CN108977358B - 一种封闭式生物反应器及其细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种封闭式生物反应器，包括溶液容器、收集容器、生物反应罐、进液管道和出液管道，所述进液管道和出液管道上各具有一个四通。本发明还公开了封闭式生物反应器的细胞培养方法，包括预培养；生物反应器细胞接种；生物反应器细胞灌流培养；生物反应器病毒接种；生物反应器洗换；生物反应器病毒灌流培养。本发明可实现生物反应器灌流培养，实现快速的换液，并方便清洁高压，可多次重复使用，节约了生产成本，也可以降低污染风险和提高工作效率，本发明提出的封闭式生物反应器及其细胞培养方法，取代了现有方法单一管道进行生物反应器的生产操作，不仅有效保证了疫苗生产中的无菌要求，而且操作简便，适合固定床生物反应器大规模培养。

Description

一种封闭式生物反应器及其细胞培养方法

技术领域

本发明涉及生物制药的技术领域，尤其涉及一种封闭式生物反应器及其细胞培养方法。

背景技术

在生物制品的生产中，进行大规模细胞培养通常需要用到生物反应器。传统的生物反应器培养大多数是补料分批培养，但是近年来，对连续工艺的兴趣在不断增加。与批量或补料分批培养相比，灌流培养可以给予细胞生长更好的营养和环境，从而使细胞能达到更好的状态，最后能达到更高的细胞密度以及相应更高的单位蛋白产率。这样带来的好是，灌流培养可以获得多一个数量级的目的产物。

疫苗生产工艺中无菌的控制非常重要，将直接影响产品的质量，在疫苗生产的每一步都需要严格做好无菌操作。现有的生物反应器灌流培养需要用到大量的培养液以及产生大量的培养废液和收获液，这些对无菌操作带来了较大的挑战。生物反应器灌流培养一般是单一功能的进出管道，在实际生产过程中需要多次拆装和组合，工作量大而且容易混淆，增加了污染的风险。总之这类管道不仅在操作过程中步骤繁琐、耗时耗力，操作过程中受到污染的风险较高。因此设计需要一套生物反应器灌流培养管道系统来简化相关操作和降低污染风险。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种封闭式生物反应器及其细胞培养方法，不仅有效保证了疫苗生产中的无菌要求，而且操作简便，适合固定床生物反应器大规模培养。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：一种封闭式生物反应器，包括溶液容器、收集容器、生物反应罐、进液管道和出液管道，所述进液管道和出液管道上各具有一个四通；

所述进液管道的四通的第一端口与所述生物反应罐的第一进液阀连接，进液管道的四通的第二端口与所述生物反应罐的第二进液阀连接，进液管道的四通的第三端口和所述溶液容器的出液端连接，进液管道的四通的第四端口作为备用端口；

所述出液管道的四通的第一端口与所述生物反应罐的出液阀连接，出液管道的四通的第二端口与所述生物反应器罐的排液阀连接，出液管道的四通的第三端口和所述收集容器的进液端连接，出液管道的四通的第四端口作为备用端口。

优选地，所述进液管道的四通的第一端口与所述生物反应罐的第一进液阀之间采用硅胶管和罐流泵管相连；所述进液管道的四通的第二端口与所述生物反应罐的第二进液阀之间采用硅胶管和进液泵管相连；所述进液管道的四通的第三端口和所述溶液容器的出液端之间采用硅胶管相连；所述进液管道的四通的第四端口通过硅胶管连接细胞悬液、毒种或者另一个溶液容器的出液端。

优选地，所述出液管道的四通的第一端口与所述生物反应罐的出液阀之间采用硅胶管和罐流泵管相连；所述出液管道的四通的第二端口与所述生物反应器罐的排液阀之间采用硅胶管和出液泵管相连；所述出液管道的四通的第三端口和所述收集容器的进液端之间采用硅胶管相连；所述出液管道的四通的第四端口通过硅胶管连接另一个收集容器的进液端。

进一步地，所述溶液容器和收集容器为具有支撑容器的一次性无菌袋；所述溶液容器的出液端位于一次性无菌袋的底部，收集容器的进液端位于一次性无菌袋的顶部。

进一步地，所述进液管道的四通的第一端口与所述生物反应罐的第一进液阀之间的罐流泵管处设有进液精密蠕动泵；所述进液管道的四通的第二端口与所述生物反应罐的第二进液阀之间的进液泵管处设有进液工业蠕动泵。

进一步地，所述出液管道的四通的第一端口与所述生物反应罐的出液阀之间的罐流泵管处设有出液精密蠕动泵；所述出液管道的四通的第二端口与所述生物反应器罐的排液阀之间的出液泵管处设有出液工业蠕动泵。

在本发明的一实施方式中，所述进液管道和出液管道的四通的每一个端口都设有止流夹。

在本发明的一实施方式中，所述进液管道和出液管道的四通由不锈钢或聚丙烯制成。

其中，所述生物反应罐为固定床生物反应器罐。

另外，本发明还提出一种封闭式生物反应器的细胞培养方法，包括以下步骤：

1)预培养：打开生物反应罐的排液阀，打开出液管道的四通的第二端口和第三端口的止流夹，启动出液工业蠕动泵把生物反应罐内的PBS溶液泵出到收集容器；关闭生物反应罐的排液阀，打开生物反应罐的第二进液阀，打开进液管道的四通的第二端口和第二进液阀的止流夹，启动进液工业蠕动泵把溶液容器的培养液泵入到生物反应罐内；开启生物反应器参数控制进行预培养；

2)生物反应器细胞接种：打开生物反应罐的排液阀，打开出液管道的四通的第二端口和第三端口的止流夹，启动出液工业蠕动泵把生物反应罐内的预培养液泵出到收集容器；关闭生物反应罐的排液阀，打开生物反应罐的第二进液阀，打开进液管道的第二端口和第二进液阀的止流夹，启动进液工业蠕动泵再次把溶液容器的培养液泵入到生物反应罐内；然后打开进液管道的四通的第二端口和第四端口的止流夹，启动进液工业蠕动泵把细胞悬液泵入到生物反应罐内；开启生物反应器参数控制完成生物反应器细胞接种操作；

3)生物反应器细胞灌流培养：打开生物反应罐的出液阀和第一进液阀，打开进液管道的四通的第一端口和第二进液阀的止流夹，打开出液管道的四通的第一端口和第三端口的止流夹，启动进液精密蠕动泵和出液精密蠕动泵到相同泵速，根据细胞增殖情况从零开始逐渐增加泵速进行细胞灌流培养；培养液用完更换新的培养液，收集液收满更换新的收集袋；

4)生物反应器病毒接种：细胞增殖到一定密度后，打开生物反应罐的排液阀，打开出液管道的四通的第二端口和第三端口的止流夹，启动出液工业蠕动泵把生物反应罐内的培养液泵出到收集容器；关闭生物反应罐的排液阀，打开生物反应罐的第二进液阀，打开进液管道的四通的第二端口和第二进液阀的止流夹，启动进液工业蠕动泵把溶液容器的病毒接种液泵入到生物反应罐内；然后打开进液管道的四通的第二端口和第四端口的止流夹，启动进液工业蠕动泵把毒种泵入到生物反应罐内；开启生物反应器参数控制完成生物反应器病毒接种操作；

5)生物反应器洗换：病毒接种后第二天，打开生物反应罐的排液阀，打开出液管道的四通的第二端口和第三端口的止流夹，启动出液工业蠕动泵把生物反应罐内的溶液泵出到收集容器；打开生物反应罐的第二进液阀，打开进液管道的四通的第二端口和第二进液阀的止流夹，启动进液工业蠕动泵把洗换液泵入到生物反应罐内，然后搅拌10min，重复以上步骤4-6次；再次把生物反应罐内的溶液泵出到收集容器，然后打开生物反应罐的第二进液阀，打开进液管道的四通的第二端口和第二进液阀的止流夹，启动进液工业蠕动泵把病毒培养液泵入到生物反应罐内，开启生物反应器参数控制进行病毒培养；

6)生物反应器病毒灌流培养：打开生物反应罐的出液阀和第一进液阀，打开进液管道的四通的第一端口和第二进液阀的止流夹，打开出液管道四通的第一端口和第三端口的止流夹，启动进液精密蠕动泵和出液精密蠕动泵到相同泵速，按生物反应器工作体积的2-5倍体积的泵速进行病毒灌流培养连续收获病毒液；培养液用完更换新的培养液，收获液收满更换新的收集袋；

其中，所述步骤1)中的培养液为含有3％-10％新生牛血清的199溶液；所述步骤4)中的病毒接种液为含有1％新生牛血清的199溶液；所述步骤5)中的洗换液为不含新生牛血清的199溶液或PBS溶液；所述步骤5)中的病毒培养液为含0.1％-0.5％人血白蛋白的199溶液。

由上，本发明的封闭式生物反应器及其细胞培养方法，可实现生物反应器灌流培养，也可以实现快速的换液。封闭式生物反应器的管道系统方便清洁高压，可多次重复使用，节约了生产成本，也可以降低污染风险和提高工作效率。另外，本发明提出的封闭式生物反应器及其细胞培养方法，取代了现有方法单一管道进行生物反应器的生产操作，不仅有效保证了疫苗生产中的无菌要求，而且操作简便，适合固定床生物反应器大规模培养，简化了生产步骤，缩短了操作时间，极大提高了生产效率。该管道方便清洁高压，可多次重复使用，减少了硅胶管的用量，节约了生产成本。减少了无菌操作的次数，降低了污染风险，保障了疫苗产品的安全。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。

图1是本发明优选实施例的封闭式生物反应器的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，是本发明优选实施例的封闭式生物反应器的结构示意图，本发明的封闭式生物反应器包括溶液容器1、收集容器2、生物反应罐3、进液管道4和出液管道5；所述进液管道4和出液管道5各有一个四通40、50组成。

所述进液管道4的四通40的第一端口41由灌流泵管(Cole-Parmer 06508-25)和硅胶管(Nalgene 8600-0140)的组合与生物反应罐3的第一进液阀31连接，四通40的第二端口42由进液泵管(Cole-Parmer 96410-73)和硅胶管(Nalgene8600-0140)的组合与生物反应罐3的第二进液阀32连接，四通40的第三端口43由硅胶管(Nalgene 8600-0140)和溶液容器1的出液端连接，四通40的第四端口44作为备用端口，通过硅胶管(Nalgene 8600-0140)连接细胞悬液、毒种或者另一个溶液容器的出液端。

所述出液管道5的四通50的第一端口51由灌流泵管(Cole-Parmer 06508-25)和硅胶管(Nalgene 8600-0140)的组合与生物反应罐3顶盖的出液阀33连接，四通50的第二端口52由出液泵管(Cole-Parmer 96410-73)和硅胶管(Nalgene8600-0140)的组合与生物反应器罐3罐底的排液阀34连接，四通50的第三端口53由硅胶管(Nalgene 8600-0140)和收集容器2的进液端连接，四通50的第四端口54作为备用端口，通过硅胶管(Nalgene 8600-0140)连接另一个收集容器的进液端。

其中，所述溶液容器1和收集容器2为有支撑容器的一次性无菌袋(HycloneSH30652.03)。溶液容器1的出液端位于一次性无菌袋(Hyclone SH30652.03)的底部，收集容器2的进液端位于一次性无菌袋(Hyclone SH30652.03)的顶部。

其中，所述进液精密蠕动泵45(保定兰格恒流泵有限公司，型号为BT100-2J)位于进液管道4的灌流泵管(Cole-Parmer 06508-25)处，出液精密蠕动泵55(保定兰格恒流泵有限公司，型号为BT100-2J)位于出液管道5的灌流泵管(Cole-Parmer 06508-25)处。所述进液工业蠕动泵46(保定兰格恒流泵有限公司，型号为YT600-1J)位于进液管道4的进液泵管(Cole-Parmer 96410-73)处，出液工业蠕动泵56(保定兰格恒流泵有限公司，型号为YT600-1J)位于出液管道5的出液泵管(Cole-Parmer 96410-73)处。

其中，所述进液管道4和出液管道5的四通的每一个端口都有止流夹。所述四通40，50的材质为不锈钢或聚丙烯。所述生物反应罐3是固定床生物反应器罐(上海日泰医药设备工程有限公司的Cellipower 09 50L生物反应器)。本发明的实施例的系统还配有若干止血钳辅助管路的开合。用止血钳或止流夹夹住管道，实现对管道的密闭。

本发明的封闭式生物反应器的细胞培养方法包括以下步骤：

预培养

使用上述的封闭式生物反应器管道系统进行冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)Cellipower 09 50L生物反应器预培养。

1)安装、灭菌、调试好上海日泰医药设备工程有限公司的Cellipower 09 50L生物反应器。

2)打开生物反应罐3的排液阀34，打开出液管道5的四通50的第二端口52和第三端口53的止流夹，启动出液工业蠕动泵56把生物反应罐3内的PBS溶液泵出到收集容器2。

3)关闭排液阀34，打开生物反应罐3的第二进液阀32，打开进液管道4的四通40的第二端口42和第三端口43的止流夹，启动进液工业蠕动泵46把溶液容器1的含7.5％新生牛血清的199培养液泵入40L到生物反应罐3内。

4)设置生物反应器参数为pH 7.20，DO50.0，搅拌转速120rpm，温度37.0℃，并使实际值稳定至设定值完成预培养。

生物反应器细胞接种

使用上述的封闭式生物反应器管道系统进行冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)Cellipower 09 50L生物反应器细胞接种。

1)接种细胞前，打开生物反应罐3的排液阀34，打开出液管道5的四通50的第二端口52和第三端口53的止流夹，启动出液工业蠕动泵56把生物反应罐3内的含7.5％新生牛血清的199培养液泵出到收集容器2。

3)关闭排液阀34，打开生物反应罐3的第二进液阀32，打开进液管道4的四通40的第二端口42和第三端口43的止流夹，启动进液工业蠕动泵46把溶液容器1的含7.5％新生牛血清的199培养液泵入40L到生物反应罐3内。

4)设置生物反应器参数为pH 7.20，DO50.0，搅拌转速120rpm，温度37.0℃，并使实际值稳定至设定值。取样校正pH读数。

5)根据从细胞组接收的细胞悬液的密度，计算准备接种至生物反应罐的细胞悬液体积，使接种后生物反应罐细胞密度为2×10⁵～5×10⁵个/ml,接种时将搅拌转速降为60rpm，关闭进气，同时关闭pH、DO的自动控制。

6)接种60分钟后生物反应罐内液体变澄清时开进气，同时开启pH、DO的自动控制。细胞接种后6小时内，慢慢将生物反应器参数调回设置值，最终设置pH 7.20，DO 50.0，搅拌转速120rpm，温度37.0℃，并使实际值稳定至设定值。

生物反应器细胞灌流培养

使用上述的封闭式生物反应器管道系统进行冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)Cellipower 09 50L生物反应器细胞灌流培养。

1)细胞接种后，打开生物反应罐3顶盖的出液阀33和第一进液阀31，打开进液管道4的四通40的第一端口41和第三端口43的止流夹，打开出液管道5的四通(50)的第一端口51和第三端口53的止流夹，启动进液精密蠕动泵45和出液精密蠕动泵55到相同泵速，根据细胞增殖情况从零开始逐渐增加泵速进行细胞灌流培养。

2)每日观察并记录生物反应器各参数，培养液用完更换新的培养液，收集液收满更换新的收集袋。

3)连续灌流培养7～11天后准备接毒。

生物反应器病毒接种

使用上述的封闭式生物反应器管道系统进行冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)Cellipower 09 50L生物反应器病毒接种。

1)接种病毒前，打开生物反应罐3的排液阀34，打开出液管道5的四通50的第二端口52和第三端口53的止流夹，启动出液工业蠕动泵56把生物反应罐3内的含7.5％新生牛血清的199培养液泵出到收集容器2。

3)关闭排液阀34，打开生物反应罐3的第二进液阀32，打开进液管道4的四通40的第二端口42和第三端口43的止流夹，启动进液工业蠕动泵46把溶液容器1的含1％新生牛血清的199培养液泵入40L到生物反应罐内。

4)设置生物反应器参数为pH 7.50，DO50.0，搅拌转速120rpm，温度35.0℃，并使实际值稳定至设定值。取样校正pH读数。

5)然后打开进液管道4的四通40的第二端口42和第四端口44的止流夹，启动进液工业蠕动泵46把狂犬病毒毒种(aGV15)泵入到生物反应罐3内，使罐内细胞的病毒感染量为0.1M.O.I。

6)病毒接种10分钟后生物反应罐3内液体变澄清时开进气，同时开启pH、DO的自动控制。病毒接种后6小时内，慢慢将生物反应器参数调回设置值，最终设置pH 7.50，DO50.0，搅拌转速120rpm，温度35.0℃，并使实际值稳定至设定值。

生物反应器洗换

使用上述的封闭式生物反应器管道系统进行冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)Cellipower 09 50L生物反应器洗换。

1)病毒接种后第二天进行洗换。关闭所有参数的自动控制，打开生物反应罐3的排液阀34，打开出液管道5的四通50的第二端口52和第三端口53的止流夹，启动出液工业蠕动泵56把生物反应罐3内的含1％新生牛血清的199培养液泵出到收集容器2。

3)关闭排液阀34，打开生物反应罐3的第二进液阀32，打开进液管道4的四通40的第二端口42和第三端口43的止流夹，启动进液工业蠕动泵46把溶液容器1的不含血清的199培养液泵入50L到生物反应罐3内。120rpm搅拌10分钟。如此反复洗换6次。

4)洗换完后关闭排液阀34，打开生物反应罐3的第二进液阀32，打开进液管道4的四通40的第二端口42和第三端口43的止流夹，启动进液工业蠕动泵46把溶液容器1的含0.1％人血白蛋白的199培养液泵入40L到生物反应罐3内。

5)洗换完6小时内，慢慢将生物反应器参数调回设置值，最终设置生物反应器参数为pH7.50，DO50.0，搅拌转速120rpm，温度35.0℃，并使实际值稳定至设定值。

生物反应器病毒灌流培养

使用上述的封闭式生物反应器管道系统进行冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)Cellipower 09 50L生物反应器病毒灌流培养。

1)洗换完6小时后，打开生物反应罐3罐顶的出液阀33和第一进液阀31，打开进液管道4的四通40的第一端口41和第三端口43的止流夹，打开出液管道5的四通50的第一端口51和第三端口53的止流夹，启动进液精密蠕动泵45和出液精密蠕动泵55到相同泵速，每天连续灌注2.0～5.0倍工作体积的0.1％人血白蛋白培养液。

2)培养液用完更换新的培养液，收获液收满更换新的收集袋，连续收获病毒液10天。

3)病毒收获液取样后放2～8℃冷库存放。

本发明的封闭式生物反应器及其细胞培养方法，可实现生物反应器灌流培养，也可以实现快速的换液。封闭式生物反应器的管道系统方便清洁高压，可多次重复使用，节约了生产成本，也可以降低污染风险和提高工作效率。另外，本发明提出的封闭式生物反应器及其细胞培养方法，取代了现有方法单一管道进行生物反应器的生产操作，不仅有效保证了疫苗生产中的无菌要求，而且操作简便，适合固定床生物反应器大规模培养，主要可实现以下的有益效果：

1、简化了生产步骤，缩短了操作时间，极大提高了生产效率。

2、该管道方便清洁高压，可多次重复使用，减少了硅胶管的用量，节约了生产成本。

3、减少了无菌操作的次数，降低了污染风险，保障了疫苗产品的安全。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种封闭式生物反应器，其特征在于：包括溶液容器（1）、收集容器（2）、生物反应罐（3）、进液管道（4）和出液管道（5），所述进液管道（4）和出液管道（5）上各具有一个四通；

所述进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）与所述生物反应罐（3）的第一进液阀（31）连接，四通（40）的第二端口（42）与所述生物反应罐（3）的第二进液阀（32）连接，四通（40）的第三端口（43）和所述溶液容器（1）的出液端连接，四通（40）的第四端口（44）作为备用端口；

所述出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）与所述生物反应罐（3）的出液阀（33）连接，四通（50）的第二端口（52）与所述生物反应器罐（3）的排液阀（34）连接，四通（50）的第三端口（53）和所述收集容器（2）的进液端连接，四通（50）的第四端口（54）作为备用端口；

所述进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）与所述生物反应罐（3）的第一进液阀（31）之间采用硅胶管和灌流泵管相连；所述四通（40）的第二端口（42）与所述生物反应罐的第二进液阀（32）之间采用硅胶管和进液泵管相连；所述四通（40）的第三端口（43）和所述溶液容器（1）的出液端之间采用硅胶管相连；所述四通（40）的第四端口（44）通过硅胶管连接细胞悬液、毒种或者另一个溶液容器的出液端；

所述进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）与所述生物反应罐（3）的第一进液阀（31）之间的罐流泵管处设有进液精密蠕动泵（45）；所述四通（40）的第二端口（42）与所述生物反应罐（3）的第二进液阀（32）之间的进液泵管处设有进液工业蠕动泵（46）；

所述出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）与所述生物反应罐（3）的出液阀（33）之间采用硅胶管和灌流泵管相连；所述四通（50）的第二端口（52）与所述生物反应器罐（3）的排液阀（34）之间采用硅胶管和出液泵管相连；所述四通（50）的第三端口（53）和所述收集容器（2）的进液端之间采用硅胶管相连；所述四通（50）的第四端口（54）通过硅胶管连接另一个收集容器的进液端；

所述出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）与所述生物反应罐（3）的出液阀（33）之间的罐流泵管处设有出液精密蠕动泵（55）；所述四通（50）的第二端口（52）与所述生物反应器罐（3）的排液阀（34）之间的出液泵管处设有出液工业蠕动泵（56）；

所述进液管道（4）和出液管道（5）的四通（40，50）的每一个端口都设有止流夹。

2.如权利要求1所述的封闭式生物反应器，其特征在于：所述溶液容器（1）和收集容器（2）为具有支撑容器的一次性无菌袋；所述溶液容器（1）的出液端位于一次性无菌袋的底部，收集容器（2）的进液端位于一次性无菌袋的顶部。

3.如权利要求1所述的封闭式生物反应器，其特征在于：所述进液管道（4）和出液管道（5）的四通（40，50）由不锈钢或聚丙烯制成。

4.如权利要求1所述的封闭式生物反应器，其特征在于：所述生物反应罐（3）为固定床生物反应器罐。

5.一种采用如权利要求1至4任一项所述的封闭式生物反应器的细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）预培养：打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的PBS溶液泵出到收集容器（2）；关闭生物反应罐（3）的排液阀（34），打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把溶液容器（1）的培养液泵入到生物反应罐（3）内；开启生物反应器参数控制进行预培养；

2）生物反应器细胞接种：打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的预培养液泵出到收集容器（2）；关闭生物反应罐（3）的排液阀（34），打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）再次把溶液容器（1）的培养液泵入到生物反应罐（3）内；然后打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第四端口（44）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把细胞悬液泵入到生物反应罐（3）内；开启生物反应器参数控制完成生物反应器细胞接种操作；

3）生物反应器细胞灌流培养：打开生物反应罐（3）的出液阀（33）和第一进液阀（31），打开进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）和第三端口（43）的止流夹，打开出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）和第三端口（53）的止流夹，启动进液精密蠕动泵（45）和出液精密蠕动泵（55）到相同泵速，根据细胞增殖情况从零开始逐渐增加泵速进行细胞灌流培养；培养液用完更换新的培养液，收集液收满更换新的收集袋；

4）生物反应器病毒接种：细胞增殖到一定密度后，打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的培养液泵出到收集容器（2）；关闭生物反应罐（3）的排液阀（34），打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把溶液容器（1）的病毒接种液泵入到生物反应罐（3）内；然后打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第四端口（44）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把毒种泵入到生物反应罐（3）内；开启生物反应器参数控制完成生物反应器病毒接种操作；

5）生物反应器洗换：病毒接种后第二天，打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的溶液泵出到收集容器（2）；打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把洗换液泵入到生物反应罐（3）内，然后搅拌10min，重复以上步骤4-6次；再次把生物反应罐（3）内的溶液泵出到收集容器（2），然后打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把病毒培养液泵入到生物反应罐（3）内，开启生物反应器参数控制进行病毒培养；

6）生物反应器病毒灌流培养：打开生物反应罐（3）的出液阀（33）和第一进液阀（31），打开进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）和第三端口（43）的止流夹，打开出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）和第三端口（53）的止流夹，启动进液精密蠕动泵（45）和出液精密蠕动泵（55）到相同泵速，按生物反应器工作体积的2-5倍体积的泵速进行病毒灌流培养连续收获病毒液；培养液用完更换新的培养液，收获液收满更换新的收集袋；

其中，所述步骤1）中的培养液为含有3%-10%新生牛血清的199溶液；所述步骤4）中的病毒接种液为含有1%新生牛血清的199溶液；所述步骤5）中的洗换液为不含新生牛血清的199溶液或PBS溶液；所述步骤5）中的病毒培养液为含0.1%-0.5%人血白蛋白的199溶液。

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