KR101924271B1 - 약독화된 히스토필러스 솜니를 함유하는 면역학적 조성물 - Google Patents

약독화된 히스토필러스 솜니를 함유하는 면역학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약독화된 히스토필러스 솜니 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다. 상기 약독화된 균주는 상응하는 병원성 박테리아에 비해 다양한 독성-관련 유전자를 보다 낮은 수준으로 발현하거나 또는 발현하지 않는다. 유리하게, 약독화된 히스토필러스 솜니 균주는 경구, 비내, 기도내, 또는 피하 투여될 수 있다.

Description

약독화된 히스토필러스 솜니를 함유하는 면역학적 조성물{IMMUNOLOGICAL COMPOSITIONS CONTAINING ATTENUATED HISTOPHILUS SOMNI}
참조로 편입
본 출원은 2014년 3월 25일 출원된 미국 가출원 USSN 제61/970,195호의 우선권을 청구하며, 이를 전체로 참조로 본원에 편입시킨다. 본원에 인용된 모든 다른 참조문헌도 역시 그들 전체로 참조로 본원에 편입시킨다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 서류 사본 대신 텍스트 형식으로 제공하며, 본 명세서에 참조로 편입시킨다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일명은 MER_13_225P_ST25이다. 이 텍스트 파일은 17,356 KB이고, 2014년 2월 20일에 생성되었으며, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-웹을 통해 전자 제출되었다.
발명의 분야
본 발명은 대체로 유전자 조작된, 약독화 박테리아 백신, 구체적으로 히스토필러스 솜니(Histophilus somni)(이전에 해모필러스 솜너스(Haemophilus somnus))에 의해 야기되는 감염/질병에 대해 소에게 광범위하고, 안전하며 효과적인 보호성을 제공하는 것들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약독화 박테리아를 제조하는 방법, 및 약독화 박테리아의 감소된 병원성과 연관된 핵산 변이의 동정에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 본 발명의 박테리아, 예를 들어 살아있는 약독화된 박테리아를 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 박테리아는 또한 조성물에서 불활성화될 수 있지만, 박테리아가 생 약독화 히스토필러스 솜니인 것이 유리하다. 그러므로 본 발명은 또한 이러한 조성물을 제조 및/또는 제제화하는 방법에 관한 것이고, 예를 들어 적합한 배지 상에서 또는 배지 내에서 박테리아를 배양 또는 성장 또는 전파시키고, 그 박테리아를 수확하며, 선택적으로 박테리아를 불활성화시키고, 선택적으로 적합한 수의학적으로 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 비히클 및/또는 보조제 및/또는 안정화제와 혼합한다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 조성물의 제제화에서 박테리아의 용도에 관한 것이다.
소 호흡기 복합 질환(BRDC)은 복수개의 미생물 병원체로 이루어지고 소 산업의 상당한 경제적 손실의 원인이 된다. 예방 백신과 발병 후 약물을 포함한 치료 비용은 년간 거의 $40억으로 추정된다(Griffin, 1997). BRDC 진단된 동물에서 관찰된 행동의 연관 손실과, 평균 일일 증체량, 포획시 체중, 및 육질 등급에 대한 상당한 손실이 경제적 효과에 더해진다(Babcock, 2010). 감소된 행동과 연관된 구체적인 금전적 손실에 관한 보고는 다양한데, 아마도 BRDC의 다양한 사례 정의에 기인하는 듯 하지만, 동물 당 $40(Fulton, 2002) 내지 거의 $300(Duff and Gaylean 2011)로 추정된다. 행동 소실은 또한 동물이 BRDC 치료를 필요로 하는 횟수만큼 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다(Fulton, 2002).
히스토필러스 솜니(이전에 해모필러스 솜너스)는 BRDC의 핵심 원인체로 동정되었다(Duff and Gaylean 2011). 파스텔레라시아(Pasterellacea)과에 속하는 이 그람 음성 다형성 구상 간균(Korczak, 2004)은 소, 양 및 다른 반추동물의 상기도 및 비뇨생식로의 정상적인 미생물군총의 일부를 구성한다(Ward, 2006). 이는 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 및 만하이미아 해모라이티카(Mannheimia haemolytica)(둘 모두 역시 BRDC와 연관)를 포함한 다른 소 병원체를 비롯하여 인간 병원체 해모필러스 두크레이이(Haemophilus ducreyi) 및 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)와 밀접하게 관련된다(Challacombe, 2007).
건강한 송아지의 상기도에서 에이치.솜니의 단리율은 질환의 임상 징후없이 50% 정도로 높게 추정되지만, BRDC로 진단받은 동물은 상기 박테리아의 단리율이 보다 더 높았다(Griffin, 2010). 스트레스 상태이거나 또는 면역억제 상태 하에서, 에이치. 솜니는 하기도, 심장 내막, 또는 중추 신경계에 군집화될 수 있으며, 폐렴, 심장내막염, 관절염, 유산, 패혈증, 및 혈전색전성 뇌수막염(TEME)과 같은 다양한 질환의 유병 기생충으로서 동정되었다(Ward, 2006).
도살 시에, BRDC에 적절한 치료(예방 백신접종 및 발병중 적절한 항생제)를 받은 동물의 15% 미만은 폐 병변 징후를 보이며 이들 병변은 전체 폐의 5% 미만이 연관된다(Griffin, 2010). 반대로, 적절한 관리를 받지 않은 동물의 50%는 도살 시에 폐 병변이 나타나고, 이들 병변은 전체 폐의 15% 이상이 관여된다(Griffin, 2010). 만 마리 이상의 동물에 대한 한 사육장 연구에서, 459 마리의 송아지(4.6%)가 한가지 형태의 질환 또는 다른 형태의 질환에 의해 폐사되었다. 이 연구의 폐사율 중에서, 279 마리(60.8%)는 호흡기 질환과 관련된 것으로 확인되었고, 호흡기 감염된 동물 중에, 226 마리(81.0%)는 에이치. 솜니 관련 폐렴, 흉막염, 또는 농양(Ribble, 1988)과 연관있었다. 에이치. 솜니 감염에 대응하여 항생제 치료가 성공적이었지만, 항생제 내성 사육장 단리주의 높은 발병률이 우려된다(Duff and Gaylean, 2011). 사후 반응보다는 사전대응적이고 훨썬 더 비용 효율적이므로 백신접종에 의한 예방적 관리가 바람직하다.
많은 에이치. 솜니 백신이 현재 다양한 동물 건강 회사에서 입수가능하지만, 이들 백신은 주로 사멸된 박테린으로 구성되고 TEME 예방 목적으로 30년 전에 허가된 것들이다. 이들 박테린 백신의 사용은 TEME에는 효과적이지만, 사육소의 호흡기 질환에 대해서는 중성적이거나 심지어 부정적인 효과를 보였다. 음성적인 부작용은 소 호흡기 합포성 바이러스(BRSV)로 감염된 송아지를 백신접종시킨 경우 IgE 유발된 과민성 쇼크 및 상호작용을 포함한다(Griffin, 2010). 1980년대 후반에 시작된 TEME 발병률 감소와 미국에서 에이치. 솜니 관련 폐렴 및 캐나다에서 심근염의 출현은 백신 생산을 위한 효율적인 항원의 추가적인 조사에 대한 필요성을 이끌었다(O'Toole, 2009).
에이치. 솜니 관련 폐렴은 육우 및 낙동 산업에 경제적으로 중요한 병태이다. 현재 입수가능한 백신의 사육장 효능에 대한 증거가 거의 없어, 차세대 백신 생성물 연구에 대한 필요성은 정당하다.
본 발명의 목적은 약독화 박테리아를 비롯하여 에이치. 솜니에 의한 감염의 치료 및 예방을 위한 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예에서, 백신은 보다 독성인 균주와 비교하여 병원성이 덜한, 약독화된 에이치. 솜니를 포함한다. 종합적인 비교 서열 분석은 보다 독성인 균주에 비해서, 약독화된 에이치. 솜니 균주에는 중요한 독성 인자가 부재함을 밝혀 주었다. 따라서, 보다 독성인 에이치. 솜니 균주가 보유하는 독성 인자가 결여된, 약독화된 에이치. 솜니를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본원에서 정의된 바와 같이, 용어 "유전자"는 광범위한 의미로 사용되며 코딩 및 비코딩 서열(즉, 상류 및 하류 조절 서열, 프로모터, 5'/3' UTR, 인트론, 및 엑손) 둘 모두를 포함하는 것이다. 오직 유전자의 코딩 서열만을 의도하여 언급하는 경우에, 용어 "유전자의 코딩 서열" 또는 "CDS"는 본 명세서 전반에서 상호교환적으로 사용된다. 특이적 핵산이 설명되는 경우, 당업자는 즉각적으로 그 서열의 모든 유발가능한 형태(mRNA, vRNA, cRNA, DNA, 단백질 등)를 소유하는 것이다.
본 발명은 약독화된 에이치. 솜니, 또는 약독화된 에이치. 솜니를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 에이치. 솜니에 대항하여 면역학적(또는 면역원성) 또는 보호성 반응을 유발시키기 위한 방법을 비롯하여, 에이치. 솜니, 또는 에이치. 솜니에 의해 유발된 질환 상태(들)을 예방하거나 또는 치료하기 위한 방법을 더 제공한다. 그에 더하여, 적어도 약독화된 에이치. 솜니 균주(들) 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
이들 및 다른 구체예들은 이하의 구체적인 설명에서 개시하거나 또는 그로부터 명백해지며 그에 포괄된다.
당업자에게, 그 최고 방식을 포함하여, 본 발명의 완전하고 확실한 사항들을 첨부된 도면의 참조를 포함해, 명세서의 나머지에서 보다 구체적으로 기재한다:
도 1은 챌린지 모델에서 시험된 각 단리주 및 용량에 따른 평균 폐 병변 비율을 도시한다. 상이한 글자군들은 아크 사인 전환 데이타에 수행된 스튜던트 t 검정에 따라 유의한 차이가 있다.
도 2는 백신이 비내로 (intranasal) 투여된 백신접종-챌린지 실험의 개별 소에서 관찰된 폐 병변 비율을 도시한다. 동일한 색상 막대는 같은 단리주로 백신접종된 동물의 결과를 나타낸다. 백신접종 단리주는 막대 아래에 열거하였고, 모든 동물들은 동일한 챌린지 단리주로 챌린지되었다. 동일한 글자(들)가 수반된 군들은 아크 사인 전환된 데이타에 수행된 스튜던트 t 검정법에 따라 유의한 차이가 없다.
본 발명은 미생물, 예컨대 박테리아, 예를 들어 에이치. 솜니의 약독화에 관여되는 뉴클레오티드 서열 및 유전자, 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 산물(예를 들어, 단백질, 항원, 면역원, 에피토프), 이러한 뉴클레오티드 서열, 생성물, 미생물을 제조하는 방법, 및 예컨대 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하기 위해서 또는 면역학적 또는 면역 반응을 유발시키기 위해서 또는 벡터로서, 예를 들어 발현 벡터(예를 들어, 시험관내 또는 생체내 발현 벡터)로서 이의 용도를 제공한다.
미생물의 뉴클레오티드 서열 및 유전자에서 동정된 돌연변이는 신규하고 불명확한 약독화 돌연변이체를 생산한다. 이들 돌연변이체는 높은 정도의 면역원성을 갖는 생 약독화 면역원성 조성물 또는 생 약독화 백신의 생산에 유용하다.
돌연변이의 동정은 신규하고 불명확한 뉴클레오티드 서열 및 유전자를 비롯하여, 이러한 뉴클레오티드 서열 및 유전자에 의해 코딩된 신규하고 불명료한 유전자 생성물을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 에이치. 솜니 또는 에이치. 솜니에 의해 야기된 질병에 대항하여 소에서 안전하고 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있는 약독화된 에이치. 솜니 균주를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열 또는 유전자에 약독화 돌연변이를 함유하는 박테리아를 제공하고 여기서 상기 돌연변이는 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 변화시켜, 그 결과 박테리아의 독성이 약독화된다.
구체적으로, 본 발명은 동물에서 면역원성 반응을 유발하는 약독화된 에이치. 솜니 균주 및 이를 포함한 백신, 구체적으로 소에서 반응을 유발, 유도 또는 자극하는 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함한다.
관심의 구체적인 에이치. 솜니 약독화 균주는 독성 균주에 비해, 유전자에 돌연변이를 갖는다. 개시된 돌연변이를 갖는 균주 이외에도, 개시된 독성 유전자에 임의 개수의 돌연변이를 갖는 약독화된 균주가 본 발명의 실시에 사용될 수 있음을 인식한다.
다른 측면에서, 신규한 약독화된 에이치. 솜니 균주는 에이치. 솜니 및 에이치. 솜니에 의해 야기된 질병/감염에 대항해 안전하고, 효과적인 백신으로 제제화된다.
일 구체예에서, 약독화된 에이치. 솜니 균주는 에이치. 솜니 또는 에이치. 솜니에 의해 야기된 질병에 대항하여 소에서 안전하고 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있다.
특정 구체예에서, 약독화된 균주는 그외에는 유전적으로 유사한 독성 균주에 비해, 1 또는 몇몇 독성 유전자가 결여된다. 일 구체예에서, 약독화된 균주는 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질(HSM_1160) 및 지단백질(HSM_1714)이 결여되고/되거나 발현되지 않는다. 균주의 약독화 표현형의 원인이기도 하는 부재 유전자는 3형 다중구리 산화효소(HSM_1726) 및 TetR 패밀리 전사 조절인자(HSM_1734)를 포함한다. 보다 더 특정 구체예에서, 약독화된 균주는 명칭 PTA-121029 하에서 ATCC에 기탁된 것과 동일하다.
일 구체예에서, 균주는 비내로 또는 피하로 투여될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 개시된 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함하는 면역학적 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 약학적 또는 수의학적 허용 비히클, 희석제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 후속 독성 에이치. 솜니 챌린지에 대항하여 소에서 안전하고 보호적인 면역 반응을 제공할 수 있다.
여전히 다른 구체예에서, 상기 조성물은 안전하고 효과적인 백신 제제에 사용하기 적합하며, 그들의 동족 유전자 생성물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전하게 결실되는 것을 포함해, 적어도 다음의 유전자가 돌연변이된, 유전자 조작된, 비천연 유래의, 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함할 수 있다: HSM_0270, HSM_0338, HSM_0377, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0953, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1426, HSM_1616, HSM_1624, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793 및 HSM_1889. 구체예에서, 조작된 에이치. 솜니 균주는 TK #4와 비교하여 동일한 약독화된 표현형을 갖는다.
관련 구체예에서, 상기 조성물은 안전하고 효과적인 백신 제제에 사용하기 적합하고, 그들의 동족 유전자 생성물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전하게 결실된 것을 포함하여, 충분한 개수의 다음의 유전자가 돌연변이된, 유전자 조작된, 비천연 유래의, 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함할 수 있다: HSM_0270, HSM_0338, HSM_0377, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0953, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1426, HSM_1616, HSM_1624, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793 및 HSM_1889. 특정 구체예에서, 조작된 에이치. 솜니 균주는 TK #4와 비교하여 동일한 약독화된 표현형을 갖는다.
다른 구체예에서, 조성물은 안전하고 효과적인 백신 제제에 사용하기 적합하고, 그의 동족 유전자 생성물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전하게 결실된 것을 포함하여, 적어도 다음의 유전자가 돌연변이된, 유전자 조작된, 비천연 유래의, 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함할 수 있다: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1726, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 및 HSM_1793. 특정 구체예에서, 조작된 에이치. 솜니 균주는 TK #42와 비교하여 동일한 약독화된 표현형을 갖는다.
관련 구체예에서, 조성물은 안전하고 효과적인 백신 제제에 사용하기 적합하고, 그 동족 유전자 생성물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전하게 결실되는 것을 포함하여, 충분한 수의 다음의 유전자가 돌연변이된, 조작된 비천연 유래의, 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함할 수 있다: HSM_0077, HSM_0270, HSM_0708, HSM_0975, HSM_1191, HSM_1257, HSM_1448, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1624, HSM_1714, HSM_1726, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1734, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741 및 HSM_1793. 특정 구체예에서, 조작된 에이치. 솜니 균주는 TK #42와 비교하여 동일한 약독화된 표현형을 갖는다.
다른 구체예에서, 조성물은 안전하고 효과적인 백신 제제에 사용하기 적합하고, 그 동족 유전자 생성물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전하게 결실된 것을 포함하여, 적어도 다음의 유전자가 돌연변이된, 유전자 조작된, 비천연 유래의, 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함할 수 있다: HSM_0268, HSM_0270, HSM_0274, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0938, HSM_1022, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1212, HSM_1257, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1667, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793 및 HSM_1889. 특정 구체예에서, 조작된 에이치. 솜니 균주는 TK #34와 비교하여 동일한 약독화된 표현형을 갖는다.
관련 구체예에서, 조성물은 안전하고 효과적인 백신 제제에 사용하기 적합하고, 그 동족 유전자 생성물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전하게 결실되는 것을 포함하여, 충분한 개수의 다음의 유전자가 돌연변이된, 유전자 조작된, 비천연 유래의, 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함할 수 있다: HSM_0268, HSM_0270, HSM_0274, HSM_0598, HSM_0708, HSM_0749, HSM_0938, HSM_1022, HSM_1160, HSM_1191, HSM_1212, HSM_1257, HSM_1542, HSM_1571, HSM_1667, HSM_1728, HSM_1730, HSM_1736, HSM_1737, HSM_1741, HSM_1793 및 HSM_1889. 특정 구체예에서, 조작된 에이치. 솜니 균주는 TK #34와 비교하여 동일한 약독화된 표현형을 갖는다.
본 출원인은 이제 이들 충분한 세트의 약독화되는 유전자 결실을 개시하며, 당업자는 어떠한 이들 유전자 결실의 서브조합들이 비슷하거나 또는 동등하게 약독화된 에이치. 솜니 백신 균주를 생성시키는데 필요한지를 결정하는데 단지 비통상적인 작업들만이 남아 있음을 이해하게 된다.
다른 구체예에서, 조성물은 에이치. 솜니이외의 소 병원체와 관련되거나 또는 그로부터 유래된 적어도 하나의 추가 항원을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 적어도 하나 또는 그 이상의 추가 항원(들)은 에이치. 솜니, 소 호흡기 복합 질환(BRDC), 소 호흡기 합포성 바이러스(BRSV), 소 바이러스성 설사병(BVD), 소 파라인플루엔자 3(PI3), 감염성 소 비강기관염(IBR), 소 헤르페스바이러스-1(BHV-1), 청설병 바이러스(BTV), 또는 소에서 감염시키고 및 질병 또는 질병에 대한 감수성을 야기할 수 있는 임의의 다른 병원체에 대항하여 면역 반응을 소에서 유발시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함하는 개시된 면역학적 조성물 중 적어도 하나의 투여를 포함하는 동물을 백신접종하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 에이치. 솜니 백신은 보조제를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 보조제는 클로스트리듐(clostridium), 에이치. 솜니, 만하이미아, 파스퇴렐라, 히스토필러스, 살모넬라(Salmonella), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 또는 이의 조합 및/또는 변이를 포함하는, 전체 박테리아 및/또는 박테리아를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 보조제는 IgM, IgG, IgA, 및/또는 이의 조합의 동물 생산을 증가시킨다.
다른 구체예에서, 본 발명은 에이치. 솜니, 또는 에이치. 솜니에 의해 야기된 질병에 대항하여 소과 동물에서 안전하고 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있는, 약독화된 히스토필러스 솜니(에이치. 솜니) 균주를 제공하고, 이러한 약독화된 균주는 소과 동물에서 감염을 일으킬 수 없는 약독화된 균주가 만들어지도록, 기준 독성 에이치. 솜니 균주에 비해, 최소 개수의 독성 인자-코딩 유전자가 그의 게놈 서열에서 결여된다.
일 구체예에서, 기준 독성 균주는 서열번호 2에 기재된 서열과 같은 유전자의 적어도 약 99%를 코딩하는 게놈 DNA 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 1, 3, 4, 또는 5에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩한다. 특정 구체예에서, 약독화된 균주(들)은 서열번호 1, 3, 4, 또는 5에 기재된 바와 같은 서열을 그 게놈에 갖는 약독화된 균주에 의해 발현되는 상응하는 독성 유전자의 수준과 대략 균등하거나, 또는 더 낮은 수준(미검출 수준 포함)으로 임의의 독성 인자 유전자를 발현한다.
특정 구체예에서, 약독화된 균주는 에이치. 솜니 균주 2336에 비해, 에이치 솜니 균주 #4와 동일한 유전자의 적어도 약 99%가 결여된다. 이러한 구체예에서, 균주 2336은 서열번호 6에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩하는 게놈 서열을 포함하고, 균주 #4는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩하는 게놈 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 약독화된 균주는 명칭 PTA-121029 하에 ATCC에 기탁된, #4 단리주(즉, TK #4)이다. 다른 구체예에서, 약독화된 균주는 명칭 PTA-121030 하에 ATCC에 기탁된 #42 단리주(즉, TK #42)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 약독화된 균주를 포함하는 면역학적 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 조성물은 서열번호 1, 3, 4 또는 5에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩하는, 약독화된 균주를 포함한다.
일 특정 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩한다. 관련 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 서열과 모든 동일한 유전자를 코딩한다.
일 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 4에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩한다. 관련 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 4에 기재된 바와 같은 서열과 모든 동일한 유전자를 코딩한다.
여전히 다른 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩한다. 관련 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 서열과 모든 동일한 유전자를 코딩한다.
또 다른 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 5에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 약 99%를 코딩한다. 관련 구체예에서, 약독화된 균주는 서열번호 5에 기재된 바와 같은 서열과 모든 동일한 유전자를 코딩한다.
일 구체예에서, 면역학적 조성물은 약학적 또는 수의학적 허용 비히클, 희석제 또는 부형제를 더 포함한다.
특정 구체예에서, 면역학적 조성물은 독성 에이치. 솜니 균주에 대한 후속 노출에 대항하여 소과 동물을 보호하는, 보호 면역 반응을 소과 동물에서 유발시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 면역학적 조성물은 소과 동물에서 병원체-특이적 면역 반응을 유발시킬 수 있는 적어도 하나 또는 그 이상의 추가 항원을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나 또는 그 이상의 추가 항원은 소에서 그 항원이 유래된 병원체에 후속 노출로부터 동물을 보호하기에 충분한 면역 반응을 유발시킨다. 따라서, 소 PI3 항원이 면역학적 조성물의 성분으로 포함되는 경우, 이 조성물은 보호 면역 반응을 유발시켜야 한다.
다른 구체예에서, 추가 항원은 소 호흡기 복합 질환, BRSV, BVD, PI3 또는 소과 동물에서 감염시키고 및 질병 또는 질병에 대한 감수성을 야기할 수 있는 임의의 다른 병원체에 후속 노출에 대항하여 동물의 면역 반응을 강화시키는, 면역 반응을 소과 동물에서 유발시킬 수 있다. 예를 들어, BRSV 항원은 독성 BRSV에 후속 노출에 대항한 보호성을 제공하게 된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 면역학적 조성물의 적어도 한 용량을 소과 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 소과 동물을 백신접종하는 방법을 제공한다.
"항원" 또는 "면역원"은 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 전체 유기체, 사멸된 것, 약독화된 것 또는 살아있는 것; 유기체의 서브유닛 또는 일부분; 면역원성 특성을 갖는 삽입부를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 세포에 제시시 면역 반을 유도할 수 있는 DNA 조각 또는 단편; 폴리펩티드, 에피토프, 햅텐, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 단편"은 임의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형이거나 또는 분지형일 수 있고, 개질된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 아미노산 이외의 화학적 모이어티가 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 천연적으로 또는 개재에 의해, 예를 들어 디설피드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 또는 생체활성 성분과의 접합에 의해 개질되는 아미노산 중합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성 또는 항원성 폴리펩티드"는 숙주에게 투여되면, 그 단백질에 대해 체액성 및/또는 세포 유형의 면역 반응을 일으킬 수 있다는 점에서 면역학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게 단백질 단편은 전체 단백질과 실질적으로 동일한 면역학적 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 단편은 적어도 하나의 에피토프 또는 항원 결정부를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다. 본원에서 사용하는 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 전체 길이 서열의 단백질, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. "면역원성 단편"은 1 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기 기술된 면역학적 반응을 유발시키는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당분야에 잘 알려진, 임의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용해 동정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 그 펩티드가 단백질 분자의 일부분에 상응하는 것인 대량의 펩티드를 고상 지지체 상에서 동시에 합성하고, 이 펩티드들을 여전히 지지체에 부착시킨 상태로 항체와 펩티드를 반응시켜 결정된다. 이러한 기술은 당분야에서 알려져 있고 예를 들어, 미국 특허 제4,708,871호; 문헌 [Geysen et al., 1984]; 문헌 [Geysen et al., 1986]을 참조한다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는 예를 들어, X-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명 등과 같은 아미노산의 공간적 입체형태에 의해 쉽게 식별된다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상동]을 참조한다. T. 파르바(T. parva)의 단백질에 특히 적용가능한 방법이 그 전체로 참조로 본원에 편입된 PCT/US2004/022605에 완벽하게 설명되어 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 항원성 폴리펩티드의 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 따라서, "면역원성 또는 항원성 폴리펩티드"는 그 폴리펩티드가 본원에 정의된 바와 같은 면역학적 반응을 생성시키는 기능을 하는 한, 서열의 결실, 부가 및 치환을 더 고려한다. 용어 "보존성 변이"는 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 아미노산 잔기의 치환, 또는 코딩되는 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기이도록 핵산 서열의 뉴클레오티드의 치환을 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 대체로 성질이 보존적이며, 즉 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 치환들이다. 예를 들어, 아미노산은 대체로 다음의 4개 패밀리로 나뉜다: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스틴, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예에는 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌을 다른 소수성 잔기로 치환, 또는 극성 잔기를 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 리신을 아르기닌으로 치환, 아스파르트산을 글루탐산으로 치환, 또는 아스파라긴을 글루타민으로 치환 등, 또는 생물학적 활성에 주요한 효과를 미치지 않는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사 보존성 치환을 포함한다. 따라서, 기준 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 소수의 아미노산 치환을 보유하는 기준 폴리펩티드의 정의에 속한다. 이들 변형에 의해 생성되는 모든 폴리펩티드를 본원에 포함시킨다. 용어 "보존성 변이"는 또한 치환된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 역시 미치환된 폴리펩티드와 면역반응한다면 미치환된 부모 아미노산 대신에 치환된 아미노산의 사용을 포함한다.
용어 "에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 햅텐 상의 부위를 의미한다. 이 용어는 또한 "항원성 결정부" 또는 "항원성 결정 부위"와 상호교환적으로 사용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항원의 결합을 차단하는 한 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역검정법으로 동정할 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응"은 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 전개이다. 일반적으로, "면역학적 반응"은 다음의 효과 중 1 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생산. 바람직하게, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 강화되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되도록 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타내게 된다. 이러한 보호성은 감염된 숙주에 의해 정상적으로 나타나는 증상 및/또는 임상적 질환 징후의 감소 또는 결여, 신속한 회복 시간 및/또는 감염된 숙주에서 저하된 바이러스 역가로 입증된다.
"동물"은 포유동물, 조류 등을 의도한다. 본원에서 사용되는 동물 또는 숙주는 포유동물 및 인간을 포함한다. 동물은 말과 동물(예를 들어, 말), 갯과 동물(예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 재칼), 고양잇과 동물(예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 야생 고양이, 다른 거대 고양이, 및 치타 및 스라소니를 포함한 다른 고양잇과), 양과 동물(예를 들어, 양), 소과 동물(예를 들어, 소, 송아지, 수송아지, 황소), 돼지과 동물(예를 들어, 돼지), 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 오스트리치, 에뮤 및 화식조), 영장류(예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 기번 원숭이, 유인원), 흰담비, 물개, 및 어류로 이루어진 군에서 선택된다. 용어 "동물"은 또한 신생기, 배아기 및 태아기를 포함하여, 모든 발생 단계의 개별 동물을 포함한다.
달리 설명하지 않으면, 본원에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어는 본원이 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어 "한", "하나" 및 "그"는 달리 명확하게 표시하지 않으면 복수 대상물을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 달리 명확하게 언급하지 않으면 "및"을 포함하고자 한다.
본원 및 특히 청구항 및/또는 단락들에서, "포함하다", "포함하는, "포함한" 등의 용어는 미국 특허법에서 그에 부여되는 의미를 가지며, 예를 들어 이들은 "포괄하다", "포괄하는", "포괄하는" 등을 의미하며, "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지다"와 같은 용어는 미국 특허법에서 그들에 부여하는 의미를 가지고, 예를 들어 성분들을 명쾌하게 열거하지 않지만, 발명의 기본 또는 신규 특징에 영향을 주거나 또는 종래에 발견된 성분들은 배제한다.
조성물
본 발명은 동물에서 반응을 유발시키거나, 유도하거나 또는 자극하는, 약독화된 에이치. 솜니 균주 및 약학적 또는 수의학적 허용 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함하는 에이치. 솜니 백신 또는 조성물에 관한 것이다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 하이브리드인 RNA 또는 DNA를 의미한다. 이 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예들이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 개질된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결기 예컨대 플루오로리보스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해, 중합 후 더 개질될 수 있다. 이러한 정의에 포함되는 다른 유형의 개질은 캡, 유사체로 천연 유래 뉴클레오티드 중 1 이상의 치환, 및 단백질에 폴리뉴클레오티드를 부착시키기 위한 수단의 도입, 금속 이온, 표지화 성분, 다른 폴리뉴클레오티드 또는 고상 지지체 등이다. 폴리뉴클레오티드는 화학 합성으로 얻거나 또는 미생물에서 유래될 수 있다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 폴리뉴클레오티드의 임의 절편을 의미하고자 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 게놈 서열의 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA의 코딩 서열 및/또는 그들 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전자는 또한 mRNA 또는 기능성 RNA를 발현하거나, 또는 특별한 단백질을 코딩하고, 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 의미한다.
"단리된" 생물학적 성분(예컨대 핵산 또는 단백질 또는 세포 소기관)은 성분들이 천연적으로 생성되는 유기체의 세포 내 다른 생물학적 성분, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체이외의 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포 소기관으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 성분을 의미한다. "단리된" 핵산 및 단백질은 표준 정제 방법으로 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 재조합 기술뿐만 아니라 화학 합성으로 제조된 핵산 및 단백질도 포괄한다.
용어 "보존성 변이"는 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 아미노산 잔기의 치환, 또는 코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기이도록 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 치환을 의미한다. 이러한 점에서, 특히 바람직한 치환은 상기에 기술된 바와 같이, 대체로 자연적으로 보존성일 것이다.
용어 "재조합체"는 자연계에서 생성되지 않거나 또는 자연계에 발견되지 않는 배열로 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"이종성"은 비교되는 그 독립체의 나머지와 유전적으로 구별되는 독립체에서 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 유전자 조작 기술에 의해 상이한 공급원에서 유래된 플라스미드 또는 벡터 내에 배치될 수 있고, 이것이 이종성 폴리뉴클레오티드이다. 그 천연 코딩 서열에서 제거되어 천연 서열 이외의 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가의 서열, 예컨대 동일한 전사 유닛 내 추가의 코딩 서열, 제어 성분 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 5'UTR, 3'UTR, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위, 동일하거나 또는 다른 프로모터 제어 하의 추가 전사 유닛, 클로닝, 발현, 이종성 재조합, 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 서열, 및 본 발명의 구체예를 제공하는데 바람직한 임의의 그러한 구성체를 포함할 수 있다.
사용 방법 및 제조 물품
본 발명은 다음의 방법 구체예들을 포함한다. 일 구체예에서, 약독화된 에이치. 솜니 균주 및 약학적 또는 수의학적 허용 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물을 백신접종하는 방법을 개시한다. 이러한 구체예의 일 측면에서, 동물은 소이다.
본 발명의 일 구체예에서, 적어도 하나의 공통 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용한 적어도 1회의 1차 투여 및 적어도 1회의 부스터 투여로 구성된, 프라임-부스트(prime-boost) 계획을 적용할 수 있다. 전형적으로, 1차 투여에 사용되는 면역학적 조성물 또는 백신은 부스터로서 사용되는 것과 사실상 다르다. 그러나, 동일한 조성물이 1차 투여 및 부스터 투여에 사용될 수 있음을 주목한다. 이러한 투여 프로토콜을 "프라임-부스트"라고 한다.
프라임-부스트 계획은 적어도 하나의 공통 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체 또는 단편을 사용하는 적어도 1회의 프라임-투여 및 적어도 1회의 부스트 투여를 포함한다. 프라임-투여에 사용되는 백신은 이후의 부스터 백신과는 사실상 상이할 수 있다. 프라임-투여는 1 이상의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게, 부스트 투여는 1 이상의 투여를 포함할 수 있다.
박테리아 항원을 기준으로, 소 또는 소과 동물 조성물의 용량 부피는 대체로 약 0.1 내지 약 2.0 mL, 약 0.1 내지 약 1.0 mL, 및 약 0.5 mL 내지 약 1.0 mL이다.
백신의 효능은 에이치. 솜니의 독성이 있는, 이종 균주로, 동물, 예컨대 소과 동물을 챌린지한 마지막 면역화 후 약 3 내지 5주에 시험할 수 있다. 동물은 비내로, 기도 내 및/또는 경-기도로 (trans-tracheally) 챌린지될 수 있다. 비강, 기도, 폐, 뇌, 및/또는 입으로부터 샘플을 챌린지 전 및 후에 수집하고 에이치. 솜니-특이적 항체의 존재를 분석할 수 있다.
프라임-부스트 프로토콜에 사용되는 본 발명의 약독화된 바이러스 균주를 포함하는 조성물은 약학적 또는 수의학적 허용 비히클, 희석제 또는 부형제에 함유된다. 본 발명의 프로토콜은 에이치. 솜니로부터 동물을 보호하고/하거나 감염된 동물에서 질환 진행을 예방한다.
다양한 투여는 바람직하게 원-샷 용량이지만 복수 용량을 1 내지 6주 떨어져 수행할 수 있다. 바람직한 시간 간격은 2 내지 3주이고, 연간 부스터도 또한 구상된다. 일 구체예에서, 조성물은 약 5주령 내지 약 6주령 송아지에 투여된다. 다른 구체예에서, 송아지는 약 3주령 내지 약 4주령일 수 있다.
본원의 개시는 예로 제공되며 본 발명이 이에 제한되는 것이 아님을 당업자는 이해해야 한다. 본원의 개시 및 당분야의 지식을 통해, 당업자는 임의의 과도한 실험없이, 투여 횟수, 투여 경로, 및 각 주사 프로토콜에 사용되는 용량을 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 약독화된 에이치. 솜니 면역학적 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 유발시키기 위한 유효량을 전달하는 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 동물에서 에이치. 솜니에 대항하여 면역학적 또는 보호적 반응을 유발 또는 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 약독화된 에이치. 솜니 균주를 포함하는 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 유발시키기 위한 유효량을 전달하는 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 동물에서 에이치. 솜니에 대항하여 면역학적 또는 보호적 반응을 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
약학적 또는 수의학적 허용 담체 또는 비히클 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적 또는 수의학적 허용 담체 또는 비히클 또는 부형제는 0.9% NaCl(예를 들어, 염수) 용액 또는 인산염 완충액일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 다른 약학적 또는 수의학적 허용 담체 또는 비히클 또는 부형제는 제한없이, 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 약학적 또는 수의학적 허용 담체 또는 비히클 또는 부형제는 약독화된 박테리아의 투여를 용이하게 하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있다. 용량 및 용량 부피는 본원의 일반적인 설명에서 기술하였고 또한 임의의 과도한 실험없이, 당분야의 지식과 함께 본 개시를 읽고 당업자가 결정할 수 있다.
개시된 결과들을 보조제의 사용없이 얻었지만, 면역학적 조성물 및 백신은 적절한 보조제를 더 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 본 발명의 실시에 사용하기 적합한 보조제는 (1) 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체 중합체, (2) 면역자극 서열(ISS), 예컨대 1 이상의 비메틸화된 CpG 유닛을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열(Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀션, 예컨대 M. Powell, M. Newman이 Plenum Press에서 1995년에 출판한 문헌 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"]의 147 페이지에 설명된 SPT 에멀션, 및 동일 문헌의 183 페이지에 설명된 에멀션 MF59, (4) 4차 암모늄 염을 함유하는 양이온성 지질, 예를 들어 DDA, (5) 사이토카인, (6) 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄, (7) 사포닌, 또는 (8) 본 출원에서 참조로 인용 및 편입시킨 임의 문헌에 설명된 다른 보조제, 또는 (9) 이의 임의의 조합 또는 혼합물이다.
일 구체예에서, 보조제는 점막벽을 통해 개선된 흡수를 촉진하는 것들을 포함한다. 일부 예에는 MPL, LTK63, 독소, PLG 미세입자 및 몇몇 다른 것들(Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627)이 포함된다. 일 구체예에서, 보조제는 키토산일 수 있다(Van der Lubben et al. 2001; Patel et al. 2005; Majithiya et al. 2008; 미국 특허 제5,980.912호).
참조문헌
Figure 112016103382110-pct00001
Figure 112016103382110-pct00002
Figure 112016103382110-pct00003
본 발명을 이하의 비제한적인 실시예들로 더욱 설명한다.
실시예
문헌에 수많은 에이치. 솜니 독성 인자에 대해 보고되어 있다. 단일 독성 인자가 병원체의 역할을 지배하는 것으로 보이지 않지만, 대신 몇몇 인자들이 소정 단리주를 독성으로 만드는데 함께 작용하는 것으로 보인다. 7개의 독성 인자가 동정되었다: DR2(혈청에 대한 내성에 관여하는 IbpA 도메인 내 보존된 세포독성 Fic 모티프를 함유하는 직접 반복부), hsst-I(CMP-Neu5Ac-β-Gal-α-(2-3)-시알릴트랜스퍼라제로서, 여기서는 리포올리고사카라이드(LOS)의 시알릴화가 항체 결합을 억제하는 것으로 확인됨), lob2b(LOS 합성에 관여하는 글리코트랜스퍼라제를 코딩), nan 리아제(N-아세틸뉴라미네이트 리아제이며, 시알산 물질대사에 관여함), nan 에피머라제(N-아세틸만노사민-6-포스페이트-2-에피머라제이며, 탄수화물의 수송 및 물질대사에 관여함), luxS(AI-2 쿼럼 센싱에 관여), 및 uspE(생체막 형성시 응집 및 세포 이동성에 필요한 보편적 스트레스 단백질). 이들 유전자 각각을 증폭하기 위해 프라이머를 디자인하였고 PCR 반응 변수를 최적화하였다.
50개 단리주를 스크리닝을 위해 선별하였다. 단리주 선별을 위한 기준은 그들이 이 실험을 시작하여 대략 1년 내에 단리되어야만하고 다양한 지리적 위치에서 유래되거나 또는 가능한 유전자형 다양성이 높은 특정 관심 사례에서 유래되어야 한다는 것이다. 이의 목적은 현장에서 에이치. 솜니를 의미하는 가장 유행하는 단리주를 찾고 또한 가능한 많은 다양성으로 시도하고 스크리닝하는 것이다. 단리주들은 각각의 관심 독성 인자에 대해 정의된 PCR 반응을 수행하는 것 이외에도, 그들의 성장 및 콜로니 외관을 평가받았다. PCR 반응은 1% 아가로스 겔에서 시각화시켰다. 성장, 콜로니 외관, 및 PCR 결과를 기반으로 단리주 선별 후, 동물 모델을 찾고 관심 단리주를 평가하는데 사용하였다.
실시예 1 - 에이치. 솜니 마우스 챌린지 모델 개발
성장, 지리적 다양성, 및 서열 정보를 기반으로, 21개 단리주가 마우스에서의 평가에 선별되었다(표 1).
표 1. 천연 유래 에이치. 솜니 백신 후보로 평가된 단리주
단리주 # 사례 # 장소 서열번호
TK #1 12-0137-7 그랜드뷰, ID
TK #2 12-0137-8 그랜드뷰, ID
TK #3 12-0137-9 그랜드뷰, ID
TK #4 12-0137-4 그랜드뷰, ID 1
TK #5 12-0137-6 그랜드뷰, ID
TK #14 12-0137-13 그랜드뷰, ID
TK #15 12-0137-11 그랜드뷰, ID
TK #21 11-4134-1 마샬, MN 2
TK #22 11-4601-1 그레이트 벤드, KS
TK #24 11-2909-2 칼리슬, KY
TK #28 11-0125-1 플레인뷰, TX 3
TK #30 11-3169-2 라스 아니마스, CO
TK #33 11-3454-4 페어몬트, MN
TK #34 11-3452-2 페어몬트, MN 5
TK #37 12-0370-1 크레스코, IA
TK #40 11-0012-1 게티스버그, SD
TK #41 11-4378-2 게티스버그, SD
TK #42 11-0141-1 파크스톤, SD 4
TK #44 11-0263-1 메스키트, NV
TK #47 11-4312-1 수 센터, IA
2336 2336 공공 WT (대조군) 6
-80℃에 보관된 단리주를 콜럼비아 + 5% 양 혈액 한천 플레이트(CSBA)(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 상에 스트리킹-플레이팅하였다. 이 플레이트들을 37℃에서 5% CO2 존재 하에 항온배양시켰다. 18시간 성장 후, 플레이트를 2 mL DPBS로 세척하고 최종 용액을 추가의 DPBS로 희석하고 배양물과 FBS(RT로 예열)를 1:1로 혼합하여 5 x 108 내지 1 x 109 CFU/용량의 최종 농도를 얻었다. FBS를 부가한 후, 배양물을 5분간 RT에서 항온반응시켜서 에이치. 솜니 독성 인자를 상향조절시킨 후, 얼음에 놓아두었다.
단리주 당 10마리의, 18-20 g NSA:CF-1 마우스(Harlan Sprague Dawley)의 각각의 군은 그 지정된 단리주로 0.5 cc 복강내(IP) 주사되었다. 10마리 마우스의 대조군은 DPBS + FBS를 주사받았다. 각각의 마우스 케이지의 상층부에 필터-탑을 위치시켰고 케이지 1개는 단리주 당 10마리 마우스에 해당한다. 단리주를 희석하고 플레이팅하였고, 플레이트들을 2일 동안 37℃에서 5% CO2 하에 항온배양시켰다. 플레이트를 계측하고 각 단리주의 실제 CFU/용량을 결정하였다. 부가적으로, 5마리 마우스는 SQ로 단리주 2336 또는 TK #33을 주사받아서, 이 투여 경로가 IP 경로의 대안(독성 평가용)으로 실용적인지 여부를 결정하였다. 챌린지 후, 마우스의 폐사율을 날마다 관찰하였다.
대부분의 단리주는 중간 내지 높은 8 log CFU/용량을 산출하였다. SQ 방법은 마우스를 챌린지하는데 성공적이지 않은 방법인 것으로 확인되었다. 단리주 TK #4, TK #24, TK #14, 대조군, 및 2336은 폐사율이 최소인데 반해, 단리주 TK #1, TK #2, TK #21, TK #28, 및 TK #30은 최고 폐사율이 발생되었다(표 2).
표 2. 18-20 g 마우스를 플레이트-성장된 단리주로 챌린지시 폐사율
단리주 # 경로 CFU/용량 폐사율%
TK #33 SQ 3.7 x 108 0
대조군 IP 0 0
2336 IP 1.7 x 109 0
2336 SQ 1.7 x 109 0
TK #4 IP 7.6 x 108 10
TK #14 IP 8.7 x 108 10
TK #24 IP 5.5 x 108 10
TK #34 IP 7.2 x 108 20
TK #42 IP 5.9 x 108 20
TK #5 IP 6.2 x 108 30
TK #15 IP 7.5 x 108 30
TK #33 IP 3.7 x 108 30
TK #37 IP 7.3 x 108 30
TK #41 IP 9.9 x 108 30
TK #3 IP 8.6 x 108 40
TK #22 IP 8.0 x 108 40
TK #40 IP 9.9 x 108 40
TK #44 IP 9.0 x 108 40
TK #47 IP 7.0 x 108 40
TK #1 IP 8.0 x 108 50
TK #2 IP 8.7 x 108 50
TK #28 IP 7.1 x 108 50
TK #30 IP 4.8 x 108 50
TK #21 IP 5.1 X 108 80
챌린지 모델. 2개 실험을 수행하여 이전 실험에 비해 백신접종-챌린지 연구에서 더 커질 수 있는 마우스에 이상적인 CFU/용량 및 챌린지 배양 조제물을 결정하였다(즉, 백신접종과 챌린지 사이의 3주의 성장을 고려). 제1 실험을 위해, 40마리의, 25-30 g NSA: CF-1 마우스(Harlan Sprague Dawley)를 사용하였다. 에이치. 솜니 단리주 TK #21을 CSBA 상에 스트리킹-플레이팅하였다. 37℃에서 5% CO2 하에 ∼24시간 성장시킨 후, 단리주를 추가의 CSBA 위에 깔고 동일 조건 하에서 18-20시간 동안 성장시켰다. 각각의 플레이트를 2 mL DPBS로 세척하고 액체를 수집하였다. 원래 플레이트 세척물로부터의 희석물을 만들어 CFU/용량이 다양한 2개의 추가 용액을 생성시켰다. 각각의 희석물을 FBS와 1:1로 혼합하여 낮은 8 log 내지 낮은 9 log/용량 범위로 챌린지 유체의 최종 농도를 얻었다. 대조군 유체는 1:1 DPBS 및 FBS로 생성시켰다. 모든 FBS 부가된 배양물을 실온에서 5분간 항온반응시킨 후, 얼음 위에 두었다. 마우스를 0.5 cc IP로 챌린지시키고 챌린지 후 폐사율을 모니터링하였다. 챌린지 배양물을 희석하고 플레이팅하여 최고 폐사율에 필요한 이상적인 CFU/용량을 결정하였다.
챌린지 배양물 TK #21을 플레이트에서 성장시켰고 마우스가 더 커져서(25-30 g), 백신접종 후 3주에 그들 예상 크기를 차지했을 때, 최고 폐사율은 5.7 x 108 CFU/용량에서 달성되었다(표 3).
표 3. 25-30 g 마우스를 플레이트-성장된 단리주로 챌린지시 폐사율
군 단리주 CFU/용량 폐사율%
1 TK #21 1.6 x 109 9.1
2 TK #21 5.7 x 108 27.3
3 TK #21 4.2 x 108 20
4 대조군 0 0
최종 챌린지 실험은 30마리, 25-30 g NSA: CF-1 마우스(Harlan Sprague Dawley)로 수행하여 플레이트(문헌에서 통상적으로 수행하는 바와 같음) 또는 액체배지에서 성장시킨 챌린지 배양물간 차이를 비교하였다. 상기와 유사하게, 단리주TK #21를 냉동 보관물로부터 빼내서 추가 플레이트 상에 깔았다. 액체배지 배양물의 경우, 플레이트를 2 mL 콜럼비아 액체배지로 세척하고 50 ㎕를 25 mL의 예열된 콜럼비아 액체배지에 부가하였다. 배양물을 부가한 후 37℃ 및 250 rpm으로 설정된 진탕 배양기에 위치시킨 후 강하게 진탕시켰다. 성장을 모니터링하였고 모든 유체가 부가된, 최종 챌린지 배양물이 중간-8 log/용량을 함유하는 것으로 추정될 때 배양을 멈추었다. 또한, 챌린지 배양물을 상기와 같이 플레이트 세척물로 준비하였는데, 배양물을 DPBS로 희석하고 액체배지 배양물과 대략 동일한 농도로 하였다. 액체배지 및 플레이트 배양물 둘 모두를 FBS와 1:1로 혼합하고 얼음에 두기 전에 5분간 실온에서 항온반응시켰다. 11마리 마우스/방법을 0.5 cc의 플레이트 세척물 또는 액체배지의 IP로 챌린지하였고 10마리 마우스를 대조군으로 하여 균등량의 콜럼비아 액체배지 및 DPBS의 혼합물을 FBS와 1:1 혼합하여 제공하였다. 마우스를 챌린지 후 폐사율을 모니터링하였고 희석 및 플레이팅을 완료하여 CFU/용량을 결정하였다.
플레이트 상에서 성장시킨 동일한 단리주와 비교하여 액체배지에서 성장된 단리주 #21로 마우스를 챌린지한 경우에 25-30 g 마우스의 보다 높은 폐사율이 발생되었다(표 4). 특히 문헌에서는 독성 챌린지 실험에 사용하기 위해 에이치. 솜니를 액체배지에 키우는 것과는 동떨어져서 당업자에게 설명한다는 것을 고려하면, 이러한 결과는 예상치 못하였다(Berghaus et. al., 2006; Geertsema et. al., 2008; Gershwin et. al., 2005).
표 4. 25-30 g 마우스를 플레이트/액체배지-성장시킨 단리주로 챌린지시 폐사율
성장 방법 단리주 CFU/용량 폐사율%
플레이트 TK #21 5.3 x 108 36.4
액체배지 TK #21 4.8 x 108 54.5
---- 대조군 ---- 0
18-20 g인 130마리 NSA: CF-1 마우스를 Harlan Sprague Dawley에서 구매하였다. 5종의 에이치. 솜니 단리주(TK #42, TK #14, TK #4, TK #24, 및 TK #34)를 백신 후보물로서 이전 연구에서 선별하였다. 이들 단리주를 저장물로부터 빼내서 CSBA 상에 스트리킹하였고 ∼24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온배양시켰다. 단리주들을 새로운 CSBA로 옮기고 플레이트 표면 상에 깔고 ∼18시간 동안 성장되도록 하였다. 플레이트를 2 mL 콜럼비아 액체배지로 세척하였다. 이들 단리주의 성장을 포함한 이전 실험들을 기반으로, 단리주 TK #42 및 TK #34의 경우, 100 ㎕의 플레이트 세척물을 25 mL의 콜럼비아 액체배지에 부가하였고, 단리주 TK #4, TK #14, 및 TK #24의 경우, 50 ㎕의 플레이트 세척물을 25 mL 콜럼비아 액체배지에 부가하였다.
배양물들을 37℃ 및 200 rpm에서 항온배양하였다. 단리주의 성장을 모니터링하고 배양물을 항온배양에서 꺼내어 콜럼비아 액체배지로 대략 1 x 108 CFU/용량을 함유하도록 희석하였고 이의 1:10 희석물로 각 단리주에 대해서, 1 x 107 CFU/용량으로 추정되는 다른 백신을 만들었다. 대조군은 멸균된 콜럼비아 액체배지로 백신접종하였고 다른 대조군은 시판되는 SOMUBAC®(Zoetis, Kalamazoo, MI, 수산화알루미늄이 보조된, 불활성화 히스토필러스 백신)로 백신접종하였다.
각각의 백신은 제조한 후 얼음에 유지시켰고 각각의 군은 6마리 마우스를 포함하는 콜럼비아 대조군을 제외하고, 10마리 마우스를 포함하였다. 백신은 0.5 cc를 SQ 전달하였다. 백신접종 후, 그 백신을 희석하고 플레이팅하여 실제 CFU/용량을 결정하였고 마우스는 부작용 및/또는 폐사를 날마다 모니터링하였다. 각 백신에 포함된 내독소는 리뮐러스 아메보사이트 용해물 키트(Lonza, Allendale, NJ)를 사용해 결정하였다.
백신접종 후 19일에, 마우스를 에이치. 솜니 단리주 TK #21로 챌린지하였다. 150 ㎕의 플레이트 세척물을 사용해 각각 75 mL의 예열된 콜럼비아 액체배지를 함유하는 2개의 플라스크 각각에 접종한 것을 제외하고, 상기와 유사하게 액체배지에서 성장을 위해 야생형을 준비하였다. 플라스크를 37℃ 및 250 rpm에서 항온배양하였다. 배양물을 항온배양에서 꺼내고, 희석하였고 실온에서 FBS와 1:1로 혼합하여 중간-8 log/용량을 함유하게 하였다. 배양물을 실온에서 5분간 FBS와 항온반응시키고, 얼음에 두었다. 챌린지 생성물은 챌린지 전 및 후에 플레이팅하여 CFU/용량이 우리의 추정치와 일치하는지를 확인하였다. 마우스는 0.5 cc의 챌린지 배양물을 IP 투여받았고 폐사를 날마다 모니터링하였다.
SOMUBAC®(Zoetis, 수산화알루미늄이 보조된, 불활성화된 히스토필러스 백신) 및 8 log인 단리주 TK #34 및 TK #22로 백신접종시킨 마우스는 적색 주사 부위 반응이 발현되었다. TK #22를 제외한, 모든 단리주는 대조군과 비교하여, 챌린지 전에 마우스에 일부 보호성을 제공하였다. 단리주 TK #4는 양쪽 백신 용량에서 효과적이었지만, 단리주 TK #34는 8 log에서 최고였고 단리주 TK #24 및 TK #42는 7 log에서 최고였다. 양쪽 용량에서, 단리주 TK #14는 어느 정도 보호성을 제공하였지만 다른 것들보다 낮았다(표 5). 8 log의 단리주 TK #24 및 8 log의 TK #42는 챌린지 전, 백신접종 후에 10마리 중 1마리 마우스가 폐사하였다.
표 5. 저독성 단리주로 백신접종하고 고독성 단리주로 챌린지한 마우스의 폐사율
단리주 백신 CFU/용량 백신 EU/용량* 챌린지 CFU/용량 폐사율%
TK #4 1.8 x 107 ---- 5.1 x 108 10
TK #4 1.8 x 108 31,559 5.1 x 108 20
TK #14 1.8 x 107 ---- 5.1 x 108 40
TK #14 1.8 x 108 30,287 5.1 x 108 40
TK #22 1.3 x 107 ---- 5.1 x 108 60
TK #22 1.3 x 108 54,451 5.1 x 108 80
TK #24 1.3 x 107 ---- 5.1 x 108 10
TK #24 1.3 x 108 38,372 5.1 x 108 33
TK #34 1.6 x 107 ---- 5.1 x 108 40
TK #34 1.6 x 108 28,107 5.1 x 108 0
TK #42 1.3 x 107 ---- 5.1 x 108 10
TK #42 1.3 x 108 33,648 5.1 x 108 33
SOMUBAC® ----- ---- 5.1 x 108 10
대조군 0 2,307 5.1 x 108 67
*EU/용량 = 내독소 단위/용량; EU/용량은 8 log 백신에서만 결정하였다.
실시예 2 - 에이치. 솜니 송아지 챌린지
백신 후보를 시험하기 전에, 송아지 챌린지 모델을 개발해야 했다. 이러한 실험을 위해서, 20마리의 홀슈타인 숫송아지를 사용하였다. 송아지는 단리주 TK #21 또는 153-3(에이치. 솜니로 인한 임상 질환이 확진된 송아지로부터 획득)을 사용해 54일령에 챌린지하였다. 챌린지 배양물은 상기와 유사하게 액체배지로 준비하였다. 챌린지 배양물의 CFU/용량을 추정하기 위해, 이전에 확립한 표준 곡선(y = -5 x 10-8x + 92.017 (x = CFU/mL 및 y = %T (540 nm))을 사용해 ∼2.5 x 108 및 2.5 x 109 CFU/용량으로 각 단리주에 대해 최종 챌린지 농도를 획득하는데 필요한 희석을 결정하였다. 배양물을 EBSS로 희석하고 나서 1:1 비율의 FBS를 부가하고 이후 배양물을 5분간 실온에서 항온반응시켰다. 챌린지 배양물은 챌린지 용량을 추적하기 위해 추가의 EBSS와 함께 얼음에 두었다. 단리주 및 용량 당 각각 4마리 송아지에게, 20 cc의 챌린지물을 경-기도로 투여하고 60 cc의 EBSS로 폐를 추적하였다. 4마리의 동물은 1:1 EBSS 및 FBS를 제공하여, 비챌린지 대조군으로 남겼다. 챌린지 배양물을 희석하고 챌린지 전 및 후에 플레이팅하여 투여된 실제 CUF를 결정하였다. 임상 징후를 다음과 같이 동일한 사람이 날마다 등급매기고 기록하였다.
표 6. 송아지 챌린지 임상 징후 등급 기준
자세
등급 기준
0 정상
1 활기없음
2 다소 활기없음
3 심하게 활기없음
식욕 감퇴
등급 기준
0 정상
1 식욕 낮음
2 식욕 없음
3 식욕 또는 교감 없음 → 인도적 안락사
호흡수
등급 기준
0 정상
1 호흡수 증가
2 호흡 곤란
3 호흡 곤란 및 천명
비루
등급 기준
0 정상
1 소량의 한쪽 비루
2 양쪽에서, 과도한 점질 비루
3 진한 양쪽 비루
기침
등급 기준
0 정상
1 단발성 기침
2 이따금씩 자발적 기침 또는 반복적인 기침
3 반복적인 자발적 기침
서있거나 또는 걷는 능력
등급 기준
0 정상
1 미끼로 일어나고 걷는 욕구있음
2 미끼로 일어나지만 걷는 욕구없음
3 일어나기/걷기 욕구없음 → 인도적 안락사
각 동물의 총 임상 점수는 각각의 카테고리에서 결정된 등급을 합산하여 계산하였다. 동물이 폐사되거나, 안락사 기준을 충족하면, 부검을 수행하고 폐를 적출하였다. 참관한 수의사가 폐를 표면적 병변%에 따라 등급을 매겼고, 조직을 분석하였다. 4일 후, 나머지 동물을 안락사시키고 상기와 같이 부검하였다. 폐 병변을 아크 사인-변환시켰고 등급화하였고, "JMP Fit Y by X" 함수를 사용해 분석하고 평균은 스튜던트 t로 나누었다.
24마리 홀슈타인 수송아지는 백신접종을 위해 각각 5마리 동물을 포함하는 5 우리에 나누어 두고 4마리는 비백신접종 대조군으로 하였다. 또한, 챌린지 모델의 비챌린지 군의 4마리는 살려두고 다음 주에 챌린지되기로 계획된 송아지 백신접종-챌린지 실험에 제공하였다. 이들을 개별 우리에 두었다. 챌린지 모델의 대조군이라고 한, 이들 동물은 같은 우리지만 챌린지된 동물과 같은 우리는 아닌 것이 이들 동물 챌린지시 결과에 영향을 미칠 수 있는지를 확인하기 위한 추가 실험 대조군이었다. 마우스의 백신은 단리주 TK #28, TK #42, TK #4, 및 TK #34를 사용해 제조하였다. 백신 배양물은 추가의 FBS없이 상기 챌린지 배양물과 유사하게 제조하였다. 백신은 5 x 108 CFU/용량을 함유하는 것으로 추정되었고 용량은 각 송아지 콧구멍에 2 cc, 1 cc 투여되었다.
백신을 백신접종 전 및 후에 희석하고 플레이팅하여 실제 CFU/용량을 결정하였다. 동물 건강은 백신접종 후에 모니터링하였다. 코 면봉 및 혈액 샘플을 -17일(도착 후 1일), 0일(백신접종 당일, 소아지 연령 = 35일령), 14일, 21일, 및 33일(챌린지 당일)에 동물에서 수집하였다. 코 면봉은 박테리아 배양을 위해 Newport Laboratories Diagnostic Lab에 제출되었고 혈액 샘플은 가능한 혈청학을 위해 유지시켰다. 챌린지 모델 실험의 4마리 대조군 동물이 추가된 모든 동물들을 추산된 5 x 109 CFU/용량으로 상기와 동일하게 챌린지시켰다. 임상 징후, 부검, 폐 병변, 박테리아 배양, 마이코플라즈마(Mycoplasma) PCR, 및 통계학은 상기와 같이 수행하였고 전체 임상 점수 및 폐 병변도 역시 JMP Fit Y by X로 분석하였다.
챌린지 실험의 경우, 실제 플레이팅된 CFU/용량은 예상하여 추산된 2.5 x 109 또는 2.5 x 108 CFU/용량에 매우 근접하였다. 단리주 TK #21로 챌린지한 동물은 9 log 군은 3.9 x 109 CFU/용량이 제공되고 8 log 군은 2.9 x 108 CFU/용량이 제공되었다. 단리주 153-3으로 챌린지된 동물은 9 log 군은 1.8 x 109 CFU/용량이 제공되고 8 log 군은 1.7 x 108 CFU/용량이 제공되었다.
임의의 다른 챌린지군보다 9 log의 단리주 TK #21로 챌린지된 동물에서 질환의 임상 징후가 더 관찰되었다(표 7). 또한, 임의의 다른 챌린지 군보다 단리주 TK #21로 챌린지된 동물에서 보다 심각한 폐 병변이 관찰되었다(도 1). 폐렴 병변을 갖는 대부분의 송아지는 폐 조직으로부터 에이치. 솜니가 회수되었다. 실험 전반에서, 피. 멀토시다(P. multocida)가 코 면봉 및 폐 조직에서 회수되었지만, 챌린지 후까지 폐렴의 임상 징후가 보이지 않았으므로, 질환 증상의 기여 원인으로 보이지 않았다. 또한, 많은 동물들이 폐 조직에서 엠. 보비스(M. bovis) 양성이거나 또는 그것이 의심되는 것으로 확진되었다. 예상대로, 엠. 보보컬리(M. bovoculi)는 검출되지 않았다.
표 7. 챌린지 모델 실험 동안 등급매긴 임상 징후의 평균 합.
단리주 평균 임상 점수*
153-3 (9 log) 0.75
153-3 (8 log) 0.25
대조군 0.00
TK #21 (9 log) 7.00
TK #21 (8 log) 1.75
*폐사 전 동물에서 매긴 마지막 등급에 의한다.
백신접종에 사용된 박테리아의 실제 농도는 추산된 5 x 108 CFU/용량에 근접하였다. 에이치. 솜니는 오직 생 박테리아로 백신접종 후, 2 내지 3마리 동물에서 백신접종 후 14일, 21일 및 33일의 각 코 면봉 수집일에 회수되었다. 코 면봉은 에이치. 솜니가 더 많이는 아니고 21-33일 동안 비강에서 생존한 채로 남아 있음을 확인시켜주었다(표 8).
표 8. 단리주 TK #28, TK #42, TK #4, 및 TK #34로 비내 백신접종된 송아지에 투여된 박테리아 농도 및 내독소, 및 실험 전반에서 백신접종된 동물에서 회수된 에이치. 솜리 단리주의 수
백신 단리주 투여된 실제 CFU/용량 내독소 단위/mL 코 면봉 회수(회수일))*
TK #28 3.90 x 108 27,800 2 송아지 (d21)
1 송아지 (d33)
TK #42 4.40 x 108 31,700 1 송아지 (d14)
TK #4 7.80 x 108 25,800 1 송아지 (d21)
TK #34 6.20 x 108 42,000 2 송아지 (d14); 1 송아지 (d33)
대조군 0 <10,000 없음
챌린지 시 각각의 송아지에 제공된 단리주 TK #21의 농도는 7.39 x 109 CFU/용량이었다. 챌린지는 백신의 효능을 결정하고 가장 효과적인 백신 후보를 결정하는데 효과적이었다. 임상 징후 및 폐 병변 비율은 단리주 TK #4가 가장 효과적인 백신이고 단리주 TK #34는 최저 효과인 반면, 단리주 TK #28 및 TK #42는 그 중간에 속하는 것으로 확인되었다(표 9; 도 2). 에이치. 솜니는 모두 단리주 TK #4로 백신접종된 3마리 송아지를 제외하고, 실험의 모든 송아지의 폐에서 회수되어, 폐 병변이 있는 동물의 질환 및/또는 폐사 원인이 챌린지 단리주에 기인하는 것임을 시사하였다. 실험 동안, 실험이 진행됨에 따라 점점 더, 일부 송아지의 비강에서 피. 멀토시다가 회수되었다. 챌린지 후, 피. 멀토시다는 28마리 송아지 중 9마리의 폐 조직에서 회수되었고 엠. 보비스는 동물 중 3마리의 폐에서 검출되었다. 백신 접종은 피. 멀토시다 또는 엠. 보비스의 존재 또는 부재와 상관있는 것으로 보이지 않는다. 또한, 챌린지 모델의 대조군은 이 실험의 대조군 모델과 비교시 챌린지에 감수성이지 않았다. 챌린지 모델 대조군을 챌린지 동물과 동일한 우리에 수용하였으므로, 이전 노출로 일부 면역성을 획득했을 수 있다(표 9).
표 9. 비내로 백신접종하고 에이치. 솜니 야생형을 챌린지한 동물의 임상 점수
단리주 평균 임상 점수*
TK #28 5.80 BC
TK #42 6.00 BC
TK #4 1.40 C
TK #34 11.80 A
대조군 10.50 AB
챌린지 모델의 대조군 3.50 C
*는 폐사 전 동물에 매긴 마지막 등급의 평균 임상 점수이다. 다른 글자의 임상 점수는 스튜던트 t 검정에 따라 유의한 차이가 있다.
고찰
마우스 모델의 데이타가 송아지에서 얻은 결과와 충분히 상관성이 있으므로, 본 발명자는 소 백신/챌린지 후보를 선별하는데 신규하고 유용한 도구를 제공하였다. 단리주 TK #21은 그 독성과 결과의 재현성 덕분에 우수한 챌린지 단리주이다. 이상적인 챌린지 용량은 경-기도 투여시 소에서 용량 당 대략 중간 내지 높은 9 log인 것으로 보인다.
비내 백신으로 사용시, 단리주 TK #4는 후속 에이치. 솜니 챌린지에 대항하여 유의하게 보호되었다(5마리 송아지 중 4마리). 임상 징후 및 폐 병변은 비백신접종과 유의하게 차이가 있었다. 단리주 TK #28 및 TK #42는 백신접종된 송아지에서 일부 보호성을 유도하였지만, 효능은 낮았다(5마리 송아지 중 2마리).
실시예 3 - 독성 및 무독성 에이치. 솜니 단리주의 비교 게놈 분석
앞서 기술한 바와 같이, 다양한 에이치. 솜니 단리주는 마우스 및 소에서 독성 수준이 상이하였다. 1종 구체적으로, TK #4는 비내 소 백신 후보로서 유망해 보였다(실시예 2). 또한, TK #21은 문헌에서 사용된 챌린지 단리주 (2336 및 HS91)의 전형적인 표현형을 보유하는, 소 및 마우스에 고도로 독성인 챌린지 단리주로 입증되었다. 이러한 독성에 영향을 주는 인자를 더욱 이해하고 또한 최근에 획득된 단리주가 이전 단리주와 유사한지를 확인하기 위해서, 8종의 에이치. 솜니 단리주를 전체 게놈 서열분석하였다. 4개 유전자, 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질, 지단백질, 3형 다중구리 산화효소, 및 TetR 패밀리 전사 조절인자가 TK #4에는 없었지만, TK #21에는 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근에 단리된 에이치. 솜니는 1985년에 단리된 야생형, 2336에 존재하는 211 내지 316 유전자가 결여되었다. 1991년에 단리된, HS91는 2336과 비교시 오직 15개 유전자만 결여되었다. 이 데이타는 TK #4의 유전형이 그 무독성 표현형의 원인이고, 시간 경과에 따라 에이치. 솜니 개체군 내에 유전적 부동이 존재함을 의미한다. 결과들은 TK #4 약독화의 유전적 설명 및 천연 유전적 부동에 대응하여 효능을 유지하기 위한 현행 백신 및 챌린지 단리주의 필요성을 입증한다.
차등적인 독성의 유전적 및 분자적 근거를 이해하기 위해, 9-방식 비교 게놈 분석을 유전자은행 단리주 2336과 대조하여 TK #4, TK #21, TK #34, TK #28, TK #42, HS91, 2336(적어도 문헌에 따른, 고도의 독성 균주), 129PT(유전자은행의 기지 무독성 균주), 및 153-3(중급 독성 균주) 간에 수행하였다. 이 분석은 또한 가능한 유전적 부동에 관한 우리의 이해를 향상시키고, 독성/무독성 기전에 관여하는 유전자를 설명해 준다.
재료 및 방법
서열분석용 샘플 준비
8종 에이치. 솜니 단리주는 전체 게놈 서열분석이 가치있는 다양한 세트의 단리주로서 동정하였다(표 10). 이들 단리주는 수많은 장소에서 유래되며, 광범위한 독성을 가지며, 다른 년도에 동물에서 단리하였다. 모든 이들 단리주는 콜럼비아 액체배지(BD Ref# 294420; Lot# 0292713, Franklin Lakes, NJ)에서 성장시켰고, 성장 후에 뉴포트 래보래토리즈 연구 및 개발 시설(Worthington, MN)의 -80℃ 냉동고 내 극저온 바이알에서 배양물(Fisher Scientific Cat.# 10-500-26, Waltham, MA)을 냉동시키기 위해 10% 글리세롤을 부가하였다. 단리주를 냉동고에서 꺼내어 콜럼비아 양 혈액 한천 플레이트(CSBA)(BD Ref# 22165/221263; Lot# 2227132 2012 11 13, Franklin Lakes, NJ) 상에 스트리킹-플레이팅하였다. 이 플레이트들을 밤새 37℃에서 5% CO2 존재하에 항온반응시켰다. 24-26시간 후, 플레이트를 항온배양기에서 꺼내고 37℃ 및 5% CO2에서 성장시키기 위해 추가 CSBA에 까는데 사용하였다. 항온배양 16-18시간 후에, 플레이트는 2 mL의 예열된 콜럼비아 액체배지로 세척하고 각 접종량에 하나의 플라스크를 사용하여, 각 배양에 대해 25 mL 콜럼비아 액체배지의 액체배지 배양을 100 ㎕ 또는 150 ㎕를 사용해 시작하였다. 액체배지 배양물을 200 rpm에서 진탕시켰고 투과율(%T)(540 nm)을 배양물이 15-20%T에 도달할 때까지 모니터링하였다. 액체배지 배양물을 항온배양기에서 꺼내어, 15,000 rpm에서 매회 2분간 1.5 mL 배양물을 회전시켜 동일한 미세원심분리 튜브에 3회 펠렛화시키고, 약간 변형시킨 제조사의 권장안에 따라, 박테리아 게놈 DNA 정제 키트(Edge Biosystems, Gaithersburg, MD)를 사용해 게놈 DNA를 단리하였다. DNA는 각 배양물의 3중 회전 펠렛으로부터, 삼중으로 추출하였다. 권장된 DNA 추출 과정의 변형은 DNA를 100 ㎕의 TE에 재현탁시키고 DNA 전단없이 DNA 펠렛 용해를 촉진하기 위해 15분간 37℃에서 항온반응시켰다. 3회 추출물을 모으고 1% 아가로스 겔 상에서 비교하고, 나노드롭에서 정량하고 순도를 확인하였다. 아이다호 대학 거점 시설(Moscow, ID)에서 서열분석을 위해 필요한 총 DNA를 제공하기 위해 DNA 양을 계산하였다.
표 10. 비교 게놈 분석에 사용된 에이치. 솜니 단리주의 목록
단리주 명칭 사례 # 장소 표현형
TK #34 11-3452-2 페어몬트, MN 마우스에서 폐사율 감소했으나, 소 백신으로서 폐렴을 감소시킬 수 없음
HS91 NA 에임스, IA 1991년의 야생형
TK #21 11-4134-1 마샬, MN 챌린지 실험에서 마우스 및 송아지에 고도로 독성
TK #42 11-0141-1 파크스톤, SD 마우스 및 소 백신으로서 마우스에서 독성을 감소시키고 일부 보호성을 공급
2336 NA Dr. Briggs
 독성 에이치. 솜니의 산업 표준; 그러나, 본 발명자는 챌린지 불일치를 발견해 연령 및 계대수에 의문을 가짐
TK #28 11-0125-1 플레인뷰, TX 소에 일부 보호성 공급
TK #4 12-0137-4 그랜드뷰, ID 마우스에서 독성 감소, 챌린지시 마우스 및 소 보호
153-3 NA 워팅턴, MN 최근 획득한 야생형이고 송아지 폐사 원인으로 보임. 송아지 챌린지 적정 실험에서 TK #21만큼 유독하지 않음.
고품질 판독 및 서열 포함범위 필터링
2336 기탁# CP000947와 대조해, NCBI 데이타베이스, 기탁# CP000436의 129PT와 비교를 위해, 현장 단리주에 유사한 접근법이 사용될 필요가 있었다. 따라서, ART 판독 모의 소프트웨어 (http://www.niehs.nih.gov/research/resources/software/biostatistics/art/)를 사용해 129PT로부터 가판독을 생성시켰다. ART는 다음의 명령행으로 실행시켰다: art_illumina -i Hs129PT.fasta -p -l 250 -f 60 -m 500 -s 10 -na -o Hs129PT_sim, 이는 -p=paired에 동일시, -l=250bp, -f=60x 범위, -m=DAN 단편의 평균 크기, -s=10 DNA 단편 크기의 표준 편차. 다음으로, 모든 단리주 판독치는 아이다호 대학에서 개발한 판독치 클리닝 프로그램(웹사이트에서 이용가능)인, SeqyClean를 사용해 Illumina TruSeq 어댑터로 품질을 필터링하였다. 이 프로그램은 Q-값 < 20인 5 또는 그 이상의 염기를 포함하는 서열분석 어댑터 및 저품질 판독치를 제거시켜, 염기 판독 동안 오류를 제거하고 정확성을 증가시켰다.
판독치 맵핑
게놈 DNA 결과는 bowtie2 디폴트 파라미터를 사용해, NCBI 데이타베이스, 기탁 # CP000947의 2336과 대조해 맵핑하였다. MAPQ <10에 대해 커스톰 스트립트를 사용한 여과를 이용해 배가되어 맵핑된 판독치를 제거하였다. 동일한 단리주는 정렬 비율이 > 95%로 예상된다.
유전자 포함범위
Samtools가 2336 기준과 대조해 각 위치의 맵핑 포함범위를 계산하는데 이용되었다. 이는 각 유전자에 대한 포함범위를 갖는 염기의 비율을 계산하는데 사용되었다. 80% 미만의 염기를 함유하는 유전자는 개별 단리주에 대해 부재로 칭하였다. 2336과 대조해 빠진 유전자에 대해 2회의 분석을 수행하였다. 1차는 HS91(2336과 유사한 시대), TK #21, TK #4, 153-3, 및 129PT와 비교하였다. 2차는 TK #34, TK #42, 2336(우리의 2336이 데이타베이스와 일치됨을 확인위함), TK #28, 및 129PT와 비교하였다.
병원성 섬(Pathogenicity Island; PI) 및 통합 및 접합 성분(ICE)
HS91, TK #21, TK #4, 153-3 및 129PT의 전체 게놈 서열분석 결과를 2336과 비교하였다. 병원성 섬(PI) 및 통합 접합 성분(ICE)은 리컴비나제, 인테그라제, 트린스포사제, 헬리카제 및 파지 반복부와 같은 측접하는 서명 서열의 존재를 기반으로 검색하였다. 이들 추정 서명 서열의 클러스터를 함유하는 게놈 영역을 잠재적인 PI 또는 ICE로 찾아내었다.
결과
클리닝된 서열은 모든 단리주에 대해 100x의 근사값 포함범위를 갖는다. 포함범위의 정도는 호출된 염기의 품질에 신뢰를 준다(표 11).
표 11. 각각의 서열분석된 단리주에 대한 미가공 판독치 및 추정된 염기 포함범위의 품질.
라이브러리 PE 판독 서열분석된 염기 추정 미가공 포함범위 클리닝된 PE 판독치 클리닝 후 유지된 염기 추정되는 클리닝된 포함범위
TK #34 454,197 235,274,046 103.93 460,095 210,850,732 93.14
HS91 554,783 287,377,594 126.94 527,851 243,734,387 107.66
TK #21 583,750 302,382,500 133.57 541,644 249,871,771 110.37
TK #42 527,632 273,313,376 120.73 493,941 228,248,524 100.82
2336 848,512 439,529,216 194.15 809,986 378,965,750 167.40
TK #28 544,568 282,086,244 124.60 520,290 241,511,214 106.68
TK #4 606,064 313,941,152 138.68 570,358 261,675,306 115.59
153-3 463,065 239,867,670 105.96 441,209 202,578,292 89.48
정렬은 단리주와 기준 균주 간 차이를 밝혀주었다. 유전자은행 2336 단리주는 Newport Labs에 의해 서열분석된 2336 게놈과 99.67% 동일하여, 게놈간 우리의 맵-기반 비교의 타당성 및 정확성을 시사한다. 2336과 다른 단리주의 유사성 비교로 2번째로 최고 유사성은 HS91이었다. 또한, NCBI 데이타베이스의 공생 129PT(기탁# CP000436)는 기준 비교로서 데이타베이스의 2336과 정렬시켰다(표 12).
표 12. 유전자은행 2336 기탁# CP000947와 정렬시킨 서열분석 데이타의 비율. 단리주는 최고에서 최저 정렬 비율로 열거되었다.
단리주 정렬 비율(%)
HS91 99.71
2336 99.67
153-3 96.11
TK #34 92.11
TK #4 91.30
TK #21 88.35
129PT* 87.92
TK #42 83.84
TK #28 83.33
*기탁 # CP000436.
단리주 중에서, 129PT는 2336 야생형과 비교하여 많은 독성 및 독성-연관 유전자가 결여되었다. 보다 최근에 획득된 단리주는 2336 야생형과 비교시, 이전 단리주보다 더 전체 유전자가 결여되었다(표 13).
표 13. NCBI 데이타베이스의 2336 기탁# CP00947과 비교하여 서열분석된 각 단리주에서 존재 또는 부재로 추정되는 유전자의 수
단리주 존재 유전자 부재 유전자
129PT* 1593 472
TK #34 1749 316
TK #4 1758 307
TK #21 1840 225
TK #42 1848 217
153-3 1851 214
TK #28 1854 211
2336 2048 17
HS91 2050 15
*기탁 # CP000436.
2336에 비해 1차 및 2차 분석에서 부재하는 유전자를 비교한 경우, 공생 129PT는 임의의 다른 비교 단리주보다 병원성 및/또는 독성과 연관된 유전자가 더 결여되었다. 통틀어 129PT는 HS91, TK #21, TK #4, 153-3, 및 129PT에서 수집된 총 47개 결손 유전자 중 44개가 결여되었다(표 14). 또한 TK #34, TK #42, 2336, TK #28, 및 129PT에서 수집된 총 47개 결손 유전자 중 44개가 결여되었다(표 15). 단리주 2336은 NCBI 데이타에 존재하는 오직 하나의 확인된 병원성-연관 유전자만이 결여된 것으로 확인되었다. 이 유전자는 YadA 도메인-함유 단백질(표 15)이다.
백신 후보, TK #4는 분석된 단리주에서 가능한 47개 부재 유전자 중 총 23개가 결여되었다. 이 후보는 헤마글루티닌/헤모라이신의 부착 및 접착 유전자, YadA 도메인-함유 단백질(총 5 반복부 결손), 및 헤마글루티닌 도메인-함유 단백질이 결여되었다. TK#4는 또한 트랜스페린 결합 단백질(철 흡수용) 및 숙주에 저장된 금속을 흡수하는 능력을 제공하는 3형 다중구리 산화효소의 2개 이소폼이 결여되었다. 숙주 군집화를 담당하는 유전자 예컨대 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질(인두 군집화) 및 펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신이 또한 TK #4에서 결손되었다. 또한, TetR 패밀리 전사 조절인자의 2개 이소폼, 아실트랜스퍼라제 3, MarR 패밀리 전사 조절인자의 2개 이소폼, 소형 다중약물 내성 단백질, MarR 패밀리 전사 조절인자, 및 스트레스-감응성 제한 시스템 단백질을 포함한 약물 내성 또는 스트레스인자에 대한 반응을 담당하는 유전자들이 결손되었다. 최근에, TK #4는 숙주 방어를 회피하는 병원체의 능력에 영향을 미치는 일부 유전자 예컨대 리포올리고사카라이드 시알릴트랜스퍼라제, 지단백질, 및 Abi 패밀리 단백질(박테리오신으로부터의 자가-면역에 관여)이 결여되었다(표 14).
2336과 비교하여, 고병원성 TK #21은 또한 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질, 지단백질, 3형 다중구리 산화효소의 한가지 이소폼, 및 TetR 패밀리 전사 조절인자의 한가지 이소폼을 제외하고, TK #4에서 결손된 것으로 확인된 유사한 독성 유전자가 결여되었다(23개 결손 TK #4 유전자 중 19개). TK #4는 갖고 TK #21은 결여된 유일한 유전자는 YadA 도메인-함유 단백질의 한 반복부이다(표 14).
HS91은 2336과 매우 유사하고 출판된 문헌에 따라 균등하게 독성이다. 잠재적으로 병원성에서 역할을 수행할 수 있는 독성 또는 독성-연관 유전자 중 어떠한 것도 HS91에서 결손된 것으로 확인되지 않았다(표 14).
단리주 153-3은 TK#4에서 결손된 것으로 확인된 많은 잠재적인 독성 유전자가 결여(TK #4에서 결손된 23개 중 14개)되었지만, TK #4에는 존재하는 일부 추가의 유전자 결손이 존재하였다(모든 단리주에서 확인된 총 47개 중 23개 결손). TK #4 이외에도, 153-3은 사상 헤마글루티닌 외막 단백질, 어드헤신, YadA 도메인-함유 단백질의 10 반복수(TK #4의 5개와 비교), 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질, 및 아세틸트랜스퍼라제가 결여되었다. TK #4에는 결여되었지만 153-3에는 존재하는 유전자는 스트레스-감응성 제한 시스템 단백질, 헤마글루티닌 도메인-함유 단백질, 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질, 리포올리고사카라이드 시알릴트랜스퍼라제, Abi 패밀리 단백질, 지단백질, 3형 다중구리 산화효소의 한 가지 이소폼, TetR 패밀리 전사 조절인자의 한가지 이소폼, 및 펩티다제 S8/ S53 서브틸리신 케신 세돌리신이다(표 14).
2차 분석의 3종의 최신 단리주는 이전 단리주보다 유전자가 더 결손되었다. TK #34는 최신 단리주의 대부분의 유전자가 결여되었는데, 47개 중 22개였다. 이들 유전자는 사상 헤마글루티닌 외막 단백질, 헤마글루티닌/헤모라이신-유사 단백질, 어드헤신, 스트레스-감응성 제한 시스템, YadA 도메인-함유 단백질의 6 반복부, 트랜스페린 결합 단백질, 헤마글루티닌 도메인-함유 단백질의 2개 이소폼, 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질, TetR 패밀리 전사 조절인자, lob1 단백질, MerR 패밀리 전사 조절인자의 2개 이소폼, 3형 다중구리 산화효소, 소형 다중약물 내성 단백질, MarR 패밀리 전사 조절인자, 및 펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신을 포함한다. TK #34에서 결손된 22개 유전자 중에서, TK #42는 12개가 결여된 것으로 확인되었다. 이들은 헤마글루티닌/헤모라이신-유사 단백질, YadA 도메인-함유 단백질의 5 반복부, TetR 패밀리 전사 조절인자의 한 가지 이소폼, MerR 패밀리 전사 조절인자의 2가지 이소폼, 3형 다중구리 산화효소의 한가지 이소폼, 소형 다중약물 내성 단백질, 및 MarR 패밀리 전사 조절인자를 포함한다. TK #34에 또한 부재하는 12개 유전자 이외에도, TK #42는 YadA 도메인-함유 단백질의 1개 반복부, 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질, 독성 연관 단백질 D(VapD), 아실트랜스퍼라제 3, 지단백질, 3형 다중구리 산화효소의 다른 이소폼, 및 TetR 전사 조절인자의 다른 이소폼이 역시 결여되었다. TK #42에 부재하는 모든 유전자는 예외없이 TK #28에도 부재하였다(표 15).
표 14. 2336(기탁# CP00947)과 비교시, HS91, TK #21, TK #4, 153-3, 및 129PT의 분석 게놈 중 1 이상에서 결손된 독성 관여 유전자
NCBI 유전자 # 결손? 유전자 명칭 유전자 기능
HSM_0052 129PT 외막 단백질 수송 단백질 P1 면역학적으로 중요한 단백질의 수송 및 숙주 회피에 관여하는 포린에 관여할 수 있음
HSM_0077 153-3 & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0164 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_0268 153-3 & 129PT 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 상피 세포, 마크로파지와의 부착을 매개, 기도 군집화에 필요
HSM_0270 TK #21, TK #4, 153-3, & 129PT 헤마글루티닌/헤모라이신-유사 단백질 숙주 세포에 박테리아 부착 및 침투를 담당하는 표면 당단백질
HSM_0274 153-3 & 129PT 어드헤신 세포 부착에 관여
HSM_0338 TK #21, TK #4, 153-3, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0346 153-3 & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0377 TK #21, TK #4, 153-3, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0394 153-3 & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0598 TK #21, TK #4, and 129PT 스트레스-감응성 제한 시스템 단백질 스트레스 하에서 박테리아가 보다 용이하게 외래 DNA, 예컨대 파지 DNA를 획득할 수 있게함(Schferet. al. 1994)
HSM_0695 129PT 알칼리 포스파타제 생체막 형성을 촉진
HSM_0708 TK #21, TK #4, 153-3, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0749 TK #21, TK #4 & 153-3 트랜스페린 결합 단백질 박테리아가 숙주로부터 저장된 철을 획득할 수 있게 함, 독성에 영향을 줄 수 있음
HSM_0844 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0953 TK #21 & TK #4 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질 박테리아 부착에 관여
HSM_0975 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_0977 153-3 & 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_0978 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_1089 129PT 헤모라이신 활성화/분비 단백질-유사 단백질 적혈 세포 용해에 관여
HSM_1090 129PT 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 숙주 또는 다른 세포에 부착을 촉진하는 어드헤신 분비에 관여할 수 있음, 숙주 군집화에 필요
HSM_1160 TK #4 & 129PT 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질 펩티도글리칸 분해 및 인두의 군집화 및 숙주 상피 세포의 침입에서 중요한 역할을 할 수 있음
HSM_1191 TK #21, TK #4, 153-3, & 129PT TetR 패밀리 전사 조절인자 다중약물 유출 펌프, 항생체 생합성 경로, 삼투압 및 독성 화학물에 반응, 이화 경로의 제어, 분화 과정, 및 병원성의 전사 제어에 관여(Ramos et. al. 2005)
HSM_1212 129PT 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질 박테리아 부착에 관여
HSM_1257 TK #21, TK #4, 153-3, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1426 TK #21, TK #4, & 129PT 리포올리고사카라이드 시알릴트랜스퍼라제 리포올리고사카라이드 상의 장식에 영향을 주고 숙주 방어를 회피하는 병원체 능력에 영향을 줌
HSM_1448 129PT 독성-연관 단백질 D (VapD) 영역 독소/항독소 유전자좌, 스트레스 조건 동안 번역에 관여할 수 있음, 번역 정지가 숙주의 생존을 향상시키고 만성 점막 감염을 촉진함(Daines et. al. 2004)
HSM_1484 153-3 & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1542 153-3 & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1571 TK #21 & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1616 TK #21, TK #4, & 129PT Abi 패밀리 단백질 박테리오신에 대한 자가 면역성에 관여(Kjos et. al. 2010)
HSM_1624 TK #21, TK #4, 153-3 & 129PT 아실트랜스퍼라제 3 약물 내성 및 다른 숙주 회피 반응은 아실트랜스퍼라제 존재에 의존적일 수 있음
HSM_1647 129PT FhaB 단백질 숙주-세포 결합 및 감염에서 역할할 수 있음
HSM_1651 129PT 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 숙주 또는 다른 세포와의 부착을 용이하게 하는 어드헤신 분비에 관여할 수 있고, 숙주 군집화에 필요
HSM_1667 129PT Lob1 단백질 숙주 인식을 회피 또는 지연시키기 위한 리포올리고사카라이드 생합성에 관여(Cox et. al. 1998)
HSM_1669 153-3 아세틸트랜스퍼라제 숙주 면역계 회피, 독성, 및 약물 내성에 관여(Aubry et. al. 2011)
HSM_1714 TK #4 & 129PT 지단백질 세포 표면에 발현되고 숙주 회피 및 독성에 관여할 수 있음
HSM_1726 TK #4 & 129PT 3형 다중구리 산화효소 숙주의 감염된 조직, 예컨대 폐 군집화로 인한 저산소 환경에서 철(II) 획득에 관여할 수 있음(Huston et. al. 2002)
HSM_1728 TK #21, TK #4, 153-3, 129PT MerR 패밀리 전사 조절인자 스트레스인자 예컨대 산화 스트레스, 중금속, 또는 항생제에 반응하는 차선 프로모터를 통한 전사 조절인자(Brown et. al. 2003)
HSM_1730 TK #21, TK #4, 153-3, 129PT 3형 다중구리 산화효소 숙주의 감염된 조직, 예컨대 폐 군집화로 인한 저산소 환경에서 철(II) 획득에 관여할 수 있음(Huston et. al. 2002)
HSM_1734 TK #4, 129PT TetR 패밀리 전사 조절인자 다중약물 유출 펌프, 항생제의 생합성 경로, 삼투압 및 독성 화학물에 반응, 이화 경로의 제어, 분화 과정, 및 병원성의 전사 제어에 관여(Ramos et. al. 2005)
HSM_1736 TK #21, TK #4, 153-3 & 129PT 소형 다중약물 내성 단백질 항생제 내성에 관여하는 약물 유출 단백질(Alekshun and Levy, 2007).
HSM_1737 TK #21, TK #4, 153-3 & 129PT MarR 패밀리 전사 조절인자 항생제 내성, 스트레스 반응, 독성 또는 방향족 화합물의 이화작용에 관여하는 유전자의 활성을 조절(Perera and Grove, 2010)
HSM_1741 TK #21, TK #4, 153-3 & 129PT MerR 패밀리 전사 조절인자 스트레스인자 예컨대 산화 스트레스, 중금속, 또는 항생제에 반응하는 차선 프로모터를 통한 전사 조절인자(Brown et. al. 2003)
HSM_1793 TK #21, TK #4, 153-3 & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1794 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요한 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_1889 TK #21, TK #4, & 129PT 펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신 숙주의 초기 군집화를 돕는 히드롤라제, 프로테아제 및 세린 프로테아제로 기능
표 15. 2336(NCBI 데이타베이스의 기탁 # CP00947)과 비교시, TK #34, TK #42, 2336, TK #28, 및 129PT의 분석 게놈의 1 이상에서 결손된 독성 관여 유전자.
2336 NCBI 유전자 # 결손? 유전자 명칭 유전자 기능
HSM_0052 129PT 외막 단백질 수송 단백질 P1 면역학적으로 중요한 단백질의 수송 및 숙주 회피에 관여하는 포린에 관여할 수 있음
HSM_0077 TK #42, TK #28, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0164 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_0268 TK #34 & 129PT 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 상피 세포, 마크로파지에 부착을 매개, 기도 군집화에 필요
HSM_0270 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT 헤마글루티닌/헤모라이신-유사 단백질 숙주 세포에 박테리아 부착 및 침투를 담당하는 표면 당단백질
HSM_0274 TK #34 & 129PT 어드헤신 세포 부착에 관여
HSM_0338 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0346 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0377 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0394 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0598 TK #34 & 129PT 스트레스-감응성 제한 시스템 단백질 스트레스 하에서 박테리아가 보다 쉽게 외래 DNA, 예컨대 파지 DNA를 획득할 수 있게 함(Schfer et. al. 1994)
HSM_0695 129PT
알칼리 포스파타제		 생체막 형성을 촉진
HSM_0708 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0749 TK #34 트랜스페린 결합 단백질 박테리아가 숙주로부터 저장된 철을 획득할 수 있게 함, 독성에 영향을 줄 수 있음
HSM_0844 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_0938 TK #34
헤마글루티딘 도메인-함유 단백질
 박테리아 부착에 관여
HSM_0975 TK #42, TK #28, & 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_0977 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질
 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_0978 129PT 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질 억셉터에 당 모이어티 전달에 관여, 중요 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_1022 TK #34 YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1089 129PT
헤모라이신 활성화/분비 단백질-유사 단백질
 적혈 세포 용해에 관여
HSM_1090 129PT 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 상피 세포, 마크로파지에 부착을 매개, 기도 군집화에 필요
HSM_1160 TK #34 & 129PT 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질 펩티도글리칸 분해 및 또한 인두의 군집화 및 숙주 상피 세포의 침입에서 중요한 역할을 할 수 있음
HSM_1191 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT
TetR 패밀리 전사 조절인자
 다중약물 유출 펌프, 항생제 생합성 경로, 삼투압 스트레스 및 독성 화학물에 반응, 이화경로의 제어, 분화 과정, 및 병원성의 전사 조절에 관여(Ramos et. al. 2005)
HSM_1212 TK #34 & 129PT
헤마글루티딘 도메인-함유 단백질
 박테리아 부착에 관여
HSM_1257 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1426 129PT 리포올리고사카라이드 시알릴트랜스퍼라제 리포올리고사카라이드의 장식에 영향을 주고 숙주 방어를 회피하는 병원체 능력에 영향을 줌
HSM_1448 TK #42, TK #28, & 129PT 독성-연관 단백질 D (VapD) 영역 독소/항독소 유전자좌, 스트레스 상태 동안 번역에 관여할 수 있고, 번역 중지는 숙주 생존을 향상시키고 만성 점막 감염을 촉진(Daines et. al. 2004)
HSM_1484 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1542 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1571 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1616 129PT Abi 패밀리 단백질 박테리오신에 대한 자가 면역성에 관여(Kjos et. al. 2010)
HSM_1624 TK #42, TK #28, & 129PT 아실트랜스퍼라제 3 약물 내성 및 다른 숙주 회피 반응은 아실트랜스퍼라제의 존재에 의존적일 수 있음
HSM_1647 129PT FhaB 단백질 숙주-세포 결합 및 감염에서 역할을 할 수 있음
HSM_1651 129PT 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 숙주 또는 다른 세포에 부착을 촉진하는 어드헤신의 분비에 관여할 수 있고, 숙주 군집화에 필요
HSM_1667 TK #34 & 129PT Lob1 단백질 숙주 인식을 회피 또는 지연시키기 위한 리포올리고사카라이드 생합성에 관여(Cox et. al. 1998)
HSM_1714 TK #42, TK #28, & 129PT 지단백질 세포 표면에서 발현되고 숙주 회피 및 독성에 관여할 수 있음
HSM_1726 TK #42, TK #28, & 129PT 3형 다중구리 산화효소 숙주의 감염된 조직, 예컨대 폐 군집화로 인한 저산소 환경에서 철(II) 획득에 관여할 수 있음(Huston et. al. 2002)
HSM_1728 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT MerR 패밀리 전사 조절인자 스트레스인자 예컨대 산화 스트레스, 중금속, 또는 항생제에 반응하는 차선 프로모터를 통한 전사 조절인자(Brown et. al. 2003)
HSM_1730 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT 3형 다중구리 산화효소 숙주의 감염된 조직, 예컨대 폐 군집화로 인한 저산소 환경에서 철(II) 획득에 관여할 수 있음(Huston et. al. 2002)
HSM_1734 TK #42, TK #28, & 129PT TetR 패밀리 전사 조절인자 다중약물 유출 펌프, 항생제 생합성 경로, 삼투압 스트레스 및 독성 화학물에 반응, 이화 경로의 제어, 분화 과정 및 병원성의 전사 제어에 관여(Ramos et. al. 2005)
HSM_1736 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT 소형 다중약물 내성 단백질 항생제 내성에 관여하는 약물 유출 단백질(Alekshun and Levy, 2007)
HSM_1737 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT MarR 패밀리 전사 조절인자 항생제 내성, 스트레스 반응, 독성 또는 방향족 화합물의 이화작용에 관여하는 유전자의 활성을 조절(Perera and Grove, 2010)
HSM_1741 TK #34, TK #42, TK #28, & 129PT MerR 패밀리 전사 조절인자 스트레스인자 예컨대 산화 스트레스, 중금속, 또는 항생제에 반응하는 차선 프로모터를 통한 전사 조절인자(Brown et. al. 2003)
HSM_1793 TK #34, TK #42, 2336, TK #28, &129PT YadA 도메인-함유 단백질 콜라겐 결합 외막 단백질에 의한 세포 부착을 통해 숙주 세포에서 병원성 및 독성을 촉진
HSM_1794 129PT
글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질
 억셉터에 당 모이어티를 전달하는데 관여, 중요한 독성 인자 예컨대 리포올리고사카라이드 생성을 담당(Kahler et. al. 1996)
HSM_1889 TK #34 & 129PT
펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신		 숙주의 초기 군집화를 돕는 히드롤라제, 프로테아제, 및 세린 프로테아제로 기능
7개의 추정 PI 또는 ICE가 전체 게놈 편집으로 확인되었다.
제1의 하나는 HSM_R0009 내지 대략 HSM_0254(∼28kb) 사이에 위치하지만, 주목할만한 독성, 독성-연관, 또는 약물 내성 유전자가 이 위치에 존재하는 것으로 보이지 않는다. HS91 및 2336은 존재하는 모든 유전자를 함유하지만, TK #21, TK #4, 153-3, 129PT, 및 TK #34는 이 PI 또는 ICE에 위치하는 대부분의 유전자가 결여된 것으로 보인다. TK #42 및 TK #28은 이 처음 PI 또는 ICE의 일부를 갖는다.
제2 위치는 HSM_0319 내지 HSM_0348 사이(∼41kb)였고, 이 위치에는 YadA 도메인-함유 단백질의 2개 반복부가 존재하였는데, TK #21, TK #4, 153-3, 및 129PT에는 하나가 결여되어 있고, 다른 하나는 153-3 및 129PT에 결손되어 있다.
제3 PI는 HSM_0638 내지 HSM_0692 사이(∼45kb)에 위치하였다. 단리주 153-3, 129PT, 및 TK #34는 이 잠재적인 PI 또는 ICE의 많은 유전자가 결여되었지만, 추정되는 독성, 독성-연관, 또는 약물 내성 유전자는 확인되지 않았는데, PI의 많은 유전자가 오직 가설 단백질로 확인되었기 때문이다.
제4 PI 위치는 HSM_0847 내지 HSM_0923 사이(∼73kb)였다. 역시 이 범위 내에는 어떠한 독성 인자도 확인되지 않았지만, TK #21, TK #4, 153-3, 129PT, 및 TK #34는 이 영역에 존재하는 대부분의 유전자가 결여되었다.
제5 PI 위치는 HSM_1115 내지 HSM_1167 사이(∼51kb)였다. TK #4는 HSM_1129 내지 HSM_1146 및 HSM_1149 내지 HSM_1167이 결여되어 있으며, 이 부재 영역은 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질을 포함한다. 단리주 129PT는 HSM_1131 내지 HSM_1167이 결여되었고, TK #34는 HSM_1129 내지 HSM_1144 및 HSM_1149 내지 HSM_1167이 결여되어 있지만, 다른 단리주들은 이들 유전자 대부분이 존재한다. 또한, 박테리아 감각을 돕는데 관여하고 광범위하게 다양한 환경에 반응할 수 있는 2-성분 반응 조절인자가 HSM_1124에 존재한다. 모든 서열분석된 단리주들은 이 2-성분 반응 조절인자를 함유한다.
제6의 추정 PI 또는 ICE는 HSM_1615 내지 HSM_1719(∼101kb)이다. 이 영역에는, Abi 패밀리 단백질, 아실트랜스퍼라제 3, FhaB 단백질, 사상 헤마글루티닌 외막 단백질, Lob1 단백질, 아세틸트랜스퍼라제, 및 지단백질이 존재한다. TK #21, TK #4, 153-3, 129PT, TK #28, TK #42, 및 TK #34는 잠재적으로 그들의 상이한 독성 수준에 기여하는, 이들 중 일부가 결여되어 있다(표 14 & 15).
마지막으로 가능한 PI 또는 ICE는 HSM_1860 내지 HSM_R0065(∼38kb)에 위치한다. 이 영역에서 TK #21, TK #4, 129PT, 및 TK #34에서 결손된 핵심 유전자 하나는 초기 숙주 군집화에 중요한, 펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신이다. TK #21, TK #4, 129PT, TK #34, TK #42, 및 TK #28에 결손된 다른 유전자들이 존재하고, 이들 대부분은 가설 단백질 또는 트랜스포사제로 확인되었다. HS91, 153-3, TK #42, 2336, 및 TK #28은 이 전체 영역의 대부분 또는 전부가 온전한 것으로 나타났다.
고찰
TK #4는 충분하게 약독화된 것으로 보이는 한편, 여전히 적절한 면역 반응을 유발시킬 수 있어서, 이 균주는 강력한 백신 후보가 된다. TK #4는 대략 동일한 해에 획득된 다른 단리주와 유사한 일부 유전자가 결여되어 있지만, 부재 유전자 중 일부는 TK #4에 고유하며, 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질(GHFP), 지단백질(LP), 3형 다중구리 산화효소, 및 TetR 패밀리 전사 조절인자를 포함한다. TK #4 및 병원성 단리주 둘 모두에서 결손된, 몇몇 유전자는 약독화된 표현형에 기여하지만, 이들 유전자는 무독성에 필수적인 것으로 보이지 않는다.
다른 한편, TK #4에 고유하게 부재하지만, 병원성 균주에는 존재하는 2개 유전자, 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질 및 지단백질은 TK #4의 약독화된 표현형에 필수적이고 충분한 것으로 보인다.
TK #4에서 이들 2개 유전자 발현의 부재와 약독화된 독성 사이에 인과 관계는 GHFP 및 LP 단백질이 군집화 및 숙주 방어의 회피에서 중요한 역할을 수행한다고 제안한, 이전에 공개된 연구로 뒷받침된다(Asgarali et. al. 2009; Garbe and Collin, 2010; Liu et. al. 2008; and Guzman-Brambila et. al. 2012). 게다가, 데이타는 TK #4가 129PT만큼 약독화되지 않았지만, 이 균주는 소와 마우스 둘 모두에 대해 보호성(후속 독성 공격으로부터)을 제공한다.
TK #34는 또한 TK #4와 유사하게 고도로 약독화되었지만, TK #4는 숙주 회피에 관여하는 많은 수의 유전자가 결손되었다. TK #4 및 TK #34는 둘 모두가 개별적으로 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질 및 YadA 도메인-함유 단백질의 다양한 이소폼 또는 반복부가 결여되었다. TK #34는 TK #4는 갖고 있는, 사상 헤마글루티닌 외막 단백질, 어드헤션, 및 lob1 단백질이 결여되었다. TK #4는 TK #34에는 존재하는 리포올리고사카라이드 시알릴트랜스퍼라제, Abi 패밀리 단백질, 아실트랜스퍼라제 3, 지단백질, 다중구리 3, 및 TetR 전사 조절인자가 결여되어 있다. 이 결과들은 결손된 독성 인자의 조합이 마우스 및 소에서 보호적인 부분 약독화된 박테리아(TK #4) 또는 마우스 및 소에 대해 고도로 약독화되었지만 비보호적 단리주(TK #34)에 기여함을 시사한다. 이 데이타는 여기서 단독으로 당업자가 충분하게 약독화되었지만, 충분히 보호적인 에이치. 솜니 백신 균주를 얻기위해 어떠한 유전자를 결실시켜야 하는지를 앞서 예측할 수 없음을 의미한다.
마지막으로, 수평적 유전자 전달이 일부 내성 유전자를 이 단리주에게 전달하지 않은 것으로 보이며, 다른 독성 인자의 결여는 질환을 야기시킬 수 없도록 충분히 단리주를 약독화시킨 것으로 보인다. 한편, 공생 균주보다 더 많은 독성 인자의 존재는 TK #4를 강력한 백신 후보로 만든다(즉, 이 균주는 숙주 체액성 면역 반응을 자극하고 장기간 보호성을 제공하기에 충분히 길게 생존할 수 있다).
TK #21은 마우스 및 소에서 고도의 독성 단리주인 것으로 확인되었다. 그러나, 유전적으로, 현행 단리주, TK #4 및 153-3(TK #21에 비해 독성이 덜함)과 보다 유사한 반면, 동시에 다른 기지의 독성 균주, 2336 및 HS91로부터 더 분기된다. TK #21은 TK #4에 결여된 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질, 지단백질, 3형 다중구리 산화효소의 한가지 이소폼, 및 TetR 패밀리 전사 조절인자의 한가지 이소폼을 보유한다. 이들 4개 유전자는 모두 TK #4의 약독화에 기여할 수 있다. TK #21에서 상이한 이소폼으로서 결손이 확인되지 않은 가장 고유한 유전자 결손은 글리코시드 히드롤라제 및 지단백질이다. 조합된 이들 유전자는 챌린지 단리주(그 유전자들을 가짐) 및 백신 후보(그 유전자들이 결여) 간에 충분한 차이를 야기하는데 필수적인 것으로 보인다. TK #21은 TK #4는 갖는 Yad A 도메인-함유 단백질이 결여되었지만, 독성 결여에 기여하는 것으로 보이지 않는다. TK #21와 연관된 독성은 2336으로부터의 그 분기에 의한 것이 아니라, 대신 TK #4와의 미세한 차이에 의한 것으로 보인다.
TK #21, TK #4, 153-3, TK #34, TK #42, 및 TK #28의 보다 최근 단리주는 유사한 것으로 보이지만, 이들은 2336 및 HS91과 눈에 띄게 다르다(표 15 참조). 이 데이타는 에이치. 솜니 개체군이 시간에 따라 진화하고 2336의 대체로 허용되는 챌린지 단리주는 송아지들이 최근에 직면하는 에이치. 솜니 유전자 풀과 더 이상 관련되지 않음을 시사한다. 이는 또한 백신 후보로서 TK #4를 뒷받침하는 증거를 제공하는데, 그 유전적 조성이 송아지의 소 호흡기 복합 질환에서 최근에 순환하는 균주와 매우 관련있기 때문이다. 정렬 비율은 HS91 및 2336이 매우 밀접하게 관련되며, TK #21, TK #4, 153-3, TK #34, TK #42, 및 TK #28이 밀접하게 관련됨을 뒷받침한다. 또한 현행 단리주는 1980-1990년대에 단리된 것들과 유전적으로 상이한 것으로 확인되었다. 또한, 유전자 부재를 조사시, 보다 최근의 단리주가 HS91보다 더 많은 수의 2336 유전자를 결여하고 있으며, 현행 단리주가 또한 유사한 유전자를 결여한 경향이 있다. 이는 게놈이 에이치. 솜니에서 자연적으로 부동됨을 암시한다. 또한, 현행 단리주는 미국 내 다른 주들을 대표하므로, 여기서 보이는 유전적 부동이 미국 내 현행 에이치. 솜니 개체군을 대표함을 암시한다.
종합적으로, 이러한 데이타는 다수 유전자의 조합이 단리주를 효과적인 백신 또는 챌린지 후보로 만드는데 필요하고, 오직 소수 유전자의 손실이 그 생명을 가져가는 것에 비해 동물을 구하도록 충분히 후보물을 약독화시킬 수 있음을 시사한다. 이러한 데이타는 또한 에이치. 솜니 개체군이 시간에 따라 부동하고 산업은 관련 백신을 유지시키기 위해 발달될 필요가 있음을 시사한다. 이 데이타는 상업적 백신 효능의 주기적 재평가를 비롯하여, 자생 백신의 중요성을 강력하게 뒷받침한다.
표 16. "SAMTools mpileup"로 분석된 각 단리주에 대해 동정된 변이체(2336, 기탁# CP00947에 관함)
샘플 총 변이체 필터링한 변이체
129PT 22,040 21,733
TK #34 23,386 23,179
HS91 132 12
HS91 ΔaroC 1,481 1,343
TK #21 25,840 25,157
TK #42 21,833 21,677
2336 (출원인의 단리주) 134 15
TK #28 21,803 21,590
TK #4 25,868 25,176
153-3 21,260 20,750
HS91 ΔnanPU 1,468 1,330
동정된 많은 SNP(표 16)이외에도, 많은 결손 유전자들이 존재한다(표 17-23). 보다 최근의 단리주(TK #21, TK #4, 153-3, TK #34, TK #42, 및 TK #28) 및 129PT가 대부분의 SNP를 가진데 반해, HS91 야생형, HS91 돌연변이체, 및 2336은 모든 독성-연관 유전자에 대한 SNP를 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않았다. LOS 생합성 또는 개질 유전자의 경우, 최고 비율의 SNP가 두 분석에서 글리코실 트랜스퍼라제 및 아세틸트랜스퍼라제 유전자에 존재하였고, 2군 분석에서는 lob2b에 존재하였다. 단리주 129PT는 대부분의 LOS 생합성 또는 개질 유전자가 결여되었다. 부착, 군집화, 및 생체막 형성 유전자의 경우, 대부분의 SNP는 YadA 도메인-함유 단백질 및 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질에 존재하였다. 많은 부착, 군집화, 및 생체막 형성 유전자는 최근 단리주에서 결손되었다. 1군의 글리코시드 히드롤라제 및 양쪽 군에서 TonB-의존적 수용기의 일부가 숙주 침입 또는 금속 흡수에 대한 대부분의 SNP를 가졌다. 많은 스트레스-반응, 항생제 내성 유전자, 및 약물 유출 유전자가 보다 새로운 단리주 대부분에서 결손되었다. 존재하는 것들 중에서, SPN의 비율은 1군의 TerR 패밀리 전사 조절인자를 제외하고 상당히 낮았다.
LOS 생합성 또는 개질에 관여하는 유전자의 경우, 129PT를 제외하고 모든 단리주는 OMP 수송 단백질 P1에 1개 삽입-결실 (indel) 을 가졌다. TK #21 및 TK #34는 각각 lob2b.에 대해 1 및 2개 삽입-결실을 가졌다. 모든 최근 단리주는 pgmB에 대해 1개 삽입-결실을 가졌지만, 보다 오래된 단리주 HS91 및 2336은 그렇지 않았다. TK #42 및 TK #28은 글리코실 트랜스퍼라제 패밀리 단백질에 1개 삽입-결실을 가졌고, 이들은 lob2a에 1개 삽입-결실을 가졌다. 단리주 129PT는 neuA HS 에 삽입-결실을 가졌다.
부착, 군집화, 및 생체막 형성에 관여하는 독성-연관 유전자의 비-동의 삽입-결실에 관한 1군 분석에서, TK #21 및 TK #4는 최대의 삽입-결실을 가졌다. 이들은 YadA 도메인-함유 단백질(TK #21는 총 26개 삽입-결실 및 TK #4는 총 32개 삽입-결실), 사상 헤마글루티닌 외막 단백질(TK #21은 총 6개 삽입-결실 및 TK #4는 총 5개 삽입-결실)에서 일어났고, TK #21은 어드헤신에 1개 삽입-결실이 일어났다. 단리주 153-3도 역시 1군의 일부 삽입-결실을 가졌지만, 129PT와 어느 정도 유사하게, 분석된 유전자의 대부분이 결실되었다. 비동의 삽입-결실이 존재하는 유전자는 YadA 도메인 함유 단백질(총 6개 삽입-결실), 사상 헤마글루티닌 외막 단백질(3개 삽입-결실), 및 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질(1개 삽입-결실; 표 19)이었다. 부착, 군집화 및 생체막 형성의 2군 분석의 경우, 단리주 TK #34, TK #42, 및 TK #28은 최대 삽입-결실을 가졌다. 삽입-결실은 YadA 도메인-함유 단백질(TK #34는 총 24개 삽입-결실, TK #42는 총 31개 삽입-결실, 및 TK #28은 총 31개 삽입-결실), 사상 헤마글루티닌 외막 단백질(TK #34는 총 2개 삽입-결실, TK #42는 총 4개 삽입-결실, 및 TK #28은 총 4개 삽입-결실)에 있었고 TK #34는 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질에 1개 삽입-결실이 있었다. 또한, 129PT는 YadA 도메인-함유 단백질에 7개 삽입-결실을 가지고 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질에 1개 삽입-결실을 가졌지만, 분석된 많은 유전자가 결실되었다. 마지막으로, HS91 ΔaroC 및 HS91 ΔnanPU은 사상 헤마글루티닌 외막 단백질에 각각 3개 및 2개의 총 삽입-결실을 가졌고, YadA 도메인-함유 단백질에 각각 1개를 가졌다(표 20).
표 17. 리포올리고사카라이드(LOS) 생합성 또는 개질에 관여하는 독성-연관 유전자의 1군 분석에 따른 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전체 번호 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실 #
HS91 TK #21 TK #4 153-3 129PT
HSM_0052 234 1 1 1 1 *
HSM_0164
 1569 0 0 0 0 *
HSM_0204
 1383 0 0 0 0 0
HSM_0397 930 0 0 0 0 0
HSM_0572
 555 0 0 0 0 0
HSM_0840 588 0 0 0 0 0
HSM_0925 1431 0 0 0 0 0
HSM_0938 1167 0 0 0 0 0
HSM_0975 696 0 0 0 0 *
HSM_0977 834 0 1 0 *
*		 *
HSM_0978 816 0 0 0 0 *
HSM_1062 1365 0 0 0 0 0
HSM_1063 888 0 0 0 0 0
HSM_1117 672 0 0 0 0 1
HSM_1118 1020 0 0 0 0 0
HSM_1256 1017 0 0 0 0 0
HSM_1426 903 0 * * 0 *
HSM_1667 129 0 0 0 0 *
HSM_1669 876 0 0 0 * 0
HSM_1714 630 0 0 * 0 *
HSM_1794 936 0 0 0 0 *
HSM_1832 1656 0 1 1 1 1
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손된 것으로 확인된 경우를 의미한다.
표 18. 리포올리고사카라이드(LOS) 생합성 또는 개질에 관여하는 독성-연관 유전자의 2군 분석에 따른 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전자 번호 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실의 #
TK HS91 TK 2336 TK HS91 129PT
HSM_0052 234 1 1 1 1 1 1 *
HSM_0164
 1569 0 0 1 0 1 0 *
HSM_0204
 1383 0 0 0 0 0 0 0
HSM_0397 930 0 0 0 0 0 0 0
HSM_0572
 555 0 0 0 0 0 0 0
HSM_0840 588 0 0 0 0 0 0 0
HSM_0925 1431 0 0 0 0 0 0 0
HSM_0938 1167 * 0 0 0 0 0 0
HSM_0975 696 0 0 * 0 * 0 *
HSM_0977 834 2 0 0 0 0 0 *
HSM_0978 816 0 0 1 0 1 0 *
HSM_1062 1365 0 0 0 0 0 0 0
HSM_1063 888 0 0 0 0 0 0 0
HSM_1117 672 0 0 0 0 0 0 1
HSM_1118 1020 0 0 0 0 0 0 0
HSM_1256 1017 0 0 0 0 0 0 0
HSM_1426 903 0 0 0 0 0 0 *
HSM_1667 129 * 0 0 0 0 0 *
HSM_1669 876 0 0 0 0 0 0 0
HSM_1714 630 0 * * 0 * * *
HSM_1794 936 0 0 0 0 0 0 *
HSM_1832 1656 1 0 1 0 1 0 1
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손된 것으로 확인된 경우를 의미한다.
표 19 (5). 부착, 군집화, 또는 생체막 형성에 관여하는 독성-연관 유전자의 1군 분석에 따른 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전자 번호 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실의 #
HS91 TK #21 TK #4 153-3 129PT
HSM_0077 12192 0 3 2 * *
HSM_0268 7119 0 1 1 * *
HSM_0270 3480 0 * * * *
HSM_0274 1569 0 1 0 * *
HSM_0338 7260 0 * * * *
HSM_0346 4653 0 3 3 * *
HSM_0377 9948 0 * * * *
HSM_0394 9870 0 1 1 * *
HSM_0695 924 0 0 0 0 *
HSM_0708 11025 0 * * * *
HSM_0844 9417 0 6 6 1 *
HSM_0953 1227 0 * * 1 1
HSM_1022 11250 0 4 4 1 6
HSM_1090 5268 0 3 3 3 *
HSM_1212 1170 0 0 0 0 *
HSM_1257 13971 0 * * * *
HSM_1484 6540 0 3 4 * *
HSM_1542 7158 0 6 8 * *
HSM_1571 11772 0 * 4 4 *
HSM_1647 2124 0 0 0 0 *
HSM_1651 8235 0 2 1 0 *
HSM_1793 8277 0 * * * *
HSM_1889 2193 0 * * 0 *
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손된 것으로 확인된 경우를 의미한다.
표 20 (6). 부착, 군집화, 또는 생체막 형성에 관여하는 독성-연관 유전자의 2군 분석에 따른 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전자 번호 유전자명 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실의 #
TK HS91 TK 2336 TK HS91 129PT
HSM_0077 YadA 도메인-함유 단백질 12192 4 0 * 0 * 0 *
HSM_0268 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 7119 * 0 1 0 1 0 *
HSM_0270 헤마글루티닌/헤모라이신-유사 단백질 3480 * 0 * 0 * 0 *
HSM_0274 어드헤신 1569 * 0 0 0 0 0 *
HSM_0338 YadA 도메인-함유 단백질 7260 3 0 5 0 5 0 *
HSM_0346 YadA 도메인-함유 단백질 4653 7 0 5 0 5 0 *
HSM_0377 YadA 도메인-함유 단백질 9948 5 * 8 0 8 * *
HSM_0394 YadA 도메인-함유 단백질 9870 0 1 0 0 0 1 *
HSM_0695 알칼리 포스파타제 924 0 0 0 0 0 0 *
HSM_0708 YadA 도메인-함유 단백질 11025 * 0 * 0 * 0 *
HSM_0844 YadA 도메인-함유 단백질 9417 1 0 5 0 5 0 *
HSM_0953 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질 1227 1 0 0 0 0 0 1
HSM_1022 YadA 도메인-함유 단백질 11250 * 0 7 0 7 0 7
HSM_1090 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 5268 2 3 3 0 3 2 *
HSM_1212 헤마글루티딘 도메인-함유 단백질 1170 * 0 1 0 1 0 *
HSM_1257 YadA 도메인-함유 단백질 13971 * 0 * 0 * 0 *
HSM_1484 YadA 도메인-함유 단백질 6540 4 0 1 0 1 0 *
HSM_1542 YadA 도메인-함유 단백질 7158 * 0 * 0 * 0 *
HSM_1571 YadA 도메인-함유 단백질 11772 * 0 * 0 * 0 *
HSM_1647 FhaB 단백질 2124 0 0 0 0 0 0 *
HSM_1651 사상 헤마글루티닌 외막 단백질 8235 0 0 0 0 0 0 *
HSM_1793 YadA 도메인-함유 단백질 8277 * * * * * 0 *
HSM_1889 펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신 2193 * * 0 0 0 * *
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손된 것으로 확인된 경우를 의미한다.
표 21. 숙주 침입 또는 금속 흡수에 관여하는 독성-연관 유전자의 1군 분석에 따라 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전자 명칭 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실의 #
HS91 TK #21 TK #4 153-3 129PT
HSM_0047 2754 0 0 2 0 1
HSM_0749 1989 1 * * * 1
HSM_0750 2916 0 2 2 2 4
HSM_0931 1779 0 0 0 1 0
HSM_1089 1353 0 0 0 0 *
HSM_1160 537 0 0 * 0 *
HSM_1168 3111 0 0 0 0 1
HSM_1176 261 0 1 1 0 2
HSM_1726 1548 0 0 * 0 *
HSM_1730 1605 0 0 0 0 0
HSM_1962 2607 0 0 0 0 0
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손된 것으로 확인된 경우를 의미한다.
표 22. 숙주 침입 및 금속 흡수에 관여하는 독성-연관 유전자의 2군 분석에 따라 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전자 명칭 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실의 #
TK HS91 TK 2336 TK HS91 129PT
HSM_0047 2754 2 0 1 0 1 0 1
HSM_0749 1989 * 0 1 1 1 0 1
HSM_0750 2916 2 0 2 0 1 0 3
HSM_0931 1779 0 0 0 0 0 0 0
HSM_1089 1353 0 0 1 0 1 0 *
HSM_1160 537 * 0 0 0 0 0 *
HSM_1168 3111 0 0 0 0 0 0 1
HSM_1176 261 2 0 0 0 0 0 2
HSM_1726 1548 0 * * 0 * * *
HSM_1730 1605 0 0 0 0 0 0 0
HSM_1962 2607 0 0 0 0 0 0 0
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손된 것으로 확인된 경우를 의미한다.
표 23. 스트레스 반응, 항생제 내성, 및 약물 유출에 관여하는 독성-연관 유전자의 1군 분석에 따른 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전자 명칭 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실의 #
HS91 TK #21 TK #4 153-3 129PT
HSM_0598 1890 0 * * 0 *
HSM_1191 573 0 * * * *
HSM_1448 282 0 0 0 0 *
HSM_1616 981 0 * * 0 *
HSM_1624 1029 1 * * * *
HSM_1728 405 0 * * * *
HSM_1734 624 0 0 * 0 *
HSM_1736 333 0 * * * *
HSM_1737 450 0 * * * *
HSM_1741 399 0 * * * *
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손된 것으로 확인된 경우를 의미한다.
표 24. 스트레스 반응, 항생제 내성, 및 약물 유출에 관여하는 독성-연관 유전자의 2군 분석에 따른 단리주에 존재하는 삽입-결실의 수
유전자 번호 총 bp 존재하는 비동의 삽입-결실의 #
TK HS91 TK 2336 TK HS91 129PT
HSM_0598 1890 * 0 0 0 0 0 *
HSM_1191 573 * 0 * 0 * 0 *
HSM_1448 282 0 0 * 0 * 0 *
HSM_1616 981 0 0 0 0 0 0 *
HSM_1624 1029 2 2 * 1 * 2 *
HSM_1728 405 * * * 0 * * *
HSM_1734 624 0 * * 0 * * *
HSM_1736 333 * * * 0 * * *
HSM_1737 450 * * * 0 * * *
HSM_1741 399 * * * 0 * * *
*는 유전자가 특정 단리주에서 결손되었음을 의미한다.
숙주 침입 및 금속 흡수에 관여하는 독성-연관 유전자의 경우 최근 단리주 및 129PT 중에서 결손된 삽입-결실에 많은 유사성이 존재하였다. 이들 유전자는 TonB-의존적 수용기(TK #4 및 TK #34 각각에 2개 삽입-결실, TK #42, TK #28 및 129PT에 1개 삽입-결실), TbpB(HS91, TK #42, 2336, TK #28, 및 129PT에 각각 1개 삽입-결실), TbpA(TK #21, TK #4, 153-3, TK #34, 및 TK #42에 2개 삽입-결실, 129PT에 3 또는 4개 삽입-결실(2 분석 결과 이 단리주에서는 상이한 삽입-결과 추정값이 얻어졌음), 및 TK #28에 1개 삽입-결실), TbpA2(153-3에 1개 삽입-결실), 용혈 활성화/분비 단백질-유사 단백질(TK #42 및 TK #28 각각에 1개 삽입-결실), TonB-의존적 헤모글로빈/트랜스페린/락토페린 패밀리 수용기(129PT에 1개 삽입-결실), 및 외막 헤민 수용기 단백질(TK #21 및 TK #4에 1개 삽입-결실, TK #34 및 129PT에 2개 삽입-결실)을 포함한다. 스트레스 반응, 항생제 내성, 및 약물 유출 유전자 중에 임의의 삽입-결실을 갖는 유일한 유전자는 아실트랜스퍼라제 3이었다. HS91 및 2336에는 1개 비동의 삽입-결실이 존재하였고, TK #34, HS91 ΔaroC, 및 HS91 ΔnanPU에는 2개가 존재하였다.
* * * * * * * *
본 발명의 바람직한 구체예들을 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 사조 또는 범주를 벗어나지 않고 많은 명백한 그 변형들이 가능하므로 상기 단락들에 의해 정의된 발명은 상기의 설명에 기재된 특정 사항들에 제한되지 않는다.

Claims (30)

  1. 히스토필러스. 솜니(Histophilus somni)(에이치. 솜니) 또는 에이치. 솜니에 의해 야기된 질환에 대항해 소과 동물에서 안전하고 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있는, 약독화된 히스토필러스 솜니 균주로서,
    상기 약독화된 균주는 기준 독성 에이치. 솜니 균주에 비해, 그의 게놈 서열에, 그의 동족 야생형 유전자 산물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전한 결실을 포함하여, 다음의 독성 인자-코딩 유전자가 돌연변이되고:
    NCBI 유전자 번호 HSM_0270 인 헤마글루티닌/헤모라이신-유사 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0338 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0377 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0598 인 스트레스-감응성 제한 시스템 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0708 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0749 인 트랜스페린 결합 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0953 인 헤마글루티닌 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1160 인 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1191 인 TetR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1257 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1426 인 리포올리고사카라이드 시알릴트랜스퍼라제 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1616 인 Abi 패밀리 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1624 인 아실트랜스퍼라제 3 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1714 인 지단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1728 인 MerR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1730 인 3형 다중구리 산화효소 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1734 인 TetR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1736 인 소형 다중약물 내성 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1737 인 MarR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1741 인 MerR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1793 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자 및
    NCBI 유전자 번호 HSM_1889 인 펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신 유전자,
    이러한 독성 인자-코딩 유전자의 상대적 결핍은 약독화된 균주가 소과 동물에서 감염을 야기할 수 없게 만드는, 약독화된 히스토필러스 솜니 균주.
  2. 제1항에 있어서, 기준 독성 균주는 서열번호 2에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 99%, 또는 100%를 코딩하고 발현하는 게놈 DNA 서열을 포함하고,
    약독화된 균주는 서열번호 1 에 기재된 바와 같은 서열을 그의 게놈에 갖는 약독화된 균주에 의해 발현되는 상응하는 독성 유전자의 수준과 균등하거나, 또는 더 낮은 수준으로 임의의 독성 인자 유전자를 발현하는 것인 약독화된 균주.
  3. 제2항에 있어서, 약독화된 균주는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 100%를 코딩하고 발현하는 것인 약독화된 균주.
  4. 제2항에 있어서, 약독화된 균주는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 서열과 동일한 유전자의 적어도 99%를 코딩하고 발현하며,
    약독화된 균주는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 서열을 그 게놈에 갖는 약독화된 균주에 의해 발현되는 상응하는 독성 유전자의 수준과 균등하거나, 또는 더 낮은 수준으로 임의의 독성 인자 유전자를 발현하는 것인 약독화된 균주.
  5. 제1항에 있어서, 약독화된 균주는, 에이치. 솜니 균주 2336에 비해 명칭 PTA-121029 하에 ATCC에 기탁된 균주에서 결여된 유전자의 적어도 99%가, 에이치. 솜니 균주 2336에 비해 결여된 것인 약독화된 균주.
  6. 제1항에 있어서, 약독화된 균주는 명칭 PTA-121029 하에 ATCC에 기탁된 균주와 동일한 유전자의 적어도 99%를 코딩하고 발현하는 것인 약독화된 균주.
  7. 제6항에 있어서, 약독화된 균주는 명칭 PTA-121029 하에 ATCC에 기탁된 것과 동일한 균주인 약독화된 균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 약독화된 균주로 이루어지거나 또는 포함하는 면역학적 또는 백신 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 약학적 또는 수의학적 허용 비히클, 희석제 또는 부형제를 더 포함하는 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 조성물은 적어도 하나의 독성 에이치. 솜니 균주에 후속 노출에 대항해 보호성 면역 반응을 소과 동물에서 유발시키며, 조성물은 비보조인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 소과 동물에서 병원체-특이적 면역 반응을 유발시킬 수 있는, 적어도 하나 또는 그 이상의 추가 항원을 더 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 항원은 이 항원이 유래된 병원체에 후속 노출로부터 동물을 보호하기에 충분한 면역 반응을 소과 동물에서 유발시키는 것인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 적어도 하나 또는 그 이상의 추가 항원은 소 호흡기 복합 질환(BRDC), 소 호흡기 합포성 바이러스(BRSV), 소 바이러스성 설사병(BVD), 소 파라인플루엔자 3(PI3), 감염성 소 비강기관염(IBR), 1형 소 헤르페스바이러스(BHV-1), 청설병 바이러스(BTV), 또는 소과 동물에서 감염시키고 질병 또는 질병에 대한 감수성을 야기할 수 있는 임의의 다른 병원체에 대항해 소과 동물에서 면역 반응을 유발시킬 수 있는 조성물.
  14. 제13항의 조성물을 소과 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 후속 독성 에이치. 솜니 감염에 대항해 이를 필요로 하는 소과 동물에서 보호 면역성을 유발시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 후속 독성 에이치. 솜니 감염은 적어도 하나의 독성 에이치. 솜니 균주로 감염된, 다른 소과 동물에 의해 소과 동물에게 전염된, 자연 감염인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 백신접종은 비내, 피하 또는 근육내인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 약독화된 균주는 NCBI 유전자 번호 HSM_1726 인 3형 다중구리 산화효소 유전자가 더 결여되거나 또는 발현되지 않는 방법.
  18. 안전하고 효과적인 백신 제제에 사용하기 적합한 유전자 조작된, 비천연 유래의, 약독화된 에이치. 솜니 균주로서,
    그의 동족 야생형 유전자 산물을 발현하는 유전자의 능력을 제거하기 위해, 완전한 결실을 포함하여, 다음의 유전자가 돌연변이된, 약독화된 에이치. 솜니 균주:
    NCBI 유전자 번호 HSM_0270 인 헤마글루티닌/헤모라이신-유사 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0338 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0377 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0598 인 스트레스-감응성 제한 시스템 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0708 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0749 인 트랜스페린 결합 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_0953 인 헤마글루티닌 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1160 인 글리코시드 히드롤라제 패밀리 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1191 인 TetR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1257 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1426 인 리포올리고사카라이드 시알릴트랜스퍼라제 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1616 인 Abi 패밀리 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1624 인 아실트랜스퍼라제 3 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1714 인 지단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1728 인 MerR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1730 인 3형 다중구리 산화효소 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1734 인 TetR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1736 인 소형 다중약물 내성 단백질 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1737 인 MarR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1741 인 MerR 패밀리 전사 조절인자 유전자,
    NCBI 유전자 번호 HSM_1793 인 YadA 도메인-함유 단백질 유전자 및
    NCBI 유전자 번호 HSM_1889 인 펩티다제 S8/S53 서브틸리신 케신 세돌리신 유전자.
  19. 제18항의 약독화된 균주를 포함하는 백신 조성물.
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