CN103937753B - H9n2亚型禽流感病毒毒株及其灭活疫苗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株H9N2亚型禽流感病毒株及其灭活疫苗和应用，属于禽流感病毒毒株的分离和应用领域。本发明从疑似H9N2禽流感发病鸡群中分离得到一株低致病性的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株，其微生物保藏编号为：CGMCC？No.8853。本发明还公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，包括：培养病毒，获得病毒液上清；加入灭活剂，将病毒液上清灭活；混匀佐剂和病毒液上清，乳化，即得。免疫保护试验证明，本发明所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平。

Description

H9N2亚型禽流感病毒毒株及其灭活疫苗和应用

技术领域

本发明涉及禽流感病毒株，尤其涉及一株分离的H9N2亚型禽流感病毒（AvainInfluenzaVirus）J/ZY毒株及用该毒株制备的预防H9N2亚型禽流感病毒的灭活疫苗，属于禽流感病毒毒株的分离和应用领域。

背景技术

禽流行性感冒(简称禽流感，AvainInfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类(包括家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病，被世界动物卫生组织确立为A类传染病。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。

H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。虽然该H9N2亚型禽流感病毒(A1V)对禽群呈低致病力，主要临床表现仅为轻度呼吸道症状，但由于易与其他致病微生物发生协同作用，造成继发感染，从而引起了禽群的高发病率和致死率，对各国养禽业的危害也很大。更重要的是，该亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，也有机会在人类大流传，给人类健康带来了严重的威胁。

预防禽流感发生与传播的最有效手段是疫苗接种。目前，市售的禽流感疫苗绝大多数为鸡胚组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差异大、且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株；

本发明的目的之二是将所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株应用于预防H9N2亚型禽流感。

本发明的目的之三是提供一种制备预防H9N2亚型禽流感病毒的灭活疫苗的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明从中国吉林省某养鸡地区的疑似H9N2禽流感发病鸡群中分离得到一株低致病性的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株，本发明将分离的毒株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.8853；分类命名为：禽流感病毒。保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年3月7日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明从中国吉林省某养鸡地区的疑似H9N2禽流感发病鸡群中，无菌采取具有典型临床症状病鸡的肺脏和肝脏等组织剪碎，按1:5（W/V）比例加入灭菌生理盐水后，研钵研磨后，-40℃/室温冻融3次，3000r/min离心15min，取上清液。将上述病料上清液通过0.22μm微孔滤器除菌，尿囊腔接种10日龄非免疫鸡胚。每份病料接种8枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2mL，同时作不接种对照，37℃孵育。弃去24h内死胚，无菌收集48h的鸡胚尿囊液，-40℃保存备用病毒分离后需要在SPF鸡胚上进行3次终点有限稀释克隆纯化，即每一次均取最高稀释度有血凝价鸡胚尿囊液作为下一次传代纯化的种毒。如此经三次纯化后，以10^-3稀释度接种9-11日龄SPF胚，48h后收取鸡胚尿囊液，经菌检证明无污染后，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。本发明将分离的H9N2亚型禽流感病毒毒株采用RT-PCR鉴定，扩增得到753bp的目的基因片段，与预期结果相符。对分离的病毒所做分型鉴定结果为所分离的毒株为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/Jilin/J/ZY（缩写为J/ZY）。

本发明通过鸡胚半数感染量(EID50)、半数组织感染量(TCID50)和静脉接种指数(IVPI)试验检测分离的病毒J/ZY株的致病性，试验中对细胞毒和胚毒进行了同步试验，以比较不同培养方式繁殖的病毒液在毒力方面的差异。测定结果显示，细胞毒、胚毒EID50/0.1ml分别为10^6.9、10^6.3；细胞毒、胚毒TCID50/0.1ml分别为10^6.5、10^6.1；细胞毒、胚毒IVPI分别为0.8、0.9；细胞毒、胚毒HA分别为2¹⁰、2⁹。以上结果显示本发明所分离的病毒J/ZY株为低致病性禽流感病毒。

本发明将经MDCK细胞和SPF鸡胚扩增的两种病毒液分别制备成油乳剂灭活苗进行免疫保护试验，结果显示，用分离的病毒J/ZY株油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡，在免疫后1周鸡群就可检测到低水平的HI抗体，免疫后2周免疫组所有鸡群都产生明显的抗体，平均HI抗体水平达61og2，免疫后3周各试验组的HI抗体水平达到高峰，平均效价达71og2以上；实验结果表明本发明所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平。并且从抗体检测结果可以看出，在各个时间点细胞毒制备疫苗免疫组的抗体水平均要比胚毒制备疫苗免疫组高，抗体水平上升也较快。

因此，本发明提供一种防治禽流感的疫苗组合物，包括：预防或治疗上有效量的所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株以及药学上可接受的佐剂。

将本发明所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株分别经MDCK细胞和SPF鸡胚扩增，收集两种病毒液分别制备成油乳剂灭活苗，即获得禽流感细胞毒灭活疫苗和禽流感胚毒灭活疫苗。

本发明进一步提供了一种制备禽流感疫苗的方法，该方法包括以下步骤

（1）培养所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株，得到病毒液，离心取上清；

（2）向病毒液上清中加入灭活剂，将病毒液上清灭活；

（3）灭活后的病毒液上清与佐剂混合均匀，乳化，即得。

步骤（1）中将H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株接种病毒宿主细胞或SPF鸡胚得到扩增的病毒液；其中，所述的病毒宿主细胞优选为MDCK细胞。

步骤（1）中将收集的病毒液5000r/min离心30min，取上清。

步骤（2）中向病毒液上清中加入的灭活剂是福尔马林，加入福尔马林至其终浓度为病毒液上清总量的0.1%，于37℃灭活48小时。

步骤（3）中，所述的佐剂为油佐剂，其中，按体积比计，按体积比计，灭活后的病毒液上清和油佐剂的比例优选为1：1.5。

附图说明

图1为本发明所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株HA基因的RT-PCR扩增结果；M：DNAMarker；1：分离的病毒的鸡胚尿囊液；2：空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株的分离及鉴定

1、实验方法

1.1病毒的分离

2010年从中国吉林省某养鸡地区的疑似H9N2禽流感发病鸡群中，无菌采取具有典型临床症状病鸡的肺脏和肝脏等组织剪碎，按1:5（W/V）比例加入灭菌生理盐水后，研钵研磨后，-40℃/室温冻融3次，3000r/min离心15min，取上清液备用。

将上述病料上清液通过0.22μm微孔滤器除菌，尿囊腔接种10日龄非免疫鸡胚。每份病料接种8枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2mL，同时作不接种对照，37℃孵育。弃去24h内死胚，无菌收集48h的鸡胚尿囊液，-40℃保存备用。

病毒分离后需要在SPF鸡胚上进行3次终点有限稀释克隆纯化，即每一次均取最高稀释度有血凝价鸡胚尿囊液作为下一次传代纯化的种毒。如此经三次纯化后，以10^-3稀释度接种9-11日龄SPF胚，48h后收取鸡胚尿囊液，经菌检证明无污染后，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。

1.2所分离的病毒株的血清学鉴定

将无菌收集的鸡胚尿囊液以1.0%鸡红细胞悬液采用β微量法进行HA试验，以HA价≥3log2为试验阳性。对有直接血凝性的样本进行H9亚型AIVHI（血凝抑制试验）与NI（神经氨酸酶抑制试验）。

1.3所分离的病毒株的RT-PCR鉴定

根据GenBank已发表的H9N2毒株的HA基因序列，用Primer5.0软件设计一对H9N2HA基因的特异性引物，用于HA基因部分序列的扩增。预期扩增产物片段长度为753bp。引物序列如下：上游引物(18bp)：5′-AATGGTCCTACATCGTCG-3′；下游引物(18bp)：5′-TGGCTCCAAATAGTCCTC-3′，以上引物由上海生物工程有限公司合成。用H9N2AIVHA基因的特异性引物对分离病毒的鸡胚尿囊液进行RT-PCR扩增，另设空白对照。

2、实验结果

2.1病毒株的分离

病料经过4代鸡胚培养后，HA血凝价逐渐稳定，鸡胚死亡数开始增长，胚体病变逐渐明显。病毒经适当稀释后，接种SPF鸡胚尿囊腔，收集接种后48h鸡胚的尿囊液，经菌检证明无污染后，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。

2.2病毒株的血清学鉴定

取病毒分离为阳性的尿囊液，用ND、IB、IBD及EDS-76抗血清进行HI试验，不产生抑制现象,表明分离株并非上述病毒株，结果只能被H9AIV阳性血清所抑制。神经氨酸酶抑制试验检测，该病毒只能被N2亚型阳性血清特异性抑制，因此，鉴定结果为H9N2亚型禽流感病毒，并命名为A/Chicken/Jilin/J/ZY（缩写为J/ZY）。

2.3病毒株的RT-PCR鉴定

用H9N2AIVHA基因的特异性引物对分离的病毒的鸡胚尿囊液进行RT-PCR扩增，得到753bp的目的基因片段(图1)，与预期结果相符。

对分离的病毒所做分型鉴定结果为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/Jilin/J/ZY（缩写为J/ZY）。

实验例1分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY株的致病性测定

1、实验方法

1.1病毒J/ZY株在MDCK细胞中的增殖

将纯化的组织毒用灭菌生理盐水稀释后，接种90%长成单层后的MDCK细胞，37℃培养48～72h，细胞病变达75%以上，放入-70℃中反复冻融3次，收获病毒液。传代10次，直至病毒在MDCK细胞增殖良好。

1.2病毒EID₅₀测定

将分离的病毒用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释，设置10^-1～10^-99个稀释梯度，并设立空白对照组，每个稀释度接种5枚10日龄非免疫鸡胚，弃24h死亡胚，于接种后72h4℃过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液，测定其HA效价，并参考Reed-Muench方法计算出病毒EID₅₀。

根据EID₅₀结果，将病毒J/ZY株以l×10⁷EID₅₀剂量接种SPF鸡胚（0.lml/胚），35℃温箱孵育，详细记录鸡胚死亡情况，以评定分离的病毒J/ZY株对鸡胚的致病性。

1.3病毒TCID₅₀测定

将状态良好的MDCK细胞以2～3×10⁵个/孔接种96孔细胞培养板，置37℃，6%CO₂培养箱培养12～24h。弃去培养基，用无菌PBS洗涤已培养成单层的MDCK细胞3遍，以去除培养基中的血清成分，避免血清对病毒吸附的影响。

用超纯水配制的无菌PBS(pH7.2)将J/ZY株病毒液进行10倍梯度稀释，设置10^-3～10^-108个稀释梯度。将每个稀释度的病毒接种于MDCK细胞，每个稀释度接种8孔，100μL/孔，37℃吸附1h左右。弃去吸附液，用灭菌PBS洗涤MDCK细胞一遍，加入含终浓度2μg/ml的TPCK-trypsin的细胞维持液(含2万单位双抗的无血清DMEM培养基)，置35℃，6%CO₂培养箱培养，每隔12h观察1次。待到细胞病变(CPE)和HA效价不再发生变化时，用Reed-Muench公式计算TCID₅₀。

1.4静脉接种致病指数(IVPI)的测定

取6周龄非免疫鸡8只，按中华人民共和国兽用生物制品质量标准的方法测定IVPI。引起禽流感的A型流感病毒对6周龄鸡的静脉致病指数(IVPI)大于1.2或感染的A型流感病毒H5或H7亚型的核苷酸序列在血凝素的裂解位点上有多个碱性氨基酸，即确定为高致病性禽流感病毒。

2、实验结果

根据EID₅₀结果，将病毒J/ZY株以l×10⁷EID₅₀剂量接种10只10日龄SPF鸡胚（0.lml/胚）后，24h内无鸡胚死亡。在36～96h孵育期间致死4枚鸡胚，死亡率为40%。病毒J/ZY株的HA、EID₅₀、TCID₅₀和IVPI测定结果见表1。测定结果显示本发明所分离的病毒J/ZY株为低致病性禽流感病毒。

表1分离的病毒J/ZY株致病性测定

实验例2H9N2亚型禽流感病毒J/ZY株的免疫保护实验

1、实验方法

1.1病毒的扩增

分离的病毒J/ZY株分别经MDCK细胞转瓶培养扩增(收集细胞培养上清)及接种SPF鸡胚扩增(收集尿囊液)，另设接种无菌PBS的同日龄同批次SPF鸡胚，收获其尿囊液作为正常空白鸡胚尿囊液。以上扩增的病毒液收集以后均分装，置于-70℃保存备用。

1.2灭活疫苗的制备

经MDCK细胞和SPF鸡胚扩增的两种病毒液5000r/min离心30min，取上清，加入终浓度0.1%的福尔马林溶液，于37℃灭活48h。经过无菌性检验之后，将灭活病毒液上清分别与油佐剂按体积比1：1.5混合，乳化后用于动物免疫。

1.3免疫及攻毒

为了排除免疫抗原量对免疫效果的影响，根据试验中测得的数据，通过用空白尿囊液稀释的方法，将经MDCK细胞和SPF鸡胚扩增的两种病毒液调整为具有相同HA效价、EID₅₀和TCID₅₀的三组病毒液，分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同的剂量后，观察免疫及保护效果。

实验动物分组：

NC/NE—表示未经稀释的原始细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

HC/HE—表示经稀释得到的具有相同HA效价的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

EC/EE—表示经稀释得到的具有相同EID₅₀的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

TC/TE—表示经稀释得到的具有相同TCID₅₀的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

每组14只SPF鸡，同时留5只不免疫作为攻毒对照组。

所有试验SPF鸡于负压隔离器内饲养至4周龄进行免疫，免疫前采血，HI抗体检测均为阴性。灭活疫苗按每只0.3m1的剂量经胸部肌肉接种免疫。首次免疫后第7、14、21天采血，用商品化标准抗原检测抗体效价。免疫4周后，用分离的病毒J/ZY株尿囊液做攻毒试验。攻毒剂量均为105.0EID₅₀，每只鸡100μL。攻毒后的第3、5、7天分别采取咽喉和泄殖腔拭子，进行病毒分离检测，取处理后的样本上清液，以尿囊腔途径接种SPF鸡胚，收集死亡鸡胚的尿囊液进行HA效价检测，当HA效价达41og2以上时，确定病毒分离为阳性。

2、实验结果

将分离的病毒J/ZY株油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡，并排除了免疫时抗原量对各组免疫保护效果的影响，在免疫后1周鸡群就可检测到低水平的HI抗体水平，免疫后2周免疫组所有鸡群都产生明显的抗体，平均HI抗体水平达61og2，免疫后3周各试验组的HI抗体水平达到高峰，平均效价达71og2以上（表2），表明分离的病毒J/ZY株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平。并且从抗体检测结果可以看出，在各个时间点细胞毒制备疫苗免疫组的抗体水平均要比胚毒制备疫苗免疫组高，抗体水平上升也较快。

表2不同试验组在免疫后不同时间的抗体水平

Claims (10)

1.一株H9N2亚型禽流感病毒(AvainInfluenzaVirus)毒株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.8853。

2.权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒毒株在制备预防禽流感疫苗中的用途。

3.一种预防禽流感的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒毒株和药学上可接受的佐剂。

4.一种制备H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒毒株，得到病毒液，离心取上清；

(2)向病毒液上清中加入灭活剂，将病毒液上清灭活；

(3)灭活后的病毒液上清与佐剂混合均匀，乳化，即得。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中将权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒毒株接种病毒宿主细胞或SPF鸡胚得到扩增的病毒液。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中向病毒液上清中加入的灭活剂是福尔马林。

7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中向病毒液上清中加入福尔马林至其终浓度为病毒液上清总量的0.1％。

8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的灭活时间为48小时。

9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：按体积比计，步骤(3)中灭活后的病毒液上清和油佐剂的比例为1：1.5。

10.由权利要求4～9任一项方法制备得到的预防H9N2亚型禽流感病毒的灭活疫苗。