CN104922665A - 一种鸡新城疫、传染性支气管炎和h9亚型禽流感三联灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提供了一种新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株和H9亚型禽流感病毒SY株；H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No.5968。该鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗免疫效果良好，制备工艺稳定可靠。

Description

一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是一种主要引起禽急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和死亡率，对养鸡业危害严重，OIE将其列为A类疫病，我国也将其划分为一类动物疫病。

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)感染可导致雏鸡、肉鸡出现咳嗽、喷嚏、气管啰音等症状，发育缓慢，产蛋鸡产蛋减少和产蛋品质下降等，是危害养禽业的一种主要传染病。

H9亚型禽流感虽属于低致病性禽流感，死亡率低，但临床上发病率高，主要临床表现为轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右的死亡，且极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。

目前，针对以上三种疫病的防制主要依靠疫苗接种，市场上也有相应的灭活单苗和联苗，但由于存在制苗毒株免疫原性不强，联苗中各病毒抗原配比不科学而导致的疫苗制备工艺技术不稳定，对传染性支气管炎的预防免疫期较短，进而造成免疫失败现象。因此，研制一种具有广谱抗原性的鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种免疫效果良好、制备工艺稳定可靠的新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为，一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No.5968。

进一步地，灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，鸡新城疫病毒La Sota株的含量≥3×10^8.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升传染性支气管炎病毒M41株病毒液中，传染性支气管炎病毒M41株的含量≥3×10^6.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中，所述H9亚型禽流感病毒SY株的含量≥3×10^8.0EID₅₀。

本发明还提供了上述鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备方法，用鸡胚繁殖鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎毒M41株和H9亚型禽流感病毒SY株，分别收获相应的病毒液，分别浓缩和灭活，然后将灭活后的病毒液混合均匀，得到混合抗原液，将混合抗原液乳化，得到所述鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗。

进一步地，该混合抗原液中灭活的鸡新城疫病毒La Sota株抗原液、灭活的传染性支气管炎毒M41株抗原液和H9亚型禽流感病毒SY株病抗原液的体积比为5:6:4。

进一步地，该混合抗原液乳化的过程如下：将混合抗原液和灭菌的吐温-80按照体积比96:4混合均匀，得水相溶液；将注射用白油和司本-80按照体积比94:6混合，然后加硬脂酸铝2份，随加热随搅拌至透明为止，高压灭菌得油相溶液；将所述水相溶液和油相溶液混合乳化均匀。

进一步地，该水相溶液和油相溶液的体积为3:7。

本发明一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗具有如下优点：

1.选育优良的制苗毒株。鸡新城疫病毒La Sota株和传染性支气管炎病毒M41株，选用标准制苗毒株，均来源于中国兽医药品监察所，经过鉴定、扩繁、传代研究建立了生产种子批毒。H9亚型禽流感病毒SY株，是从陕西省某地区临床疑似禽流感病毒感染死亡鸡病料上分离到的一株低致病性禽流感病毒，具有稳定、良好的特异性和免疫原性，抗体产生时间短，效价高，免疫持续期长，对同源/非同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫预防作用。经哈尔滨兽医研究所国家禽流感研究中心鉴定，为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/Shaanxi/SY/97(H9N2)株，分类命名：A型流感病毒H9N2亚型。保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2012年4月11日；

2.稳定可靠的疫苗生产工艺，在对制苗毒液进行浓缩时，采用美国进口Millipore切向流超滤浓缩设备，对各病毒液进行了3～4倍的浓缩，且在抗原配比时，通过不同抗原配比进行动物免疫试验，最终选定La Sota株，M41株，SY株三种浓缩病毒液按5:6:4配比时，免疫效果最为稳定，各项检验指标均可达到质量标准要求，且生产成本经济。

3.本发明提供的三联苗可用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感，达到一针防三病的效果，减少免疫成本和免疫应激反应；减少人力劳动成本，降低养殖业养殖户的风险，保障公众健康。

本发明中H9亚型禽流感病毒SY株具有以下特点：

1.病毒含量：将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至96小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:32(微量法)者判为感染，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

2.红细胞凝集价：按《中国兽药典》附录进行测定，对鸡红细胞凝集价应不低于1:640(微量法1:512)。

3.对鸡胚的毒力：将毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1ml，置37℃孵育96小时。应至少有8枚鸡胚死亡，胚体表现重度充血、出血等病变。

4.对雏鸡的毒力：将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，滴鼻接种28日龄SPF鸡10只，每只0.1ml，另取条件相同的SPF鸡5只，不接种作为对照，在同条件下分别饲养，观察14日，应不出现死亡或明显异常反应。接种后第5日，采集鸡喉头和泄殖腔拭子，用9～11日龄SPF鸡胚分离病毒。试验组中应至少9只为阳性，对照鸡应全部为阴性。

5.特异性：将毒种稀释至含10^5.0EID₅₀/0.1ml，与等量的抗H9亚型禽流感病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，接种SPF鸡胚10枚，观察96小时，24～96小时内不引起特异性死亡且至少存活8枚，取鸡胚液做红细胞凝集试验，应为阴性。

6.免疫原性：将毒种接种鸡胚制备病毒液，经甲醛灭活后，按本规程油佐剂配方制成灭活疫苗。按以下方法进行检验：

6.1取28日龄SPF鸡15只，其中10只各皮下或肌肉接种该灭活疫苗0.3ml，另5只不接种，作为对照。接种后21日，分别采血，分离血清，用H9亚型禽流感抗原检测HI抗体。免疫鸡HI抗体效价的几何平均值应不低于1:64(微量法)，对照鸡HI抗体效价均应不高于1:4(微量法)。

6.2取28日龄SPF鸡15只，其中10只各皮下或肌肉接种该灭活疫苗0.3ml，另5只不接种，作为对照。接种后21日，翅静脉注射AIV SY株病毒液，每只鸡0.2m1(含10^8.0EID₅₀)。攻毒后第5日，分别采集每只鸡喉头和泄殖腔拭子，两者混合进行病毒分离，各尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察4日，逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚胚液的HA效价不低于1∶16，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。免疫组应至少有9只鸡病毒分离阴性，对照组应至少有4只鸡病毒分离阳性。

7.纯净：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

8.基础种子代数：E3～E10代。

具体实施方式

本发明一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗实施例中所用的SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。禽流感H5、H7、H9阳性血清购自哈尔滨维科生物技术有限公司，新城疫(ND)、减蛋综合征(EDS)阳性血清购自中国兽医药品监察所。

实施例1

本发明一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCCNo.5968。灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，所述鸡新城疫病毒La Sota株的含量≥3×10^8.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升传染性支气管炎病毒M41株病毒液中，所述传染性支气管炎病毒M41株的含量≥3×10^6.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中，所述H9亚型禽流感病毒SY株的含量≥3×10^8.0EID₅₀

本发明一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗中H9亚型禽流感病毒SY株的分离与鉴定：

1.病毒分离：将临床送检的疑似禽流感死亡鸡的脾、肝、心脏等组织，称重后按1:5(W/V)比例加入灭菌生理盐水研磨，然后冻融3次，3000转/分钟离心30分钟，上清液无菌过滤后接种10日龄SPF鸡胚10枚，其中7枚尿囊腔接种病料处理上清液0.1ml/枚，另3枚接种生理盐水作对照。接种后将鸡胚放回孵箱中继续孵育，每天照蛋2次，弃去24h内死亡鸡胚，将24h后死亡的鸡胚及时取出，放4℃冰箱4h，再无菌收取鸡胚尿囊液，并观察鸡胚的病变特征，未死亡胚观察至96h，取出按上法收取鸡胚尿囊液，取样检测。

2.血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HI)：按《中国兽药典》的方法进行。收获鸡胚液能够凝集鸡红细胞，HA价为1:1024。而且该未知病毒的血凝活性能被禽流感H9阳性血清特异性抑制，不能被ND、EDS及禽流感H5阳性血清抑制。

3.病毒鉴定：将未知病毒尿囊液经适当稀释后进行磷钨酸负染色，电镜下观察，镜下可见具有典型正黏病毒形态特征的病毒粒子。同时将尿囊液样送哈尔滨兽医研究所国家禽流感研究中心，经血清学方法鉴定后，该分离物为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/Shaanxi/SY/97(H9N2)株(简称SY株)。

4.静脉接种致病指数(IVPI)测定：按国际兽疫局(OIE)规定法测定，IVPI＝0.04。

5.病毒含量测定：将病毒尿囊液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-9、10^-104个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各7个，每胚0.1ml，观察至96小时，24小时内死亡的鸡胚弃去不计，24～96小时死亡鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，96小时后活胚，逐个收获胚液，分别测定红细胞凝集价，鸡胚死亡、胚体、头、爪、翅出血、肝脏发红或尿囊液HA效价在1:32以上判为感染，计算EID₅₀，EID₅₀＝10^-8.24/0.1ml。

6.对流行毒株的交叉保护性研究：将H9亚型禽流感病毒SY株按常规方法制成灭活疫苗(灭活前每0.1ml禽流感病毒SY株毒液中病毒含量≥10^8.0EID₅₀)，对21日龄SPF鸡颈背侧皮下注射H9亚型禽流感灭活疫苗0.3ml/只，接种后21日采血，检测血清AIV HI抗体效价，并分别用AIV SY株和AIV流行毒株Hz、Gz、Qd、Fj等(陕西、青岛、福建等地分离的H9亚型AIV地方流行毒株)攻毒，攻毒后第5日从喉头和泄殖腔采拭子样，用10日龄SPF鸡胚分离病毒，分离阴性的样品，盲传一代后判定。结果如表1，免疫组鸡抗体水平均在1:400以上，病毒分离均为阴性。因此，H9亚型禽流感病毒SY株对不同地区分离的H9亚型禽流感流行株均具有良好的免疫保护作用，可以有效地预防H9亚型禽流感。

表1 禽流感H9亚型流行毒株的攻毒试验

注：*病毒分离阳性鸡数/攻毒鸡数。

实施例2

本发明一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCCNo.5968。灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，所述鸡新城疫病毒La Sota株的含量≥3×10^8.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升传染性支气管炎病毒M41株病毒液中，所述传染性支气管炎病毒M41株的含量≥3×10^6.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中，所述H9亚型禽流感病毒SY株的含量≥3×10^8.0EID₅₀

上述该鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备方法：

1.制苗用毒液的制备：

(1)鸡新城疫病毒液的制备：

具体方法如下：

接种：取鸡新城疫病毒La Sota株生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，每胚尿囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

孵育和观察：鸡胚接种后，每日照蛋1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却4～24小时。

收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定红细胞凝集价，应不低于1:160(微量法1:128)。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无细菌生长。置-20℃下保存备用。

(2)鸡传染性支气管炎病毒M41株制苗用毒液的制备：

具体方法如下：

接种：取鸡传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种，用灭菌生理盐水适当稀释(10^-2～10^-3)，每胚尿囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋。

孵育和观察：鸡胚接种后，30小时前照蛋1次，弃去死胚，30～36小时死亡的鸡胚随时取出，至36小时不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃中冷却4～24小时。

收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干枚鸡胚的胚液混合为一组，装于灭菌容器内，同时每组抽样按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长，HA试验应为阴性。置-20℃下保存备用。

(3)H9亚型禽流感病毒SY株制苗用病毒液的制备：

具体方法如下：

接种：取禽流感病毒SY株生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-4稀释，每胚尿囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋。

孵育和观察：接种后24小时照蛋1次，弃去死胚。24小时后，每4～8小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却4～24小时。

收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。每若干枚鸡胚的胚液混合为一组，装于灭菌容器内，同时每组抽样按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。置-20℃下保存备用。

2.制苗用毒液的浓缩：将收获的三种病毒液澄清处理，除去病毒液中的大颗粒杂质，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统分别将三种病毒液浓缩至原体积的1/3至1/4。

3.灭活：将检验合格的各病毒浓缩液分别加入10％甲醛溶液，使其甲醛溶液的终浓度均为0.1％，随加随搅拌，使其充分混匀，37℃条件下灭活(从抗原液温度升至37℃开始计时)，NDV灭活16小时，IBV和AIV灭活24小时。灭活完毕后，分别取样，进行灭活检验，灭活后的病毒液置2～8℃保存，应不超过1个月。

4.半成品检验：

(1)无菌检验：取灭活后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(2)病毒含量测定：

①将灭活前的鸡新城疫病毒浓缩液抽样检测，每0.1ml病毒含量应≥3×10^8.0EID₅₀。

②将灭活前的鸡传染性支气管炎病毒浓缩液抽样检测，每0.1ml病毒含量应≥3×10^6.0EID₅₀。

③将灭活前的鸡H9亚型禽流感病毒浓缩液抽样检测，每0.1ml病毒含量应≥3×10^8.0EID₅₀。

(3)灭活检验：

①取灭活后的鸡新城疫病毒浓缩液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过2枚，收获所有鸡胚的胚液进行HA试验，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行HA试验，应全部为阴性。

②取灭活后的鸡传染性支气管炎病毒浓缩液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察6日，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚，逐个检查胎儿，均应不出现失水、蜷缩、侏儒胚等特征性病变，并盲传一代，均应不出现失水、蜷缩、侏儒胚等特征性病变。

③取灭活后的H9亚型禽流感病毒浓缩液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚，收获所有鸡胚的胚液进行HA试验，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行HA试验，应全部为阴性。

5.油佐剂灭活疫苗的制备：

(1)油相制备：取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加热随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。

(2)水相制备：将灭活的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒液按5:6:4的比例充分混合。取混合后的抗原液96份，加入灭菌的吐温-804份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。

(3)乳化：将7份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入3份水相，加完后，中速混合，然后高速乳化。在乳化终止前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。

6.分装：定量分装，加盖密封并贴标签。

采用上述方法制备3批鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，批号为110301，110302，110303，并按下列方法进行成品的效力检验。

(1)鸡新城疫部分效力检验：每批疫苗皮下或肌肉注射1月龄SPF鸡各10只，每只注射剂量为20μl，另5只不免疫作为对照，3周后，每只鸡先采血分离血清，并测定ND HI抗体价，然后肌肉注射ND强毒北京株，剂量为10^5.0ELD₅₀，观察14天。3批疫苗免疫鸡几何平均抗体分别为1:59.7，1:45.2，1:52.0，均不低于1:16的标准，对照鸡均不高于1:4，具体见表2。

表2 新支流三联苗新城疫抗体检测结果

注：“－”代表阴性

(2)传染性支气管炎部分效力检验：用2周龄SPF鸡30只，取其中10只作对照，另20只14日龄时各点眼、滴鼻接种H120活疫苗1羽份，3周后采血，测定血清的HI抗体效价，每只鸡再分别以颈部皮下或肌肉途径接种3批三联灭活疫苗0.5ml，灭活疫苗接种后4周再分别采血测定血清的HI抗体效价。结果，接种H120活疫苗3周后IB HI抗体水平1:22.6，灭活苗免后3周，3批免疫鸡IB HI几何平均抗体水平分别为1:142.4，1:146.9，1:158.2，分别是活苗免后3周的6.3倍、6.5倍、7倍。

(3)H9亚型禽流感部分效力检验：用21～28日龄SPF鸡10只，各颈背侧皮下注射疫苗0.3ml，接种后21日，连同对照鸡10只，采血，分离血清，测定HI抗体效价。结果见表3，免疫组鸡几何平均抗体水平≥1:675.6，

表3 新支流三联苗H9禽流感抗体检测结果

注：“－”代表阴性

实施例3

采用实施例2中所制备的鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，批号为110301，110302，110303，并按下列方法进行灭活疫苗最小免疫剂量试验：

取SPF鸡110只，其中90只在14日龄时滴鼻、点眼接种H120活苗，每只1羽份，免后3周采血分离血清，检测IB HI抗体；同时以0.1ml、0.2ml、0.3ml三个剂量，分别接种3批三联苗，每个剂量接种10只，剩余20只SPF鸡不免疫作为对照。免疫鸡三联苗接种后4周采血，分离血清，分别测定ND、IB、AI HI抗体。并取110301批疫苗免疫的3组鸡和10只对照鸡进行NDV北京株的攻毒试验，每只鸡肌肉注射鸡新城疫病毒强毒北京株10^5.0ELD₅₀，观察14日，记录不同剂量组攻毒保护结果。取110302批疫苗免疫的3组鸡和另10只对照鸡进行AIV的攻毒试验，每只鸡肌肉注射禽流感病毒SY株病毒液0.5ml(含5×10^8.0EID₅₀)，攻毒后第5日，从鸡喉头和泄殖腔采样，用9～11日龄SPF鸡胚分离病毒。结果见表4。

表4 三联苗最小免疫剂量试验结果

由表4结果可知，接种3批三联苗的所有试验鸡ND HI抗体水平均≥1:272，处于抗体保护临界水平以上，110301批疫苗接种鸡强毒攻击后保护率10/10，10只对照鸡全部死亡。针对传染性支气管炎部分，当疫苗接种量为0.1ml时，3批疫苗的试验鸡灭活苗免后4周血清的HI抗体水平为活苗免后3周的2.4～2.6倍，而接种量为0.2ml、0.3ml时，灭活苗免后4周血清的HI抗体水平为活苗免后3周的4.2～5.2倍。对于AI：所有疫苗接种鸡AI HI抗体水平均≥1:76.1。110302批疫苗接种鸡禽流感攻毒后病毒分离率0/10，9/10只对照鸡病毒分离阳性。因此，综合考虑疫苗各组分免疫效果，该三联苗的最小免疫剂量为0.2ml。

Claims (6)

1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No.5968。

2.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗，其特征在于，灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，所述鸡新城疫病毒La Sota株的含量≥3×10^8.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升传染性支气管炎病毒M41株病毒液中，所述传染性支气管炎病毒M41株的含量≥3×10^6.0EID₅₀；灭活前每0.1毫升H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中，所述H9亚型禽流感病毒SY株的含量≥3×10^8.0EID₅₀。

3.一种如权利要求1或2所述的鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，用鸡胚繁殖鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎毒M41株和H9亚型禽流感病毒SY株，分别收获相应的病毒液，分别浓缩和灭活，然后将灭活后的病毒液混合均匀，得到混合抗原液，将所述混合抗原液乳化，得到所述鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗。

4.一种如权利要求3所述的鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合抗原液中灭活的鸡新城疫病毒La Sota株抗原液、灭活的传染性支气管炎毒M41株抗原液和H9亚型禽流感病毒SY株病抗原液的体积比为5:6:4。

5.一种如权利要求3或4所述的鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合抗原液乳化的过程如下：将所述混合抗原液和灭菌的吐温-80按照体积比96:4混合均匀，得水相溶液；将注射用白油和司本-80按照体积比94:6混合，然后加硬脂酸铝2份，随加热随搅拌至透明为止，高压灭菌得油相溶液；将所述水相溶液和油相溶液混合乳化均匀。

6.一种如权利要求5所述的鸡新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述水相溶液和油相溶液的体积为3:7。