc的EBSS至肺内。4个动物保留为非攻击对照，其被给予1:1的EBSS和FBS。稀释攻击培养物，并将其在攻击前和攻击后铺板以测定实际施用的CFU。由同一人对对临床体征进行评级和记录如下：
表6.小牛攻击临床体征评级标准
通过合计针对每一个分类测定的评级来计算每一个动物的总临床评分。如果发现动物死亡，或满足无痛处死的标准，则进行尸检，并取出肺。主治兽医就表面积病变百分比对肺进行评级，将组织进行分析。4天之后，将剩余的动物无痛处死，并如上进行尸检。对肺部病变进行反正弦变换，使用“JMP Fit Y by X”函数进行分析，并用学生氏t检验分离平均值。
将24头Holstein小公牛分入5个围栏(每个围栏包含5只动物各自用于接种疫苗，并且4只动物用作非接种对照)。另外，如果安排了小牛接种疫苗-攻击研究，则使来自攻击模型的非攻击组的4只动物保持存活以在下周被攻击。将它们保持在分开的围栏中。这些动物(被称为来自攻击模型的对照)是另外的实验对照，其用来观察当这些动物被攻击时，处于相同牲口棚中但不在与被攻击的动物相同的围栏中是否可影响结果。如针对小鼠那样，使用分离株TK#28、TK#42、TK#4和TK#34制备疫苗。与上述攻击培养物类似地制备疫苗培养物，但不添加FBS。所述疫苗据估计含有5x108CFU/剂量，剂量为2cc，每一个小牛鼻孔中施用1cc。
稀释所述疫苗，在接种疫苗前和接种疫苗后将其铺板以测定实际CFU/剂量。接种疫苗后监测动物的健康。在第-17天(在到达后1天)、第0天(接种疫苗的日期，小牛年龄＝35日龄)、第14天、第21天和第33天(攻击的日期)收集鼻拭子和血液样品。将鼻试子呈送至Newport Laboratories Diagnostic Lab以进行细菌培养，保留血液样品以用于可能的血清学。以估计的5x109CFU/剂量，如上文中一样攻击所有动物外加来自攻击模型研究的4只对照动物。如上利用总的临床评分进行临床体征、尸检、肺部病变、细菌培养、支原体(Mycoplasma)PCR和统计，也用JMP Fit Y by X分析肺部病变。
为了进行攻击研究，实际铺板的CFU/剂量十分接近预测的估计的2.5x109或2.5x108CFU/剂量。对于9log组，用分离株TK#21攻击的动物给予3.9x109CFU/剂量，对于8log组，给予2.9x108CFU/剂量。对于9log组，用分离株153-3攻击的动物给予1.8x109CFU/剂量，以及对于8log组，给予1.7x108CFU/剂量。
对于用分离株TK#21以9logs攻击的动物观察到比任何其它攻击组更多的疾病的临床体征(表7)。另外，对于用分离株TK#21攻击的动物观察到比任何其它攻击组更严重的肺部病变(图1)。大部分具有肺部病变的小牛具有从肺组织回收的睡眠嗜组织菌。在整个研究过程中，从鼻拭子和肺组织回收多杀性巴氏杆菌(P.multocida)，但其似乎不是疾病症状的促成原因，因为动物在直至攻击后都未显示肺炎的临床症状。同样地，许多动物在肺组织中被确认为对牛分枝杆菌(M.bovis)呈阳性，或怀疑在肺组织中具有牛分枝杆菌。正如所预期的，未检测到M.bovoculi。
表7.在攻击模型研究期间评级的临床体征的平均总和
分离株 平均临床评分*
153-3(9logs) 0.75
153-3(8logs) 0.25
对照 0.00
TK#21(9logs) 7.00
TK#21(8logs) 1.75
*来自对动物死亡前所采取的最后一次评级
用于接种的细菌的实际浓度接近估计的5x108CFU/剂量。仅在利用活细菌接种后在接种后第14天、第21天和第33天的鼻拭子采集日期的每一个日期从2至3只动物回收睡眠嗜组织菌。鼻拭子显示睡眠嗜组织菌可在鼻道中保持存活21-33天(如果不是更多的话)(表8)。
表8.向利用分离株TK#28、TK#42、TK#4和TK#34鼻内接种的小牛施用的细菌浓度和内毒素，和在整个研究过程中从接种的动物回收的睡眠嗜组织菌分离株的数量。
在攻击时给予每一头小牛的分离株TK#21的浓度为7.39x109CFU/剂量。所述攻击在测定疫苗的功效和测定最有效的疫苗候选物中是有效的。肺部病变的临床体征和百分比表明分离株TK#4是最有效的疫苗，分离株TK#34是有效性最低的，而分离株TK#28和TK#42落在之间(表9；图2)。除均用分离株TK#4接种的3头小牛外，在研究中从所有小牛的肺回收了睡眠嗜组织菌，这表明具有肺部病变的动物的死亡和/或疾病的原因归因于攻击分离株。在研究过程中，从一些小牛的鼻道回收了多杀性巴氏杆菌，其随着研究进展而不断增加。攻击后，从28头小牛中的9头的肺组织回收了多杀性巴氏杆菌，并在来自其中3只动物的肺中检测到牛分枝杆菌。接种疫苗似乎与多杀性巴氏杆菌或牛分枝杆菌的存在或不存在无关。另外，当与来自本研究的对照动物相比较时，来自攻击模型的对照，不如对照对攻击易感。由于将攻击模型对照关在与受攻击的动物相同的牲口棚中，因此它们可能已从先前的暴露获得一定的免疫(表9)。
表9.来自鼻内接种并用睡眠嗜组织菌野生型攻击的动物的临床评分
*为来自对动物死亡前所采取的最后一次评级的平均临床评分。根据学生氏t检验，具有不同字母的临床评分是显著不同的。
讨论
因为小鼠模型中的数据与在小牛中获得的结果良好相关，因此本发明人已提供了用于选择牛疫苗/攻击候选物的新型有用的工具。分离株TK#21因其毒力和结果的再现性而为优异的攻击分离株。当经气管施用时，在牛中理想的攻击剂量似乎为约中等至高9logs/剂量。
当用作鼻内疫苗时，分离株TK#4对于随后的睡眠嗜组织菌攻击具有显著的保护性(5头小牛中的4头)。临床体征和肺部病变与非接种疫苗者显著不同。分离株TK#28和TK#42在接种疫苗的小牛中诱导一定的保护，但功效较低(5头小牛中的2头)。
实施例3–强毒和无毒睡眠嗜组织菌分离株的比较基因组分析
如上所论述的，不同的睡眠嗜组织菌分离株在小鼠和牛中具有不同水平的毒力。一株(特别是菌株TK#4)显示了作为鼻内牛疫苗候选物的前景(实施例2)。另外，TK#21被证明是牛和小鼠的强毒攻击分离株，其具有文献中使用的攻击分离株(2336和HS91)的典型表型。为了更好地理解影响该毒力的因素以及也为了确定最近获得的分离株是否仍然与较早的分离株相似，将8株睡眠嗜组织菌分离株送去进行全基因组测序。发现4个基因(糖苷水解酶家族蛋白、脂蛋白、多铜氧化酶3型和TetR家族转录调节剂)在TK#4中丢失，但存在于TK#21中。同样，最近分离的睡眠嗜组织菌缺少211个至316个存在于2336(于1985年中分离的野生型)中的基因。当与2336相比较时，HS91(来自1991年的分离株)仅缺少15个基因。这些数据表明，TK#4的基因型促成其无毒性表型，并且随时间流逝在睡眠嗜组织菌群体内存在遗传漂变。这些结果证实了TK#4的减毒的遗传学解释以及对响应于天然遗传漂变保持功效的现有疫苗和攻击分离株的需要。
为了理解差异毒力的遗传和分子基础，针对GenBank分离株2336在TK#4、TK#21、TK#34、TK#28、TK#42、HS91、2336(高度强毒株，至少根据文献)、129PT(GenBank中的已知的无毒株)和153-3(中等毒株)之间进行9向比较基因组分析(9-way comparative genomeanalysis)。该分析还将促进我们对可能遗传漂变的理解，以及描绘参与毒力/无毒力机制的基因。
材料和方法
用于测序的样品制备
将8株睡眠嗜组织菌分离株鉴定为可在全基因组测序中有价值的一组不同的分离株(表10)。这些分离株来自许多地方，具有宽范围的毒力，并且是不同年份从动物分离而来。在Columbia肉汤(BD Ref#294420；Lot#0292713,Franklin Lakes,NJ)中生长所有这些分离株，并在生长后，添加10％甘油以在Newport Laboratories Research andDevelopment设施(Worthington,MN)中在-80℃冰箱中于低温小瓶(Fisher ScientificCat.#10-500-26,Waltham,MA)中冷冻培养物。从冰箱取出分离株，将其划线铺板至Columbia绵羊血琼脂板(CSBA)(BD Ref#22165/221263；Lot#2227132 2012 11 13,Franklin Lakes,NJ)上。将板于37℃在5％CO2下培养过夜。24-26小时后，从培养箱取出板，将其用于铺在另外的CSBA上以在37℃和5％CO2下生长过夜。在培养16-18小时后，将板用2mL预温热的Columbia肉汤洗涤，对于每一个培养物，每一个接种量物量使用一个培养瓶，将其以100μL或150μL用于起始25mL Columbia肉汤的肉汤培养。以200rpm振荡肉汤培养物，监测透光度百分比(％T)(540nm)直至培养物达到15-20％T。从培养箱取出肉汤培养物，将其通过以15,000rpm旋转(每次2分钟)1.5mL的培养物来在同一微量离心管中沉淀3次，按照制造商的推荐(进行少许改进)使用Bacterial Genomic DNA Purification试剂盒(EdgeBiosystems,Gaithersburg,MD)分离基因组DNA。以一式三份从每一个培养物的一式三份旋转沉淀提取DNA。对推荐的DNA提取方法的改进是将DNA重悬浮于100μL TE中，将其在37℃温育15分钟，以促进溶解DNA沉淀而不剪切DNA。随后混合3个提取物，在1％琼脂糖上进行比较，定量，在纳米微滴(Nanodrop)上检查纯度。计算DNA的量以提供用于在University ofIdaho核心设施(Moscow,ID)进行测序所需的总DNA。
表10.用于比较基因组分析的睡眠嗜组织菌分离株的列表
过滤高质量读取(read)和序列覆盖度(coverage)
为了将来自NCBI数据库的129PT(登录号CP000436)针对2336(登录号CP000947)进行比较，需要对现场分离株使用类似方法。因此，利用ART读取仿真软件(http://www.niehs.nih.gov/research/resources/software/biostatistics/art/)从129PT生成假读取。利用以下命令行运行ART：art_illumina-i Hs129PT.fasta-p-l 250-f 60-m 500-s 10-na-o Hs129PT_sim，其等同于-p＝配对的,-l＝250bp,-f＝60x覆盖度,-m＝DNA片段的平均大小,-s＝10DNA片段大小的标准差。随后，使用SeqyClean，利用Illumina TruSeq接头就质量过滤所有分离株读取，所述SeqyClean是在University of Idaho开发的读取清除程序(可在其网站上获得)。该程序除去测序接头和含有5个或更多个Q-值<20的碱基的低质量读取，从而消除碱基读取期间的错误和增加准确度。
读取作图
使用bowtie2缺省参数将基因组DNA结果相对在NCBI数据库中的2336(登录号CP000947)进行作图。将使用针对MAPQ<10的定制脚本的过滤用于除去多个作图的读取。预期相同的分离株具有>95％的比对率。
基因覆盖度
Samtools被用来计算每一个位置相对2336参照的作图覆盖度。这被用来计算具有对于每一个基因的覆盖度的碱基百分比。含有少于80％的碱基的基因被称为对于该各自的分离物是不存在的。相对2336对丢失的基因进行两种分析。第一种分析比较HS91(在与2336相似的年代)、TK#21、TK#4、153-3和129PT。第二种分析比较TK#34、TK#42、2336(以确认我们的2336匹配数据库)、TK#28和129PT。
致病岛(PI)以及整合与接合元件(Integrative and Conjugative Elements) (ICE)
将HS91、TK#21、TK#4、153-3和129PT的全基因组测序的结果与2336比较。基于旁侧特征序列(flanking signature sequence)如重组酶、整合酶、转座酶、解旋酶和噬菌体重复序列的存在搜索致病岛(PI)和整合与接合元件(ICE)。含有一簇这些推定的特征序列的基因组区域被鉴定为潜在的PI或ICE。
结果
被清除的序列对于所有分离株具有近100x的覆盖度。覆盖的程度在所谓的碱基的质量上给予我们信心(表11)。
表11.每一个测序的分离株的原始读取和估计的碱基覆盖度的质量
比对揭示了分离株与参照株之间的差异。GenBank 2336分离株与由Newport Labs测序的2336基因组具有99.67％的同一性，表明我们的基于基因组间的比较的作图的有效性和准确度。由此，将其它分离株与2336的相似性与对HS91的第二高的相似性完成比较。同样，将NCBI数据库中的共生129PT(登录号CP000436)与数据库的2336比对以作为参照比较(表12)。
表12.与GenBank 2336登录号CP000947比对的测序数据百分比。将分离株从最高至最低百分比的比对率列出。
分离株 比对率(％)
HS91 99.71
2336 99.67
153-3 96.11
TK#34 92.11
TK#4 91.30
TK#21 88.35
129PT* 87.92
TK#42 83.84
TK#28 83.33
*登录号CP000436。
在分离株当中，129PT相较于2336野生型缺少许多毒力基因和毒力相关基因。当与2336野生型比较时，更加靠近现在所获得的分离株比更早的分离株缺少更多的总的基因(表13)。
表13.估计的相较于NCBI数据库中的2336(登录号CP00947)对于每一个测序的分离株是存在的或不存在的基因的数量
*登录号CP000436。
当比较在第一种和第二种分析中相对于2336不存在的基因时，129PT(共生)比任何其它被比较的分离株缺少更多的与致病性和/或毒力相关的那些基因。129PT总共缺少从HS91、TK#21、TK#4、153-3和129PT汇编的总共47个丢失的基因中的44个基因(表14)。它也缺少从TK#34、TK#42、2336、TK#28和129PT汇编的总共47个丢失的基因中的44个基因(表15)。已发现分离株2336仅缺少一个存在于NCBI数据库中的已鉴定的致病性相关基因。该基因是含YadA结构域的蛋白(表15)。
疫苗候选物TK#4总共缺少来自经分析的分离株的可能的47个不存在的基因中的23个基因。该候选物缺少血凝素/溶血素的附着和粘附基因，含YadA结构域的蛋白(总共丢失5个重复)和含血凝素结构域的蛋白质。TK#4还缺少转铁蛋白结合蛋白(用于铁摄取)和多铜氧化酶3型的两个同种型(提供摄取储存在宿主中的金属的能力)。负责宿主定殖的基因诸如糖苷水解酶家族蛋白(nasopharnyx定殖)和肽酶S8/S53枯草杆菌蛋白酶kexinsedolisin也从TK#4丢失。同样，负责药物抗性或对应激物的应答的基因也发生丢失，所述基因包括TetR家族转录调节剂的两个同种型、酰基转移酶3、MarR家族转录调节剂的两个同种型、小的多药抗性蛋白、MarR家族转录调节剂和应激-敏感性限制系统蛋白。最后，TK#4缺少一些影响病原体逃避宿主防御的能力的基因诸如脂寡糖唾液酰基转移酶、脂蛋白和Abi家族蛋白(其参与来自细菌素类的自身免疫)(表14)。
相较于2336，高度致病性TK#21也缺少在TK#4中被发现丢失的类似毒力基因(23个丢失的TK#4基因中的19个基因)，除糖苷水解酶家族蛋白、脂蛋白、多铜氧化酶3型的一个同种型和TetR家族转录调节剂的一个同种型外。TK#21缺少但TK#4具有的唯一基因是一个重复的含YadA结构域的蛋白(表14)。
根据公开的文献，HS91与2336高度相似并且毒力相当。在HS91中未发现丢失在发病机制中可潜在地起作用的毒力或毒力相关基因(表14)。
分离株153-3缺少在TK#4中被发现丢失的许多潜在的毒力基因(在TK#4中丢失的23个基因中的14个基因)，但丢失一些存在于TK#4中的另外的基因(所有分离株中鉴定的总共47个基因中有23个基因丢失)。除了TK#4以外，153-3也缺少丝状血凝素外膜蛋白、粘附素、10个重复的含YadA结构域的蛋白(相较于对于TK#4的5个重复)、糖基转移酶家族蛋白和乙酰转移酶。TK#4缺少但存在于153-3中的基因是应激-敏感性限制系统蛋白、含血凝素结构域的蛋白、糖苷水解酶家族蛋白、脂寡糖唾液酰基转移酶、Abi家族蛋白、脂蛋白、多铜氧化酶3型的一个同种型、TetR家族转录调节剂的一个同种型，和肽酶S8/S53酶枯草杆菌蛋白酶Kexin sedolisin(表14)。
来自第二种分析的3个最近的分离株比更早的分离株具有更多丢失基因。TK#34缺少最近的分离株的大多数基因，47个基因中的22个基因。这些基因包括丝状血凝素外膜蛋白、血凝素/溶血素样蛋白、粘附素、应激-敏感性限制系统、6个重复的含YadA结构域的蛋白、转铁蛋白结合蛋白、含血凝素结构域的蛋白的两个同种型、糖苷水解酶家族蛋白、TetR家族转录调节剂、lob1蛋白、MerR家族转录调节剂的两个同种型、多铜氧化酶3型、小的多药抗性蛋白、MarR家族转录调节剂以及肽S8/S53枯草杆菌蛋白酶kexin sedolisin。在TK#34中丢失的22个基因当中，发现TK#42缺少12个基因。这些基因包括：血凝素/溶血素样蛋白、5个重复的含YadA结构域的蛋白、TetR家族转录调节剂的一个同种型、MerR家族转录调节剂的2个同种型、多铜氧化酶3型的一个同种型、小的多药抗性蛋白和MarR家庭转录调控因子。除了TK#34也不存在的12个基因以外，TK#42还缺少一个重复的含YadA结构域的蛋白、糖基转移酶家族蛋白、毒力相关蛋白D(VapD)、酰基转移酶3、脂蛋白、多铜氧化酶3型的另一个同种型和TetR转录调控因子的另一个同种型。所有在TK#42中不存在的基因在TK#28中也不存在，没有例外(表15)。
表14.当与2336(登录号CP00947)比较时，在HS91、TK#21、TK#4、153-3和129PT的被分析基因组的一个或多个中丢失的参与毒力的基因
表15.当与2336(NCBI数据库中的登录号CP00947)比较时，TK#34、TK#42、2336、TK#28和129PT的被分析的基因组的一个或多个中丢失的参与毒力的基因
从全基因组汇编(whole genome compilation)鉴定了7个推定的PI或ICE。
第一PI或ICE位于HSM_R0009与大约HSM_0254之间(～28kb)，但似乎没有明显的毒力基因、毒力相关基因或药物抗性基因存在于这个位置中。HS91和2336含有所有存在的基因；然而，TK#21、TK#4、153-3、129PT和TK#34似乎缺少大部分位于该PI或ICE中的基因。TK#42和TK#28具有该第一PI或ICE的一部分。
第二位置在HSM_0319至HSM_0348之间(～41kb)，并且在该位置上存在两个重复的含YadA结构域的蛋白，其中一个是不存在于TK#21、TK#4、153-3和129PT中，另一个在153-3和129PT中丢失。
第三个PI位于HSM_0638至HSM_0692之间(～45kb)。分离株153-3、129PT和TK#34缺少在该潜在PI或ICE中的许多基因；然而，没有一个被鉴定为推定的毒力基因、毒力相关基因或耐药基因，因为PI中的很多基因仅被鉴定为假设的蛋白。
第四PI位置在HSM_0847与HSM_0923之间在该范围内再次未鉴定出毒力因子；然而TK#21、TK#4、153-3、129PT和TK#34缺少大部分在该区域中发现的基因。
第五PI位置在HSM_1115与HSM_1167之间(～51kb)。TK#4缺少HSM_1129至HSM_1146和HSM_1149至HSM_1167，该不存在的区域包括糖苷水解酶家族蛋白。分离株129PT缺少HSM_1131至HSM_1167，TK#34缺少HSM_1129至HSM_1144和HSM_1149至HSM_1167，但其它分离株具有这些存在的基因中的大多数。在HSM_1124上还存在双组分应答调节剂，其可参与帮助细菌感测多种环境并对其作出响应。所有测序的分离株均包含该双组分应答调节剂。
第六推定的PI或ICE是从HSM_1615至HSM_1719(～101kb)。在该区域内，存在Abi家族蛋白、酰基转移酶3、FhaB蛋白、丝状血凝素外膜蛋白、Lob1蛋白、乙酰转移酶和脂蛋白。TK#21、TK#4、153-3、129PT、TK#28、TK#42和TK#34缺少这些基因中的一些基因(表14和15)，从而潜在促成它们的不同水平的毒力。
最后一个潜在的PI或ICE位于HSM_1860至HSM_R0065(～38kb)。在该区域中从TK#21、TK#4、129PT和TK#34丢失的一个关键基因是肽酶S8/S53枯草杆菌蛋白酶kexinsedolisin，其对于初始宿主定殖是非常重要的。还有其它基因从TK#21、TK#4、129PT、TK#34、TK#42和TK#28丢失，其大部分被鉴定为假设的蛋白或转座酶。HS91、153-3、TK#42、2336和TK#28似乎具有该整个区域的大部分或全部完整区域。
讨论
TK#4似乎是被充分减毒，同时仍能够引发足够的免疫应答，使得该菌株成为强候选疫苗。TK#4缺少一些与在大约同年获得的其它分离株相似的基因；然而，一些不存在的基因对于TK#4是唯一的，包括：糖苷水解酶家族蛋白(GHFP)、脂蛋白(LP)、多铜氧化酶3型和TetR家族转录调节剂。从TK#4和致病分离株均丢失的几个基因，可促成减毒表型，然而，这些基因似乎不是无毒所必需的。
在另一方面，从TK#4独特地缺失然而存在于致病株中的两个基因，糖苷水解酶家族蛋白和脂蛋白，似乎对于TK#4的减毒表型是必要和充分的。
(TK#4中)这两个基因的表达不存在与减毒的毒力之间的因果关系得到先前公开的工作支持，所述工作表明GHFP和LP蛋白在定殖和宿主防御的逃避中起着重要的作用(Asgarali等2009；Garbe和Collin,2010；Liu等2008；以及Guzmán-Brambila等2012)。此外，该数据表明，虽然TK#4的减毒程度不如129PT，但该菌株为牛和小鼠二者提供保护(免受随后强毒攻击)。
与TK#4类似，TK#34也被高度减毒；然而，TK#4丢失更多数量的参与宿主逃避的基因。TK#4和TK#34二者均分别缺少含血凝素结构域的蛋白和含YadA结构域的蛋白的各种同种型或重复。TK#34缺少TK#4所具有的丝状血凝素外膜蛋白、粘附素、Lob1蛋白。TK#4缺少存在于TK#34中的脂寡糖唾液酰基转移酶、Abi家族蛋白、酰基转移酶3、脂蛋白、多铜氧化酶3型和TetR转录调节剂。结果表明，丢失的毒力因子的组合促成了在小鼠和牛中具有保护性的部分减毒的细菌(TK#4)或高度减毒但对于小鼠和牛无保护性的分离株(TK#34)。此处的数据单独地表明，本领域技术人员无法提前预测应当缺失哪些基因，以获得足够的减毒，但仍具有充分防护性的睡眠嗜组织菌疫苗株。
最后，水平基因转移似乎没有将一些抗性基因传递给该分离物，并且其它毒力因子的缺少似乎已使该分离株充分减毒以使其不能引发疾病。在另一方面，比共生菌株更多的毒力因子的存在使得TK#4成为强候选疫苗(即，该菌株能存活得足够长以刺激宿主体液免疫应答并提供长期的保护)。
已发现TK#21在小鼠和牛中是高强毒分离株。然而，在遗传上，其与当前菌株TK#4和153-3更相似(相对于TK#21毒力较小)，然而同时与其它已知的强毒株2336和HS91更加趋异。TK#21确实具有TK#4缺少的糖苷水解酶家族蛋白、脂蛋白、多铜氧化酶3型的一个同种型，和TetR家族转录调节剂的一个同种型。这4个基因均可促成TK#4的减毒。在TK#21中作为不同的同种型未被发现丢失的丢失的最独特的基因是糖苷水解酶和脂蛋白。组合在一起的这些基因似乎是造成攻击分离株(具有所述基因)与疫苗候选物(缺少所述基因)之间的充分差异所必需的。TK#21确实缺少TK#4所具有的含Yad A结构域的蛋白；然而，这似乎并不促成毒力的缺乏。与TK#21相关的毒力似乎不归因于其与2336的趋异，而是归因于其与TK#4的微妙差异。
TK#21、TK#4、153-3、TK#34、TK#42和TK#28的更加靠近现在的分离株似乎是相似的，但它们与2336和HS91显著不同(见表15)。这些数据表明，睡眠嗜组织菌群正随时间流逝而进化，以及普遍接受攻击分离株2336可能不再与小牛目前面临的睡眠嗜组织菌的基因库相关。这也提供了支持TK#4作为疫苗候选物的证据，因为其遗传组成与小牛的牛呼吸道疾病综合征中目前流行的菌株高度相关。比对率支持HS91和2336是十分密切相关的，以及TK#21、TK#4、153-3、TK#34、TK#42和TK#28是密切相关的。还表明的是，目前的分离株在遗传上与二十世纪年代所分离的那些分离株不同。同样，当观察基因的不存在时，更加靠近现在的分离株比HS91缺少更多数量的2336基因，并且当前的分离株也往往缺少相似的基因。这意味着基因组在睡眠嗜组织菌中天然漂变。同样，由于当前的分离株代表了美国国内的不同状态，因此这意味着，此处看到的遗传漂变代表美国的当前的睡眠嗜组织菌群。
总体而言，该数据表明，许多基因的组合可能是使分离株成为有效疫苗或攻击候选物所需的，并且只有少数基因的丢失可使候选物减毒至足以拯救动物的生命而非结束其生命。该数据还表明，所述睡眠嗜组织菌群随时间流逝确实漂变，并且该产业需要进化以保持相关疫苗。这些数据强烈支持自体疫苗性以及定期重新评价商业疫苗功效的重要性。
表16.针对利用“SAMTools mpileup”分析的每一个分离株鉴定的变体(对于2336，登录号CP00947)
除了许多鉴定的SNP(表16)以外，还存在许多丢失的基因(表17-23)。对于所有毒相关基因，更加靠近现在的分离株(TK#21、TK#4、153-3、TK#34、TK#42和TK#28)和129PT具有最多SNP，而HS91野生型、HS91突变体和2336具有少数SNP乃至没有SNP。对于LOS生物合成或修饰基因，在两种分析中的糖基转移酶和乙酰转移酶基因中，以及在组2分析的lob2b中发现最高百分比的SNP。分离株129PT缺少最多LOS生物合成或修饰基因。对于粘附、定殖和生物膜形成基因，在含YadA结构域的蛋白和含血凝素结构域的蛋白中发生最多SNP。所述粘附、定殖和生物膜形成基因中的许多基因在最近的分离株中丢失。组1中的糖苷水解酶以及两个组中的一些TonB依赖性受体对于宿主侵袭或金属摄取具有最多SNP。许多应激反应、抗生素抗性基因和药物外排基因从大多数更加新的分离株中丢失。在存在的分离株当中，除TetR家族转录调节剂外，组1中的SNP的百分比相当低。
对于参与LOS生物合成或修饰的基因，除129PT外的所有分离株在OMP转运蛋白P1中具有1个插入缺失。对于lob2b，TK#21和TK#34分别具有1个和2个插入缺失。所有最近的分离株对于pgmB具有1个插入缺失，但HS91和2336的较早分离株没有。TK#42和TK#28在糖基转移酶家族蛋白中具有1个插入缺失，并且它们在lob2a中具有1个插入缺失。分离株129PT在neuAHS中具有插入缺失。
在参与粘附、定殖和与生物膜形成的毒力相关基因的非同义插入缺失的组1分析中，TK#21和TK#4具有最多插入缺失。这些插入缺失发生在含YadA结构域的蛋白(对于TK#21总共26个插入缺失，对于TK#4总共32个插入缺失)、丝状血凝素外膜蛋白(对于TK#21总共6个插入缺失和对于TK#4总共5个插入缺失)以及对于TK#21在粘附素中1个插入缺失。分离株153-3也在组1中具有一些插入缺失，但缺少大部分被分析的基因，有点类似于129PT。存在的具有非同义插入缺失的这些基因有含YadA结构域的蛋白(总共6个插入缺失)、丝状血凝素外膜蛋白(3个插入缺失)和含血凝素结构域的蛋白(1个插入缺失；表19)。对于关于粘附、定殖和生物膜形成的组2的分析，分离株TK#34、TK#42和TK#28具有最多插入缺失。这些插入缺失存在于含YadA结构域的蛋白(对于TK#34总共24个插入缺失，对于TK#42总共31个插入缺失，以及对于TK#28总共31个插入缺失)、丝状血凝素外膜蛋白(对于TK#34总共2个插入缺失，对于TK#42总共4个插入缺失，以及对于TK#28总共4个插入缺失)以及对于TK#34在含血凝素结构域的蛋白中存在1个插入缺失。而且，129PT对于含YadA结构域的蛋白具有7插入缺失并且在含血凝素结构域的蛋白中具有1个插入缺失，虽然其缺乏许多被分析的基因。最后，HS91 ΔaroC和HS91 ΔnanPU分别总共具有3个和2个插入缺失，以及对于丝状血凝素外膜蛋白和对于含YadA结构域的蛋白各自具有1个插入缺失(表20)。
表17.存在于来自参与脂寡糖(LOS)生物合成或修饰的毒力相关基因的组1分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示此时对于该特定分离株发现基因丢失。
表18.存在于来自参与脂寡糖(LOS)生物合成或修饰的毒力相关基因的组2分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示此时对于该特定分离株发现基因丢失。
表19(5).存在于来自参与粘附、定殖或生物膜形成的毒力相关基因的组1分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示此时对于该特定分离株发现基因丢失。
表20(6).存在于来自参与粘附、定殖或生物膜形成的毒力相关基因的组2分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示此时对于该特定分离株发现基因丢失。
表21.存在于来自参与宿主侵袭或金属摄取的毒力相关基因的组1分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示此时对于该特定分离株发现基因丢失。
表22.存在于来自参与宿主侵袭或金属摄取的毒力相关基因的组2分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示此时对于该特定分离株发现基因丢失。
表23.存在于来自参与应激反应、抗生素抗性和药物外排的毒力相关基因的组1分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示此时对于该特定分离株发现基因丢失。
表24.存在于来自参与应激反应、抗生素抗性和药物外排的毒力相关基因的组2分析的分离株中的插入缺失的数量
*表示基因从该特定分离株丢失。
对于参与宿主侵袭和金属摄取的毒力相关基因在最近的分离株和129PT当中丢失的插入缺失存在许多相似性。这些基因包括TonB依赖性受体(对于TK#4和TK#34的每一个存在2个插入缺失，对于TK#42、TK#28和129PT存在1个插入缺失)、TbpB(对于HS91、TK#42、2336、TK#28和129PT各自存在1个插入缺失)、TbpA(对于TK#21、TK#4、153-3、TK#34和TK#42存在2个插入缺失，对于129PT存在3个或4个插入缺失(对于该分离株，两次分析的结果导致不同的插入缺失估计)，以及对于TK#28存在1个插入缺失)、TbpA2(对于153-3存在1个插入缺失)、溶血激活/分泌蛋白样蛋白(对于TK#42和TK#28各自存在1个插入缺失)、TonB依赖性血红蛋白/转铁蛋白/乳铁蛋白家族受体(对于129PT存在1个插入缺失)和外膜血红素受体蛋白(对于TK#21和TK#4存在1个插入缺失，对于TK#34和129PT存在2个插入缺失)。在应激反应、抗生素抗性和药物外排基因当中具有任何插入缺失的唯一基因是酰基转移酶3。在HS91和2336中存在1个非同义插入缺失，而在TK#34、HS91 ΔaroC和HS91 ΔnanPU中存在2个插入缺失。
* * * * * * * *
在已这样详细地描述本发明的优选实施方案后，应当理解的是，由上述段落定义的本发明不限于上述描述中所示的具体细节，因为其许多显而易见的变化是可能的，而不脱离本发明的精神或范围。

Claims (30)

1.一种减毒睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)株，其能够在牛类动物中提供抗睡眠嗜组织菌或由睡眠嗜组织菌引起的疾病的安全有效的免疫应答；其中所述减毒株相对于参照强毒睡眠嗜组织菌株在其基因组序列中缺少最小数量的毒力因子编码基因；并且其中该毒力因子编码基因的相对不足使得所述减毒株不能在所述牛类动物中引起感染。
2.权利要求1的减毒株，其中所述参照强毒株包含基因组DNA序列，其编码和表达至少99％或100％的与如SEQ ID NO:2中所示的序列所编码的基因相同的基因；和
其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQID NO:1、3、4和5中之任一所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。
3.权利要求2的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少100％的与如SEQ ID NO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因。
4.权利要求2的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQ ID NO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因；和
其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQID NO:1中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。
5.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQ ID NO:3中所示的序列所编码的基因相同的基因；和
其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQID NO:3中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。
6.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQ ID NO:4中所示的序列所编码的基因相同的基因；和
其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQID NO:4中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。
7.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株编码和表达至少99％的与如SEQ ID NO:5中所示的序列所编码的基因相同的基因；和
其中所述减毒株以约等于或低于(包括不可检测的水平)由在其基因组中具有如SEQID NO:5中所示的序列的减毒株表达的对应毒力基因的水平的水平表达任何毒力因子基因。
8.权利要求1的减毒株，其中所述减毒株相对于睡眠嗜组织菌株2336缺少至少99％的与睡眠嗜组织菌株#4所编码的基因相同的基因；其中菌株2336包含基因组序列，其编码和表达至少99％的与如SEQ ID NO:6中所示的序列所编码的基因相同的基因；和
其中菌株#4包含基因组序列，其编码和表达至少99％的与如SEQ ID NO:1中所示的序列所编码的基因相同的基因。
9.权利要求1的减毒株，其编码和表达至少99％的与在名称PTA-121029(TK#4)或PTA-121030(TK#42)下保藏在ATCC中的菌株中的基因相同的基因。
10.权利要求9的菌株，其中所述菌株是与在名称PTA-121029(TK#4)下保藏在ATCC中的菌株相同的菌株。
11.权利要求9的菌株，其中所述菌株是与在名称PTA-121030(TK#42)下保藏在ATCC中的菌株相同的菌株。
12.一种免疫组合物，其包含权利要求1至11的任一项的减毒株或基本上由其组成。
13.权利要求12的组合物，其还包含药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。
14.权利要求12的组合物，其中所述组合物在牛类动物中引发抗随后对至少一种强毒睡眠嗜组织菌株的暴露的保护性免疫应答；并且其中所述组合物是非佐剂化的。
15.权利要求12的组合物，其还包含至少一种或多种另外的抗原，所述抗原能够在牛类动物中引发病原体特异性免疫应答。
16.权利要求15的组合物，其中所述抗原在牛类动物中引发足以保护所述动物免受随后对所述抗原所源自的病原体的暴露的侵害的免疫应答。
17.权利要求15的组合物，其中所述至少一种或多种另外的抗原能够在牛类动物中引发抗以下疾病或病毒的免疫应答：牛呼吸道疾病综合征(BRDC)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻(BVD)、牛副流感3(PI3)、牛传染性鼻气管炎(IBR)、牛疱疹病毒-1(BHV-1)、蓝舌病病毒(BTV)或能够在牛类动物中感染和引起疾病或对疾病的易感性的任何其它病原体。
18.一种在有此需要的牛类动物中引发抗随后的强毒睡眠嗜组织菌感染的保护性免疫的方法，其包括向所述牛类动物施用权利要求12的组合物的步骤。
19.权利要求18的方法，其中所述随后的强毒睡眠嗜组织菌是通过被至少一种强毒睡眠嗜组织菌株感染的另一个牛类动物传播至牛的自然感染。
20.权利要求18的方法，其中接种疫苗是鼻内、皮下或肌内接种。
21.权利要求18的方法，其中所述组合物包含缺少或不表达糖苷水解酶家族蛋白(HSM_1160)和脂蛋白(HSM_1714)基因的减毒株。
22.权利要求21的方法，其中所述减毒株还缺少或不表达多铜氧化酶3型(HSM_1726)和TetR家族转录调节剂(HSM_1734)基因。
23.一种在名称PTA-121028下保藏在ATCC的高毒睡眠嗜组织菌攻击株。
24.一种方法，其使板上生长的睡眠嗜组织菌株的毒力增加如通过用肉汤生长的菌株对比在平板上生长的同一菌株接种的动物的参照组的死亡率百分比测量的至少约20％，该方法包括步骤：a)提供睡眠嗜组织菌株；b)在Columbia肉汤或其等效肉汤中生长所述菌株，从而增加毒力。
25.一种提供高毒睡眠嗜组织菌攻击剂量的方法，其包括提供有效量的权利要求24中的菌株。
26.权利要求26的方法，其还包括在Columbia肉汤或其等效肉汤中生长所述菌株。
27.权利要求27的方法，其中所述有效量是至少约4.8x10E8CFU/剂量。
28.一种遗传工程化的非天然存在的减毒睡眠嗜组织菌株，其适合用于安全有效的疫苗制剂，并且具有至少以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源野生型基因产物的能力：HSM_1160(糖苷水解酶家族蛋白)和HSM_1714(脂蛋白)。
29.权利要求28的遗传工程化的减毒睡眠嗜组织菌株，其具有至少以下突变的基因，包括所述基因被完全缺失，以消除所述基因表达其同源野生型基因产物的能力：HSM_0270、HSM_0338、HSM_0377、HSM_0598、HSM_0708、HSM_0749、HSM_0953、HSM_1160、HSM_1191、HSM_1257、HSM_1426、HSM_1616、HSM_1624、HSM_1714、HSM_1728、HSM_1730、HSM_1734、HSM_1736、HSM_1737、HSM_1741、HSM_1793和HSM_1889。
30.一种疫苗组合物，其包含权利要求28的菌株。
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