KR20120027381A

KR20120027381A - 일본뇌염 백신 및 그것의 제조 방법

Info

Publication number: KR20120027381A
Application number: KR1020117030728A
Authority: KR
Inventors: 라제쉬 자인; 밀린드 브이 갈갈카르; 카필 메이달; 수드한슈 브라티
Original assignee: 파나세아 바이오테크 리미티드
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2012-03-21
Also published as: WO2010137036A3; AR076924A1; WO2010137036A2

Abstract

본 발명은 신규 일본뇌염 백신 및 그것의 제조를 위한 신규 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 일본뇌염 바이러스 균주 P20778 백신에 관한 것으로서, 바이러스 적응 및 증식이 혈청이 없고, 동물 기원 첨가제가 없는 배지 중에서 수행된다. 바이러스는 특히 Vero 셀라인에서 증식될 수 있다.

Description

일본뇌염 백신 및 그것의 제조 방법{JAPANESE ENCEPHALITIS VACCINE AND METHOD OF MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 신규 일본뇌염 백신과 그것을 제조하는 신규 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 일본뇌염 바이러스 균주 P20778 백신에 관한 것으로서, 바이러스의 적응과 증식이 혈청 및 동물 기원의 첨가제가 없는 배지에서 이루어진다.

일본뇌염(JE)은 많은 아시아 국가들에서 바이러스 뇌염을 일으키는 주요 원인이다. 감염은 모기를 통해 이루어지며, 일본뇌염 바이러스에 의해서 야기된다. 임상 징후는 다양하며, 두통, 발열, 정신상태의 변화 및 발작, 진전, 과긴장성 부전마비 및 조정기능의 손실의 개시를 포함할 수 있다(선택된 백신-예방가능한 질환의 WHO 권장 감독 기준. 제네바: 세계보건기구, 2003). 이 바이러스는 모기와 돼지 및/또는 물새 사이의 전염 고리에 존재한다. 사람은 감염된 모기(Culex spp.)에 물렸을 때만 의도치 않게 감염되는데, 이 질환은 주로 시골과 시골 주변 환경에서 발견된다.

이 질환은 중국의 일부 지역과 러시아 연방의 일부 지역과 남동 아시아에서는 계절적 분포를 가진 풍토병이다. 열대기후 지역에서는 연중 내내 전염이 관찰된다. 현재 북부 인도와 남부 네팔과 중앙 인도와 서부 인도의 일부 지역이 일본뇌염의 고토착지역으로서 간주되는데, 해당 기관들은 예방접종 캠페인으로 대응하고 있다. 새로운 지역으로의 일본뇌염의 전파는 관개 프로그램에 의해서 지원되는 경지 개발 및 집중적 쌀 재배와 관련되었다. 일본뇌염 백신은 수십 년 전부터 이용되어 왔고, 질환을 통제할 수 있는 잠재력이 입증되었다. 모기를 통제하거나 돼지로의 확장을 통제하는 것과 같은 다른 통제 수단은 신뢰성이 낮은 것으로 나타났다. WHO는 일본뇌염이 공중보건 문제로서 인식되는 모든 지역에서 일본뇌염 예방접종을 권장하고 있다(WHO-WER 2006; 81:325).

질환 감독은 대부분 일정한 패턴이 있는데, 사례 확인과 다른 원인으로 인한 뇌염과의 구분은 실험실에서의 진단이 필요하며, 이것은 주로 감시 지역에서 수행된다. 사례별 감독은 예방접종을 통해 일본뇌염을 효과적으로 통제하고 있는 국가들에서 확립되어 있다. 전체적으로 이 질환은 실제보다 덜 보고되고 있다고 생각되며, 연간 사망률은 10,000-15,000건의 범위로 추정되고, 총 임상 사례 건수는 약 50,000건 정도일 수 있다. 이러한 사례들 중에서 최대 50%는 영구적인 신경정신병적 결과를 나타낸다.

일본뇌염 바이러스(JEV)는 동물 바이러스에서도 플라비비리다(Flaviviridae)에 과의 일원이다. 일본뇌염 바이러스는 외피보유 양성-감지 단일가닥 RNA 바이러스이다. 형태학적으로 플라비바이러스 비리온은 직경 약 40nm의 구형 바이러스로서, 캡시드(C) 단백질과 복합체화된 11kb 게놈을 함유하는 뉴클레오캡시드를 둘러싼 지질 이중층으로 이루어진다(Rice, C. M. et al. Science 229:726-33, 1985). 막 위의 표면 돌출부는 글리코실화된 외피(E)와 막(M) 단백질로 이루어진다. 세포내 발생기 비리온에 존재하는 전막(prM)(premembrane) 당단백질은 푸린형 프로테아제에 의해서 성숙한 M 단백질로 절단된다. 표적 세포막에 바이러스가 부착되어 융합되는 것을 포함하는 중요한 생리학적 활성은 53kD E 단백질과 관련되며, 이로써 항체 중화의 일차적 표적 및 후보 백신의 중요한 성분이 된다(Koshini, E. et al. Virol. 188:714-20, 1992).

현재 일본뇌염의 경우 3개의 주요 백신이 상업적으로 사용되고 있는데, 이들은 (i) 몇몇 아시아 국가들에서 생산되는, 일본뇌염 바이러스의 나카야마 또는 베이징 균주에 기초한, 마우스 뇌 유래의 정제되고 불활화된 백신; (ii) 베이징 P-3 균주에 기초한 세포 배양물 유래의 불활화된 일본뇌염 백신, 및 (iii) 중국에서 제조되어 풍토병 지역에서 현재 가장 널리 사용되고 있는 백신인, 일본뇌염 바이러스의 SA 14-14-2 균주에 기초한, 세포 배양물 유래의 감독된(attenuated) 생 백신이다. 현재 인체용으로 미국 FDA의 라이센스를 가진 유일한 일본뇌염 백신은 일본의 BIKEN Institute에서 제조되는 JE-VAX인데, 이것은 Aventis-Pasteur에 의해 미국에서 널리 유통되고 있다. 이것은 젖먹이 마우스의 뇌에서 증식되어 정제되고 포르말린으로 불활화된, 일본뇌염 바이러스의 병독성 균주로부터 제조된다.

마우스 뇌 유래 백신의 단점은 반응유발성, 신경조직에서의 생산, 유발된 보호의 제한된 기간, 불량한 면역원성으로 인한 수회 분량의 필요 및 대부분의 국가에서 자체 제조하지 않는 것, 분량당 비교적 높은 가격이다. 또한, 이 백신은 어린 마우스의 뇌내 주사에 의해서 생산되므로, 제조가 어렵고 비용이 많이 들며, 백신과 관련된 신경학적 부작용이 발생할 가능성에 대한 우려가 있다. 제조 과정에서 계속해서 정제하여 순도와 효력을 증가시켰지만, 최근까지도 국소 및 전신 반응이 보통 빈도로 보고되었다. 또한, 백신 생산을 위해 상당한 수의 갓 태어난 마우스가 필요한 것이 동물에게는 잔인한 일이었다. 게다가, 우발적 감염원과 미량의 마우스 뇌 유래 단백질로 인한 이론적인 위험은 급성 산재성 뇌척수염(ADEM)과 같은 신경학적 부작용을 초래할 수 있다. 마우스 뇌 유래의 일본뇌염 백신을 제조하는 일본의 주된 제조자는 최근 그것의 생산을 중단했으며, 다른 제조자들에 의해서 생산되는 이 백신의 양은 제한적이었다.

세포 배양물 유래의 백신은 중국에서 제조되며 널리 사용되는데, 중국에서는 감독된 생 백신이 불활화된 백신을 점점 대체하고 있다. SA 14-14-2 백신 균주는 그것의 SA 14 부모로부터 세포 배양물(일차 햄스터 신장세포-PHK 세포)과 동물(마우스, 햄스터)에서 계속해서 플라크를 정제하면서(일차 병아리 배아세포에서) 연속 계대 배양함으로써 얻어졌다. 일차 햄스터 세포에 우발적 감염원이 존재할 가능성에 대한 우려로 인해 중국 이외의 지역에서의 사용은 제한적인 듯하다. 중국 백신이 제조되는 PHK 세포는 바이러스 백신용으로 세계보건기구(WHO)에 의해 승인되지 않았거나, 또는 선진국에서는 인체 사용을 허가하지 않고 있다. 백신 생산에 일차 햄스터 세포를 사용하는 것의 주된 단점은 백신의 품질에 관한 불확실성인데, 햄스터가 어떤 병원균들에 감염될 수 있고, 검출되지 않은 상태로 진행되면 상당한 안전 문제를 일으킬 수 있기 때문이다. 이러한 비판들로 인하여 그것의 광범한 사용에 관해 신뢰성을 갖기 위해서는 백신의 안전성에 대한 추가의 제어된 연구가 필요하다. 일차 세포로부터 백신을 생산하는 것의 또 다른 단점은 바이러스의 낮은 수확률과 대량 생산을 어렵게 하는 높은 비용이다.

혈청, 동물 성분들로부터 주로 기원하는 원료나 물질을 사용한 백신 제품에 있어서의 특별한 우려는 동물 유래의 감염원이 존재할 높은 위험으로 인해 생기며, 이것은 인체 사용에 유해할 수 있다. 이러한 문제에 대한 대책으로서 안전성에 대한 법률적 수단이 강화되었는데, 예를 들어 2003년에 일본 의약법 개정에 따라 "생물-기원 제품"에 대한 새로운 체제가 생겨났으며, 이것은 동물-기원 성분들이 없는 의약 제품의 개발을 추구하고 있다.

본 발명은 마우스 뇌나 일차 셀라인에서 생산된 일본뇌염 바이러스에 있어서의 선행 문제들을 극복하는, 바람직하게는 백신 생산을 위한 Vero 세포와 같은 연속 셀라인에서 이루어지는, 일본뇌염 바이러스의 개발 및 증식을 제안한다. 또한, 본 발명은 일본뇌염 바이러스의 배양, 일본뇌염 바이러스의 불활화 및 백신 생산의 하위 과정을 위해 개발된 비용 효과적인 방법을 확인한다.

요약하면, 본 발명은 다음의 방식으로 이전의 상업화된 일본뇌염 백신에 대한 개선된 방법을 확인한다.

1. 안전성: 발명된 바이러스 백신은 Vero 세포 배양을 통해 병독성을 획득하지 않을 것이며, 생산에 따른 위험이 감소되고, 바이러스 불활화 과정의 엄격한 통제에 의해 부과되는 것을 넘어서 수혜자에게 추가의 안전성 수준이 제공된다. 선행기술의 동물 배지는 안전성에 문제를 가질 수 있는 감염성 동물 바이러스를 보유할 가능성이 있다. 따라서, 혈청이 없고/동물 성분이 없는 배지를 사용하는 것은 결과의 백신이 동물 유래 병원균으로 오염되지 않도록 보장할 것이다.

2. 안전한 생산 기질에서 증가된 공급: 본 발명의 일본뇌염 백신은 혈청 및 동물 유래 성분의 부재하에 생산되며, 이전의 상업화된 일본뇌염 백신에서는 달성되지 않은 수율이 높고 저렴하며 대규모인 생산을 제공한다.

3. 바람직하지 않은 혈청, 동물 유래 성분들의 제거로 인한 반응유발성의 저하.

4. 효력의 증진 가능성.

5. 상위 및 하위 과정에서 사용되는 표준의 쉽게 이용할 수 있는 배지와 다른 원료의 사용으로 인한 비용 효율성.

6. 혈청 및 동물 유래 성분들의 제거로 인해 많은 국가들에서 허용성 증가.

도 1: 불활화된 일본뇌염 바이러스 Vellore 균주(P20778)에 대해 발생한 토끼 혈청의 면역원성 및 교차반응성. 플라크 감소 중화 시험(PRNT)을 사용하여 얻어진 기능적 항체들의 NT50 값을 각 시험감염 균주에 대해 플롯팅하여, 상이한 일본뇌염 바이러스 균주들의 플라크 형성 단위를 중화하는 혈청의 정량적 능력을 나타낸다.

이들 목적 및 다른 목적에 따라서, 본 발명은 일본뇌염 백신, 더 구체적으로 P20778을 사용한 Vero 세포 유래의 불활화된 일본뇌염 백신의 개발 및 생산을 위한 신규 방법을 제공하며, 상기 방법은 Vero 셀라인을 혈청 및 동물 성분이 없는 배지에 적응시키는 단계; 연속 계대 배양에 의해 Vero 셀라인에서 P20778을 적응시키는 단계; P20778의 마스터 및 작업용 시드 뱅크를 확립하는 단계; 혈청 및 동물 성분이 없는 배지에서 바이러스의 생산적 복제에 허용적인 세포를 배양하는 단계; 세포를 바이러스로 감염시키는 단계; 자손 바이러스가 생산될 때까지 혈청 및 동물 성분이 없는 배지에서 감염된 세포를 배양하는 단계; 배양물로부터 바이러스를 분리한 후에 정제, 불활화 및 제제화하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 혈청 및 동물 성분이 없는 배지에서 바이러스의 생산적 복제에 허용적인 Vero 세포를 배양하는 단계, 세포를 바이러스로 감염시키는 단계, 자손 바이러스가 생산될 때까지 혈청 및 동물 성분이 없는 배지에서 감염된 세포를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 바이러스를 분리하는 단계에 의해서 얻어진 일본뇌염 바이러스 균주 P20778을 제공한다.

본 발명의 가장 바람직한 양태에서, 일본뇌염 바이러스의 인도 균주(P20778)가 잠재적 백신 후보로서 확인되었다. 이 균주는 인도 벨로어의 크리스티안 메디컬 칼리지의 환자로부터 임상적으로 분리되었다. JEV 게놈은 약 11kb의 플러스-센스 단일가닥 RNA이다. 이것은 3432 아미노산 길이의 폴리펩티드 단백질을 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임을 가지며, 이것은 이어서 숙주 세포 프로테아제와 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제에 의해서 동시- 및 후-번역 절단되어, 각 바이러스 단백질을 3개의 구조 단백질, 즉 캡시드(C), 글리코실화된 외피(E) 및 막(M) 단백질과 7개의 비구조 단백질 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5로 산출한다. 글리코실화된 외피 단백질 E는 면역원성이고 중화 항체 반응을 초래하는 것으로 판명되었다. JEV의 게놈은 RNA 분자이므로, 교정(proofreading) 능력을 결여한 RNA 복제 기구로서 전개될 높은 잠재력을 가진다. Vellore P20778 분리주는 10977개의 염기를 가진다. 이것은 프로토타입 바이러스와 비교하여 추가의 염기를 가진다. 추가의 염기는 3-비-코딩 영역(NCR)의 일부로서, 바이러스 폴리단백질의 길이에는 영향을 미치지 않고, 따라서 모든 바이러스 단백질의 예상된 부위는 GP78(인도, 1978) 및 JaOArS982(일본, 1982) 균주와 같은 다른 JEV 균주와 유사하다.

나카야마 균주로부터 제조된 일본뇌염 백신은 Vellore P20778 균주와 더 효과적인 교차 중화를 나타냈으며, 이는 Vellore 균주와 일본의 나카야마 균주의 관계를 입증한다. 다른 흥미로운 발견은 Vellore 균주가 베이징-1 균주와 더 근친인 것으로 판명된 것이다. 따라서, 인도 균주인 Vellore P20778은 잘 특성화되며, 중국 및 일본의 분리주와 계통발생학적으로 근친이다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 바이러스는 Vero 조직 배양 세포에서 증식될 수 있다. Vero 세포는 원숭이 신장에서 유래된 비-종양형성성 세포이다. Vero 셀라인은 다른 표준 셀라인보다 더 유리한데, Vero 세포가 대규모 세포 배양에 더 쉽게 적응될 수 있고, 형질전환된 세포는 무한 수명을 가지기 때문이다. 특정 구체예에서, 사용된 Vero 셀라인은 (WHO-Vero 10-87)이다. 그러나, 본 발명은 상기 언급된 셀라인에만 제한되지 않으며, 당업자에 의해 고려되는 다른 동등물들도 본 발명의 범위 내에 들어간다.

본 발명의 한 바람직한 구체예는 일본뇌염 바이러스 Vellore 균주 P20778을 포함하는 일본뇌염 백신에 관한 것으로서, 상기 바이러스는 Vero 셀라인에서 증식된다. 더 바람직한 구체예에 따라서, Vero 셀라인 (WHO-Vero 10-87)이 바이러스의 증식에 사용된다.

적절한 세포 또는 숙주 시스템의 선택에 더하여, 또한 바이러스 균주가 번식되는 배양 조건이 상업적으로 허용되는 수율의 달성을 위해 상당히 중요하다. 따라서, 원하는 바이러스 균주의 수율을 최대화하기 위해서는 숙주 시스템과 배양 조건이 모두 특이적으로 적응되어서 원하는 바이러스 균주에 대한 유리한 환경 조건을 달성할 수 있어야 한다. 따라서, 바이러스 균주의 높은 수율을 달성하기 위해서는 최적 성장 조건을 만드는 시스템이 필요하다. 효과적인 생산 시스템은 주로 상응하는 배양 시스템의 바이러스 집단의 적응에 기초하며, 주로 다른 숙주 시스템에 의한 중간 단계를 활용하고, 대부분은 동물 기원의 혈청인 단백질 첨가제를 이용한다. 그러나, 본 발명은 혈청이나 동물 성분의 첨가 없이 이러한 결과를 달성한다.

본 발명의 실시에 있어서 유용할 수 있는 혈청이 없는 배지는, 제한할 필요는 없지만 Iscove 배지, Ultra-CHO 배지(BioWhittaker), EX-CELL(JRH Bioscience), SFM4MegaVir 배지 등을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에 따라서, 글루타민 및 젠타마이신술페이트 같은 적합한 첨가제와 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)가 Vero 세포의 증식뿐만 아니라 바이러스의 증식을 위해 선택된 배지로서 사용될 수 있다. 더 바람직한 구체예에 따라서, 약 2-5mM의 안정한 글루타민 및 약 20-100μg/mL의 젠타마이신술페이트와 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)가 사용될 수 있다. 가장 바람직한 구체예에 따라서, 약 4mM의 안정한 글루타민 및 약 70μg/mL의 젠타마이신술페이트와 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)가 사용될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라서, "약"은 본 발명의 백신의 제조 과정에서 사용된 각 성분의 양을 설명하기 위해서 본원에서 사용될 수 있으며, 해당 특정 성분에 대해 언급된 양의 바람직하게 ±20%, 더 바람직하게는 ±10%, 가장 바람직하게는 ±5%의 양으로 존재하는 상기 성분의 양을 의미한다.

단층 배양법이나 현탁 배양법과 같은 세포 배양의 공지된 방법들이 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다.

단층 배양법은 관심의 바이러스와 함께 용기의 안쪽 표면에서 배양된 세포를 성장시키고 감염시킨 다음, 감염된 세포에 스탠딩 배양 또는 롤-스트릭 배양을 행하여, 배양 상청액 중에 바이러스를 제조하는 것이다. 이 목적에 사용되는 용기는 평판 배양 용기 또는 롤-스트릭 배양 플라스크일 수 있다. 용기의 특정한 예들은 페트리 디쉬, T 플라스크, 롤러 보틀 또는 다층 플라스크를 포함한다. 용기의 재료는 플라스틱 같은 유리가 아닌 재질이 바람직하다.

현탁 배양법의 예는 마이크로캐리어 비드를 사용하는 마이크로캐리어 방법이다. 이러한 마이크로캐리어 방법에서는, 세포가 생물반응기(배양 탱크) 안의 마이크로캐리어 비드의 표면에서 복제된 다음, 마이크로캐리어 비드 위의 복제된 세포가 바이러스로 감염되고, 이후 감염된 세포를 배양하여, 배양 용액 중에서 관심의 바이러스를 제조한다. 이러한 마이크로캐리어 비드 재료의 예들은, 제한되지는 않지만 세라믹, 덱스트란, 유리, 실리콘, 플라스틱 및 폴리아크릴아미드를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 구체예는 덱스트란으로 제조된 마이크로캐리어를 사용할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, Cytodex-1 마이크로캐리어 비드가 현탁 배양에 사용될 수 있다.

사용된 마이크로캐리어의 농도는 세포의 성장을 위한 충분한 표면적을 제공하기에 적합해야 한다. 본 발명의 한 바람직한 구체예는 배지 mL당 약 2-4g의 마이크로캐리어를 사용하는 것에 관한 것이다. 가장 바람직한 구체예에 따라서, 배지 mL당 약 3g의 마이크로캐리어가 사용될 수 있다.

Vero 세포 접종물의 준비는 본 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 행할 수 있으며, 세포는 합류점(confluency)까지 성장될 수 있다. 충분한 성장 후, 세포가 수확될 수 있고, 이것을 사용하여 생물반응기에 파종한다. 바람직하게, 생물반응기 파종은 배지 mL당 0.2x 10⁶ 세포 이상의 세포 밀도로 행해질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 발효기 파종은 300x lO⁶ 세포/100OmL SFM4MegaVir 배지/3g Cytodex-1 마이크로캐리어 비드의 세포 수로 행해질 수 있다. 관류 시스템과 배치 시스템은 모두 본 발명의 범위 내에 들어간다. 배지가 계속해서 공급되고 배출되는 배양 시스템을 관류 시스템이라고 한다. 이것의 대안으로서, 세포는 또한 배치 시스템에서 배양될 수 있는데, 이 시스템은 접종에서부터 수확까지는 배지를 공급하지 않는 대부분 닫힌 시스템으로서 운영된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 백신을 위한 일본뇌염 바이러스 균주 P20778을 제조하는 과정이 제공되며, 이것은 다음 단계를 포함한다.

a) 생물반응기에 Vero 세포를 파종하는 단계,

b) 생물반응기 설정 변수에서 합류점까지 세포를 성장시키는 단계,

c) 바이러스 성장 배지에 희석된 일본뇌염 바이러스 균주 P20778로 Vero 세포를 감염시키는 단계,

d) 생물반응기 설정 변수에서 감염된 세포를 인큐베이션하는 단계,

e) 바이러스를 수확한 후, 정화 및 정제하는 단계.

앞서 이미 언급된 대로, 생물반응기에서 Vero 세포를 배양하는데 사용된 바람직한 배지는 글루타민 및 젠타마이신술페이트 같은 적합한 첨가제와 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)이다.

본 출원에서 사용될 수 있는 세포 배양 조건(온도, 세포 밀도, pH 등)은 매우 넓은 범위에 걸쳐 가변적이며, 본 출원의 요건에 맞춰 적응될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 생물반응기 세포 배양은 다음의 생물반응기 설정 변수에서 증식될 수 있다:

RPM: 20-60

온도: 35-37℃

% pO₂(용존 산소의 부분 압력): 30-60%

pH: 7.1-7.4

가장 바람직한 구체예에서, 사용된 설정 변수는 바람직하게는 다음과 같다:

RPM: 40-60

온도: 37℃

% pO₂: 40-60%

pH: 7.2

생물반응기 안의 pH는 적합한 버퍼 시스템을 사용하여 유지될 수 있다. 바람직하게, pH는 7.5% 멸균 중탄산나트륨 용액을 사용하여 유지될 수 있다.

일단 생물반응기 안에서 바람직한 세포 수에 도달되면, 세포는 본 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 일본뇌염 바이러스로 감염될 수 있다. 생물반응기 안의 Vero 세포가 바이러스로 감염될 수 있는 합류 세포의 세포 밀도는 바람직하게는 배지 mL당 약 0.5x 10⁶ 내지 약 2.0x 10⁶ 세포일 수 있다. 세포의 감염에 사용되는 MOI(감염 다중도)는 약 0.01-0.5, 바람직하게는 약 0.1일 수 있다.

구체예들 중 하나에서, 세포 바이오매스로부터 바이러스의 생산을 위한 성장 변수들은 다음과 같이 조정될 수 있다:

RPM: 20-60

온도: 34-37℃

% pO₂: 20-60%

pH: 7.1-7.7

세포 바이오매스로부터 바이러스의 생산에 사용되는 성장 변수들은 본 발명의 바람직한 구체예에 따라서 다음과 같다:

RPM: 40-60

온도: 34℃

% pO₂: 30-60%

pH: 7.4-7.6

또한, 본 발명은 바이러스의 수확 및 분리를 위한 적합한 방법을 제공한다. 바이러스 분리 동안, 세포는 분리, 여과 및 한외여과와 같은 표준 방법에 의해 배양 배지로부터 분리된다. 다음에, 바이러스 또는 단백질이 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피 등과 같은 당업자에게 충분히 공지된 방법에 따라서 농축되고, 이후 정제된다.

생물반응기의 배양 상청액이 생물반응기로부터 적절한 간격으로 수확될 수 있다. 수확은 감염 후 최대 약 168시간까지 24시간 또는 48시간마다 행해질 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 수확은 감염 후 72시간, 96시간, 120시간 및 144시간째에 행해질 수 있다.

수확된 바이러스는 원심분리, 막 여과, 카트리지 여과 또는 중공섬유 여과와 같은 본 분야에 공지된 방법 또는 이들 방법의 조합에 의해서 정화될 수 있다. 정화된 수확물은 그것의 생육성을 상실하지 않을 수 있는 적절한 온도에서 보관될 수 있다. 보관에 사용되는 온도는 바람직하게는 10℃ 이하이다.

바람직한 구체예에서, 수확물은 고속 띠 원심분리를 사용하여 정제될 수 있다.

가장 바람직한 구체예에 따라서, 수크로오스 또는 CsCl2를 0-60%(w/v) 농도의 연속적 또는 단계적 구배로 사용하여 고속 띠 원심분리가 수행될 수 있으며, Mg 이온이 함께 사용되기도 하고, 그렇지 않기도 하며, 조건은 다음과 같다.

a) 수확물 급송 속도는 20ml/분 내지 200ml/분 범위,

b) 최대 원심분리 속도는 97,000 x g,

c) 급송은 한번 또는 2번 재순환,

d) 인산염 완충 식염수를 사용하여 불순물 세척,

e) 중력에 의해서 또는 최대 0.5 bar의 양압을 적용하여 바이러스를 함유하는 분획을 수집.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라서, 바이러스 분획은 접선류 여과 단계를 더 거칠 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 바이러스는 정제 과정에서 또는 정제 후에 불활화된다. 바이러스 불활화는, 예를 들어 정제 과정 도중의 어떤 지점에서 β-프로피오락톤 또는 포름알데히드에 의해서 발생할 수 있다. 불활화제의 농도는 공지된 방법에 의해 최적화될 수 있다. 바람직한 β-프로피오락톤 농도는 1:3000 내지 1:6000(v/v)의 범위일 수 있다. 일반적으로, 이것은 공지된 화학적 또는 물리적 수단에 의해서 달성될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 생산된 불활화된 바이러스는 백신으로 사용하기 위해서 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 제제화될 수 있다. 백신 제제에서 사용하기 위한 수많은 제약학적으로 허용되는 용액들이 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 당업자에 의해서 본 발명에서 사용할 수 있도록 쉽게 적응될 수 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(18th edition)). 바람직하게, 백신은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조된다. 탄수화물(소르비톨, 만니톨, 녹말, 수크로오스, 덱스트란, 글루코오스 등), 버퍼(알칼리 금속 인산염), 다른 부형제, 희석제, 담체 및 애쥬번트와 같은 안정제를 첨가하는 것이 가능하다. 제제는 안정제의 첨가 후에 동결건조될 수 있고, 진공 또는 질소 중에서 보관될 수 있다. 원한다면, 애쥬번트 작용을 하는 하나 이상의 화합물이 첨가될 수 있다. 이 목적을 위한 적합한 화합물은, 예를 들어 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 또는 산화 알루미늄, 미네랄 오일, 에멀젼 및 사포닌이다. 또한, 원한다면, Tween 및 Span과 같은 하나 이상의 유화제가 바이러스 물질에 첨가된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 백신은 알루미늄 애쥬번트 위에 흡착된 불활화된 일본뇌염 바이러스 균주 P20778을 포함한다.

본 발명의 방법을 사용하여 생산된 백신은 일본뇌염 바이러스에 의해 야기된 감염의 치료를 위해서, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 방법을 사용하여, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 양으로 피험자에게 투여될 수 있다.

상응하는 백신의 면역원성 및/또는 효능은 적재 감염에 따른 보호 실험 또는 중화에 필요한 항체 역가의 결정과 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해서 결정될 수 있다.

바이러스 양 또는 생산된 항체의 양의 결정은 바이러스 적정, 적혈구응집 검사, 항원 결정 또는 상이한 타입의 단백질 결정과 같은 당업자에게 충분히 공지된 표준 방법에 따라서 항원의 역가 또는 양을 결정함으로써 행해질 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명과 발명의 이점을 더 예시하기 위해 사용된다. 다음의 특정한 예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위한 것임이 이해되어야 한다.

실시예 1

상위 과정

Vero 셀라인(WHO-Vero 10-87)을 작업용 세포 뱅크의 바이알로부터 증식시켰다. 작업용 세포 뱅크의 확장은 어떤 적합한 용기에서 행해질 수 있다. Vero 세포 증식에 사용된 배지는 4mM의 안정한 글루타민 및 70μg/mL의 젠타마이신술페이트 같은 적합한 첨가제와 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)와 같은 혈청 및 동물 성분이 없는 배지였다. 생물반응기 파종에 사용되는 시드가 배지 mL당 0.2x 10⁶ 세포 이상의 세포 수를 갖는 밀도까지 세포를 성장시켰다. Vero 세포는 생물반응기에서 단층 배양으로서, 또는 덱스트란이나 다른 적합한 재료로 제조될 수 있는 마이크로캐리어와 같은 지지체를 사용한 현탁 배양으로서, 4mM의 안정한 글루타민 및 70μg/mL의 젠타마이신술페이트 같은 적합한 첨가제와 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)와 같은 배지에서 증식될 수 있다. 세포의 해리는 동물 성분이 없는 HyQTase(Hyclone) 용액이나 다른 적합한 세포해리제를 사용하여 행해질 수 있다. 현탁 배양의 경우에, 생물반응기 파종은 30Ox 1O⁶ 세포/100OmL SFM4MegaVir 배지/3g Cytodex-1 마이크로캐리어 비드의 세포 수로 행해질 수 있다. 세포 성장에 바람직한 생물반응기 변수들은 다음과 같다:

RPM: 40-60

온도: 37℃

% pO₂: 40-60%

pH: 7.2

생물반응기 안의 pH는 7.5% 멸균 중탄산나트륨 용액을 사용하여 유지되었다.

시드 로트로부터 일본뇌염 바이러스 P20778을 필요한 부피만큼 덜어서 4mM의 안정한 글루타민 및 70μg/mL의 젠타마이신술페이트 같은 적합한 첨가제와 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)와 같은 적합한 성장 배지에 희석했다. Vero 세포가 합류점에 도달하면 바이러스 현탁액으로 감염시켰다. 필요한 시간 동안 인큐베이션했다. 얻어진 바이러스를 사용하여 생물반응기에서 성장하고 있는 Vero 세포를 감염시켰다.

세포 밀도가 0.5x 10⁶ 내지 2x 10⁶ 세포/ml일 때 Vero 세포의 감염이 행해질 수 있다. 이상적으로, 세포의 감염은 Cytodex-1 마이크로캐리어 비드 상에서 70-90%의 세포 합류점을 나타낼 때 0.5-1.5x 1O⁶ 세포/mL의 세포 수에서 행해질 수 있다. 0.1의 바이러스 MOI(감염 다중도)가 Vero 세포 감염에 이상적이다. 바이러스 생산을 위한 생물반응기 설정 변수는 다음과 같았다:

RPM: 40-60

온도: 34℃

% pO₂: 30-60%

pH: 7.4-7.6

수확물 수집은 이상적으로 감염 후 72시간, 96시간, 120시간 및 144시간째에 행해진다.

하위 과정

상위 과정에서의 수확물은 원심분리, 막 여과 및 카트리지 여과 또는 중공섬유 여과와 같은 공지된 방법을 사용하여 정화된 후, 10℃ 이하의 온도에서 보관될 수 있다. 정화된 수확물(단일 수확물 또는 합쳐진 수확물 - 살아있거나 또는 불활화된)은 수크로오스 또는 CsCl2를 0-60(w/v) 사이의 농도에서 연속적 또는 단계적 구배로 사용하여 고속 띠 원심분리에 의해 정제될 수 있으며, 이때 마그네슘 이온이 2-50mM의 농도로 함께 사용되기도 하고, 그렇지 않기도 하다. 수확물 급송 속도는 20mL/분 내지 200mL/분 범위였다. 원심분리 과정에서 최대 속도는 이상적으로는 97,000 x g여야 한다. 바이러스가 특정 띠에 농축되기까지 걸리는 띠형성 시간은 이상적으로는 20분 내지 240분이다. 상기 언급된 것과 동일하게 설정된 조건에서 유량이 한번 또는 2번 재순환될 수 있다. 상기 언급된 것과 동일한 조건에서 인산염 완충 식염수를 흘려 보내서 불순물을 씻어낼 수 있다. 로터 속도가 늦춰질 수 있으며, 일단 로터가 정지되었다면, 중력에 의해서 또는 최대 0.5 bar까지 양압을 적용함으로써 바이러스가 분획으로 수집될 수 있다.

분석 후 수집된 분획들이 합쳐질 수 있으며, 인산염 완충 식염수로 2배 희석한 후에, TFF 또는 중공섬유 기술의 경우 100KDa 이상의 MWCO를 사용하여 추가 정제 및 버퍼 교환을 행한다. 인산염 완충 식염수(pH 7.0-7.8)로 4 등량 부피를 넘지 않도록 해서 정용여과가 행해질 수 있다. 다음에, 정용여과된 바이러스 샘플은 0.45-0.1 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 바이러스의 불활화는 1:3000 내지 1:6000(v/v)의 농도에서 2-8℃의 온도에서 베타-프로피오락톤을 사용하여 행해질 수 있으며, 계속 교반하면서 120시간을 넘지 않도록 한다. 잔류 베타-프로피오락톤의 가수분해를 위해, 불활화 중인 샘플은 30분 이상의 기간 동안 계속 교반하면서 40℃ 이하의 온도에서 유지될 수 있다. 다음에, 불활화된 바이러스가 0.45-0.1 마이크론 필터를 통해 즉시 여과되고, 이후 알루미늄-기재 애쥬번트 위에 흡착될 수 있다. 다음에, 흡착된 불활화된 바이러스는 4℃ 내지 30℃의 온도에서 보관될 수 있다.

불활화된 일본뇌염 바이러스의 제제화

불활화된 바이러스의 제제화는 본 분야에 공지된 표준 기술에 따라서 수행될 수 있다.

실시예 2

이 실시예는 다양한 일본뇌염 바이러스 균주에 의한 시험감염에 대해서, 본 발명의 백신과 대조 백신을 사용하여 도출된 항체 반응에 있어서 면역원성과 교차반응성을 비교한다.

면역원성 및 교차반응성 시험

토끼의 면역화:

뉴질랜드 흰색 토끼(8-12주)로서 6마리의 수컷과 6마리의 암컷으로 이루어진 그룹을 인산알루미늄과 혼합된 불활화된 JEV 백신으로 피하 면역화했다. 면역화된 토끼에게 초회 주사 후 7일 및 21일째에 초회 용량과 동일한 용량으로 추가 용량을 제공했다. 초회 주사 후 42일째에 동물에서 채혈해서 혈청을 분리하여 -20℃에 보관했다.

시험관내 플라크 감소 중화 시험(PRNT):

혈청을 30분간 56℃에서 인큐베이션하여 보체를 불활화시켰다. 혈청 샘플과 NIBSC 대조 혈청 표준을 2% FBS를 함유한 MEM에서 1:160에서 시작하여 1:5120까지 그리고 1:40에서 시작하여 1:1280까지 각각 2배 희석했다. 다음에, 혈청 샘플(200μL)을 바이러스를 각각 50-150pfu씩 함유하는 상이한 균주, 즉 베이징, GP-78, 나카야마, JaOAr 및 Vellore의 JEV 배양 상청액과 동일한 부피로 혼합했다. 바이러스-항체 혼합물을 15-30분마다 간헐적으로 흔들면서 90분간 36.5±0.5℃에서 인큐베이션한 후, PS 세포의 약 70% 합류 단층을 함유하는 6-웰 배양 평판에 200μL씩 첨가했다. 평판을 CO₂ 인큐베이터(5% CO₂)에서 90분간 36.5±0.5℃에서 인큐베이션했다.

이어서, 웰에서 접종물을 덜어내고, 2% 아가로오스를 함유하는 3mL 오버레이 아가 배지를 웰마다 첨가했다. 평판을 15분간 5±3℃에서 유지하여 오버레이 아가 배지를 고화시켰다. 다음에, 평판을 4-5일간 5% CO₂ 중에서 36.5±0.5℃에서 인큐베이션하여 플라크를 발생시켰다. 각 웰의 플라크를 계수한 후, 고정 및 염색하여 중화 역가 50%(NT50) 값을 계산했다.

면역원성 및 교차반응성 연구 결과:

이 결과로부터 정제되고 불활화된 일본뇌염 바이러스 Vellore(P20778) 균주를 사용하여 제조된 백신이 기능적 항체의 측면에서 토끼에서 면역원성 반응을 도출할 수 있음이 자명하며, 이 기능적 항체들은 상동성 일본뇌염 바이러스 균주뿐만 아니라 이종성 일본뇌염 바이러스 균주를 중화할 수 있고, 따라서 면역원성 및 교차반응성의 증거가 된다.

LD50 연구

스위스 알비노 마우스(4-6주)로서 6마리의 수컷과 6마리의 암컷으로 이루어진 그룹에 상이한 바이러스 균주, 즉 베이징, GP-78, 나카야마, JaOAr 및 Vellore의 상이한 10배 희석물을 각각 뇌내 주사했다. 주사된 마우스를 14일간 사망률에 대해 모니터했다. Read & Muench법에 따라서 LD50 값을 계산했다(Quality Control of Vaccine and Sera, Manual 1993, CRI Kasauli).

얻어진 LD50 값들:

상기 결과는 생체내 마우스 모델에서 상이한 일본뇌염 바이러스 균주들의 병독성 수준을 나타낸다. 베이징 균주가 가장 병독성인 것으로 판명되며, JaOAr 균주가 시험된 균주들 중에서 가장 적은 병독성이 가장 적은 것으로 판명된다.

더 나아가, 동물 혈청의 존재하에 먼저 바이러스를 증식시키고, 이어서 혈청 및 동물 성분이 없는 배지 중에서 제한된 희석에 의해서 몇 회전의 플라크 정제를 수행하여 탈유도체화함으로써 혈청 오염 위험을 줄이는 것도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

Claims

일본뇌염 바이러스 Vellore 균주 P20778을 포함하는 일본뇌염 백신으로, 바이러스가 Vero 셀라인에서 증식된 백신.
제 1 항에 있어서, Vero 셀라인이 WHO-Vero 10-87인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 바이러스가 혈청 및 동물 성분이 없는 배지 중에서 증식된 것을 특징으로 하는 백신.
제 3 항에 있어서, 바이러스 증식에 사용된 배지가 적합한 첨가제(들)과 함께 조제될 수 있는 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)인 것을 특징으로 하는 백신.
제 4 항에 있어서, 배지는 약 2-5mM 글루타민을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 5 항에 있어서, 배지는 약 4mM 글루타민을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 2 항에 있어서, Vero 셀라인 (WHO-Vero 10-87)이 세포 성장을 위한 지지체로서 마이크로캐리어를 사용하여 현탁 배양으로서 증식된 것을 특징으로 하는 백신.
제 7 항에 있어서, 사용된 마이크로캐리어는 세라믹, 덱스트란, 유리, 실리콘, 플라스틱 및 폴리아크릴아미드로 구성되는 군으로부터 선택된 재질로 이루어진 것을 특징으로 하는 백신.
제 8 항에 있어서, 사용된 마이크로캐리어는 덱스트란으로 이루어진 것을 특징으로 하는 백신.
제 9 항에 있어서, 사용된 마이크로캐리어는 Cytodex-1 마이크로캐리어 비드인 것을 특징으로 하는 백신.
a) Vero 세포를 생물반응기에 파종하는 단계;
b) 생물반응기 설정 변수에서 합류점까지 세포를 성장시키는 단계;
c) 일본뇌염 바이러스 균주로 Vero 세포를 감염시키는 단계;
d) 생물반응기 설정 변수에서 감염된 세포를 인큐베이션하는 단계;
e) 바이러스를 수확한 후, 정화 및 정제하는 단계
를 포함하는, 백신을 위한 일본뇌염 바이러스 균주 p20778을 제조하는 방법.
제 11 항에 있어서, Vero 세포의 배양에 사용된 배지는 혈청 및 동물 성분이 없는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 배지는 적합한 첨가제(들)과 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 세포 성장을 위한 생물반응기 설정 변수는 rpm - 20-60; 온도 - 35-37℃; % pO₂ - 30-60% 및 pH - 7.1-7.4인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 합류 세포의 세포 밀도는 약 0.5x 10⁶ 내지 2.0x 10⁶ 세포/mL인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 바이러스 성장 배지는 혈청 및 동물 성분이 없는 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 바이러스 성장 배지는 적합한 첨가제(들)과 함께 조제된 SFM4MegaVir 배지(Hyclone)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 바이러스를 사용한 Vero 세포의 감염은 약 0.01-0.5의 MOI에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 0.1의 MOI를 Vero 세포의 감염에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 감염 후 배양물의 인큐베이션은 rpm - 20-60; 온도- 34-37℃; %pO₂ - 20-60% 및 pH - 7.1-7.7의 생물반응기 설정 변수에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 수확물을 원심분리, 막 여과, 카트리지 여과 및 중공섬유 여과로부터 선택된 기술 중 어느 하나 또는 조합을 사용하여 정화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 수확물을 고속 띠 원심분리에 의해 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 고속 띠 원심분리는
a) Mg+2 이온을 함께 사용하거나 사용하지 않는 0-60%(w/v) 농도의 수크로오스 또는 CsCl2의 연속적 또는 단계적 구배,
b) 20mL/분 내지 200mL/분 범위의 수확물 급송 속도,
c) 97,000 x g의 최대 원심분리 속도,
d) 한번 또는 2번 재순환되는 급송,
e) 인산염 완충 식염수를 사용한 불순물 세척, 및
f) 바이러스 함유 분획의 중력에 의한 또는 최대 0.5 bar의 양압을 적용함에 의한 수집
을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 바이러스 분획이 추가의 접선류 여과 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
베타-프로피오락톤을 사용하여 일본뇌염 바이러스 균주 P20778을 불활화하는 방법.
제 25 항에 있어서, 불활화는 120시간을 넘지 않는 시간 동안 2-8℃의 온도에서 1:3000 내지 1:6000(v/v)의 베타-프로피오락톤 농도에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 30분 이상의 시간 동안 40℃ 이하의 온도에서 불활화 샘플 중에 잔류한 베타-프로피오락톤을 가수분해하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 선택적으로 다른 부형제, 희석제, 안정제, 담체 및 애쥬번트와 함께, 불활화된 일본뇌염 바이러스 균주 P20778을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 알루미늄 애쥬번트에 흡착된 불활화된 일본뇌염 바이러스 균주 P20778을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
전술한 항들 중 어느 한 항에 따른 백신을 피험자에게 투여함으로써 일본뇌염 바이러스에 의해 야기된 감염을 치료하는 방법.