CN109207436B

CN109207436B - 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用

Info

Publication number: CN109207436B
Application number: CN201710552460.9A
Authority: CN
Inventors: 张贺楠; 张钊伟; 于雷; 邵葳; 周建民; 史张艳; 程海波
Original assignee: Qyh Biotech Co ltd
Current assignee: QYH BIOTECH Co.,Ltd.
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2037-07-07
Also published as: CN109207436A

Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体公开了一株I群4型禽腺病毒毒株及其应用。所述I群4型禽腺病毒毒株ZMXZAV‑4株，保藏编号为CGMCC No.14296。其具有细胞适应性强，产毒量高，免疫原性强等特点。以此毒株为基础发明的鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒三联灭活疫苗，其中鸡新城疫病毒为La Sota毒株；传染性法氏囊病病毒为LY23株，保藏编号为CGMCC No.11594；禽腺病毒为I群4型禽腺病毒ZMXZAV‑4株，保藏编号为CGMCC No.14296。该疫苗安全、有效，可用于预防鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒病，达到一针防三病的效果，减少免疫成本和免疫应激反应。

Description

一株I群4型禽腺病毒毒株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一株I群4型禽腺病毒毒株及其在一种鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒三联灭活疫苗中的应用。

背景技术

随着家禽集约化养殖的兴起，禽病流行特点日趋复杂化，往往许多旧的疫病没有得到有效控制，新的疫病又不断发生，这一直制约着养禽业健康稳定发展。

鸡新城疫是一种急性、高度接触性传染病，具有很高的发病率和病死率，一旦爆发将给家禽养殖业带来严重损失，OIE将其列为须上报疫病。

鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，主要侵害淋巴组织，特别是法氏囊。该病自发现以来，一直是养鸡业的重大疾病之一：发病鸡群的死亡率、淘汰率增加，雏鸡在早期感染该病后会引起严重的、长期的免疫抑制。

自2014年来不断有心包积液－肝坏死综合征的报道，该病是由I 群禽腺病毒引起，近阶段该病在河南、山东、河北、安徽、山西等省大面积流行，死亡率在10％～30％，严重时可达80％，且该病的发生呈上升趋势，该病发病急、病程短，已成为危害蛋鸡、肉鸡生产的主要传染病。

新城疫及鸡传染性法氏囊病的长期存在，已经给广大养殖户带来了巨大的经济损失，而心包积液-肝坏死综合征的出现，更给我们增加了防控的难度。接种疫苗是预防传染病的最有效方式，疫苗接种动物机体后，刺激机体产生特异性抗体，当体内的抗体滴度达到一定数值后，就可以抵抗这种病原微生物的侵袭、感染，起到预防这种疾病的作用。一般情况下，必须同时接种以上3种疾病的单独的疫苗来预防这些疾病在鸡群中的爆发，不仅耗时费力，还造成鸡只的应激，影响生产性能。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一株I群4 禽腺病毒毒株及其在一种鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒三联灭活疫苗中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种禽腺病毒血清4型ZMXZAV-4株，经鉴定为禽腺病毒4型，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年6月19日，保藏号为：CGMCC No.14296。

该疫苗禽腺病毒血清4型ZMXZAV-4株是由中牧研究院分离的流行性强毒株，且经过纯化，细胞适应性强，免疫原性强，对心包积液综合症具有良好的保护性。

因此，本发明还提供了所述禽腺病毒血清4型ZMXZAV-4株在制备预防心包积液－肝炎综合征的药物上的应用。

进一步地，本发明提供一种鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒三联灭活疫苗，用于预防新城疫、鸡传染性法氏囊病和心包积液－肝炎综合征。该三联灭活疫苗含有的抗原为灭活的鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和I群4型禽腺病毒。

其中，鸡新城疫病毒为鸡新城疫病毒La Sota株。

鸡传染性法氏囊病病毒为鸡传染性法氏囊病病毒LY23株，其为鸡传染性法氏囊病病毒超强毒毒株的DF-1细胞适应株，经鉴定为鸡传染性法氏囊病病毒，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2015年11 月19日，保藏编号为CGMCC No.11594。

禽腺病毒为I群4型禽腺病毒ZMXZAV-4株，其为细胞适应克隆株，保藏编号为CGMCC No.14296。

本发明所述的三联灭活疫苗的制备方法如下：

1)油相制备：

取注射用白油94份和司本-80 6份混合后，加入2％硬脂酸铝，高压灭菌后备用。

2)水相制备：

将鸡新城疫病毒La Sota株接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚液；鸡传染性法氏囊病病毒IBDV-LY23株接种DF1细胞，收获细胞病变后的细胞培养液；禽腺病毒ZMXZAV-4株接种LMH细胞，收获细胞病变后的病毒液；

所述收获的病毒液浓缩至原体积的1/3，分别加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.1％～0.2％，边加边充分摇匀，置37℃充分灭活。

将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性法氏囊病病毒液、禽腺病毒病毒液按1:1:1的比例混合，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，传染性法氏囊病病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀，禽腺病毒病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30 分钟，使吐温-80完全溶解。

3、乳化

取油相2份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml 加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

4、分装

定量分装，加盖密封。

本发明涉及到的原料或试剂如无特殊说明均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明经驯化后适应细胞规模化培养，并且经蚀斑纯化筛选出一种I群4型禽腺病毒ZMXZAV-4株毒株，其具有产毒量高、免疫原性强的优点。

本发明所提供的疫苗所使用的传染性法氏囊病病毒LY23株，是超强毒的流行毒株，病毒滴度高、免疫原性好，对传染性法氏囊病病毒标准强毒株及超强流行毒株均有良好保作用。本发明制备的疫苗安全性高、效力稳定，注射后预防效果显著，可用于预防鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒(I群4型)所引起的疾病，达到一针防多病的效果，减少免疫成本和免疫应激反应。

附图说明

图1为本发明实例1中ZMXZAV-4株hexon基因的PCR检测结果；其中，M为Trans2Kplus Marker；1为hexon基因的PCR产物；2为阴性对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明在临床病料中分离到一株I群4型禽腺病毒，并通过蚀斑纯化技术筛选出产毒量高，细胞适应性强的克隆株。将该病毒与鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒用于联苗的研制。

实施例1禽腺病毒ZMXZAV-4株的分离、纯化与鉴定

1、流行病学情况

2014年以来，我国部分地区出现了一种扩散快、死亡率高、发病急的疫病，鸡只发病前无明显症状，发病后很快出现急性死亡。初期主要是小型养殖场发病，很快规模化养殖场也开始出现发病，由于没有较好的防治对策，养殖户经济损失严重。该病主要感染3～6周龄肉鸡，死亡率为20％～80％，蛋鸡、种鸡都有感染。经分析为疑似心包积水综合征，病原可能为禽腺病毒。申请人2014年从河南某鸡场具有心包积水典型特征的病死鸡中分离到一株病毒。

2、禽腺病毒ZMXZAV-4株的分离

(1)病料处理

采集出现典型症状和病理变化的病鸡肝脏、脾脏组织，剪碎研磨，称重量后分别按照1:3的重量比加入灭菌的PBS，4℃、6000r/min离心 10min，4℃、8000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌1.5ml离心管中，加入双抗(终浓度为青霉素2000IU/ml，链霉素2mg/ml)，37℃ 作用1h，经卵黄囊接种5日龄SPF鸡胚各5枚，0.2ml/枚。弃去24h内死亡的鸡胚，以后每隔6h观察1次，收取死亡鸡胚的尿囊液及胚体，至 216h取出所有鸡胚尿囊液及胚体，组织捣碎，用含青链霉素的无菌 PBS做2倍稀释，留样检测，病毒分离物置于-70℃保存。

(2)hexon基因序列测定及血清型鉴定

提取样品核酸，根据已公布的FAV-I hexon基因序列设计引物对基因进行克隆。分离毒株与禽腺病毒I亚群4型的亲缘关系最近，与血清8型、9型等I亚群其他血清型以及EDSV、HEV亲缘关系较远。并且，与近期的分离株同源性较高，而与早期分离株同源性较低。提示采用分离株制备疫苗，可对流行毒株具有更好的防疫效果。

将病毒液用不含血清的DMEM稀释1000倍，分别等量加入I群禽腺病毒1～12型标准阳性血清，37℃下作用60分钟。将中和样品接种生长良好的LMH细胞(24孔细胞板)，每一中和样品接种5孔LMH 细胞。接种后每6小时观察一次，记录每组细胞有无CPE。结果显示，待检病毒液与I群4型禽腺病毒标准阳性血清中和后，接种鸡肝细胞，细胞不产生细胞病变。而与其他血清型标准阳性血清中和后，接种 LMH细胞仍可产生细胞病变。

(3)病毒的蚀斑克隆纯化及筛选

将病毒液用DMEM进行10倍梯度稀释至10^-5～10^-9后接种至生长成致密单层的LMH细胞，吸附1h后，弃掉液体，加铺约3mm厚的第一层营养琼脂(终浓度为1％低熔点琼脂糖、2％胎牛血清的 DMEM)，置CO₂培养箱，37℃，5％CO₂条件下倒置培养48h后(待细胞出现病变时)加铺第二层营养琼脂(终浓度为1％低熔点琼脂糖、 2％胎牛血清的1×DMEM)，37℃，5％CO₂条件下避光倒置培养。待蚀斑形成后用滴头吸出，连同琼脂糖一起放入1.0ml的不含血清 DMEM中，反复冻融3次，使病毒充分释放，接种新的空白LMH细胞，进行病毒增殖，如此重复克隆三次。随机挑选第四代克隆的五个蚀斑，进行培养，测定病毒含量，分别挑选病毒含量最高的一株毒，作为基础种毒F1代，并通过LMH细胞连续传代至15代。

(4)禽腺病毒毒株的保藏

将该毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.14296，保藏日期2017年6月19日。

3、禽腺病毒ZMXZAV-4株的鉴定

(1)禽腺病毒ZMXZAV-4株的培养

将禽腺病毒ZMXZAV-4株病毒液用DMEM进行适当稀释后接种至生长成致密单层的LMH细胞，37℃吸附1h，弃病毒吸附液，重新加入2％血清浓度的DMEM作维持液，37℃继续培养，每天于倒置相差显微镜下观察CPE变化，待80％以上LMH细胞出现CPE后收毒，并通过鸡肝细胞连续传至F15代。

(2)无菌检验和支原体检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，ZMXZAV-4株F1代种毒样品接种后，无菌和支原体生长。

(3)病毒含量测定

将ZMXZAV-4株F1代病毒液10倍系列稀释后，取10^-6、10^-7、10^-8、 10^-9、10^-10五个稀释度，分别接种96孔细胞板上的单层LMH细胞，置 37℃孵育72小时。72小时后，逐孔观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明：ZMXZAV-4株F1代种毒的病毒含量为10^7.67TCID₅₀/0.1ml。

(4)禽腺病毒ZMXZAV-4株外源病毒检验

采用鸡检验法进行，将病毒液灭活后乳化，肌肉注射途径接种14 日龄SPF鸡，21日后再次以相同方法重复接种1次。第一次接种后42 天采血，进行相关病原的血清抗体监测。结果表明，ZMXZAV-4株病毒液无外源病毒污染。

表1禽腺病毒ZMXZAV-4株外源病毒血清学检验结果

注：－表示阴性，+表示阳性。

(5)对SPF鸡的毒力试验

取禽腺病毒ZMXZAV-4株F1代和F10代分别进行攻毒试验。将30 只14日龄SPF鸡随机分成3组，每组10只，第一组用ZMXZAV-4株F1 代病毒液100倍稀释后按0.2ml/只的剂量通过肌肉注射途径攻毒，第二组用F10代病毒液100倍稀释后按0.2ml/只的剂量通过肌肉注射途径攻毒，第三组接种DMEM培养基作为阴性对照。同条件饲养并观察10d。结果如表2所示，ZMXZAV-4株F1代和F10代攻毒后，2～3天内鸡只开始发病，3～5天为发病死亡的高峰期，7天内发病率达100％(发病标准：(1)攻毒后出现羽毛蓬松、采食减少、扎堆、精神萎靡等症状并在10天内死亡；(2)攻毒后10天出现羽毛蓬松、采食减少、扎堆、精神萎靡等症状的未死亡鸡只剖检见明显心包积液、肝脏出血、肿胀等)，死亡率≥80％，对照组鸡只无任何临床症状。不同代次毒株攻毒试验结果说明，ZMXZAV-4株毒力较强且稳定，通过肌肉接种，可造成100％发病。

表2各代次毒株对SPF鸡毒力试验结果

组别

品种

日龄

攻毒途径

攻毒数

死亡数

死亡率

发病数

发病率

F1代

来航

14d

肌注

10

9

90％

10

100％

F10代

来航

14d

肌注

10

8

80％

10

100％

对照

来航

14d

肌注

10

0

(7)免疫原性测定

将ZMXZAV-4株F5代、F10代种毒，分别接种生长良好的LMH细胞，收获病毒液，制成灭活疫苗，具体方法如下：将白油和司本-80 按照94︰6的体积比混匀后作为疫苗油相。采用甲醛灭活禽腺病毒 ZMXZAV-4株病毒液，得到灭活病毒液。将灭活病毒液和吐温-80按照体积比96︰4混匀，作为疫苗水相。将油相和水相按照2︰1的体积比混匀，即获得灭活疫苗。

将F5代、F10代毒种制备的灭活疫苗按0.3ml/羽份颈部皮下分别免疫14日龄SPF鸡各10只，另取10只不免疫作为空白对照。免疫后21 天，所有试验鸡采血，分离血清，参照现行《兽用生物制品检验操作规程》中方法进行琼脂扩散试验。同时对免疫组和对照组的鸡进行禽腺病毒ZMXZAV-4株(F5代)攻毒保护试验。

攻毒保护试验：用禽腺病毒ZMXZAV-4株(F5代)代进行攻毒，每只鸡肌肉注射0.2ml(≥10^6.0TCID₅₀)，攻毒后10日内每日观察鸡群状态，如发病则判为不保护；若试验鸡只攻毒后在观测期内不发病判为保护。(发病标准：(1)攻毒后出现羽毛蓬松、采食减少、扎堆、精神萎靡等症状并在10天内死亡；(2)攻毒后10天出现羽毛蓬松、采食减少、扎堆、精神萎靡等症状的未死亡鸡只剖检见明显心包积液、肝脏出血、肿胀等)

结果表明，F5代、F10代毒种制备的灭活疫苗按照0.3ml/羽份剂量免疫后21天，免疫组血清琼扩抗体阳性率均高达10/10；禽腺病毒 ZMXZAV-4株(F5代)攻毒保护试验结果表明，F5代、F10代毒种制备的灭活疫苗免疫组所有攻毒鸡只均为保护，对照组攻毒鸡只全部发病。

表3不同代次毒株免疫原性测定结果

组别

日龄

免疫途径

免疫数

免疫量

抗体阳性率

攻毒量

保护率

发病率

F5代

14d

皮下

10

0.3ml

10/10

0.2ml

10/10

/

F10代

14d

皮下

10

0.3ml

10/10

0.2ml

10/10

/

对照

14d

/

10

/

0/10

0.2ml

/

10/10

禽腺病毒ZMXZAV-4株生物学特性研究结果表明，该毒是I群4 型的流行毒株，可在LMH细胞上高滴度增殖，不同代次均具有良好的免疫原性，能够有效抵抗同源病毒攻击。因此可作为禽腺病毒病的候选毒株，用于灭活疫苗研制。

实施例2鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗毒种来源及标准

1、毒种来源

鸡新城疫毒种为鸡新城疫病毒La Sota株，效检用毒株为鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AVl611株)，均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应；传染性法氏囊病病毒种为LY23株，由中牧实业股份有限公司鉴定、保管，效检用毒株为传染性法氏囊病病毒BC6/85 株(CVCC AV7)，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应；制苗及效检用禽腺病毒毒种为ZMXZAV-4株，由中牧实业股份有限公司鉴定、保管。

2、毒种标准

2.1鸡新城疫病毒La Sota株应符合下列标准

2.1.1对鸡脑内致病指数(ICPI)应为0.1～0.4。

2.1.2对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)应为 103～119小时。

2.1.3对鸡胚的毒力

将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF 鸡胚10枚，每胚0.1mL，置36～37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～120 小时死亡70％以上，胎儿须有明显充血、出血病痕。

2.1.4红细胞凝集价

将毒种做2倍系列稀释，按微量法进行HA效价测定，含毒鸡胚液对鸡红细胞凝集价应≥9log2。

2.1.5病毒含量

按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^–8、 10^-9三个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1mL，置36℃～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120 小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥7log₂(微量法)者判为感染，计算EID₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

2.1.6安全性

用2～7日龄SPF雏鸡20只，分成两组，第一组10只，每只滴鼻接种5倍稀释的含毒胚液0.05mL；第二组10只，不接种作为对照，两组在同条件下分别饲养管理，观察10日，应无不正常反应。如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不应超过1只。

2.1.7免疫原性

对1月龄SPF鸡滴鼻免疫，最小免疫量≤5000EID₅₀。

2.1.8纯净

按现行《中国兽药典》附录进行，毒种应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

2.1.9特异性

将毒种稀释至含10⁵EID₅₀/0.1mL，与等量抗鸡新城疫病毒标准阳性血清混合，室温中和1小时后，接种SPF鸡胚10只，观察120小时，在24～120小时内不引起特异死亡且至少存活8只，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。

2.1.10基础种子代数

2～5代。

2.1.11毒株保存

-20℃以下保存，保存期为36个月；-70℃以下保存，保存期为 60个月。

2.2传染性法氏囊病病毒LY23株应符合以下标准

2.2.1病毒含量

2.2.1.1细胞半数感染量(TCID₅₀)

将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8三个稀释度，分别接种96孔细胞板上的单层DF-1细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml，置37℃孵育144小时后，观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按照Reed-Muench方法计算TCID₅₀。每0.1mL病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀。

2.2.1.2鸡胚半数致死量(ELD₅₀)

将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、 10^-8三个稀释度各经绒毛尿囊膜(CAM)途径接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1mL，置36℃～37℃继续孵育，弃掉24h内死亡的鸡胚。以后每 12h照蛋1次，观察至168h，详细记录各组鸡胚死亡情况及胚体病变，计算ELD₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^6.0ELD₅₀。

2.2.2对SPF鸡的毒力测定

将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4滴度，点眼接种21～28日龄SPF鸡10只，每只0.1ml(≥10^2.0ELD₅₀)。攻毒后观察14日，至少应有8只死亡。

2.2.3特异性

将毒种稀释至含10⁴TCID₅₀/0.1mL，与等量抗鸡传染性法氏囊病病毒标准阳性血清混合，置37℃中和60分钟后，接种DF1细胞， 0.2ml/孔(中和组)。同时设病毒对照组和阴性对照组各5孔，分别接种稀释好的病毒液及灭菌生理盐水，0.1ml/孔。接种后置37℃培养5天，每天观察细胞病变情况。中和组、阴性对照组细胞无病变，病毒对照组所有孔全部出现典型病变。

2.2.4免疫原性

2.2.4.1免疫原性——血清学方法

将毒种制成油乳剂灭活疫苗后(抗原含量≥10^7.0TCID₅₀/0.3ml)，颈部皮下或肌肉注射4～5周龄SPF鸡10只，每只0.3ml，另取10只不免疫，作为空白对照。免疫28天后，所有试验鸡采血，分离血清，测定琼扩抗体。免疫鸡应至少有9只琼扩抗体水平≥1︰8，对照鸡均应为阴性。

2.2.4.1免疫原性——免疫攻毒法

强毒攻毒:将毒种制成油乳剂灭活疫苗后(抗原含量 ≥10^7.0TCID₅₀/0.3ml)，颈部皮下或肌肉注射4～5周龄SPF鸡10只，每只0.3ml，另取10只不免疫，作为空白对照。接种后28日，连同对照鸡5只，各点眼接种传染性法氏囊病病毒BC6/85株(CVCC AV7) (≥10MID)，接种后96h剖杀，检查法氏囊病变，健康对照组5只鸡应无任何变化，攻毒对照组5只鸡应至少4只法氏囊出现病变，免疫组应至少有8只鸡的法氏囊无病变。

超强毒攻毒:将毒种制成油乳剂灭活疫苗(抗原含量 ≥10^7.0TCID₅₀/0.3ml)，颈部皮下或肌肉注射4～5周龄SPF鸡10只，每只0.3ml，另取10只不免疫，作为空白对照。接种后28日，连同对照鸡10只，各点眼接种传染性法氏囊病病毒LY23株0.1ml (≥10^2.0ELD₅₀)。攻毒后观察14日，至少应有8只死亡。

2.2.5纯净性

2.2.6基础种子代数

2～3代。

2.2.7毒株保存

-20℃以下保存，保存期暂定为24个月。

2.3禽腺病毒ZMXZAV-4株应符合以下标准

2.3.1病毒含量

将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-9三个稀释度，分别接种96孔细胞板上的单层LMH细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml，置37℃孵育72小时后，观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按照Reed-Muench方法计算 TCID₅₀。每0.1ml病毒含量应≥10^7.5TCID₅₀。

2.3.2对SPF鸡的毒力测定

将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，经肌肉接种21～28日龄 SPF鸡10只，每只0.2ml(≥10^6.0TCID₅₀)，观察14日，至少应有8 只发病(发病标准：(1)攻毒后出现羽毛蓬松、采食减少、扎堆、精神萎靡等症状并在10天内死亡；(2)攻毒后10天出现羽毛蓬松、采食减少、扎堆、精神萎靡等症状的未死亡鸡只剖检见明显心包积液、肝脏出血、肿胀等)。

2.3.3特异性

将毒种稀释至含10^4.0TCID₅₀/0.1mL，与等量抗I群4型禽腺病毒标准阳性血清混合，置37℃中和1h后，接种LMH细胞，0.2ml/孔(中和组)。同时设病毒对照组和阴性对照组各5孔，分别接种稀释好的病毒液及不含血清的DMEM，0.2ml/孔。接种后置37℃培养7天，每天观察细胞病变情况。中和组、阴性对照组细胞无病变，病毒对照组所有孔全部出现典型病变。

2.3.4免疫原性

将毒种制成油乳剂灭活疫苗后(抗原含量≥10^7.5TCID₅₀/0.1ml)，颈部皮下或肌肉注射4～5周龄SPF鸡10只，每只0.3ml，另取10只不免疫，作为空白对照。免疫28天后，所有试验鸡采血，分离血清，测定琼扩抗体。免疫鸡应至少有9只琼扩抗体为阳性，对照鸡均应为阴性。接种后28日，连同对照鸡10只，各肌肉注射稀释禽腺病毒 ZMXZAV-4株(F4～F8代)0.2ml(≥10^6.0TCID₅₀)，攻毒后观察14日，攻毒对照组10只鸡应至少8只发病，免疫组应保护至少8只。

2.3.5纯净性

2.3.6基础种子代数

2～3代。

2.3.7毒株保存

-20℃以下保存，保存期暂定为24个月。

2.4鸡新城疫病毒北京株(CVCC AV1611株)应符合下列标准

2.4.1对鸡最小致死量用2～8月龄SPF鸡4只，各肌肉注射10^-7或10^-8稀释度的病毒液1ml，14日内应全部死于新城疫。

2.4.2对鸡胚半数致死量将毒种作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、 10^-8 3个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，记录接种后24～72小时死亡且胎儿病痕明显的鸡胚，计算ELD₅₀，每 0.1ml病毒含量应≥10^7.0ELD₅₀。

2.4.3纯净性按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

2.4.4毒种保存在-70℃以下保存，有效期为72个月。

2.5鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株(CVCC AV7株)应符合下列标准。

2.5.1对鸡的感染量

将种毒作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 4个稀释度，分别点眼接种28～42日龄SPF鸡，0.1ml/只。攻毒后每天观察鸡只的临床表现及死亡情况，记录发病和死亡鸡数，剖检观察死亡鸡法氏囊等病变，至96小时扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变，以法氏囊肿大、萎缩、发炎、有分泌物等任一项临床表现，判为感染。最小感染量(BID)应≥10^4.0/0.1ml。

2.5.2特异性

将毒种用灭菌生理盐水稀释至10^5.0ELD₅₀/0.1ml，与等量抗鸡传染性法氏囊病特异性血清混合，置室温中和1小时，以绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚10个，每胚接种0.2ml；同时设病毒对照 10个，每胚接种病毒液0.1ml(含10^5.0ELD₅₀/0.1ml)，同条件观察168 小时。在24～168小时内中和组鸡胚应全部健活，对照组鸡胚至少死亡9个，鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验(HA)应均为阴性。

2.5.3纯净检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

2.5.4保存

在-20℃以下保存，有效期为24个月。在-70℃以下保存，有效期为60个月。

实施例3鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗生产用毒种的制备

1、鸡新城疫病毒La Sota株毒种制备

将毒种用灭菌生理盐水或PBS作适当稀释(如10^-4或10^-5)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1:512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于无菌瓶中，注明收获日期、毒种代次及装量，冷冻保存。

2、传染性法氏囊病病毒LY23株毒种制备

挑选长势良好的DF1细胞，弃掉原细胞培养液，加入含有1％毒种的细胞维持液，置37℃培养，当细胞病变达80％以上时收获细胞毒，冻融3次，3000rpm离心10分钟去除细胞碎片，取上清液定量分装于无菌瓶中，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次及装量，冷冻保存。

3、禽腺病毒ZMXZAV-4株毒种制备

挑选长势良好的LMH细胞，弃掉原细胞培养液，将禽腺病毒 ZMXZAV-4株毒种用DMEM进行适当稀释(如10^-3或10^-4)后接种至 LMH细胞，37℃吸附2h后，加入2％血清浓度的DMEM作维持液，置 37℃培养，当细胞病变达80％以上时收获细胞毒，冻融3次，3000rpm 离心10分钟去除细胞碎片，取上清液定量分装于无菌瓶中，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次及装量，冷冻保存。

实施例4鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗制苗用抗原的生产

1、制苗材料的选择

1.1新城疫病毒制苗材选取发育良好的10～11日龄SPF鸡胚。

1.2传染性法氏囊病病毒制苗材料DF1细胞。

1.3I群4型禽腺病毒制苗材料LMH细胞。

2、疫苗抗原的制备

2.1鸡新城疫病毒抗原液的制备。

2.1.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

2.1.2孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至 96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24 小时。

2.1.3收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1:256(微量法)者应弃去。同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

2.1.4浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩3倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1︰768(微量法)时停止浓缩，按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

2.1.5灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。37℃灭活16小时后取出，留样，进行半成品检验，其余病毒液放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.2传染性法氏囊病病毒抗原液的制备。

2.2.1DF1细胞复苏及培养培养

从液氮罐中取出冻存管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml 培养液的离心管中，1000r/min离心5分钟。用含新生牛血清的培养液悬浮细胞，置37℃、5％CO₂培养箱培养，当长成良好单层时用胰酶 -EDTA消化细胞。将扩大培养的细胞接种到细胞工厂中，37℃培养。

2.2.2接毒

挑选长势良好的DF1细胞，弃掉原细胞培养液，加入含有1％毒种的细胞维持液，置37℃培养。

2.2.3观察与收获

接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，当细胞病变达80％以上时收获细胞毒，冻融3次，3000r/min离心10分钟去除细胞碎片，上清液放于灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥10^7.0TCID₅₀/0.1ml。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。收获的病毒液灭活前在-15℃保存，应不超过30日。

2.2.4浓缩

将收获的病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩 3倍，同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的病毒液随即进行灭活。

2.2.5灭活

将传染性法氏囊病病毒抗原液导入灭活罐内，加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。37℃灭活16小时后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.3禽腺病毒ZMXZAV-4株抗原液的制备。

2.3.1LMH细胞复苏及培养培养

2.3.2接毒

挑选长势良好的LMH细胞，弃掉原细胞培养液，将禽腺病毒 ZMXZAV-4株毒种用DMEM进行适当稀释(如10^-3或10^-4)后接种至 LMH细胞，37℃吸附2h后，加入2％血清浓度的DMEM作维持液，置 37℃培养。

2.3.3观察与收获

接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，当细胞病变达85％以上时收获细胞毒，冻融3次，3000r/min离心10分钟去除细胞碎片，上清液放于灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥10^7.5TCID₅₀/0.1ml。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。收获的病毒液灭活前在-15℃保存，应不超过30日。

2.3.4浓缩

2.3.5灭活

将禽腺病毒ZMXZAV-4株抗原液导入灭活罐内，加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。37℃灭活16小时后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

3、半成品检验。

3.1鸡新城疫病毒部分

3.1.1无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

3.1.2灭活检验取10日龄SPF鸡胚6枚，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1个。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

3.1.3红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按现行《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1:2048(微量法)者，方可用于制苗。

3.1.4病毒含量测定

将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、 10^-9 3个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚 0.1m1，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128(微量法)者，判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.5EID₅₀的胚液，方可用于制苗。

3.2传染性法氏囊病病毒部分

3.2.1无菌检验

取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

3.2.2灭活检验

将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种长势良好的DF1(24孔细胞板)5孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种的DF1细胞作空白对照，37℃、5％CO₂培养箱培养，观察120小时。细胞对照孔及样品孔均应不出现细胞病变。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时，样品孔仍不出现细胞病变时，判定为灭活完全。

3.2.3病毒含量测定

取灭活前的病毒液进行测定，每0.1ml病毒含量应≥10^7.5TCID₅₀。

3.3禽腺病毒部分

3.3.1无菌检验

3.3.2灭活检验

将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种长势良好的LMH细胞(24 孔细胞板)5孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种的 LMH细胞作空白对照，37℃、5％CO₂培养箱培养，观察120小时。细胞对照孔及样品孔均应不出现细胞病变。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时，样品孔仍不出现细胞病变时，判定为灭活完全。

3.2.3病毒含量测定

取灭活前的病毒液进行测定，每0.1ml病毒含量应≥10^8.0TCID₅₀。

实施例5鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗的制备

1、油相制备

取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

2、水相制备

将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性法氏囊病病毒液、禽腺病毒病毒液按适当比例混合(1:1:1)。使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，传染性法氏囊病病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀，禽腺病毒病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

3、乳化

4、分装

定量分装，加盖密封。

实施例6鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗的安全性试验

疫苗的安全性试验包括一次单剂量接种安全试验、单剂量重复接种安全试验、一次超剂量接种安全试验。

1、单剂量接种安全性试验

7日龄SPF鸡25只，分成3组，1、2组每组10只，第1组颈背部皮下注射本三联灭活疫苗，每只0.3ml；第2组肌肉注射本三联灭活疫苗，每只0.3ml；第3组为非免疫对照组，5只鸡。注射后观察21日。结果免疫鸡只未出现任何不良反应，精神，采食量正常，表明该疫苗是安全的。

表3SPF鸡单剂量安全性试验结果

2、超剂量接种的安全性试验

用7日龄SPF鸡15只将其分为2组，第1组10只用于免疫，其中颈背侧皮下注射0.3ml，胸部肌肉注射0.3ml(每只共注射0.6ml)，注射后观察21日。第2组5只，为健康对照。结果免疫鸡只未出现任何不良反应，精神，采食量正常，表明该疫苗是安全的。

表4SPF鸡单剂量安全性试验结果

单剂量重复接种的安全性试验

7日龄SPF鸡45只，分成5组，1～4组每组10只，第1组胸部肌肉注射0.3ml疫苗，接种后14天，再次以同样剂量重复接种；第2组颈背部皮下注射0.3ml疫苗，接种后14天，再次以同样剂量重复接种；第3组颈背部皮下注射0.3ml疫苗，接种后14天，胸部肌肉注射0.3ml疫苗；第4组胸部肌肉注射0.3ml疫苗，接种后14天，颈背部皮下注射0.3ml 疫苗；第5组5只，为健康对照。第二次接种后21天内观察鸡群状况，接种后21天时剖杀鸡只，观察局部反应。结果免疫鸡只未出现任何不良反应，精神，采食量正常，表明该疫苗是安全的。

表5单剂量重复接种安全性试验

上述安全性试验结果可知，SPF鸡只免疫本三联灭活疫苗未出现任何不良反应，精神，采食量正常，表明该疫苗是安全的。实施例7鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗的效力试验

1、新城疫部分效检

将15只3周龄的SPF鸡分成2组，第1组10只鸡，为免疫组，用疫苗免疫，每只胸部肌注疫苗20μl；第2组为对照组，5只鸡，不作任何处理。免疫后21天所有鸡只采血测ND HI抗体，采血完后用NDV强毒北京株肌肉注射攻击，每只10⁵ELD₅₀，攻毒后观察14天，记录发病死亡及保护鸡数。免疫21天后，免疫组ND HI抗体效价的几何平均值大于4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值0.8log2，免疫组攻毒结果10/10保护，符合要求，试验结果请见表6。

表6三联苗ND部分效力试验结果

2、传染性法氏囊病部分效检将35只20～30日龄的SPF鸡分成3 组，第1、2组10只鸡，为免疫组，用疫苗免疫，每只胸部肌注疫苗0.3ml；第3组为对照组，15只鸡，不作任何处理。免疫后21天所有鸡只采血测琼扩抗体。采血完后第1组10只免疫鸡连同5只非免疫对照鸡各点眼接种传染性法氏囊病病毒BC6/85株(CVCC AV7)(≥10MID)，接种后96h剖杀，检查法氏囊病变。第2组10只免疫鸡连同10只非免疫对照鸡各点眼接种传染性法氏囊病病毒LY23株0.1ml(≥10^2.0ELD₅₀)。攻毒后观察14日。疫苗免疫后28天，传染性法氏囊血清琼扩抗体均9/10 不低于18，达到血清学效力检验标准；BC6/85株强毒攻毒后，免疫组10/10被保护，对照组5/5感染；LY23株超强毒攻毒后，免疫组9/10 被保护，对照组10/10死亡；均达到攻毒保护效力检验标准。

表7疫苗免疫后21天血清琼扩抗体水平及攻毒结果

3、禽腺病毒部分效检

将20只7～10日龄的SPF鸡分成2组，每组10只鸡，第1组为免疫组，用疫苗免疫，每只胸部肌注疫苗0.3ml；第2组为对照组，10只鸡，不作任何处理。免疫后21天所有鸡只采血测琼扩抗体。采血完后第1组 10只免疫鸡连同对照组10只鸡各肌肉注射禽腺病毒ZMXZAV-4株 0.2ml(≥10^6.0TCID₅₀)，攻毒后观察14日。疫苗免疫后21天，免疫组禽腺病毒(ZMXZAV-4株)血清琼扩抗体10/10阳性；禽腺病毒ZMXZAV-4 株攻毒后，免疫组10/10保护，对照组10/10发病，达到攻毒保护效力检验标准。

表8疫苗免疫后21天血清琼扩抗体水平及攻毒结果

以上结果表明，制备的鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗安全、有效。

而且，本发明的鸡新城疫、传染性法氏囊病、禽腺病毒三联灭活苗中鸡新城疫和传染性法氏囊病部分不低于现有标准要求；禽腺病毒 (I群4型)部分因为无该类产品及相关标准问世，无法进行产品比较，但该疫苗禽腺病毒(I群4型)毒株来自分离的流行性强毒株，且经过纯化，细胞适应性强，免疫原性强，具有良好的保护性，可用于预防同源病毒导致的疫病。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一株I群4型禽腺病毒毒株ZMXZAV-4株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.14296。

2.由权利要求1所述毒株或由其重组毒株制备的生物制品。

3.权利要求1所述的I群4型禽腺病毒毒株ZMXZAV-4株在制备预防鸡心包积液－肝炎综合征的药物上的应用。

4.一种鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原来自灭活的鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和权利要求1所述的I群4型禽腺病毒毒株ZMXZAV-4株。

5.根据权利要求4所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述鸡新城疫病毒为鸡新城疫病毒La Sota株；所述鸡传染性法氏囊病病毒为鸡传染性法氏囊病病毒 LY23株，保藏编号为CGMCC No.11594。

6.根据权利要求5所述的三联灭活疫苗，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

1）油相制备：

取注射用白油 94份和司本-80 6份混合后，加入2%硬脂酸铝，高压灭菌后备用；

2）水相制备：

将鸡新城疫病毒La Sota株接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚液；鸡传染性法氏囊病病毒IBDV-LY23株接种DF1细胞，收获细胞病变后的细胞培养液；禽腺病毒ZMXZAV-4 株接种LMH细胞，收获细胞病变后的病毒液；

所述收获的病毒液浓缩至原体积的1/3，分别加入10%甲醛溶液，使其终浓度为0.1%~0.2%，边加边充分摇匀，置37℃充分灭活；

将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性法氏囊病病毒液、禽腺病毒病毒液按1:1:1的比例混合，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，传染性法氏囊病病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀，禽腺病毒病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀，得到混合抗原液；

取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20~30分钟，使吐温-80完全溶解；

3）乳化：

取2份油相，1份水相，放入乳化罐中，4000r/min搅拌30~40分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%，即得。