CN116348595A - 传染性支气管炎病毒株dmv1639的减毒分离株 - Google Patents

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Abstract

阐述了以专利名称PTA‑12657保藏在ATCC的热减毒传染性支气管炎病毒(TBV)分离株PDRC DMV/1639、其子代和衍生物以及其组合物。还阐述了用于将这些分离株和组合物作为疫苗施用以预防鸡形目禽感染强毒性IBV的方法。

Description

传染性支气管炎病毒株DMV1639的减毒分离株
继续申请数据
本申请要求于2020年9月22日提交的美国临时申请序列号63/081,392的权益，该申请通过援引并入本文。
背景技术
禽传染性支气管炎病毒(IBV)在鸡群中引发上呼吸道疾病，严重危害经济效益(Economic Data[经济数据]，U.S.Poultry&Egg Association[美国禽蛋协会],2016)。鉴于这种病毒的流行性和传染性，在美国几乎所有商业家禽均以血清型特异性方式接种IBV疫苗(Cavanagh，2007,Veterinary Research[兽医学研究]；38:281-297)。IBV是有包膜的正义单链核糖核酸(RNA)病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)的γ冠状病毒属(Gammacoronavirus)。与大多数RNA病毒一样，由于高突变率和重组事件，IBV具有遗传多样性。新的IBV变种不断出现，使得基于疫苗接种的传染性支气管炎(IB)控制变得复杂。IBV的Delmarva/1639(DMV/1639)株从2011年的美国特拉华州/马里兰州/弗吉尼亚州(德尔马瓦)半岛的IB爆发中首次被分离(Gelb等人，2012,Avian Dis[禽疫病]；57(1):65-70)。这种病毒现在是家禽业的重要经济问题并且持续蔓延。而且，尽管通过用一种或多种其他IBV血清型进行疫苗接种来针对DMV/1639株进行交叉保护可能在限制与DMV/1639感染有关的临床体征方面部分有效，但仍需要针对DMV/1639型病毒的改进疫苗。
发明内容
本发明包括传染性支气管炎病毒(IBV)分离株，其中该IBV分离株包括以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639或其子代或衍生物，其中其子代或衍生物具有与以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639基本相同的生物学和血清学特征。在一些方面，该IBV分离株是冻干的、冷冻干燥的或冷冻的。
本发明还包括含有如本文所述的IBV分离株或子代或衍生物的组合物。在一些方面，该组合物进一步包括药学上可接受的载剂。在一些方面，该组合物进一步包括佐剂。在一些方面，该组合物进一步包括其他病毒材料。在一些方面，该组合物被配制成用于鼻内、眼内、口服、粘膜、肌肉内、皮下或卵内施用。在一些方面，组合物被配制成用于喷雾或雾化。
本发明还包括含有如本文所述的IBV分离株或其子代或衍生物或者如本文所述的组合物的疫苗。在一些方面，该疫苗减少了家禽中由IBV感染诱导的一种或多种临床体征和/或病毒载量。
本发明包括用于鸡形目(Galliformes)禽的疫苗，该疫苗包括一定量的以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639或其子代或衍生物，该量足以保护这些禽免于家禽中传染性支气管炎病毒(IBV)感染所诱导的一种或多种临床体征。
本发明还包括含有如本文所述的IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗的泡腾片剂。
本发明还包括在家禽中产生针对传染性支气管炎病毒(IBV)的免疫应答的方法，该方法包括施用如本文所述的IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗。
本发明还包括在家禽中产生抗IBV抗体的方法，该方法包括向家禽施用如本文所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
本发明还包括减少家禽中由传染性支气管炎病毒(IBV)感染诱导的一种或多种临床体征和/或病毒载量的方法，该方法包括施用有效量的如本文所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
本发明还包括用于降低鸡形目禽对传染性支气管炎病毒(IBV)感染的易感性的方法，该方法包括向该禽施用有效量的如本文所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
本发明还包括用于保护鸡形目禽免受传染性支气管炎病毒(IBV)感染的方法，该方法包括向该禽施用有效量的如本文所述的IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗。
在使用本文所述的方法的一些方面，施用是鼻内、眼内、口服、粘膜、肌肉内或皮下施用。
在使用本文所述的方法的一些方面，施用包括卵内施用。
在使用本文所述的方法的一些方面，将IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗通过气溶胶施用。
在使用本文所述的方法的一些方面，将IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗通过喷雾施用。
在使用本文所述的方法的一些方面，将IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗通过饮用水施用。
在使用本文所述的方法的一些方面，施用包括施用于种母鸡。
在使用本文所述的方法的一些方面，家禽包括鸡形目禽。
在使用本文所述的方法的一些方面，该禽是鸡或火鸡。
附图说明
图1A和1B.疫苗接种后的第七天采样。图1A显示了用De1639、PDRC DMV1639和MADMV/1639+Mass进行疫苗接种的病毒载量(倒置Ct值)和阳性百分比。图1B显示了用DE1639+iBron、iBron和iBron+Mass进行疫苗接种的病毒载量和阳性百分比。
图2.自体DE1639疫苗接种的鸡的第14天采样。
图3A和3B.仅自体DE1639疫苗接种的鸡的第28天病毒载量。图3A显示了倒置Ct值。图3B显示了阳性百分比。
图4.疫苗/攻击组的攻击后临床体征。
图5.基于DMV特异性病毒的PCR检测的攻击后病毒载量。
图6.DE1639和PDRC DMV/1639疫苗接种的鸡的第七天疫苗采样。
图7.DE1639疫苗接种的鸡的第14天采样。
图8.在攻击前仅DE1639疫苗接种的鸡的第28天病毒载量。
图9.疫苗/攻击组的攻击后临床体征。
图10.基于DMV特异性病毒的PCR检测的攻击后病毒载量。
图11.比较DMV/1639病毒的不同分离株的系统树。下方的方框代表来自初始2015爆发的分离株，自体疫苗以箭头表示。来自2019的更近的分离株在上方的方框中，PDRC疫苗以箭头表示。
具体实施方式
本发明涉及家禽病毒学领域、特别是传染性支气管炎病毒(IBV)领域的新材料和方法。
禽传染性支气管炎病毒(IBV)是γ冠状病毒。带包膜的IBV病毒具有单链正义RNA基因组，其编码病毒RNA相关性RNA聚合酶、三种主要结构蛋白(核衣壳蛋白、膜蛋白和刺突(S)蛋白)以及许多调节蛋白(Masters,2006,Adv Vir Res[病毒研究进展]；66:193-292)。IBV的刺突糖蛋白被翻译为前体蛋白(So)并且随后被宿主细胞丝氨酸蛋白酶切割为两个亚单位，N末端S1糖蛋白和C末端S2糖蛋白。S1和S2糖蛋白介导细胞附着、病毒-细胞膜融合，并且在宿主细胞特异性中发挥重要作用，在病毒表面上形成棒状突起。S1糖蛋白诱导中和病毒和抑制血凝的抗体。
由于主要发生在S1刺突蛋白基因中的快速重组、插入、缺失或点突变事件而出现新的变异株。随着基于血清学的测试、PCR的使用，S1基因的部分测序可以用于IBV分离株的分组和分型。刺突糖蛋白序列的少许变化可以导致新的血清型。已有文献称，低至5％的IBVS1序列差异可以导致其他方面类似的分离株之间的交叉保护丧失(Cavanagh,2003,AvianPathol[禽类病理学]；32:567-582)。基于刺突1(S1)蛋白的可变性，已经描述了包括32个不同病毒谱系的六种IBV基因型(Valastro等人，2016,Infect Genet Evol[感染遗传学和进化]；39:349-364)，已经得到全世界的认可。
IBV的Delmarva/1639(DMV/1639)株从2011年的德尔马瓦半岛的传染性支气管炎(IB)爆发中首次被分离(Gelb等人，2012,Avian Dis[禽疫病]；57(1):65-70)，这种IBV变种的感染对家禽养殖者带来持续的挑战。目前，没有针对这种IBV株的商品疫苗。而且，尽管通过用一种或多种其他IBV血清型进行疫苗接种来针对DMV/1639株进行交叉保护可能在限制与DMV/1639感染有关的临床体征方面证明有效，但仍需要针对DMV/1639型病毒的改进疫苗。
本发明提供了IBV株DMV1639的活的热减毒分离株及其子代和衍生物。当作为活配制品施用给禽时，这种减毒IBV分离株是安全的，并且可以有效地预防IBV感染和减少IBV感染的发生率和严重性。
这种IBV株DMV1639的活的热减毒分离株(在本文中也称作热减毒DMV/1639、减毒DMV/1639、PDRC DMV/1639、热减毒PDRC DMV1639和减毒DMV/1639-佐治亚分离株(GeorgiaIsolate))于2020年5月15日作为专利保藏号PTA-126757保藏在美国典型培养物保藏中心
Figure BDA0004136641690000051
专利保藏处，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号，邮编：20110-2209(10801University Boulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,USA)。此保藏是依照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约进行的。
本发明还包括于2020年5月15日作为专利保藏号PTA-126757保藏于
Figure BDA0004136641690000052
的IBV株DMV1639的活的热减毒分离株的具有相当或相似生物学、血清学和/或遗传特性的分离的子代和分离的衍生物。如本文所用，血清学、生物学和遗传学特征可以包括本文所含实例中的数据中描述的一个或多个特征。更特别地，PTA-126757的子代或衍生株可以保留属于本发明的特别有利的保护特性，如本文所含实例中更详细地描述的。
根据本发明的IBV病毒分离株可以通过常规方法繁殖，这些方法包括但不限于本文所含实例部分中描述的方法。简言之，向能够支持IBV病毒分离株复制的基质接种本发明的IBV病毒分离株并进行繁殖直至该病毒被复制至希望的感染滴度或抗原量容量。然后收获包含病毒的材料。适合的基质可以包括含胚蛋、原发性(禽)细胞培养物(例如像，鸡胚肝细胞、鸡胚成纤维细胞、或鸡肾细胞)，哺乳动物细胞系(例如像，VERO细胞系或BGM-70细胞系)，或禽细胞系(例如像，QT-35、QM-7或LMH)。
在优选实施例中，病毒可以在包括但不限于含胚鸡蛋的含胚蛋中繁殖。例如，可以将9到11日龄含胚鸡蛋经由绒毛膜尿囊(CAS)途径接种(Dufour-Zavala，“A laboratorymanual for the isolation,identification and characterization of avianpathogens[分离、鉴定和表征禽类病原体的实验室手册],”第5版,美国鸟类病理学家协会(American Association of Avian Pathologists),弗罗里达州杰克逊维尔市(Jacksonville,Fl.),2008。可以将接种过的蛋于37℃孵育48小时，在该时间点收集绒毛膜尿囊液体。
本发明的组合物和疫苗的滴度可以为约101.5至约1010EID50(胚胎感染剂量)/ml。在一些方面，本发明的组合物和疫苗的滴度可以约为101.5EID50/ml、约102EID50/ml、约102.5EID50/ml、约103EID50/ml、约103.5EID50/ml、约104EID50/ml、约104.5EID50/ml、约105EID50/ml、约105.5EID50/ml、约106EID50/ml、约106.5EID50/ml、约107EID50/ml、约107.5EID50/ml,约108EID50/ml、约108.5EID50/ml、约109EID50/ml、约109.5EID50/ml、约1010EID50/ml或其任何范围。例如，在一些应用中，本发明的组合物和疫苗的滴度可以约为102EID50/ml至约108EID50/ml。滴度可以在例如尿囊液中测量。
病毒可以使用例如以下方案滴定：在无菌去离子水中进行病毒的10倍连续稀释，将每种稀释液接种到五个10日龄含胚SPF鸡蛋中(0.1ml/蛋)。将接种过的蛋于37℃孵育7天，检查胚胎的IBV特异性病变。接种后24小时内的胚胎死亡被视为非特异性的，并且不被纳入病毒滴度计算。病毒滴度通过Reed和Muench的方法计算(Reed和Muench,1938,American Journal of Hygiene[美国卫生杂志]27:493-497)，并且以50％胚胎感染剂量(EID50)表达。
本发明包括含有如本文所述的分离的病毒的组合物和疫苗。在一些应用中，可以制备本发明的疫苗制备物并且根据针对IBV疫苗测试的美国联邦法规(CFR)第9卷第113.327节进行测试。
在一些实施例中，病毒是活的。在一些实施例中，病毒是灭活的或杀死的。本发明的病毒及其组合物和疫苗可以被存储直到以多种形式中的任何一种使用。例如，此类材料可以是冻干的或冷冻干燥的,并且可以被再水化以供使用。在一些实施例中，病毒或其组合物或疫苗可以是冷冻的。
在一些实施例中，病毒、组合物或其疫苗可以被配制为泡腾片剂。例如，此类泡腾片剂可以包装在轻质铝泡罩中。该片剂可以被溶解在水中，并且例如通过口服、鼻内或通过气溶胶喷雾施用，从而使液滴经由禽的粘膜进入。
本发明的组合物和疫苗可以包括例如水或培养基。此类组合物和疫苗可以包括一种或多种合适的药学上可接受的载剂、稳定剂、防腐剂、稀释剂和/或缓冲剂。合适的稳定剂包括例如SPGA、糖类(比如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精或葡萄糖等)或蛋白质(比如白蛋白或酪蛋白等)。当通过冻干法制备干疫苗制剂时，稳定剂是特别有利的。合适的防腐剂包括例如硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)和庆大霉素。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(比如缓冲盐水等)、醇和多元醇(比如甘油等)。
本发明的组合物或疫苗还可以包含一种或多种具有佐剂活性的化合物。出于此目的的适合的化合物或组合物包括氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、植物油、动物油、基于例如矿物油(如Bayol FTM或Marcol52TM、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂)、或植物油(vegetableoil)(如维生素E醋酸酯)的水包油或油包水乳液、以及皂甙类。
本发明的组合物或疫苗可以进一步包含一种或多种源自其他感染家禽的病原体的免疫原。此类免疫原可以源自例如马立克氏病病毒(Marek's disease virus)(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)的其他血清型(包括但不限于本文所述的血清型中的任何一种)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)(NDV)、产蛋下降综合征(EDS)病毒、火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)、痘病毒、呼肠孤病毒、鸡细小病毒以及禽肾炎病毒(包括但不限于ANV-1和ANV-2)。
本发明的组合物和疫苗可以是基本上纯的。如本文所用，“基本上纯的”将意味着材料基本上不含通常会在自然界中发现的大分子或其它生物实体。
针对IBV进行疫苗接种对于大多数商品鸡来说是常见的。疫苗可以为通过物质气溶胶应用递送的经修饰的活病毒疫苗。疫苗接种中使用的血清型通常是基于禽类可能会在实地中暴露于何种血清型来选择的。IBV的不同血清型之间的交叉保护作用非常小。因此，本发明提供了在施用时不会导致显著的指示IBV疾病的临床体征或病变的免疫学材料。本发明还提供了低毒力的免疫学材料、在回代时毒力不增加的免疫学材料和/或防止感染强毒性野生型IBV株的免疫学材料。
本发明的组合物或疫苗可以通过任何合适的已知家禽接种方法施用，包括经鼻、经眼、通过注射、在饮用水中、在饲料中、通过暴露、在卵内、经母体、通过呼吸吸入等等。免疫原性组合物或疫苗可以通过多种物质施用技术来施用，比如通过将疫苗置于饮用水中或通过喷雾或雾化。当通过注射施用时，免疫原性组合物或疫苗可以肠胃外施用。肠胃外施用包括例如通过静脉内、皮下、肌肉内、或腹膜内注射施用。
本发明的组合物和疫苗可以被施用于许多易感于IBV感染的禽类物种中任何一种的禽，包括但不限于家禽、鸡形目禽以及外来禽物种。鸡形目禽包括但不限于鸡、火鸡、松鸡、鹌鹑以及野鸡。如本文所用，家禽包括出于收集它们的蛋的目的而饲养或为了获取它们的肉和/或羽毛的目的而杀死的驯化的禽。这些最典型的禽是鸡雁小纲(Galloanserae)的成员(飞禽)，尤其是鸡形目(包括例如鸡、鹌鹑、火鸡及松鸡)和通常被称为“水禽”的鸭科(Anatidae)(在雁形目(Anseriformes)中)(包括例如，鸭、鹅及天鹅)的成员。家禽还可以包括其他禽，这些禽因它们的肉被杀死，如鸽或白鸽或被认为是猎物的禽如野鸡。鸡包括但不限于母鸡、公鸡、肉鸡、肉禽、蛋鸡、种鸡、种母鸡的后代及蛋鸡。如本文所用，术语“易感”意指在与非易感个体或类群相比时，对于参考微生物的有害应答的可能性或现实性，和/或一种或多种指示禽类IBV感染的病理状态。
可以在孵化之前或之后向家禽施用本发明的疫苗。家禽可以在多个年龄时接受疫苗。例如，肉鸡可以在卵内、在一日龄、或在2-3周龄时疫苗接种。产蛋家畜或繁育家畜可以例如在约6周龄至12周龄时疫苗接种并且在约16周龄至20周龄时加强。此类产蛋家畜或繁育家畜可以在约6周龄、在约7周龄、在约8周龄、在约9周龄、在约10周龄、在约11周龄或在约12周龄时疫苗接种。而且，在一些实施例中，此类产蛋家畜或繁育家畜可以在约前两周龄内疫苗接种。此类产蛋家畜或繁育家畜可以在约16周龄、在约17周龄、在约18周龄、在约19周龄或在约20周龄时加强。此类产蛋家畜或繁育家畜的后代可以展示对如本文所述的多肽的抗体滴度，这将预防或缓解该后代的IBV感染症状。卵内疫苗接种可以例如在约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天或在其任何范围时发生。
可以在任何适合的年龄对鸡进行疫苗接种，这些鸡在第一次疫苗接种前通常为约一至三日龄。这些鸡可以仅疫苗接种一次。或者，如果使用两个剂量疫苗，例如当这些鸡是3日龄至一周龄时给予第一剂量并且在另外的1-10周后随后给予第二剂量。
可以贯穿鸡的一生施用该组合物的多剂量。由于母源性免疫是给肉鸡子代提供保护的原始来源，所以种鸡典型地被疫苗接种，虽然如果需要的话肉鸡也可以疫苗接种。
在一些实施例中，本发明的活的减毒IBV分离株可以以每只禽约101.5至约1010EID50的剂量施用。在一些方面，本发明的活的减毒IBV分离株可以以每只禽约101.5EID50、每只禽约102EID50、每只禽约102.5EID50、每只禽约103EID50、每只禽约103.5EID50、每只禽约104EID50、每只禽约104.5EID50、每只禽约105EID50、每只禽约105.5EID50、每只禽约106EID50、每只禽约106.5EID50、每只禽约107EID50、每只禽约107.5EID50、每只禽约108EID50、每只禽约108.5EID50、每只禽约109EID50、每只禽约109.5EID50、每只禽约1010EID50或其任何范围的剂量施用。例如，在一些应用中，可以施用每只禽约102至约105EID50的剂量。
如本文所述的病毒、组合物或疫苗可以被施用于家禽或其他动物以引起对IBV病毒和/或IBV S1多肽(包括但不限于IBV DMV 1639血清型)的免疫应答。免疫应答可以例如包括细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答中的一种或多种，细胞介导的免疫应答涉及淋巴细胞响应于抗原暴露的产生，体液免疫应答涉及血浆淋巴细胞(B细胞)响应于抗原暴露的产生，随后是抗体产生。体液免疫应答可以包括IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE应答。体液或细胞免疫应答的确定可以通过许多方法中的任何一种来确定，这些方法包括但不限于本文所述方法中的任何一种。该免疫应答可以赋予或不赋予保护性免疫。此类免疫应答可以导致未来IBV感染(例如DMV/1639血清型IBV病毒的感染)的症状减少或缓解。此类免疫应答可以预防未来的家禽IBV感染，例如预防DMV/1639血清型IBV病毒感染。免疫可以包括疫苗接种后与未接种疫苗的类群相比，在禽种群中诱导较高水平的保护。
本发明包括在家禽中产生抗IBV免疫应答的方法，该方法包括施用如本文所述的分离的病毒、组合物或疫苗。在一些方面，免疫包含体液免疫和/或细胞免疫。在一些方面，免疫包含粘膜免疫。
施用如本文所述的分离的病毒、组合物或疫苗可以导致减少、抑制或预防IBV感染的一种或多种疾病表现，包括传染性支气管炎(IB)的一种或多种疾病表现。此类症状可以包括以下各项中的一种或多种：体重抑制、产蛋量减少、死亡、临床体征(比如，例如流泪、喘息、咔哒声、窦渗出物、结膜炎和/或啰音等)、组织病理学适应症(比如，例如气管病变等)、抗IBV血清抗体滴度(例如通过ELISA确定)和/或IBV病毒分离(例如通过气管拭子样本的实时RT-PCT测量)。
本发明包括在家禽中减少、已知或预防IBV感染的方法，该方法包括施用如本文所述的分离的病毒、组合物或疫苗。在一些方面，施用如本文所述的分离的病毒、组合物或疫苗减少、抑制或预防了IBV DMV/1639变异株的感染。在一些方面，施用如本文所述的分离的病毒、组合物或疫苗提供了交叉保护，减少、抑制或预防了除IBV DMV/1639株之外的IBV株感染的一种或多种疾病表现。
在本发明的方法的一些方面，施用包括注射、喷雾、口服施用、或呼吸施用。在本发明的方法的一些方面，施用诱导粘膜免疫。在本发明的方法的一些方面，施用包括卵内施用。在一些方面，卵内施用包括在约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、或其任何范围时施用。
本发明的物质组合物可以为基本上纯的。如本文所用，“基本上纯的”将意味着材料基本上不含通常会与它在自然界中发现的类似的任何大分子或其它生物实体。在一些实施例中，此类配制品中使用的生物体是活的。在一些实施例中，该生物体、组合物或疫苗可以是冻干的。本发明包括分离的病毒。如本文所用，“分离的”是指从其初始环境(例如，如果它是天然存在的，那么是自然环境)移除的材料并且因此“通过人工”从其自然状态改变。
本发明的病毒、组合物和疫苗可以被施用于易感于IBV感染的许多禽类物种中任何一种的禽，包括但不限于家禽、鸡形目禽以及外来禽物种。鸡形目禽包括但不限于鸡、火鸡、松鸡、鹌鹑以及野鸡。如本文所用，家禽包括出于收集它们的蛋的目的而饲养或为了获取它们的肉和/或羽毛的目的而杀死的驯化的禽。这些最典型的禽是鸡雁小纲(飞禽)的成员，尤其是鸡形目(包括例如鸡、鹌鹑、火鸡及松鸡)和通常被称为“水禽”的鸭科(在雁形目中)(包括例如，鸭、鹅及天鹅)的成员。家禽还可以包括其他禽，这些禽因它们的肉被杀死，如鸽或白鸽或被认为是猎物的禽如野鸡。
“家禽”旨在包含任何品种的鸡、雉、鸸鹋、鸵鸟和其他类型的易感于IBV感染的禽。鸡包括但不限于母鸡、公鸡、肉鸡、肉禽、蛋鸡、种鸡、种母鸡的后代及蛋鸡。在一些实施例中，本发明的物质组合物和方法还适用于除家禽之外的易感于IBV感染的动物。如在此使用的，术语“易感”意指在与非易感个体户或类群相比时，对于参考微生物的有害应答(比如，例如在与非易感个体或类群相比时活力减弱或不能茁壮生长等)的可能性或现实性，和/或一种或多种指示IBV感染的病理学状态(包括但不限于本文所述那些中的任何一种)。
本发明的组合物和疫苗可以被配制成用于通过兽医学领域已知的许多途径中的任何一种递送，比如，例如粘膜、鼻内、眼内或口服施用等。本发明的组合物和疫苗可以被配制成用于递送至呼吸道粘膜，并且可以被施用以使其立即或最终与禽的呼吸道粘膜接触。本发明的组合物和疫苗可以被配制成用于通过兽医学领域已知的许多途径中的任何一种递送，比如，例如喷雾或雾化等。
本发明的免疫原性组合物或疫苗可以通过任何合适的已知禽接种方法施用，这些方法包括但不限于经鼻、经眼、通过滴眼剂、通过注射、在饮用水中、在饲料中、通过暴露、在卵内、经母体等。
免疫原性组合物或疫苗可以通过多种物质施用技术来使用，比如将疫苗置于饮用水中或通过喷雾动物环境等。组合物可以通过用溶液喷雾个体或群体来施用，此类气溶胶递送可以包括施用掺入小液体颗粒中的组合物。此类喷雾型颗粒的液滴大小可以在约10微米至约100微米之间的范围内，更优选液滴大小在约<1微米至约50微米之间。为产生这种小颗粒，可以使用常规的喷雾设备和气溶胶发生器，比如用于背负式喷雾器、孵化场喷雾器和雾化喷雾器的市售气溶胶发生器等。通过饮用水施用可以使用常规设备进行。当通过注射施用时，免疫原性组合物或疫苗可以肠胃外施用。肠胃外施用包括例如通过静脉内、皮下、肌肉内、或腹膜内注射施用。
本发明的组合物或疫苗可以在孵化之前或之后施用于禽。禽可以在多个年龄中的任何一个接受此类疫苗组合物。在孵化后递送的情况下，材料可以在例如孵化后约一周、孵化后约两周、孵化后约三周、孵化后约四周、孵化后约五周、孵化后约六周或其任何范围内递送。对于卵内施用，材料可以在孵育期约十七天、孵育期约十八天、孵育期约十九天、孵育期约二十天及其任何范围内递送。
本发明的病毒可以用于任何常用的IBV检测方法，比如例如血凝(HA)(Lashgari和Newman,1984,Avian Dis[禽疫病]；28:435–443)、血凝抑制(King和Hopkins,1983,AvianDis[禽疫病]；27:100–112)、AGPT(Lohr,1980,Avian Dis[禽疫病]；24:463–467；和Lohr1981,Avian Dis[禽疫病]；15:1058–1064)、RT-PCR(Kwon等人,1993,Avian Dis[禽疫病]；37:194–202)和实时RT-PCR(Calison等人，2006,J Virological Methods[病毒学方法杂志]；138:60-65)。
本发明的示例性实施例包括但不限于以下。
1.一种传染性支气管炎病毒(IBV)分离株，其中该IBV分离株包含以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639或其子代或衍生物，其中其子代或衍生物具有与以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的该热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639基本相同的生物学和血清学特征。
2.如实施例1所述的IBV分离株，其中该IBV分离株是冻干的、冷冻干燥的或冷冻的。
3.一种组合物，该组合物包含如实施例1或2所述的IBV分离株。
4.如实施例3所述的组合物，该组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
5.一种疫苗，该疫苗包含经分离的如实施例1或2所述的IBV分离株或其子代或衍生物或如实施例3或4所述的组合物。
6.如实施例5所述的疫苗，其中该疫苗减少了家禽中由IBV感染诱导的一种或多种临床体征和/或病毒载量。
7.一种用于鸡形目禽的疫苗，该疫苗包含一定量的以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的该热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639或其子代或衍生物，该量足以保护这些禽免于家禽中由传染性支气管炎病毒(IBV)感染诱导的一种或多种临床体征。
8.如实施例3至7中任一项所述的组合物或疫苗，该组合物或疫苗包含进一步包含佐剂。
9.如实施例3至8中任一项所述的组合物或疫苗，该组合物或疫苗进一步包含其他病毒材料。
10.如实施例3至9中任一项所述的组合物或疫苗，其中该组合物或配制品被配制成用于鼻内、眼内、口服、粘膜、肌肉内、皮下或卵内施用。
11.如实施例3至10中任一项所述的组合物或疫苗，其中该组合物或疫苗被配制成用于喷雾或雾化。
12.一种泡腾片剂，该泡腾片剂包含如实施例1至11中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
13.一种在家禽中产生针对传染性支气管炎病毒(IBV)的免疫应答的方法，该方法包括向该家禽施用如实施例1至12中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物、疫苗或泡腾片剂。
14.一种在家禽中产生抗IBV抗体的方法，该方法包括向该家禽施用如实施例1至12中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物、疫苗或泡腾片剂。
15.一种减少家禽中由传染性支气管炎病毒(IBV)感染诱导的一种或多种临床体征和/或病毒载量的方法，该方法包括向该家禽施用有效量的如实施例1至12中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物、疫苗或泡腾片剂。
16.一种用于降低鸡形目禽对传染性支气管炎病毒(IBV)感染的易感性的方法，该述方法包括向该禽施用有效量的如实施例1至11中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物、疫苗或泡腾片剂。
17.一种用于保护鸡形目禽免受传染性支气管炎病毒(IBV)感染的方法，该方法包括向该禽施用有效量的如实施例1至11中任一项所述的IBV分离株或子代或衍生物、组合物、疫苗或泡腾片剂。
18.如实施例13至17中任一项所述的方法，其中施用是鼻内、眼内、口服、粘膜、肌肉内或皮下施用。
19.如实施例13至18中任一项所述的方法，其中施用包括卵内施用。
20.如实施例13至19中任一项所述的方法，其中将该IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗通过气溶胶施用。
21.如实施例13至19中任一项所述的方法，其中将该IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗通过喷雾施用。
22.如实施例13至19中任一项所述的方法，其中将该IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗通过饮用水施用。
23.如实施例13至22中任一项所述的方法，其中施用包括施用于种母鸡或公鸡。
24.如实施例13至23中任一项所述的方法，其中该家禽包含鸡形目禽。
25.如实施例13至24中任一项所述的方法，其中该禽是鸡或火鸡。
术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，叙述一个或多个优选实施例不意味着其他实施例是没用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变型在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制意义。
除非另外说明，否则“一个/种(a/an)”、“该”和“至少一个”可互换使用，并且意指一个或多于一个。
同样，通过端点叙述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于本文披露的包括不连续的步骤的任何方法，这些步骤可以按任何可行顺序进行。并且，如果适宜，两个或更多个步骤的任何组合可以同时进行。
除非另外指示，否则本说明书和权利要求书中使用的表示组分的量、分子量等等的所有数值应被理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非另外指示相反含义，否则在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，可以根据本发明所寻求获得的所需特性而变化。至少，并不是试图将等同原则限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
尽管阐明本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，尽可能地精确报告在具体实例中阐明的数值。然而，所有数值固有地含有一个范围，该范围必然是其各自的测试测量中存在的标准偏差所产生的。
在整个申请中的若干个地方，通过实例列表提供了指导，这些实例能以各种组合使用。在每种情况下，所述列表仅用作代表组，而不应解释为排他性列表。应理解，特定实例、材料、量和程序应根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。
通篇中所有标题都为了方便读者，并且除非如此规定，否则不应当用于限制在标题后的文本的含义。
本发明通过以下实例来说明。应理解，特定实例、材料、量和程序应根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。
实例
实例1
活的热减毒IBV株DMV1639用作家禽疫苗
使用热处理使禽冠状病毒传染性支气管炎病毒DMV/1639株减毒。简言之，初始样本是在2019年从佐治亚州一家经历呼吸道体征的肉鸡农场采集的。将病毒分离，然后在含胚蛋中传代3次。然后遵循Jackwood等人先前公布的减毒方法将该样本(共4代)通过14次热激传代进行热激减毒(Jackwood等人，2010,Avian Pathology[禽类病理学]；39:227-233)。随后将在热激传代第14代(hsp14)之后回收的病毒通过含胚蛋传代一次以扩增病毒，得到总共19次传代，5次传统传代和14次热激传代。
如下面的实例所述，使经处理的病毒在含胚蛋中繁殖并测试其在家禽中的安全性和药效。使用针对IBV疫苗测试的美国联邦法规(CFR)第9卷的标准，减毒的病毒通过了安全性测试和药效测试二者。这种DMV/1639株是最近从佐治亚州分离的病毒，并且代表这种病毒的导致家禽上呼吸道疾病的进化版本。这种病毒现在是家禽业的重要经济问题并且持续蔓延。目前，没有针对这种IBV株的商品疫苗。
这种IBV株DMV/1639的活的热减毒分离株(在本文中也称热减毒DMV/1639、减毒DMV/1639、PDRC DMV/1639、热减毒PDRC DMV/1639、热减毒PDRC DMV/1639和减毒DMV/1639-佐治亚分离株)于2020年5月15日作为专利保藏号PTA-126757保藏在美国典型培养物保藏中心
Figure BDA0004136641690000171
专利保藏处，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号，邮编：20110(10801University Boulevard,Manassas,Virginia 20110,USA)。
实例2
热减毒PDRC DMV1639、DE1639、Ma5和iBron GA08的同源和异源保护能力的比较
当将多种IBV疫苗类型(通常为Ma5和4/91)组合在一起时，对IBV疫苗的交叉保护概念进行了广泛研究。最近，一些疫苗制造商提出，单一IBV疫苗可能能够针对异源攻击血清型进行交叉保护而不需要附加的IBV疫苗。附加地，看起来一些正在使用的疫苗可能不能完全预防目前在实地中流行的同源病毒。为调查这些问题，针对致病性DMV/1639攻击测试了四种不同的疫苗以评估保护。
材料与方法
病毒。在本研究中使用了Mass型(勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))、iBron GA08型(诗华公司(Ceva))、DE1639(在本文中也称作自体DMV/1639和MA DMV/1639)和减毒(通过热处理)PDRC DMV/1639疫苗。使用的攻击病毒是最近的DMV/1639/11分离株。
实验设计。实验设计如表1所示。一日龄母源性抗体阳性肉鸡用于本实验。将每组一百只鸡在1日龄时用全剂量的每种疫苗喷雾进行疫苗接种，并且分组放入圈舍。在第7天，对每组的所有鸡进行拭抹，并且使用实时RT-PCR检测疫苗病毒。在28日龄时，将每个攻击病毒组的10只禽和每个对照组的5只禽移入隔离笼中，并且用1X 104EID50的DMV/1639/11攻击。通过在含胚蛋中返滴定来验证攻击病毒的滴度。在攻击后5天进行尸检。将DE1639疫苗组保持在圈舍中并且拭抹直到于42日龄用于疫苗滚动评估。
Figure BDA0004136641690000181
Figure BDA0004136641690000191
表1.实验设计。
尸检/临床体征。记录临床体征，并且基于公布的实验室打分方法来打分(Jackwood等人，2015,Avian Diseases[禽疫病]；59(3):368-374.https://doi.org/10.1637/11026-012415-Reg.1)，其中0＝无体征，1＝轻微喘息或咔哒声，2＝更明显的喘息、窦分泌物、结膜炎，3＝啰音。
尸检/RNA提取和通过实时RT-PCR进行的攻击病毒检测。在尸检时，收集来自腭裂口咽区的鼻后孔内拭子，并置于1ml冰冷的PBS中，用于通过实时RT-PCR进行病毒检测。根据制造商协议在KingFisher磁性粒子处理器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市(Waltham,MA))上使用MagMAX-96RNA分离试剂盒(Ambion公司，美国得克萨斯州奥斯汀市(Austin TX))从50ul PBS中提取病毒RNA。根据制造商的推荐，使用Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System[快速实时PCR系统](生命技术公司(Life Technologies)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市(Carlsbad,CA))和AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR试剂盒(Ambion公司)进行实时RT-PCR。用于实时RT-PCR的引物和探针对应于所测试的特定血清型。引物得自整合DNA科技公司(Integrated DNA Technologies)(美国爱荷华州科勒尔威尔市(Coralville,IA))，Taqman探针由生物研究技术公司(BioSearch Technologies)(美国加利福尼亚州诺瓦托市(Novato,CA))合成。
结果
对于本试验，将100只鸡用表1所示疫苗进行喷雾疫苗接种。然后将每组的所有100只鸡放入圈舍中，放在新鲜垫料上以模拟实地环境条件。在疫苗接种后7天(dpv)，在每组所有鸡的鼻后孔裂中拭抹以测量存在的疫苗病毒，数据可在图1A和1B中看到。如预期的，基于先前的疫苗采样，DE1639疫苗在疫苗接种期间仅感染了约60％的鸡，并且得到的病毒载量相对较低(平均Ct值约为33)。这与在PDRC开发的PDRC DMV/1639疫苗形成对比，后者感染了几乎100％，平均Ct值约为26.5。当将DE1639疫苗与其他疫苗结合使用时，与使用单一疫苗相比，感染率实际上下降了。当与Mass疫苗结合时，DE1639疫苗仅感染约35％的鸡，而病毒载量相同(Ct值约为32)。
Mass疫苗100％感染，平均Ct值约为25，表明不是疫苗应用问题导致DE1639疫苗对该组的疫苗接种失败。当将DE1639疫苗与来自诗华公司(Ceva)的iBron组合时观察到相同的趋势，其中仅约10％的鸡对自体DMV/1639呈阳性，Ct值约为33。鸡对于iBron是约95％阳性的，平均Ct值约为26，再次证明这不是应用问题。当单独评估iBron时，几乎100％的鸡呈阳性，平均Ct值约为25，表明良好的摄取和复制。有趣的是，当观察iBron与Mass疫苗混合时，鸡对于iBron仍然是100％阳性的，平均Ct约为26，但只有60％的鸡对Mass呈阳性，平均Ct约为27.5。然而，阳性值的“尾巴”表明不是所有禽一致地用Mass进行疫苗接种.看起来在将iBron(强疫苗)与来自BI公司的DE1639或Mass(较弱疫苗)组合时，看起来可能存在一些疫苗干扰。
因为DE1639疫苗接种组的第7天采样不好，所以决定在第14天时再次对接受该疫苗的那些组进行拭抹以评估病毒载量和潜在的疫苗滚动。该数据可以在图2中看到。与第7天相比，第14天时仅疫苗接种DE1639组中的阳性百分比(约85％)和病毒载量(平均Ct为25.5)均有所增加。这表明，与传统的IBV疫苗相比，这种疫苗的病毒疫苗复制峰值的出现要晚得多。用这种疫苗和Mass进行疫苗接种的组中的DE1639疫苗的阳性百分比也增加了(从第7天的约35％阳性到第14天的约60％阳性)，但是平均病毒载量(Ct约为32)不变。这将表明在Mass疫苗和DE1639疫苗之间仍然有疫苗抑制发生，并且正在建立滚动反应的条件，其中部分群体在不同的时间变成阳性。对于DE1639和iBron疫苗接种组，只有一个样本呈阳性，表明iBron疫苗基本上使DE1639疫苗停止工作。仅DE1639疫苗组还在疫苗接种后第28天(dpv)进行拭抹以查看仍然存在多少疫苗。结果如图3A和3B所示。约25％的禽仍为阳性的，病毒载量在Ct值36至22范围内(平均Ct约28)。这表明疫苗继续在群体中滚动。
一项其他值得注意的观察结果是，单独或与另一种疫苗组合给予iBron疫苗的多组在疫苗接种后第7天和第14天表现出显著的临床呼吸道体征。当进行拭抹以测量疫苗时，在1/4至1/3的鸡中观察到啰音。在任何其他疫苗组中均没有观察到临床呼吸道体征。
将每个疫苗组中的鸡在疫苗接种后第28天用致病性DMV/1639型IB病毒以每只禽约1x 104EID50进行攻击。攻击后五天，记录临床呼吸道体征，取拭子以通过PCR进行IBV载量分析。除了Mass/iBron疫苗接种和攻击的组之外，所有组的临床体征在统计学上均显著低于未经疫苗接种的、DMV/1639攻击的组，尽管所有组在数字上看都打分较低。结果如图4所示。基于先前使用DMV/1639型攻击病毒和许多IBV疫苗进行的疫苗攻击研究的结果，这并不令人惊讶。
通过DMV/1639型特异性PCR确定的病毒载量表明，所有组的病毒载量在统计学上均显著低于未经疫苗接种的、被攻击的组。结果如图5所示。总体上，未经疫苗接种的、被攻击的组的平均Ct值约为23，所有5个样本均非常接近该值。用DE1639疫苗进行疫苗接种的组在攻击后有8/10的样本呈病毒阳性，但这些样本分成两个不同的组。一组聚集在29Ct值标记周围，并且另一组聚集在34Ct值标记周围。
因为该分析不能区分疫苗与攻击病毒，所以不可能说所有这些阳性样本都是疫苗或攻击或者这些阳性样本中没有一个是疫苗或攻击病毒。但基于来自该组的第28天样本和进行这些研究时的经验，人们将估计这些阳性值中半数来自攻击病毒。PDRC DMV/1639疫苗接种的组在攻击后仅有一个阳性样本，Ct值约为33，表明几乎没有病毒存在。该测试表明，基于9-CFR标准(90％或以上的样本为病毒阴性的)，PDRC DMV/1639疫苗针对该攻击病毒是完全保护的。用DE1639和Mass进行疫苗接种的组在攻击后仅有2个样本呈阳性，平均Ct值约为32。考虑到DE1639疫苗在与Mass疫苗结合时似乎在一定程度上被抑制，这是有趣的。但也不能排除在随机选择鸡进行攻击时，我们无意中选择了接受DMV/1639疫苗的鸡，从而产生了一些免疫力。接种了DE1639疫苗和iBron的组有8/10个样本呈阳性，平均Ct值约为31。该组的Ct值在约26-38范围内，表明仅实现了对攻击的部分保护。
看起来iBron疫苗对DE1639疫苗的抑制确实影响了针对DMV/1639攻击的特异性中和抗体的产生。对于Mass和iBron疫苗组和仅iBron疫苗组，9/10和8/10的样本在攻击后呈阳性，平均Ct值分别约为30和32。这两组在攻击后的平均Ct和阳性总数上与DE1639和iBron疫苗组非常相似，表明在这些组中的任何一个中都没有适当地产生特异性中和抗体。
讨论
基于实地观察，实验如期结束。DE1639疫苗在最初疫苗接种时没有完全感染，然后在这些禽中至少停留到攻击时间点。此外，攻击后检测到病毒的比率高于攻击前检测到疫苗的比率，表明攻击后检测到的病毒中至少有一些是攻击病毒。这意味着或者DE1639疫苗与攻击不是完全抗原匹配的，或者这些禽由于感染率低以至没有完成疫苗接种而不能免于攻击。不管怎样，这种疫苗都不能有效制止攻击病毒。
DE1639和iBron、Mass和iBron以及仅iBron接种组也是如此。在那些组中，几乎所有禽都接受了iBron疫苗，并且一部分禽接受了组合的另一种疫苗。这表明iBron疫苗在一定程度上抑制了另一种疫苗，并且iBron疫苗本身不是完全保护的。
唯一被完全保护(90％或以上为阴性)的组是用PDRC DMV/1639疫苗进行疫苗接种的组。这是从最近的2019年分离株发展而来的，它似乎与实地病毒具有良好的抗原匹配。此外，该疫苗以低于其他疫苗(约1x 103.5EID50)的滴度给予，但仍具有近乎完全的感染和复制动力学。
DE1639疫苗不能提供对攻击的良好保护，并且该疫苗持续存在于群体中，建立了滚动反应场景并模糊了诊断画面。当评估攻击后的病毒检测时，Mass和iBron的组合与DE1639疫苗一样保护，其他实验显示了与该组合类似的结果。这种疫苗组合可以减少临床体征，并且潜在地减少攻击对性能和谴责的影响，但它不能完全阻止DMV/1639攻击病毒的感染和复制。
实例3
比较现在的DE1639疫苗与DMV/1639疫苗的同源保护能力
尽管一些生产公司使用了减毒活自体疫苗，但DMV/1639IB病毒至少自2014年以来一直在家禽群中持续流行。这种正在使用的疫苗似乎不能针对目前实地流行的同源病毒进行保护。出于该原因，生产了本发明的新型热减毒DMV/1639疫苗，以努力增加对目前流行的这种变种血清型实地病毒的保护。
材料与方法
病毒。在本研究中使用特拉华大学(University of Delaware)开发的热减毒活病毒DMV/1639型疫苗(DE1639)和如本文所述的减毒PDRC DMV/1639疫苗(以专利名称PTA-12657保存于ATCC)。所用的攻击病毒是来自德尔马瓦半岛的肉鸡群体的最近的DMV/1639/11分离株。
实验设计。实验设计如下表2所示。一日龄母源性抗体阳性肉鸡用于本实验。将每组一百只鸡在1日龄时用全剂量的每种疫苗喷雾进行疫苗接种，并且分组放入圈舍。在第7天，对每组中的所有鸡进行拭抹并且使用实时PCR检测疫苗病毒。在28日龄时，将每个攻击病毒组的10只禽和每个对照组的5只禽移入隔离笼中，并且用1X 104EID50的DMV/1639/11攻击。通过在含胚蛋中返滴定来验证攻击病毒的滴度。在攻击后5天进行尸检。
Figure BDA0004136641690000241
表2.实验设计。
尸检/临床体征。记录临床体征，并且基于公布的实验室打分方法来打分(Jackwood等人，2015,Avian Diseases[禽疫病]；59(3):368-374.https://doi.org/10.1637/11026-012415-Reg.1)，其中0＝无体征，1＝轻微喘息或咔哒声，2＝更明显的喘息、窦分泌物、结膜炎，3＝啰音。
尸检/RNA提取和通过实时RT-PCR进行的攻击病毒检测。在尸检时，收集来自腭裂口咽区的鼻后孔内拭子，并置于1ml冰冷的PBS中，用于通过实时RT-PCR进行病毒检测。根据制造商协议在KingFisher磁性粒子处理器(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市)上使用MagMAX-96RNA分离试剂盒(Ambion公司，美国得克萨斯州奥斯汀市)从50ulPBS中提取病毒RNA。根据制造商的推荐，使用Applied Biosystems 7500Fast Real-TimePCR System[快速实时PCR系统](生命技术公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市)和AGPATH-IDTM One-Step RT-PCR试剂盒(Ambion公司)进行实时RT-PCR。用于实时RT-PCR的引物和探针对应于所测试的特定血清型。引物得自整合DNA科技公司(美国爱荷华州科勒尔威尔市)，
Figure BDA0004136641690000242
探针由生物研究技术公司(美国加利福尼亚州诺瓦托市)合成。
结果
纯度测试。使用检测美国所有已知IBV血清型的引物和探针通过定量实时PCR检测PDRC DMV/1639疫苗的纯度。下表3表明，疫苗仅检测出DMV/1639阳性，表明不存在其他IBV污染物。还将该疫苗涂在血琼脂细菌平板上，在孵育24或48小时时没有检测到生长。
Figure BDA0004136641690000251
表3.对PDRC DMV/1639疫苗进行qRT-PCR。
安全性研究。在疫苗实验中使用的病毒用于遵循USDA 9CFR指南进行安全性研究。在药效研究中实际给予鸡的疫苗的滴度为1 x 103.4EID50，安全性研究需要至少10倍剂量。为此，将3.16 x 105 EID50的剂量在孵化当天通过眼鼻途径分别施用于26只SPF鸡。四只SPF鸡保持不进行疫苗接种，作为对比阴性对照。将26只经疫苗接种的鸡分开到两个隔离笼中，一笼中有15只鸡，另一笼中有11只鸡。在总共21天时间内，每天监测所有鸡的与IBV疫苗感染或死亡相关的任何夸大的临床体征。两只小鸡在试验期间因八字腿被安乐死，但没有显示出任何IBV感染的体征，尸检没有发现任何典型的IBV病变。在21天实验中，研究中没有小鸡表现出任何IBV的体征。日常监测结果可见下表4。
Figure BDA0004136641690000252
Figure BDA0004136641690000261
表4.安全性研究。
药效研究。对于本实验，一次性对100只鸡用表2中所示疫苗进行喷雾疫苗接种。然后将每组的所有100只鸡放入圈型舍中，放在新鲜垫料上以模拟实地环境条件。在疫苗接种后7天(dpv)，在每组所有鸡的鼻后孔裂中拭抹以测量存在的疫苗病毒。所有数据可见于图6。如预期的，基于先前的疫苗采样，DE1639疫苗在疫苗接种期间仅感染了约60％的鸡，并且得到的病毒载量相对较低(平均Ct值约为33)。这与本文所述的DMV/1639疫苗(PDRC DMV/1639)形成对比，后者的感染接近100％，平均Ct值约为26.5(图6)。
因为DE1639疫苗接种组的第7天采样不好，所以在第14天时再次对该组进行拭抹以评估病毒载量和潜在的疫苗滚动。该数据可见于图7。与第7天相比，第14天时DE1639疫苗接种组的阳性百分比(约85％)和病毒载量(平均Ct为25.5)均有所增加。这表明，与传统的IBV疫苗相比，这种疫苗的病毒疫苗复制峰值的出现要晚得多。还在疫苗接种第28天(dpv)对DE1639疫苗组进行拭抹以查看仍然存在多少疫苗(图8)。约25％的禽仍为阳性的，病毒载量在Ct值36-22范围内(平均Ct约28)。这表明疫苗继续在群体中滚动。
随机选择每个疫苗组中的十只鸡，并且在疫苗接种后第28天用致病性DMV/1639型IB病毒以每只禽约1x 104EID50进行攻击。攻击后五天，记录临床呼吸道体征，取拭子以通过PCR进行IBV载量分析。所有组的临床体征在统计学上均显著低于未经疫苗接种的、DMV/1639攻击的组(图9)。
通过DMV/1639型特异性PCR确定的病毒载量表明，所有组的病毒载量在统计学上均显著低于未经疫苗接种的、被攻击的组(图10)。总体上，未经疫苗接种的、被攻击的组的平均Ct值约为23，所有5个样本均非常接近该值。用DE1639疫苗进行疫苗接种的组在攻击后有8/10的样本呈病毒阳性，但这些样本分成两个不同的组。一组聚集在29Ct值标记周围，并且另一组聚集在34Ct值标记周围。因为该分析不能区分疫苗与攻击病毒，所以不可能说所有这些阳性样本都是疫苗或攻击或者这些阳性样本中没有一个是疫苗或攻击病毒。但是基于来自该组的第28天样本和进行这些研究时的经验，可以估计这些阳性值的半数来自攻击病毒。PDRC DMV/1639疫苗接种的组在攻击后仅有一个阳性样本，Ct值约为33，表明几乎没有病毒存在。该测试表明，基于9-CFR标准(90％或以上的样本为病毒阴性的)，PDRC疫苗针对该攻击病毒是完全保护的。
讨论
实验如期结束。DE1639疫苗在最初疫苗接种时没有完全感染，然后在这些禽中至少停留到攻击时间点。此外，攻击后检测到病毒的比率高于攻击前检测到疫苗的比率，表明攻击后检测到的病毒中至少有一些是攻击病毒。这意味着或者DE1639疫苗与攻击不是完全抗原匹配的，或者这些禽由于感染率低以至没有完成疫苗接种而不能免于攻击。不管怎样，这种疫苗都不能有效制止攻击病毒。这也与实地情况匹配，其中在使用自体DMV疫苗进行疫苗接种的群体中持续检测出DMV/1639。唯一被完全保护(90％或以上为阴性)的组是用本文所述的热减毒PDRC DMV/1639疫苗(以专利保藏号PTA-126757保藏在
Figure BDA0004136641690000281
专利保藏处)进行疫苗接种的组。PDRC DMV/1639疫苗是从最近的2019年分离株发展而来的，它似乎与实地病毒具有良好的抗原匹配。此外，该疫苗以低于其他疫苗(约1x 1003.4EID50)的滴度给予，但仍具有近乎完全的感染和复制动力学。
对于较新的PDRC疫苗有改进药效的一项可能的解释为，其与当前流行的实地病毒有更好的抗原匹配。在图11所示的系统表中，比较了不同的DMV/1639病毒分离株。下方的方框代表来自初始2015爆发的分离株，自体疫苗以箭头表示。来自2019的更近的分离株在上方的方框中，PDRC疫苗以箭头表示。本研究中使用的分离自德尔马瓦肉鸡群体的攻击病毒的序列也落入上框所示的进化枝中。看起来，随着病毒全国范围内转移，它似乎已经进化，但已经开始“定居”，因为现在大多数分离株聚集在一起。
实例4
使热减毒PDRC DMV/1639疫苗回代以评估减毒稳定性
通过本实例，通过将疫苗在易感鸡中回代来评估如本文所述的热减毒PDRC DMV/1639疫苗的稳定性。
材料与方法
病毒。在本研究中使用以专利名称PTA-12657报春在ATCC的减毒(通过热处理)PDRC DMV/1639病毒疫苗。
实验设计。一日龄无特定病原体(SPF)的肉鸡用于本实验。最初对五只1日龄鸡鼻内和眼内给予体积为0.1ml的3.16x 103 50％胚胎感染剂量(EID50)的疫苗。在疫苗接种后2天或3天之后，拭抹每只禽的鼻后孔裂，汇集到3ml PBS(pH 7.4)中，将0.1ml该汇集样本给予另一组五只1日龄SPF鸡中的每只禽。将这重复10次。在整个研究过程中，检查所有禽的临床体征，并且在最后一次回代(回代次数10)时，在疫苗接种后5天对五只单独的禽进行尸检。在该尸检中，取鼻后孔内拭子并且不汇集，检查这些禽的临床体征和病变。
临床体征。记录临床体征，并且基于公布的实验室打分方法来打分(Jackwood等人，2015,Avian Diseases[禽疫病]；59(3):368-374.https://doi.org/10.1637/11026-012415-Reg.1)，其中0＝无体征，1＝轻微喘息或咔哒声，2＝更明显的喘息、窦分泌物、结膜炎，3＝啰音。
RNA提取和通过实时RT-PCR进行的病毒检测。收集来自腭裂口咽区的鼻后孔内拭子，针对回代组1至9，将其汇集到3ml冰冷的PBS中以用于通过实时RT-PCR进行病毒检测。将来自回代组10的五只禽的鼻后孔内拭子保持为单独的样本并且置于1ml冰冷的PBS中以用于通过实时RT-PCR进行病毒检测。
根据制造商协议在KingFisher磁性粒子处理器(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市)上使用MagMAX-96RNA分离试剂盒(Ambion公司，美国得克萨斯州奥斯汀市)从50ul PBS中提取病毒RNA。根据制造商的推荐，使用Applied Biosystems 7500FastReal-Time PCR System[快速实时PCR系统](生命技术公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市)和AGPATH-IDTM One-Step RT-PCR试剂盒(Ambion公司)进行实时RT-PCR。用于实时RT-PCR的引物和探针对应于特定的DMV/1639血清型。引物得自整合DNA科技公司(美国爱荷华州科勒尔威尔市)，Taqman探针由生物研究技术公司(美国加利福尼亚州诺瓦托市)合成。
结果
给予热减毒PDRC DMV/1639疫苗的多只禽中没有一只出现临床体征。此外，回代10组的所有五只禽不存在临床体征和病变。
实时RT-PCR结果在表5中呈现。在来自回代组1至9的汇集样本以及来自从回代组10的五只禽中获取的每个单独样本中都检测到疫苗病毒。
回代组a CTb值
1 17.06
2 20.08
3 21.99
4 21.53
5 20.42
6 22.90
7 22.97
8 20.75
9 22.20
10-1 20.80
10-2 21.97
10-3 20.45
10-4 21.32
10-5 21.51
a组1至9是5个拭子在3ml PBS中的汇集，组10-1至10-5是在1ml PBS中的来自于最后回代组的五只禽的5个单独样本。
b CT＝循环阈值
表5.汇集(组1-9)和单独(组10)的鼻后孔内拭子样本的实时RT-PCR数据。
讨论
基于本实验的数据，热减毒PDRC DMV/1639疫苗在10次回代后在易感SPF鸡中是稳定的。在来自每个回代组的鸡中检测到疫苗病毒，并且没有检测到任何禽临床体征或病变(仅回代组10)。CT值在22.97至17.06范围内，表明大量疫苗被传代至每组鸡。考虑到在这些禽中没有看到任何临床体征或病变的数据和实施，清楚地表明PDRC DMV/1639疫苗的减毒性质是稳定的，并且在实地使用应该是安全的。
实例5
纯度
对特拉华大学农业与自然资源实验室(University of Delaware Agriculturaland Natural Resources Laboratory)以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的PDRC DMV/1639疫苗样本进行的针对传染性鼻炎、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体、NAHLN禽流感(AIV)、NAHLN禽副粘病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)、IBV-DE072/GA99、IBV-Ark、IBV-Mass/Conn、IBV-DMV/1639和IBV-GA08的分析仅检测到IBV和IBV-DMV1639，表明了纯度。进行这种分析以确保分离株不包含任何商品家禽中常见的病原体，或者任何能够毁灭商品家禽的病原体(比如AI或NDV)。在考虑疫苗生产时，纯度是至关重要的，应该彻底评估。进行这种分析也是为了确保从测试中获得的任何结果(见前面的实例)不会受到混杂变量(比如另一种病原体的污染等)的正面或负面影响。这些数据确保在分离、繁殖和制备疫苗种子时采取了最高质量控制措施，并且呈现的数据是单独该DMV/1639/11病毒疫苗的真实反映。
实例6
实地研究
本文所述的PDRC DMV/1639疫苗(以专利名称PTA-12657保藏在ATCC)已在商业环境中施用于超过5,000万只鸡。对疫苗的分析表明，疫苗在商业条件下对于感染和复制非常有效。该分析对于确保疫苗成功非常重要，因为大多数家禽传染性支气管炎病毒疫苗(像本文所述的DMV/1639疫苗一样)都是使用滴眼施用方式测试和验证的。尽管是实验室实验的金标准，但不可能对每一只生产的商品鸡进行滴眼疫苗接种。出于这一原因，使用喷雾柜将疫苗雾化到鸡身上，对商品鸡集体进行接种疫苗。在此过程中有许多潜在的失败点，这些失败点在过去影响了其他IBV疫苗的疫苗药效。该数据表明，即使通过喷雾大量施用，本文所述的DMV/1639疫苗在感染和复制鸡方面也非常有效，这是诱导适当免疫应答的主要步骤。该数据还有助于确定疫苗的最有效剂量，因为可以记录和评估使用该疫苗的商业环境中的不良疫苗反应和给予鸡的实际剂量。
本文引用的所有专利、专利申请、以及出版物和电子可得材料(包括例如提交到例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列，以及提交到例如SwissProt数据库、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)的完整披露内容通过援引并入。在本申请的披露内容和通过援引并入本文的任何文件的披露内容之间存在任何不一致性的情况下，本申请的披露内容应当占据主导。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节，因为将在权利要求定义的本发明内包含对于本领域技术人员而言显而易见的变体。

Claims (24)

1.一种传染性支气管炎病毒(IBV)分离株，其中该IBV分离株包含以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639或其子代或衍生物，其中其子代或衍生物具有与以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的该热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639基本相同的生物学和血清学特征。
2.如权利要求1所述的IBV分离株，其中该IBV分离株是冻干的、冷冻干燥的或冷冻的。
3.一种组合物，该组合物包含如权利要求1所述的IBV分离株。
4.如权利要求3所述的组合物，该组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
5.一种疫苗，该疫苗包含经分离的如权利要求1所述的IBV分离株或其子代或衍生物。
6.如权利要求5所述的疫苗，其中该疫苗减少了家禽中由IBV感染诱导的一种或多种临床体征和/或病毒载量。
7.一种用于鸡形目禽的疫苗，该疫苗包含一定量的以专利名称PTA-12657保藏在ATCC的该热减毒IBV分离株PDRC DMV/1639或其子代或衍生物，该量足以保护这些禽免于家禽中由传染性支气管炎病毒(IBV)感染诱导的一种或多种临床体征。
8.如权利要求3至7中任一项所述的组合物或疫苗，该组合物或疫苗进一步包含佐剂。
9.如权利要求3至8中任一项所述的组合物或疫苗，该组合物或疫苗进一步包含其他病毒材料。
10.如权利要求3至9中任一项所述的组合物或疫苗，其中该组合物或配制品被配制成用于鼻内、眼内、口服、粘膜、肌肉内、皮下或卵内施用。
11.如权利要求3至10中任一项所述的组合物或疫苗，其中该组合物或疫苗被配制成用于喷雾或雾化。
12.一种泡腾片剂，该泡腾片剂包含如权利要求1至11中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
13.一种在家禽中产生针对传染性支气管炎病毒(IBV)的免疫应答的方法，该方法包括向该家禽施用如权利要求1至11中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
14.一种在家禽中产生抗IBV抗体的方法，该方法包括向该家禽施用如权利要求1至11中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
15.一种减少家禽中由传染性支气管炎病毒(IBV)感染诱导的一种或多种临床体征和/或病毒载量的方法，该方法包括向该家禽施用有效量的如权利要求1至11中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
16.一种用于降低鸡形目禽对传染性支气管炎病毒(IBV)感染的易感性的方法，该方法包括向该禽施用有效量的如权利要求1至11中任一项所述的IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗。
17.一种用于保护鸡形目禽免受传染性支气管炎病毒(IBV)感染的方法，该方法包括向该禽施用有效量的如权利要求1至11中任一项所述的IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗。
18.如权利要求13至17中任一项所述的方法，其中施用是鼻内、眼内、口服、粘膜、肌肉内或皮下施用。
19.如权利要求13至18中任一项所述的方法，其中施用包括卵内施用。
20.如权利要求13至19中任一项所述的方法，其中将该IBV分离株或其子代或衍生物、组合物或疫苗通过气溶胶施用。
21.如权利要求13至19中任一项所述的方法，其中将该IBV分离株或子代或衍生物、组合物或疫苗通过喷雾施用。
22.如权利要求13至21中任一项所述的方法，其中施用包括施用于种母鸡。
23.如权利要求13至22中任一项所述的方法，其中该家禽包括鸡形目禽。
24.如权利要求13至23中任一项所述的方法，其中该禽是鸡或火鸡。
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