MX2011007732A - Formulacion de mycoplasma gallisepticum. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una formulación que evita la infección de Mycoplasma galHsepticum virulenta en pájaros en el orden de gallináceos GaIHf. La formulación comprende la cepa K5831 de Mycoplasma galHsepticum o derivados de la misma en un portador aceptable farmacéuticamente. Se presenta también una vacuna la cual evita la infección virulenta con Mycoplasma galHsepticum en pájaros del orden de gallináceos. Se presentan también los métodos para administrar la formulación y la vacuna.

Description

FORMULACION DE MYCOPLASMA GALLISEPTICUM Antecedentes de la Invención El Mycoplasma gallisepticx (MG por sus siglas en inglés) es un patógeno respiratorio infeccioso de pollos y pavos. Es el Mycoplasma más patogénico y es el patógeno económicamente más significativo de las aves. Las pérdidas económicas a partir del condenamiento o degradación de animales muertos, eficiencia de producción de alimento y huevo reducido, y costos de medicación incrementados son factores que hacen a esta enfermedad muy costosa y uno de los problemas que confronta la producción comercial de aves mundialmente . El control de MG es generalmente por aislamiento y mantenimiento de provisión de reproducción libre de MG. Sin embargo, la expansión rápida de la producción de aves en pequeñas áreas geográficas y granjas con edades múltiples en donde nunca disminuye la población hacen que la erradicación y control de MG por tales esfuerzos de bioseguridad sea difícil y necesitan la implementación de medidas adicionales. En estas situaciones, la inmunización profiláctica de aves de corral contra enfermedad relacionada son MG implica el uso de vacunas inactivadas o exposición a vacuna viva atenuada de cepas de MG. Ver, por ejemplo, Kleven et al, 1997, Acta Vet Hung: 45 (3) : 299-305.

Sin embargo, cada procedimiento tiene desventajas.

Ref.: 221934 Las vacunas inactivadas, mientras que son generalmente efectivas para proteger contra pérdida de producción de huevo en carnadas, no evita confiablemente la infección o proporciona protección consistente contra la enfermedad respiratoria. Y, mientras que las vacunas de MG atenuadas vivas parece ser las más efectivas, y por lo tanto más populares que las vacunas inactivadas, pueden producir enfermedad o dañar la función reproductora.

Una característica importante de una vacuna viva de MG efectiva es la capacidad para incrementar la resistencia a la infección con la cepa del tipo silvestre, y desplazar las cepas del tipo silvestre con la cepa de vacuna en sitios de producción de múltiples edades (Levisohn and Kleven, 2000 Rev Sci Tech; 19 (2) : 425-42 ; y Turner and Kleven, 1988, Avian Dis; 42 (2) :404-7) .

Actualmente, las vacunas vivas disponibles para el control de MG incluyan la cepa F (Luginbuhl et al, 1967, Ann NY Acad Sci, 143:234-238; Adler et al., 1960, Am J Vet Res; 21:482-485), 6/85 (Evans and Afees, 1992, Avian Dis; 36:197-201) y ts-11 (Whithear et al., 1990, Aust Vet J; 67:159-165; y Whithear et al., 1990, Aust Vet J; 67:168-174). La cepa F es transmisible en corrales y pollos en corrales adyacentes y puede ser aislada de granjas grandes después de que ha cesado la vacunación. Las cepas ts-11 y 6/85 /(son transmisibles, aunque deficientemente, a partir de aves vacunadas a no vacunadas cuando están en contacto. La cepa F persiste en niveles superiores en el tracto respiratorio superior que ts-11 ó 6/85 y ts-11 parece colonizar más efectivamente que 6/85. La cepa F también se transmite de la gallina al huevo. Desafortunadamente, aunque cada una de las vacunas actualmente disponibles tiene sus ventajas, ninguna de ellas obtiene el estado ideal en cada aspecto. Por lo tanto, hay-una necesidad de cepas de vacuna de MG vivas mejoradas que sean tanto seguras como eficaces, que sean estables y no virulentas.

Sumario de la Invención La presente invención incluye una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, en donde la cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada es la cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 depositada en ATCC bajo la designación de Patente PTA-9495.

La presente invención incluye un cultivo biológica y esencialmente puro de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada en la Colección Americana de Cultivos tipo (ATCC, por sus siglas en inglés) bajo el no. de patente PTA-94-95.

La presente invención incluye una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, en donde la cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada es la cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 depositada en el ATCC bajo la designación de Patente PTA- 9495, o una progenie o derivado de la misma, en donde la progenie o derivado de la misma tiene las mismas características biológicas, serológicas y/o genéticas de la cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 depositada en ATCC bajo la designación PTA-9495.

La presente invención incluye un cultivo esencial y biológicamente puro de la cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 depositada en ATCC bajo la designación de patente PTA-9495, o una progenie o derivado de la misma, en donde la progenie o derivado de la misma tiene esencialmente las mismas características biológicas y serológicas de la cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 depositada en ATCC bajo la designación de patente PTA-9495.

En algunas modalidades de la presente invención, la cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, progenie o derivado de la misma es liofilizada.

La presente invención incluye una composición la cual incluye una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, progenie o derivado de la misma como se describe en la presente. En algunas modalidades, una composición puede además incluir agua. En algunas modalidades, una composición puede además incluir un portador aceptable farmacéuticamente. En algunas modalidades, una composición puede ser formulada para administración mucosal . En algunas modalidades, una composición puede ser formulada para administración intranasal, intraocular, u oral. En algunas modalidades, puede ser formulada una composición para aspersión o aerosol.

La presente invención incluye una vacuna, la cual incluye una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, progenie o derivado de la misma, como se describe en la presente, o una composición como se describe en la presente. En algunas modalidades, una vacuna puede reducir la susceptibilidad de los pájaros del. orden de gallináceos a la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum.

La presente invención incluye una vacuna para pájaros del orden de gallináceas la cual incluye una cantidad de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum, depositada en ATCC bajo la designación de depósito de patente PTA-9495, o un derivado de la misma, suficiente para proteger a los pájaros de la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, y un portador aceptable farmacéuticamente. En algunas modalidades, una cantidad protectora es aquella cantidad requerida para que la cepa K8531 de Mycoplasma gallisepticum colonice el tracto respiratorio superior del pájaro. En algunas modalidades, una cantidad protectora está entre aproximadamente 50 y aproximadamente 5xl07 ccu/pájaro.

La presente invención incluye un método para reducir la susceptibilidad de un pájaro del orden de los gallináceas contra la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, el método incluye administrar al pájaro la cepa de Mycoplasma gallisepticum 5831 depositada en ATCC bajo la designación de depósito de patente PTA-9495, o una progenie o derivado de la misma.

La presente invención incluye un método para reducir la susceptibilidad de un pájaro del orden de gallináceas contra la enfermedad por Mycoplasma gallisepticum, el método que incluye administrar una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, progenie o derivado de la misma como se describe en la presente, una composición como se describe en la presente, o una vacuna como se describe en la presente a un pájaro.

La presente invención incluye un método para proteger al pájaro del orden de gallináceos contra la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, el método que incluye administrar al pájaro la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada en el ATCC bajo la designación de depósito de patente PTA-9495, o una . rogenie o derivado de la misma .

La presente invención incluye un método para proteger a un pájaro del orden de gallináceas contra la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, el método que incluye administrar una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, progenie o derivado como se describe en la presente, una composición como se describe en la presente, o una vacuna como se describe en la presente a un pájaro.

En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum, o progenie o derivado de la misma persiste en el epitelio respiratorio del pájaro. En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum o progenie o derivado de la misma , excluye otras cepas de Mycoplasma gallisepticum a partir del epitelio respiratorio. En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, la cepa 5831 de Mycoplasma gallisepticum o progenie o derivado de la misma es administrada a la mucosa respiratoria. En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum o progenie o derivado de la misma es administrada por gotas en los ojos. En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum o progenie o derivado de la misma es administrada nasalmente . En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, la cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 o progenie o derivado de la misma es administrada por aerosol. En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum o progenie o derivado de la misma es administrada en agua para beber. En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, el método además incluye administrar por lo menos una formulación de refuerzo adicional al pájaro. En algunos aspectos de los métodos de la presente invención, el pájaro puede ser un pollo o pavo.

Los términos "comprende" y variaciones del mismo no tienen un significado limitante en donde aparezcan estos términos en la descripción.

A menos que se especifique otra cosa "uno, una, un" "la, el, lo" y "por lo menos uno" son usados intercambiablemente y significan uno o más de uno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica, la cual representa el resumen de los resultados para estudio de capacidad de transmisión de contacto directo. Los resultados son mostrados como % positivo.

La Figura 2 es una gráfica, la cual representa el resumen de resultados de un estudio de excreción. Los resultados son mostrados como % positivo.

La Figura 3 es una gráfica, la cual representa resultados de estudio de desplazamiento, en números de copias (LoglO) de la cepa R en pollos vacunados y pollos no vacunados (controles) en 0, 2, 4 y 8 semanas post introducción de sembradores de cepa R.

La Figura 4 es una gráfica, la cual representa resultados de estudio de desplazamiento, en números de copias (LoglO) de cepa R en pollos vacunados y pollos no vacunados (controles) en 0, 2, 4 y 8 semanas post introducción de sembradores de cepa R.

La Figura 5 es una gráfica de barras, la cual representa resultados de estudios de desplazamiento, en números de copias (LoglO) de vacunas de pollos en 0, 2, 4 y 8 semanas post introducción de sembradores de cepa R.

La Figura 6 es una gráfica lineal, la cual representa resultados de estudios de desplazamiento, en números de copias (loglO) de vacunas de pollos en 0,2,4 y 8 semanas post introducción de sembradores de cepa R.

La Figura 7 representa los resultados del análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD por sus siglas en inglés) para huella de K5831B-19 y K5883-2 aislado de pasaje de regreso. La banda 1 es K2101. La banda 2 es K5831B-19. La banda 3 es K5833-2. La banda 4 es la cepa R. La banda 5 es 6/85. La banda 6 es ts-11. La banda 7 es la cepa F. La banda 8 es el control negativo. La banda 9 es un marcador de puntos moleculares de 100 pb.

La Figura 8 representa los resultados del análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) para huella de K5831B-19 aislados de pasaje de regreso diez días post reto con K5831B-19, K882-1 o cepa R.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticu (MG) , progenie y derivados de los mismos que son avirulentos inmunogénicos y estables cuando se administran como formulaciones vivas . Las formulaciones de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención son seguras y eficaces para inhibir las infecciones de Mycoplasma gallisepticum y serán útiles para reducir la incidencia y severidad de la enfermedad de infecciones por Mycoplasma gallisepticum en pájaros.

La cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum es depositada en la Colección Americana de Cultivos tipo (ATTC®, por sus siglas en inglés) , 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20110-2209, USA, como PTA-9495 el 15 de Septiembre de 2008. Esta cepa es depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patentes. La cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum es también referida como cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum, MG 5831, MG 5831B-19, cepa MG 5831, K5831, K5831B-19, ATCC PTA-9495, y PTA-9495. La cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum se aisla de pollos estimulados con la cepa de Mycoplasma gallisepticum K2101 (MG K2101) . MG 2101 es un aislado de campo, aislado en Colorado en 1984 de gotas que demuestran protección en huevos de una parvada de capa comercial. De aproximadamente treinta aislados, aislados B-l a B-30, se selecciona el aislado MG K5831B-19 para caracterización y análisis adicional.

La presente invención incluye la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum aislada ( G) que se deposita con la designación de depósito de patentes ATCC como PTA-9495 el 15 de Septiembre de 2008. Como se usa en la presente, "aislado" se refiere a material removido de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si este se presenta naturalmente) , y de esta forma es alterado "por la mano del hombre" de su estado natural . También se incluye en la presente invención la progenie aislada y derivados aislados de cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum designación de Depósito de Patente ATCC PTA-9495 y cepas con características biológicas, serológicas y/o genéticas equivalentes o similares. Como se usa en la presente, las características serológicas, biológicas y genéticas pueden incluir una o más características descritas en los datos en los Ejemplos y Figuras incluidos en la presente. Más particularmente, las cepas de progenie o derivados del material PTA-9495 retienen las propiedades protectoras particularmente favorables que pertenecen a la presente invención. La progenie de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum eesignación de depósito de patente ATCC PTA-9495 puede ser obtenida por cualquiera de los numerosos métodos para propagación de Mycoplasma gallisepticum conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, cultivo in vitro o pasaje de nuevo en un pájaro. Ejemplos de progenie incluyen, por ejemplo, reaislados de K5866, K5969, K5872 y K5876. y K5883-2 como se describe en el Ejemplo 3. Derivados de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum designación de depósito de patente ATCC PTA-9495 deben incluir versiones modificadas genéticamente de la cepa MG K5831 depositada. Las manipulaciones incluyen, pero no se limitan a, mutagenizar la cepa MG o introducir genes o casetes de genes que codifican las proteínas alternativas o proteínas no funcionales, o secuencias de nucleótidos no codificantes en el organismo de MG.

La cepa MG K5831 y progenie y derivados de la misma pueden ser identificados y diferenciados de otras cepas de Mycoplasma gallisepticum usando cualquiera de las muchas técnicas que han sido desarrolladas para la diferenciación de cepas de Mycoplasma gallisepticum, incluyendo, por ejemplo, análisis de perfil de proteína (Khan et al., 1987, Avian Dis; 31:315-320), polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP por sus siglas en inglés) (Kleven et al., 1988, Avian Dis; 32:731-741), ribotipificación (Yogev et al., 1988, Avian Dis; 32:220-231), sondas de ADN específicas a cepa (Khan et al., 1989, Avian Pathol ; 18:135-146), PCR con cebadores específicos a cepa (Nascimento et al., 1993, Avian Dis; 37:203-211), y ADN polimórfico amplificado aleatorio (RADP) (Charlton et al., 1999 J vet Diag invest; 11: 158-161; Fan et al., 1995, Avian Dis 39; 729-735; y Geary et al., 1994, Mol Cell Probes; 8:311-316). El método RAPD ha sido utilizado exitosamente para identificar las cepas de vacunas en tanto condiciones experimentales y de campo (Ley et al., 1997, Avian Dis; 41:187-194; Kleven and Fan, 1998, Avian Dis; 42:300-306; Turner and Kleven 1998, Avian Dis 42: 404-407), asi como también para rastrear los aislados relacionados epidemiológicamente en el campo (Kempf, 1998, Avian Pathol; 27:7-14; Ley et al., 1997, Emerg infect Dis; 3:375-380, Charlton et al., 1999, J Vet Diagn Invest 11, 408-415; Levisohn & Kleven, 2000, Rev Sci Tech; 19:425-442). La progenie o derivados de K5831 puede compartir una o más de las características de identificación de cepa K5831 MG. La progenie o derivados de K5831 pueden compartir substancialmente todas las características identificadas. La presente invención también contempla, en aspectos adicionales, la cepa MG K2101 parental, progenie y derivados de los mismos y su uso en cualquiera de las composiciones, vacuna y métodos descritos en la presente.

La cepa K5831 MG, progenie y derivados de la misma pueden ser identificados y diferenciados a partir de otras cepas de Mycoplasma gallisepticum usando análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) . Brevemente, las reacciones de cadena polimerasa cebada arbitraria (AP-PCR) que implica tres ciclos de amplificación de baja astringencia seguido por PCR en astringencia superior es realizada con tres cebadores elegidos arbitrariamente, usando procedimientos descritos con mayor detalle por Fan et al.

(Fan et al., 1995, Avian Dis; 39-729-735). Los tres cebadores de oligonucleótido usados con M16SPCR5 " (AGGCAGCAGTAGGGAAT (SEQ ID N0:16)); M13F (GTAAAACGACGGC (SEQ ID N0:17)); y S10LIG03' (CATAACTAACATAAGGGCAA (SEQ ID NO: 18)). Los resultados representativos del análisis RAPD para K5831B-19 y progenie K5833-2 son mostrados en las Figuras 7 y 8. La progenie y derivados de la misma pueden demostrar un perfil RAPD substancialmente equivalente de cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum designación de depósito de patente en ATCC como PTA-9495 cuando se utilizan los cebadores Fan.

K5831, progenie o derivados de la misma pueden ser identificados y diferenciados de otras cepas de Mycoplasma gallisepticum usando un procedimiento de secuenciación objetivado por gen (GTS por sus siglas en inglés) . Cualquiera de la variedad de genes puede ser analizada. Por ejemplo, secuencias genéticas de gen gapA, el gen mgc2, el gen pvpA y/o el gen que codifica una lipoproteína superficial conservada predicha puede ser usada. Estas cuatro secuencias de genes son identificadas primero en el genoma de la cepa Riow de Mycoplasma gallisepticum (Papazisi et al. 2003, Microbiol; 149:2307-2316). El gen gapA codifica una proteína mostrada para ser implicada en el proceso de citadhesión (Gob et al. 1998 Microbiol: 144:2971-2978) identificada como secuencia de genoma de codificación de ADN (CDS por sus siglas en inglés) MGA_0934. El gen mgc2 codifica una segunda proteína de citadhesina también conocida para jugar un papel en el proceso de unión (Hnatow et al., 1998, Infect Immun, 66:3436-3442) identificada como el genoma CDS MGA_0932. El gen pvpA codifica una citadhesina accesoria putativa que exhibe variación de tamaño entre las cepas de Mycoplasma gallisepticum (Boguslavsky et al., 2000, Infect immun; 68:3956-3964; Liu et al., 2001, J Clin icrobiol; 39:1882-1888) . El gen que codifica una lipoproteína superficial conservada predicha, reconocida originalmente por Nascimnto et al. (Nascimento et al., 1991, Avian Dis; 35:62-69), es identificada como genoma CDS MGA_0319 (Papazisi et al., 2003, Microbiology, 149:2307-2316).

La progenie o derivados de K5831 pueden compartir una o más de las secuencias identificadas de la cepa K5831B de Mycoplasma gallisepticum en porciones del gen pvpA de citadhesina (SEQ ID N0:13), el gen gapA de citadhesina (SEQ ID NO: 15), el gen mgc2 de citadhesina (SEQ ID NO:14) o el genoma designado como gen que codifica la lipoproteína superficial hipotética no caracterizada que codifica la secuencia de ADN (CDS) MGA_0319 (SEQ ID NO:12), como se determina por el análisis de secuenciación objetivada por gen (GTS por siglas en ingles) descrito con mayor detalle en el Ejemplo 8, siguiendo, por ejemplo, los procedimientos descritos con mayor detalle en Ferguson et al. (Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151:1883-1893).

La cepa K5831 MG y la progenie o derivados de la misma pueden demostrar una curva estándar PCT de tiempo real Taqman con uno o más valores CT promedio de 37.20, 33.48, 30.48, 27.15, 23.97, 20.74, 17.28 y 13.70 para número de copia log de templado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, respectivamente; una ecuación lineal de y=-0.3021x + 12.203; y/o un valor de R cuadrado si 0.9996. El PCT de tiempo real Taqman puede utilizar cebadores del gen mgc2, número de acceso GenBank AY556238, como, por ejemplo, usar una secuencia de cebador cadena adelante (5 '-3') incluyendo nucleótidos 218 a 237 de AY556238 ( TCAAGAACCAACTCAACCA (SEQ ID NO:l)), una secuencia de cebador inversa (5'-3') incluyendo los nucleótidos 329 a 308 de AY556238 (GGATTAGGACCAAATTGCGGAT (SEQ ID NO : 2 ) ) , una secuencia de sonda etiquetada dual (5 '-3') incluyendo los nucleótidos 280 a 303 de AY556238 (CAACCAGGATTTAATCAACCTCG (SEQ ID NO: 3)), y una temperatura de templado/extensión de 61°C. Alternativamente, las sondas similares de gen mgc2, no. de acceso de GenBank AY556282, pueden ser usadas. La metodología para la determinación es descrita con mayor detalle por Raviv et al. (Raviv et al., 2008, Veterinary Medicine, 129(1-2):179-87). La progenie o derivados de K5831 puede compartir una o más de las características identificadas de cepa K5831 MG determinadas por el ensayo PCR de tiempo real de Taqman.

Las cepas de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención demuestran una variedad de características biológicas y/o serológicas adicionales, incluyendo, pero no limitadas a cualquiera de aquellas descritas en los ejemplos incluidos en la presente. Por ejemplo, las cepas de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención pueden demostrar proporciones disminuidas de transmisión. Las cepas de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención pueden demostrar persistencia mejorada en el tracto respiratorio. Las cepas de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención pueden demostrar poco o ningún incremento de virulencia cuando se vuelven a pasar. Las cepas de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención pueden demostrar poca o ninguna transmisión vertical. La vacunación con una cepa de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención puede resultar en menor colonización con otras cepas de Mycoplasma gallisepticum, como por ejemplo, la cepa R. La vacunación con una cepa de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención puede resultar en lesiones gruesas después del reto que permanece principalmente en el sistema respiratorio de pájaros estimulados.

Con la presente invención, la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum es evaluada por estudios para investigar la dosis mínima, capacidad de transmisión, persistencia y excreción, paso de nuevo, distribución corporal, transmisión vertical, desplazamiento de cepas virulentas, patogenicidad en huevos embrionados y pollos, y caracterización de propiedades bioquímicas, biológicas y serológicas . El título mínimo de MG K5831 necesario para infectar e inducir la protección adecuada de vacuna es aproximadamente 6.22 x 105CCU/ml. MG K5831 tiene una proporción relativamente baja de transmisión y persiste en el tracto respiratorio superior por al menos cinco meses. Se evalúa que no hay incremento en virulencia de MG K5831 cuando se pasa de nuevo cinco veces a través de pollos y lesiones gruesas después del estimulo. MG K5831 permanece principalmente en el sistema respiratorio de pájaros estimulados. No se detecta transmisión vertical de MG K5831. Y la vacunación con MG K5831 resulta en menor colonización con la cepa R.

La presente invención incluye composiciones de las cepas de Mycoplasma gallisepticum, progenie y derivados de la misma descritos en la presente. Las composiciones pueden servir como vacunas que reducen la susceptibilidad de pájaros a enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum. Las composiciones pueden servir como vacunas que protegen a los pájaros de enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum. Las composiciones y vacunas de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, agua o medio de cultivo. Las composiciones y vacunas pueden incluir portadores o diluyentes aceptables farmacéuticamente. Los portadores incluyen, por ejemplo, estabilizantes, conservadores y amortiguadores. Los estabilizantes adecuados incluyen, por ejemplo SPGA, carbohidratos (como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa) , las proteínas (como suero de leche seco, albúmina o caseína) o productos de degradación de los mismos. Amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo, fosfatos de metal alcalinos. Conservadores adecuados incluyen, por ejemplo, timerosal, mertiolate y gentamicina. Los diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, amortiguador acuoso (como solución salina amortiguada) alcoholes, y polioles (como glicerol) .

Las cepas MG, composiciones y vacunas de la presente invención pueden ser substancialmente puras . Como se usa en la presente, "substancialmente puro" significará material esencialmente libre de cualesquiera macromoléculas similares y otras entidades biológicas que pueden ser normalmente encontradas en la naturaleza.

Preferentemente los organismos usados en las formulaciones están vivos ; En algunas modalidades, los organismos, composiciones o vacunas pueden ser liofilizados .

Las composiciones y vacunas de la presente invención pueden ser administradas a pájaros de cualquiera de la variedad de especies aviarias que son susceptibles a Mycoplasma gallisepticum, incluyendo, pero no limitados a, aves, pájaros de la orden de gallináceos, y especies de pájaros exóticos. Los pájaros del orden de gallináceos incluyen, pero no se limitan a, pollos, pavos, urogallos, codornices y faisanes. Como se usa en la presente, aves incluyen aves domesticadas que son mantenidas para el propósito de recolectar sus huevos, o sacrificar para su carne' y/o plumas. Estos más típicamente son miembros del superorden Galloanserae (aves de crianza) , especialmente el orden de gallináceos (lo cual incluyen, por ejemplo pollos, codornices, pavos, y urogallos) y la familia Anatidae (en orden Anseriformes) , comúnmente conocidos como "aves de crianza de agua" (incluyendo, por ejemplo, patos, gansos y cisnes) . Las aves pueden también incluir otros pájaros los cuales son sacrificados para su carne, como las palomas o palomos o pájaros considerados para juegos, como los faisanes. Los pájaros, incluyen pero no se limitan pollitos, gallos, pollo asadero, pollo para asar, carnada, reproductor, la descendencia de los pollos reproductores y carnadas. Como se usa en la presente, el término "susceptible para" significa la posibilidad o realidad de una respuesta dañina para el microorganismo de referencia, como, por ejemplo, vigor reducido o falla para crecer prolíficamente, cuando se compara con individuos o grupos no susceptibles, y/o uno o más estados patológicos indicativos de la infección con Mycoplasma gallisepticum.

Las composiciones y vacunas de la presente invención pueden ser formuladas para suministro por cualquiera de una variedad de rutas conocidas en las técnicas veterinarias, como por ejemplo, administración mucosal, intranasal, intraocular u oral. Las composiciones y vacunas de la presente invención pueden ser formuladas para suministro a la mucosa respiratoria y pueden ser administradas de tal forma que es inmediata o eventualmente puesta en contacto con las membranas mucosales respiratorias del pájaro. Las composiciones y vacunas de la presente invención pueden ser formuladas por cualquiera de una variedad de modos conocidos en las técnicas veterinarias, como por ejemplo, aspersión y aerolización . Una composición inmunogénica o vacuna de la presente invención puede ser administrada por cualquier método conocido adecuado para inocular pájaros que incluyen, pero no se limitan a, nasal u of álmicamente por inyección, en agua para beber, en alimento, por exposición, in ovo, maternalmente y similares.

La composición inmunogénica o . vacuna puede ser administrada por técnicas de administración de masa como por colocar la vacuna en agua para beber o por rociar el ambiente del animal. Una composición puede ser administrada por rociar un individuo o ave de crianza con una solución, el suministro de aerosol puede implicar la administración de la composición incorporada en partículas pequeñas de líquido. Las partículas de tipo de aspersión pueden tener un tamaño de gotas en el intervalo de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 10 mieras, más preferentemente, un tamaño de gota de entre aproximadamente <1 a aproximadamente 50 mieras. Para la generación de las partículas pequeñas, el aparato de aspersión convencional y generadores de aerosol pueden ser usados, como los generadores de aspersión comercialmente disponibles para aspersión de por saco colgante, aspersión de criadero y aspersión por atomizador. La administración a través de agua para beber puede ser realizada usando un aparato convencional. Cuando se administra por inyección, la composición inmunogénica o vacuna puede ser administrada parentalmente . La administración parental incluyen, por ejemplo, administración por inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal .

Una composición o vacuna de la presente invención puede ser administrada a pájaros antes o después de la empolladura. Los pájaros pueden recibir una composición de vacuna en cualquiera de una variedad de edades . Con el suministro después de la empolladura, los materiales pueden ser suministrados, por ejemplo, aproximadamente una semana después de la empolladura, aproximadamente dos semanas después de la empolladura, aproximadamente tres semanas después de la empolladura, aproximadamente cuatro semanas después de la empolladura, aproximadamente cinco semanas después de la empolladura, aproximadamente seis semanas después de la empolladura, o cualquier intervalo de los mismos. Para administración in ovo, los materiales pueden ser suministrados aproximadamente a diecisiete días de incubación, aproximadamente dieciocho días de incubación, aproximadamente diecinueve días de incubación, aproximadamente veinte días de incubación, y cualquier intervalo de los mismos.

Las composiciones y vacunas de la presente invención pueden ser ajustadas para incluir una concentración designada de Mycoplasma gallisepticum. Los organismos pueden ser medidos como unidades de cambio de color. Las unidades de cambio de color, también referidas en la presente como "ccu" de Mycoplasma gallisepticum pueden ser cuantificadas usando metodología estándar establecida, incluyen, por ejemplo, protocolos indicados en Rodwell y Whitcomb (in "Methods in Mycoplasmology" , Eds . Razin and Tully, 1993). Por ejemplo, una cantidad efectiva puede ser administrada a un pájaro simple en una gota por ojo por pájaro, una gota que es aproximadamente 0.05 mi, por lo tanto con una concentración de entre aproximadamente lxlO3 y aproximadamente lxlO6 unidades de cambio de color/ml (ccu/ml) , esto es equivalente a aproximadamente 50 a aproximadamente 50,000 ccu/p jaro. Por ejemplo, una concentración de aproximadamente 50, aproximadamente lxlO2 cc/ml, aproximadamente 5xl02 ccu/ml, aproximadamente lxlO3 ccu/ml, aproximadamente 5xl03 ccu/ml, aproximadamente lxlO4 ccu/ml, aproximadamente 5xl04 ccu/ml, aproximadamente lxlO5 ccu/ml, aproximadamente 5xl05 ccu/ml, aproximadamente 1x10s ccu/ml, aproximadamente 5x10s ccu/ml, aproximadamente lxlO7 ccu/ml, aproximadamente 5xl07 ccu/ml, y cualquier intervalo de los mismos (tal como, por ejemplo, aproximadamente lxlO5 ccu/ml a aproximadamente lxlO6 ccu/ml) pueden ser usados.

Las cepas de Mycoplasma gallisepticum de la presente invención pueden ser administradas a pájaros para reducir la susceptibilidad a infección por Mycoplasma gallisepticum. Con la administración, los materiales no resultan en signos clínicos significativos o lesiones indicativos de Mycoplasma gallisepticum. Los materiales presentes persisten, no son producidos por modificación genética, tienen baja virulencia, estabilidad incrementada sobre muchos de los pasajes vivos, no tienen incrementos en virulencia cuando se pasan de nuevo cinco veces, y/o permanecen principalmente en el sistema respiratorio. Los materiales presentes no se transmiten a huevos, o transmiten a huevos a una muy baja proporción. Por otra parte, la presente invención puede desplazar las cepas del " tipo silvestre virulentas y desplazar las cepas endémicas circulantes a partir de las operaciones de aves.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar materiales inmunológicos que no resultan en signos clínicos significativos o lesiones indicativas de enfermedad por MG. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos que persisten en el tracto respiratorio superior por al menos cinco meses. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos que no son producidos por modificación genética. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos de baja virulencia. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos que tienen estabilidad incrementada sobre muchos pasos in vivo. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos sin incremento en virulencia cuando se pasan de nuevo por lo menos cinco veces. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos que permanecen principalmente en el sistema respiratorio. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos que no se transmiten huevos, o transmitir a huevos a una muy baja proporción. Es otro objeto proporcionar materiales inmunológicos que evitan la infección con cepas del tipo silvestre virulantes y así desplazar cepas endémicas circulantes a partir de operaciones de aves.

Sin desear estar limitados por alguna teoría particular, las cepas de MG de la presente invención estimulan la inmunidad y persisten en la mucosa respiratoria de pájaros tratados, especialmente en el tracto respiratorio superior. De esta forma, un resultado benéfico de tratamiento de pájaros con los materiales presentes es la capacidad de los materiales para excluir cepas de campo virulentas a partir de la colonización en el tracto respiratorio superior. Como se usa en la presente, las cepas de "campo" incluyen cualesquiera cepas presentes en el ambiente de los pájaros, incluyendo cepas del tipo silvestre, o cepas que están presentes en aves mixtas por virtud de intentos previos en vacunación. La cantidad administrada puede ser aquella cantidad necesaria para colonizar el tracto respiratorio superior de cualquier pájaro individual, o cualquier ave de cría dada, preferentemente por un periodo suficiente para proporcionar protección contra invasión por cepas del tipo silvestre virulentas. La cantidad administrada puede ser suficiente para colonizar el tracto respiratorio de los páj aros .

Las cepas de Mycoplasma gallisepticu (MG) de la presente invención pueden hacerse crecer en cultivo de acuerdo a, pero no limitado al siguiente protocolo. El medio de frey para aislamiento de Micoplasmas aviarios.

Base de caldo de Micoplasma 22.5 g Dextrosa 3.0 g Suero de cerdo 120 mi Extracto de levadura 35 mi Rojo fenol (1%) 2.5 mi Acetato de talio (10%) A 6 mi Ampicilina 1 g/litroA Combinar reactivos y cantidad suficiente para 1000 mi con agua destilada.

Aacetato de talio y ampicilina pueden ser omitidos cuando se trabaja con cultivos de MG puros, como en la producción de vacuna comercial.

Ajustar el pH a 7.8 con 20% de NaOH y esterilizar por filtro.

Otros factores de crecimiento y conservadores pueden ser usados en lugar de unos enlistados anteriormente sin alejarse del alcance de la invención.

Para medio de agar usar 1% de agar purificado como un agar de iones #2, agar noble, o agar purificado Difco. Todos los componentes excepto el suero y ampicilina son esterilizados por llevar a autoclave en 121°C por 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar asépticamente suero y ampicilina, los cuales han sido preesterilizados por filtración y calentados a 50°C. Mezclar y vaciar a platos a una profundidad de aproximadamente 5 mm.

La invención también proporciona un kit el cual incluye cepa K5831 de MycQplasma gallisepticum, y/o una progenie o derivado de los mismos descritos en la presente. El kit puede incluir uno o más recipientes llenos con Mycoplasma gallisepticum de la presente invención. La cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum puede ser liofilizada. El kit puede incluir contenedores adicionales, separados de otras cepas de Mycoplas a gallisepticum u otros patógenos de aves. Adicionalmente, se incluye también el kit que puede incluir otros reactivos como amortiguadores y soluciones necesarias para practicar la invención. Opcionalmente asociado con el recipiente pueden estar instrucciones anotadas o impresas. Un kit de la presente invención puede incluir "material de empaque". Como se usa en la presente, el término "material de empaque" se refiere a una o más estructuras físicas usadas para alojar los contenidos del kit. El material de empaque es construido por métodos bien conocidos, preferentemente para proporcionar un ambiente libre de contaminantes, estéril. El material de empaque puede ser una matriz sólida o un material como vidrio, plástico, papel, papel aluminio, y similares. De esta forma, por ejemplo, un empaque puede ser un vial de vidrio o plástico usado para contener cantidades ccu de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum.

La presente invención es ilustrada por los siguientes ejemplos. Es para ser entendido que los ejemplos, materiales, cantidades y procedimientos particulares son interpretados ampliamente de acuerdo con el alcance y espíritu de la invención como se indica en la presente. Por cualquier método descrito en la presente que incluye etapas discretas, las etapas pueden ser realizadas en cualquier orden factible. Y, como sea apropiado, cualquier combinación de dos o más etapas pueden ser realizadas simultáneamente.

Ejemplos Ejemplo 1 Cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum Estudios de dosis mínima Este ejemplo investiga la dosis mínima infecciosa y la dosis protectora mínima de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum (MG) como una vacuna viva en pollos. Ochenta pollos de tipo carnada comercial son adquiridos de ocho semanas de edad a partir de una fuente conocida para ser libre de MG y se alojan en ocho corrales. Los pollos son tamizados para detectar la presencia de Micoplasma por cultivo y serología al llegar. Los resultados del tamiz de prevacunación de los pollos son negativos para la presencia de Micoplasma y anticuerpos .

Para tamizado de serología, se analizan los sueros para anticuerpos de MG usando la prueba de aglutinación de placa de suero (SPA por sus siglas en inglés) usando antígeno comercial (Intervet America, Millsboro, Del) y la prueba de inhibición de hemaglutinación (HI por sus siglas en inglés) con antígeno preparado de la cepa A5969 y eritrocitos de pollo. Las pruebas SPA y HI son realizadas de acuerdo con procedimientos descritos por Kleve (Kleven S. H. Mycoplasmosis : In¡ A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Cuarta edición, Pour ed.

D.E. Swayne, J. R. Glisson, M. W. Jackwood, J. E. Pearson and W. M. Reed, Eds . American Association of Avian Pathologist, Kennett Square, PA, pág. 74-80, 1998) . Una clasificación de SPA > es considerada positiva. Un título HI de 1:20 es considerada sospechosa y > 1:40 es considerada positiva. Los ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzima comercial (ELISA por sus siglas en inglés) son también realizados en el suero (IDEXX, Westbrook, Maine) .

Para el aislamiento e identificación de Micoplasma, frotis de algodón a partir de fisura de coana, tráquea, sacos aéreos o varios sitios para distribución corporal son usados para cultivo. Los frotis son inoculados en caldo modificado de Frey y agar y se incuban en 37 °C por un mínimo de tres semanas. Los aislados de Micoplasma son identificados usando inmunofluorescencia directa.

Para determinar la dosis infecciosa mínima, seis grupos de doce pollos son vacunados por medio de aerosol con diluciones de K5831B-19 a partir de 107 unidades de cambio de color/ml (ccu/ml) a 102 ccu/ml . En tres días post reto se les realiza a los pollos un frotis y se cultivan para MG. En cinco semanas post vacunación se sangran los pollos y se cultiva. Una dosis de 6.22 xlOs ccu/ml infecta diez de doce pollos (83%); 6.22 x 105 ccu/ml infecta cuatro de doce pollos (33%) y 6.22 x 104 ccu/ml infecta dos de doce pollos (17%). En 33 días post vacunación los grupos vacunados con 5.22 x 106 ccu/ml y 6.22 x 105 ccu/ml de K5831B-19 son 100% positivos para MG por cultivo. Estos descubrimientos son resumidos en la Tabla 1.

Tabla 1. Dosis Infecciosa Mínima. Aislamiento de MG a partir de las tráqueas de pollos 3 días post vacunación (aerosol) con K5831B-19A Dosis de la vacuna Aislamiento de MG (Tráquea) Ninguna 0/lla 6 .22 x 101 0/11" 6 .22 x 102 0/7* 6 .22 x 103 0/9a 6 .22 x 104 2/12ab 6 .22 x 105 4/12b 6 .22 x 106 10/12° A valores dentro de una columna con un índice superior de caso menor diferente son significativamente diferentes (P < 0.05) B No. de muestras positivas/no. de muestras probadas Para determinar la dosis protectora mínima, en seis semanas post vacunación se retan los pollos con la cepa R. Un grupo sirve como controles retados no vacunados y un segundo grupo no retado como controles negativos. Se les practica la autopsia a los pájaros en diez días post reto y se evalúan por clasificación de lesión de saco aéreo, serología, cultivo y espesor de mucosa de tráquea y se clasifica. Los grupos vacunados con 6.22 x 106 ccu/ml y 6.22 ccu/ml de K5831B-19 tienen clasificaciones de lesión de saco aéreo promedio significativamente menores y mediciones de mucosa traqueal media cuando se comparan con los controles de reto no vacunados. La dosis de vacuna de 6.22 xlO6 cc/ml también resultan en aislamientos de MG significativamente menores a partir de los sacos aéreos de los pájaros cuando se comparan con los controles. El análisis RAPD de algunos de los aislados de los grupos vacunados con 6.22 x 106 ccu/ml y 6.22 x 105 de K5831B-19 muestran que los aislados pueden ser cultivos mixtos de cepa R y K5831B-19. Estos resultados son resumidos en la Tabla 2.

Por lo tanto, 6.22 x 105 ccu/ml de K5831B-19 es el título mínimo necesario para infectar e inducir la protección adecuada de vacunación.. Aunque solamente 33% de los pollos son inicialmente infectados por esta dosis, 30 días después 100% del grupo son infectados y la protección es buena. Un título de 6.22 x 10s ccu/ml resulta en mejor protección. Esta dosis mínima puede ser afectada por muchos factores que incluyen el método- de administración, alojamiento y ambiente.

Ejemplo 2 Cepa 5831 de Mycoplasma gallisepticum Transmisibilidad y Excreción Este ejemplo investiga el potencial de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum (MG) para transmitir de pollos infectados a pollos jóvenes. Se investiga la persistencia (excreción) de K5831B-19 en el tracto respiratorio de pájaros vacunados.

Procedimiento Ciento veinticinco pollos de tipo de carnada de machos son adquiridos de una fuente libre de Micoplasma. Los pájaros son alojados en corrales. Hay cuatro grupos (35, 15, 20 y 20 pollos en cada corral) para el estudio de transmisión y un grupo de 35 pollos para el estudio de excreción. Cinco pollos de tres semanas de edad se tamizan para Micoplasma por cultivo y serología.

Transmisibilidad. Se infectan 35 pollos de cuatro semanas de edad en el grupo sembrador de pollos con K583IB- 19 por vía aerosol. Cinco de estos pollos son entonces mezclados con el grupo de 15 contactos directos . Se colocan veinte pollos en un corral inmediatamente adyacente a los contactos directos (contactos entre los alambres) . Otro grupo de 20 pollos son colocados en un corral separado a partir de contactos directos por un corral vacío (contactos de entre corrales vacíos) . Los quince contactos directos y cinco pollos de cada uno de los grupos de contacto entre alambre y entre corral vacío son sangrados para serología y los frotis son obtenidos para cultivo de Micoplasraa en 1, 2, 4, 8, 12, 16 y 20 semanas post inoculación de los sembradores. Se remueven cinco sembradores viejos (sangrados y a los que se les realiza frotis) y se reemplazan con cinco nuevos sembradores en cada sangrado/f rotis . En post inoculación de 20 semanas todos los pájaros son sangrados, cultivados y eutanizados.

Excreción. En 35 pollos de cuatro semanas de edad con K5831B-19 por medio de aerosol. Cinco pollos post inoculación de 1, 2, 4, 8, 12, 16 y 20 semanas se remueven y evalúan por serología, cultivo de tráquea y frotis de sacos aéreos e his topatología de la tráquea.

Tabla 2 Dosis Protectora Mínima. Respuesta Serológica, clasificaciones de lesión y aislamiento de Mg a partir de pollos con 10 días post reto con la cepa RA Dosis de Reto SPA HI ELISA Clasificac Espesor de Aislamiento de M3 la vacuna ión de la mucosa Fisura Sacos aéreos lesión de de la coanal saco aéreo tráquea Ninguna No 0/?0?(0.0)& 7/9(1.2)te 0/10(0.0)a 0/10(0.0) 3 70.7±20.5a 0/10a 0/10a Ninguna Si 10/10 (2.9)te 8/8(2.2)b 10/10(1.0)* 10/10 (3. l)b 173.8+60.6° 10/10" 10/10c 6.22X101 Si 10/10(3. )c 9/9(2.3)b 10/10(1.4)te 10/10(3.1)" 252±59.8d ío/io" 10/10c 6.22X102 Si 9/10 (2.1)^ 10/10 (2.4)b 10/10(2.0)1"31 10/10(3.1)" ±31.1+ 9.2^ 10/10" 10/10c 6.22X103 Si 10/10 (3.3) c 8/8(2.3)b 10/10(1.6)ta 9/10(2.4)b 175.9±64.4C 10/10" 10/10C 6.22xl04 Si 10/10 (2.8)ta 8/8(2.3)b 10/10 (2.5) 10/10(2.3)" 186.7±70.6ai 10/10" 10/10C 6.22X105 Si 10/10 (3.1)1* 10/10 (2.3) b 10/10 (3. l)d 5/10(l.l)a 86.3±13.8* 10/10" d/??^ 6.22X106 Si 10/10 (2.3) b 9/9(2.2)b 10/10 (2.7) d 1/10(0.2)a 96 -1±19.8a" 10/10" 7/10" A Valores dentro de una columna con un índice superior de caso inferior son significativamente diferentes (P 0.05) BNo de muestras positivas/no. de muestras probadas (SPA > 1, HI:> 20, ELISA; > 0.05, clasificación de sacos aéreos) cGrado de aglutinación media (de 0 a 4) Dtítulo medio log 10 Eproporción de muestra media/positiva F macroscópicamente clasificado de 0 a 4 G espesor medio (µ??) Resultados Transmisibilidad . Se presentan los resultados de transmisibilidad en la Tabla 3. En post introducción de cuatro semanas (PI) de los sembradores, un pájaro mixto (contacto directo) es positivo al cultivo para K5831B-19. En PI de ocho semanas los contactos directos tienen un nivel inferior de infección (2/15) por cultivo y serología. En dieciséis de PI la mayoría de los contactos directos (12/14) son infectados con K5831B-19. La vacuna no se transmite a. pájaros en un corral adyacente separado por malla de alambre a pájaros separados por un corral vacío. Estos datos son presentados gráficamente en la Figura 1.

Tabla 3 (Capacidad de transmisión) . Respuesta serologica y aislamiento de Mg a partir de fisura coanal de pollos post reto con la cepa K5831B-19 por gotas para los ojos (sembradores), contacto directo, contacto indirecto entre corrales vecinos (adyacente) o con una separada de corral vacío.

Semanas Contacto SPA HI ELISA Aislamiento post reto K583XB-9 de MG 1 Sembradores de 5/5" (4. 0)B 3/5(0. 8)c 0/5(0.0)° 5/5 Corral vacío 0/15(0. 0)B 0/15 (0 .0) 0/15 (0.0) 0/15 adyacente 1/5(0. 2) 0/5(0. 0) 0/5(0.0) 0/5 directo 0/5(0. 0) 0/5(0. 0) 0/5(0.0) 0/5 2 Sembradores de 5/5 (4. 0) 5/5(1. 5) 0/5(0.1) 5/5 Corral vacío 0/15 (0 .0) 0/15 (0 .0) 0/15 (0.0) 0/15 adyacente 0/5 (0. 0) 0/5(0. 0) 0/5(0.0) 0/5 directo 0/5(0. 0) 0/5(0. 0) 0/580.0) 0/5 4 Sembradores d 5/5(4. 0) 5/5(1. 8) 5/5(2.1) 5/5 corral vacío 0/15 (0 .0) 0/15 (0 .0) 0/15(0.0) 1/15 adyacente 0/5(0. 0} 0/5(0. 0) 0/5(0.09 0/5 directo 0/5(0. 0) 0/5(0. 0) 0/5 (0.09 0/5 8 Sembradores 5/5(4. 0) 5/5(1. 9) 5/5(2.1) 5/5 de corral 2/15 (0 .5) 3/15 (0 .3) 0/15 (0.1) 2/15 vacío 0/5(0. 0) 0/5(0. 0) 0/5(0.0) 0/5 adyacente 0/5(0. 0) 0/5(0. 0 ) 0/5(0.0) 0/5 directo 12 Sembradores 5/5(4.0) 5/5(1.7) 5/5 (2.2) 5/5 de corral 1/15(0.3) 1/15(0.1) 1/15(0.1) 1/15 vacío 0/5(0.0) 0/5(0.0) 0/5 (0.0) 0/5 adyacente 0/5(0.0) 0/5(0.0) 0/5(0.0) 0/5 directo 16 Sembradores 5/5 (3.8) 5/5(1.8) 5/5(3.0) 5/5 de corral 11/14(2.6) 10/14 (1.2) 6/14(0.6) 12/14 vacío 0/5 (0.0) 0/5(0.0) 0/5(0.0) 0/5 adyacente 0/5(0.0) 0/5(0.0) 0/5(0.0) 0/5 directo 20 Sembradores 4/4 (4.0) 5/5(1.8) 4/4 (2.3) 4/5 de corral 13/1 (3.7) 13/14 (1.7) 13/14 (1.4) 13/14 vacío 0/20(0.0) 0/20 (0.0) 0/20(0.0) 0/18 adyacente 0/20(0.0) 0/20 (0.0) 0/20(0.0) 0/18 directo A No. de muestras positivas/no. de muestras positivas (SPA> 1, HI:> 40, y ELISA: > 0.6) B grado de aglutinación media (de 0 a 4) c título media log 10 D proporción de muestra media/positiva geométrica + desviación estándar Tabla 4.

Respuesta serológica y aislamiento de MG a partir de post inoculación de pollos con K5831B-19 Semana SPA HI Clasifica Espesor de Clasifica Aislamiento de M3 post reto ción de mucosa de ción de Fisura Sacos aéreos saco tráquea tráquea coanal 1 5/5B(4.0)c 4/5(1.1)¾ 0/5(0.01) a 0/5 60.6±8.0 0. .0 5/5a 4/5a 2 5/5 (4.0) 5/5(1.5)* 0/5(0.19)a 0/5 58.4+10.8 0. .0 5/5a 2/5* 4 5/5(4.0) 5/5(1.8)b 2/5(0.39)* 0/5 69.7±7.6 0. .0 5/5a 1/5" 8 5/5(4.0) 5/5(1.7)" 5/5(1.36)^ 0/5 89.2±9.6 0. .0 5/5a 0/5" 12 5/5(4.0) 5/5(1.8)" 5/5 (2.17) 01 0/5 192.2±94.3 0. .0 5/5a 0/5" 16 5/5(4.0) 5/5(1.8)" 5/5(2.80)d 0/5 116.6±5.2 0. .0 3/4a 0/5" 20 5/5(4.0) 5/5(1.7)* 5/5 (2.58)d 0/5 134.1±30.4 0. .0 3/4a 0/5" A Valores dentro de una columna con un índice superior de caso inferior diferente son significativamente diferentes (P< 0.05) B No. de muestras positivas/no. de muestras probadas (SPA > 1; HI: > 20, y ELISA: > 0.5) cgrado de aglutinamiento media (de 0 a 4) Dtítulo medio log 10 E proporción muestra/positiva media Excreción. Se presentan los resultados de excreción en la Tabla 4. K5831B-10 es reaislado de pájaros vacunados hasta post vacunación de 20 semanas tiempo en el cual se concluye el estudio. La incidencia de reaislamiento a partir de sacos aéreos y tráquea disminuye al paso del tiempo. La vacuna está ausente de sacos aéreos post vacunación de ocho semanas y la incidencia de recuperación de la tráquea disminuye a 60% (3/5) en post vacunación de 20 semanas. Los pájaros continúan para ser seropositivos en post vacunación de 20 semanas. Estos datos son presentados gráficamente en la Figura 2.

En este estudio la mayoría de los pollos mixtos permanecen negativos hasta 20 semanas de edad después del inicio de la madurez sexual. Puede ser concluido que K5831B-19 tiene una proporción relativamente baja de transmisión. En este estudio, K5831B-19 persiste en el tracto respiratorio superior para la duración del estudio (cinco meses) .

Ejemplo 3 Cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum Pasaje de nuevo en pollos Este ejemplo investiga el potencial de la cepa 5831 de Mycoplasma. gallisepticum (MG) para provocar enfermedad en pollos después de cinco pasajes de nuevo en pollos. Se investiga también la distribución de MG en el cuerpo de pollos con reto.

Procedimientos Pasaje de nuevo. Se adquieren veinticinco pollos SPF en tres semanas, de edad y se alojan en cinco unidades de aislamiento. Un grupo de cinco pollos es retado con K5831B-19 por medio de gotas para los ojos. En un post reto de una semana se frotan las tráqueas de estos pájaros y estos frotis son usados para infectar un segundo grupo de cinco pollos. Se pasa de nuevo K5831B-19 en esta forma cinco veces. Se vuelve a aislar MG de pollos infectados por inoculación de los frotis de la tráquea en caldo de Frey modificado después de que se usan los frotis para transferir la infección (K5866, K5969, K5872, y K5876) . El reaislado final de K5831B-19 (B5883-2) se usa en el estudio de reto.

Reto. Ochenta pollos del tipo de carnada comercial son adquiridos de una fuente conocida para ser libre de MG y MS. Estos pollos son alojados en cuatro alojamientos de colonias. Se tamizan ocho pollos de cuatro semanas de edad, para asegurar que sean libres de MG por serología y cultivo. Tres de los grupos de pollos de cinco semanas de edad son retados con cultivos de fase log de cepa K5831B-19 (2.59 xlO8 CCü/ml) , K5883-2 (1.21X107 ccu/ml) y cepa R (1.15 x 108 ccu/ml) . Un grupo no es retado (controles negativos) . Se someten a autopsia los pájaros en diez días post reto y se evalúan por clasificación de lesión de saco aéreo, serología y cultivo.

Distribución corporal. Además de la tráquea y sacos aéreos, seis sitios (rinón, hígado, bolsa, pulmones, cecal tonsil y bazo) a partir de cinco pájaros con reto de 5831B-19 (2.59 x 108 ccu/ml) anterior son cultivados.

ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) . Se usa el análisis RAPD para aislados de huella. El análisis y secuenciación de RAPD de cuatro genes . objetivados (pvpA, mgc2, gapA y MGA_0319) son usados para comparar K2101, K5831B-19 y K5883-2. El procedimiento y cebadores usados son como se describe por Fan et al. (Fan et al., 1995, Avian Dis 39:729-735) .

Análisis de Secuencia de ADN. Las secuencias de ADN de aislados y cepas de referencia son analizados y comparados como se describe previamente (Ferguson et al., 2003, Avian Dis; 47 (3) : 523-30) . Las secuencias del gen pvpA (Boguslavsky et al., 2000, Infect Immun; 68:3956-3964); y Liu et al., 2001, J Clin Microbiol; 39:1882-1888), una secuencia de lipoproteína (MGA_0319) (Nascimento et al., 1991, Avian Dis; 35:62-69), gapA (Goh et al., 1998, Microbiol; 44:2971-2978; y Keeler et al., 1996, Infect Immun; 64:1541-1547) y el gen citadehsina mgc2 (Hnatow et al., 1998, Infect Immun; 66:3436-3442) son comparados como se describe previamente (Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151:1883-1893). Se realiza el análisis de secuencia con MegAlign (DNASTAR, Lasergene, Inc., Madison, isconsin) .

PCR de tiempo real que diferencia la cepa cuantitativa. Las laringes de pájaros con nautopsia son recolectados en tubos PBS estériles de 4 mi. Un mi de lavado de laringe (después de muestras de vórtice por 30 segundos) se usa para extracción de ADN. Los extractos de ADN son sometidos a PCR de tiempo real Taqman con cebadores y sondas capaces de diferenciación entre las vacunas (K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, cepa F) y cepa R. Se hace el análisis cuantitativo por graficar el número de ciclo de umbral (valor CT) en curvas estándar determinadas previamente junto con controles estandarizados para las reacciones. (Raviv et al., 2008, Vet Microbiol; 129(1-2): 179-87).

Resultados Pasaje de nuevo. El análisis RAPD y de secuencia de K5831B-19 y K5883-2 no muestra cambios genéticos que resultan del pasaje de nuevo. Ambos demuestran un patrón K2101 de RAPD. Los resultados de RAPD son mostrados en las Figuras 7 y 8.

Reto. Los resultados del reto son presentados en la Tabla 5. El reto con el aislado de pasaje de nuevo (K5883-2) no resultan en un incremento significativo en lesiones gruesas (clasificaciones de saco aereo) cuando se comparan con K5831B-19 original y controles negativos (P< 0.05).

Distribución corporal. Se recupera MG de los pulmones (5/5) así como también las tráqueas (20/20) de pájaros con reto con K5831B-19. Se vuelve a aislar el MG también de 6 de 20 (30%) de los sacos aéreos de estos pollos. Estas no son aislamientos de estudios de riñon, hígado, bolsa, cecales.

Tabla 5. Pasaje de nuevo K5831B-19 . Respuesta serológica y clasificaciones de lesión de pollos 10 días p<ost reto con K5831B-19, K883-2, o cepa RA Reto SPA HI ELISA Clasificación Aislamiento MG de lesión de Tráquea Sacos saco aéreo aéreos Ninguno 0/20B (0.0)Ca 0/20 (0.0)Da 1/20(0.01)Ea 0/20(0.0)F 0/20* 0/20b K5831B- 20/20 (20. )b 0/20(0.0)a 0/20 (0.0)a 0/20(0.0)a 20/20 6/20 19 20/20 (2.0) b 17/20 (1.2)b 9/20 (0.6)b 1/20(0. l)a 20/20 15/20c K5883-2 20/20 (2.0) 20/20 (1.9)° 17/20 (1.1) c 18/20(2.0)b 20/20b 19/20c Cepa R Valores dentro de una columna con un índice superior de caso inferior diferente son significativamente diferentes (P< 0.05) B No. de muestras positivas/no. de muestras probadas (SPA > 1; HI: ^ 20, y ELISA: > 0.5, clasificación de saco aéreo > 1) cgrado de aglutinamiento media (de 0 a 4) Dtítulo medio log 10 E proporción muestra/positiva media Fclasificación media Discusión K5831B-19, una cepa de MG que se presenta en forma natural de baja virulencia puede tener la ventaja de estabilidad incrementada sobre muchos pasos in vivo cuando se compara con las cepas de vacuna atenuadas de laboratorio. Este ejemplo demuestra que no hay incremento en virulencia de K5831B-19 cuando se pasan de nuevo cinco veces a través de pollos y se evalúan las lesiones gruesas después de reto. A partir de análisis de distribución corporal, este ejemplo también demuestra que K5831B-19 permanece principalmente en el sistema respiratorio de pájaros con reto.

Ejemplo 4 Transmisión vertical 5831 de cepa de Mycoplaama gallisepticum Este ejemplo investiga el potencial de la cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum (MG) para transmitirse de pollos infectados a embriones.

Procedimientos Se adquieren treinta pollos de carnada hembra y nuevo machos a partir de una fuente libre de Mycoplasma. Los pájaros son alojados en tres corrales (diez hembras y tres machos por corral) . En cinco pollos de 25 semanas de edad (aproximadamente 80% de producción) son tamizados para Micoplasma por cultivo y serología. Se retan pollos de 25.3 semanas de edad por aerosol con K5831B-19 (6.2 x 108 ccu/ml) . Se recolectan los huevos diariamente a partir de 24 semanas de edad hasta el final de estudio. Los sacos de yema de embriones incubados de 18 días de edad son cultivados para Micoplasma. Pollos de 32 semanas de edad se someten a autopsia y se evalúan.

Resultados Los pollos son negativos para Micoplasma por serología y cultivo en tamizado de prevacunacion.

Cultivo de embriones. No se recupera el Micoplasma de ninguno de los embriones durante el estudió.

Cultivo de tráquea y saco aéreo. Se recupera el MG de 35/36 (97%) de frotis de tráqueas pero solamente de 4/36 (11%) de frotis de sacos aéreos en post vacunación de siete semanas de edad.

Serología. En post vacunación de siete semanas todos los pollos se han seroconvertido a MG.

Lesiones de tráquea y saco aéreo. Ninguna lesión de saco aéreo se observa en autopsia. Unos cuantos de los pájaros tienen lesiones traqueales muy ligeras que consisten de infiltración linfocítico, hiperplasia de glándula mucosal y pérdida ciliar.

Para la evaluación de lesiones, la lesiones en pollos con autopsia durante el estudio son evaluadas en forma gruesa por lesiones de saco aéreo que clasifican en una escala de 0 a 4 (Kleven et al., 1972, Avian Dis; 16:915-924). Las lesiones traqueales son evaluadas microscópicamente por medir el ancho de la mucosa traqueal. Una sección es recolectada de la tercera parte de la tráquea (aproximadamente una pulgada (2.54 cm) distal de la laringe) y se fija en 10% de formalina neutral. Se mide el espesor de mucosa traqueal en cuatro puntos equidistantes en cortes histológicos de secciones transversales de tráqueas. Las lesiones tráqueas son también clasificadas de 0 a 3. Con el análisis estadístico, clasificaciones de lesiones de saco aéreo y clasificaciones SPA son analizadas usando la prueba de Kruskal-Wallis Rank Sums . El espesor de mucosa traqueal media, títulos HI log 10, proporciones S/P ELISA y números de copias loglO son analizados usando la prueba HSD de Tukey-Kramer. JMP® Statistics ade Visual (SAS Institute Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC 27513) .

Discusión Con este ejemplo, no se detecta K5831B-19 en huevos embrionarios. La cepa debe llegar a ser sistemática para pasar a través del tracto respiratorio a la descendencia. A partir de los estudios más tempranos, K5831B-19 parece permanecer principalmente en el tracto respiratorio superior y aunque puede ser recuperado de esta área por periodos relativamente grandes de tiempo después de la vacunación (hasta 20 semanas) , la recuperación de los sacos aéreos es más variable y disminuye sobre unas cuantas semanas. Este ejemplo también demuestra que, si K5831B-19 es transmitido a través de huevos, está en una muy baja proporción que no puede ser detectada bajo estas condiciones experimentales.

Ejemplo 5 Desplazamiento de vacuna de Mycoplasma gallisepticum Este ejemplo investiga el potencial de vjacunas de Mycoplasma gallisepticum (MG) K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85 y cepa F para desplazar las cepas virulentas en pollos infectados .

Procedimientos Ciento veintisiete pollos de tipo de carnada libre de MG/MS son adquiridos en un día de edad a partir de una fuente comercial. En tres semanas de edad, diez pollos son tamizados por Micoplasma por cultivo y serología. Ocho semanas de edad, grupos de 20 pollos son vacunados con K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85 y cepa F. Un grupo de 12 pollos de 13.3 semanas de edad (sembradores) son inoculados con cepa R por medio de gota de ojos. Cinco pollos de 14 semanas de edad, de cada uno de los grupos vacunados son sometidos a autopsia y se evalúan (autopsia 1) . En este momento (post vacunación de seis semanas) , dos sembradores son mixtos con el resto de 15 pollos en cada uno de los grupos vacunados y 15 pollos simples (controles retados) . Los pollos son sometidos a estrés por vacunación con Newcastle/bronquitis infecciosa en este momento. Dos semanas después de la introducción de los sembradores, cinco pájaros de cada uno de los grupos son removidos, se someten a autopsia y se evalúan (autopsia 2) . Este procedimiento es repetido en cuatro y ocho semanas post reto (autopsia 3 y 4) . En cada autopsia, la evaluación consiste de cultivo, serología, clasificación de lesiones de saco aéreo, histopatología de tráqueas, y análisis de PCR cuantitativo (Q-PCR) .

Vacunación. Las vacunas 6/85 (Mycovac-L ® Intervet, Millsboro, DE) y la cepa F (F Vax-MG® Schering-Plough Animal Health Corporation, Summit, NJ) son administradas por aspersión gruesa usando un dispersor de pintura comercial (Preval Sprayer División, Precisión Valve Corporation, Yonkers, NY) . Estas vacunas liofilizadas son reconstituidas de acuerdó a las instrucciones de los fabricantes con agua destilada para una concentración de 1 dosis/ml. K5831B-19 y K5054 son también administrados por aspersión gruesa como cultivos de crecimiento activamente frescos. Los cultivos de fase de log son diluidos 1:10 con caldo modificado de Frey antes a la aplicación a la dosis más cercanamente próxima de las vacunas comerciales . Se administra aproximadamente un mililitro (Mi) de cultivo) por pájaro. La vacuna ts-11 (Merial Select, Qainesville, GA) es administrada congelada por gota para los ojos de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes . Todos los grupos son también vacunados con Newcastle-Bronchitis (Poulvac® Aero, Fort Dodge Animal Health, Fort Doge, 1A) por medio de aspersión gruesa de acuerdo a las direcciones de los fabricantes.

Reto. La cepa R es una cepa MG virulenta. Se administra por gota de ojos (100 µ?/pá aro) a los sembradores .

Resultados Serología. A partir de los resultados serológicos de la primera autopsia (post vacunación de seis semanas) todos los grupos vacunados han sido seroconvertidos a MG con la excepción del grupo vacunado con 6/85. El grupo ts-11 es seroconvertido menos fuertemente que los grupos vacunados con K5831B-19, K5054 y cepa F. Los grupos 6/85 y ts-11 ambos rezagados atrás de los otros grupos en términos de seroconversión hasta cuatro a ocho semanas después de la introducción de los sembradores.

Lesiones de saco aéreo. Dos semanas después de la introducción de los sembradores algunos de los pájaros tienen lesiones de saco aéreo medias, probablemente asociadas con la vacunación de Newcastle-Bronquitis .

Lesiones Traqueales. El análisis de reacciones traqueales es complicado por la introducción de virus de vacuna NDV/IB. Hay alguna reacción también en los grupos antes de la introducción de sembradores y virus de vacunas que pueden haber sido asociados con diferencias ambientales entre las casas.

PCR. Los grupos vacunados con números de copias menores de K5831B-19 y la cepa F log 10 de la cepa R a través del estudio cuando se comparan con otras vacunas y los controles no vacunados. Estas diferencias no son siempre significativas. No hay 6/85 detectado en el grupo vacunado con 6/85 hasta la autopsia final en ocho semanas después de la introducción de los sembradores. Debe ser notado que todos los sembradores son infectados con las vacunas respectivas.

Discusión Los resultados de este ejemplo son presentados en las Tablas 6 y 7 y las Figuras 3-6. Este ejemplo demuestra que las vacunas con K5831B-19 y la cepa F resultan en los números de copia más bajos loglO de cepa R, indicando menor colonización con la cepa R. Estas vacunas pueden ser muy útiles para la prevención de infección con cepas del tipo silvestre virulentas y por lo tanto desplazan cepas endémicas circulantes de las operaciones de aves .

Tabla 6. Respuesta Serológica, clasificaciones de lesión, aislamiento d MG y PCR cuantitativa de pollos vacunados mixtos con sembradores infectados con cepa RA Senara Vacuna SEA m ELISA Panificación, Espesar de Aislamiento Q-PCR post de lesión de mucosa de tráquea De K3 Vacuna0 Oepa R reto saco aéreo traqueal (fisura coanal) 0 Ninguna ND ND ND ND ND ND ND N/A ND 6/85 0/5^(0.0)° 0/5(0.0)E 0/5(0.19) p ND 107.5+12.8" 0.0+0. & 0/5 0/5(0.0±0.0)c ' 0/5(0.0±0.0)G ts-11 4/5(2.6) 3/5(0.8) 3/5(0.88) ND 99.62S.-f1 ?.?+?.?" 4/5 5/5<2.5±1.7) 0/5(0.0±0.0) K5831 5/5(3.6) 5/5(1.4) 5/5 (2.01) ND 105.8+51.7" 0.4+O.SP 5/5 5/5(4.7+0.9) 0/5(0.0±0.0) K5054 5/5(3.8) 5/5(1.4) 4/5(0.63) ND 142.8±54.9* 1.4±0.S* 5/5 4/5(3.3±2.3) 0/5(0.0+0.0) Cfcpa F 5/5(4.0) 5/5(1.9) 5/5(3.33) ND 198.0±53.5* 1.8+0.4* 5/5 3/5(1.7±1.7) 0/5(0.0+0.0) 2 Ninguna 5/5(3.4) 5/5(1.5) 4/5(0.86) 3/5(0.8) 581.1+264.0° 2.6±0.9° 5/5 N/A 5/5(4.2+0.8)° 6/85 0/5 (0.0) 0/5(0.0) 0/5(0.13) 1/5(0.2) 149.8±30.5* 0.6+0.5s 1/5 0/5(0.0±0.0) 3/5(1.8+2.5)* ts-11 5/5(2.4) 1/5(0.3) 2/5(0.55) 1/5(0.4) 156.5+17.6s 1.0+0.0* 5/5 3/5(3.5+3.2) 4/5(2.7+2.7)* K5831 5/5(4.0) 5/5(1-7) 5/5(3.00) 1/5(0.2) 444.5+120.7* 2.6+0.5° 5/5 5/5(4.8+0.7) 0/5<0.0±0.0)b K5054 5/5(4.0) 5/5(1.7) 5/5(2.11) 1/5(0.2) 439.5+315.8* 2.0±1.0* 3/4 2/5(0.6+0.8) 5/5(4.0±2.3)a CSpa F 5/5(4.0) 5/5(1.7) 5/5(2.42) 1/5(0.2) 303.8+96.5* 2.0±0.7* 5/5 5/5(3.7+0.8) 1/5(0.6+1.4)* 4 Ninguna 5/5(3.6) 5/5(1.7) 2/5 (0.40) 0/5(0.0) 478.5+247.0* 2.410.9a 5/5 N/A 4/5(1.4+1.4)* 6/85 3/5(1.2) 2/5(0.6) 2/5(0.59) 0/5(0.0) 148.6±18.8" 0.8+0.4" 5/5 0/5(0.0+0.0) 5/5(3.9+1.4)* ts-11 5/5(4.0) 5/5(1.5) 4/5(1.22) 0/5(0.0) 173.9+43.6s 1.2+0.4* 5/5 2/5(1.2±1.9) 3/5(2.2±2.4)* K5831 5/5(4.0) 5/5(1.8) 5/5(2.50) 0/5(0.0) 186.3±33.l" 1.2±0.8* 5/5 2/5(l.l±1.6) 3/5(l.l±1.4)b K5054 5/5(4.0) 4/5(1.3) 5/5(1.65) 0/5(0.0) 211.2+79.3" 1.6±0.5* 5/5 0/5(0.0±0.0) 5/5(4.2±1.0)" C F 5/5(4.0) 5/5(1.6) 5/5(1.66) 0/5 (0.0) 183.4+32.8" 1.2i0.4* 5/5 5/5 (2.6±1.0) 4/5(1.2+0.8)" 8 Ninguna 5/5(3.4) 4/5<1.3) 4/5(1.67) 0/5(0.0) 190.5±55.1* 1.6±0.5* 4/5 N/A 3/5(1.3±1.7)* 6/85 5/5(4.0) 5/5(1.8) 5/5(3.55) 1/5(0.2) 313.1±108.5* 2.0±0.7" 5/5 2/5(0.7+1.0) 5/5(2.5±1.0)* ts-11 5/5(3.6) 5/5(1.7) 4/5(2.62) 0/5 (0.0) 263.9±71.3* 1.8+0.5* 4/5 3/5(1.0+1.0) 3/5(1.9+1.8)* K5831 5/5(4.0) 5/5(1.6) 5/5(4.13) 0/5(0.0) 173.6+21. l 0.8+0.5" 5/5 4/5(1.9±l.l) 2/5(1.1+1.5)* 5054 5/5(3.8) 5/5(1.7) 5/5(1.54) 0/5(0.0) 208.3±51.1* 1.4±0.5° 5/5 5/5(3.1+0.6) 5/5(3.4+0.9)" Cepa F 5/5(4.0) S/5(1.5) 5/5(2.03) 0/5(0.0) 195.9+24.0* 1.0±0.7* 5/5 5/5(3.7±0.5) 1/5(0.2±1.5)b Valores dentro de una columna con un índice superior de caso inferior diferente son significativamente diferentes (P < 0.05) B específico PCR quantitativo para vacunas respectivas para cada grupo c De muestras positivas/no. de muestras probadas (SPA:>1, HI:>20, y ELISA: > 0.5) Dgrado de aglutinación media (de 0 a 4) E título medio log 10 D muestra media/proporción positiva G proporción de muestra/positiva media ND= no hecho N/A=no aplicable Tabla 7. Respuesta Serológica, clasificaciones de lesiones/ aislamiento de MG y PCR cuantitativa de sembradores retados con cepa R y mixtos con pollos vacunados Sanana Vacuna SEA HI ELISA CLasif. De Espesar de Clarri de Aisi¿miento Q-KR pcst lesión de mocosa tráquea De NE Vacuna1 Cepa R reto saco aéreo traqueal (fisura coaral) 8 Niiguna 2/2B(4.0) ,,,2/2(1.6)D 2/2(2.5)E 0/2(0.0) 171.2±39.6 0.5+0.7 2/2 N/A 1/2 (1.2±1.8)F 6/85 C 2/2(1.8) 0/5(1.01) 1/2(0.5) 108±23.5 1.0+0.0 2/2 2/2(3.3±0.2)P 2/2(1.4+0.4) tS-U. 2/2(4.0) 2/2(1.9) 2/2(2.68) 0/2(0.0) 267.7±2.9 2.0±0.0 1/2 2/2(3.3±0.7) 0/2(0.0±0.0) K5831 2/2(4.0) 2/2(1.8) 2/2(4.27) 0/2(0.0) 195.1±35.2 1.5±0.7 2/2 2/2(3.5±0.1) 1/2(0.3±0.4) K5054 2/2(4.0) 2/2(1.6) 2/2(3.06) 0/2(0.0) 243.8±51.4 0.5±0.7 2/2 2/2(3.7+0.0) 2/2(4.2+0.1) Cepa F 2/2(4.0) 2/2(1.8) 2/2(1.8) 0/2(0.0) 185.7±48.4 1.5±0.7 1/1 2/2(3.8±0.1) 1/2(0.9±1.2) 2/2(4.0) A PCR cuantitativa especifica para vacunas respectivas para cada grupo B no de muestras positivas/no. de muestras probadas (SPA:>1, HI:>20, y ELISA: > 0.5) cgrado de aglutinación media (de 0 a 4) Dtítulo medio log 10 proporción de muestra media/positiva F número de copia promedio loglO + SD N/A=no aplicable Ejemplo 6 Patogenicidad de cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 en huevos embrionados Se determina la patogenicidad de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum (MG) en huevos embrionados por evaluación de la dosis letal de huevo embrionado (ELD50) y se compara con aquella de la cepa R.

La dosis letal de huevo embrionado (ELD50) . 0.2 mi de 100 a 108 ccu/ml de muestras diluidas (K5831B-19 y cepa R) se inocula en huevos embrionados de dieciséis días embrionados por medio de la ruta de saco de yema. Arriba de doces días de incubación, se examinan los embriones y se calcula ELD50. Los resultados de este ejemplo son mostrados en las Tablas 8 y 9.

Ejemplo 7 Propiedades Bioquímicas, Biológicas y Serológicas de cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum Con este ejemplo, se evalúan las propiedades bioquímicas, biológicas y serológicas de la cepa K5831 de Mycoplasma gallispticum.

Procedimientos Se examinan las propiedades de K5831B-19 por las siguientes pruebas : 1. Prueba de Fermentación de Glucosa 2. Prueba de Hidrólisis de Arginina Prueba de requerimiento de beta-NAD Prueba de reducción de tetrazolio Prueba de producción de película y mancha Prueba de Hemadsorcion Prueba de Inhibición de Crecimiento (GIT por sus siglas en inglés) Prueba de Inhibición de Metabolismo (MIT por sus siglas en inglés) Tabla 8: Cepa ELD50 de K5831B-19 Ddlucich flfprox. De Resultados # de nuertes # de acuiulafc o Proporción % de nuertes no. aproe, de no. de (- LldLTTB) nuertes No infectado (nuerte total) co faxiLsmoG arganiisn-s (C Ü) 0 10*7 9/9 9 0 34 0 1.00 100 1003.7E+O7 1 10*6 7/10 7 3 25 3 0.89 89 893720000 2 10*5 7/10 7 3 18 6 0.75 75 75372000 3 10*4 4/10 4 6 11 12 0.48 48 4837200 4 10*3 3/9 3 6 7 18 0.28 28 283720 5 10*2 2/10 2 8 4 26 0.13 13 13372 6 10*1 2/10 2 8 2 34 0.06 6 637.2 7 10 0/9 0 9 0 43 0 0 03.72 15 8 0 0/10 0 10 0 53 0 0 00 PD 0.92 Punto final 3.72 x 10 9 (309416 organismos) Tabla 9. ELD50 de cepa R Dilución Aprax no. Resultados # de # de Acumulativo Proporción % de no. aprox. de muertes muertes No (muertes/total) muertes de organismos (- trauma) afectado organismos (COJ) 2 10*5 10/10 10 0 44 0 1.00 100 100230000 3 10*4 10/10 10 0 34 0 1.00 100 10023000 4 10*3 8/9 8 1 24 1 0.96 96 962300 5 10*2 8/10 8 2 16 3 0.84 84 84230 6 10*1 5/10 5 5 8 8 0.50 50 5023 10 7 10 2/10 2 8 3 16 0.16 16 162.3 8 0 1/9 1 8 1 24 0.04 4 40 PD 0 Punto final 2.3 x 101 (23 organismos) 15 Punto final 2.3 x 10o'2 (3 organismos) Cada prueba es realizada de acuerdo con métodos comunes descritos con más detalle , en Methods in Mycoplasmology, vo. I, S. Razin, J. G. Tully, Eds, 1983. Brevemente: por la prueba de fermentación de glucosa, los materiales son medio de prueba (caldo de Frey modificado (con glucosa) ) , medio de control (caldo de Frey modificado sin glucosa) , y cultivos de caldo de fase log de cepas de prueba. Método: 1:1000 diluciones de cultivos de prueba son hechos en el medio de control . 0.1 mi de los cultivos diluidos son transferidos a tubos que contienen el medio de prueba y medio de control. Los tubos son incubados en 37 °C por 24 horas y se observa por cambio de color.

Para la prueba de hidrólisis de arginina, los materiales son medio de prueba (caldo de Frey modificado con arginina) , medio de control (caldo de Frey modificado (sin arginina) ) , y cultivos de caldo de fase log de cepas de prueba. Método: 1:1000 diluciones de cultivos de prueba son hechos en el medio de control. Los cultivos diluidos son inoculados en tubos que contienen el medio de prueba y el medio de control. Los tubos son inoculados en 37°C y se observan por dos semanas para cambio de color.

Para la prueba de requerimiento de beta-NAD, los materiales incluyen medio de prueba (caldo de Frey modificado sin beta-NAD) , medio de control (caldo de Frey modificado (con beta-NAD) ) y cultivos de caldo de fase log de cepas de prueba. Método: se hacen 1:1000 diluciones de cultivos de prueba en el medio de prueba. Los cultivos diluidos son inoculados en tubos que contienen el medio de prueba y medio de control. Los tubos son incubados en 37°C y se observan para crecimiento (cambio de color) .

Para la prueba de reducción de tetrazolio, los materiales incluyen medio de prueba (caldo de tetrazolio) y cultivos de caldo de fase log de cepas de prueba. Método: se hacen 1:1000 diluciones de cultivos de prueba en el medio de prueba. Los cultivos diluidos son inoculados en tubos que contienen el medio de prueba. Los tubos son inoculados en 37°C y se observan para crecimiento y cambio de color (rosa a púrpura rojizo) .

Para la prueba de producción de película y mancha, los materiales incluyen placas de agar de emulsión de yema de huevo y cultivos de caldo de fase log de cepas de prueba. Método : cepas de prueba son inoculadas en placas de agar y se incuban en 37°C. Las placas son observadas diariamente por 2 semanas para película y manchas.

Para la prueba de hemadsorción, el material incluye 10% de suspensión de eritrocitos de pollo lavados en PBS y placas de agar con colonias de cepas de prueba. Método: se prepara 0.5% de suspensión de RBC en 2 mi de PBS y se pipetea en placas de agar. Las placas son incubadas en 37°C por 30 minutos. Se vacía la suspensión de RBC en exceso y se lavan las placas con 5 mi de PBS . Las placas son examinadas para adsorción de RBC a colonias.

Para la prueba de inhibición de crecimiento (GIT por sus siglas en inglés) , el material incluye antisuero (MG y MS) , discos de papel de filtro absorbente estéril (diámetro de 6 mm) , cultivos de caldo de organismos de prueba, y placas de agar de Frey modificado. Método: los discos son saturados con antisuero de MG o MS . Las placas son inoculadas con 0.1 mi de cultivos de prueba diluidos y dispersados eventualmente . Se permite que sea absorbido el inoculo en temperatura ambiente. Los discos son colocados en las superficies de agar inoculado por lo menos dos cm aparte. Las placas son incubadas en 37°C y se examina para evidencia de zonas de inhibición.

Para la prueba de inhibición de metabolismo (MIT por sus siglas en inglés) , los materiales incluyen caldo de Frey modificado (con glucosa y NAD) , cultivos de caldo de organismos de prueba, antisuero (MG y MS) , y placa de microtitulo. Método: 25 µ? de medio de caldo es agregado a todos los pozos de placa de microtitulo: 25 µ? de medio de caldo se agrega a todos los pozos de la placa de microtitulo. Se agrega 25 µ? de antisuero MG o MS^ tratado con calor a los primeros pozos (excepto los controles) y diluido en serie (dos veces) . 50 µ? de los cultivos diluidos apropiados (103-104 CCU/ml) se agregan a todos los pozos apropiados excepto los controles. 125 µ? de caldo se agregan a todos los pozos excepto los controles (lo cual recibe 175 µ? de medios) . Se sellan las placas de microtítulo y se incuban en 37 °C. Las placas son primero leídas después de 72 horas de incubación.

Se prueban las siguientes cepas: K5831B-19 PG31 M. gallisepticum WVU1853 de Mycoplasma synoviae M iowae (serotipo I) (solamente prueba de hidrólisis de arginina) M. gallinarum (Serotipo B) K285 (prueba de producción de película y mancha solamente) Resultados La tabla 10 presenta los datos de estos estudios.

Tabla 10. Propiedades de K2101 de Mycoplasma gallisepticum (K5831B-19) K5831 B-19 PG-31 de M. WVU 1853 de M.iowae M. gallisepticura M . synoviae (Suero . gallinarum I) (Suero. B) K285 Fermentación de glucosa + + + ND ND Hidrólisis de arginina - - - + ND Requerimiento de Beta- - - + ND ND NAD Reducción de tetrazolio + + ND ND Producción de película - - + ND + y mancha Hemadsorción + + + ND ND Inhibición de Anti-MG 5.5B 7.5 0 ND ND cree . Anti-MS 0 0 4.5 ND ND (GIT) Inhibición Anti-MG 5120c 10240 <20. ND ND de Anti-MS <20 <20 ND ND ND metabolismo (MIT) Ejemplo 8 Caracterización de cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum por secuenciación objetivada por gen La cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum se caracteriza por análisis de secuenciación objetiva por gen (GTS por sus siglas en inglés) de porciones de gen pvpA de citadhesina putativa, el gen gapA de citadhesina, el gen mgc2 de citadhesina, y un . gen que codifica la lipoproteína superficial hipotética no caracterizada designado secuencia de ADN que codifica el genoma (CDS) (MGA_0319 , siguiendo los procedimientos descritos con mayor detalle en Ferguson et al. (Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151:1883-1893), lo cual se incorpora para referencia en la presente.

Brevemente, se extrae el ácido nucleico de 150 a 250 µ? de un cultivo crecido en medio de Frey modificado o cultivos de provisión de medio de Frey congelado almacenados con 5% (v/v) de glicerol. Se extrae el ADN genómico usando el mini kit de QIAamp DNA (QIAGEN) , siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las secuencias cadena delante y a la inversa para los genes objetivados son como a continuación. Para el cebador cadena adelante es gapA 3F, que tiene una secuencia de TTCTAGCGCTTTAGCCCTAAACCC (SEQ ID NO: 4), y el cebador inverso es gapA 4R, que tiene una secuencia de CTTGTGGAACAGCAACGTATTCGC (SEQ ID NO: 5). Para el gen MGA__0319 el cebador cadena adelante es lp 1F, que tiene la secuencia de CCAGGCATTTAAAAATCCCAAAGACC (SEQ ID NO: 6), y el cebador inverso lp IR, que tiene una secuencia de GGATCCCATCTCGACCACGAGAAAA (SEQ ID NO. 7) . Para el gen mgc2 el cebador cadena adelante es mgc2 1F, que tiene una secuencia de GCTTTGTGTTCTCGGGTGCTA (SEQ ID NO: 8), y el cebador inverso es mgc2 IR, que tiene una secuencia de CGGTGGAAAACCAGCTCTTG (SEQ ID NO: 9) . Para el gen pvpA el cebador cadena adelante es pvpA 3F, que tiene una secuencia de GCCAMTCCAACTCAACAAGCTGA (SEQ ID NO: 10), y el cebador inverso es pvpA 4R, que tiene una secuencia de GGACGTSGTCCTGGCTGGTTAGC (SEQ ID NO: 11) .

Todas las amplificaciones son realizadas en un termociclador PTC-200 DNA Engine MJ (MJ Research) a 94 °C por 3 minutos, y 40 ciclos de 94°C por 20 segundos, 55 a 60°C por 40 segundos, 72°C por 60 segundos, y 72°C por 5 minutos. La temperatura de templado óptimo utilizado para amplificar el MGA_0319 y genes pvpA es 55°C, para amplificar el gen mgc2 una temperatura de templado de 58°C es utilizado, y 60°C es utilizado para amplificar el gen gapA. Los productos PCR son detectados con luz UV en un gel de agarosa al 2% que contiene µg de bromuro de etidio/ml. Se secuencia el fragmento de gen amplificado usando un secuenciador automatizado Applied Biosystems Prism 377 (PE Applied Biosystems) . Cada producto de amplificación es secuenciado en ambas direcciones con los cebadores de amplificación cadena adelante y cadena inversa. El traslape completo de secuencias complementarias es realizado usando el programa SEQMAN (en LASERGENE, DNASTAR) .

El análisis GTS del gen MGA_0319 en cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum produce la siguiente secuencia: ATGAGAGCTT ATAACCAATT CATTACTAGA GGGTTGGACA GTTATGTAAA TAGTACAACT AAAGGGATTA ATATTCCCAA CAACTTATCA TCAGATTCTG GTGGTAAGTT GTTAATGACT GCTTCTGATA TGTTCGATAG TTTTGACGTA TCATTTAGTG CAGCTTATGT TCAACAATAT TTAAAACAAA CTAATAATAC TAACCGTGAT ACTGTTGGTG TAGTTCAATC AGATATTGAT GAGATCAATC TGATGAATAA TTTCATTAGA GCTAAGGCAA ATGGTAACAC AACCAACAGC TACTCACAAC AGATTACTAA TAATTCATTA TTAAAAACTG GTGAAGCGAA TCGAACTÁCT GATCCATATT ÁCAATGCTTA TGCAGATTTA GCAGCTGGAA CTAAAGATAT CCACGAAATC TTTGAATGAA ATGGGATGAA GAGAGTTGAT TCTTCGAAAT CAGATAATTC ATCAACAAAC GTAATGAGTA AAAAT (SEQ ED NO: 12).

El análisis de GTS del gen pvpA en cepa K5831B-19 de Mycoplasma galliseptic m produce la siguiente secuencia: GGTAGtCCTA AGTTATTAGG TCCAAACCAA GCTGGTCATC CACAACACGG ACCACGTCCG ATGAATGCTC ATCCAGGTCA ACCACGCCCT CAACAAGCTG GCCCACGTCC AATGGGAGCT GGTGGATCTA ACCAACCAAG ACCAATGCCA AATGGTCTAC AAAACCCACA AGGTCCÁCGA CCAATGAACC CTCAAGGCGA TCCTCGTCCT CAACCAGCTG GTGTCAGACC TAACAGCCCA CAAAATTCTC AACCACGCCC AATGCCAAAT AAACCACAAG GTCCACGACC AATGGGTGCT CCAAATCCTC AACCAGGCCC TCAACAAGCT GGCCCACGTC CAATGGGAGT TGGTGGATCT AACCAACCAA GACCAATGCC AAATCGTCCA CAAAACCCAC AAGGTCCACG ACCAATGAAC CCTCAAGGCG ATCCTCGTCC TCAACCAGCT GgtGTc (SEQ ID NO:13).

El análisis GTS del gen mgc2 en cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum produce la siguiente secuenc ia : TTTTATCCAGTAGTQGGTGC AGGTGCTGGG TTGATTGTTGTTTCTTTACT CTTGGGTTTA GGGATTGGGA TTCCGATCGC TAAGAAAAAA GAAAGAATGA TGATCCAAGAACGTGAAGAA CACCAAAAGA TGGTTGAATC CCTTGGTATA ATCGAAGAAC AAAATAAAAG AGAAGCGATT GAGCCAACTG CAGCAGTGCC AACTGAAGAA GTTAATACTC AAGAACCAAC TCAACCAGCT GGTGTTAÁTG TAGCTAATAA CCCTCAGATG GGGATCAATC AACCAGGATTTAATCAACCT CAGATTAATC CGCAATTTGGTCCTAATCCC CAACAAAGAA TTAACCCACAGGGCTTTGGT GGCCCAATGC CACCTAACCAAATGGGAATG CGACCAGGGTTTAACCAAAT GCCCCCACAA ATGGGAGGAATOCCACCTAA CCAAATGGGA ATGCGACCAG GGTTTAACCA AATGCCCCCA CAAATGGGAG GAATGCCACC AAGACGAAAC TTCCCTA CG AAATGCCTAA TATGAATCAA CCAAGACCAG GTTTCAGACC ACAACCTGGT GGTGGGGTGC CGATGGGAAATAAAGCTGTA GGTGGGTTTAATCAC (SEQ EDN0:14).

Análisis GTS del gen gapA en cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum produce la siguiente secuencia: CCTAACCGAA TTACTAACCC ATTAATGAAT AGAGATAACG TAATCGGTCA AGGTGCGTTC ATTAGTAGAA ATGATATTCC ATCATCATTC TTTGAAAACA AAATTAATGA TATTGTAACT ACAGAAGCTG ATGGTAAAGA AGTATTAGAT AGTAAATACA TTAATTCAAT CTATAGATATACTCCACCTC AAAACAATCC TGATATTAGA TTAAGATTAT TAGTAATTGA TCGTTCTAGA GCAACTAATG ACTTCATTAA GTTATTACCT CAAGTATTAG TTGATGGCGA ATACGTTGCT GTTCCACAA (SEQ ID NO;15).

El análisis GTS caracteriza K5831B-19 como la secuencia gapA tipo Va, secuencia MGA_0319 tipo Va, secuencia mgc2 tipo Iva, secuencia pvpA tipo Illa, secuencia mgc2/pvpA tipo Illa, y secuencia gapA/MGA_0319/mgc2/pvpA tipo Vlla, como se describe en Ferguson et al .

La descripción completa de todas las patentes, aplicaciones de patente, y publicaciones, y material disponible electrónicamente (incluyendo, por ejemplo, presentaciones de secuencia de nucleótidos en, por ejemplo GenBank and RefSeq, y presentaciones de secuencia de aminoácidos en, por ejemplo, SwissPro, PIR, PRF, PDB y traducciones de regiones de codificación anotadas en GenBank and RefSeq) citadas en la presente son incorporadas para referencia. La descripción y ejemplos mencionados anteriormente en la presente han sido dados para claridad de entendimiento solamente. No son entendidas limitaciones innecesarias a partir de la misma. La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos, serán incluidas variaciones obvias para un experto en la técnica dentro de la invención definida por las reivindicaciones.

Todos los títulos son para la conveniencia del lector y no deben ser usados para limitar el alcance del texto que sigue al título, a menos que así sea especificado.

Texto libre de listado de secuencia SEQ ID NO: 1-11 y 16-18 cebadores de oligonucleótidos sintético SEQ ID NO: 12 secuencia de nucleótidos parcial del gen GA_0319 en la cepa K5831B-19 de Mycoplasma galliseptic m obtenida por secuenciación objetivada por gen.

SEQ ID NO: 13 Secuencia de nucleótidos parcial del gen pvpA en cepa K5831B-19 de Mycoplasma gallisepticum obtenida por secuenciación objetivada por gen. SEQ ID NO: 14 Secuencia de nucleótidos parcial del gen mgc2 en cepa K5831B-10 de Mycoplasma gallisepticum obtenida por secuenciación objetivada por gen. SEQ ID NO: 15 Secuencia de nucleótidos parcial del gen gapA en la cepa K5831B de Mycoplasma gallisepticum obtenida por secuenciación objetivada por gen.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro .de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, caracterizada porque la cepa de Mycoplasma gallisepticum es la cepa de Mycoplasma gallisepticum K5831 depositada en ATCC bajo la Designación de Patente PTA-9495.

2. Un cultivo esencial y biológicamente puro de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada en ATCC bajo la Designación de Patente PTA-9495.

3. Una cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada, caracterizada porque la cepa de Mycoplasma gallisepticum aislada es la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada en ATCC bajo la Designación de Patente PTA-9495, o una progenie o derivado de la misma, en donde una progenie o derivado de la misma tiene esencialmente las mismas características biológicas y serológicas de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositado en ATCC bajo designación de Patente PTA-9495.

4. Un cultivo esencial y biológicamente puro de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada en ATCC bajo la designación de Patente PTA-9495, o una progenie o derivado de la misma, caracterizado porque una progenie o derivado de la misma tiene esencialmente las mismas características biológicas y serológicas de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada en ATCC bajo la designación de Patente PTA-9495.

5. Mycoplasma gallisepticum aislado de conformidad con cualquiera con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el Mycoplasma gallisepticum es liofilizado .

6. Una composición caracterizada porque comprende el Mycoplasma gallisepticum de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque además comprende agua.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque además comprende un portador aceptable farmacéuticamente

9. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la composición es formulada para administración mucosal .

10. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la composición es formulada para administración intranasal, intraocular u oral.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la composición es formulada para dispersión y aerolización.

12. Una vacuna caracterizada porque comprende el Mycoplasma gallisepticum ¦ aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ó la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-11.

13. La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la vacuna reduce la susceptibilidad de un pájaro del orden gallináceos a la enfermedad inducida por la cepa de Mycoplasma gallisepticum.

14. Una vacuna para pájaros del orden gallináceos caracterizada porque comprende una cantidad de la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum, depositada en el ATCC bajo la Designación de Depósito de Patente PTA-9495 o una progenie o derivado de la misma, suficiente para proteger a los pájaros de la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, y un portador aceptable farmacéuticamente .

15. La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 12-14, caracterizada porque la cantidad protectora es la cantidad requerida para que la cepa K8531 de Mycoplasma colonice el tracto respiratorio superior del pájaro.

16. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizada porque la cantidad protectora está entre aproximadamente 50 y aproximadamente 5 x 107 ccu/pájaro.

17. Un método para reducir la susceptibilidad del pájaro del orden gallináceos contra la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticu , caracterizado porque comprende administrar al pájaro la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositada en ATCC bajo la designación de Depósito de Patentes PTA-9495, o una progenie o derivado de la misma.

18. Un método para reducir la susceptibilidad de un pájaro de la orden gallináceos contra la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, caracterizado porque comprende administrar un Mycoplasma gallisepticum aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, o una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 al pájaro.

19. Un método para proteger un pájaro del orden gallináceos contra la enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, caracterizado porque comprende administrar al pájaro la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum depositado en ATCC bajo la designación de Depósito de Patente PTA-9495, o progenie o derivado de los mismos.

20. Un método para proteger un pájaro de la orden de gallináceos contra enfermedad inducida por Mycoplasma gallisepticum, caracterizado porque , comprende administrar Mycoplasma gallisepticum aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, o una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 al pájaro.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum persiste en el epitelio respiratorio del pájaro.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum excluye cepas de Mycoplasma gallisepticum a partir del epitelio respiratorio.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, caracterizado porque la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum se administra a la mucosa respiratoria.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, caracterizado porque la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum es administrada por las gotas de ojos .

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, caracterizado porque la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum se administra nasalmente .

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, caracterizado porque la cepa K5831 de Mycopaslama gallisepticum se administra por aerosol.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, caracterizado porque la cepa K5831 de Mycoplasma gallisepticum se administra por agua para beber.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-27, caracterizado porque además comprende administrar por lo menos una formulación de refuerzo adicional al pájaro.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-28, caracterizado porque el pájaro es un pollo o pavo.