CN107354130A - 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法 - Google Patents

一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，包括：1)取健康人胎盘绒毛膜组织，剪成条块状，用生理盐水充分冲洗；2)加入适量生理盐水，用匀浆器将绒毛膜切碎为细小颗粒，用生理盐水冲洗至澄清；3)再次用匀浆器处理至微小颗粒后，离心去除上层血细胞；4)沉淀中加入酶进行消化，离心分离沉淀；5)用生理盐水离心洗涤两次后，沉淀中加入培养基接种培养；6)第7天弃除组织块和培养液，用生理盐水冲洗培养瓶底后，加入新鲜培养基，之后每3天更换培养基至细胞融合度达80‑90%，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。本发明操作简便快捷，可获得高质量的人胎盘绒毛膜间充质干细胞。

Description

一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法。
背景技术
间充质干细胞是普遍存在于不同组织的多潜能成体干细胞，目前已经从骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、绒毛膜、蜕膜、脐带、脐血等组织中分离培养出间充质干细胞。已有研究表明间充质干细胞具有分化能力强，倍增时间短，具有免疫调节作用和低下的免疫原性，易于转染的特性，是再生医学的一种理想种子细胞和基因治疗载体，已成为干细胞临床转化应用研究的热点，但是如何体外简便、快捷分离出大量原代间充质干细胞是间充质干细胞研究和应用的基础，也是间充质干细胞研究领域中的重要研究方向。
目前，使用的间充质干细胞主要为骨髓间充质干细胞，其来源方便快捷，可是该来源间充质干细胞具有如下缺陷：1.在骨髓中含量低（约0.1～0.01‰），而且随着年龄增加，其扩增、分化能力和细胞数量出现明显下降趋势；2.存在伦理问题，来源受到限制；3.供者有不适感，不易接受；4.病毒感染机会大；5.异体移植的免疫排斥强。人胎盘绒毛膜间充质干细胞是一种能替代骨髓间充质干细胞, 并可弥补其缺陷的间充质干细胞。人胎盘绒毛膜间充质干细胞有如下优势：1.取材几乎不受限制。胎盘为“废弃”物，只要在正常分娩的健康产妇知情同意的基础上，都能够提供胎盘。供者无痛苦，污染机会少；2.胎盘绒毛膜间充质干细胞更加原始，免疫原性更低，获得的原代间充质干细胞数量大；3.不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论。因此人胎盘绒毛膜间充质干细胞受到再生医学领域的广泛关注。
目前，人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法有组织块法和酶消化法，这两者分离培养方法耗时费力，过程繁琐易污染，是影响人胎盘绒毛膜间充质干细胞研究和应用获取材料的关键，具体表现如下：
组织块法获得的间充质干细胞纯度高，细胞活力强的优点，但是培养周期长、分离成功率不高，手工剪切和铺放相对耗时费力，也导致一个工作日内难以完成整个胎盘绒毛膜组织的处理；种植的组织块相对来说比较大，组织内的细胞不能有效的游移出来，导致标本利用不充分。
酶消化法分离培养周期短、成功率高的优点，但是需要手工剪碎组织块，耗时费力；酶消化时间长，对细胞造成较大伤害，影响细胞活力和传代；为去除红细胞，需要使用密度梯度离心分离或红细胞裂解液，为获得单个单核细胞，需要繁琐的细胞过滤过程，这些增加试剂和实验步骤，影响细胞活力，增加了人力、时间成本和污染机会；去除了消化不完全的组织块，使得组织标本利用不充分；而且获得的细胞是胎血来源和绒毛膜来源的混合间充质干细胞。
现有的提取组织来源间充质干细胞方法都是组织块法或酶消化法的优化，例如“一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法”（CN104560869A）；“一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法”（CN105713871A）；“胎盘间充质干细胞体外分离、扩增和诱导分化的方法”（CN106032529A）；“回输临床治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法”（CN105713869A）；“从胎盘、脐带中提、制同源性间充质干细胞注射剂的方法”（CN103263440A）；“从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法”（CN103320382A）。这些方法不可避免存在组织块法或酶消化法的缺点，有的方法还增加了操作程序，有的方法还额外添加其它化学试剂或生物制品。有待进一步完善。
因此克服现有方法的不足，建立简便、快捷且能够获得大量原代细胞的人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、快捷且能获得大量原代人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：
1)取人胎盘绒毛膜组织，剪成1～3cm条块状，用生理盐水充分冲洗，并称量绒毛膜湿重；
2)用手持式电动匀浆器处理绒毛膜至细小颗粒，再次用生理盐水冲洗至澄清；
3)再次用匀浆器处理至微小颗粒后，离心去除上层血细胞；
4)沉淀中加入同体积的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ，于37℃消化；
5)用生理盐水离心洗涤两次后，沉淀中加入培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
6)第7天弃除组织块和培养液，用生理盐水冲洗培养瓶底后，加入新鲜培养基，之后每3天更换培养基至细胞融合度达80-90%，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。
作为上述分离方法的进一步改进，人胎盘绒毛膜组织取自产后6小时内，无老化钙化、无传染性疾病的胎盘，并用生理盐水充分冲洗绒毛膜组织上的血液。
作为上述分离方法的进一步改进，剪取的胎盘小叶绒毛膜厚度为0.3～0.5 cm。
作为上述分离方法的进一步改进，人胎盘绒毛膜组织为整个胎盘的绒毛膜组织。
作为上述分离方法的进一步改进，细小颗粒的大小为0.1～0.3cm3。
作为上述分离方法的进一步改进，微小颗粒的大小为0.1～0.5mm3。
作为上述分离方法的进一步改进，匀浆器处理时，胎盘组织与生理盐水的体积比为1：（2～3）。
作为上述分离方法的进一步改进，匀浆器处理时的温度为4～25℃。
作为上述分离方法的进一步改进，胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ的消化时间为0.5～3h。
作为上述分离方法的进一步改进，离心去除上层血细胞的离心条件为：转速300～500 r/min，5min，4℃。
作为上述分离方法的进一步改进，离心时的温度为4～10℃。
本发明的有益效果是：
本发明方法结合了酶消化法和组织块法的原理，运用了酶消化法和组织块法的优点：本发明用酶和手持电动匀浆器处理标本，使得绒毛膜组织成为微小的组织块及单个核细胞，减少了组织剪切时间、组织铺排时间和消化时间，提高了贴壁面积，有利于人胎盘绒毛膜间充质干细胞爬出微小组织块。
本发明方法简便、快捷：减少了手工处理时间和人力消耗，减少了处理步骤和清除红细胞试剂的使用，从而减少了污染机会。
本发明方法提高了P0代细胞的产量：每次分离标本都能够处理完一个完整胎盘的绒毛膜组织，同时，组织贴壁面积提高，导致P0代细胞产量提高。
本发明方法提高了P0代细胞的纯度：清除了胎血，提高了获得人胎盘绒毛膜间充质干细胞的均一性，也排除了红细胞影响人胎盘绒毛膜间充质干细胞贴壁的局限。
附图说明
图1是P3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞细胞形态图；
图2 是流式细胞检测获得的人胎盘绒毛膜间充质干细胞P3代的抗体表达情况图；
图3是P3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞生长曲线；
图4是P3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞诱导分化脂肪细胞，油红O染色阳性；成骨细胞，茜素红染色阳性。
具体实施方式
本领域技术人员应认识到下列实施例仅用于说明本发明，而不是视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。有用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。如无特别说明，实施例中的操作均在本领域技术人员所理解的无菌条件下进行。
用于消化细胞的酶为本领域常用的组织消化酶，方便比较起见，本发明中使用等体积比的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ于37℃消化。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
无血清培养基购自Gibco公司，货号为A10334-01；
胰蛋白酶购自Gibco公司，货号为25200056；
胶原酶Ⅱ购自Gibco公司，货号为17101-015；
细胞冻存混合液，购自WAK-Chemie Medical GmbH，货号为WAK-DEX40-50-5。
人胎盘组织的获得和转运：
经医院伦理委员会批准，征得产妇和家属同意书面知情同意的情况下，获取剖宫产健康足月的新生儿胎盘，胎盘无老化钙化，孕妇的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等传染性感染性疾病检测为阴性。将产房获得的胎盘放入无菌盒中，加入500ml生理盐水，并转运至GMP实验室。分娩后6小时内在无菌条件下剪取绒毛膜，并用生理盐水冲洗去除表面血污，备用。
实施例1：
1)取人胎盘绒毛膜组织，剪成1～3cm条块状大小，用生理盐水反复冲洗至无血迹；
2)用手持式电动匀浆器处理绒毛膜至0.1～0.3cm3细小颗粒，再次用生理盐水冲洗至澄清；
3)再次用匀浆器处理至0.1～0.5mm3左右微小颗粒后，离心300r/min，5min，去除上层血细胞；
4)沉淀中加入同体积的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ，于37℃，消化0.5h；
5)消化物用生理盐水离心洗涤两次后，沉淀中加入培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
6)第7天弃除组织块和培养液，用生理盐水冲洗培养瓶底后，加入新鲜培养基，之后每3天更换培养基至细胞融合度达80～90%，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。
实施例2：
1)取人胎盘绒毛膜组织，剪成1～3cm条块状大小，用生理盐水反复冲洗至无血迹；
2)用手持式电动匀浆器处理绒毛膜至0.1～0.3cm3细小颗粒，再次用生理盐水冲洗至澄清；
3)再次用匀浆器处理至0.1～0.5mm3左右微小颗粒后，离心500r/min，5min，去除上层血细胞；
4)沉淀中加入同体积的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ，于37℃，消化1h；
5)消化物用生理盐水离心洗涤两次后，沉淀中加入培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
6)第7天弃除组织块和培养液，用生理盐水冲洗培养瓶底后，加入新鲜培养基，之后每3天更换培养基至细胞融合度达80～90%，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。
人胎盘绒毛膜间充质干细胞的传代、冻存和复苏
传代：当培养瓶中细胞达到80-90%融合状态时，移除培养基，用生理盐水冲洗培养瓶两次，加入3ml胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化约3-5分钟，加入培养基15ml，终止胰酶消化作用，取100ul用于计细胞活率和细胞数。离心（1500r/min，5min）后按1:2传代接种，置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中，一般2-3天即可达到80-90%融合状态，需要再次传代。
冻存：达到需要冻存的代数时，按照传代消化后，根据细胞数量，加入培养基和细胞冻存液，使得细胞浓度为1×106/ml，细胞冻存液为10%。混匀后，分装于2ml的冻存管中，转移至程序降温仪中，按照第一步降温速度为5℃/min，降到4℃，第二步降温速度为1℃/min，降到-45℃，第三步降温速度为5℃/min，降到-100℃。当温度到达-100℃，取出冻存盒，转移至-196℃液氮中。
复温：需要复温时，从液氮中取出冻存管，立即置于37-42℃水浴箱中并不断摇晃冻存管，吸取溶化后的细胞悬液于离心管中，加入5-10ml培养基，然后离心（1500r/min，5min），去除上清液，沉淀加入培养基后置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中静止培养，第二天即可见细胞贴壁生长，细胞达到80-90%融合状态时，进行传代。
对比例1：人胎盘绒毛膜间充质干细胞的酶消化分离培养方法
1)在脐带附件剪取3-6个胎盘小叶，用手术眼科剪剪碎至1mm3大小，35g绒毛膜湿重组织需要耗时2-3h的人力；
2)加入50ml离心管中，室温，离心500r/min，5min，去除上清液；
3)沉淀中加入同体积的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ，于37℃，消化8-16h；
4)用生理盐水离心（1500r/min，5min）洗涤两次后，用200um网筛过滤，该过程需要不断挤压组织液和冲洗，需要耗时2-3h，获得消化后的单核细胞和胎血中的各类细胞；
5)加入Ficoll分离液中，离心去除大部分红细胞，分离出单个核细胞，用生理盐水离心（1500r/min，5min）洗涤两次后，沉淀加入培养基；
6)接种1-2个T75培养瓶，置于饱和湿度、37℃、5%CO2的培养箱中静止培养，细胞达到80-90%融合状态时，进行传代。
对比例2：人胎盘绒毛膜间充质干细胞的组织块分离培养方法
1)在脐带附件剪取3-6个胎盘小叶，用手术眼科剪剪碎至1mm3大小，35g绒毛膜湿重组织需要耗时2-3h的人力；
2)用镊子把处理好的组织块铺排在Φ100mm培养皿中，每35g绒毛膜组织接种约3-4个Φ100mm培养皿，把培养皿倒置于37℃、5%CO2的培养箱中0.5-2h；
3)在每个培养皿中，轻轻沿培养皿边缘加入5ml培养基，将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中静止培养；
4)7天后，置于倒置显微镜下观察，可以看到少数细胞从组织块的边沿爬出来，数量少而且不明显，轻轻吸出培养基，加入新鲜培养基10ml，置于培养箱中继续培养；
5)培养的第15天，爬出的细胞形成生长集落，一般情况下，4个培养皿约有2-3个集落，剔除培养组织块，用生理盐水冲洗培养皿底，加入10ml新鲜培养基，细胞达到80-90%融合状态时，进行传代。
人胎盘绒毛膜间充质干细胞的生物学特性鉴定：
（1）人胎盘绒毛膜间充质干细胞表面标记物检测
人胎盘绒毛膜间充质干细胞表面标记检测：取培养至第三代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，调节细胞浓度为1×109L-1，用流式抗体CD45、CD34、、CD14、CD19、HLA-DR 、CD90、CD105、CD73和相应的同型对照各10ul标记，混匀后避光室温孵育30min，用PBS洗涤2次（1500 r/min，5min），重重悬后用流式细胞仪进行检测，收取10000个细胞数，分析该群细胞中，表面标记物的表达率。需要达到CD90、CD105和CD73的表达率大于95%，CD45、CD34、、CD14、CD19和HLA-DR的表达率小于2%。
（2）人胎盘绒毛膜间充质干细胞诱导分化检测
成骨诱导分化检测：取培养至第三代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，接种于24孔培养板，当细胞长到80%融合度时，换成成骨诱导培养基，培养四周后，用茜素红染色试剂盒染色，倒置显微镜下观察分析和拍照。
成脂诱导分化检测：取培养至第三代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，接种于24孔培养板，当细胞长到80%融合度时，换成成脂诱导培养基，培养四周后，用油红O染色试剂盒染色，倒置显微镜下观察分析和拍照。
（3）人胎盘绒毛膜间充质干细胞生长曲线检测
取P3代细胞，用培养基吹打成单细胞悬液，以2×104/cm2接种于96孔板上，设置7组，每组7孔，置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养，每隔24h，任意选择一组，加入10ul CCK-8溶液，酶标仪检测各组细胞吸光度值（激发波长450nm），用无细胞的培养基做空白对照，连续7天，每天取7孔的吸光度均值绘制生长曲线。
（4）人胎盘绒毛膜间充质干细胞传染感染性因素检查
取P3代细胞，用培养基吹打成单细胞悬液，排除包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等传染性感染性疾病，并排除细菌、真菌和支原体等污染。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改造，这些变化和改造都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，包括如下步骤：
1）取人胎盘绒毛膜组织，剪成1-3cm条块状，用生理盐水充分冲洗，并称量绒毛膜湿重；
2）用手持式电动匀浆器处理绒毛膜至细小颗粒，再次用生理盐水冲洗至澄清；
3）再次用匀浆器处理至微小颗粒后，离心去除上层血细胞；
4）沉淀中加入同体积的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ，于37℃消化；
5）用生理盐水离心洗涤两次后，沉淀中加入培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
6）第7天弃除组织块和培养液，用生理盐水冲洗培养瓶底后，加入新鲜培养基，之后每3天更换培养基至细胞融合度达80-90%，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：人胎盘绒毛膜组织取自产后6小时内，无老化钙化、无传染性疾病的胎盘，并用生理盐水充分冲洗绒毛膜组织上的血液。
3.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：人胎盘绒毛膜组织厚度为0.3～0.5cm。
4.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：人胎盘绒毛膜组织为整个胎盘的绒毛膜组织。
5.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：细小颗粒的大小为0.1～0.3cm3。
6.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：匀浆器处理时，绒毛膜组织与生理盐水的体积为1：（2～3）。
7.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：匀浆器处理时，温度为4～25℃。
8.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：微小颗粒的大小为0.1～0.5mm3。
9.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：离心去除上层血细胞的离心条件为：转速300～500 r/min，5min，4℃。
10.根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法，其特征在于：胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ的消化时间为0.5～3h。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165523A (zh) * 2018-03-02 2018-06-15 贵州泛特尔细胞生物技术有限公司 一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法
CN110257326A (zh) * 2019-06-11 2019-09-20 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种胎盘间充质干细胞的制备方法
CN110592006A (zh) * 2019-08-14 2019-12-20 广州乾晖生物科技有限公司 人源间充质干细胞库及构建方法
CN111979177A (zh) * 2020-07-20 2020-11-24 深圳市中佳生物医疗科技有限公司 一种人胆管上皮细胞的制备方法及其培养基

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102146359A (zh) * 2011-01-13 2011-08-10 王泰华 从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法
CN102920734A (zh) * 2012-11-14 2013-02-13 青岛奥克生物开发有限公司 一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用
CN103555663A (zh) * 2013-11-19 2014-02-05 武汉道培胎盘干细胞生物技术有限公司 一种培养人羊膜间充质干细胞的方法
CN106032529A (zh) * 2016-07-06 2016-10-19 章毅 胎盘间充质干细胞体外分离、扩增和诱导分化的方法
CN106282107A (zh) * 2016-08-30 2017-01-04 章毅 人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102146359A (zh) * 2011-01-13 2011-08-10 王泰华 从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法
CN102920734A (zh) * 2012-11-14 2013-02-13 青岛奥克生物开发有限公司 一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用
CN103555663A (zh) * 2013-11-19 2014-02-05 武汉道培胎盘干细胞生物技术有限公司 一种培养人羊膜间充质干细胞的方法
CN106032529A (zh) * 2016-07-06 2016-10-19 章毅 胎盘间充质干细胞体外分离、扩增和诱导分化的方法
CN106282107A (zh) * 2016-08-30 2017-01-04 章毅 人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
唐书生等: "人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养的新方法", 《生物医学工程研究》 *
金宇林等: "人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养：组织块法的优化", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165523A (zh) * 2018-03-02 2018-06-15 贵州泛特尔细胞生物技术有限公司 一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法
CN110257326A (zh) * 2019-06-11 2019-09-20 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种胎盘间充质干细胞的制备方法
CN110592006A (zh) * 2019-08-14 2019-12-20 广州乾晖生物科技有限公司 人源间充质干细胞库及构建方法
CN111979177A (zh) * 2020-07-20 2020-11-24 深圳市中佳生物医疗科技有限公司 一种人胆管上皮细胞的制备方法及其培养基
CN111979177B (zh) * 2020-07-20 2023-05-16 深圳市中佳生物医疗科技有限公司 一种人胆管上皮细胞的制备方法及其培养基

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