CN208023014U - 一种细胞消化器 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供了一种细胞消化器。本实用新型的细胞消化器由消化罐、用于支撑消化罐的支架、消化罐顶盖组成;所述消化罐包括罐体和罐底,罐底为收集液体的腔体,腔体的最下端设置排液口,罐体和罐底连接处水平设置一个可拆卸的筛网,所述筛网与罐体相配合,可以将微载体或杂质团块截留,并使细胞流穿至罐底的腔体内;罐体外侧壁设置取样回收口,取样回收口位于筛网上方,用于取样或回收微载体。本实用新型的细胞消化器可用于原代细胞的消化和微载体培养细胞消化,在消化过程中可将细胞和微载体或大团块实时分离,大大缩短了细胞消化周期并避免底层细胞受压,有利于细胞的传代培养,适用于工厂化规模化细胞培养。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种细胞消化器。
背景技术
原代细胞制备过程中,需要把组织剪成小块,然后采用消化剂消化成组织团块进而消化成单个细胞。这个过程中,细胞是逐步从组织上游离下来变成单细胞悬液的。现有的消化技术无法实时收集细胞和终止消化,使细胞生物学特性受到很大破坏,导致细胞贴壁率低,难以成活。
生物制品领域在制备细胞种子和细胞培养时,通常会将细胞接种到微载体上,采用发酵罐培养。细胞发酵培养过程中最重要的是细胞的消化。而现有技术公开的各种发酵罐的排液口均在发酵罐的最底端的上方,细胞消化的时候,通常要用适宜的洗涤液洗涤细胞表面。将洗涤液排出需要先将微载体沉降,每次需要30分钟以上,一般需要洗涤3次,沉降微载体3次,非常耗时。细胞洗涤结束后,添加消化剂消化。因为发酵罐内细胞较多,加上发酵罐本身的构造导致无法肉眼判断消化进程。消化过程中需要多次取样,观察细胞状态。然而市售发酵罐的取样口都高于发酵罐的最下方,导致必须添加过量的消化液增加体积使得液位高于取样口才能取到样。众所周知,过量的消化液极易对细胞造成不可逆的损害,从而改变细胞生物学特性,导致细胞在后续培养过程中成活率低,甚至影响生物制品的质量。而细胞消化结束后,微载体和细胞同时沉淀无法有效分离,因此极难应用到细胞种子的制备。因此,迫切需要一种无需添加过量消化液就能方便取样、且无需沉降微载体就能快速排放溶液的高效细胞消化器。
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种细胞消化器。
本实用新型提供的一种细胞消化器,该细胞消化器由消化罐、用于支撑消化罐的支架、消化罐顶盖组成,所述消化罐包括罐体和罐底,罐底为收集液体的腔体,腔体的最下端设置排液口,罐体和罐底连接处水平设置一个可拆卸的筛网,所述筛网与罐体相配合,可以将微载体或杂质团块截留,使细胞流穿至罐底的腔体内;罐体外侧壁下方、且在罐体和罐底连接处的上方设置取样回收口。
所述的罐体为圆柱形,所述罐底的底面为下凹的弧形或三角形,罐底底面的最下端设置一个排液口。该排液口用于连接外部容器或设备,排液口与外部容器或设备连接的管道上有止水夹,用于控制液体的排放。
本领域技术人员可以根据待截留物质直径选择适合孔径的筛网。
所述消化罐的材质为玻璃或不锈钢。
所述筛网的材质为不锈钢。
所述取样回收口用于消化过程取样、判断消化程度,还可用于回收微载体。
所述的罐体外表面设有保温夹套,夹套外侧壁上方设有夹套出水口,夹套外侧壁下方设有夹套进水口。
所述消化罐顶盖设有可拆卸的搅拌桨、搅拌马达和搅拌速度调节器;消化罐顶盖盖在消化罐上开始工作时,搅拌桨始终位于所述筛网的上方。搅拌速度调节器用于调节搅拌桨的搅拌速度。搅拌桨、搅拌电机和搅拌速度调节器通过信号输入、输出设备相连接。
进一步地,搅拌桨为独立双层搅拌,上层搅拌桨为洗涤细胞时起重要搅拌作用。下层搅拌桨为细胞消化过程中进行搅拌,下层搅拌桨有孔,是为了减小搅拌对细胞的损伤,搅拌桨边缘为流线型。搅拌桨具有一定角度,可降低搅拌过程中的剪切力。
所述消化罐顶盖设有待消化细胞进口、洗涤液和消化液进口、消化终止液进口、压缩空气进口、尾气排放出口、压力表连接口、备用口。
所述备用口有若干个,可以连接pH调节装置,溶氧控制装置或温度控制装置。
本实用新型的有益效果在于:
(1)本实用新型在消化罐的罐体与罐底连接处设置的筛网可以有效截留组织团块和微载体,实现溶液快速排放,实现单细胞与组织团块或者微载体的分离,可以有目的的收集单一产物。对于细胞种子制备过程,大大减少了微载体作为杂质在细胞冻存过程中产生的不利影响,保证了细胞的纯度。
(2)由于设置了可以截留微载体和细胞团块的筛网,使整个消化过程无需等待微载体沉降过程,大大缩短了细胞消化周期,并克服了现有技术中长时间沉降微载体带来的底层细胞受压的弊端,减少了生物反应器原位消化过程中存在的底层细胞受压迫,溶氧传质差等问题,使细胞处于相对较好的状态,有利于细胞成活率高,并促进细胞在新的体系中快速贴壁和增殖。
(3)本实用新型在消化罐罐底的最底端设置了排液口,分离的细胞或溶液可通过排液口进入下一级容器或设备。连接排液口与下一级容器或设备的管道上有止水夹,可以控制液体排放。
(4)本实用新型在罐体的外壁、罐体和罐底连接处的上方设置取样回收口,该取样回收口由于位于消化罐罐体的下方,可以在不额外增加消化液的同时,回收微载体和杂质团块,且可以随时取样以判断消化程度、是否达到终点。
(5)本实用新型双层可拆卸式搅拌桨:在消化过程中可以充分搅拌,使消化液分布均匀,达到细胞均一消化,克服了原位消化由于消化液体积较小无法充分搅拌的问题。搅拌速度可以根据需要实时调节。搅拌桨具备一定的角度和流线型,可以保证在搅拌消化过程中剪切力小,降低能耗和成本。
(6)本实用新型提供的细胞消化器确保整个细胞消化过程中始终处于封闭的无菌环境中进行单一消化,降低了细胞被污染的风险。
附图说明
图1为本实用新型细胞消化器结构图,其中1为排液口,2为筛网,3为取样回收口,4为夹套进水口,5为搅拌桨,6为夹套出水口,7为消化罐顶盖,8为支撑消化罐的支架,9为搅拌电机。
图2为本实用新型细胞消化器顶盖的结构简图,其中10为顶盖提手,11为洗涤液或消化液进口,12为待消化细胞进口,13为消化终止液进口,14为压力表连接口,15、18为备用口,16为尾气排放出口,17为锁紧螺栓,19为压缩空气进口。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型,但不用来限制本实用新型的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1细胞消化器
如图1所示,细胞消化器由消化罐、用于支撑消化罐的支架8、消化罐顶盖7组成,消化罐包括罐体和罐底,消化罐材质为不锈钢,罐底为收集液体的腔体,腔体的最下端设置排液口1,罐体和罐底连接处水平设置一个可拆卸的筛网2,筛网与罐体相配合,筛网的直径与圆柱形罐体的直径相同,可以将微载体或杂质团块截留,使细胞流穿至罐底的腔体内;罐体外侧壁下方、且在罐体和罐底连接处的上方设置取样回收口3。
罐底的底面为下凹的弧形或三角形,罐底底面的最下端设置一个排液口1。该排液口用于连接外部容器或设备,排液口与外部容器或设备连接的管道上有止水夹,用于控制液体的排放。
本领域技术人员可以根据待截留物质直径选择适合孔径的筛网。
筛网2的材质为不锈钢。
取样回收口3用于消化过程取样、判断消化程度,还可用于回收微载体。
所述的罐体外表面设有保温夹套,夹套外侧壁上方设有夹套出水口6,夹套外侧壁下方设有夹套进水口4。
消化罐顶盖设有可拆卸的搅拌桨5、搅拌电机9和搅拌速度调节器;消化罐顶盖盖在消化罐上开始工作时,搅拌桨始终位于筛网的上方。搅拌速度调节器用于调节搅拌桨的搅拌速度。搅拌桨、搅拌电机和搅拌速度调节器通过信号输入、输出设备相连接。
进一步地,搅拌桨为独立双层搅拌,搅拌桨边缘为流线型。搅拌桨具有一定角度,可降低搅拌过程中的剪切力
如图2所示,消化罐顶盖设有待消化细胞进口12、洗涤液或消化液进口11、消化终止液进口13、压缩空气进口19、尾气排放出口16、压力表连接口14、备用口15、18。
备用口有若干个,可以连接pH调节装置,溶氧控制装置或温度控制装置。
实施例2采用本实用新型的细胞消化器进行原代细胞(鸡胚成纤维细胞)制备
1)在无菌环境下选取鸡胚腿肌、胸肌,去除表皮、血管和结缔组织。将待消化组织利用0.02M PBS缓冲液洗涤干净,剪成1mm3小块,约1L。
2)将待消化组织无菌转入实施例1的细胞消化器(已高压灭菌)中,加入等体积的0.25%胰蛋白酶溶液。本实施例选用的筛网孔径是75μm。
3)外接控温系统,维持消化温度在37℃,同时进行低速搅拌。
4)当消化体系变浑浊或者待消化组织块变成糜状,通过底部排液口收集细胞悬液,细胞悬液转移至另外的容器中进行终止消化。
5)向细胞消化器中再次加入等体积的0.25%胰蛋白酶溶液,控温(37℃)低速搅拌(50rpm),继续消化。
6)重复步骤4)-5)至消化结束。
7)将两批收集的细胞悬液合并,然后低速离心(1000rpm,15min),去除上清。
8)采用含10%血清的199细胞培养基对细胞团块进行重悬,终体积1000ml。计算细胞密度为2.3×106cells/ml和细胞成活率为97%。
9)将细胞接种到T175瓶中,细胞接种密度为5×106cells/ml,培养体积为60ml/瓶。在CO2培养箱中培养,培养条件为37℃,5.0%CO2浓度。细胞培养48小时,细胞完全贴壁后,弃掉原有培养基以及未贴壁的纤维及杂质部分,更换等体积相同组分的培养基继续培养。
10)待细胞生长至致密单层,进行消化传代。
实施例3利用细胞消化器实现细胞微载体悬浮培养14L向130L规模放大。
1)细胞在14L生物反应器(发酵罐)中培养3-5天,待细胞在微载体上长成致密单层停止细胞培养。
2)将本实用新型的细胞消化器主体及附属管道清洗干净并组装好,在高压蒸汽灭菌柜中进行121℃高压灭菌30min。灭菌结束后,在层流保护下使设备降至室温。
3)将生物反应器收获管道与细胞消化器的待消化细胞进口无菌连接,将带细胞的微载体及培养基转入细胞消化器。同时将细胞消化器罐底的排液口与废液收集容器连接,细胞及培养基转入消化器的同时,打开消化罐底部排放止水夹,及时排掉培养基。本实施例选用的筛网孔径是75μm。
4)最终获得约1-2L微载体,从洗涤液进口加入2倍体积洗涤缓冲液。开启控温系统,维持温度在37℃,低速搅拌(60rpm)洗涤细胞。待微载体被充分搅拌之后停止搅拌,从罐底部排液口排掉缓冲液。
5)洗涤3次细胞直至无培养基颜色,最后排掉洗涤缓冲液。
6)加入2倍体积细胞消化液,控温(37℃)低速搅拌(60rpm)消化。待消化体系变浑浊或者从取样回收口进行取样观察50%的细胞被消化下来,通过消化罐底部的排液口收集细胞悬液,将细胞悬液转移至另外的容器中进行终止消化。
7)重复步骤6)至取样观察微载体上细胞完全消化下来。
8)将分批收集的细胞悬液合并,最终获得4L细胞悬液(显微镜下,细胞均匀单一),然后低速离心,去除上清。
9)采用细胞培养基对细胞团块进行重悬,最终体积是3L。计算细胞密度得9.3×106cells/ml,细胞成活率为96%。
10)按照下一级细胞培养所需要的细胞密度,量取适宜体积胞悬液转入下一级生物反应器进行细胞培养。
11)将微载体回收管道(即图1中的3取样回收口)与下一级生物反应器无菌连接。将微载体转移到下一级生物反应器进行重复利用。实施例4利用生物反应器和本实用新型的细胞消化器进行微载体细胞培养制备细胞种子
1)细胞在40L生物反应器(实际培养体积为30L)中培养3-5天,待细胞在微载体上长成致密单层停止细胞培养,计算细胞密度。
2)将细胞消化器主体及附属管道清洗干净并组装好,在高压蒸汽灭菌柜中进行121℃高压灭菌30min。灭菌结束后,在层流保护下使设备降至室温。
3)将生物反应器收获管道与细胞消化器的待消化细胞进口无菌连接,将带细胞的微载体及培养基转入细胞消化器。同时将细胞消化器罐底的排液口与废液收集容器连接,细胞及培养基转入消化器的同时,打开消化罐底部排放止水夹,及时排掉培养基。本实施例选用的筛网孔径是75μm。
4)最终获得约3L微载体,从洗涤液进口加入2倍体积洗涤缓冲液。开启控温系统,维持温度在37℃,低速搅拌(60rpm)洗涤细胞。待微载体被充分搅拌之后停止搅拌,从罐底部排液口排掉缓冲液。
5)洗涤3次细胞直至无培养基颜色,最后排掉洗涤缓冲液。
6)加入2倍体积细胞消化液,控温(37℃)低速搅拌(60rpm)消化。待消化体系变浑浊或者取样观察50%的细胞被消化下来,通过底部管道收集细胞悬液,,将细胞悬液转移至另外的容器中进行终止消化。
7)重复步骤6)至取样观察微载体上细胞完全消化下来。
8)将分批收集的细胞悬液合并,将细胞悬液低速离心,去除上清。
9)采用细胞培养基对细胞团块进行重悬,按照规定冻存密度及体积将细胞悬液分装到合适规格的冻存管中。
10)将分装好的细胞种子放置于程序降温仪中,从室温(25℃)将至-190℃。
11)将冻存好的细胞种子置于液氮罐中保存。
Claims (10)
1.一种细胞消化器,由消化罐、用于支撑消化罐的支架、消化罐顶盖组成,其特征在于,所述消化罐包括罐体和罐底,罐底为收集液体的腔体,腔体的最下端设置排液口,罐体和罐底连接处水平设置一个可拆卸的筛网,所述筛网与罐体相配合,可以将微载体或杂质团块截留,使细胞流穿至罐底的腔体内;罐体外侧壁下方、且在罐体和罐底连接处的上方设置取样回收口。
2.如权利要求1所述的细胞消化器,其特征在于,所述的罐体为圆柱形,所述罐底的底面为下凹的弧形或三角形,罐底底面的最下端设置一个排液口。
3.如权利要求1所述的细胞消化器,其特征在于,筛网孔径根据待截留物质直径选择。
4.如权利要求1所述的细胞消化器,其特征在于,所述的罐体外表面设有保温夹套,夹套外侧壁上方设有夹套出水口,夹套外侧壁下方设有夹套进水口。
5.如权利要求1所述的细胞消化器,其特征在于,所述消化罐顶盖设有可拆卸的搅拌桨、搅拌电机和搅拌速度调节器;消化罐顶盖盖在消化罐上开始工作时,搅拌桨始终位于所述筛网的上方。
6.如权利要求5所述的细胞消化器,其特征在于,搅拌桨为独立双层搅拌,搅拌桨边缘为流线型;下层搅拌桨有孔,以减少对细胞的损伤。
7.如权利要求1-6任一所述的细胞消化器,其特征在于,所述消化罐顶盖设有待消化细胞进口、洗涤液和消化液进口、消化终止液进口、压缩空气进口、尾气排放出口、压力表连接口、备用口。
8.如权利要求7所述的细胞消化器,其特征在于,所述备用口有若干个,可以连接pH调节装置,溶氧控制装置或温度控制装置。
9.如权利要求1-6任一所述的细胞消化器,其特征在于,所述消化罐的材质为玻璃或不锈钢。
10.如权利要求1-6任一所述的细胞消化器,其特征在于,所述筛网的材质为不锈钢。
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CN201721863627.5U CN208023014U (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | 一种细胞消化器 |
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CN201721863627.5U CN208023014U (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | 一种细胞消化器 |
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CN208023014U true CN208023014U (zh) | 2018-10-30 |
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CN201721863627.5U Active CN208023014U (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | 一种细胞消化器 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN107974399A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-05-01 | 北京科兴生物制品有限公司 | 一种细胞消化器 |
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2017
- 2017-12-27 CN CN201721863627.5U patent/CN208023014U/zh active Active
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