BRPI1006947B1 - composição, vacina para aves da ordem galliformes e usos das mesmas - Google Patents

Abstract

composição, vacina para aves da ordem galliformes e usos das mesmas a presente invenção refere-se a uma formulação que previne infecção por mycoplasma gallisepticum virulento em aves da ordem galliformes. a formulação compreende cepa viva de mycoplasma gallisepticum k5831 ou derivados da mesma em um veículo farmaceuticamente aceitável. também é apresentada uma vacina que previne infecção por mycoplasma gallisepticum virulento em aves da ordem galliformes. também são apresentados métodos para administrar a formulação e vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO, VACINA PARA AVES DA ORDEM GALLIFORMES E USOS DAS MESMAS.

DADOS DE REQUERIMENTO CONTÍNUO

Este requerimento reivindica o benefício do Requerimento Provisório de Patente dos Estados Unidos N° de Série 61/146.472, arquivado em 22 de janeiro de 2009, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente.

ANTECEDENTES

A presente invenção refere-se ao Mycoplasma gallisepticum (MG), que é um patógeno respiratório infeccioso de frangos e perus. É o patógeno de micoplasma mais patogênico e economicamente significativo de aves domésticas. As perdas econômicas por condenação ou desclassificação de carcaças, reduzida eficiência da produção de ração e ovos, e aumento dos custos de medicação são fatores que tornam isto um dos problemas de doença mais caros confrontando a produção comercial de aves domésticas mundialmente. O controle do MG geralmente é por isolamento e manutenção de estoque de criação livre de MG. No entanto, a rápida expansão da produção de aves domésticas em pequenas áreas geográficas e fazendas de múltiplas idades que nunca despovoam tornam a erradicação e o controle de MG por semelhantes esforços de biossegurança isoladamente difíceis e necessitam da implementação de medidas adicionais. Nestas situações, a imunização profilática de ave doméstica contra doença relacionada com MG envolve o uso de vacinas inativadas ou exposição a cepas de vacinas vivas atenuadas de MG. Vide, por exemplo, Kleven et al., 1997, Acta Vet Hung; 45(3): 299-305.

No entanto, cada abordagem tem desvantagens. As vacinas inativadas, apesar de geralmente eficazes na proteção contra perda de produção de ovos em galinhas poedeiras (layers), não previnem infecção de modo confiável ou proporcionam proteção consistente contra doença respiratória. E, apesar das vacinas vivas atenuadas de MG parecerem ser mais eficazes, e portanto mais populares, do que vacinas inativadas, elas podem produzir doença ou conferir função reprodutiva.

Petição 870190064108, de 09/07/2019, pág. 5/13

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Uma característica importante de uma vacina viva de MG eficaz é a capacidade para aumentar a resistência a infecção por cepa selvagem, e para substituir cepas selvagens com a cepa de vacina sobre sítios de produção de múltiplas idades (Levisohn e Kleven, 2000, Rev Sci Tech; 19(2): 42542; e Turner e Kleven, 1998, Avian Dis; 42(2): 404-7). Atualmente, vacinas vivas disponíveis para o controle de MG incluem cepa F (Luginbuhl et al., 1967, Ann NY Acad Sci; 143: 234-238; Adler et al., 1960, Am J Vet Res; 21: 482-485), 6/85 (Evans e Hafez, 1992, Avian Dis; 36: 197-201) e ts-11 (Whithear et al., 1990, Aust Vet J; Q7: 159-165; e Whithear et al., 1990, Aust Vet J; 67: 168-174). A cepa F é transmissível para companheiros de galinheiro e frangos não vacinados em galinheiros adjacentes e pode ser isolada de granjas muito depois de a vacinação ter cessado. As cepas ts-11 e 6/85 são transmissíveis, embora insuficientemente, de aves domésticas vacinadas para não vacinadas quando em contato. A cepa F persiste em níveis mais elevados no trato respiratório superior do que quer ts-11 ou 6/85, e ts-11 parece colonizar de modo mais eficaz do que 6/85. A cepa F também transmite da galinha para o ovo. Infelizmente, embora cada uma das vacinas disponíveis atualmente tenha suas vantagens, nenhuma delas atinge o status ideal em todos os aspectos. Portanto, existe, por conseguinte, a necessidade de cepas de vacinas vivas de MG aprimoradas que sejam tanto seguras quanto eficazes, que sejam estáveis e não virulentas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção inclui uma cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum, em que a cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum é a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Patente PTA-9495.

A presente invenção inclui uma cultura essencialmente biologicamente pura da cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Patente PTA-9495.

A presente invenção inclui uma cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum, em que a cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum é a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação

3/48 de Patente PTA-9495, ou uma progênie ou derivado da mesma, em que uma progênie ou derivado da mesma tem as mesmas características biológicas, sorológicas, e/ou genéticas da cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Patente PTA-9495.

A presente invenção inclui uma cultura essencialmente biologicamente pura da cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Patente PTA-9495, ou uma progênie ou derivado da mesma, em que uma progênie ou derivado da mesma tem essencialmente as mesmas características biológicas e sorológicas da cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Patente PTA-9495.

Em algumas modalidades da presente invenção, a cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum, progênie ou derivado da mesma é liofilizada.

A presente invenção inclui uma composição incluindo uma cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum, progênie ou derivado da mesma, conforme descrito aqui neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, uma composição pode incluir adicionalmente água. Em algumas modalidades, uma composição pode incluir adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma composição pode ser formulada para administração na mucosa. Em algumas modalidades, uma composição pode ser formulada para administração intranasal, intraocular, ou oral. Em algumas modalidades, uma composição pode ser formulada para pulverização ou aerolização.

A presente invenção inclui uma vacina incluindo uma cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum, progênie ou derivado da mesma, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, ou uma composição conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, uma vacina pode reduzir a suscetibilidade de algumas aves da ordem Galliformes a doença induzida por Mycoplasma gallisepticum.

A presente invenção inclui uma vacina para aves da ordem Galliformes incluindo uma quantidade da cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum, depositada na ATCC sob a Designação de Depósito de Patente PTA

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9495 ou um derivado da mesma, suficiente para proteger as aves contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma quantidade protetora é a quantidade requerida para a cepa K8531 de Mycoplasma gallisepticum colonizar o trato respiratório superior da ave. Em algumas modalidades, uma quantidade protetora está entre cerca de 50 e cerca de 5 X 10⁷ ccu/ ave.

A presente invenção inclui um método para reduzir a suscetibilidade de uma ave da ordem Galliformes contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum, o método incluindo administrar à ave a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Depósito de Patente PTA-9495, ou uma progênie ou derivado da mesma.

A presente invenção inclui um método para reduzir a suscetibilidade de uma ave da ordem Galliformes contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum, o método incluindo administrar uma cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum, progênie ou derivado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, uma composição conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, ou uma vacina conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, à ave.

A presente invenção inclui um método para proteger uma ave da ordem Galliformes contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum, o método incluindo administrar à ave a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Depósito de Patente PTA9495, ou uma progênie ou derivado da mesma.

A presente invenção inclui um método para proteger uma ave da ordem Galliformes contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum, o método incluindo administrar uma cepa isolada de Mycoplasma gallisepticum, progênie ou derivado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, uma composição conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, ou uma vacina conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, à ave.

Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum ou progênie ou derivado da mesma

5/48 persiste no epitélio respiratório da ave. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum ou progênie ou derivado da mesma exclui outras cepas de Mycoplasma gallisepticum do epitélio respiratório. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum ou progênie ou derivado da mesma é administrada à mucosa respiratória. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum ou progênie ou derivado da mesma é administrada por gotas oculares. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum ou progênie ou derivado da mesma é administrada por via nasal. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum ou progênie ou derivado da mesma é administrada por aerosol. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum ou progênie ou derivado da mesma é administrada pela água potável. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, o método inclui adicionalmente administrar no mínimo uma formulação de reforço adicional à ave. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a ave pode ser um frango ou peru.

Os termos compreende e variações do mesmo não têm um significado limitante onde estes termos aparecem na descrição e nas reivindicações.

A menos que especificado de modo diverso, um, uma, o,, a e no mínimo um são usados de modo intercambiável e significam um ou mais de um.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 é um gráfico representando o sumário de resultados para um estudo de transmissibilidade por contato direto. Os resultados são mostrados como % positiva.

A figura 2 é um gráfico representando o sumário de resultados de um estudo de excreção. Os resultados são mostrados como % positiva.

A figura 3 é um gráfico representando resultados de estudo de deslocamento, em números de cópias (Log10) de cepa R em frangos vaci

6/48 nados e frangos não vacinados (controles) em 0, 2, 4 e 8 semanas pós introdução de semeadores de cepa R.

A figura 4 é um gráfico representando resultados de estudo de deslocamento, em números de cópias (Log10) de cepa R em frangos vacinados e frangos não vacinados (controles) em 0, 2, 4 e 8 semanas pós introdução de semeadores de cepa R.

A figura 5 é um gráfico representando resultados de estudo de deslocamento, em números de cópias (Log10) de vacinas de frangos em 0, 2, 4 e 8 semanas pós introdução de semeadores de cepa R.

A figura 6 é um gráfico representando resultados de estudo de deslocamento, em números de cópias (Log 10) de vacinas de frangos em 0, 2, 4 e 8 semanas pós introdução de semeadores de cepa R.

A figura 7 apresenta os resultados de análise de DNA Polimórfico Amplificado Randômica (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) para impressão digital (fingerprint) de K5831B-19 e isolado de passagem de volta (back passage isolate) K5883-2. A alameda 1 é K2101. A alameda 2 é K5831B-19. A alameda 3 é K5833-2. A alameda 4 é cepa R. A alameda 5 é 6/85. A alameda 6 é ts-11. A alameda 7 é cepa F. A alameda 8 é um controle negativo. A alameda 9 é a progressão de 100 bp.

A figura 8 apresenta os resultados de análise de DNA Polimórfico Amplificado Randômica (RAPD) para impressão digital de K5831B-19 isolados de passagem de volta dez dias pós estímulo com K5831B-19, K882-1, ou cepa R.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum (MG), progênie, e derivados da mesma que são avirulentos, imunogênicos, e estáveis quando administrados como formulações vivas. Formulações do Mycoplasma gallisepticum da presente invenção são seguras e eficazes para inibir infecções por Mycoplasma gallisepticum e serão úteis na redução da incidência e da gravidade de doença de infecções por Mycoplasma gallisepticum em aves.

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A cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum foi depositada junto à American Type Culture Collection (ATCC®), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA, como PTA-9495 em 15 de setembro de 2008. Esta cepa foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para os Fins de Procedimento de Patente (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedimento). A cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum também é referida aqui, neste requerimento de patente, como Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19, MG K5831, MG K5831B-19, MG cepa K5831, MG cepa K5831B-19, K5831, K5831B-19, ATCC PTA-9495, e PTA-9495. A cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum foi isolada a partir de frangos estimulados com Mycoplasma gallisepticum cepa K2101 (MG K2101). MG K2101 foi um isolado de campo, isolado no Colorado em 1984 a partir de um bando de galinha poedeira (layer flock) comercial demonstrando gotas em proteção de ovos. De aproximadamente trinta isolados, os isolados B-1 a B-30, o isolado MG K5831B-19 foi selecionado para caracterização e análise adicional.

A presente invenção inclui a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum (MG) isolada que foi depositada com a Designação de Depósito de Patente ATCC como PTA-9495, em 15 de setembro de 2008. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, isolado se refere a material removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ocorrer naturalmente), e portanto é alterado pela mão do homem a partir de seu estado natural. Também são incluídos na presente invenção a progênie isolada e derivados isolados de Mycoplasma gallisepticum cepa K5831 com Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-9495 e cepas com características equivalentes ou similares biológicas, sorológicas, e/ou genéticas. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, características sorológicas, biológicas, e genéticas podem incluir uma ou mais das características descritas nos dados nos exemplos e figuras incluídos com este. Mais particularmente, a progênie ou derivado cepas do material PTA-9495 conserva as propriedades protetoras particularmente favoráveis pertencentes à

8/48 presente invenção. A progênie de Mycoplasma gallisepticum cepa K5831 Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-9495 pode ser obtida por qualquer um dos vários métodos para propagar Mycoplasma gallisepticum conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, cultura in vitro ou passagem de volta em uma ave. Exemplos de progênie incluem, por exemplo, os reisolados K5866, K5969, K5872, e K5876, e K5883-2, conforme descrito no exemplo 3. Derivados de Mycoplasma gallisepticum cepa K5831 Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-9495 incluirão versões geneticamente modificadas da cepa MG K5831 depositada. As manipulações referidas incluem, mas não estão limitadas a, mutagenizar a cepa de MG ou introduzir genes ou cassetes de genes codificando proteínas alternativas ou proteínas não funcionais, ou sequências de nucleotídeos não codificantes no organismo MG.

A cepa K5831 de MG e progênie e derivados da mesma pode ser identificada e diferenciada de outras cepas de M. gallisepticum usando qualquer uma das muitas técnicas que têm sido desenvolvidas para a diferenciação de cepas de M. gallisepticum, incluindo, por exemplo, análise do perfil de proteína (Khan et al., 1987, Avian Dis- 31: 315-320), polimorfismo de extensão de fragmento de restrição (RFLP) (Kleven et al., 1988, Avian Dis; 32:731-741), ribotipagem (Yogev et al., 1988, Avian Dis; 32: 220-231), sondas de DNA cepaespecíficas (Khan et al., 1989, Avian Pathol; 18: 135146), PCR com iniciadores cepaespecíficos (Nascimento et al., 1993, Avian Dis; 37: 203-211), e DNA polimórfico amplificado randômico (RAPD) (Charlton et al., 1999, J Vet Diag Invest, 11: 158-161; Fan et al., 1995, Avian Dis 39; 729-735; e Geary et al., 1994, Mol Cell Probes; 8: 311-316). O método RAPD tem sido usado com sucesso para identificar cepas de vacina tanto em condições experimentais e quanto de campo (Ley et al., 1997, Avian Dis; 41: 187-194; Kleven e Fan, 1998, Avian Dis; 42: 300-306; Turner e Kleven 1998, Avian Dis 42; 404-407), bem como para rastrear isolados relacionados epidemiologicamente no campo (Kempf, 1998, Avian Pathol; 27: 7-14; Ley et al., 1997, Emerg Infect Dis; 3: 375-380; Charlton et al., 1999, J Vet Diagn Invest 11, 408-415; Levisohn & Kleven, 2000, Rev Sci Tech; 19: 425-442).

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A progênie ou derivados de K5831 podem partilhar uma ou mais das características de identificação da cepa K5831 de MG. A progênie ou derivados de K5831 podem partilhar substancialmente todas as características de identificação referidas. A presente invenção também contempla, em aspectos adicionais, a cepa de MG K2101 parental, progênie e derivados da mesma e seu uso em quaisquer das composições, vacina, e métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.

Cepa MG K5831, progênie e derivados das mesmas podem ser identificados e diferenciados de outras cepas de M. gallisepticum usando análise de DNA Polimórfico Amplificado Randômica (RAPD). Em resumo, reações em cadeia da polimerase com iniciadores arbitrários (AP-PCR) envolvendo três ciclos de amplificação de baixa estringência seguidas por PCR em maior estringência é realizada com três iniciadores escolhidos arbitrariamente, usando procedimentos descritos em mais detalhes por Fan et al. (Fan et al., 1995, Avian Dis', 39: 729-735). Os três iniciadores de oligonucleotídeos usados são M16SPCR5' (AGGCAGCAGTAGGGAAT (SEQ ID NO: 16)); M13F (GTAAAACGACGGC (SEQ ID NO: 17)); e S1OLIGO3' (CATAACTAACATAAGGGCAA (SEQ ID NO: 18)). Resultados representativos de semelhante análise RAPD para K5831B-19 e progênie K5833-2 são mostrados nas figuras 7 e 8. A progênie e derivados da mesma podem demonstrar um perfil RAPD substancialmente equivalente de Mycoplasma gallisepticum cepa K5831 Designação de Depósito de Patente ATCC ao PTA-9495 quando são utilizados os iniciadores Fan.

K5831, progênie ou derivado da mesma podem ser identificados e differenciados de outras cepas de M. gallisepticum usando uma abordagem de sequenciamento direcionado ao gene (GTS, gene targeted sequencing). Pode ser analisada qualquer um de uma variedade de genes. Por exemplo, podem ser usadas sequências genéticas do gene gapA gene, do gene mgc2, do gene pvpA e/ou do gene codificando uma lipoproteína superficial conservada prevista. Estas quatro sequências genéticas foram primeiro identificadas no genoma de M. gallisepticum R|_OW cepa (Papazisi et al., 2003, Microbiol·, 149: 2307-2316). O gene gapA codifica uma proteína que

10/48 foi demostrado que esta envolvida no processo de citadesão (Goh et al., 1998, Microbiol; 144: 2971-2978) identificado como sequência de DNA codificando genoma (CDS) MGA_0934. O gene mgc2 codifica uma segunda proteína citadesina também conhecida por desempenhar um papel no processo de ligação (Hnatow et al., 1998, Infect Immun; 66: 3436-3442) identificada como genoma CDS MGA_0932. O gene pvpA codifica uma citadesina acessória putativa que apresenta variação de tamanho entre cepas de M. gallisepticum (Boguslavsky et al., 2000, Infect Immun; 68: 3956-3964; Liu et al., 2001, J Clin Microbiol; 39: 1882-1888). O gene codificando uma lipoproteína superficial conservada prevista, originalmente reconhecida por Nascimento et al. (Nascimento et al. 1991, Avian Dis; 35: 62-69), foi identificada como genoma CDS MGA_0319 (Papazisi et al., 2003, Microbiology; 149: 2307-2316).

A progênie ou derivados de K5831 podem partilhar uma ou mais das sequências de identificação de Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B em porções do gene pvpA de citadesina (SEQ ID NO: 13), o gene gapA de citadesina (SEQ ID NO: 15), o gene mgc2 de citadesina (SEQ ID NO: 14), ou o gene codificando lipoproteína superficial hipotética não caracterizada designada sequência de DNA codificando genoma (CDS) MGA_0319 (SEQ ID NO: 12), conforme determinado pela análise por sequenciamento direcionado ao gene (GTS) descrita em mais detalhes no exemplo 8, seguindo, por exemplo, os procedimentos descritos em mais detalhes em Ferguson et al. (Ferguson etal., 2005, Microbiol; 151: 1883-1893).

A cepa K5831 de MG e progênie ou derivados da mesma pode demonstrar uma curva-padrão de PCT em tempo real de Taqman com um ou mais de um valor de Ct médio de 37,20, 33,48, 30,48, 27,15, 23,97, 20,74, 17,28, e 13,70 para número de cópias de logw modelo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, e 8, respectivamente; uma equação linear de y=-0,3021x + 12,203; e/ou um valor /?-quadrado se 0,9996. Um PCT em tempo real de Taqman semelhante pode utilizar iniciadores do gene mgc2, Número de Acesso no GenBank AY556238, tal como, por exemplo, usando uma sequência de iniciador senso (5'->3') incluindo os nucleotídeos 218 a 237 de AY556238 (CTCAA

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GAACCAACTCAACCA (SEQ ID NO: 1)), uma sequência de iniciador reverso (5'—>3') incluindo os nucleotideos 329 a 308 de AY556238 (GGATTAGGACCAAATTGCGGAT (SEQ ID NO: 2)), uma sequência de sonda dupla etiquetada (5'—>3') incluindo os nucleotideos 280 a 303 de AY556238 (CAACCAGGATTTAATCAACCTCG (SEQ ID NO: 3)), e uma temperatura de recozimento I extensão de 61 °C. Alternativamente, podem ser usadas sondas similares do gene mgc2, Número de Acesso no GenBank AY556282. A metodologia para uma determinação semelhante é descrita em mais detalhes por Raviv et al. (Raviv et al., 2008, Veterinary Medicine; 129(1-2): 17987). A progênie ou derivados de K5831 pode partilhar uma ou mais das características de identificação da cepa K5831 de MG determinadas por uma prova de PCR em tempo real de Taqman semelhante.

Cepas de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção demonstram uma variedade de características biológicas e/ou sorológicas adicionais, incluindo, mas não limitadas a quaisquer daquelas descritas nos exemplos incluídos com este. Por exemplo, cepas de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção podem demonstrar menores taxas de transmissão. As cepas de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção podem demonstrar aumentada persistência no trato respiratório superior. As cepas de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção podem demonstrar pouco ou nenhum aumento na virulência quando passadas de volta. As cepas de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção podem demonstrar transmissão vertical limitada ou nenhuma transmissão vertical. Vacinação com uma cepa de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção pode resultar em menor colonização com outras cepas de Mycoplasma gallisepticum, tais como por exemplo, a cepa R. Vacinação com uma cepa de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção pode resultar em lesões grosseiras depois do estímulo que permanecem essencialmente no sistema respiratório das aves estimuladas.

Com a presente invenção, a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum foi avaliada por estudos para investigar a dose mínima, a transmissibilidade, a persistência e a excreção, passagem de volta, a distribuição

12/48 corporal, transmissão vertical, deslocamento de cepas virulentas, patogenicidade em ovos embrionados e frangos, e caracterização de propriedades bioquímicas, biológicas e sorológicas. O título mínimo de MG K5831 necessário para infectar e induzir proteção de vacina adequada foi de cerca de 6,22 x 10⁵CCU/ml. MG K5831 teve uma taxa relativamente baixa de transmissão e persistiu no trato respiratório superior por no mínimo cinco meses. Não houve aumento na virulência de MG K5831 quando passada de volta cinco vezes através dos frangos e foram avaliadas lesões macroscópicas depois de estímulo. MG K5831 permaneceu essencialmente no sistema respiratório de aves estimuladas. Não foi detectada transmissão vertical de MG K5831. E vacinação com MG K5831 resultou em menor colonização com cepa R

A presente invenção inclui composições das cepas de Mycoplasma gallisepticum, progênie e derivados das mesmas descritos aqui, neste requerimento de patente. As referidas composições podem servir como vacinas que reduzem a suscetibilidade de algumas aves a doença induzida por Mycoplasma gallisepticum. As referidas composições podem servir como vacinas que protegem as aves contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum. Composições e vacinas da presente invenção podem incluir, por exemplo, água ou meio de cultura. As referidas composições e vacinas podem incluir veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Veículos incluem, por exemplo, estabilizantes, conservantes e tampões. Estabilizantes adequados incluem, por exemplo, SPGA, carboidratos (tais como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrano, glutamato ou glicose), proteínas (tais como soro de leite em pó, albumina aou caseína) ou produtos da degradação dos mesmos. Tampões adequados incluem, por exemplo, fosfatos de metais de álcali. Conservantes adequados incluem, por exemplo, thimerosal, merthiolate e gentamicina. Diluentes, incluem, mas não são limitados a, água, tampão aquoso (tal como salina tamponada), alcoóis, e polióis (taos como glicerol).

As cepas de MG, composições e vacinas da presente invenção podem ser substancialmente puras. Conforme usado aqui, neste requerí

13/48 mento de patente, substancialmente puras significara material essencialmente livre de quaisquer macromoléculas similares ou outras entidades biológicas que normalmente seriam encontradas com esta na natureza.

Preferencialmente os organismos usados em semelhantes formulações estão vivos. Em algumas modalidades, os organismos, composições, ou vacinas podem ser liofilizados.

Composições e vacinas da presente invenção podem ser administradas a aves de qualquer uma de uma variedade de espécies de aves que são suscetíveis a Mycoplasma gallisepticum, incluindo, mas não limitadas a, aves domésticas, aves da ordem Galliformes, e espécies de aves exóticas. Aves da ordem Galliformes incluem, mas não são limitadas a, frangos, perus, perdiz, codornas, e faisões. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, aves domésticas inclui aves domesticadas que são mantidas para o propósito de colher seus ovos, ou matar para sua carne e/ou penas. Estas o mais tipicamente são membros da superordem Galloanserae (frango), especialmente da ordem Galliformes (a qual inclui, por exemplo, frangos, codorna, perus, e perdiz) e da família Anatidae (da ordem Anseriformes), comumente conhecida como ave aquática (incluindo, por exemplo, patos, gansos e cisnes). Aves domésticas também podem incluir outras aves as quais são mortas por sua carne, tais como pombos ou pombas ou aves consideradas como sendo de diversão, como faisões. Frangos incluem, mas não são limitados a, galinhas, galos, frangos de corte, frango para assar (roasters), galinhas poedeiras, reprodutores, a ninhada de galinhas reprodutoras, e poedeiras. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo suscetível a significa a possibilidade ou realidade de uma reação prejudicial para o micro-organismo referido, tal como, por exemplo, reduzido vigor ou um déficit de crescimento, em comparação com alguns indivíduos ou grupos não suscetíveis, e/ou um ou mais estados patológicos indicativos de infecção por Mycoplasma gallisepticum.

Composições e vacinas da presente invenção podem ser formuladas para liberação por qualquer uma de uma variedade de vias conhecidas na técnica veterinária, tais como, por exemplo, administração na mucosa,

14/48 intranasal, intraocular, ou oral. Composições e vacinas da presente invenção podem ser formuladas para liberação na mucosa respiratória e podem ser administradas de tal modo que são imediatamente ou eventualmente trazidas em contato com as membranas mucosas respiratórias da ave. Composições e vacinas da presente invenção podem ser formuladas para liberação por qualquer uma de uma variedade de modos conhecidos na técnica veterinária, tais como por exemplo, pulverização ou aerolização. Uma composição imunogênica ou vacina da presente invenção pode ser administrada por qualquer método conhecido adequado de inoculação de aves incluindo, mas não limitados a, por via nasal, por via oftálmica, por injeção, em água potável, na ração, por exposição, in ovo, por via materna, e similares.

A composição imunogênica ou vacina pode ser administrada por técnicas de administração em massa tais como colocando a vacina na água potável ou pulverizando o ambiente dos animais. Uma composição pode ser administrada pulverizando um indivíduo ou o bando com uma solução, a liberação por aerosol referida pode envolver a administração da composição incorporada em pequenas partículas de líquido. As partículas do tipo de spray referidas podem ter um tamanho de gotícula variando a partir de entre cerca de 10 a cerca de 100 micra, mais preferencialmente, um tamanho de gotícula a partir de entre cerca de <1 a cerca de 50 micra. Para a produção das partículas pequenas, podem ser usados equipamento de spray convencional e geradores de aerosol, tais como os geradores de spray disponíveis comercialmente para pulverização costal (knapsack spray), pulverização de incubadora (hatchery spray) e pulverização por atomização (atomist spray). Pode ser realizada administração através da água potável usando equipamentos convencionais. Quando administrada por injeção, a composição imunogênica ou vacina pode ser administrada por via parenteral. Administração parenteral inclui, por exemplo, administração por injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, ou intraperitoneal.

Uma composição ou vacina da presente invenção pode ser administrada às aves antes ou depois de incubação. As aves podem receber uma composição de vacina semelhante em qualquer uma de uma variedade

15/48 de idades. Com liberação depois da incubação, os materiais podem ser liberados, por exemplo, cerca de uma semana depois da incubação, cerca de duas semanas depois da incubação, cerca de três semanas depois da incubação, cerca de quatro semanas depois da incubação, cerca de cinco semanas depois da incubação, cerca de seis semanas depois da incubação, ou qualquer faixa dos mesmos. Para administração in ovo, os materiais podem ser liberados cerca de dezessete dias de incubação, cerca de dezoito dias de incubação, cerca de dezenove dias de incubação, cerca de vinte dias de incubação, e qualquer faixa dos mesmos.

Composições e vacinas da presente invenção podem ser ajustadas para incluir uma concentração designada de Mycoplasma gallisepticum. Os organismos podem ser medidos como unidades de mudança de cor. Unidades de mudança de cor, também referidas aqui, neste requerimento de patente, como ecu, de Mycoplasma gallisepticum podem ser quantificadas usando metodologia padrão estabelecida, incluindo, por exemplo, protocolos determinados em Rodwell e Whitcomb (Em Methods in Mycoplasmology, Eds. Razin and Tully, 1993). Por exemplo, uma quantidade eficaz pode ser administrada a uma única ave em uma gota por olho por ave, uma gota sendo aproximadamente 0,05 ml, portanto com uma concentração de entre cerca de 1x10³ e cerca de 1x10⁶ unidades de mudança de cor/ml (ccu/ml), isto é equivalente a cerca de 50 a cerca de 50,000 ccu/ ave. Por exemplo, pode ser usada uma concentração; de cerca de 50, cerca de 1x10² ccu/ml, cerca de 5x10² ccu/ml, cerca de 1x10³ ccu/ml, cerca de 5x10³ ccu/ml, cerca de 1x10⁴ ccu/ml, cerca de 5x10⁴ ccu/ml, cerca de 1x10⁵ ccu/ml, cerca de 5x10⁵ ccu/ml, cerca de 1x10⁶ ccu/ml, cerca de 5x10⁶ ccu/ml, cerca de 1x10⁷ ccu/ml, cerca de 5x10⁷ ccu/ml, e qualquer faixa das mesmas (tal como, por exemplo, cerca de 1x10⁵ ccu/ml a cerca de 1x10⁶ ccu/ml).

As cepas de Mycoplasma gallisepticum da presente invenção podem ser administradas a aves para reduzir a suscetibilidade a infecção por Mycoplasma gallisepticum. Com a administração referida, os materiais não resultam em importantes sinais clínicos ou lesões indicativos de Mycoplasma gallisepticum. Os presentes materiais persistem, não são produzi

16/48 dos por engenharia genética, têm baixa virulência, aumentada estabilidade acima de muitas passagens in vivo, não têm aumento na virulência quando passada de volta cinco vezes, e/ou permanecem essencialmente no sistema respiratório. Os presentes materiais não transmitem para ovos, ou transmitem para ovos em uma taxa muito baixa. Além disso, a presente invenção pode deslocar cepas selvagens virulentas e deslocar cepas endêmicas circulantes de operações de aves domésticas.

Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar materiais imunológicos que não resultam em importantes sinais clínicos ou lesões indicativos de doença por MG. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos que persistem no trato respiratório superior por no mínimo cinco meses. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos que não são produzidos por engenharia genética. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos de baixa virulência. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos que tenham aumentada estabilidade sobre muitas passagens in vivo. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos sem aumento na virulência quando passada de volta no mínimo cinco vezes. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos que permanecem essencialmente no sistema respiratório. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos que não transmitem para ovos, ou transmitem para ovos uma taxa muito baixa. É outro objetivo proporcionar materiais imunológicos que previnem infecção com cepas selvagens virulentas e portanto deslocam cepas endêmicas circulantes de operações de aves domésticas.

Sem desejar ser limitado por qualquer uma teoria em particular, as cepas de MG da presente invenção estimulam a imunidade e persistem na mucosa respiratória de aves tratadas, especialmente no trato respiratório superior. Portanto, um resultado benéfico do tratamento de aves com os presentes materiais é a capacidade dos materiais para excluir cepas de campo virulentas de colonizar o trato respiratório superior. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, cepas de campo incluem quaisquer cepas presentes no ambiente das aves, incluindo cepas selvagens, ou cepas que estão presentes em aves domésticas misturadas em virtude de prévias

17/48 tentativas na vacinação. A quantidade administrada pode ser a quantidade necessária para colonizar o trato respiratório superior de qualquer ave individual, ou qualquer dado bando, preferencialmente por um período suficiente para proporcionar proteção contra invasão por cepas selvagens virulentas. A quantidade administrada pode ser suficiente para colonizar o trato respiratório de uma ave.

As cepas de Mycoplasma gallisepticum (MG) da presente invenção podem ser cultivadas em cultura de acordo com, mas não limitadasao, seguinte protocolo. Meio de Frey para o isolamento de micoplasmas aviários:

Caldo de Micoplasma base 22,5 g

Dextrose 3 g

Soro suíno 120 ml

Extrato de levedura 35 ml

Vermelho fenol (1%) 2,5 ml

Acetato de tálio (10%)^A 6 ml

Ampicilina 1 g/litro^A

Combinar os reagentes e q.s. até 1000 ml com água destilada.

^A- Acetato de tálio e ampicilina podem ser omitidos ao trabalhar com culturas de MG puro, tal como em produção de vacina comercial.

Ajustar o pH para 7,8 com 20% de NaOH e esterilizar por filtro.

Outros fatores de crescimento e conservantes podem ser usados em vez daqueles listados acioma sem se afastar do âmbito da invenção.

Para meio de ágar usar 1% de um ágar purificado tal como ágar iônico no. 2, ágar Noble, ou ágar purificado Difco. Todos os componentes exceto soro e ampicilina são esterilizados por autoclave a 121 °C por 15 minutos. Resfriar até 50°C e adicionar asseticamente soro e ampicilina, os quais foram pré-esterilizados por filtração e aquecidos até 50°C. Misturar e verter as lâminas até uma profundidade de aproximadamente 5 mm.

A invenção também proporciona um kit incluindo cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum, e/ou uma progênie ou derivado da mesma descritos aqui, neste requerimento de patente. O kit pode incluir um ou mais

18/48 recipientes preenchidos com um Mycoplasma gallisepticum da presente invenção. A cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum pode ser liofilizada. O kit pode incluir recipientes adicionais, separados de outras cepas de Mycoplasma gallisepticum ou outros patógenos de aves domésticas. Adicionalmente, o kit pode incluir outros reagentes tais como tampões e também são incluídas soluções necessárias para praticar a invenção. Opcionalmente associadas com os referidos um ou mais recipientes pode haver uma nota ou instruções impressas. Um kit da presente invenção pode incluir material de acondicionamento. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo material de acondicionamento se refere a uma ou mais estruturas físicas usadas para alojar os conteúdos do kit. O material de acondicionamento é construído por métodos de conhecimento geral, preferencialmente para proporcionar um ambiente estéril, livre de contaminantes. O material de acondicionamento pode ser uma matriz sólida ou um material tal como vidro, plástico, papel, folha fina de metal, e similares. Portanto, por exemplo, uma embalagem pode ser um frasco de vidro ou de plástico usado para conter quantidades em ccu da cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum.

A presente invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos. Deve ser entendido que os exemplos, materiais, quantidades, e procedimentos particulares devem ser interpretados amplamente de acordo com o âmbito e o espírito da invenção conforme determinado aqui, neste requerimento de patente. Para qualquer método descrito aqui, neste requerimento de patente, que inclui etapas distintas, as etapas podem ser conduzidas em qualquer ordem viável. E, conforme apropriado, qualquer combinação de duas ou mais etapas pode ser conduzida simultaneamente.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Mycoplasma gallisepticum Cepa K5831

Estudos de Dose Mínima

Este exemplo investiga a dose mínima infecciosa e a dose mínima protetora de Mycoplasma gallisepticum (MG) cepa K5831 como uma vacina viva em frangos. Oitenta frangos do tipo galinha poedeira comercial

19/48 foram adquiridos com oito semanas de idade a partir de uma fonte conhecida por ser livre de MG e MS e alojados em oito galinheiros. Os frangos foram triados para a presença de micoplasma por cultura e sorologia na chegada. Os resultados da triagem pré-vacinação dos frangos foram negativos para a presença de micoplasma e anticorpos.

Para triagem sorológica, os soros foram analisados para anticorpos contra MG usando o teste de aglutinação de lâmina de soro (SPA) usando antígeno comercial (Intervet America, Millsboro, Del), e o teste de inibição de hemaglutinação (HI) com antígeno preparado a partir de cepa A5969 e eritrócitos de frango. O teste de SPA e de inibição de hemaglutinação foram realizados de acordo com procedimentos descritos por Kleven (Kleven, S. H. Mycoplasmosis. Em: A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, Four ed. D. E. Swayne, J. R. Glisson, M. W. Jackwood, J. E. Pearson e W. M. Reed, eds. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA. pp 74-80. 1998). Um escore de SPA >1 foi considerado positivo. Um título de HI de 1:20 foi considerado suspeito e > 1:40 foi considerado positivo. Ensaios imunosorventes ligados a enzima comerciais (ELISA) também foram realizados sobre os soros (IDEXX, Westbrook, Maine).

Para o isolamento e identificação de micoplasma, foram suados esfregaços de algodão de fissura coanal, traqueia, sacos de ar ou vários sítios para distribuição corporal para cultura. Os esfregaços foram inoculados em caldo modificado de Frey e ágar e incubados a 37°C por um mínimo de três semanas. Isolados de micoplasma foram identificados usando imunofluorescência direta.

Para determinar a dose mínima infecciosa, seis grupos de doze frangos foram vacinados através de aerosol com diluições de K5831B-19 de 10⁷ unidades de troca de cor/ml (ccu/ml) a 10² ccu/ml. Em três dias pós estímulo foi realizado esfregaço dos frangos e foram cultivados para MG. Em cinco semanas pós vacinação os frangos foram sangrados e cultivados. Uma dose de 6,22 x 10⁶ ccu/ml infectou dez dos doze frangos (83%); uma dose de 6,22 x 10⁵ ccu/ml infectou quatro de doze frangos (33%) e uma do

20/48 se de 6,22 x 10⁴ ccu/ml infectou dois de doze frangos (17%). Em 33 dias pós vacinação os grupos vacinados com 6,22 x 10⁶ ccu/ml e 6,22 x 10 ⁵ ccu/ml de K5831B-19 foram 100% positivos para MG por cultura. Estes achados estão resumidos na tabela 1.

Tabela 1. Dose mínima infecciosa. Isolamento de MG das traqueias de frangos 3 dias pós vacinação (aerossol) com K5831B-19^A.

	Dose da Vacina	isolamento de MG (Traqueia)
	Nenhuma	0/11a
	6,22 x 101	0/11a
	6,22 x 102	0/7a
	6,22 x 103	0/9a
	6,22 x 104	2/12ab
	6,22 x 105	4/12b
	6,22 x 106	10/12c
	^Valores dentro de uma coluna com um sobrescrito em letra minúscula diferente são significativamente diferentes (P< 0,05) bN° de amostras positivas/ N° de amostras testadas

Para determinar a dose mínima protetora, em seis semanas pós vacinação os frangos foram estimulados com a cepa R. Um grupo serviu como controles estimulados não vacinados e um segundo grupo não estimulado como controles negativos. As aves foram necropsiadas em dez dias pós estímulo e avaliadas por classificação da lesão do saco de ar, sorologia, cultura e espessura da mucosa da traqueia e pontuação. Os grupos vacinados com 6,22 x 10⁶ ccu/ml e 6,22 x 10⁵ ccu/ml de K5831B-19 tiveram escores médios de lesões de saco de ar e medições médias da mucosa da traqueia significativamente menores quando comparados com os controles de estímulo não vacinados. A dose de vacina de 6,22 x 10⁶ ccu/ml também resultou em significativamente menos isolamentos de MG dos sacos de ar das aves quando comparados com os controles. Análise por RAPD de alguns dos isolados dos grupos vacinados com 6,22 x 10 ⁶ ccu/ml e 6,22 x 10⁵

21/48 ccu/ml de K5831B-19 mostraram que os isolados podem ser culturas mistas de cepa R e K5831B-19. Estes resultados estão resumidos na tabela 2.

Portanto, 6,22 x 10⁵ ccu/ml de K5831B-19 é o título mínimo necessário para infectar e induzir proteção de vacina adequada. Embora somente 33% dos frangos tenham sido inicialmente infectados por esta dose, 30 dias depois 100% do grupo foi infectado e a proteção foi boa. Um título de 6,22 x 10⁶ ccu/ml resultou em melhor proteção. Esta dose mínima pode ser afetada por muitos fatores incluindo o método de administração, alojamento e ambiente.

Exemplo 2

Mycoplasma gallisepticum Cepa K5831

Transmissibilidade e Excreção

Este exemplo investiga o potencial de Mycoplasma gallisepticum (MG) cepa K5831 para transmitir a partir de frangos infectados para frangos naive. A persistência (excreção) de K5831B-19 no trato respiratório de aves vacinadas foi investigada.

Procedimento

Cento e vinte e cinco frangos machos do tipo poedeira foram adquiridos de uma fonte livre de Mycoplasma. As aves foram alojadas em galinheiros. Houve quatro grupos (35, 15, 20 e 20 frangos em cada galinheiro) para o estudo de transmissibilidade e um grupo de 35 frangos para o estudo de excreção. Cinco frangos com três semanas de idade foram triados para Mycoplasma por cultura e sorologia.

Transmissibilidade. 35 frangos com quatro semanas de idade no grupo de frangos semeadores foram infectados com K5831B-19 através de aerossol. Cinco destes frangos foram então misturados com o grupo de 15 contatos diretos. Vinte frangos foram colocados em uma gaiola imediatamente adjacente aos contatos diretos (contatos através de arame). Outro grupo de 20 frangos foi colocado em uma gaiola separada dos contatos diretos por um galinheiro vazio (contatos através de gaiola vazia). Os quinze contatos diretos e cinco frangos de cada um dos grupos de contato através de arame e de contato através de galinheiro vazio foram sangrados para

22/48 sorologia e esfregaços foram obtidos para cultura de micoplasma em 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas pós inoculação dos semeadores. Os cinco semeadores velhos foram removidos (sangrados e feitos esfregaços) e substituídos com cinco novos semeadores em cada sangria/ esfregaço. Em 20 semanas 5 pós inoculação todas as aves foram sangradas, cultivadas e submetidas a eutanásia.

Excreção. 35 frangos com quatro semanas de idade foram inoculados com K5831B-19 através de aerossol. Em 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas pós inoculação cinco frangos foram removidos e avaliados por soro10 logia, cultura de esfregaços de traqueia e de saco de ar e histopatologia da traqueia.

23/48

Tabela 2. Dose mínima protetora. Reação sorológica, escores das lesões e isolamento de MG a partir de frangos 10 dias pós estímulo com cepa R^A.

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E co

CD E

CD o E as φ

CD o tn as

CD o E as φ

Grau de aglutinação média (de 0 a 4).

Título médio Iog10

Proporção de amostra média/ positiva

Classificados macroscopicamente de 0 a 4

Espessura média (pm)

E co

24/48

Resultados

Transmissibilidade. Resultados de transmissibilidade são apresentados na tabela 3. Em quatro semanas pós introdução (PI) dos semeadores, uma ave misturada (contato direto) estava cultura positiva para 5 K5831B-19. Em oito semanas pós introdução os contatos diretos tinham um baixo nível de infecção (2/15) por cultura e sorologia. Em dezesseis semanas pós introdução a maioria dos contatos diretos (12/14) estavam infectados com K5831B-19. A vacina não transmitiu para aves em um galinheiro adjacente separado por tela metálica ou para aves separadas por um gali10 nheiro vazio. Estes dados são apresentados graficamente na figura 1.

Tabela 3. (Transmissibilidade). Reação sorológica e isolamento de MG a partir da fissura coanal de frangos pós estímulo com a cepa K5831B-19 por gota ocular (semeadores), contato direto, contato indireto entre galinheiros contíguos (adjacentes) ou com um galinheiro vazio separando.

Semanas Pós Estímulo	Contato com K5831B-19	SPA	HI	ELISA	isolamento de MG
1	Semeadores	5/5A (4,0)B	3/5 (0,8)C	0/5 (0,0)D	5/5
Direto	0/15(0,0)B	0/15(0,0)	0/15(0,0)	0/15
Adjacente	1/5 (0,2)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
Galinheiro vazio	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
2	Semeadores	5/5 (4,0)	5/5(1,5)	0/5 (0,1)	5/5
Direto	0/15(0,0)	0/15(0,0)	0/15(0,0)	0/15
Adjacente	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
Galinheiro vazio	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
4	Semeadores	5/5 (4,0)	5/5(1,8)	5/5 (0,9)	5/5
Direto	0/15(0,0)	0/15(0,0)	0/15(0,0)	1/15
Adjacente	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
Galinheiro vazio	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
8	Semeadores	5/5 (4,0)	5/5 (1,9)	5/5 (2,1)	5/5
Direto	2/15(0,5)	3/15(0,3)	0/15(0,1)	2/15
Adjacente	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
Galinheiro vazio	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5

25/48

Semanas Pós Estímulo	Contato com K5831B-19	SPA	HI	ELISA	isolamento de MG
12	Semeadores	5/5 (4,0)	5/5(1,7)	5/5 (2,2)	5/5
Direto	1/15(0,3)	1/15(0,1)	1/15(0,1)	1/15
Adjacente	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
Galinheiro vazio	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
16	Semeadores	5/5 (3,8)	5/5 (1,8)	5/5 (3,0)	5/5
Direto	11/14(2,6)	10/14(1,2)	6/14 (0,6)	12/14
Adjacente	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
Galinheiro vazio	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5 (0,0)	0/5
20	Semeadores	4/4 (4,0)	5/5(1,8)	4/4 (2,3)	4/5
Direto	13/14(3,7)	13/14(1,7)	13/14 (1.4)	13/14
Adjacente	0/20 (0,0)	0/20 (0,0)	0/20 (0,0)	0/18
Galinheiro vazio	0/20 (0,0)	0/20 (0,0)	0/20 (0,0)	0/18

^A N° de amostras positivas/ N° de amostras testadas (SPA: >1, HI: > 40, e

ELISA: > 0,6) ^B Grau de aglutinação média (de 0 a 4).

^c Título Médio Log10 ^D Proporção geométrica de amostra média / positiva + desvio padrão

26/48

Tabela 4. Reação sorológica e isolamento de MG de frangos pós inoculação com K5831B-19^A.

isolamento de MG	Sacos de ar	as	2/5ab	1/5b	0/5b	0/5b	_Q LO —, O	0/5b	AValores dentro de uma coluna com um sobrescrito de letra minúscula diferente são significativamente diferentes (P< 0,05) bNo. de amostras positivas/ No. de amostras testadas (SPA: >1, HI: >20, e ELISA: > 0,5) c Grau de aglutinação média (de 0 a 4).
Traqueia	5/5a	05 LO LO	as LO LO	5/5a	5/5a	05 CO	3/5a
Escore traqueal	o o	0,0	0,0	0‘0	0,2	o o	0‘0
Espessura da mucosa da traqueia	60,6 ±8,0	58,4 ± 10,8	69,7 ±7,6	89,2 ± 9,6	192,2 ± 94,3	CM IO +1 CD CD t— r—	134,1 ±30,4
Escore de lesão de saco de ar	0/5	0/5	0/5	0/5	LO —. O	LO — O	0/5
ELISA	0/5 (0,01 )Ea	0/5 (0,19)a	2/5 (0,39)ab	5/5(1,36)bc	O t— cm LO LO	T) O 00 CM LO LO	00 LO CM LO LO
T	4/5(1,1)Da	5/5(1,5)ab	5/5 (1,8)b	5/5 (1,7)b	6q T— LO LO	5/5 (1,8)b	5/5 (1,7)ab
SPA	o o m LO — LO	5/5 (4,0)	5/5(4,0)	5/5(4,0)	O LO — LO	o LO IO	5/5 (4,0)
Semanas Pós estímulo	v	CM		00	OI	CD	20

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27/48

Excreção. Os resultados de excreção são apresentados na tabela 4. K5831B-19 foi reisolado de aves vacinadas até 20 semanas pós vacinação em cujo tempo o estudo foi concluído. A incidência de re-isolamento dos sacos de ar e traqueia diminuiu com o tempo. A vacina estava ausente dos sacos de ar por volta de oito semanas pós vacinação e a incidência de recuperação da traqueia diminuiu para 60% (3/5) em 20 semanas pós vacinação. As aves continuaram a ser soropositivas em 20 semanas pós vacinação. Estes dados são apresentados graficamente na figura 2.

Neste estudo a maioria dos frangos misturados permaneceu negativo até 20 semanas de idade depois do início da maturidade sexual. Pode ser concluído que K5831B-19 tem uma taxa de transmissão relativamente baixa. Neste estudo, K5831B-19 persistiu no trato respiratório superior pela duração do estudo (cinco meses).

Exemplo 3

Mycoplasma gallisepticum Cepa K5831

Passagem de Volta em frangos

Este exemplo investiga o potencial de Mycoplasma gallisepticum (MG) cepa K5831 para causar doença em frangos depois de cinco passagens de volta em frangos. A distribuição de MG no corpo de frangos estimulados também foi investigada.

Procedimentos

Passagem de volta. Vinte e cinco frangos SPF foram adquiridos com três semanas de idade e alojados em cinco unidades de isolamento. Um grupo de cinco frangos foi estimulado com K5831B-19 através de gota ocular. Em uma semana pós estímulo a traqueias destas aves foram esfregadas e estes esfregaços foram usados para infectar um segundo grupo de cinco frangos. K5831B-19 foi passado de volta desta maneira cinco vezes. MG foi reisolado de frangos infectados por inoculação dos esfregaços traqueais em caldo de Frey modificado depois dos esfregaços serem usados para transferir a infecção (K5866, K5969, K5872, e K5876). O reisolado final de K5831B-19 (K5883-2) foi usado no estudo de estímulo.

Estímulo. Oitenta frangos do tipo poedeira comercial foram ad

28/48 quiridos de uma fonte conhecida por ser livre de MG e MS. Estes frangos foram alojados em quatro casas de colônia. Com quatro semanas de idade, oito frangos foram triados para assegurar que eles estavam livre de MG por sorologia e cultura. Com cinco semanas de idade, três dos grupos de frangos foram estimulados com culturas de fase de log de K5831B-19 (2,59 x10⁸ CCU/ml), K5883-2 (1,21x10⁷ccu/ml), e cepa R (1,15x10⁸ ccu/ml). Um grupo não foi estimulado (controles negativos). As aves foram necropsiadas em dez dias pós estímulo e avaliadas por classificação da lesão do saco de ar, sorologia, e cultura.

Distribuição Corporal. Além da traqueia e sacos de ar, seis sítios (rim, fígado, bursa, pulmões, tonsila cecal, e baço) de cinco aves estimuladas com K5831B-19 (2,59 x10⁸ ccu/ml) acima foram cultivados.

DNA polimórfico amplificado randômico (RAPD). Análise RAPD foi usada para impressão digital de isolados de MG. Análise RAPD e sequenciamento direcionado para quatro genes (pvpA, mgc2, gapA e MGA_0319) foram usados para comparar K2101, K5831B-19 e K5883-2. O procedimento e iniciadores usados foram conforme descrito por Fan et a/.(Fan etal., 1995, Avian Dis; 39: 729-735).

Análise de sequência de DNA. Sequências de DNA de isolados e cepas de referência foram analisadas e comparadas conforme previamente descrito (Ferguson et al., 2003, Avian Dis; 47(3): 523-30). As sequências do gene pvpA (Boguslavsky et al., 2000, Infect Immun; 68: 3956-3964; e Liu et al., 2001, J Clin Microbiol; 39: 1882-1888), uma sequência de lipoproteina (MGA_0319) (Nascimento et al., 1991, Avian Dis; 35: 62-69), gapA (Goh et al., 1998, Microbiol; 44: 2971-2978; e Keeler et al., 1996, Infect Immun; 64: 1541-1547), e o gene mgc2 de citadesina (Hnatow et al., 1998, Infect Immun; 66: 3436-3442) foram comparados conforme previamente descrito (Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151: 1883-1893). Foi realizada análise de sequência com MegAlign (DNASTAR, Lasergene, Inc. Madison, Wisconsin).

PCR em tempo real de diferenciação de cepas quantitativo. As laringes de aves necropsiadas foram coletadas em tubos de 4 ml de PBS estéril. Um ml de uma lavagem laringeal (depois de turbilhonar as amostras

29/48 por 30 segundos) foi usado para extração de DNA. Os extratos de DNA foram submetidos a PCR em tempo real de Taqman com iniciadores e sondas capazes de diferenciação entre as vacinas (K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, cepa F) e cepa R. A análise foi tornada quantitativa plotando o número do ciclo de limiar (Valor CT) sobre curvas-padrão determinadas previamente junto com controles padronizados para as reações. (Raviv et. al., 2008, Vet Microbiol; 129(1-2): 179-87).

Resultados

Passagem de volta. Análise RAPD e de sequência de K5831B19 e K5883-2 não apresentaram alterações genéticas resultantes de passagem de volta. Ambas demonstram um padrão RAPD de K2101. Os resultados da análise RAPD são mostrados nas figuras 7 e 8.

Estímulo. Os resultados do estímulo são apresentados na Tabela 5. Estímulo com o isolado passado de volta (K5883-2) não resultou em um aumento significativo em lesões macroscópicas (escores dos sacos de ar) quando comparados com estímulo com ο K5831B-19 original e controles negativos (P< 0,05).

Distribuição corporal. MG foi recuperado dos pulmões (5/5) bem como das traqueias (20/20) de aves estimuladas com K5831B-19. MG também foi reisolado de 6 de 20 (30%) dos sacos de ar destes frangos. Não houve isolamentos dos estudos de rim, fígado, bursa e cecais.

Tabela 5. Passagem de volta de K5831B-19. Reação sorológica e escores das lesões de frangos 10 dias pós estímulo com K5831B-19, K883-2, ou cepa R^a

Estímulo	SPA	HI	ELISA	Escore de lesão de saco de ar	isolamento de MG
Traqueia	Sacos de ar
Nenhum	0/20b	0/20 (0,0)Da	1/20	0/20 (0,0 )Fa	0/20a	0/20a
K5831B-19	20/20	0/20 (0,0)a	0/20	0/20 (0,0)a	20/20b	6/20b
K5883-2	20/20	17/20 (1,2)b	9/20	1/20 (0,1 )a	20/20b	15/20c
cepa R	20/20	20/20 (1,9)c	17/20	18/20 (2,0)b	20/20b	19/20c

^AValores dentro de uma coluna com um sobrescrito de letra minúscula dife30/48 rente são significativamente diferentes (P< 0,05) ^bNo. de amostras positivas/ No. de amostras testadas (SPA: >1, HI: >20, e ELISA: > 0,5, Escore do saco de ar > 1) ^cGrau de aglutinação média (de 0 a 4).

^D Título médio log 10 ^E Proporção de amostra média/ positiva ^F Escore médio

Discussão

K5831B-19, uma cepa de MG que ocorre naturalmente de baixa virulência pode ter a vantagem de aumentada estabilidade durante muitas passagens in vivo quando comparada com cepas de vacina atenuadas de laboratório. Este exemplo demonstra que não houve aumento na virulência de K5831B-19 quando passada de volta cinco vezes através de frangos e são avaliadas as lesões macroscópicas depois do estímulo. A partir da análise da distribuição corporal, este exemplo também demonstra que K5831B19 permanece essencialmente no sistema respiratório de aves estimuladas. Exemplo 4

Transmissão Vertical da Cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum

Este exemplo investiga o potencial da cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum (MG) para transmitir de frangos infectados para embriões.

Procedimentos

Trinta frangos do tipo poedeira fêmeas e nove machos foram adquiridos de uma fonte livre de Mycoplasma. As aves foram alojadas em três galinheiros (dez fêmeas e três machos por galinheiro). Com 25 semanas de idade (aproximadamente 80% da produção) cinco frangos foram triados para Mycoplasma por cultura e sorologia. Com 25,3 semanas de idade os frangos foram estimulados por aerossol com K5831B-19 (6,2 x 10⁸ ccu/ml). Os ovos foram coletados diariamente a partir de 24 semanas de idade até o fim do estudo. Os sacos vitelinos de embriões incubados de 18 dias de idade foram cultivados para Mycoplasma. Com 32 semanas de idade os frangos foram necropsiados e avaliados.

31/48

Resultados

Os frangos eram negativos para Mycoplasma por sorologia e cultura na triagem pré-vacinação.

Cultura de embriões. Mycoplasma não foi recuperado de qualquer um dos embriões durante o estudo.

Traqueia e saco de ar cultura. MG foi recuperado de 35/36 (97%) dos esfregaços traqueais mas de somente 4/36 (11%) dos esfregaços de saco de ar em sete semanas pós vacinação.

Sorologia. Em sete semanas pós vacinação todos os frangos tinham soroconvertido para MG.

Lesões traqueais e do saco de ar. Não foram vistas lesões do saco de ar na necrópsia. Alguns dos pássaros tiveram lesões traqueais muito brandas consistindo em infiltração linfocítica, hiperplasia da glândula mucosa, e perda de cílios.

Para a avaliação de lesões, as lesões em frangos necropsiados durante o estudo foram avaliadas macroscopicamente por pontuação das lesões do saco de ar em uma escala de 0 a 4 (Kleven et a!., 1972, Avian Dis; 16: 915-924). As lesões traqueais foram avaliadas microscopicamente medindo a largura da mucosa da traqueia. Uma seção foi coletada dó terço superior da traqueia (aproximadamente uma polegada distai da laringe) e fixada em 10% de formalina neutra. A espessura da mucosa da traqueia foi medida em quatro pontos equidistantes sobre lâminas histológicas de seções transversais das traqueias. As lesões traqueais também foram classificadas de 0 a 3. Com a análise estatística, escores de lesões de saco de ar, escores traqueais e escores de SPA foram analisados usando o teste de somas de pontuações de Kruskal-Wallis (Kruskal-Wallis Rank Sums). A espessura média da mucosa da traqueia, Iog10 dos títulos de HI, proporções ELISA S/P, e números de cópias log 10 foram analisados usando o teste de HSD de Tukey-Kramer. JMP® Statistics Made Visual (SAS Institute Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC 27513).

Discussão

Com este exemplo, não foi detectado K5831B-19 em ovos em

32/48 brionados. A cepa deve se tornar sistêmica para passar através do trato reprodutivo para a ninhada. A partir de estudos anteriores, K5831B-19 parece permanecer essencialmente no trato respiratório superior e embora possa ser recuperado desta área por períodos de tempo relativamente longos depois da vacinação (até 20 semanas), a recuperação dos sacos de ar é mais variável e diminui acima de umas poucas semanas. Este exemplo também demonstra que, se K5831B-19 é transmitido através dos ovos de qualquer modo, é em uma taxa muito baixa que não pode ser detectada sob estas condições experimentais.

Exemplo 5

Deslocamento de Vacina de Mycoplasma gallisepticum

Este exemplo investiga o potencial das vacinas de Mycoplasma gallisepticum (MG) K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, e cepa F para deslocar cepas virulentas em frangos infectados.

Procedimentos

Cento e vinte e sete frangos do tipo poedeira livres de MG/MS foram adquiridos com um dia de idade a partir de uma fonte comercial. Com três semanas de idade, dez frangos foram triados para Mycoplasma por cultura e sorologia. Com oito semanas de idade, grupos de 20 frangos foram vacinados com K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, e cepa F. Com 13,3 semanas de idade um grupo de 12 frangos (semeadores) foi inoculado com cepa R através de gota ocular. Com 14 semanas de idade, cinco frangos de cada um dos grupos vacinados foram necropsiados e avaliados (Necrópsia 1). Nesta ocasião (seis semanas pós vacinação), dois semeadores foram misturados com os 15 frangos restantes em cada um dos grupos vacinados e 15 frangos naive (controles estimulados). Os frangos foram estressadas por vacinação com Newcastle e Bronquite Infecciosa neste momento. Duas semanas depois da introdução dos semeadores, cinco aves de cada um dos grupos foram removidas, necropsiadas e avaliadas (Necrópsia 2). Este procedimento foi repetido em quatro e oito semanas pós estímulo (Necrópsias 3 e 4). Em cada necrópsia, a avaliação consistiu de cultura, sorologia, pontuação das lesões do saco de ar, histopatologia das traqueias, e análise por

33/48

PCR quantitativa (Q-PCR).

Vacinação. As vacinas de 6/85 (Mycovac-L® Intervet, Millsboro, DE) e de cepa F (F Vax-MG® Schering-Plough Animal Health Corporation, Summit, NJ) foram administradas por pulverização de gota grossa usando um pulverizador de tinta comercial (Preval Sprayer Division, Precision Valve Corporation, Yonkers, NY). Estas vacinas liofilizadas foram reconstituídas de acordo com as instruções do fabricante com água destilada até uma concentração de 1 dose/ml. K5831B-19 e K5054 também foram administradas por pulverização de gota grossa como culturas crescendo ativamente recentes. As culturas de fase de log foram diluídas a 1:10 com caldo modificado de Frey antes da aplicação para aproximar mais de perto a dose das vacinas comerciais. Aproximadamente um mililitro (ml) de cultura foi administrado por ave. A vacina ts-11 (Merial Select, Gainesville, GA) foi administrada descongelada por gota ocular de acordo com as instruções dos fabricantes. Todos os grupos também foram vacinados com Bronquite e Newcastle (Poulvac® Aero, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) através de pulverização de gota grossa de acordo com as instruções dos fabricantes.

Estímulo. A cepa R é uma cepa de MG virulenta. Foi administrada por gota ocular (100 pl/ ave) aos semeadores.

Resultados

Sorologia. A partir dos resultados sorológicos da primeira necrópsia (seis semanas pós vacinação) todos os grupos vacinados tinham soroconvertido para MG com exceção do grupo vacinado com 6/85. O grupo ts-11 soroconverteu menos fortemente do que os grupos vacinados com K5831B-19, K5054 e cepa F. Ambos os grupos 6/85 e ts-11 ficaram defasados atrás dos outros grupos em termos de soroconversão até quatro a oito semanas depois da introdução dos semeadores.

Lesões do Saco de ar. Em duas semanas depois da introdução dos semeadores algumas das aves tiveram lesões brandas do saco de ar, provavelmente associadas com a vacinação de Bronquite e Newcastle.

Lesões da Traqueia. A análise de reações da traqueia foi complicada pela introdução do vírus da vacina NDV/IB. Também houve alguma

34/48 reação nos grupos antes da introdução de semeadores e vírus de vacina que podem ter sido associados com diferenças ambientais entre as casas.

PCR. Os grupos vacinados com K5831B-19 e cepa F reduzem os números de cópias Iog10 de cepa R do começo ao fim do estudo quando 5 comparados com as outras vacinas e os controles não vacinados. Estas diferenças não foram sempre significativas. Não houve 6/85 detectados no grupo vacinado com 6/85 até a necrópsia final em oito semanas depois da introdução dos semeadores. Deve ser observado que todos os semeadores foram infectados com as vacinas respectivas.

Discussão

Os resultados deste exemplo são apresentados nas tabelas 6 e 7 e nas figuras 3 a 6. Este exemplo demonstra que as vacinas das cepas K5831B-19 e F resultaram nos menores números de cópias log 10 de cepa R, indicando menor colonização com cepa R. Estas vacinas podem ser muito úteis para 15 prevenir infecção com cepas selvagens virulentas e portanto deslocar cepas endêmicas circulantes de operações de aves domésticas.

35/48

Tabela 6. Reação sorológica, escores de lesões, isolamento de MG e PCR quantitativo de frangos vacinados misturados com semeadores infectados com -cepa R^A.

Q-PCR

cepa R

ND

0/5 (0,0 ± 0,0)G

o' θ’ +1 O o’ ID δ

0/5 (0,0 ± 0,0)

0/5 (0,0 ± 0,0)

0/5 (0,0 ± 0,0)

5/5 (4,2 ± 0,8)a

ro ID cm’ Ή CO ID δ

ro cm 44 cm ID

0/5 (0,0 ± 0,0)b

5/5 (4,0 ± 2,3)a

XJ ro +1 CD o’ JO

VacinaB

N/A

0/5 (0,0 ± 0,0)G

z—K +1 ID CM ID ID

5/5 (4,7 ± 0,9)

4/5 (3,3 ±2,3)

3/5 (1,7 ±1,7)

V/N

0/5 (0,0 ±0,0)

3/5 (3,5 ± 3,2)

5/5 (4,8 ± 0,7)

2/5 (0,6 ± 0,8)

5/5 (3,7 ± 0,8)

Isolamento de MG (Fissura Coanal)

ND

0/5

ID

5/5

5/5

5/5

5/5

ID

5/5

5/5

3/4

5/5

Escore Traqueal

ND

XJ O o’ Ή O o’

X2 O o’ +1 o o’

XI O o’ 44 o’

1,4 ± 0,5a

1,8 ± 0,4a

CO σ> o’ 44 co cm’

o ID o’ +1 CD o’

o Λ Ο o’ +1 o V

CQ ID o’ +1 CD cm’

ro O_ Ή O cm’

XJ CQ^ o' 44 O cm

Espessura da mucosa da tra- queia

ND

107,5 ± 12,8b

Λ ID~ Ή CO o’ o

XJ ID 44 co ID’ o

XJ ro O LO Ή CO N

co IO_ co’ ID +1 Ο co O

581,1 ± 264,0a

149,8 ± 30,5b

x> CD_ +1 ID co’ ID

XJ CQ^ o’ CM +1 LO 5

ro CO ID CO +1 LO σ> co

CQ ID cd’ σ> 44 co co O co

Escore de lesão de saco de ar

ND

ND

Q Z

ND

ND

ND

3/5 (0,8)

1/5 (0,2)

1/5 (0,4)

1/5 (0,2)

1/5 (0,2)

1/5 (0,2)

ELISA

ND

σΓ o’ io δ

CO co o’ ID δ

5/5(2,01)

4/5 (0,63)

5/5 (3,33)

4/5 (0,86)

0/5(0,13)

2/5 (0,55)

5/5 (3,00)

5/5(2,11)

5/5 (2,42)

ΞΕ

ND

3(0‘0) 9/0

a? o’ ID δ

5/5(1,4)

5/5(1,4)

5/5(1,9)

5/5(1,5)

0/5 (0,0)

1/5 (0,3)

5/5(1,7)

5/5 (1,7)

5/5(1,7)

SPA

ND

Q o' o’ o ID δ

co CM ID

5/5 (3,6)

5/5 (3,8)

5/5 (4,0)

5/5 (3,4)

0/5 (0,0)

5/5 (2,4)

5/5 (4,0)

5/5 (4,0)

5/5 (4,0)

Vacina

Nenhuma

6/85

τ- ι (/) M—»

K5831

K5054

cepa F

Nenhuma

6/85

ώ

K5831

K5054

cepa F

Semanas Pós Estímulo

o

CM

36/48

Continuação...

ΙΟ

37/48

ro π

ω ra ω

Uj

CO

CD

ΛΙ ω

C/J

LU ω

E

CD ω

ω Ui +1

ÇM CM

CO ra (D Q.

<D Φ ω ra

LU Φ ω ra Ό ra ω Φ

OT ω

E <D ω

O

E ω

LU

LO

Tabela 7. Reação sorológica, escores das lesões, isolamento de MG e PCR quantitativo de semeadores estimulados com cepa R e misturados com frangos vacinados.

ro o Ui <D E ra

Q Ui LU ro

Ui Ui CD Q.

Ui ra ra

Ui LU ra

0) ra (D

IO ra

O) ra ό ra >ra

Ui <D ra ura <fí O E 05

Φ o Φ Q.

Φ

O ω ra <fí O E 05

Φ

Grau de aglutinação média (de 0 a 4).

Título médio Iog10

Proporção de amostra média/ positiva

38/48

Exemplo 6

Patogenicidade de Mycoplasma gallisepticum cepa

K5831 em ovos embrionados

A patogenicidade de Mycoplasma gallisepticum (MG) cepaK5831 em ovos embrionados foi determinado por avaliação da dose letal do ovo embrionado (ELD₅o) e comparando com a da cepa R.

Dose letal do ovo embrionado (ELD₅₀). 0,2 mL de amostras diluídas a 100 a 10⁸ ccu/ml (K5831B-19 e cepa R) foi inoculado em dez ovos embrionados de seis dias através da via do saco vitelino. Acima de doze dias de incubação, os embriões foram examinados e a ELD₅₀ foi calculada. Resultados de este exemplo são mostrados nas tabelas 8 e 9.

Exemplo 7

Propriedades bioquímicas, biológicas e sorológicas de

Mycoplasma gallisepticum cepa K5831

Com este exemplo, as propriedades bioquímicas, biológicas e sorológicas de Mycoplasma gallisepticum (MG) cepa K5831 foram avaliadas. Procedimentos

As propriedades de K5831B-19 foram examinadas pelos seguintes testes:

1. Teste de fermentação de glicose

2. Teste de hidrólise de arginina

3. Teste de requisito de β-NAD

4. Teste de redução de tetrazólio

5. Teste de produção de filme e ponto

6. Teste de hemadsorção

7. Teste de inibição do crescimento (GIT)

8. Teste de inibição do metabolismo (MIT)

39/48

N° aprox de orgamsmos	1003.7E+07	893720000	75372000	4837200	283720	13372	637,2	03,72	00
% de Mortos	100	68	75	48	00 CM	CO 3^	CO	o	o
Proporção (Mortos/Total) I	o o	0,89	0,75	CO o	00 CM o'	0,13	0,06	o	o
Cumulativo	Não afetados	O	CO	<o	CN	00 V	26	34	CO	53
Mortos	CO	25	CO	T“	b-		CM	o	o
N° de não afetados	o	CO	CO	CO	<0	00	CO	σ>	O
N° de mortos (- trauma)	O)	b-	b*		CO	CM	CM	o	o
Resultados	6/6	o V	7/10	o	3/9	2/10	2/10	6/0	0/10
N° aprox de organismos (CCU)	10*7	10*6	10*5	10*4	10*3	10*2	10*1	O V”	o
Diluição	o		CM	CO		IO	CD		00

PD 0,92

Desfecho 3,72 x 10^4,9 (309416 organismos)

CO

40/48

Tabela 9. cepa R ELD;

N° aprox de organismos	100230000	10023000	962300	84230	5023	CO CM CD T—	o	PD0 Desfecho 2,3 x 101 (23 organismos) 5 Desfecho 2,3 x 10o·2 (3 organismos)
% de Mortos	100	100	96	s	09	CD v-
Proporção (Mortos/Total)	1,00	1,00	0,96	0,84	o *o o	CD T— o	0,04
Cumulativo	Não afetados	o	o		co	CO	CO v—	24
Mortos	44	CO	CM	CO	CO	CO
N° de não afetados	o	o		CM	u>	co	CO
N° de mortos (- trauma) ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________!	O r—	o	CO	00		CM	T—
Resulta- dos	10/10 _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________I	10/10	8/9	8/10	5/10	o T- CM	CD
N° aprox de organismos (CCU)	10*5	10*4	10*3	10*2	10*1	O	o
Diluição i	CM	co		IO	CD	h-	CO

41/48

Cada teste foi conduzido de acordo com métodos comuns descritos em mais detalhes em Methods in Mycoplasmology, Vol. I. S. Razin, J. G. Tully, Eds. 1983. Em resumo: para o teste de fermentação de glicose, os materiais foram meio de teste (caldo de Frey modificado (com glicose)), meio controle (caldo de Frey modificado sem glicose), e culturas de caldo de fase de log de cepas de teste. Método: diluições a 1:1000 das culturas de teste foram feitas no meio controle. 0,1 ml das culturas diluídas foram transferidos para tubos contendo o meio de teste e o meio controle. Os tubos foram incubados a 37°C por 24 horas e observados para mudança de cor.

Para o teste de hidrólise de arginina, os materiais foram meio de teste (caldo de Frey modificado com arginina), meio controle (caldo de Frey modificado (sem arginina)), e culturas de caldo de fase de log de cepas de teste. Método: diluições a 1:1000 das culturas de teste foram feitas no meio controle. As culturas diluídas foram inoculadas dentro de tubos contendo o meio de teste e o meio controle. Os tubos foram incubados a 37°C e observados por duas semanas para mudança de cor.

Para o teste de requisito de β-NAD, os materiais incluíram meio de teste (caldo de Frey modificado sem β-NAD), meio controle (caldo de Frey modificado (com β-NAD)) e culturas de caldoe de fase de log das cepas de teste. Método: diluições a 1:1000 das culturas de teste foram feitas no meio de teste. As culturas diluídas foram inoculadas dentro de tubos contendo o meio de teste e o meio controle. Os tubos foram incubados a 37°C e observados para crescimento (mudança de cor).

Para o teste de redução de tetrazólio, os materiais incluíram meio de teste (Caldo de Tetrazólio) e culturas de caldo de fase de log das cepas de teste. Método: diluições a 1:1000 das culturas de teste foram feitas no meio de teste. As culturas diluídas foram inoculadas dentro de tubos contendo o meio de teste. Os tubos foram incubados a 37°C e observados para crescimento e mudança de cor (rosa para púrpura avermelhado).

Para o teste de produção de filme e ponto, os materiais incluíram lâminas de ágar de emulsão de gema de ovo e culturas de caldo de fase de log das cepas de teste. Método: Cepas de teste foram inoculadas sobre

42/48 lâminas de ágar e incubadas a 37°C. As lâminas foram observadas diariamente por 2 semanas para filme e pontos.

Para o teste de hemadsorção, o material incluiu suspensão lavada a 10% de eritrócitos de frango em PBS e lâminas de ágar com colônias das cepas de teste. Método: suspensão a 0,5% de hemácias em 2 ml de PBS foi preparada e pipetada sobre lâminas de ágar. As lâminas foram incubadas a 37°C por 30 minutos. O excesso de suspensão de hemácias foi vertido e as lâminas foram lavadas com 5 ml de PBS. As lâminas foram examinadas para adsorção de hemácias a colônias.

Para o teste de inibição do crescimento (GIT), o material incluiu antisoros (MG e MS), discos de papel filtro absorvente estéril (6 mm de diâmetro), culturas de caldo de organismos de teste, e lâminas de ágar de Frey modificado. Método: Os discos foram saturados com antisoros MG ou MS. As lâminas foram inoculadas com 0,1 ml de culturas de teste diluídas e distribuídas uniformemente. O inóculo foi deixado para ser absorvido em temperatura ambiente. Os discos foram colocados sobre as superfícies do ágar inoculado no mínimo com dois cm de separação. As lâminas foram incubadas a 37°C e examinadas para evidência de zonas de inibição.

Para o teste de inibição do metabolismo (MIT), os materiais incluíram caldo de Frey modificado (com glicose e NAD), culturas de caldo de organismos de teste, antisoros (MG e MS), e Lâmina de microtítulo. Método: 25 pl de meio de caldo foi adicionado a todos os poços da lâmina de microtítulo. 25 μΙ de antisoros MG ou MS tratados com calor foi adicionado aos primeiros poços (exceto os controles) e diluído serialmente (duas vezes). 50 μΙ das culturas diluídas apropriadas (103 a 104 CCU/ml) foi adicionado a todos os poços apropriados exceto os controles. 125 μΙ de caldo foi adicionado a todos os poços exceto os controles (os quais receberam 175 μΙ de meio). As lâminas de microtítulo foram seladas e incubadas a 37°C. As lâmina foram lidas pela primeira vez depois de 72 horas de incubação.

Foram testadas as seguintes cepas:

K5831B-19

M. gallisepticum PG31

43/48

Mycoplasma synoviae WVU1853

M. iowae (Sorotipo I) (teste de hidrólise de arginina somente)

M. gallinarum (Sorotipo B) K285 (teste de produção de filme e ponto somente)

Resultados

A tabela 10 apresenta os dados destes estudos.

Tabela 10. Propriedades de Mycoplasma gallisepticum cepa K2101 (K5831B-19)

-	K5831 B-19	M. gallisepticum PG-31	M. synoviae WVU 1853	M. iowae (Sero. I)	M. galli- narum (Sero. B) K285
Fermentação de glicose	+	+	+	ND	ND
Hidrólise de arginina	-	-	-	+	ND
Requisito de β-NAD	-	-	+	ND	ND
Redução de tetrazólio	+	+	WA	ND	ND
Produção de filme e ponto	-	-	+	ND	+
Hemadsorção	+	+	+	ND	ND
Inibição do crescimento (GIT)	Anti- MG	5,5 B	7,5	0	ND	ND
	Anti-MS	0	0	4,5	ND	ND
Inibição do metabolismo (MIT)	Anti- MG	5120c	10240	<20	ND	ND
	Anti-MS	<20	<20	ND	ND	ND

Exemplo 8

Caracterização de Mycoplasma gallisepticum cepa K5831 por

Sequenciamento Direcionado ao Gene (Gene-Targeted)

Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 foi caracterizada por análise por sequenciamento direcionado ao gene (GTS) de porções do gene pvpA de cytadesina putativo, do gene gapA de cytadesina, do gene mgc2 de

44/48 cytadesina, e um gene codificando lipoproteina superficial hipotéticalnão caracterizada designado sequência de DNA codificante de genoma (CDS) MGA_0319, seguindo procedimentos descritos em mais detalhes em Ferguson et al. (Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151: 1883-1893), o qual é incorporado por meio de referência aqui, neste requerimento de patente.

Em resumo, ácido nucleico foi extraído de 150 a 250 pl de uma cultura cultivada em meio de Frey modificado ou culturas de estoque de meio de Frey congelado armazenado com 5% (em v/v) de glicerol. DNA genômico foi extraído usando o kit QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), seguindo as recomendações do fabricante. Sequências senso e reversas para os genes-alvo foram como se segue. Para o gene gapA o iniciador senso foi gapA 3F, tendo uma sequência de TTCTAGCGCTTTAGCCCTAAACCC (SEQ ID NO: 4), e o iniciador reverso foi gapA 4R, tendo uma sequência de CTTGTGGAACAGCAACGTATTCGC (SEQ ID NO: 5). Para o gene MGA 0319 o iniciador senso foi Ip 1F, tendo a sequência de CCAGGCATTTAAAAATCCCAAAGACC (SEQ ID NO: 6), e o iniciador reverso foi Ip 1R, tendo uma sequência de GGATCCCATCTCGACCACGAGAAAA (SEQ ID NO: 7). Para o gene mgc2 o iniciador senso foi mgc2 1F, tendo uma sequência de GCTTTGTGTTCTCGGGTGCTA (SEQ ID NO: 8), e o iniciador reverso foi mgc2 1R, tendo uma sequência de CGGTGGAAAACCAGCTCTTG (SEQ ID NO: 9). Para o gene pvpA o iniciador senso foi pvpA 3F, tendo uma sequência de GCCAMTCCAACTCAACAAGCTGA (SEQ ID NO: 10), e o iniciador reverso foi pvpA 4R, tendo uma sequência de GGACGTSGTCCTGGCTGGTTAGC (SEQ ID NO: 11).

Todas as amplificações foram realizadas em um thermocycler PTC-200 DNA Engine MJ (MJ Research) a 94 °C por 3 minutos, e 40 ciclos de 94°C por 20 segundos, 55 a 60 °C por 40 segundos, 72 °C por 60 segundos, e 72 °C por 5 minutos. A temperatura ótima de recozimento utilizada para amplificar os genes MGA_0319 e pvpA foi de 55 °C, para amplificar o gene mgc2 foi utilizada uma temperatura de recozimento de 58 °C, e 60 °C foi utilizado para amplificar o gene gapA. Produtos de PCR foram detectados com luz UV em um gel a 2% de agarose contendo pg de brometo de

45/48 etídio I ml. O fragmento genético amplificado foi sequenciado usando um sequenciador automático Applied Biosystems Prism 377 (PE Applied Biosystems). Cada produto de amplificação foi sequenciado em ambas as direções com os iniciadores de amplificação senso e reverso. Foi realizada completa 5 sobreposição de sequências complementares usando o programa SEQMAN (em LASERGENE; DNASTAR).

Análise por GTS do gene MGA_0319 em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 produziu a seguinte sequência: ATGAGAGCTT ATAACCAATF

CATTACTAGA GGGTTGGACA GTTATGTAAA TAGTACAACT

AAAGGGATTA ATATTCCCAA CAACTTATCA TCAGATTCTG GTGGTAAGTT GTTAATGACT GCTTCTGATA TGTTCGATAG TTTTGACGTA TCATTTAGTG CAGCTTATGT TCAACAATAT TTAAAACAAA CTAATAATAC TAACCGTGAT ACTGTTGGTG TAGTTCAATC AGATATTGAT GAGATCAATC TGATGAATAA TTTCATTAGA GCTAAGGCAA ATGGTAACAC

AACCAACACC TACTCACAAC AGATTACTAA TAATTCATTA TTAAAAACTG GTGAAGCGAA TCGAACTACT GATCCATATT ACAATGCTTA TGC AGATTTA GCAGCTGGAA CTAAAGATAT CCACGAAATC TTTGAATGAA ATGGGATGAA GACAGTTGAT TCTTCGAAAT CAGATAATTC ATCAACAAAC GTAATGAGTA AAAAT (SEQ ID NO: 12).

Análise por GTS do gene pvpA em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 produziu a seguinte sequência: GGTAGtCCTA AGTTATTAGG TCCAAACCAA

GCTGGTCATC CACAACACGG ÂCCACGTCCG ATGAATGCTC ATCCAGGTCA ACCACGCCCT CAACAAGCTG GCCCACGTCC AATGGGAGCT GGTGGATCTA ACCAACCAAG ACCAATGCC A AATGGTCTAC AAAACCCACA AGGTCCACGA CCAATGAACC CTCAAGGCGA TCCTCGTCCT CAACCAGCTG GTGTCAGACC TAACAGCCCA CAAAATTCTC AACCACGCCC AATGCCAAAT AAACCACAAG GTCCACGACC AATGGGTGCT CCAAATCCTC AACCAGGCCC TCAACAAGCT GGCCCACGTC CAATGGGAGT TGGTGGATCT AACCAACCAA GACCAATGCC AAATCGTCCA CAAAACCCAC AAGGTCCACG ACCAATGAAC CCTCAAGGCG ATCCTCGTCC TCAACCAGCT GgtGTc (SEQ ID NO: 13).

46/48

Análise por GTS do gene mgc2 em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 produziu a seguinte sequência: TTTTATCCAG TAGTGGGTGC AGGTGCTGGG

TTGATTGTTG TTTCTTTACT CTTGGGTTTA GGGATTGGGA TTCCGATCGC TAAGAAAAAA GAAAGAATGA TGATCCAAGA ACGTGAAGAA ÇACCAAAAGA TGGTTGAATC CCTTGGTATA ATCGAAGAAC

AAAATAAAAC AGAAGCGATT GAGCCAACTG CAGCAGTGCC

AACTGAAGAA GTTAATACTC AAGAACCAAC TGAACCAGCT

GGTGTTAATG TAGCTAATAA CCCTCAGATG GGGATCAATC AACCAGGATT TAATCAACCT CAGATTAATC CGCAATTTGG TCCTAATCCC CAACAAAGAAITAACCCACA GGGCTTTGGT GGCCCAATGC

CACCTAACCA AATGGGAATG CGACC AGGGT TTAACCAAAT GCCCCCACAA ATGGGAGGAA TGCC ACCTAA CCAAATGGGA ATGCGACCAG GGTTTAACCA AATGCCCCCA CAAATGGGAG GAATGCCACC AAGACCAAAC TTCCCTAACC AAATGCCTAA TATGAATCAA CCAAGACCAG GTTTCAGACC AC AACCTGGT GGTGGGGTGC CGATGGGAAA TAAAGCTGTA GGTGGGTTTA ATCAC (SEQ ID NO: 14),

Análise por GTS do gene gapA em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 produziu a seguinte sequência:

CCTAACCGAA TTACTAACCC ATTAATGAAT

AGAGATAACG TAATCGGTCA AGGTGCGTTC ATTAGTAGAA

ATGATATTCC ATCATCATTC TTTGAAAACA AAATTAATGA TATTGTAACT ACAGAAGCTG ATGGTAAAGA AGTATTAGAT AGTAAATACA

TTAATTCAAT CTATAGATAT ACTCCACCTC AAAACAATCC TGATATTAGA TTAAGATTAT TAGTAATTGA TCGTTCTAGA GCAACTAATG ACTTCATTAA GTTAITACCT CAAGTATTAG TTGATGGCGA ATACGTTGCT GTTCCACAA (SEQ ©NO:15).

Análise por GTS caracteriza K5831B-19 como sequência gapA tipo Va, sequência MGA 0319 tipo Va, sequência mgc2 tipo IVa, sequência pvpA tipo IIIa, sequência mgc2/pvpA tipo IIIa, e sequência gapAIMGA_03'\9lmgc2/pvpA tipo Vila, conforme descrito em Ferguson et al.

A completa descrição de todas as patentes, requerimentos de

47/48 patente, e publicações, e material disponível eletronicamente (incluindo, por exemplo, submissões de sequências de nucleotídeos, por exemplo, no GenBank e RefSeq, e submissões de sequências de aminoácidos, por exemplo, no SwissProt, PIR, PRF, PDB, e translações de regiões codificantes anotadas no GenBank e RefSeq) citados aqui, neste requerimento de patente, são incorporados por meio de referência. A descrição detalhada e exemplos precedentes foram proporcionados para clareza do entendimento somente. Não devem ser entendidas limitações desnecessárias a partir dos mesmos. A invenção não está limitada aos exatos detalhes mostrados e descritos, porque variações óbvias para uma pessoa versada na técnica serão incluídas dentro da invenção definida pelas reivindicações.

Tdos os títulos são para a conveniência do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue o título, a menos que especificado deste modo.

Texto Livre de Listagem de Sequências

SEQ ID NO: 1 a 11 e 16 a 18 Iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos.

SEQ ID NO: 12	Sequência de nucleotídeos parcial do gene MGA_0319 em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 obtida por sequenciamento direcionado ao gene (gene targeted).
SEQ ID NO: 13	Sequência de nucleotídeos parcial do gene pvpA em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 obtida por sequenciamento direcionado ao gene.
SEQ ID NO: 14	Sequência de nucleotídeos parcial do gene mgc2 em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B-19 obtida por sequenciamento direcionado ao gene.
SEQ ID NO: 15	Sequência de nucleotídeos parcial do gene gapA em Mycoplasma gallisepticum cepa K5831B obtida por sequenciamento direcionado ao gene.

48/48

10801 UwVwvify Boulwarf · Msnasúü, VA 20110-2209 USA Telephone: 703-36^-2700 · FAX; 703-334-2932

BUDAPEST ΊΊ8ΕΑΤΤ ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR IKE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE

JGVTEKMiZTOAMX. FORM

RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT ISSUED PURSUANT TO RULE 73 AND VIABILITY STATEMENT ISSUED PURSUANT TO RULE 10.2

To: (Name and Address if Depositor or Attorney)

University of Georgia, Research Fbundation, Inc.

ATTN: Sohail Malik

630 Boyd GSRC

200 D. W. Brooks Drive

Athens, GA 30602-7411

Deposited on Behalf of: University of Georgia, Research Foundation, Inc.

Date of Receipt of Culture by the ATCCtc September 15.2008

Identification Reference by Depositor: ATCO» Patent Deposit Designation:

Mycoplasma gallisepticum K5831 PTA-9495

The deposit was received by this Interneti one! Depository Authority and has. been accepted.

The strain wtU be made available if a patent office signatory to the Budapest Treaty certifies one's right to receive, ar if a US. Patent is issued citing flic strain, and ATCCs is instructed by the United States Patent & Trademark. Office or the depositor to release said strain.

If the deposit should die or be destroyed during the effective term of the patent, it shall be your responsibility to replace it with viable material It is also your responsibility to supply a sufficient quantity for distribution for the deposit term. ATCC8 wtU distribute the material for 30 years or 5 years following the most recent request for the deposit, whichever is longer. The United States and many other countries are signatory to the Budapest Treaty.

We will inform you of requests for the strain for 30 years from date of deposit

The deposit was tested October 09.2008 and on that date, the culture was viable.

International Depository Authority; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA

Signature of person having authority to represent ATCC9:

I Ett oHrtu BteuMm e=<FCE, £_*eMnlfMÍsfetaMSlscuçi s45 ___________& OfoiiLmwwMi: October 31.2tM»

ATCC Patent Depository Date

Ce: Kristine H Johnson

Ref: Docket or Case No. 36643-00016

SM.9

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

   uma cepa de Mycoplasma gallisepticum isolada, em que é a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada na ATCC sob a Designação de Patente PTA-9495; e um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é liofilizada.
3. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração através da mucosa, intranasal, intraocular ou oral, ou formulada para pulverização ou aerolização.
4. 4. Vacina para aves da ordem Galliformes, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade da cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum, depositada na ATCC sob a Designação de Depósito de Patente PTA-9495, suficiente para proteger as aves contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. 5. Vacina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a quantidade protetora é a quantidade requerida para a cepa K8531 de Mycoplasma gallisepticum para colonizar o trato respiratório superior da ave.
6. 6. Vacina, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que a quantidade protetora está entre 50 e 5 X 10⁷ unidades de troca de cor (ccu)/ ave.
7. 7. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma vacina, como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para reduzir a suscetibilidade de uma ave da ordem Galliformes contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum.
8. 8. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma vacina, como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma

   Petição 870190064108, de 09/07/2019, pág. 6/13

   2/2 composição para proteger uma ave da ordem Galliformes contra doença induzida por Mycoplasma gallisepticum.
9. 9. Uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum persiste no epitélio

   5 respiratório da ave.
10. 10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum exclui outras cepas de Mycoplasma gallisepticum do epitélio respiratório.
11. 11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10,

    10 caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo a cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum é administrada: à mucosa respiratória, por gotas oculares, por via nasal, por aerossol, e por água potável.
12. 12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar no mínimo

    15 uma formulação de reforço adicional à ave.
13. 13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que a ave é um frango ou peru.