CN101948812A - 嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒疫苗株，尤其涉及一种嗜肾型传染性支气管炎病毒强毒疫苗株及其应用，属于生物技术领域。所述嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3957，其纤突蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的基因序列。本发明提供一种疫苗组合物，包含所述嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株和药学上可接受的佐剂或载体。本发明提供的嗜肾型传染性支气管炎病毒强毒疫苗株，对目前流行的嗜肾型IBV有很好的免疫原性。DS10病毒制成的疫苗，不仅能有效抵抗自身毒株的攻毒，还能有效保护呼吸型疫苗株的攻击，因此，能够有效的防治鸡传染性支气管病毒。

Description

嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及一种嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒疫苗株，尤其涉及一种嗜肾型传染性支气管炎病毒强毒疫苗株及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)是传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，简称IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。按病毒感染后出现的致病症状，即致病型，可以分为嗜肾型、呼吸型等。嗜肾型传染性支气管炎以肾脏病变为主，还出现泌尿生殖系统病症，伴有呼吸道症状，表现为肾脏苍白肿大、肾小管和输尿管扩张充满尿酸盐、排出白色稀粪等。对各种日龄、性别的鸡均易感染，但主要侵害1～4周龄雏鸡，幼雏鸡感染本病后常引起输卵管永久性退化，因呼吸道或肾脏病变而引起的死亡率高达40％～90％。成年肉鸡感染IBV后，通常会引起饲料报酬降低，死淘率上升，蛋鸡感染后，产蛋下降，且耐过后产蛋水平无法恢复到感染前的水平，相对而言，因该病而使鸡的产肉、产蛋率下降而致的效益损失比死亡损失更大。另外，由该病经常并发或继发大肠杆菌葡萄球菌、或霉形体感染，使死亡率大大增加，对养鸡产业造成严重危害。

有研究表明，在我国嗜肾型IBV至少存在16个不同血清型，且不断有新的血清型出现。我国的免疫鸡群和非免疫鸡群均易发生嗜肾型IBV的感染，原因是现有呼吸型疫苗株，如H120，M41株不能对嗜肾型IBV的攻击产生有效保护。

大部分学者认为，目前我国鸡传染性支气管炎的危害主要是嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)在鸡群中流行所致。由于保护型不一致，现有国产和进口的嗜肾型传染性支气管炎疫苗均为活疫苗，这些活疫苗的免疫效果均不太理想。国外疫苗毒株在遗传距离上与我国流行的嗜肾型IBV毒株相距较远。有研究表明，用我国不同嗜肾型传染性支气管炎活疫苗免疫鸡后，用流行的嗜肾型传染性支气管炎病毒进行攻毒，但均未能对目前流行的嗜肾型传染性支气管炎野毒株的攻击提供有效保护。因此，亟需研制一种能对现有流行的嗜肾型鸡传染性支气管炎提供有效保护的疫苗株。

发明内容

本发明针对当前嗜肾型IBV难以控制的问题，提供一种嗜肾型鸡传染性支气管炎毒株强毒灭活疫苗株，该毒株对目前流行的嗜肾型IBV有很好的免疫原性。

本发明提供的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3957。

该嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株的保藏信息如下：

生物材料(毒株)：Ck/Jiangsu/DS10/2008

分类命名：鸡传染性支气管炎病毒

拉丁文学名：Infectious Bronchitis Virus(IBV)

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2010年6月25日

保藏编号：CGMCC No.3957

所述疫苗株的纤突蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的基因序列。

本发明提供一种疫苗组合物，包含所述嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株和药学上可接受的佐剂或载体。

该疫苗组合物的制备方法为：将在SPF鸡胚上扩增的尿囊液经检测EID₅₀效价合格后经甲醛灭活，再与佐剂混匀，做成油乳剂灭活疫苗。

本发明还提供上述疫苗组合物在制备防治鸡传染性支气管病毒药物中的应用。

该疫苗组合物用于预防嗜肾型IBV，当某区域家禽存在嗜肾型IBV感染或受嗜肾型IBV感染的风险时，给予接种本疫苗组合物，可采用颈背部皮下注射或肌肉途径注射免疫。

本发明提供的嗜肾型传染性支气管炎病毒强毒疫苗株，对目前流行的嗜肾型IBV有很好的免疫原性。其疫苗组合物不仅能有效抵抗自身毒株的攻毒，还能有效保护M41病毒的攻击。而M41病毒制成的疫苗，不能有效抵抗嗜肾型传支DS10病毒的攻击。DS10病毒制成的疫苗，不仅能有效抵抗自身毒株的攻毒，还能有效保护呼吸型疫苗株的攻击，因此，能够有效的防治鸡传染性支气管病毒。

具体实施方式

本疫苗的实施方式仅用于举例说明本发明的目的，但不构成本疫苗在除鸡之外其他IBV易感禽类上使用的限制。

实施例1病毒的获得与特性测定

本实施例采用从我国江苏地区发病鸡群中分离得到的疑似嗜肾型鸡传染性支气管炎病料，经接种无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)鸡胚分离病毒，将该毒株在SPF鸡胚上经3次有限稀释法克隆纯化病毒，获得嗜肾型鸡传染性支气管炎强毒疫苗株，命名为Ck/Jiangsu/DS10/2008，简称DS10。将病毒DS10回归接种SPF鸡，对病毒的致病性和免疫原性进行评价。

具体方法：

(1)、病毒DS10扩增：将病毒DS10用无菌PBS缓冲液稀释10³倍后，经尿囊腔途径接种11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2mL/胚，37℃培养，在36～48h内收获鸡胚的尿囊液。

(2)、病毒血凝性鉴定：将步骤1获得的鸡胚尿囊液离心后浓缩100倍，再经魏氏梭菌菌液处理后，分别与1％(体积比)的鸡、兔、绵羊、豚鼠红细胞悬液作用，测定血凝(HA)效价。其HA效价均为“0”。结果表明该病毒无血凝性。

(3)、病毒的EID₅₀：将步骤1获得的鸡胚尿囊液用无菌PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，取稀释10⁶～10⁹倍的尿囊液，接种10～11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2ml/胚，置37℃培养，弃去24h内死亡的鸡胚，剖检观察24h后至168h内死亡的鸡胚和168h仍健活的鸡胚的胚体情况，按出现有侏儒，羽毛稀疏，囊膜增厚，明显肾脏尿酸盐或输尿管尿酸盐沉积症状之一，判为感染。检测结果为：尿囊液病毒含量为10^7.0EID₅₀/mL。

(4)、回归SPF鸡试验：将步骤1获得的鸡胚尿囊液用无菌PBS作10倍稀释后，取0.2mL(含毒量约为10^6.0EID₅₀)，以气管注入途径对10只42日龄SPF鸡进行攻毒，攻毒后观察14天后处死，剖检观察。14天观察期内出现至少3只鸡死亡，含死亡的鸡，至少有8只鸡有肾肿大和(或)输尿管尿酸盐沉积。结果表明病毒DS10对SPF鸡具有较强的致病性，尤其是对泌尿系统危害严重。

(5)、测定病毒纤突蛋白基因(S基因)序列，其序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2鸡胚中和保护试验

为了验证病毒DS10对呼吸型传染性支气管炎病毒的交叉保护性，对病毒DS10、病毒M41(呼吸型传染性支气管炎病毒)分别制备高免血清，将该高免血清稀释后分别与病毒DS10和病毒M41进行交叉保护试验。

(1)、制备病毒和血清：将病毒DS10和病毒M41(购自中国兽医药品监察所，简称“中监所”)分别用无菌PBS缓冲液稀释10³倍后，经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚。在接毒后36～48h内，将健活的鸡胚置2～8℃冰箱内冷冻6～8h，无菌收取病毒尿囊液，分装，置-70℃冰箱。其中，病毒EID₅₀效价大于等于10^7.0EID₅₀/mL的尿囊液作为病毒待用。病毒DS10的单因子高免血清，是用灭活后的病毒DS10经3次免疫SPF鸡制备。病毒M41的单因子高免血清购自中监所。

(2)、病毒中和的方法(固定病毒稀释血清法)：将病毒DS10和病毒M41分别用无菌PBS缓冲液稀释至4×10⁴EID₅₀/mL，作为后续高免血清的稀释液。将各病毒的高免血清分别稀释8倍、16倍和32倍，混匀后，室温下静置作用1h，或2～8℃作用2h。将上述不同稀释度的病毒高免血清各接种3枚9～11日龄SPF鸡胚，连续观察168h，弃去接种后48h内死亡鸡胚。另各取3枚胚分别接种含病毒M41和病毒DS10的稀释液(4×10⁴EID₅₀/mL)0.2mL作阳性对照，另留3枚胚不接毒，作空白对照。将48h后死亡鸡胚和168h后健活鸡胚置2～8℃冰箱内冷冻6～8h后，剖检鸡胚，观察是否有侏儒胚、尿囊膜增厚、肾脏尿酸盐沉积等现象，若每一稀释度的3枚接种胚中有1枚或1枚以上胚出现上述病理现象，记为该稀释度血清不能对相应病毒的攻击提供有效保护。

(3)、病毒中和试验结果(见表1)

表1病毒中和试验结果

注：表1中“名称”栏内各血清名称以代码表示，其命名方式为：第1字母代表高免血清，第2字母代表所接种的病毒，数字则表示血清的稀释倍数；如MD8，表示为：病毒M41的高免血清，接种的病毒为DS10病毒，血清稀释的倍数是8倍。但是，表1中的“M41”表示病毒M41。

(4)、结论：病毒DS10的高免血清做8倍稀释可有效保护效价为4×10⁴EID₅₀的病毒M41或病毒DS10攻毒，而病毒M41的高免血清做8倍稀释不能保护效价为4×10⁴EID₅₀的病毒DS10攻毒。即病毒DS10的高免血清能有效抵御病毒DS10或病毒M41的攻击，而病毒M41的高免血清仅能有效抵御病毒M41的攻击，不能有效抵御病毒DS10的攻击。

实施例3免疫原性试验

用病毒DS10或M41作为毒株分别制备油乳剂灭活疫苗，进行交叉攻毒保护试验。

(1)、病毒和疫苗制备：病毒尿囊液的制备见实施例1，尿囊液经检测EID₅₀效价大于等于10^7.0EID₅₀/mL后，经甲醛灭活，再与白油佐剂混匀，按常规方法分别制备病毒DS10和M41的油乳剂灭活疫苗。

(2)、SPF鸡：SPF鸡胚购自购自山东家禽所济南赛斯家禽科技有限公司，经自行孵化至出壳，饲养于隔离器内。

(3)、试验动物分组和免疫

14日龄SPF鸡经分组，经颈背部皮下免疫相应油乳剂灭活疫苗0.2mL。免疫前采血检测抗体效价，免疫以后每隔1周采血检测抗体效价，共采血4次，即在免疫后1W、2W、3W、4W采血。在第4次采血后攻毒，此时，鸡为42日龄。攻毒用病毒和剂量如下：分别用DS10和M41病毒尿囊液经10倍稀释后，经气管内注入途径攻毒，0.2mL/只，含病毒量为10^6.0EID₅₀。攻毒后观察14天，14日龄时扑杀，观察病变肾脏和气管等脏器病变。

(4)、结果描述(见表2)

①经病毒DS10的油乳剂灭活疫苗免疫的鸡，用DS10病毒或M41病毒攻毒，肾脏均无尿酸盐沉积或出现死亡；②用病毒M41的油乳剂免疫的鸡，用DS10攻毒后，有5只鸡死亡，死亡鸡有肾肿大或“花斑肾”，存活的5只鸡中的4只有肾肿大或输尿管尿酸盐沉积；③所有对照均成立。

表2油乳剂灭活疫苗交叉攻毒保护试验结果

(5)、结论：DS10病毒制成的疫苗，不仅能有效抵抗自身毒株的攻毒，还能有效保护M41病毒的攻击。而M41病毒制成的疫苗，不能有效抵抗嗜肾型传支DS10病毒的攻击。

Claims (4)

1.一种嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株，微生物保藏号是：CGMCCNo.3957。

2.根据权利要求1所述的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株，其特征在于所述疫苗株的纤突蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的基因序列。

3.一种疫苗组合物，其特征在于包含经甲醛灭活后的权利要求1或2所述疫苗株、药学上可接受的佐剂或载体。

4.一种权利要求3所述的疫苗组合物在制备防治鸡传染性支气管炎病毒药物中的应用。