KR20110123748A

KR20110123748A - 미코플라스마 갈리셉티쿰 제형

Info

Publication number: KR20110123748A
Application number: KR1020117019444A
Authority: KR
Inventors: 스탠리 에이치. 클레벤; 나올라 엠. 퍼거슨
Original assignee: 유니버시티 오브 죠지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2011-11-15
Also published as: CN102292432A; BRPI1006947B1; US20120021005A1; EP2389433A2; CA2749213A1; JP5642710B2; HK1161289A1; WO2010085611A2; EP2389433B1; BRPI1006947A2; JP2012515552A; EP2389433A4; MX2011007732A; CA2749213C; CN102292432B; KR101715159B1; WO2010085611A3; US8668912B2

Abstract

본 발명은 갈리포르메스(Galliformes) 목(order)의 조류에서 독성 미코플라스마 갈리셉티쿰 감염을 방지하는 제형을 제공한다. 상기 제형은 약학적으로 허용되는 담체 중에 살아있는 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 또는 이의 유도체를 포함한다. 갈리포르메스 목의 조류에서 미코플라스마 갈리셉티쿰 감염을 방지하는 백신이 또한 제시된다. 상기 제형 및 백신을 투여하는 방법이 또한 제시된다.

Description

미코플라스마 갈리셉티쿰 제형{MYCOPLASMA GALLISEPTICUM FORMULATION}

계속 출원 데이터

본 출원은 참조로서 본원에 포함되는, 2009년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제 61/146,472호를 우선권으로 주장한다.

배경

미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum, MG)은 닭 및 칠면조의 감염성 호흡기 병원체이다. 이는 가장 병원성이며, 가금의 경제적으로 유의한 미코플라스마 병원체이다. 사체의 폐기 또는 처리, 감소된 사육 및 계란 생성 효율, 및 약물 치료 비용 증가로 인한 경제적 손실이 전세계에서 상업적 가금 생산이 직면한 고비용의 질병 문제 중 하나로 만드는 요인이다. MG의 조절은 일반적으로 MG가 없는 사육 스톡(stock)의 분리 및 유지에 의해 이루어진다. 그러나, 인구가 줄지 않는 작은 지리적 구역 및 다세대의 농장에서의 가금 생산의 신속한 확장은, 단지 생물학적 안전의 노력만에 의한 MG의 박멸 및 조절을 어렵게 만들고, 추가 수단의 이행을 필요로 하게 만든다. 이러한 상황에서, MG 관련 질병에 대한 가금의 예방적 면역화는 MG의 불활성화된 백신, 또는 살아있는 약독화된 백신 균주에 대한 노출의 이용을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Kleven et al., 1997, Acta Vet Hung; 45(3):299-305]을 참조하라.

그러나, 각각의 방법은 단점을 갖는다. 레이어(layer)에서 계란 생산의 손실에 대한 보호에 일반적으로 효과적인 불활성화된 백신은 감염을 확실히 방지하지 않거나, 호흡기 질병에 대한 일관된 보호를 제공하지 않는다. 또한, 살아있는 약독화된 MG 백신은 더욱 효과적이어서, 불활성화된 백신 보다 인기가 있지만, 이들은 질병을 발생시킬 수 있거나, 생식 기능을 손상시킬 수 있다.

효과적인 MG 생(生) 백신의 중요한 특징은 야생형 균주 감염에 대한 내성을 증가시키고, 다세대 생산 장소에서 야생형 균주를 상기 백신 균주로 대체시키는 능력이다(Levisohn and Kleven, 2000, Rev Sci Tech; 19(2):425-42; 및 Turner and Kleven, 1998, Avian Dis; 42(2):404-7). 현재, MG의 조절에 이용가능한 생(生) 백신은 F 균주(Luginbuhl et al., 1967, Ann NY Acad Sci; 143:234-238; Adler et al., 1960, Am J Vet Res; 21:482-485), 6/85(Evans and Hafez, 1992, Avian Dis; 36:197-201) 및 ts-11(Whithear et al., 1990, Aust Vet J; 67:159-165; 및 Whithear et al., 1990, Aust Vet J; 67: 168-174)을 포함한다. F 균주는 인접한 우리 내의 백신접종되지 않은 우리의 상대 및 닭에 전염가능하며, 백신접종이 중단된 지 오랜 후에 농장으로부터 분리될 수 있다. 균주 ts-11 및 6/85는 비록 불량하긴 하나 접촉시에 백신접종된 가금으로부터 백신접종되지 않은 가금으로 전염이 가능하다. F 균주는 ts-11 또는 6/85 보다 상기도에서 높은 수준으로 존속하며, ts-11은 6/85보다 효과적으로 집락화되는 것으로 보인다. F-균주는 또한 암탉으로부터 계란으로 감염된다. 불행히도, 현재 이용가능한 백신 각각은 장점을 갖지만, 이들은 모두 모든 면에서 이상적인 상태에 도달하지 않는다. 따라서, 안전하고, 효과적이고, 안정적이고, 비독성인, 개선된 생(生) MG 백신 균주가 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주를 포함하며, 상기 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주이다.

본 발명은 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주의 본질적으로 생물학적으로 순수한 배양물을 포함한다.

본 발명은 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주를 포함하며, 상기 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니(progeny) 또는 유도체이며, 상기 프로제니 또는 유도체는 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주와 동일한 생물학적, 혈청학적 및/또는 유전적 특징을 갖는다.

본 발명은 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체의 본질적으로 생물학적으로 순수한 배양물을 포함하며, 상기 프로제니 또는 유도체는 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주와 본질적으로 동일한 생물학적 및 혈청학적 특징을 갖는다.

본 발명의 일부 구체예에서, 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 동결건조된다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 점막 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 비내, 안구내, 또는 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 분무 또는 에어로졸용으로 제형화될 수 있다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체를 포함하는 백신, 또는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 백신은 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스(Galliformes) 목(order) 조류의 감수성을 감소시킬 수 있다.

본 발명은 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병으로부터 조류를 보호하기에 충분한 양의 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 갈리포르메스 목 조류용 백신을 포함한다. 일부 구체예에서, 보호량은 K8531 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 조류의 상기도에 집락화되는데 필요한 양이다. 일부 구체예에서, 보호량은 약 50 내지 약 5 X 10⁷ ccu/조류이다.

본 발명은 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체를 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류의 감수성을 감소시키는 방법을 포함한다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 백신을 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류의 감수성을 감소시키는 방법을 포함한다.

본 발명은 특히 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체를 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류를 보호하는 방법을 포함한다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 백신을 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류를 보호하는 방법을 포함한다.

본 발명의 방법의 일부 양태에서, K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체가 조류의 호흡기 상피에 존속한다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 호흡기 상피로부터 다른 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주를 배제시킨다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 호흡기 점막에 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 점안액(eye drops)에 의해 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 비내 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 에어로졸에 의해 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 음료수에 의해 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, 상기 방법은 조류에 1회 이상의 추가 부스터(booster) 제형을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 양태에서, 조류는 닭 또는 칠면조일 수 있다.

용어 "포함하다" 및 이의 변형은 상기 용어가 상세한 설명 및 청구항에서 나타나는 경우에 제한된 의미를 갖지 않는다.

달리 특정되지 않는 경우, 단수형의 표현 및 복수형의 표현은 상호교환적으로 사용되며, 하나 또는 하나 이상을 의미한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 직접 접촉 전파(transmissibility) 연구 결과의 요약을 도시하는 그래프이다. 결과는 양성%로 제시된다.

도 2는 배출(excretion) 연구 결과의 요약을 도시하는 그래프이다. 결과는 양성%로 제시된다.

도 3은 R-균주 시더(seeder)의 도입 0, 2, 4 및 8주 후의 백신접종된 닭 및 백신접종되지 않은 닭(대조군)에서의 R-균주의 복제수(Log10)의 대체 연구 결과를 도시하는 그래프이다.

도 4는 R-균주 시더의 도입 0, 2, 4 및 8주 후의 백신접종된 닭 및 백신접종되지 않은 닭(대조군)에서의 R-균주의 복제수(Log10)의 대체 연구 결과를 도시하는 그래프이다.

도 5는 R-균주 시더의 도입 0, 2, 4 및 8주 후의 닭으로부터의 백신의 복제수(Log10)의 대체 연구 결과를 도시하는 그래프이다.

도 6은 R-균주 시더의 도입 0, 2, 4 및 8주 후의 닭으로부터의 백신의 복제수(Log10)의 대체 연구 결과를 도시하는 그래프이다.

도 7은 핑거프린트(fingerprint) K5831B-19 및 역 계대(back passage) 분리물 K5883-2에 대한 무작위 증폭 다형태 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 분석 결과를 제시한다. 레인 1은 K2101이다. 레인 2는 K5831B-19이다. 레인 3은 K5833-2이다. 레인 4는 R 균주이다. 레인 5는 6/85이다. 레인 6은 ts-11이다. 레인 7은 F 균주이다. 레인 8은 음성 대조군이다. 레인 9는 100 bp 래더이다.

도 8은 K5831B-19, K882-1 또는 R 균주를 이용한 공격 10일 후의 핑거프린트 K5831B-19 역 계대 분리물에 대한 무작위 증폭 다형태 DNA(RAPD) 분석 결과를 제시한다.

본 발명의 예시적 구체예의 상세한 설명

본 발명은 생(生) 제형으로 투여되는 경우에 무독성이고, 면역원성이고, 안정적인 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831, 및 이의 프로제니 및 유도체를 제공한다. 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 제형은 안전하고, 미코플라스마 갈리셉티쿰 감염을 억제하기에 효과적이며, 조류에서 미코플라스마 갈리셉티쿰 감염의 발병률 및 중증도를 감소시키는데 유용할 것이다.

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831은 2008년 9월 15일에 미국 미생물보존 센터(American Type Culture Collection(ATCC®))(10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA)에 PTA-9495로 수탁되었다. 상기 균주는 특허 절차상 미생물 수탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 수탁되었다. 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831은 또한 본원에서 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19, MG K5831, MG K5831B-19, MG 균주 K5831, MG 균주 K5831B-19, K5831, K5831B-19, ATCC PTA-9495 및 PTA-9495로 언급된다. 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831이 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K2101(MG K2101)로 공격된 닭으로부터 분리되었다. MG K2101은 저하된 계란 보호를 나타내는 산란 실용계(commercial layer) 집단으로부터 1984년에 콜로라도에서 분리된 현지 분리물(field isolate)이었다. 분리물 B-1 내지 B-30의 약 30개의 분리물에서, 분리물 MG K5831B-19가 추가 특성규명 및 분석을 위해 선택되었다.

본 발명은 2008년 9월 15일에 PTA-9495로 ATCC에 수탁된, 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 본래의 환경(예를 들어, 자연 발생하는 경우 자연 환경)으로부터 분리된 물질을 의미하며, 이에 따라 본래 상태로부터 "인간에 의해" 변경된 것을 의미한다. 본 발명에는 또한 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 ATCC 수탁번호 PTA-9495의 분리된 프로제니 및 분리된 유도체, 및 동등하거나 유사한 생물학적, 혈청학적 및/또는 유전적 특징을 갖는 균주가 포함된다. 본원에서 사용되는 혈청학적, 생물학적, 및 유전적 특징은 본원에 포함되는 실시예 및 도면의 데이터에 기재된 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 더욱 특히, PTA-9495 물질의 프로제니 또는 유도체 균주는 본 발명에 속하는 특히 바람직한 보호 특성을 보유한다. 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 ATCC 수탁번호 PTA-9495의 프로제니는, 예를 들어, 시험관내 배양 또는 조류에서의 역 계대를 포함하는 당 분야에 공지된 미코플라스마 갈리셉티쿰을 증식시키는 다양한 방법 중 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 프로제니의 예는, 예를 들어, 실시예 3에 기재된 재분리물 K5866, K5969, K5872, 및 K5876, 및 K5883-2를 포함한다. 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 ATCC 수탁번호 PTA-9495의 유도체는 수탁된 MG K5831 균주의 유전적으로 변형된 형태를 포함할 것이다. 이러한 조작은 MG 균주에서 돌연변이를 일으키거나, 대안적 단백질 또는 비기능성 단백질을 엔코딩하는 유전자 또는 유전자 카세트, 또는 비코딩 누클레오티드 서열을 MG 유기체에 도입시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

MG 균주 K5831, 및 이의 프로제니 및 유도체는, 예를 들어, 단백질 프로파일 분석(Khan et al., 1987, Avian Dis; 31:315-320), 제한 단편 길이 다형태(RFLP)(Kleven et al., 1988, Avian Dis; 32:731-741), 리보타이핑(ribotyping)(Yogev et al., 1988, Avian Dis; 32:220-231), 균주 특이적 DNA 프로브(Khan et al., 1989, Avian Pathol; 18:135-146), 균주 특이적 프라이머를 이용한 PCR(Nascimento et al., 1993, Avian Dis; 37:203-211), 및 무작위 증폭 다형태 DNA(RAPD)(Charlton et al., 1999, J Vet Diag Invest; 11:158-161; Fan et al., 1995, Avian Dis 39; 729-735; and Geary et al., 1994, Mol Cell Probes; 8:311-316)을 포함하는 M. 갈리셉티쿰 균주의 분화에 대해 개발된 다수의 기술 중 임의의 기술을 이용하여 확인되고, 다른 M. 갈리셉티쿰 균주와 구별될 수 있다. RAPD 방법은 실험 및 현지 조건 둘 모두에서 백신 균주를 확인하고(Ley et al., 1997, Avian Dis; 41:187-194; Kleven and Fan, 1998, Avian Dis; 42:300-306; Turner and Kleven 1998, Avian Dis 42; 404-407), 현지에서 역학적으로 관련된 분리물을 추적하는데 성공적으로 사용되어왔다(Kempf, 1998, Avian Pathol; 27:7-14; Ley et al., 1997, Emerg Infect Dis; 3:375-380; Charlton et al., 1999, J Vet Diagn Invest 11, 408-415; Levisohn & Kleven, 2000, Rev Sci Tech; 19:425-442). K5831의 프로제니 또는 유도체는 MG 균주 K5831의 확인된 특징 중 하나 이상을 공유할 수 있다. K5831의 프로제니 또는 유도체는 실질적으로 모든 상기 확인된 특징을 공유할 수 있다. 본 발명은 또한, 추가 양태에서, 모(parental) MG K2101 균주, 및 이의 프로제니 및 유도체, 및 본원에 기재된 임의의 조성물, 백신 및 방법에서의 이들의 용도를 고려한다.

MG 균주 K5831, 및 이의 프로제니 및 유도체는 무작위 증폭 다형태 DNA(RAPD) 분석을 이용하여 확인되고, 다른 M. 갈리셉티쿰 균주와 구별될 수 있다. 간단히, 낮은 엄격성 증폭의 3 주기 후, 높은 엄격성에서의 PCR을 포함하는 임의 프라이밍 중합효소 연쇄반응(arbitrary primed polymerase chain reaction, AP-PCR)이 문헌[Fan et al. (Fan et al., 1995, Avian Dis; 39:729-735)]에 보다 상세히 기재되는 절차를 이용하여 임의로 선택된 3개의 프라이머로 수행된다. 사용된 3개의 올리고누클레오티드 프라이머는 M16SPCR5'(AGGCAGCAGTAGGGAAT (SEQ ID NO: 16)); M13F(GTAAAACGACGGC (SEQ ID NO:17)); 및 S1OLIGO3'(CATAACTAACATAAGGGCAA (SEQ ID NO:18))이다. K5831B-19 및 프로제니 K5833-2에 대한 상기 RAPD 분석의 대표적 결과가 도 7 및 8에 제시된다. 상기 프로제니 및 유도체는 Fan 프라이머가 사용되는 경우에 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 ATCC 수탁번호 PTA-9495와 실질적으로 동등한 RAPD 프로파일을 나타낼 수 있다.

K5831, 또는 이의 프로제니 또는 유도체는 유전자 표적화 서열분석(gene-targeted sequencing, GTS) 방법을 이용하여 확인되고, 다른 M. 갈리셉티쿰 균주와 구별될 수 있다. 다양한 유전자 중 임의의 유전자가 분석될 수 있다. 예를 들어, gapA 유전자, mgc2 유전자, pvpA 유전자 및/또는 예측 보존 표면 지질단백질을 엔코딩하는 유전자의 유전 서열이 사용될 수 있다. 이러한 4개의 유전자 서열은 M. 갈리셉티쿰 R_low 균주의 유전체에서 처음 확인되었다(Papazisi et al., 2003, Microbiol; 149:2307-2316). gapA 유전자는 유전체 코딩 DNA 서열(CDS) MGA_0934로 확인된 세포유착(cytadhesion) 과정과 관련된 것으로 밝혀진 단백질을 엔코딩한다(Goh et al, 1998, Microbiol; 144:2971-2978). mgc2 유전자는 유전체 CDS MGA_0932로 확인된 부착 과정에서 역할을 하는 것으로도 공지된 제 2의 사이타드헤신(cytadhesin) 단백질을 엔코딩한다(Hnatow et al., 1998, Infect Immun; 66:3436-3442). pvpA 유전자는 M. 갈리셉티쿰 균주에서 크기 변화를 나타내는 추정적인 보조 사이타드헤신을 엔코딩한다(Boguslavsky et al., 2000, Infect Immun; 68:3956-3964; Liu et al., 2001, J Clin Microbiol; 39:1882-1888). 본래 문헌[Nascimento et al. (Nascimento et al. 1991, Avian Dis; 35:62-69)]에서 인지된 예측 보존 표면 지질단백질을 엔코딩하는 유전자가 유전체 CDS MGA_0319로 확인되었다(Papazisi et al., 2003, Microbiology; 149:2307-2316).

K5831의 프로제니 또는 유도체는, 예를 들어, 문헌[Ferguson et al. (Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151:1883-1893)]에 보다 상세히 기재된 절차에 따라, 실시예 8에 보다 상세히 기재된 유전자 표적화 서열분석(GTS) 분석에 의해 결정시, 사이타드헤신 pvpA 유전자(SEQ BD NO: 13), 사이타드헤신 gapA 유전자(SEQ ID NO: 15), 사이타드헤신 mgc2 유전자(SEQ ID NO: 14), 또는 유전체 코딩 DNA 서열(CDS) MGA_0319(SEQ ID NO: 12)로 지정된 특성규명되지 않은 가설 표면 지질단백질 엔코딩 유전자의 일부에서 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B의 확인 서열 중 하나 이상을 공유할 수 있다

MG 균주 K5831, 및 이의 프로제니 또는 유도체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 주형 log₁₀ 복제수에 대해 각각 37.20, 33.48, 30.48, 27.15, 23.97, 20.74, 17.28 및 13.70의 평균 C_T 값; y=-0.3021x + 12.203의 일차방정식; 및/또는 0.9996인지 여부의 결정계수(R-squared) 값 중 하나 이상을 갖는 택맨(Taqman) 실시간 PCT 표준 곡선을 나타낼 수 있다. 상기 택맨 실시간 PCT는, 예를 들어, AY556238의 누클레오티드 218 내지 237을 포함하는 정방향 프라이머 서열(5'→3')(CTCAAGAACCAACTCAACCA(SEQ ID NO:1)), AY556238의 누클레오티드 329 내지 308을 포함하는 역방향 프라이머 서열(5'→3')(GGATTAGGACCAAATTGCGGAT(SEQ ED NO:2)), AY556238의 누클레오티드 280 내지 303을 포함하는 이중 표지된 프로브 서열(5'-3')(CAACCAGGATTTAATCAACCTCG(SEQ ID NO:3))을 이용하는, mgc2 유전자, 유전자은행(GenBank) 등록 번호 AY556238로부터의 프라이머, 및 61℃의 어닐링/신장 온도를 이용할 수 있다. 대안적으로, mgc2 유전자, 유전자은행 등록 번호 AY556282로부터의 유사한 프로브가 이용될 수 있다. 상기 결정 방법은 문헌[Raviv et al. (Raviv et al., 2008, Veterinary Medicine; 129(1-2): 179-87)]에 보다 상세히 기재되어 있다. K5831의 프로제니 또는 유도체는 상기 택맨 실시간 PCR 검정에 의해 결정되는 MG 균주 K5831의 확인된 특징 중 하나 이상을 공유할 것이다.

본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 본원에 포함되는 실시예에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 추가 생물학적 및/또는 혈청학적 특징을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 감소된 감염률을 나타낼 수 있다. 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 상기도에서의 향상된 지속을 나타낼 수 있다. 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 역 계대되는 경우에 독성의 증가가 없거나 거의 없을 수 있다. 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 제한된 수직 감염을 나타내거나 수직 감염이 없을 수 있다. 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주를 이용한 백신접종은 다른 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 예를 들어, R 균주의 낮은 집락화를 발생시킬 것이다. 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주를 이용한 백신접종은 공격된 조류의 호흡계에 주로 잔류하는, 공격 후의 육안적 병변(gross lesion)을 발생시킬 수 있다.

본 발명과 관련하여, 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831이 최소 용량, 전파, 지속 및 배출, 역 계대, 신체 분포, 수직 감염, 독성 균주의 대체, 발육란 및 닭에서의 병원성, 및 생화학적, 생물학적 및 혈청학적 특성의 특성규명을 연구하기 위한 연구에 의해 평가되었다. 감염시키고, 적당한 백신 보호를 유도하는데 필요한 MG K5831의 최소 역가는 약 6.22 x 10⁵ CCU/ml였다. MG K5831은 비교적 낮은 감염률을 가지며, 최소한 5개월 동안 상기도에 존속한다. 닭을 통해 5회 역 계대되는 경우에 MG K5831의 독성에는 증가가 없었고, 공격 후에 육안적 병변이 평가되었다. MG K5831은 주로 공격된 조류의 호흡계에 잔류하였다. MG K5831의 수직 감염이 검출되지 않았다. 그리고, MG K5831을 이용한 백신접종은 R 균주의 낮은 집락화를 발생시켰다.

본 발명은 본원에 기재된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 및 이의 프로제니 및 유도체의 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 조류의 감수성을 감소시키는 백신으로 작용할 수 있다. 이러한 조성물은 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병으로부터 조류를 보호하는 백신으로 작용할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 백신은, 예를 들어, 물 또는 배양 배지를 포함할 수 있다. 이러한 조성물 및 백신은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 담체는, 예를 들어, 안정화제, 보존제 및 완충제를 포함한다. 적합한 안정화제는, 예를 들어, SPGA, 탄수화물(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 덱스트란, 글루타메이트 또는 글루코오스), 단백질(예를 들어, 건조 밀크 혈청, 알부민 또는 카세인) 또는 이의 분해 생성물을 포함한다. 적합한 완충제는, 예를 들어, 알칼리 금속 포스페이트를 포함한다. 적합한 보존제는, 예를 들어, 티메로살, 머티올레이트 및 젠타마이신을 포함한다. 희석제는 물, 수성 완충액(예를 들어, 완충 염수), 알코올, 및 폴리올(예를 들어, 글리세롤)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 MG 균주, 조성물 및 백신은 실질적으로 순수할 수 있다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한"은 임의의 유사한 거대분자, 또는 자연 상태에서 일반적으로 발견되는 다른 생물학적 존재물을 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미할 것이다.

바람직하게는, 상기 제형에 사용되는 유기체는 살아있는 것이다. 일부 구체예에서, 유기체, 조성물 또는 백신은 동결건조될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 백신은 가금, 갈리포르메스 목 조류, 및 외래 조류 종을 포함하나, 이에 제한되지 않는 미코플라스마 갈리셉티쿰에 민감한 다양한 조류 종 중 임의의 종의 조류에 투여될 수 있다. 갈리포르메스 목 조류는 닭, 칠면조, 뇌조, 메추라기 및 꿩을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 용어 가금은 알을 수집하거나, 고기 및/또는 깃털을 위해 도살하기 위해 유지되는 길들여진 조류를 포함한다. 이들은 가장 통상적으로는 갈로안세라에(Galloanserae) 상목(가금), 특히 갈리포르메스 목(예를 들어, 닭, 메추라기, 칠면조 및 뇌조를 포함함) 및 "물새"(예를 들어, 오리, 거위 및 백조를 포함함)로 흔히 공지된 아나티다에(Anatidae) 과(안세리포르메스(Anseriformes) 목)의 일원이다. 가금은 또한 고기를 위해 도살되는 다른 조류, 예를 들어, 집비둘기 또는 비둘기, 또는 수렵에 고려되는 조류, 예를 들어, 꿩을 포함할 수 있다. 닭은 암탉, 수탉, 브로일러(broiler), 로스터(roaster), 레이어(layer), 브리더(breeder), 브리더 암탉 및 레이어의 후손을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "~에 민감한"은 언급된 미생물에 대한 유해한 반응, 예를 들어, 민감하지 않은 개체 또는 군에 비해 감소된 활력 또는 성장 부족, 및/또는 미코플라스마 갈리셉티쿰 감염을 나타내는 하나 이상의 병리학적 상태(들)의 가능성 또는 현실성을 의미한다.

본 발명의 조성물 및 백신은 수의학 분야에 공지된 다양한 경로 중 임의의 경로, 예를 들어, 점막, 비내, 안구내 또는 경구 투여에 의한 전달용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 백신은 호흡기 점막 전달용으로 제형화될 수 있고, 이는 즉시 또는 종국적으로 조류의 호흡기 점막과 접촉되도록 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 백신은 수의학 분야에 공지된 다양한 방식 중 임의의 방식, 예를 들어, 분무 또는 에어로졸에 의한 전달용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신은 비내, 안구내, 주사, 음료수, 사료, 노출, 오보(ovo), 모체 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 조류를 접종시키는 임의의 적합한 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다.

면역원성 조성물 또는 백신은 음료수에 백신을 배치하거나, 동물의 환경으로 분무하는 것과 같은 대량 투여 기술에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 용액을 개체 또는 무리에 분무함으로써 투여될 수 있고, 이러한 에어로졸 전달은 작은 액체 입자에 포함된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 분무형 입자는 약 10 내지 약 100 마이크론 크기의 비말 크기, 더욱 바람직하게는 약 <1 내지 약 50 마이크론의 비말 크기를 가질 수 있다. 작은 입자의 생성을 위해, 통상적인 분무-장치 및 에어로졸 발생기, 예를 들어, 냅색(knapsack) 분무, 해처리(hatchery) 분무 및 아토미스트(atomist) 분무용의 시판되는 분무 발생기가 사용될 수 있다. 음료수를 통한 투여는 통상적인 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 주사에 의해 투여되는 경우, 면역원성 조성물 또는 백신은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여는, 예를 들어, 정맥내, 피하, 근내 또는 복막내 주사에 의한 투여를 포함한다.

본 발명의 조성물 또는 백신은 부화 전 또는 부화 후에 조류에 투여될 수 있다. 조류는 다양한 연령 중 임의의 연령에 백신 조성물을 투여받을 수 있다. 부화 후에 전달되는 경우, 물질은, 예를 들어, 부화 약 1주 후, 부화 약 2주 후, 부화 약 3주 후, 부화 약 4주 후, 부화 약 5주 후, 부화 약 6주 후, 또는 이의 임의의 범위에 투여될 수 있다. 오보(ovo) 투여를 위해, 물질은 인큐베이션 약 17일, 인큐베이션 약 18일, 인큐베이션 약 19일, 인큐베이션 약 20일, 및 이의 임의의 범위에 전달될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 백신은 지정된 농도의 미코플라스마 갈리셉티쿰을 포함하도록 조정될 수 있다. 유기체는 색 변화 단위로 측정될 수 있다. 본원에서 "ccu"로 언급되는 미코플라스마 갈리셉티쿰의 색 변화 단위는, 예를 들어, 문헌[Rodwell and Whitcomb (In "Methods in Mycoplasmology," Eds. Razin and Tully, 1993)]에 기재된 프로토콜을 포함하는 확립된 표준 기술을 이용하여 정량될 수 있다. 예를 들어, 유효량이 조류당 안구당 하나의 점적으로 단일한 조류에 투여될 수 있고, 하나의 점적은 약 0.05 ml이고, 이에 따라 약 1x10³ 내지 약 1x10⁶의 색 변화 단위/ml(ccu/ml)의 농도이며, 이는 약 50 내지 약 50,000 ccu/조류와 동등하다. 예를 들어, 하기 농도가 사용될 수 있다: 약 50, 약 1x10² ccu/ml, 약 5x10² ccu/ml, 약 1x10³ ccu/ml, 약 5x10³ ccu/ml, 약 1x10⁴ ccu/ml, 약 5x10⁴ ccu/ml, 약 1x10⁵ ccu/ml, 약 5x10⁵ ccu/ml, 약 1x10⁶ ccu/ml, 약 5x10⁶ ccu/ml, 약 1x10⁷ ccu/ml, 약 5x10⁷ ccu/ml, 및 이의 임의의 범위(예를 들어, 약 1x10⁵ ccu/ml 내지 약 1x10⁶ ccu/ml).

본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주는 미코플라스마 갈리셉티쿰 감염에 대한 감수성을 감소시키기 위해 조류에 투여될 수 있다. 상기 투여를 이용하여, 물질은 미코플라스마 갈리셉티쿰을 나타내는 유의한 임상적 증상 또는 병변을 발생시키지 않는다. 상기 물질은 존속되고/되거나, 유전 공학에 의해 생성되지 않고/않거나, 낮은 독성을 갖고/갖거나, 많은 생체내 계대에 걸쳐 증가된 안정성을 갖고/갖거나, 5회 역 계대되는 경우에 독성이 증가하지 않고/않거나, 주로 호흡계에 잔류한다. 상기 물질은 알을 감염시키지 않거나, 매우 낮은 비율로 알을 감염시킨다. 또한, 본 발명은 가금 작업으로부터 독성의 야생형 균주를 대체시킬 수 있고, 순환하는 풍토성 균주를 대체시킬 수 있다.

따라서, MG 질병을 나타내는 유의한 임상적 증상 또는 병변을 발생시키지 않는 면역학적 물질을 제공하는 것이 본 발명의 목표이다. 최소한 5개월 동안 상기도에 존속하는 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다. 유전 공학에 의해 생성되지 않는 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다. 낮은 독성의 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다. 많은 생체내 계대에 걸쳐 증가된 안정성을 갖는 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다. 최소한 5회 역 계대되는 경우에 독성이 증가하지 않는 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다. 호흡계에 주로 잔류하는 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다. 알을 감염시키지 않거나, 매우 낮은 비율로 알을 감염시키는 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다. 독성의 야생형 균주의 감염을 방지하여, 가금 작업으로부터 순환하는 풍토성 균주를 대체시키는 면역학적 물질을 제공하는 것이 또 다른 목표이다.

임의의 한 특정 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 본 발명의 MG 균주는 면역을 자극하고, 치료되는 조류의 호흡기 점막, 특히 상기도에 존속한다. 따라서, 본 발명의 물질을 이용한 조류의 치료의 유리한 결과는 상기도 집락화로부터 독성의 현지 균주를 배제시키는 상기 물질의 능력이다. 본원에서 사용되는 용어 "현지" 균주는 야생형 균주, 또는 이전의 백신접종의 시도에 의해 혼합된 가금에 존재하는 균주를 포함하는 조류의 환경에 존재하는 임의의 균주를 포함한다. 투여되는 양은 바람직하게는 독성의 야생형 균주에 의한 침입에 대한 보호를 제공하기에 충분한 기간 동안 임의의 개별적 조류, 또는 임의의 제공된 무리의 상기도를 집락화시키는데 필요한 양일 수 있다. 투여되는 양은 조류의 기도를 집락화시키기에 충분할 수 있다.

본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주는 하기 프로토콜을 따르나, 이에 제한되지는 않는 배양으로 성장할 수 있다. 조류 미코플라스마의 분리를 위한 프레이(Frey) 배지:

미코플라스마 브로쓰 베이스(broth base) 22.5 g

덱스트로오스 3 g

돼지 혈청 120 ml

효모 추출물 35 ml

페놀 레드(1%) 2.5 ml

탈륨 아세테이트(10%)^A 6 ml

앰피실린 1 g/리터^A

시약을 조합하고, 증류수로 1000 ml까지 채운다.

^A-시판되는 백신 제품에서와 같이 순수한 MG 배양물로 작업하는 경우 탈륨 아세테이트 및 앰피실린은 생략될 수 있다.

20% NaOH로 pH를 7.8로 조정하고, 필터 멸균시킨다.

본 발명의 범위에 벗어남이 없이 상기 나열된 것 대신에 다른 성장 인자 및 보존제가 사용될 수 있다.

아가(agar) 배지를 위해, 1%의 순수한 아가, 예를 들어, 이온 아가 #2, 노블(Noble) 아가, 또는 디프코(Difco) 정제 아가를 사용한다. 혈청 및 앰피실린을 제외한 모든 성분은 15분 동안 121℃에서 오토클레이브로 멸균된다. 50℃로 냉각시키고, 무균으로 혈청 및 앰피실린을 첨가하고, 이를 여과에 의해 예비멸균시키고, 50℃로 가온시킨다. 혼합하고, 약 5 mm의 깊이로 플레이트에 붓는다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831, 및/또는 이의 프로제니 또는 유도체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 미코플라스마 갈리셉티쿰으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831은 동결건조될 수 있다. 키트는 미코플라스마 갈리셉티쿰의 다른 균주 또는 가금의 다른 병원체의 추가적인 별개의 용기를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 완충제와 같은 다른 시약을 포함할 수 있고, 본 발명을 실시하는데 필요한 용액이 또한 포함된다. 임의로, 상기 용기(들)과 관련하여 공고 또는 인쇄된 설명서가 존재할 수 있다. 본 발명의 키트는 "패키징 물질"을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "패키징 물질"은 키트의 내용물을 수용하기 위해 사용되는 하나 이상의 물리적 구조를 의미한다. 패키징 물질은, 바람직하게는 멸균의 오염물질을 함유하지 않는 환경을 제공하기 위해 널리 공지된 방법에 의해 작제된다. 패키징 물질은 고체 매트릭스, 또는 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등과 같은 물질일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 패키지는 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831의 ccu 양을 함유하는데 사용되는 유리 또는 플라스틱 바이얼일 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 예, 물질, 양 및 절차는 본원에 기재된 본 발명의 범위 및 사상에 따라 광범위하게 해석되어야 하는 것이 이해되어야 한다. 별개의 단계를 포함하는 본원에 개시된 임의의 방법에 대해, 상기 단계는 임의의 실행가능한 순서로 수행될 수 있다. 또한, 적절한 경우, 2개 이상의 단계의 임의의 조합이 동시에 수행될 수 있다.

실시예

실시예 1

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 최소 용량 연구

본 실시예에서 닭에서 생(生) 백신으로서 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831의 최소 감염량 및 최소 보호량을 연구하였다. 80마리의 시판되는 레이어 유형 닭을 MG 및 MS를 갖지 않는 것으로 공지된 공급처로부터 8주령에 수득하였고, 8개의 우리에서 사육하였다. 닭이 도착한 후 배양 및 혈청 검사에 의해 미코플라스마의 존재에 대해 스크리닝하였다. 닭의 예비 백신접종 스크린의 결과는 미코플라스마 및 항체의 존재에 대해 음성이었다.

혈청 검사 스크리닝을 위해, 시판되는 항원(Intervet America, Millsboro, Del)을 이용한 혈청 평판 응집반응(SPA) 시험, 및 A5969 균주 및 닭 적혈구로부터 제조된 항원을 이용한 적혈구응집-억제(HI) 시험을 이용하여 MG 항체에 대해 혈청을 분석하였다. SPA 및 HI 시험을 문헌[Kleven (Kleven, S. H. Mycoplasmosis. In: A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, Four ed. D. E. Swayne, J. R. Glisson, M. W. Jackwood, J. E. Pearson and W. M. Reed, eds. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA. pp 74-80. 1998)]에 기재된 절차에 따라 수행하였다. 1 이상의 SPA 스코어를 양성으로 간주하였다. 1:20의 HI 역가를 유효한 것으로 간주하였고, 1:40 이상을 양성으로 간주하였다. 시판용 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)을 또한 혈청에 대해 수행하였다(IDEXX, Westbrook, Maine).

미코플라스마의 분리 및 확인을 위해, 후비공 틈새(choanal cleft), 기관, 기낭 또는 다양한 신체 분포 부위로부터 면봉법(cotton swab)을 배양에 사용하였다. 면봉 표본(swab)을 프레이 변형 브로쓰 및 아가에 접종시키고, 최소 3주 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 미코플라스마 분리물을 직접 면역형광법을 이용하여 확인하였다.

최소 감염량을 결정하기 위해, 12마리의 6개 군의 닭을 10⁷ 색 변화 단위/ml(ccu/ml) 내지 10² ccu/ml의 K5831B-19의 희석액을 에어로졸로 백신접종시켰다. 공격 3일 후, 닭을 면봉으로 표본 수집하고, MG에 대해 배양하였다. 백신접종 5주 후, 닭에서 채혈하고, 배양하였다. 6.22 x 10⁶ ccu/ml의 용량이 12마리의 닭 중 10마리(83%)를 감염시켰고, 6.22 x 10⁵ ccu/ml가 12마리의 닭 중 4마리(33%)를 감염시켰고, 6.22 x 10⁴ ccu/ml가 12마리의 닭 중 2마리(17%)를 감염시켰다. 백신접종 33일 후, 6.22 x 10⁶ ccu/ml 및 6.22 x 10⁵ ccu/ml의 K5831B-19로 백신접종된 군이 배양에 의해 MG에 대해 100% 양성이었다. 이러한 발견은 표 1에 요약되어 있다.

표 1. 최소 감염량. K5831B-19를 이용한 백신접종(에어로졸) 3일 후의 닭의 기관으로부터의 MG 분리^A.

최소 보호량을 결정하기 위해, 백신접종 6주 후, 닭을 R 균주로 공격하였다. 한 군은 백신접종되지 않은 공격된 대조군으로 제공하였고, 제 2의 공격되지 않은 군을 음성 대조군으로 제공하였다. 조류를 공격 10일 후에 검시하고, 기낭 병변 스코어링, 혈청 검사, 배양 및 기관 점막 두께 및 스코어링에 의해 평가하였다. 6.22 x 10⁶ ccu/ml 및 6.22 x 10⁵ ccu/ml의 K5831B-19로 백신접종된 군은 백신접종되지 않은 공격 대조군에 비해 현저히 낮은 평균 기낭 병변 스코어 및 평균 기관 점막 치수를 가졌다. 6.22 x 10⁶ ccu/ml의 백신 용량은 또한 대조군과 비교하는 경우 조류의 기낭으로부터 현저히 적은 MG 분리물을 발생시켰다. 6.22 x 10⁶ ccu/ml 및 6.22 x 10⁵ ccu/ml의 K5831B-19로 백신접종된 군으로부터의 분리물 중 일부의 RAPD 분석은, 분리물이 R 균주 및 K5831B-19의 혼합된 배양물일 수 있음을 나타내었다. 이러한 결과는 표 2에 요약되어 있다.

따라서, 6.22 x 10⁵ ccu/ml의 K5831B-19는 감염시키고, 적절한 백신 보호를 유도하는데 필요한 최소 역가이다. 상기 용량에 의해 단지 33%의 닭이 최초에 감염되었으나, 30일 후, 상기 군의 100%가 감염되었고, 보호가 우수하였다. 6.22 x 10⁶ ccu/ml의 역가가 보다 나은 보호를 발생시켰다. 이러한 최소량은 투여 방법, 사육 및 환경을 포함하는 많은 요인에 의해 영향을 받을 수 있다.

실시예 2

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 전파 및 배출

본 실시예에서 감염된 닭으로부터 나이브(naive) 닭으로 감염시키는 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831의 잠재성을 연구하였다. 백신접종된 조류의 기도에서의 K583 IB-19의 지속(배출)을 연구하였다.

절차

125 마리의 수컷 레이어 유형 닭을 미코플라스마를 갖지 않는 공급처로부터 획득하였다. 조류를 우리에서 사육하였다. 전파 연구에 대해 4개의 군(각 우리의 35, 15, 20 및 20마리의 닭)이 있었고, 배출 연구에 대해 35마리의 1개의 군이 있었다. 3주령의 5마리의 닭을 배양 및 혈청 검사에 의해 미코플라스마에 대해 스크리닝하였다.

전파. 4주령에서 시더 군 닭의 35마리의 닭을 에어로졸을 통해 K5831B-19로 감염시켰다. 이후, 상기 닭 중 5마리를 15마리의 직접 접촉 군과 혼합시켰다. 20마리의 닭을 직접 접촉과 바로 인접한 우리에 두었다(어크로스-와이어(across-wire) 접촉). 20 마리 닭의 또 다른 군을 빈 우리에 의해 직접 접촉으로부터 떨어진 우리에 두었다(어크로스-엠티-펜(across-empty-pen) 접촉). 15마리의 직접 접촉, 및 어크로스-와이어 접촉 및 어크로스-엠티-펜 접촉 군 각각으로부터의 5마리의 닭을 혈청 검사를 위해 채혈하였고, 시더의 접종 1, 2, 4, 8, 12, 16 및 20주 후에 미코플라스마 배양물에 대해 면봉 표면을 수득하였다. 각 채혈/면봉 표본 수집에서 5마리의 나이든 시더를 제거(채혈 및 면봉 표본 수집)하고, 5마리의 새로운 시더로 대체시켰다. 접종 20주 후, 모든 조류를 채혈하고, 배양시키고, 안락사시켰다.

배출. 4주령에서, 35마리의 닭을 에어로졸을 통해 K5831B-19로 접종시켰다. 접종 1, 2, 4, 8, 12, 16 및 20주 후, 5마리의 닭을 분리시키고, 혈청 검사, 기관 및 기낭 면봉 표본의 배양물 및 기관의 조직병리학으로 평가하였다.

표 2. 최소 보호량. R 균주를 이용한 공격 10일 후의 닭으로부터의 혈청학적 반응, 병변 스코어 및 MG 분리^A.

결과

전파. 전파 결과가 표 3에 제시된다. 시더의 도입(PI) 4주 후, 1마리의 혼합된 조류(직접 접촉)가 K5831B-19에 대해 배양 양성이었다. PI 8주 후, 직접 접촉은 배양 및 혈청 검사에 의해 낮은 수준의 감염(2/15)을 가졌다. PI 16주 후, 대부분의 직접 접촉(12/14)이 K5831B-19에 감염되었다. 백신은 와이어 메시(wire mesh)에 의해 분리된 인접 우리 내의 조류 또는 빈 우리에 의해 분리된 조류로 전달되지 않는다. 이러한 데이터는 도 1에 도표로 제시된다.

표 3. (전파). 점안액(시더), 직접 접촉, 이웃하는 우리 사이의 간접 접촉(인접), 또는 빈 우리 분리를 이용한 K5831B-19 균주를 이용한 공격 후의 닭의 후비공 틈새로부터의 혈청학적 반응 및 MG 분리.

표 4. K5831B-19를 이용한 접종 후의 닭으로부터의 혈청학적 반응 및 MG 분리^A.

배출. 배출 결과가 표 4에 제시된다. 백신접종 20주 후까지 K5831B-19를 백신접종된 조류로부터 재분리시켰고, 이 시점에서 연구가 종료되었다. 기낭 및 기관으로부터의 재분리의 발생률은 시간이 지남에 따라 감소하였다. 백신접종 8주 후까지 기낭으로부터 백신이 존재하지 않았고, 기관으로부터의 회수의 발생률은 백신접종 20주 후에 60%(3/5)까지 감소하였다. 조류는 백신접종 20주 후에 혈청양성반응이 지속되었다. 이러한 데이터는 도 2에 도표로 제시된다.

본 연구에서, 혼합된 닭의 대부분은 성적 성숙 발생 후 20주령까지 음성으로 유지되었다. K5831B-19가 비교적 낮은 비율의 전파를 갖는 것으로 결론내려질 수 있다. 본 연구에서, K5831B-19는 연구 지속 기간(5개월) 동안 상기도에서 존속하였다.

실시예 3

닭에서의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 역 계대

본 실시예에서 닭에서의 5회의 역 계대 후에 닭에서 질병을 야기시키는 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831의 잠재성을 연구하였다. 공격된 닭의 체내에서의 MG의 분포를 또한 연구하였다.

절차

역 계대. 25마리의 SPF 닭을 3주령에서 획득하고, 5개의 독립 단위로 사육하였다. 5마리 닭의 한 군을 점안액을 통해 K5831B-19로 공격하였다. 공격 1주 후, 상기 조류의 기관을 면봉 표본 채집하고, 상기 면봉 표본 채집물을 5마리의 닭의 두번째 군을 감염시키는데 사용하였다. K5831B-19를 상기 방식으로 5회 역 계대시켰다. MG를 변형 프레이 브로쓰로의 기관 면봉 표본 채집물의 접종에 의해 감염된 닭으로부터 재분리시킨 후, 상기 면봉 표본 채집물을 감염을 전달하는데 사용하였다(K5866, K5969, K5872, 및 K5876). K5831B-19의 최종 재분리물(K5883-2)을 공격 연구에 사용하였다.

공격. 80마리의 시판되는 레이어 유형 닭을 MG 및 MS를 함유하지 않는 것으로 공지된 공급처로부터 획득하였다. 이러한 닭을 4개의 군체 집단으로 사육하였다. 4주령에서, 8마리의 닭을 스크리닝하여, 이들이 혈청 검사 및 배양에 의해 MG를 함유하지 않은 것을 확인하였다. 5주령에서, 닭 군 중 3개의 군을 K5831B-19(2.59x10⁸ ccu/ml), K5883-2(1.21x10⁷ ccu/ml), 및 R 균주(1.15x10⁸ ccu/ml) 균주의 log 단계 배양물로 공격하였다. 하나의 군을 공격하지 않았다(음성 대조군). 조류를 공격 10일 후에 검시하였고, 기낭 병변 스코어링, 혈청 검사 및 배양에 의해 평가하였다.

신체 분포. 기관 및 기낭 외에, 상기 K5831B-19(2.59x10⁸ ccu/ml)로 공격된 5마리의 조류로부터의 6개의 부위(신장, 간, 낭, 폐, 맹장 편도, 및 비장)를 배양하였다.

무작위 증폭 다형태 DNA(RAPD). RAPD 분석을 이용하여 MG 분리물을 핑거프린팅(fingerprinting)하였다. 4개의 표적화된 유전자(pvpA, mgc2, gapA 및 MGA_0319)의 RAPD 분석 및 서열분석을 이용하여 K2101, K5831B-19 및 K5883-2를 비교하였다. 사용된 절차 및 프라이머는 문헌[Fan et al.(Fan et al., 1995, Avian Dis; 39:729-735)]에 기재된 바와 같았다.

DNA 서열 분석. 이전에 기재된 바와 같이 분리물 및 참조 균주의 DNA 서열을 분석하고 비교하였다(Ferguson et al., 2003, Avian Dis; 47(3):523-30). pvpA 유전자의 서열(Boguslavsky et al., 2000, Infect Immun; 68:3956-3964; 및 Liu et al., 2001, J Clin Microbiol; 39:1882-1888), 지질단백질 서열(MGA_0319) (Nascimento et al., 1991, Avian Dis; 35:62-69), gapA(Goh et al., 1998, Microbiol; 44:2971-2978; 및 Keeler et al., 1996, Infect Immun; 64:1541-1547), 및 mgc2 사이타드헤신 유전자(Hnatow et al., 1998, Infect Immun; 66:3436-3442)를 이전에 기재된 바와 같이 비교하였다(Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151:1883-1893). MegAlign을 이용하여 서열 분서을 수행하였다(DNASTAR, Lasergene, Inc. Madison, Wisconsin).

정량적 균주 차별화 실시간 PCR(Quantitative strain differentiating real-time PCR). 검시된 조류의 후두를 4 ml 멸균 PBS 튜브에 수집하였다. 1 ml의 후두 세척액(30초 동안 샘플을 볼텡싱시킨 후)을 DNA 추출에 사용하였다. DNA 추출물을 백신(K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, F-균주)과 R-균주를 구별할 수 있는 프라이머 및 프로브를 이용한 택맨 실시간 PCR에 적용시켰다. 분석을 반응에 대한 표준화된 대조군과 함께 이전에 결정된 표준 곡선에서 역치 주기수(CT 값)을 플로팅함으로써 정량적으로 수행하였다(Raviv et. al., 2008, Vet Microbiol; 129(1-2):179-87).

결과

역 계대. K5831B-19 및 K5883-2의 RAPD 및 서열 분석은 역 계대로부터 발생하는 유전적 변화를 나타내지 않았다. 둘 모두는 K2101 RAPD 패턴을 나타냈다. RAPD 결과는 도 7 및 8에 제시된다.

공격. 공격 결과가 표 5에 제시된다. 역 계대 분리물(K5883-2)을 이용한 공격은 본래의 K5831B-19 및 음성 대조군을 이용한 공격에 비해 육안적 병변(기낭 스코어)에서 유의한 증가를 발생시키지 않았다(P< 0.05).

신체 분포. MG를 K5831B-19로 공격된 조류의 폐(5/5) 뿐만 아니라 기관(20/20)으로부터 회수하였다. MG를 또한 상기 닭의 기낭의 20개 중 6개(30%)로부터 재분리시켰다. 신장, 간, 낭, 맹장 연구로부터는 분리가 없었다.

표 5. K5831B-19 역 계대. K5831B-19, K883-2, 또는 R 균주를 이용한 공격 10일 후의 닭의 혈청학적 반응 및 병변 스코어^A.

논의

낮은 독성의 자연 발생 MG 균주인 K5831B-19는 실험실에서 약독화된 백신 균주에 비해 많은 생체내 계대에 걸쳐 증가된 안정성의 장점을 가질 수 있다. 본 실시예는 닭을 통해 5회 역 계대되는 경우에, K5831B-19의 독성의 증가가 없음을 입증하며, 공격 후에 육안적 병변이 평가되었다. 신체 분포 분석으로부터, 본 실시예는 또한 K5831B-19가 주로 공격된 조류의 호흡계에 남아있는 것을 입증한다.

실시예 4

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831 수직 감염

본 실시예에서는 감염된 닭으로부터 배아로 전염시키는 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831B-19의 잠재성을 연구하였다.

절차

30마리의 암컷 및 9마리의 수컷 레이어 유형 닭을 미코플라스마가 없는 공급처로부터 획득하였다. 상기 조류를 3개의 우리(우리 당 10마리의 암컷 및 3마리의 수컷)에서 사육하였다. 25주령(약 80% 생산)에서, 5마리의 닭을 배양 및 혈청 검사에 의해 미코플라스마에 대해 스크리닝하였다. 25.3주령에서, 닭을 K5831B-19(6.2 x 10⁸ ccu/ml)로 에어로졸에 의해 공격하였다. 연구 종료까지 24주령으로부터 매일 계란을 수집하였다. 18일된 인큐베이션된 배아의 난황낭을 미코플라스마에 대해 배양하였다. 32주령에서 닭을 검시하고, 평가하였다.

결과

닭은 예비 백신접종 스크리닝에서 혈청 검사 및 배양에 의해 미코플라스마에 대해 음성이었다.

배아 배양. 미코플라스마는 연구 동안 어떠한 배아로부터 회수되지 않았다.

기관 및 기낭 배양. MG를 백신접종 7주 후에 기관 면봉 표본 채집물 36개 중 35개(97%)로부터 회수하였으나, 기낭 면봉 표본 채집물에서는 36개 중 4개(11%) 만을 회수하였다.

혈청 검사. 백신접종 7주 후, 모든 닭이 MG로 혈청 전환되었다.

기관 및 기낭 병변. 검시에서 기낭 병변이 관찰되지 않았다. 조류 중 소수만이 림프구 침윤, 점액선 비대 및 섬모 손실로 구성된 매우 가벼운 기관 병변을 가졌다.

병변의 평가를 위해, 연구 동안 검시된 닭의 병변을 0 내지 4의 척도의 기낭 병변 스코어링에 의해 육안으로 평가하였다(Kleven et al., 1972, Avian Dis; 16:915-924). 기관 점막의 폭을 측정함으로써 기관 병변을 현미경으로 평가하였다. 기관의 상부 1/3(후두로부터 약 1인치 떨어짐)로부터 섹션을 수집하고, 10% 중성 포르말린에 고정시켰다. 기관의 횡단면의 조직학적 슬라이드 상의 4개의 등거(equidistant) 지점에서 기관 점막 두께를 측정하였다. 기관 병변을 또한 0 내지 3으로 스코어링하였다. 통계 분석을 이용하여, 기낭 병변 스코어, 기관 스코어 및 SPA 스코어를 크루스칼-월리스 순위 합산 시험(Kruskal-Wallis Rank Sums test)을 이용하여 분석하였다. 평균 기관 점막 두께, HI 역가 log10, ELISA S/P 비, 및 복제수 log10을 터키-크래머(Tukey-Kramer) HSD 시험을 이용하여 분석하였다. JMP® 통계로 시각화시켰다(SAS Institute Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC 27513).

논의

본 실시예에서, 발육란에서 K5831B-19가 검출되지 않았다. 균주는 생식관을 통해 후손으로 전달되기 위해서는 전신성이 되어야 한다. 이전의 연구로부터, K5831B-19는 주로 상기도에 잔류하는 것으로 보였고, 이는 백신접종 후 비교적 긴 기간(20주까지) 동안 상기 영역으로부터 회수될 수 있으나, 기낭으로부터의 회수는 더욱 가변적이고, 수주에 걸쳐 감소되었다. 본 실시예는 또한 K5831B-19가 어쨋건 계란을 통해 감염되는 경우, 이는 상기 실험 조건하에서 검출가능할 수 없는 매우 낮은 비율임을 입증한다.

실시예 5

미코플라스마 갈리셉티쿰 백신 대체

본 실시예에서 감염된 닭의 독성 균주를 대체하는 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 백신 K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, 및 F 균주의 잠재성을 연구하였다.

절차

127마리의 MG/MS 비함유 레이어 유형 닭을 시판 공급처로부터 1일 연령의 닭으로 획득하였다. 3주령에서, 10마리의 닭을 배양 및 혈청 검사에 의해 미코플라스마에 대해 스크리닝하였다. 8주령에서, 20마리의 닭의 군을 K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, 및 F-균주로 백신접종하였다. 13.3주령에서, 12마리 닭(시더)의 한 군에 점안액을 통해 R 균주를 접종시켰다. 14주령에서, 백신접종된 군의 각각으로부터 5마리의 닭을 검시하고, 평가하였다(검시 1). 이 시점(백신접종 6주 후)에서, 2마리의 시더를 백신접종된 군 각각에서 나머지 15마리의 닭, 및 15마리의 나이브 닭(공격된 대조군)과 혼합하였다. 닭을 이 시점에서 뉴캐스/감염성 기관지염을 이용한 백신접종에 의해 스트레스를 가하였다. 시더의 도입 2주 후, 각 군으로부터 5마리의 조류를 분리하고, 검시하고, 평가하였다(검시 2). 이러한 절차를 공격 4 및 8주 후에 반복하였다(검시 3 및 4). 각각의 검시에서, 평가는 배양, 혈청 검사, 기낭 병변 스코어링, 기관의 조직학, 및 정량 PCR(Q-PCR) 분석으로 구성되었다.

백신접종. 6/85(Mycovac-L® Intervet, Millsboro, DE) 및 F-균주(F Vax-MG® Schering-Plough Animal Health Corporation, Summit, NJ) 백신을 시판되는 페인트 분무기(Preval Sprayer Division, Precision Valve Corporation, Yonkers, NY)를 이용하여 거친 분무에 의해 투여하였다. 이러한 동결건조된 백신을 증류수를 이용하여 제조업체 설명서에 따라 1 용량/ml의 농도로 재구성시켰다. K5831B-19 및 K5054를 또한 신선한 활동적으로 성장하는 배양물로서 거친 분무에 의해 투여하였다. log 단계 배양물을 시판되는 백신의 용량에 보다 엄밀히 근접시키기 위해 적용 전에 프레이 변형 브로쓰로 1:10 희석시켰다. 조류 당 약 1 밀리리터(ml)의 배양물을 투여하였다. ts-11 백신(Merial Select, Gainesville, GA)을 해동시키고, 제조업체 설명서에 따라 점안액에 의해 투여하였다. 모든 군을 또한 제조업체 지시에 따라 거친 분무를 통해 뉴캐슬-기관지염(Poulvac® Aero, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA)으로 백신접종하였다.

공격. R-균주는 독성 MG 균주이다. 이를 점안액(100 μl/조류)에 의해 시더에 투여하였다.

결과

혈청 검사. 첫번째 검시(백신접종 6주 후)의 혈청학적 결과로부터, 6/85로 백신접종된 군을 제외하고는, 모든 백신접종된 군이 MG로 혈청 전환되었다. ts-11 군은 K5831B-19, K5054 및 F-균주로 백신접종된 군보다 덜 강하게 혈청 전환되었다. 6/85 및 ts-11 군 둘 모두는 시더의 도입 4 내지 8주 후까지 혈청전환과 관련하여 다른 군보다 뒤떨어졌다.

기낭 병변. 시더의 도입 2주 후, 조류의 일부는 아마도 뉴캐슬-기관지염 백신접종과 관련된 가변운 기낭 병변을 가졌다.

기관 병변. 기관 반응의 분석은 NDV/IB 백신 바이러스의 도입에 의해 복잡하였다. 시더 및 백신의 도입 전에 군들에서 약간의 반응이 있었으며, 이는 우리 사이의 환경적 차이와 관련이 있을 수 있다.

PCR. K5831B-19 및 F-균주로 백신접종된 군은 다른 백신 및 백신접종되지 않은 대조군에 비해 연구 전체에 걸쳐 R 균주의 복제수 log10이 낮았다. 이러한 차이는 항상 현저하지는 않았다. 시더의 도입 8주 후의 최종 검시까지 6/85로 백신접종된 군에서 6/85가 검출되지 않았다. 모든 시더가 각각의 백신으로 감염된 것이 인지되어야 한다.

논의

본 실시예의 결과는 표 6 및 7 및 도 3-6에 제시된다. 본 실시예는 K5831B-19 및 F-균주 백신이 R 균주의 가장 낮은 복제수 log10을 발생시킨 것을 나타내며, 이는 낮은 R 균주의 집락화를 나타낸다. 이러한 백신은 독성의 야생형 균주의 감염을 방지하여, 가금 작업으로부터 순환하는 풍토 균주를 대체시키는 것에 매우 유용할 수 있다.

표 6. R-균주로 감염된 시더와 혼합된 백신접종된 닭으로부터의 혈청학적 반응, 병변 스코어, MG 분리 및 정량 PCR^A.

표 7. R-균주로 공격되고, 백신접종된 닭과 혼합된 시더로부터의 혈청학적 반응, 병변 스코어, MG 분리 및 정량 PCR.

실시예 6

발육란에서의 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831의 병원성

발육란에서의 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831의 병원성을 발육란 치사 용량(ELD₅₀)의 평가에 의해 결정하고, R 균주의 병원성과 비교하였다.

발육란 치사량(ELD₅₀). 0.2 mL의 100 내지 10⁸ ccu/ml 희석된 샘플(K5831B-19 및 R 균주)를 난황낭 경로를 통해 16일된 발육란에 접종시켰다. 접종 12일 후, 배아를 검사하고, ELD₅₀을 계산하였다. 본 실시예의 결과는 표 8 및 9에 제시된다.

실시예 7

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831의 생화학적, 생물학적 및 혈청학적 특성

본 실시예에서, 미코플라스마 갈리셉티쿰(MG) 균주 K5831의 생화학적, 생물학적 및 혈청학적 특성을 평가하였다.

절차

K5831B-19의 특성을 하기 시험으로 시험하였다:

1. 글루코오스 발효 시험

2. 아르기닌 가수분해 시험

3. β-NAD 요구 시험

4. 테트라졸륨 감소 시험

5. 필름 및 스폿 생성 시험

6. 혈구흡착 시험

7. 성장 억제 시험(GIT)

8. 대사 억제 시험(MIT)

표 8. K5831B-19 균주 ELD₅₀

표 9. R 균주 ELD₅₀

각각의 시험을 문헌[Methods in Mycoplasmology, Vol. I. S. Razin, J. G. Tully, Eds. 1983]에 보다 상세히 기재된 통상적인 방법에 따라 수행하였다. 간단히, 글루코오스 발효 시험을 위해, 물질은 시험 배지(변형된 프레이 브로쓰(글루코오스를 가짐)), 대조군 배지(글루코오스를 갖지 않는 변형된 프레이 브로쓰), 및 시험 균주의 log 단계 브로쓰 배양물이었다. 방법: 시험 배양물의 1:1000 희석액을 대조군 배지에서 제조하였다. 0.1ml의 희석된 배양물을 시험 배지 및 대조군 배지를 함유하는 튜브로 옮겼다. 튜브를 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 색 변화를 관찰하였다.

아르기닌 가수분해 시험에 대해, 물질은 시험 배지(아르기닌을 갖는 변형된 프레이 브로쓰), 대조군 배지(변형된 프레이 브로쓰(아르기닌을 갖지 않음)), 및 시험 균주의 log 단계 브로쓰 배양물이었다. 방법: 시험 배양물의 1:1000 희석액을 대조군 배지에서 제조하였다. 희석된 배양물을 시험 배지 및 대조군 배지를 함유하는 튜브에 접종시켰다. 튜브를 37℃에서 인큐베이션하고, 색 변화에 대해 2주일 동안 관찰하였다.

β-NAD 필요 시험에 대해, 물질은 시험 배지(β-NAD를 갖지 않는 변형된 프레이 브로쓰), 대조군 배지(변형된 프레이 브로쓰(β-NAD를 가짐)) 및 시험 균주의 log 단계 브로쓰 배양물을 포함하였다. 방법: 시험 배양물의 1:1000 희석액을 시험 배지에서 제조하였다. 희석된 배양물을 시험 배지 및 대조군 배지를 함유하는 튜브에 접종시켰다. 튜브를 37℃에서 인큐베이션하고, 성장(색 변화)에 대해 관찰하였다.

테트라졸륨 감소 시험에 대해, 물질은 시험 배지(테트라졸륨 브로쓰) 및 시험 균주의 log 단계 브로쓰 배양물을 포함하였다. 방법: 시험 배양물의 1:1000 희석액을 시험 배지에서 제조하였다. 희석된 배양물을 시험 배지를 함유하는 튜브에 접종시켰다. 튜브를 37℃에서 인큐베이션하고, 성장 및 색 변화(분홍색에서 붉은 자주색으로의 변화)에 대해 관찰하였다.

필름 및 스폿 생성 시험에 대해, 물질은 난황 에멀젼 아가 플레이트 및 시험 균주의 log 단계 브로쓰 배양물을 포함하였다. 방법: 시험 균주를 아가 플레이트에 접종하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 필름 및 스폿에 대해 2주 동안 매일 관찰하였다.

혈구흡착 시험에 대해, 물질은 pbs 중의 닭 적혈구의 세척된 10% 현탁액, 및 시험 균주의 집락을 갖는 아가 플레이트를 포함하였다. 방법: 2 ml PBS 중의 0.5% RBC 현탁액을 제조하고, 아가 플레이트에 피펫으로 옮겼다. 플레이트를 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 과량의 RBC 현탁액을 붓고, 플레이트를 5 ml PBS로 세척하였다. 플레이트를 집락으로의 RBC의 흡착에 대해 시험하였다.

성장 억제 시험(GIT)에 대해, 물질은 항혈청(MG 및 MS), 멸균 흡착 필터 종이 디스크(6mm 직경), 시험 유기체의 브로쓰 배양물, 및 변형 프레이 아가 플레이트를 포함하였다. 방법: 디스크를 MG 또는 MS 항혈청으로 포화시켰다. 플레이트를 0.1 ml의 희석된 시험 배양물로 접종시키고, 평탄하게 스프레딩시켰다. 접종물이 실온에서 흡착되도록 두었다. 디스크를 최소한 2 cm 떨어지도록 접종된 아가 표면에 두었다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고, 억제 구역의 존재에 대해 시험하였다.

대사 억제 시험(MIT)에 대해, 물질은 변형 프레이 브로쓰(글루코오스 및 NAD를 가짐), 시험 유기체의 브로쓰 배양물, 항혈청(MG 및 MS), 및 미세역가 플레이트를 포함하였다. 방법: 25 μl의 브로쓰 배지를 미세역가 플레이트의 모든 웰에 첨가하였다. 25 μl의 열 처리된 MG 또는 MS 항혈청을 첫번째 웰(대조군 제외)에 첨가하고, 연속 희석(2배)시켰다. 대조군을 제외하고는 50 μl의 적절히 희석된 배양물(10³-10⁴ ccu/ml)을 모든 적절한 웰에 첨가하였다. 대조군(175 μl의 배지를 수용함)을 제외하고는 모든 웰에 125 μl의 브로쓰를 첨가하였다. 미세역가 플레이트를 밀봉하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 먼저 72시간의 인큐베이션 후에 판독하였다.

하기 균주를 시험하였다:

K5831B-19

M. 갈리셉티쿰 PG31

미코플라스마 시노비에(Mycoplasma synoviae) WVU1853

M. 아이오와(M. iowae)(혈청형 I)(아르기닌 가수분해 시험 단독)

M. 갈리나룸(M. gallinarum)(혈청형 B) K285(필름 및 스폿 생성 시험 단독)

결과

표 10은 상기 연구로부터의 데이터를 제시한다.

표 10. 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K2101(K5831B-19)의 특성

실시예 8

유전자 표적화 서열 분석에 의한 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831의 특성규명

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19를 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Ferguson et al. (Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151:1883-1893)]에 보다 상세히 기재된 절차에 따라 추정 사이타드헤신 pvpA 유전자, 사이타드헤신 gapA 유전자, 사이타드헤신 mgc2 유전자, 및 특성규명되지 않은 가설의 표면 지질단백질 엔코딩 유전자 지정 유전체 코딩 DNA 서열(CDS) MGA_0319의 일부의 유전자 표적화 서열분석(GTS) 분석으로 특성규명하였다.

간단히, 변형 프레이 배지 또는 5% (v/v) 글리세롤과 함께 저장된 동결된 프레이 배지 스톡 배양물에서 성장한 150 내지 250 μl의 배양물로부터 핵산을 추출하였다. 유전체 DNA를 제조업체의 권고에 따라 키아앰프 DNA 미니 키트(QIAamp DNA Mini Kit)(QIAGEN)를 이용하여 추출하였다. 표적 유전자에 대한 정방향 및 역방향 서열은 다음과 같았다. gapA에 대해, 정방향 프라이머는 TTCTAGCGCTTTAGCCCTAAACCC(SEQ ID NO:4)의 서열을 갖는 gapA 3F였고, 역방향 프라이머는 CTTGTGGAACAGCAACGTATTCGC(SEQ ID NO:5)의 서열을 갖는 gapA 4R이었다. MGA_0319 유전자에 대해, 정방향 프라이머는 CCAGGCATTTAAAAATCCCAAAGACC(SEQ ID NO:6)의 서열을 갖는 lp 1F였고, 역방향 프라이머는 GGATCCCATCTCGACCACGAGAAAA(SEQ ID NO: 7)의 서열을 갖는 lp 1R이었다. mgc2 유전자에 대해, 정방향 프라이머는 GCTTTGTGTTCTCGGGTGCTA(SEQ ID NO:8)의 서열을 갖는 mgc2 1F였고, 역방향 프라이머는 CGGTGGAAAACCAGCTCTTG(SEQ ID NO:9)의 서열을 갖는 mgc2 1R이었다. pvpA 유전자에 대해, 정방향 프라이머는 GCCAMTCCAACTCAACAAGCTGA(SEQ ID NO: 10)의 서열을 갖는 pvpA 3F였고, 역방향 프라이머는 GGACGTSGTCCTGGCTGGTTAGC(SEQ ID NO:11)의 서열을 갖는 pvpA 4R이었다.

모든 증폭을 94℃에서 3분, 및 94℃에서 20초, 55 내지 60℃에서 40초, 72℃에서 60초 동안의 40주기, 및 72℃에서 5분 동안 PTC-200 DNA 엔진 MJ 써모사이클러(PTC-200 DNA Engine MJ thermocycler)(MJ Research)에서 수행하였다. MGA_0319 및 pvpA 유전자를 증폭시키기 위해 사용된 최적 어닐링 온도는 55℃였고, mgc2 유전자를 증폭시키기 위해, 58℃의 어닐링 온도를 이용하였고, gapA 유전자를 증폭시키기 위해 60℃를 이용하였다. PCR 생성물을 μg 에티디움 브로마이드/ml를 함유하는 2% 아가로오스 겔에서 UV 광으로 검출하였다. 증폭된 유전자 단편을 어플라이드 바이오시스템즈 프리즘 377 자동화 서열분석기(Applied Biosystems Prism 377 automated sequencer)(PE Applied Biosystems)를 이용하여 서열분석하였다. 각각의 증폭 생성물을 정방향 및 역방향 증폭 프라이머로 양 방향으로 서열분석하였다. 상보적 서열의 완전한 중첩을 SEQMAN 프로그램(LASERGENE; DNASTAR)을 이용하여 수행하였다.

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19에서의 MGA_0319 유전자의 GTS 분석은 다음과 같은 서열을 발생시켰다: ATGAGAGCTT ATAACCAATT CATTACTAGA GGGTTGGACA GTTATGTAAA TAGTACAACT AAAGGGATTA ATATTCCCAA CAACTTATCA TCAGATTCTG GTGGTAAGTT GTTAATGACT GCTTCTGATA TGTTCGATAG TTTTGACGTA TCATTTAGTG CAGCTTATGT TCAACAATAT TTAAAACAAA CTAATAATAC TAACCGTGAT ACTGTTGGTG TAGTTCAATC AGATATTGAT GAGATCAATC TGATGAATAA TTTCATTAGA GCTAAGGCAA ATGGTAACAC AACCAACACC TACTCACAAC AGATTACTAA TAATTCATTA TTAAAAACTG GTGAAGCGAA TCGAACTACT GATCCATATT ACAATGCTTA TGCAGATTTA GCAGCTGGAA CTAAAGATAT CCACGAAATC TTTGAATGAA ATGGGATGAA GACAGTTGAT TCTTCGAAAT CAGATAATTC ATCAACAAAC GTAATGAGTA AAAAT (SEQ ID NO: 12).

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19에서의 pvpA 유전자의 GTS 분석은 다음과 같은 서열을 발생시켰다: GGTAGtCCTA AGTTATTAGG TCCAAACCAA GCTGGTCATC CACAACACGG ACCACGTCCG ATGAATGCTC ATCCAGGTCA ACCACGCCCT CAACAAGCTG GCCCACGTCC AATGGGAGCT GGTGGATCTA ACCAACCAAG ACCAATGCCA AATGGTCTAC AAAACCCACA AGGTCCACGA CCAATGAACC CTCAAGGCGA TCCTCGTCCT CAACCAGCTG GTGTCAGACC TAACAGCCCA CAAAATTCTC AACCACGCCC AATGCCAAAT AAACCACAAG GTCCACGACC AATGGGTGCT CCAAATCCTC AACCAGGCCC TCAACAAGCT GGCCCACGTC CAATGGGAGT TGGTGGATCT AACCAACCAA GACCAATGCC AAATCGTCCA CAAAACCCAC AAGGTCCACG ACCAATGAAC CCTCAAGGCG ATCCTCGTCC TCAACCAGCT GgtGTc (SEQ ID NO: 13).

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19에서의 mgc2 유전자의 GTS 분석은 다음과 같은 서열을 발생시켰다: TTTTATCCAG TAGTGGGTGC AGGTGCTGGG TTGATTGTTG TTTCTTTACT CTTGGGTTTA GGGATTGGGA TTCCGATCGC TAAGAAAAAA GAAAGAATGA TGATCCAAGA ACGTGAAGAA CACCAAAAGA TGGTTGAATC CCTTGGTATA ATCGAAGAAC AAAATAAAAC AGAAGCGATT GAGCCAACTG CAGCAGTGCC AACTGAAGAA GTTAATACTC AAGAACCAAC TCAACCAGCT GGTGTTAATG TAGCTAATAA CCCTCAGATG GGGATCAATC AACCAGGATT TAATCAACCT CAGATTAATC CGCAATTTGG TCCTAATCCC CAACAAAGAA TTAACCCACA GGGCTTTGGT GGCCCAATGC CACCTAACCA AATGGGAATG CGACCAGGGT TTAACCAAAT GCCCCCACAA ATGGGAGGAA TGCCACCTAA CCAAATGGGA ATGCGACCAG GGTTTAACCA AATGCCCCCA CAAATGGGAG GAATGCCACC AAGACCAAAC TTCCCTAACC AAATGCCTAA TATGAATCAA CCAAGACCAG GTTTCAGACC ACAACCTGGT GGTGGGGTGC CGATGGGAAA TAAAGCTGTA GGTGGGTTTA ATCAC (SEQ ID NO: 14).

미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19에서의 gapA 유전자의 GTS 분석은 다음과 같은 서열을 발생시켰다: CCTAACCGAA TTACTAACCC ATTAATGAAT AGAGATAACG TAATCGGTCA AGGTGCGTTC ATTAGTAGAA ATGATATTCC ATCATCATTC TTTGAAAACA AAATTAATGA TATTGTAACT ACAGAAGCTG ATGGTAAAGA AGTATTAGAT AGTAAATACA TTAATTCAAT CTATAGATAT ACTCCACCTC AAAACAATCC TGATATTAGA TTAAGATTAT TAGTAATTGA TCGTTCTAGA GCAACTAATG ACTTCATTAA GTTATTACCT CAAGTATTAG TTGATGGCGA ATACGTTGCT GTTCCACAA (SEQ ED NO: 15).

GTS 분석은 문헌[Ferguson et al]에 기재된 바와 같이 gapA 서열 유형 Ⅴa, MGA_0319 서열 유형 Ⅴa, mgc2 서열 유형 Ⅳa, pvpA 서열 유형 Ⅲa, mgc2 / pvpA 서열 유형 Ⅲa, 및 gapA/MGA_0319/mgc2/pvpA 서열 유형 Ⅶa로서 K5831B-19를 특성규명하였다.

본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물, 및 전자적으로 이용가능한 자료(예를 들어, GenBank 및 RefSeq의 누클레오티드 서열 수탁물, 및, 예를 들어, SwissProt, PER, PRF, PDB의 아미노산 서열 수탁물, 및 GenBank 및 RefSeq의 주석이 달린 코딩 영역을 포함함)는 참조로서 본원에 포함된다. 상기 상세한 설명 및 실시예는 단지 이해의 명료를 위해 제공되었으며, 이로 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 발명은 제시되거나 기재된 정확한 상세설명에 제한되지 않으며, 당업자에게 명확한 변화가 청구항에 의해 정의된 본 발명에 포함될 것이다.

모든 표제는 독자의 편의를 위한 것으로, 특정되지 않는 한 표제를 따르도록 본문의 의미를 제한하도록 이용되어선 안 된다.

서열 목록 무료 텍스트

SEQ ID NO:1-11 및 16-18 : 합성 올리고누클레오티드 프라이머.

SEQ ID NO:12: 유전자 표적화 서열분석에 의해 수득된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19의 MGA_0319 유전자의 부분적 누클레오티드 서열.

SEQ ID NO:13: 유전자 표적화 서열분석에 의해 수득된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19의 pvpA 유전자의 부분적 누클레오티드 서열.

SEQ ID NO:14: 유전자 표적화 서열분석에 의해 수득된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B-19의 mgc2 유전자의 부분적 누클레오티드 서열.

SEQ ID NO:15: 유전자 표적화 서열분석에 의해 수득된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주 K5831B의 gapA 유전자의 부분적 누클레오티드 서열.

미국 미생물보존센터(ATCC)(국외)

PTA-9495

20080915

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF GEORGIA RESEARCH FOUNDATION, INC. KLEVEN, Stanley H. FERGUSON, Naola M. <120> MYCOPLASMA GALLISEPTICUM FORMULATION <130> 235.01390201 <150> US 61/146,472 <151> 2009-01-22 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 1 ctcaagaacc aactcaacca 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 2 ggattaggac caaattgcgg at 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 3 caaccaggat ttaatcaacc tcg 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 4 ttctagcgct ttagccctaa accc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 5 cttgtggaac agcaacgtat tcgc 24 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 6 ccaggcattt aaaaatccca aagacc 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 7 ggatcccatc tcgaccacga gaaaa 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 8 gctttgtgtt ctcgggtgct a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 9 cggtggaaaa ccagctcttg 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 10 gccamtccaa ctcaacaagc tga 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 11 ggacgtsgtc ctggctggtt agc 23 <210> 12 <211> 495 <212> DNA <213> Mycoplasma gallisepticum <400> 12 atgagagctt ataaccaatt cattactaga gggttggaca gttatgtaaa tagtacaact 60 aaagggatta atattcccaa caacttatca tcagattctg gtggtaagtt gttaatgact 120 gcttctgata tgttcgatag ttttgacgta tcatttagtg cagcttatgt tcaacaatat 180 ttaaaacaaa ctaataatac taaccgtgat actgttggtg tagttcaatc agatattgat 240 gagatcaatc tgatgaataa tttcattaga gctaaggcaa atggtaacac aaccaacacc 300 tactcacaac agattactaa taattcatta ttaaaaactg gtgaagcgaa tcgaactact 360 gatccatatt acaatgctta tgcagattta gcagctggaa ctaaagatat ccacgaaatc 420 tttgaatgaa atgggatgaa gacagttgat tcttcgaaat cagataattc atcaacaaac 480 gtaatgagta aaaat 495 <210> 13 <211> 456 <212> DNA <213> Mycoplasma gallisepticum <400> 13 ggtagtccta agttattagg tccaaaccaa gctggtcatc cacaacacgg accacgtccg 60 atgaatgctc atccaggtca accacgccct caacaagctg gcccacgtcc aatgggagct 120 ggtggatcta accaaccaag accaatgcca aatggtctac aaaacccaca aggtccacga 180 ccaatgaacc ctcaaggcga tcctcgtcct caaccagctg gtgtcagacc taacagccca 240 caaaattctc aaccacgccc aatgccaaat aaaccacaag gtccacgacc aatgggtgct 300 ccaaatcctc aaccaggccc tcaacaagct ggcccacgtc caatgggagt tggtggatct 360 aaccaaccaa gaccaatgcc aaatcgtcca caaaacccac aaggtccacg accaatgaac 420 cctcaaggcg atcctcgtcc tcaaccagct ggtgtc 456 <210> 14 <211> 615 <212> DNA <213> Mycoplasma gallisepticum <400> 14 ttttatccag tagtgggtgc aggtgctggg ttgattgttg tttctttact cttgggttta 60 gggattggga ttccgatcgc taagaaaaaa gaaagaatga tgatccaaga acgtgaagaa 120 caccaaaaga tggttgaatc ccttggtata atcgaagaac aaaataaaac agaagcgatt 180 gagccaactg cagcagtgcc aactgaagaa gttaatactc aagaaccaac tcaaccagct 240 ggtgttaatg tagctaataa ccctcagatg gggatcaatc aaccaggatt taatcaacct 300 cagattaatc cgcaatttgg tcctaatccc caacaaagaa ttaacccaca gggctttggt 360 ggcccaatgc cacctaacca aatgggaatg cgaccagggt ttaaccaaat gcccccacaa 420 atgggaggaa tgccacctaa ccaaatggga atgcgaccag ggtttaacca aatgccccca 480 caaatgggag gaatgccacc aagaccaaac ttccctaacc aaatgcctaa tatgaatcaa 540 ccaagaccag gtttcagacc acaacctggt ggtggggtgc cgatgggaaa taaagctgta 600 ggtgggttta atcac 615 <210> 15 <211> 309 <212> DNA <213> Mycoplasma gallisepticum <400> 15 cctaaccgaa ttactaaccc attaatgaat agagataacg taatcggtca aggtgcgttc 60 attagtagaa atgatattcc atcatcattc tttgaaaaca aaattaatga tattgtaact 120 acagaagctg atggtaaaga agtattagat agtaaataca ttaattcaat ctatagatat 180 actccacctc aaaacaatcc tgatattaga ttaagattat tagtaattga tcgttctaga 240 gcaactaatg acttcattaa gttattacct caagtattag ttgatggcga atacgttgct 300 gttccacaa 309 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 16 aggcagcagt agggaat 17 <210> 17 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 17 gtaaaacgac ggc 13 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 18 cataactaac ataagggcaa 20

Claims

수탁번호 PTA-9495로 미국 미생물보존 센터(American Type Culture Collection, ATCC)에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum) 균주인, 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주.
수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주의 본질적으로 생물학적으로 순수한 배양물.
수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니(progeny) 또는 유도체인 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주로서, 상기 프로제니 또는 유도체가 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주와 본질적으로 동일한 생물학적 및 혈청학적 특징을 갖는, 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주.
수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체의 본질적으로 생물학적으로 순수한 배양물로서, 상기 프로제니 또는 유도체가 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주와 본질적으로 동일한 생물학적 및 혈청학적 특징을 갖는, 배양물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰이 동결건조된 것인 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰을 포함하는 조성물.
제 6항에 있어서, 물을 추가로 포함하는 조성물.
제 6항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물이 점막 투여용으로 제형화되는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물이 비내, 안구내 또는 경구 투여용으로 제형화되는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물이 분무 또는 에어로졸용으로 제형화되는 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰 또는 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 백신.
제 12항에 있어서, 상기 백신이 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목(Galliformes order) 조류의 감수성을 감소시키는 백신.
미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병으로부터 조류를 보호하기에 충분한 양의 수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 갈리포르메스 목 조류용 백신.
제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호량이, K8531 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 조류의 상기도에 집락화되는데 필요한 양인 백신.
제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호량이 약 50 내지 약 5 X 10⁷ ccu/조류인 백신.
수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체를 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류의 감수성을 감소시키는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 분리된 미코플라스마 길리셉티쿰, 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 백신을 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류의 감수성을 감소시키는 방법.
수탁번호 PTA-9495로 ATCC에 수탁된 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주, 또는 이의 프로제니 또는 유도체를 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류를 보호하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 분리된 미코플라스마 갈리셉티쿰, 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 백신을 조류에 투여하는 것을 포함하는, 미코플라스마 갈리셉티쿰에 의해 유발되는 질병에 대해 갈리포르메스 목 조류를 보호하는 방법.
제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 조류의 호흡기 상피에 존속하는 방법.
제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 호흡기 상피로부터 다른 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주를 배제시키는 방법.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 호흡기 점막에 투여되는 방법.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 점안액(eye drops)에 의해 투여되는 방법.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 비내 투여되는 방법.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 에어로졸에 의해 투여되는 방법.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K5831 미코플라스마 갈리셉티쿰 균주가 음료수에 의해 투여되는 방법.
제 18항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 조류에 1회 이상의 추가 부스터(booster) 제형을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 17항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조류가 닭 또는 칠면조인 방법.