CN108261543B - 传代细胞源nd、ib、ai三联灭活疫苗的制备方法及其应用 - Google Patents

传代细胞源nd、ib、ai三联灭活疫苗的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用，包括步骤如下：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，用于病毒接种；采用二阶培养法，向EB66细胞接种新城疫病毒、传染性支气管炎病毒或禽流感病毒；在接毒24h后，病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到病毒液；重复上述步骤以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液并灭活；将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，制备灭活疫苗。本发明采用EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽流感病毒的培养，避免了使用鸡胚造成胚体异源蛋白和外源病毒污染的风险，提高病毒的生产品质，简化病毒的生产工艺。

Description

传代细胞源ND、IB、AI三联灭活疫苗的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种ND(鸡新城疫)、IB(传染性支气管炎)、AI(禽流感H9亚型)三联灭活疫苗的制备方法及其应用，特别是涉及一种采用全悬浮培养工艺和传代细胞源对鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感H9亚型三联灭活疫苗进行生产的方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感作为影响养禽业的三大传染病，每年导致大量养殖鸡的死亡，对我国养禽业的发展造成重大损失。现有对此三种疫病的防控多采用疫苗免疫的方式来达到良好的防控效果，而目前的疫苗主要为病毒灭活疫苗，以鸡胚作为病毒培养基质进行病毒的培养扩繁。但由于鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。此外，鸡胚中还易引入其它外源病毒，导致疫苗受到污染，影响疫苗使用安全。
已有报道采用传代细胞系Vero细胞系、BHK-21细胞系来培养鸡传染性支气管炎病毒，使用传代细胞系包括MDCK细胞系来培养禽流感病毒，但都因培养后的病毒滴度过低或无法实现大规模全悬浮培养而不能进行大批量生产，无法真正取代传统的鸡胚接种培养法。此外，目前在生产细胞源多联苗时，必须使用多种细胞来对不同病毒进行培养，导致生产工艺复杂，病毒生产品质差异较大，很难保证各生产批次的稳定性，严重限制了细胞源多联苗的生产，特别是鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的生产。
发明内容
本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用，以至少解决现有技术中三联灭活疫苗需采用多种细胞进行培养、工艺复杂、批次不稳定的问题。
本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用包括步骤如下：
步骤1：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，当EB66细胞密度达到6×106cells/mL-15×106cells/mL时，用于病毒的接种；所述EB66细胞的培养温度为35℃-37℃，培养转速为130rpm-150rpm；
步骤2：采用二阶培养法，向EB66细胞接种传染性支气管炎病毒、新城疫病毒或禽流感病毒，所述病毒的接毒量为0.0001MOI-1MOI，细胞接毒后33℃-35℃的培养温度下以110rpm-140rpm的培养转速进行吸附，吸附0.5h-2h；
步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的病毒液；
步骤4：重复步骤1-3以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液，将收获的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液分别进行灭活；
步骤5：将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，并制备灭活疫苗。
进一步地，步骤1所用EB66细胞培养方法如下：
从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化进行细胞复苏，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，以300g的离心条件离心10min，除去上清液，并加入培养基将细胞吹打重悬均匀，并接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产，至所得的EB66细胞系中细胞数量满足生物反应器的接种量。
进一步地，所述步骤1中EB66细胞于生物反应器中进行生长培养方法如下：
取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养；所述EB66细胞的培养温度为37℃；培养转速为150rpm。当EB66细胞密度达到8×106cells/mL～10×106cells/mL用于病毒的接种；
进一步地，所述步骤4中新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液的灭活方法如下：
将病毒液于灭活罐中，在搅拌的条件下加入甲醛溶液，至甲醛溶液的最终浓度为0.1％，使甲醛溶液与病毒液充分混合。在37℃的条件下保持搅拌，灭活30小时，完成病毒液的灭活。
更进一步地，所述步骤4中病毒液灭活后置2～8℃下保存。
进一步地，所述步骤2中病毒在接种吸附完成后，还需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-4倍。
更进一步地，所述步骤2中接种病毒为禽流感病毒，新的病毒生产培养基补加比例为原工作培养基体积的1倍；或所述步骤2中接种病毒为新城疫病毒，新的病毒生产培养基补加比例为原工作培养基体积的1.5倍；或所述步骤2中接种病毒为传染性支气管炎病毒，新的病毒生产培养基补加比例为原工作培养基体积的2倍。
进一步地，所述步骤2中病毒接种后，还需要补加TPCK胰酶，所述补加TPCK胰酶的方法为：在病毒接种后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶，或在病毒接种后的第0、1天各补加2mg/L的TPCK胰酶，或在病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。
更进一步地，所述步骤2中接种病毒为禽流感病毒，TPCK胰酶的补加方法为禽流感病毒在接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶；或所述步骤2中接种病毒为新城疫病毒，TPCK胰酶的补加方法为新城疫病毒在接毒后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶；或所述步骤2中接种病毒为传染性支气管炎病毒，TPCK胰酶的补加方法为在传染性支气管炎病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。
进一步地，所述制备方法还包括步骤6如下：
按重量比取注射用白油94份、司本-806份混合，随加随搅拌至充分混匀，并在121℃灭菌30分钟，完成油相的制备，冷却后备用；将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒按(0.5～5)：(1～6)：(1～7)的体积比混合，按重量比取混合后的灭活抗原96份，并加入灭菌冷却后的吐温-804份，充分搅拌至吐温-80完全溶解，完成水相的制备；按重量比取油相3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入水相2份，进行充分搅拌后乳化；将乳化后的液体进行定量分装，并加盖密封，完成鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感H9亚型三联灭活疫苗的制备。
进一步地，所述的EB66传代细胞培养基为CDEB66(健顺DP210)，该培养基属于无血清、化学界定培养基，所述悬浮培养传代细胞株为EB66株，所述的新城疫病毒为新城疫病毒lasota株，所述的传染性支气管炎病毒为M41株，所述的禽流感病毒(H9亚型)为DA株。
本发明相对于现有技术，采用EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽流感病毒的培养，避免了使用鸡胚造成胚体异源蛋白和外源病毒污染的风险，确保制备病毒具有较高纯净、质量稳定均一；同时，本发明的鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗生产方法工艺稳定，各批次之间质量差异小，疫苗质量好，安全高效，具有很好的经济效益和应用前景。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例所使用原料来源如下：
1.病毒：鸡新城疫病毒Lasota株和鸡传染性支气管炎病毒M41由肇庆大华农生物药品有限公司保存；禽流感病毒为A型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/DA/2014(H9N2)株(简称DA株)，由肇庆大华农生物药品有限公司分离鉴定和保存。
2.细胞系：EB66传代细胞系，由甘肃健顺生物科技有限公司提供；EB66细胞是法国Valneva公司所有。
3.无血清、化学界定培养基：CDEB66(DP210)培养基，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
实施例1-3所使用EB66细胞的复苏与培养方法如下：
从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化进行细胞复苏，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，以300g的离心条件离心10min，除去上清液，并加入培养基将细胞吹打重悬均匀，并接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产，至所得的EB66细胞系中细胞数量满足生物反应器的接种量。
实施例1
本发明实施例1新城疫病毒的培养方法如下：
步骤1：将EB66细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至生物反应器(SartoriusBPlus)中进行培养，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106cells/mL-16×106cells/mL，活率在90％以上时，将反应器中的细胞留600mL用于病毒的接种；
步骤2：新城疫病毒按MOI为0.01向反应器中的EB66细胞接种接毒，接毒后搅拌速度调整为80rpm，进行吸附培养1h，病毒吸附培养完成后，补加1.5倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；
步骤3：在接毒后的第0、1、2、3天分别向反应器、三角摇瓶中各补加1mg/L的TPCK胰酶，并每隔12h取样，进行EID50的检测，在病毒EID50最高时，收获病毒。
经EID50的检测，当培养条件稳定时，收获的病毒的效价最高为109.75EID50/0.1mL。
实施例2
本发明实施例2传染性支气管炎病毒的培养方法如下：
步骤1：将EB66细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至生物反应器(SartoriusBPlus)中进行培养，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106cells/mL-16×106cells/mL，活率在90％以上时，将反应器中的细胞留600mL，用于病毒的接种；
步骤2：传染性支气管炎病毒按接毒量为0.01MOI对反应器中的EB66细胞进行病毒接种，接毒后搅拌速度调整为80rpm，并吸附培养1h，待病毒吸附培养完成后，补加2倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；
步骤3：在接毒后的第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶，并每隔12h取样，进行EID50的检测，在病毒EID50最高时，收获病毒。
经EID50的检测，当培养条件稳定时，收获的病毒滴度最高为107.4EID50/0.1mL。
实施例3
本发明实施例3禽流感病毒(H9亚型)的培养方法如下：
步骤1：将EB66细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至生物反应器(SartoriusBPlus)中进行培养，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106cells/mL-16×106cells/mL，活率在90％以上时，将反应器中的细胞留600mL，用于病毒的接种；
步骤2：禽流感病毒按MOI为0.01向反应器中的EB66细胞进行病毒接种，接毒后搅拌速度调整为80rpm，进行吸附培养1h，病毒吸附培养完成后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；
步骤3：接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶，并每隔12h取样，进行EID50的检测，在病毒EID50最高时，收获病毒。
经EID50的检测，当培养条件稳定时，收获的病毒的效价最高为108.2EID50/0.1mL。
实施例4
本发明实施例4疫苗制备方法如下：
步骤1：取实施例1-3收获滴度最高的病毒液(将灭活前取出的病毒液进行EID50测定，每0.1mL病毒液病毒含量应≥107.0EID50)分别在搅拌的情况下加入甲醛溶液，边加边搅拌，至甲醛溶液的最终浓度为0.1％，使甲醛溶液与病毒液充分混合；混合后将溶液放置于37℃条件下灭活30小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，期间不停搅拌，灭活后的病毒液置2～8℃保存；
步骤2：按重量比取注射用白油94份、司本-806份混合，随加随搅拌至充分混匀，并在121℃灭菌30分钟，完成油相的制备，冷却后备用；将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒按1：1：1的体积比混合，按重量比取混合后的灭活抗原96份，并加入灭菌冷却后的吐温-804份，充分搅拌至吐温-80完全溶解，完成水相的制备；按重量比取油相3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入水相2份，进行充分搅拌后乳化；将乳化后的液体进行定量分装，并加盖密封，完成鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的制备。
实施例5
本发明实施例5疫苗免疫效力检测方法和结果如下：
步骤1：取28日龄SPF鸡15只，并取实施例5所得三联灭活疫苗向其中10只SPF鸡进行颈部皮下注射，每只注射20μL，剩余5只SPF鸡作为新城疫攻毒对照组；在接种后21日后，向每只鸡的肌肉注射新城疫病毒北京株强毒0.5ml(含105ELD50)，继续培育观察14日；结果表明，对照组全部死亡，免疫组保护8只；
步骤2：取28日龄SPF鸡20只，采用点眼接种的方式接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120)1羽份；接种21日后，对SPF鸡进行分别采血，分离血清，同时以颈部皮下注射方式对每只SPF鸡接种0.5ml实施例5所得三联灭活疫苗，在二次免疫21日后，再次对SPF鸡进行分别采血，分离血清；将两次血清分别作HI抗体效价测定，结果表明，二次免疫后获得血清的HI抗体效价几何平均值为首免血清HI效价几何平均值的4倍。
步骤3：取28日龄SPF鸡15只，并取实施例5所得三联灭活疫苗对其中10只鸡进行颈部皮下注射，每只注射0.3mL，剩余5只SPF鸡作禽流感攻毒对照组；在接种21日后，向每只鸡的静脉注射H9亚型禽流感病毒DA株鸡胚毒0.2mL(含2×107.0EID50)；攻毒后第5日采集每只鸡的喉头和泄殖腔棉拭子，并将同一只鸡所得喉头和泄殖腔棉拭子混合，收集混合拭子上清液；取75枚9～11日龄SPF鸡胚均分为15组，将从15只SPF鸡采集到的15组上清液分别接种到各组鸡胚的尿囊腔中，每胚上清液的接种量为0.2mL，在接种孵育观察72小时后，收集鸡胚液，并对各个鸡胚液的HA效价进行分别测定；每份混合拭子上清液接种的5枚鸡胚中，只要有1枚鸡胚的鸡胚液HA效价不低于1：16，即可判定该组鸡胚为病毒分离阳性，若检测鸡胚为病毒分离阴性，应将所得鸡胚液进行盲传1代，以对鸡胚感染情况进行进一步判定；结果表明，10只免疫后鸡的病毒分离为阴性，对照组5只鸡的病毒分离全为阳性。
本发明实施例1-3通过采用EB66细胞分别对鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)培养，在避免了胚体异源蛋白和外源病毒污染的风险的同时，获得具有高滴度的病毒液，使收获的病毒抗原具有纯净、质量稳定均一且安全的特点；同时，本发明实施例1-3通过采用EB66细胞分别对鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)培养，有效解决了需要采用多种细胞分别对鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)培养的问题，简化生产工艺，确保病毒液的生产工艺稳定、批间差异小、质量可控，使生产的疫苗具有安全高效的优点。同时，本发明实施例1-3采用无血清化学界定的个性化培养基，利用EB66细胞系进行新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒的全悬浮培养，使生产传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗具有安全有效的优点。
本发明实施例5中制备的三联灭活疫苗对鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)均具有高效的防疫效果，具有很好的应用前景。
综上所述，本发明采用EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽流感病毒的培养，避免了使用鸡胚造成胚体异源蛋白污染的风险，确保制备病毒具有较高纯净、质量稳定均一；同时，本发明的鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗生产方法工艺稳定，各批次之间质量差异小，疫苗质量好，安全高效，具有很好的经济效益和应用前景；此外，本发明采用无血清化学界定的个性化培养基对接毒后的EB66细胞系全悬浮培养，避免了外源病毒的引入，使生产出的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗具有安全有效的优点。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (8)

1.一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活疫苗的制备方法包括步骤如下：
步骤1：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，当EB66细胞密度达到6×106cells/mL-15×106cells/mL时，用于病毒的接种；所述EB66细胞的培养温度为35℃-37℃，培养转速为130rpm-150rpm；
步骤2：采用二阶培养法，向EB66细胞接种传染性支气管炎病毒、新城疫病毒或禽流感病毒，所述病毒的接毒量为0.0001MOI-1MOI，细胞接毒后33℃-35℃的培养温度下以110rpm-140rpm的培养转速进行吸附，吸附0.5h-2h，补加TPCK胰酶，所述补加TPCK胰酶的方法为：
接种病毒为禽流感病毒，TPCK胰酶的补加方法为禽流感病毒在接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶；或接种病毒为新城疫病毒，TPCK胰酶的补加方法为新城疫病毒在接毒后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶；或接种病毒为传染性支气管炎病毒，TPCK胰酶的补加方法为在传染性支气管炎病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。；
步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的病毒液；
步骤4：重复步骤1-3以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液，将收获的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液分别进行灭活；
步骤5：将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，并制备灭活疫苗。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1所用EB66细胞培养方法如下：
从液氮中取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化进行细胞复苏，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，以300g的离心条件离心10min，除去上清液，并加入培养基将细胞吹打重悬均匀，并接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产，至所得的EB66细胞系中细胞数量满足生物反应器的接种量。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中EB66细胞于生物反应器中进行生长培养方法如下：
取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养；所述EB66细胞的培养温度为37℃；培养转速为150rpm；当EB66细胞密度达到8×106cells/mL～10×106cells/mL用于病毒的接种。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液的灭活方法如下：
将病毒液于灭活罐中，在搅拌的条件下加入甲醛溶液，至甲醛溶液的最终浓度为0.1％，使甲醛溶液与病毒液充分混合，在37℃的条件下保持搅拌，灭活30小时，完成病毒液的灭活。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中病毒液灭活后置2～8℃下保存。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中病毒在接种吸附完成后，还需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-4倍。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中接种病毒为禽流感病毒，新的病毒生产培养基补加比例为原工作培养基体积的1倍；或所述步骤2中接种病毒为新城疫病毒，新的病毒生产培养基补加比例为原工作培养基体积的1.5倍；或所述步骤2中接种病毒为传染性支气管炎病毒，新的病毒生产培养基补加比例为原工作培养基体积的2倍。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5的具体操作如下：
按重量比取注射用白油94份、司本-80 6份混合，随加随搅拌至充分混匀，并在120-140℃灭菌30分钟，完成油相的制备，冷却后备用；将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒按(0.5～5)：(1～6)：(1～7)的体积比混合，按重量比取混合后的灭活抗原96份，并加入灭菌冷却后的吐温-80 4份，充分搅拌至吐温-80完全溶解，完成水相的制备；按重量比取油相3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入水相2份，进行充分搅拌后乳化；将乳化后的液体进行定量分装，并加盖密封，完成鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感H9亚型三联灭活疫苗的制备。
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