CN101979517B - 一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用生物反应器进行大规模生产流感病毒的方法。包括(1)将传代细胞悬液接种于载体罐中，设定生物反应器的参数进行细胞吸附与培养过程。细胞吸附与培养过程使用含血清培养液进行；(2)待细胞生长至合适密度时，对细胞进行浸洗以去除血清成分，再将流感病毒液接种到载体罐中，设定生物反应器的参数进行病毒吸附与增殖过程。病毒吸附与增殖过程使用含TPCK胰酶的无血清培养液进行；(3)病毒液的收获。本发明的优点是，采用了潮汐式生物反应器，利用传代细胞繁殖流感病毒，可以获得高滴度的病毒液。本发明方法克服了传统转瓶培养及其它生物反应器的缺点，可以大规模连续生产高滴度病毒。

Description

一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种生产流感病毒的方法。更具体地说，本发明涉及一种利用潮汐式生物反应器进行流感病毒大规模生产的方法。

背景技术

流感病毒属于正黏病毒科，根据其内部蛋白(主要是NP蛋白和M1蛋白)的血清学反应情况，可分为A(甲)、B(乙)和C(丙)三个型(属)。B和C型流感病毒主要感染人，极少情况下感染海豹和猪，但从来没有在鸟类中分离到。A型流感病毒可根据糖蛋白HA和NA的血清学反应情况进一步分为16个HA亚型和9个NA亚型。由16个HA亚型和9个NA亚型组合的大部分流感病毒亚型主要存在于禽类和动物中，其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。禽流感病毒根据其致病力又有高致性和低致病性之分。世界各地发生的高致病性禽流感主要以H5和H7亚型为主，致死率高，一旦发生往往造成巨大经济损失。而低致病性禽流感，如H9亚型，也可以引起家禽的生产性能下降，并在混合感染的情况下造成一定死亡。另因其传播效率高，流行范围广，也造成巨大危害。目前，使用病毒灭活疫苗仍然是防制流感疫情发生的重要手段。

使用鸡胚培养流感病毒是目前制备人和禽流感灭活疫苗的主要方法，但这种生产体系存在一定程度的缺陷：用鸡胚传代流感病毒易引起病毒的抗原性变异；大规模生产时存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污染的问题；病毒液(即鸡胚尿囊液)中存在着大量的杂蛋白影响疫苗的安全性和稳定性等。

以哺乳动物细胞为基质制备流感病毒疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好维持病毒抗原稳定等优点，常用的有MDCK(Madin-Darby canine kidney，Madin-Darby犬肾)细胞系和Vero(非洲绿猴肾)细胞系等。流感病毒在MDCK细胞系中增殖稳定、适应性较强，而且MDCK细胞系贴附依赖性细胞，可以应用于载体或微载体大规模培养流感病毒。

李春艳等(见文献：微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究，中国人兽共患病学报，2009，25(12)，1149-1153)曾研究应用微载体进行MDCK细胞的规模化培养并增殖H9N2亚型禽流感病毒，但技术方案中是将MDCK细胞置于转瓶中，而不是于生物反应器中进行培养。其与传统的无载体转瓶培养方式相比，虽在一定程度上提高了细胞培养密度，降低了劳动强度，但这种技术方案也存在着一些与传统的转瓶培养所共有缺点：(1)转瓶细胞培养，不能对培养液的养分、pH及溶氧等培养条件进行实时调整，因此无法保证细胞处于最佳培养状态；(2)转瓶细胞培养，操作程序繁琐，有污染风险的暴露点多，生产工艺难放大；(3)转瓶细胞培养，批间差异大，生产质量难以控制，产品质量不稳定。可见，使用转瓶的培养方式已经制约了流感病毒的规模化培养。

近年来，不少研究者开始尝试用生物反应器替代转瓶，培养细胞并增殖流感病毒。现有技术中，用于培养贴附依赖性真核细胞的生物反应器均需要借助载体或微载体来提供细胞赖以贴附与生长的表面。微载体是指直径在60～250μm，能供细胞贴附与生长的微珠。此微载体必须与具有搅拌或充气能力的设备结合，在培养液内随着轻柔的搅拌而悬浮于器皿中，其中搅拌是为了确保所有细胞皆能分配到同量的营养。

中国专利CN1807599A中报道了一种用自制的生物反应器培养MDCK或Vero细胞以生产病毒(包括流感病毒)的方法。中国专利CN101627113A中报道了一种在单次使用生物反应器中培养新型MDCK细胞，并增殖病毒(包括流感病毒)的方法。中国专利CN101062411A中报道了一种使用固定床篮式搅拌生物反应器及悬浮培养生物反应器培养Vero细胞并增殖流感病毒的方法。中国专利CN101094915A中报道了一种使用灌流式(含倾析器)的生物反应器以培养MDCK衍生细胞系，并生产人流感疫苗病毒的方法。以上4例报道中所用反应器的培养方式均为搅拌式而非潮汐式，即通过搅拌的方式使培养基达到均质，以促使细胞的新陈代谢。然而，这种搅拌的培养方式所产生的高剪切力会导致细胞损耗率高，进而影响到生物反应器的生产效率及细胞产量。

中国专利CN1433472的实施例8及实施例9中使用了中空纤维灌流生物反应器增殖人体细胞，并生产流感病毒的方法。其中所用的人体细胞为非贴附依赖型细胞，是通过悬浮方式培养培养的，而没有借助于载体或微载体进行培养。因此这种培养方式也不能实现载体或微载体培养所具有的高密度优点，其生产工艺亦存在着高成本、难以放大的缺点。

目前可用于增殖流感病毒的大多数传代细胞，如MDCK或Vero细胞等，均为动物细胞，细胞外层为质膜，脆性大，因此在反应器中应务必减少剪切力。而在现有技术中，用于培养这些传代细胞并生产流感病毒的生物反应器多采用搅拌或充气的方式，其主要是考虑减少代谢产物的积累和营养的均衡，但是搅拌或充气所产生高剪切力不可避免地对细胞造成损伤，并影响到之后的病毒增殖。也有一些培养方式，如使用中空纤维的生物反应器进行非贴附依赖细胞悬浮培养，虽能适当降低剪切力的影响，但却存在着细胞密度低、成本高、工艺不易放大，技术原理复杂等缺陷。潮汐式生物反应器可有效避免剪切力对细胞活力产生的不良影响，而且工艺容易放大。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种利用潮汐式生物反应器来培养传代细胞并增殖流感病毒的方法。

本发明至少克服了现有技术中的如下缺点：

(1)克服了转瓶细胞培养，不能对培养液的养分、pH及溶氧等培养条件进行实时调整，无法保证细胞处于最佳培养状态的缺点；

(2)克服了转瓶细胞培养，操作程序繁琐，有污染风险的暴露点多，生产工艺难放大的缺点；

(3)克服了转瓶细胞培养，批间差异大，生产质量难以控制，产品质量不稳定的缺点；

(4)克服了搅拌或充气式生物反应器高剪切力所致的细胞损耗率高的缺点；

(5)克服了利用中空纤维式生物反应器进行非贴壁依赖型细胞悬浮培养的低密度、高成本、工艺不易放大等缺点；

本发明通过对利用潮汐式生物反应器培养传代细胞并增殖流感病毒的各环节工艺进行不断地摸索与改进，克服了一系列问题，最终成功地利用潮汐式生物反应器来培养传代细胞并生产出高滴度的流感病毒。

因此，本发明提供了一种流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)细胞的接种和吸附培养：将哺乳动物细胞接种到潮汐式生物反应器载体罐(8)内的载体(9)上，进行细胞的吸附培养；

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养；

3)将流感病毒接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；

4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；和

5)在病毒含量达峰值后，收获含有流感病毒的培养液，其中步骤1)至4)中的培养在潮汐培养条件下进行，所述潮汐培养条件是通过泵出或泵入载体罐(8)内的培养液以间歇性淹没与暴露载体(9)实现的。

优选的是，所述载体罐(8)与装有培养液的培养液袋(6)以能够将培养液袋内的培养液泵入载体罐中和能将载体罐内的培养液泵入培养液袋中的方式相联通。

其中，所述载体罐中的载体由选自多糖类、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、明胶、玻璃、纤维素、聚乙烯和塑料中的一种或多种制成。优选的是，所述载体罐中的载体是台湾CESCO Bioengineering公司生产的“BioNOC II”载体。优选的是，所述载体罐中的载体占载体罐容积的40％～100％(V/V)。更优选的是，所述的潮汐式生物反应器载体罐容积为2～200L。

在本发明提供的流感病毒的大规模生产方法中，所述流感病毒是A型流感病毒或B型流感病毒。优选的是，所述的A型流感病毒为选自H1、H3、H5、H7和H9亚型中的一种。优选为选自H9N2、H1N1、H5N3、H7N2和H3N2亚型中的一种。

在本发明提供的流感病毒的大规模生产方法中，步骤3)中的病毒接种按照感染复数为0.001～1进行，优选按照感染复数为0.01～0.1进行。

在本发明提供的流感病毒的大规模生产方法中，所述哺乳动物细胞为MDCK细胞系或Vero细胞系。

优选的是，在步骤1)中以0.5×10⁷～5×10⁷cells/g载体的终密度接种细胞。优选在步骤2)中的细胞扩增培养达到0.7×10⁸～10×10⁸cells/g载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。

在本发明提供的流感病毒的大规模生产方法中，步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用含2％～10％(V/V)牛血清的细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用无血清的细胞培养液，其中所述的细胞培养液为选自DMEM、MEM、α-MEM、EMEM、1640、M199、F10和F12中的一种，所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。优选所述的无血清的细胞培养液中添加了TPCK胰酶，优选添加的TPCK胰酶浓度为0.5～10mg/L。最优选的是，所述无血清的细胞培养液中添加的TPCK胰酶浓度为1～5mg/L。

在本发明提供的流感病毒的大规模生产方法，步骤1)中所述的细胞吸附培养和步骤3)所述病毒吸附培养中设定载体罐与培养液袋的换液量为载体罐容积的5％～20％。步骤2)中所述的细胞扩增培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养设定换液量为载体罐容积的60％～90％。步骤1)～步骤4)载体罐中培养液的液面上下行速度为0.5～50L/分钟，液面在载体上下端点停滞时间为0～150分钟。步骤1)和步骤3)中程序运行均为60～240分钟。

在本发明提供的流感病毒的大规模生产方法中，在步骤1)～步骤4)的培养过程中控制葡萄糖含量范围为0.5～5g/L。步骤1)～步骤4)中所述的培养在温度30.5～37.5℃，pH调节7.0～7.5，溶氧调节20％～80％，二氧化碳浓度为0％～10％的条件下进行。

技术效果

本发明打通了利用潮汐式生物反应器进行传代细胞培养，并增殖流感病毒的工艺流程。本发明的技术方案不但能够克服使用转瓶培养传代细胞并增殖流感病毒的缺陷，还能够克服其它类型生物反应器高剪切力，工艺不易放大、高成本等缺点。具有细胞培养条件实时可控、病毒产量高、污染率低、操作简单、稳定性好，无外源因子污染、易于规模化生产的优点。本发明使流感病毒的规模化生产工艺得以显著提升。

附图说明

图1为本发明所使用的Tidecell潮汐式生物反应器结构图。该生物反应器的主要组成部分包括：1进料桶、2收料桶、3自动馈料仪、4pH/DO监控器、5恒温振荡箱、6培养液袋、7电脑控制器、8载体罐、9载体、10恒温培养舱、11进/取样管。

具体实施方式

本发明的技术方案主要包括以下步骤：

(1)细胞接种、吸附与培养

将传代细胞悬液以0.5×10⁷～5×10⁷cells/g载体的终密度接种于载体罐中，设定生物反应器的参数进行细胞吸附与培养过程。细胞吸附与培养过程使用含血清培养液进行。

(2)病毒接种、吸附与增殖

待细胞生长至0.7×10⁸～10×10⁸cells/g载体的密度时，对细胞进行一次浸洗，以去除血清成分，再将流感病毒液接种到载体罐中，设定生物反应器的参数进行病毒吸附与增殖过程。病毒吸附与增殖过程使用含TPCK(N-tosyl-L-phenylalnyl chloromethyl ketone，甲苯磺酰苯丙氨酰氨甲酮)胰酶(例如由Sigma-Aldrich公司生产的“Trypsin TPCK treated from bovine pancreas”，货号T3053)的无血清培养液进行。

(3)病毒收获

病毒液中病毒含量达峰值后，进行病毒液的收获。

较佳的，步骤(1)中的传代细胞是贴壁生长的MDCK细胞系(例如由美国标准培养物收藏中心(ATCC)保藏的MDCK(NBL-2)细胞系，保藏号CCL-34)，或Vero细胞系(例如由ATCC保藏的Vero细胞系，保藏号CCL-81)。

较佳的，在步骤(1)中使用的培养液为含2％～10％(V/V)牛血清(例如PAA公司生产的胎牛血清，货号15-151，批号A15109-1236)的培养液(例如用由Invitrogen公司生产的“Dulbecco’sModified Eagle Medium”(DMEM)培养基，货号12800-82，批号309313，按照产品说明书配制成培养液)。

较佳的，步骤(1)中所述的载体为台湾CESCO Bioengineering公司生产的“BioNOC II”载体，在载体罐中的加入量为50～70g/L。

较佳的，步骤(2)中病毒感染细胞时的感染复数(Multiplicity ofInfection，M.O.I.)为0.001～1，优选0.01～0.1。

在本发明中，所用的流感病毒包括但不限于A型流感病毒中的特定亚型(如A型流感病毒中的H1、H3、H5、H7、H9亚型)及B型流感病毒，还可用于增殖其它型或亚型流感病毒。

在本发明中，用于配制细胞培养液的培养基包括但不限于DMEM或MEM，还可使用其它细胞培养基配制，如EMEM、α-MEM、1640、M199、F10、F12等。

在本发明中，所用的牛血清包括胎牛血清和新生牛血清两种。

本发明实施例中使用了Tidecell潮汐式生物反应器，结构见图1，其主要组成部分包括：进料桶、收料桶、自动馈料仪、pH/DO监控器、恒温振荡箱、培养液袋、电脑控制器、载体罐、载体、恒温培养舱、进/取样管。各组成部分的主要功能如下：

载体罐放置于恒温培养舱中，恒温培养舱为载体罐提供一个恒温的环境。载体罐是细胞培养与病毒增殖的场所，细胞贴附生长在载体罐内部的载体上，当培养液泵入载体罐时，载体罐内的培养液液面上升并淹没细胞，向细胞供给养分，并将细胞的新陈代谢产物从细胞上去除。当载体罐内的培养液被泵出时，载体罐中的培养液液面随之下降，细胞露出，进行通风供氧。这个重复的运动使载体上的细胞能够得到足够的营养和氧气，同时产生的代谢废物如CO₂能够有效地被排出去。

载体罐的盖子上装有数根管道，这些管道的作用包括：人工手动方式向载体罐内注入液体(如接种细胞悬液等)或排出载体罐内的液体；由电脑控制器向载体罐注入气体，气体通常是压缩空气、氧气及CO₂三种的混合物，三种气体在混合物中的比例可以自动调节控制，以适应细胞培养需要。电脑控制器可自动控制混合气体向载体罐内的注入与排出，并为潮汐提供动力。

培养液袋用以盛装培养液，并通过管道与载体罐底部相通，通过与载体罐之间的液体流动，从而完成潮汐过程。培养液在潮汐过程中的灌流速度可通过电脑控制器进行调整。培养液的换液量是指在一次潮汐过程中，泵入或泵出载体罐的液体量，换液量的大小决定了载体罐内液面顶部和底部所处的位置。

在培养液袋与载体罐之间相连通的管道上设有进/取样管，可使用无菌注射器通过进/取样管对培养液进行取样，用以检测其中的葡萄糖含量及病毒含量等指标。

恒温振荡箱通过加热与振荡，来维持培养液袋内培养液温度的恒定及成分的匀质性。

收料桶及进料桶均通过自动馈料仪与培养液袋相连，培养液袋内的培养液需要进行收获时，可通过自动馈料仪进入收料桶，而进料桶内的培养液则可以通过自动馈料仪对培养液袋进行补充。

pH/DO监控器可以监测培养液袋内培养液的酸碱度(pH)及溶氧(DO)(溶氧是指氧气在培养液中的溶解饱和度)，并通过向培养液袋内自动注入碱性溶液(如NaOH溶液或NaHCO₃溶液)将培养液的pH值控制在合适范围内。

电脑控制器可以调节控制多种参数，如潮汐过程中载体罐内培养液的潮汐速率及频率、恒温培养舱的温度、溶氧、CO₂浓度(指载体罐内液面上方的混合气体中CO₂所占的体积百分比)等。

对培养液中葡萄糖含量的调节是通过人工方式进行，根据对培养液中剩余葡萄糖的含量测定结果及培养液的总体积计算出需补加的葡萄糖量，然后通过注射器将高浓度的葡萄糖溶液从进/取样管处注入培养液。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1

流感病毒：H9N2亚型流感病毒HN株(见文献：禽流感病毒(H9N2亚型，HL株)与国内部分省禽流感病毒(H9亚型)流行株抗原相关性及交互免疫的研究，2007年畜牧兽医学会年会论文集，2007，35-38)，申请人持有此毒株，并愿意按专利法相关规定自申请日起20年内向公众发放。

生物反应器及载体：Tidecell潮汐式生物反应器(载体罐体积为20L)及“BioNOC II”载体，均购自台湾CESCO Bioengineering公司。

传代细胞系：MDCK(NBL-2)(该细胞系以保藏号CCL-34保藏于ATCC，详见http://www.atcc.org)。

无血清细胞培养液：使用DMEM培养基(Invitrogen公司生产，货号12800-82，批号309313)按照产品说明书配制而成，pH值调节至7.2；

含8％(V/V)血清的细胞培养液：使用DMEM培养基(Invitrogen公司生产，货号12800-82，批号309313)按照产品说明书配制，其中添加8％(V/V)的胎牛血清(PAA公司生产，货号15-151，批号A15109-1236)，pH值调节至7.2；

含TPCK胰酶的无血清细胞培养液：使用DMEM培养基(Invitrogen公司生产，货号12800-82，批号309313)按照产品说明书配制，其中添加TPCK胰酶(Sigma-Aldrich公司生产，货号T3053)至终浓度为2mg/L，pH值调节至7.2。

CVD细胞核计数试剂盒：购自台湾CESCO Bioengineering公司，货号AB0100，批号3007。

0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml去离子水中，用1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.2，最后加去离子水定容至1L，121℃高压蒸气灭菌30分钟，室温保存。

葡萄糖溶液：将葡萄糖(购自SIGMA公司，货号7021，批号MFCD00063774)用去离子水配制成30％(W/V)的浓度，过滤除菌。

碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液：将NaHCO₃(购自SIGMA公司，货号S-4019)用去离子水配制成7.5％(W/V)的浓度，过滤除菌。

葡萄糖测定仪：购自台湾CESCO Bioengineering公司。

(1)细胞接种、吸附与培养

将1200g“BioNOC II”载体(体积约为20L)加入生物反应器的载体罐中，再加入19L PBS(0.01mol/L，pH7.2)完全浸没载体，浸泡过夜。然后将载体罐连同其中的载体及PBS一并经高压蒸汽灭菌(121℃，30分种)，灭菌后冷却至常温，将PBS排出载体罐；培养液袋放到恒温振荡箱内，将30L含8％(V/V)血清的细胞培养液注入培养液袋中，设定恒温振荡箱的温度为37℃，振荡转速为50转/分；

将15L浓度为2.0×10⁹cells/L的MDCK细胞悬液接种于载体罐中(可刚好淹没载体，即细胞起始浓度相当于2.5×10⁷cells/g载体)，将载体罐放入恒温培养舱，通过电脑控制器设定参数，进行细胞吸附过程。

细胞吸附过程中，通过电脑控制器将载体罐内液面潮汐相关参数设定为：液面上升速率(up rate)2500ml/分，顶部停留时间(topholding time)30秒；液面下降速率(down rate)2500ml/分，底部停留时间(bottom holding time)30秒，进行细胞吸附；通过电脑控制器设定培养液的换液量为2L，培养温度为37℃，CO₂浓度为5％自动调节，溶氧为20％～80％自动调节。培养液的pH值由pH/DO监控器自动控制在7.2±0.2(pH调节液为7.5％(W/V)NaHCO₃溶液)，葡萄糖含量控制在1000～3000mg/L；细胞吸附过程持续200分钟。

吸附过程结束后，通过电脑控制器将载体罐内液面潮汐相关参数的更改为：液面上升速率1900ml/分，顶部停留时间30秒；液面下降速率1900ml/分，底部停留时间30秒，进行细胞培养；通过电脑控制器设定培养液的换液量为15L，培养温度为37℃，CO₂浓度为5％自动调节，溶氧为65％自动调节，pH值为7.2±0.2自动调节，葡萄糖含量控制在1000～3000mg/L(每24小时从进/取样管处取样，并使用葡萄糖测定仪进行含量检测，当含量低于1000mg/L时，用30％(W/V)葡萄糖溶液从进/取样管处补加，使浓度恢复至3000mg/L)。

细胞接种之后每间隔12小时，用经灭菌的载体取样棒从载体罐中对载体进行一次取样，使用CVD细胞核计数试剂盒并按照产品说明书进行细胞核计数，监测细胞生长密度。细胞接种后96小时，密度已达到4.0×10⁸cells/g载体，可用于病毒接种。

(2)病毒接种、吸附、增殖与收获

泵出载体罐中的含8％(V/V)血清的细胞培养液，加入15L无血清细胞培养液，对细胞浸洗30分钟，再将无血清细胞培养液从载体罐中泵出；将培养液袋中的原培养液弃去，更换为含TPCK胰酶的无血清细胞培养液。

将HN株H9N2亚型流感病毒液接种到载体罐中，病毒接种时的M.O.I.为0.03。

病毒吸附过程中，通过电脑控制器将载体罐内液面潮汐相关参数设定为：液面上升速率2500ml/分，顶部停留时间30秒；液面下降速率2500ml/分，底部停留时间30秒。病毒吸附过程持续200分钟，促进流感病毒吸附于传代细胞。

病毒吸附过程结束后，通过电脑控制器将载体罐内液面潮汐相关参数的更改为：液面上升速率1900ml/分，顶部停留时间30秒；液面下降速率1900ml/分，底部停留时间30秒，进行病毒增殖。

病毒吸附与增殖过程中，通过电脑控制器设定培养液的换液量分别为2L和15L，培养温度为37℃，CO₂浓度为3％自动调节，溶氧为45％自动调节；培养液的pH值由pH/DO监控器控制在7.2±0.2自动调节，葡萄糖含量控制在1000～3000mg/L。

从病毒接种后的24小时开始，每间隔12小时从进/取样管处对培养液(即病毒液)进行一次取样，用血凝试验法检测病毒液的HA滴度。在HA滴度达到峰值后的12小时，通过自动馈料仪收获病毒液到收料桶内。收获时，载体罐内需存留部分病毒液(以完全浸没载体为宜)，罐体内的病毒液经反复冻融3次后，合并收获至收料桶内)。

共收获病毒液50L，经检测，HA为1∶1024，病毒含量为10^8.8TCID₅₀/ml。

实施例2

流感病毒：H1N1亚型流感病毒(该毒株参见中国专利CN1644686A，该毒株以保藏号CGMCC No.1014保藏于中国普通微生物保藏管理中心)。

无血清细胞培养液：使用MEM培养基(GIBCO公司生产，货号61100-087，批号678277)按照产品说明书配制而成，pH值调节至7.2。

含8％(V/V)血清的细胞培养液：使用MEM培养基(GIBCO公司生产，货号61100-087，批号678277)按照产品说明书配制，其中添加8％(V/V)的新生牛血清(GIBCO公司生产，货号16010-14，批号693745)，pH值调节至7.2。

含TPCK胰酶的无血清细胞培养液：使用MEM培养基(GIBCO公司生产，货号61100-087，批号678277)按照产品说明书配制，其中添加TPCK胰酶(Sigma-Aldrich公司生产，货号T3053)至终浓度为2mg/L，pH值调节至7.2。

本实施例中所使用的其它试剂与材料同实施例1。

除以下两点外，本实施例中所采用的步骤、方法及各培养阶段的参数与实施例1基本相同。不同之处为：

(1)病毒接种时的M.O.I.为0.01；

(2)从病毒接种前2小时至病毒最终收获，培养温度(即通过更改恒温培养舱及恒温振荡箱的温度设定值)由37℃降为33℃。

最终收获病毒液50L，经检测，HA为1∶512；病毒含量为10^8.3TCID₅₀/m1。

实施例3

流感病毒：H5N3亚型流感病毒(该毒株参见中国专利CN1884498A，该毒株以保藏号CGMCC No.1339保藏于中国普通微生物保藏管理中心)。

含TPCK胰酶的无血清细胞培养液：使用DMEM培养基(Invitrogen公司生产，货号12800-82，批号309313)按照产品说明书配制，其中添加TPCK胰酶(Sigma-Aldrich公司生产，货号T3053)至终浓度为1mg/L，pH值调节至7.2。

本实施例中所使用的其它试剂与材料同实施例1。

本实施例中所采用的步骤、方法及各培养阶段的参数与实施例1同。

最终收获病毒液50L，经检测，HA为1∶1024，病毒含量为10^8.5TCID₅₀/ml。

实施例4

(1)流感病毒选择：H7N2亚型流感病毒(该毒株参见中国专利CN1746298A，该毒株以保藏号CCTCC-V200415保藏于中国典型培养物典藏中心)。

含TPCK胰酶的无血清细胞培养液：使用DMEM培养基(Invitrogen公司生产，货号12800-82，批号309313)按照产品说明书配制，其中添加TPCK胰酶(Sigma-Aldrich公司生产，货号T3053)至终浓度为1mg/L，pH值调节至7.2。

本实施例中所使用的其它试剂与材料同实施例1。

本实施例中所采用的步骤、方法及各培养阶段的参数与实施例1同。

最终收获病毒液50L，经检测，HA为1∶1024，病毒含量为10^8.6TCID₅₀/ml。

实施例5

流感病毒：H3N2亚型流感病毒(该毒株参见中国专利CN101560503A，该毒株以保藏号CCTCC-V200514保藏于中国典型培养物典藏中心)。

传代细胞系：Vero细胞系(该细胞系以保藏号CCL-81保藏于ATCC，详见http://www.atcc.org)。

含TPCK胰酶的无血清细胞培养液：使用DMEM培养基(Invitrogen公司生产，货号12800-82，批号309313)按照产品说明书配制，其中添加TPCK胰酶(Sigma-Aldrich公司生产，货号T3053)至终浓度为5mg/L，pH值调节至7.2。

本实施例中所使用的其它试剂与材料同实施例1。

除以下两点外，本实施例中所采用的步骤、方法及各培养阶段的参数与实施例1基本相同。不同之处为：

(1)病毒接种时的M.O.I.为0.05；

(2)从病毒接种前2小时至病毒最终收获，培养温度(即通过更改恒温培养舱及恒温振荡箱的温度设定值)由37℃降为33℃。

最终收获病毒液50L，经检测，HA为1∶512；病毒含量为10^8.6TCID₅₀/ml。

实施例6

流感病毒：B型流感病毒(该毒株参见中国专利CN101619306A，该毒株以保藏号CGMCC No.2931保藏于中国普通微生物保藏管理中心)。

传代细胞系：Vero细胞系(该细胞系以保藏号CCL-81保藏于ATCC，详见http://www.atcc.org)。

本实施例中所使用的其它试剂与材料同实施例1。

除以下两点外，本实施例中所采用的步骤、方法及各培养阶段的参数与实施例1基本相同。不同之处为：

(1)病毒接种时的M.O.I.为0.1；

(2)从病毒接种前2小时至病毒最终收获，培养温度(即通过更改恒温培养舱及恒温振荡箱的温度设定值)由37℃降为33℃。

最终收获病毒液50L，经检测，HA为1∶1024；病毒含量为10^8.8TCID₅₀/ml。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)细胞的接种和吸附培养：将哺乳动物细胞接种到潮汐式生物反应器载体罐(8)内的载体(9)上，进行细胞的吸附培养；

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养；

3)将流感病毒接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；

4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；和

5)在病毒含量达峰值后，收获含有流感病毒的培养液，

其中步骤1)至4)中的培养在潮汐培养条件下进行，所述潮汐培养条件是通过泵出或泵入载体罐(8)内的培养液以间歇性淹没与暴露载体实现的。

2.根据权利要求1所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐(8)与装有培养液的培养液袋(6)以能够将培养液袋内的培养液泵入载体罐中和能将载体罐内的培养液泵入培养液袋中的方式相联通。

3.根据权利要求1所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐中的载体由选自多糖类、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、明胶、玻璃、纤维素、聚乙烯和塑料中的一种或多种制成。

4.根据权利要求3所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐中的载体是台湾CESCO Bioengineering公司生产的“BioNOC II”载体。

5.根据权利要求1所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐中的载体占载体罐容积的40％～100％(V/V)。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的潮汐式生物反应器载体罐容积为2～200L。

7.根据权利要求1～5任一项所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述流感病毒是A型流感病毒或B型流感病毒。

8.根据权利要求7所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的A型流感病毒为选自H1、H3、H5、H7和H9亚型中的一种。

9.根据权利要求8所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的A型流感病毒为选自H9N2、H1N1、H5N3、H7N2和H3N2亚型中的一种。

10.根据权利要求9所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤3)中的病毒接种按照感染复数为0.001～1进行。

11.根据权利要求10所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤3)中的病毒接种按照感染复数为0.01～0.1进行。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为MDCK细胞系或Vero细胞系。

13.根据权利要求12所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤1)中以0.5×10⁷～5×10⁷个细胞/克载体的终密度接种细胞。

14.根据权利要求13所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤2)中的细胞扩增培养达到0.7×10⁸～10×10⁸个细胞/克载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。

15.根据权利要求14所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用含2％～10％(V/V)牛血清的细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用无血清的细胞培养液，其中所述的细胞培养液为选自DMEM、MEM、α-MEM、EMEM、1640、M199、F10和F12中的一种，所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。

16.根据权利要求15所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的无血清的细胞培养液中添加了TPCK胰酶。

17.根据权利要求16所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述无血清的细胞培养液中添加的TPCK胰酶浓度为0.5～10mg/L。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述无血清的细胞培养液中添加的TPCK胰酶浓度为1～5mg/L。

19.根据权利要求13～18中任一项所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤1)中所述的细胞吸附培养和步骤3)所述病毒吸附培养中设定载体罐与培养液袋的换液量为载体罐容积的5％～20％；步骤2)中所述的细胞扩增培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养设定换液量为载体罐容积的60％～90％；步骤1)～步骤4)载体罐中培养液的液面上下行速度为0.5～50L/分钟，液面在载体上下端点停滞时间为0～150分钟；步骤1)和步骤3)中程序运行均为60～240分钟。

20.根据权利要求19所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤1)至步骤4)的培养过程中控制葡萄糖含量范围为0.5～5g/L。

21.根据权利要求20所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤1)至步骤4)中所述的培养在温度30.5～37.5℃，pH调节7.0～7.5，溶氧调节20％～80％，二氧化碳浓度为0％～10％的条件下进行。

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