CN102766603A

CN102766603A - 一种鸡新城疫株病毒及其分离方法

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Publication number: CN102766603A
Application number: CN2012101260168A
Authority: CN
Inventors: 秦卓明; 徐怀英; 王友令
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2032-04-26
Also published as: CN102766603B

Abstract

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一种鸡新城疫株病毒及其分离方法，代号为SDM01株并提供了其分离制备方法，发明人对该毒株进行了生物保藏，保藏编号CCTCC NO：V201109；通过SPF鸡胚传代，进行了生物学特性试验如血凝性、血清中和试验、动物回归试验和外源病毒检查，试验结果证实该病毒为新城疫病毒。通过鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定，证实该新城疫病毒为强毒力毒株。通过对分离毒株及标准毒株制备阳性血清，进行HI交叉中和试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、F和HN基因序列测序比较及免疫攻毒保护试验，结果证实新城疫SDM01株与传统的疫苗毒株（La Sota株及Clone30株）在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异。

Description

一种鸡新城疫株病毒及其分离方法

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，具体提供了一种新的鸡新城疫病毒，并且提供了该病毒的分离方法及其应用。

背景技术

鸡新城疫(NewCastledisease)，由副粘病毒引起的高度接触性传染病。又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。常呈急性败血鸡新城疫鸡新城疫症状。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。死亡率高，对养鸡业为害严重。有强毒株和弱毒株两类。病毒分为低毒力型(即缓发型)、中等毒力型(即中发型)、强毒力型(即速发型)3型，现在普遍采用疫苗接种的形式来预防该类传染病，目前，我国最常用的疫苗有鸡新城疫I、II、L(Lasota)系活疫苗和油乳灭活疫苗，可以防治一般性的新城疫病毒感染，但是由于病毒的多样性，往往新变异病毒的出现会导致疫情的大面积发生，给禽类养殖带来沉重的打击。

山东某父母代肉种鸡场：发病周龄为31周，正处于产蛋高峰期，产蛋率为80％左右，临床上突然出现轻微的呼吸道症状，首先在一栋鸡舍发生产蛋下降，8天后产蛋率从80％下降到24％，采食时间明显延长，10-14天后产蛋开始缓慢回升。此后，相邻的几栋鸡舍相继发病。剖检可见喉头粘液增多，喉头、气管出血严重，心、肝、脾、肺正常；个别肾肿；卵巢以及卵泡病变不明显；肠道有点状出血。取发病前后的鸡血清进行抗体检测，同时取发病鸡的脑、输卵管和气管进行病原分离。未发病前：ND的平均抗体水平为2^8.5，高低相差5；发病初期H₉的平均抗体水平为2^8.7，高低相差4；发病10天后：发病栏ND抗体飙升至2¹²以上，发病栏中的6个抽检样品中：2个2¹⁵，2个2¹⁷，1个2¹⁸，1个2¹³。而在整个发病前后，该鸡群的H₉抗体水平无明显变化，据此可断定：该鸡场为NDV强毒感染；同时自2001年3月底至5月份，该公司不同种鸡场(相隔20公里以上)饲养的三批种鸡均连续在产蛋高峰期发病，症状一致类似的病例在天津、北京、河南、江苏、河北、山东省不同地区如东营、济宁、临沂、德州、济南、枣庄等发生。

可见该致病性毒株与传统的疫苗毒株(La Sota株及Clone30株)在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异，使得传统疫苗株已不能产生有效的保护，为了能够更好的认知该毒株及其致病性，必须对其进行进一步的分离及研究。

发明内容

本发明的发明人从上述的发病鸡群中分离到一株病毒，代号为SDM01株并提供了其分离制备方法，发明人对该毒株进行了生物保藏，保藏编号CCTCC NO：V201109；通过SPF鸡胚传代，进行了生物学特性试验如血凝性、血清中和试验、动物回归试验和外源病毒检查，试验结果证实该病毒为新城疫病毒。通过鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定，证实该新城疫病毒为强毒力毒株。通过对分离毒株及标准毒株制备阳性血清，进行HI交叉中和试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、F和HN基因序列测序比较及免疫攻毒保护试验，结果证实新城疫SDM01株与传统的疫苗毒株(La Sota株及Clone30株)在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异，SDM01株对目前流行株具有较好的保护效果，是较佳的候选疫苗毒株。

发明人对该病毒毒株进行了生物保藏，于2011年3月保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V201109。

在本发明中，发明人对该病毒毒株进行了进一步的研究，发现其具有如下的特征：

(1)发病鸡除呼吸道症状外，大部分鸡均有腺胃出血、十二指肠出血、泄殖腔出血、气管出血或粘液增多等病变，用10日龄SPF鸡胚接种病毒，可见24-72小时死亡的鸡胚均有充血或出血，肝脏有坏死和出血点；

(2)病毒分离物对1％鸡红细胞产生凝集；

(3)SPF鸡回归试验可出现呼吸道症状、腺胃出血、肠道枣核样出血、盲肠扁桃体出血及泄殖腔出血等新城疫典型病变；

(4)外源病毒检查发现，病毒分离物免疫SPF鸡的血清只呈现ND抗体呈阳性反应，而其它鸡十八种疾病均为抗体阴性反应；

(5)SDM01株病毒的F和HN基因均扩增出目的片段。经双向测序、拼接和校正后，F基因开放阅读框架(ORF)全长1,662bp，编码553个氨基酸，基因序列如Seq ID No：1所示，其所编码的氨基酸序列如Seq ID No：3所示；HN基因ORF全长1,716bp，编码571个氨基酸，基因序列如Seq ID No：2所示，其所编码的氨基酸序列如Seq ID No：4所示。

发明人还提供了该病毒的分离鉴定方法如下：

病毒的分离培养

无菌采集发病鸡的气管、脑、输卵管和肝脏，称重后分别按1∶3加入灭菌生理盐水，匀浆后经超声波处理，以3000r/min离心15min，取上清加青(链)霉素双抗至2000IU/ml，置4℃冰箱过夜，无菌检验合格后，分别接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml。弃去24小时内死亡的鸡胚，此后每6-8小时照蛋1次，及时将死亡鸡胚取出，置2-8℃冷藏，至96小时取出所有鸡胚，无菌收取鸡胚尿囊液，留样检测后将含有病毒的鸡胚尿囊液置-70℃保存备用。

为了对该病毒进行准确的鉴定，发明人进行了如下的鉴定试验方式：

1.红细胞凝集试验(HA)

病毒分离物对1％鸡红细胞发生凝集反应，HA为2⁹，即病毒的凝集效价为2⁹。

2.红细胞凝集抑制试验(HI)

病毒分离物与特异性新城疫、禽流感H9和AIV H5亚型、减蛋综合症(EDS)等病毒单因子阳性血清进行HI交叉抑制试验，进行初步鉴别诊断。结果病毒分离物只与新城疫特异性阳性血清出现阳性反应，证实该病毒分离物应为新城疫病毒。

3.动物回归试验

取40日龄SPF鸡10只，用点眼、滴鼻途径，每只鸡接种SDM01株鸡胚尿囊液0.2ml，观察14天。被接种的10只SPF鸡，在48小时左右开始出现呼吸道症状，96小时内全部死亡，剖检出现典型的新城疫症状：气管出血、十二指肠、泄殖腔粘膜、盲肠扁桃体等出血。

4.外源病毒检查

4周龄SPF鸡10只，用SDM01株制备灭活疫苗免疫，免疫1周和2周后加强免疫1次，同时设相同日龄SPF鸡对照5只，最后1次免疫3周采血。进行有关疫病的血清抗体检验，检验项目有传染性法氏囊病(IBD)、禽腺病毒I型(Adeno)、减蛋综合征(EDS)、禽脑脊髓炎(AE)、禽流感(AI)H9亚型、禽流感(AI)H5亚型、禽呼肠孤(REO)、鸡痘(FP)、传染性喉气管炎(ILT)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽白血病(AL)、鸡马立克氏病(MD)、鸡新城疫(ND)、网状内皮增生症(RE)。结果免疫鸡只新城疫抗体阳性，其它均为阴性，证实病毒分离物中只含有新城疫病毒。

5.生物学毒力检测

按照OIE方法，利用蚀斑纯化后的病毒分别进行鸡胚最小致死量(MDT)、1日龄雏鸡脑内致死指数(ICPI)和6周龄静脉接种指数(IVPI)检测，结果：MDT为50.5小时，ICPI和IVPI分别为1.76和2.41，表明为分离到的SDM01株为强毒。

6.F和HN基因测序

SDM01株的F和HN基因均扩增出目的片段。经双向测序、拼接和校正后F基因开放阅读框架(ORF)全长1,662bp，编码553个氨基酸，基因序列如Seq ID No：1所示；HN基因ORF全长1,716bp，编码571个氨基酸，基因序列如Seq ID No：2所示。

按照传统方法进行F基因分型，SDM01为基因VII型，而LaSota为基因II型。

综合上述鉴定结果，发明人可以确定该新毒株为一株新城疫病毒的强毒株。

发明人进一步的将该毒株与其它新城疫分离株抗原性比较、鸡胚中和交叉抗原同源性比较以及细胞交叉中和的抗原同源性比较，发现由其他新城疫分离株获得的传统疫苗对目前流行株的交叉保护能力较弱，相比之下，SDM01对多数分离株具有较高的交叉保护能力。

发明人还进行了现在常用的LaSota免疫对本发明所述的流行株SDM01进行了攻毒保护效果研究，结果发现传统的疫苗毒对SDM01存在着抗原性方面的差异，不能提供有效的保护。因此必须提供新的疫苗株。

综上所述，本发明提供的鸡新城疫病毒(NDV)SDM01毒株通过SPF鸡胚传代，进行了生物学特性试验如血凝性、血清中和试验、动物回归试验和外源病毒检查，试验结果证实该病毒为新城疫病毒。通过鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定，证实该新城疫病毒为强毒力毒株。通过对分离毒株及标准毒株制备阳性血清，进行HI交叉中和试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、F和HN基因序列测序比较及免疫攻毒保护试验，结果证实新城疫SDM01株与传统的疫苗毒株(La Sota株及Clone30株)在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异。

发明人对本发明所公开的鸡新城疫病毒(NDV)毒株SDM01进行了生物保藏，具体保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2011年3月31日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC

保藏编号：CCTCC NO：V201109

保藏单位地址：武汉大学

分类命名：副粘病毒科SDM01病毒

具体实施方式

实施例1病毒的分离培养：

无菌采集发病鸡的气管、脑、输卵管和肝脏，称重后分别按1∶3的重量比加入灭菌生理盐水，匀浆后经超声波处理，以3000r/min离心15min，取上清加青(链)霉素双抗至2000IU/ml，置4℃冰箱过夜，无菌检验合格后，分别接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml。弃去24小时内死亡的鸡胚，此后每6-8小时照蛋1次，及时将死亡鸡胚取出，置2-8℃冷藏，至96小时取出所有鸡胚，无菌收取鸡胚尿囊液，留样检测后病毒分离物即可置-70℃保存备用。

实施例2病毒的鉴定：

1.红细胞凝集试验(HA)

2.红细胞凝集抑制试验(HI)

病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即红细胞凝集抑制试验(HI)，具有特异性。病毒分离物与特异性新城疫、禽流感H9和AIV H5亚型、减蛋综合症(EDS)等病毒单因子阳性血清进行HI交叉抑制试验，进行初步鉴别诊断。具体方法：根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液；在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加25微升生理盐水；第1孔加相应血清25微升，吹吸混合均匀，吸25微升至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃25微升；第12孔加新城疫阳性血清25微升，作为血清对照；自第1孔至12孔各加25微升4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min；自第1孔至12孔各加1％鸡红细胞悬液25微升，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果。待病毒对照孔(第11孔)出现红细胞100％凝集(++++)，而血清对照孔(第12孔)为完全不凝集(-)时，即可进行结果观察。以100％抑制凝集(完全不凝集)的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。

结果病毒分离物只与新城疫特异性阳性血清出现阳性反应，证实该病毒分离物应为新城疫病毒。

3.3.动物回归试验

4.外源病毒检查

5.生物学毒力检测

按照OIE方法，利用细胞蚀斑纯化后的病毒分别进行鸡胚最小致死量(MDT)、1日龄雏鸡脑内致死指数(ICPI)和6周龄静脉接种指数(IVPI)检测，这是评价NDV毒力致病性的3个指标：MDT一般小于60小时的为速发型，在60～90小时为中发型，大于90小时的为缓发型；ICPI一般大于1.6为速发型，1.2～1.6为中发型，小于1.2为缓发型；IVPI一般2.0以上为速发型，2.0以下为速发型或缓发型。

本病毒检测结果：MDT为50.5小时，ICPI和IVPI分别为1.76和2.41，表明为分离到的SDM01株为强毒。

6.F和HN基因测序及鉴定

实施例3 SDM01株与其它新城疫分离株抗原性比较

1.HI同源性比较

单因子阳性血清制备，按照国家SPF鸡微生物监测方法，将制备的20株NDV抗原和阳性血清分别进行交叉HI实验，取5次检测值的平均。同时设：SPF鸡阴性血清、新城疫阳性血清对照和病毒对照。HI抗原同源性的计算按免疫学方法进行：

r1＝异源血清效价1/同源血清效价1，r2＝异源血清效价2/同源血清效价2，结果如表1。

La Sota与Clone30和F48E9的抗原同源性最高，分别为0.97和0.98，与17个分离株的抗原同源性为0.70～0.97，大多数介于0.85～0.90。其中，23.5％的NDV野毒与F48E9和La Sota间的同源性在0.9以上，但52.9％的NDV野毒与La Sota和F48E9的同源性已降至0.70～0.85，而且，即使同属于基因VII型的不同毒株间抗原的同源性也变化在0.79-1.0间。

表1.NDV不同毒株间HI同源性

2.鸡胚中和交叉抗原同源性比较

分别测定NDV毒株鸡胚半数感染量(EID₅₀)，采用固定病毒稀释血清法，能使半数鸡胚保护的最高血清稀释度即为该血清的中和效价，HI抗原同源性的计算按免疫学方法进行：

r₁＝异源血清效价₁/同源血清效价₁，r₂＝异源血清效价₂/同源血清效价₂，

传统的La Sota、Clone30和传统的F₄₈E₉强毒之间相关程度较高(大于0.6)，显示出较高的交叉保护能力，而与分离株相关程度不一，普偏低于0.5。其中，La Sota对F₄₈E₉的中和同源性在0.77，15％的NDV强毒与F₄₈E₉和La Sota间的同源性在0.5以上，85％的NDV强毒与La Sota和F₄₈E₉的同源性已降至0.15～0.5。

表2NDV不同毒株间鸡胚中和交叉抗原同源性

3.细胞交叉中和的抗原同源性比较

表3细胞交叉中和的抗原同源性

上表结果表明：La Sota、Clone30和传统的F₄₈E₉强毒之间相关程度较高，而NDV分离株之间，有的相关程度较高，有的较低，反应出NDV的复杂性，但普遍与传统的疫苗株La Sota、Clone30有一定的差异。其中，F₄₈E₉与La Sota之间中和同源性在0.63，34％的NDV强毒与F₄₈E₉和La Sota间的同源性在0.5以上，但66％的NDV强毒与La Sota和F₄₈E₉的同源性已降至0.17～0.46，说明传统疫苗株对2/3的流行株的中和能力较低，已不能对流行株产生有效保护。4.LaSota免疫对流行株的攻毒保护效果研究

用LaSota活疫苗免疫3周鸡群21日后，分别用5个流行株NDV及F48E9进行肌肉途径攻毒，观察14日。所有攻NDV分离株强毒和经典强毒F48E9未免疫SPF鸡全部发病，96h内死亡率均为100％，剖检为新城疫典型病变；疫苗对3组流行毒和经典强毒F48E9产生了较好的保护，说明传统的LaSota活疫苗对流行的强毒仍具有较好的交叉保护。但是，有2组免疫鸡发病。其中，C组攻SKY03毒的免疫鸡在120小时死亡1只，另有3只精神差，A组SDM01攻毒在168～216小时有5只出现发病症状。这说明传统的疫苗毒对SDM01、SKY03可能存在着抗原性方面的差异，不能提供有效的保护。

表4流行株攻毒后鸡群发病情况

注：*分子表示发病鸡数量，分母表示实验鸡数。

5.LaSota和SDM01株与其它NDV分离毒株F基因同源率比较

从Genebank下载经典NDV毒株的F基因序列，对分离毒株进行F基因克隆测序，推导氨基酸全长，进行同源率比较，结果见表4。NDV相同基因型的毒株氨基酸同源率相对较高。比较发现：LaSota、SBZ02、QE01、JS05、SQZ04、SY03和Taxas48等基因二型之间高度同源，氨基酸同源率为93.1％～99.6％；SDD01、JS01、JS02、SCL03、SPY03、Taiwan95、SDM01和SKY03等基因VII型的同源率为95.5％-98.7％；F48E9、JS06、SBD02、TJ03、JS701等基因IX之间的同源率为：98.7％～99.6％。

不同的基因型分离株氨基酸同源率相差较大，LaSota与基因VII型分离毒间同源率为88.1％-89.2％，远低于SDM01株与基因VII型分离毒间同源率95.7％-98.7％。

表5不同基因型代表毒株的F基因氨基酸全长与LaSota和SDM01的同源率

实施例4疫苗的制备方法

将SDM01株用灭菌生理盐水1000倍稀释后，经尿囊腔途径接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃培养，弃去24h内死亡的鸡胚，及时照蛋随时将死亡的鸡胚取出冷藏，收获72小时内死亡及获鸡胚尿囊液，加入鸡胚尿囊液总体积0.1％的甲醛，充分摇匀后于37℃灭活16h，然后按水相体积的4～6％加入吐温-80，按水与油相1∶3的比例加入兽用注射白油中，胶体磨高速乳化5～7min，乳化结束前加入终浓度为0.001％的硫柳汞即可。

序列表

Claims

1.一种鸡新城疫病毒株SDM01，其保藏编号为：CCTCC NO：V201109。

2.如权利要求1所述的鸡新城疫病毒株SDM01，其特征在于：其分离制备方法如下：

3.如权利要求1所述的鸡新城疫病毒株SDM01，其在作为疫苗株的应用。