CN108165523A - 一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法 - Google Patents

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法 Download PDF

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Abstract

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其具体操作步骤包括顺次执行的机械分离绒毛膜组织、胰酶消化、胶原酶Ⅱ消化、细胞过滤、传代纯化、冻存检测等操作步骤。采用该方案来培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞所获得的细胞数量大，而且产量高，稳定不易污染且培养成本低。

Description

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物科学领域中的干细胞分离技术，具体涉及一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法。
背景技术
在生物科学领域中，间充质干细胞被认为是一类能够自我更新，具有多向分化能力的干细胞。其最早是在骨髓中发现，后来经证实，在脂肪、骨膜、滑膜、肌肉、牙髓及脐血等多种组织中都存在这种细胞。有研究表明，脐带及胎盘来源的间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞具有相同的生物学特性，而且，胎盘作为分娩后的废弃物，不存在侵入性的获取过程，且与传统骨髓间充质干细胞相比，具有更强的增殖能力。因此，胎盘来源的间充质干细胞在生物科学领域中具有相当广阔的应用前景。
人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞(human chorionderived mesenchymal stemcells，hCDMSC) 是一类新兴的干细胞来源，因其取材方便，不受伦理学限制等优点，受到了越来越多学者的关注。由于hCDMSC在组织工程、干细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的应用前景，且由于其特殊的生物特性，间充质干细胞在组织工程和自身免疫、移植物抗宿主病等多个方面备受关注，被认为是今后干细胞研究中的热点领域。但是国内暂无有关hCDMSC的报道，国外的报道也很少，因此对hCDMSC的分离技术、生物学特性认识很有限，很大程度上限制了hCDMSC的广泛应用和推广，而相应的分离技术也相对落后，操作复杂、分离困难且培养效果差、产量低，还容易出现产生二次污染。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，采用该方法来培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞所获得的细胞数量大，而且产量高，稳定不易污染且培养成本低，以解决上述技术背景中的缺陷。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，包括以下操作步骤：
1）使用无菌止血钳剥除胎盘的羊膜层并将胎盘蜕膜部分剪下，然后将处理后的胎盘放入培养皿中用生理盐水冲洗，除去较大的血块。
2）将除下的羊膜层剪成2*2cm2大小，并转移到加入青链霉素的生理盐水培养皿中，将其浸泡2min；用止血钳将蜕膜部分的绒毛膜层进行分离，并将分离后的绒毛膜层转移到装有生理盐水的培养皿中备用。
3）将步骤2）中处理好后的绒毛膜层按4~6g每份分开，分别用有齿镊转移到50ml离心管中，并用剪头组织剪将其剪碎，然后用生理盐水定容至40ml，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用。
4）将步骤3）中处理后的组织块加入新的离心管中用胰酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用。
5）将步骤4）中处理后的组织块加入新的离心管中用胶原酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，将过滤后的细胞悬液配平后利用离心分离，弃上清液，然后将分离后的离心管底部的细胞用生理盐水吹打均匀，配平后再次进行离心分离，弃上清液。
6）将经过步骤5）处理的离心管先用3ml加有青链霉素的培养基将离心管底部的细胞团吹散，再加入12ml加有青链霉素的培养基吹打均匀，平均分配到3个T75培养瓶中，再往每个培养瓶中加入培养基至9ml，然后在培养箱中进行培养。
7）将培养箱培养48min后内进行换液，即将原代培养的培养基全部吸出，然后加有青链霉素的培养基，在培养箱中继续培养，之后每隔3天进行一次换液循环。
8）待细胞铺满瓶底的70~80%时进行细胞传代，将培养瓶中的培养基上清倒出，加入生理盐水冲洗细胞，然后在培养瓶中加入胰酶进行消化处理，待瓶底细胞60~80%变圆脱落后加入15~20ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，无需冲洗培养瓶底部细胞，将过滤后的细胞悬液配平后进行离心分离，弃上清液。
9）将步骤8）中处理后的培养瓶先用3ml无抗生素的培养基吹散离心管底部细胞团，在加入17ml无抗生素培养基吹匀，取2~3滴细胞悬液用细胞计数仪计数，然后按照密度2.0~2.5*106个/T75瓶的细胞量进行细胞种植，添加无抗生素培养基至9ml每瓶后用十字交叉法晃匀，放入培养箱中进行培养。
10）待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时再次传代，重复步骤8）以及步骤9），使接种密度降低为1.5*106个/T75培养瓶。
11）待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时再次传代，重复步骤8）以及步骤9），将传代细胞按照2.5*106接种到T175培养瓶中，体积为25ml。
12）待T175培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时进行细胞冻存，将培养瓶中的培养基上清倒出，加入生理盐水冲洗细胞，冲洗完成后在每个培养瓶用胰酶进行消化处理，待瓶底细胞变圆脱落后加入20~30ml生理盐水终止消化，将细胞悬液倒入新的离心管中配平后进行离心分离，弃上清液。
13）取步骤12）处理后的离心管，先用3ml生理盐水吹散离心管底部细胞团，再用17ml生理盐水将细胞彻底吹打均匀，取2~3滴细胞悬液用细胞计数仪计数。
14）将步骤13）中取样后的细胞悬液定容至40ml，配平后离心分离，然后向离心管中细胞先加入2ml培养基吹打均匀，再加入2ml含有质量浓度20%DMSO的冻存培养基吹打均匀，然后均匀分装到3个细胞冻存管中即得成品干细胞。
作为本发明的进一步限定：
所述步骤3）与所述步骤4）中进行离心分离时，控制离心机转速为2000rpm，离心操作时间为4~8min，优选为5min。
所述步骤4）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，且加入的胰酶与组织块体积比为3:1，并利用恒温振荡器在37℃的温度条件下消化15min。
所述步骤4）中用胶原酶进行消化处理时，采用2.5mg/mL的胶原酶进行消化处理，且加入的胶原酶与组织块的体积比为4:1，并利用恒温振荡器在37℃的温度条件下消化45min。
所述步骤5）、步骤8）、步骤12）、步骤14）中进行离心分离时，控制离心机在300G条件下离心10min，即完成离心分离操作。
所述步骤8）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，而每个培养瓶中加入的胰酶量为3ml，消化时间为2分钟。
所述步骤6）、步骤7）、步骤9）中利用培养箱进行培养时，控制培养箱温度在37℃恒温、CO2体积浓度为5%以获得最优的培养效果。
所述步骤12）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，而每个培养瓶中加入的胰酶量为5ml，消化时间为2分钟。
所述步骤14）中，往离心管中细胞中加入的培养基和冻存培养基均在4℃的冰箱中进行预冷。
在本发明中，分装到细胞冻存管中的成品干细胞在进行保存时，需要在封口后存入冻存盒进行程序性降温，最后转移至-196℃液氮储存罐中储存。
有益效果：本发明一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法能在体外对人胎盘绒毛膜干细胞进行高效分离培养，其仅将胎盘中的羊膜层和蜕膜层分离，而非将整个胎膜混合消化，这样有效减少了杂细胞的数量及种类，其分离培养后可获得大量的绒毛膜干细胞，而操作步骤简便快捷，为临床研究和生产提供了更为方便快捷的细胞来源，有效解决了绒毛膜干细胞短缺的现实问题。
附图说明
图1为本发明的培养方法下第7天的P0代细胞培养的显微图。
图2为本发明的培养方法下第11天的P0代细胞培养的显微图。
图3为本发明的培养方法下第15天的P1代细胞培养的显微图。
图4为本发明的培养方法下第18天的P2代细胞培养的显微图。
图5为本发明的培养方法下第21天的P3代细胞培养的显微图。
图6为本发明的培养方法下第24天的P4代细胞培养的显微图。
图7为本发明的培养方法下的三组样本的细胞倍增数量图。
图8为样本在流式细胞仪中检测的绒毛膜细胞表面标志物的参数图A。
图9为样本在流式细胞仪中检测的绒毛膜细胞表面标志物的参数图B。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
在本实施例中，先使用无菌止血钳剥除胎盘的羊膜层，并将胎盘蜕膜部分剪下，分贝放入新的培养皿中，用生理盐水洗涤 3 次，除去较大的血块，然后将剪下的羊膜层部分剪成2*2cm2大小，转移到加入青链霉素的生理盐水培养皿中，将其浸泡2min；并用止血钳将蜕膜部分分离，并将分离后的绒毛膜层转移到新的装有生理盐水的培养皿中待用，分离的绒毛膜层重量在5g左右。
将分离好的绒毛膜层用有齿镊转移到50ml离心管中，用剪头组织剪将其剪碎，用生理盐水定容至40ml，配平后2000rpm离心5min，弃上清，组织块用质量浓度0.125%胰酶进行消化处理，胰酶与组织块体积比为3:1，恒温振荡器37℃消化15min，在消化好的离心管中加入30ml生理盐水终止消化，配平后2000rpm离心5min，弃上清；然后向离心管的组织块中加入2.5mg/mL的胶原酶，胶原酶与组织块的体积比为4:1，恒温振荡器37℃消化45min，在消化好的离心管中加入30ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，将过滤后的细胞悬液配平后300G离心10min，弃上清，并将离心管底部的细胞用生理盐水吹打均匀，配平后在300G条件下进行二次离心操作，离心10min，弃上清，并取上述弃上清的带组织物的离心管，先用3ml加有青链霉素的培养基将离心管底部的细胞团吹散，再加入12ml吹打均匀，平均分配到3个T75培养瓶中，每个培养瓶中加入培养基至9ml，在37℃，5%体积浓度CO2浓度培养箱中培养；培养48min后内进行换液，将原代培养的培养基全部吸出，加入等量的有青链霉素的培养基，在37℃，5%体积浓度的CO2培养箱中培养，之后每隔3天进行一次换液。且自上述步骤开始，每隔一段时间从培养基中取样，并将样品送电镜观察。
待细胞铺满瓶底的70~80%时进行细胞传代，此为第二次纯化绒毛膜干细胞，操作时将培养瓶中的培养基上清倒出，加入适量的生理盐水冲洗细胞，每个培养瓶中加入3ml、质量浓度0.125%的胰酶消化2分钟后，待瓶底细胞60~80%变圆脱落后加入15~20ml生理盐水终止消化以有效减少杂细胞的含量，此时用100μm的细胞滤网过滤，无需冲洗培养瓶底部细胞，将过滤后的细胞悬液配平后300G离心10min，弃上清待用；取上述弃上清的带组织物的离心管先用3ml无抗生素的培养基吹散离心管底部细胞团，在加入17ml无抗生素培养基吹匀，取2~3滴细胞悬液细胞计数仪计数：按照密度2.0~2.5*106个/T75瓶的细胞量进行细胞种植，添加无抗生素培养基至9ml每瓶后十字交叉法晃匀，在37℃，5%体积浓度的CO2培养箱中培养；待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时方可再次传代。
重复上段文字中描述的操作步骤，将接种密度降低为1.5*106个/T75培养瓶。
待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时方可再次传代，重复上上段文字描述的上述步骤，此次传代细胞按照2.5*106接种到T175培养瓶中，体积为25ml。
待T175培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时进行细胞冻存，目的是为了三次纯化，得到符合临床干细胞的要求和能收获更多的细胞以备运用，此时将培养瓶中的培养基上清倒出，加入适量的生理盐水冲洗细胞，每个培养瓶中加入5ml、质量浓度0.125%的姨酶消化2分钟后，待瓶底细胞变圆脱落后加入30ml生理盐水终止消化，将细胞悬液倒入新离心管中配平后300G离心10min，弃上清，将组织液先用3ml生理盐水吹散离心管底部细胞团，在加入17ml生理盐水将细胞彻底吹打均匀，取2~3滴细胞悬液细胞计数仪计数，取2*106个细胞送检流式细胞仪检测绒毛膜细胞表面标志物，并得到如图8、图9所示的结果，经流式细胞仪检测，绒毛膜干细胞不表达造血干细胞表面标记CD34(0.51%)、单核细胞及其前体CD14（1.04%），强表达间充质干细胞表面标记CD73（99.57%）、CD90（99.87%）、CD105（97.15%）。
在本实施例中，得到根据电镜观察结果分别得到图1~图6的P0、P1、P2、P3、P4代细胞培养的显微图，从图片中可以看出，细胞培养在P2代时形态呈现均一，长梭形，P3代后细胞倍增速度迅速增加。而以相同培养方法培养三组样本，三组样本的细胞倍增数量图基本一致，且如图7所示。
将取样后的细胞悬液定容至40ml，配平后300G离心10min，将上清收集到新离心管中，用10ml注射器吸取10ml（每瓶5ml）上清液注入需厌氧瓶需厌氧菌进行检测，筛除不良样品。然后向离心管中细胞先加入2ml培养基吹打均匀，再加入2ml含有质量浓度20%DMSO的冻存培养基吹打均匀（培养基和含有20%DMSO的冻存培养基均在4℃冰箱预冷），均匀分装到3个细胞冻存管中，封口后放入冻存盒进行程序性降温，最后转移至-196℃液氮储存罐中储存。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1）使用无菌止血钳剥除胎盘的羊膜层并将胎盘蜕膜部分剪下，然后将处理后的胎盘放入培养皿中用生理盐水冲洗，除去较大的血块；
2）将除下的羊膜层剪成2*2cm2大小，并转移到加入青链霉素的生理盐水培养皿中，将其浸泡2min；用止血钳将蜕膜部分的绒毛膜层进行分离，并将分离后的绒毛膜层转移到装有生理盐水的培养皿中备用；
3）将步骤2）中处理好后的绒毛膜层按4~6g每份分开，分别用有齿镊转移到50ml离心管中，并用剪头组织剪将其剪碎，然后用生理盐水定容至40ml，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用；
4）将步骤3）中处理后的组织块加入新的离心管中用胰酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用；
5）将步骤4）中处理后的组织块加入新的离心管中用胶原酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，将过滤后的细胞悬液配平后利用离心分离，弃上清液，然后将分离后的离心管底部的细胞用生理盐水吹打均匀，配平后再次进行离心分离，弃上清液；
6）将经过步骤5）处理的离心管先用3ml加有青链霉素的培养基将离心管底部的细胞团吹散，再加入12ml加有青链霉素的培养基吹打均匀，平均分配到3个T75培养瓶中，再往每个培养瓶中加入培养基至9ml，然后在培养箱中进行培养；
7）将培养箱培养48min后内进行换液，即将原代培养的培养基全部吸出，然后加有青链霉素的培养基，在培养箱中继续培养，之后每隔3天进行一次换液循环；
8）待细胞铺满瓶底的70~80%时进行细胞传代，将培养瓶中的培养基上清倒出，加入生理盐水冲洗细胞，然后在每个培养瓶中加入胰酶进行消化处理，待瓶底细胞60~80%变圆脱落后加入15~20ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，无需冲洗培养瓶底部细胞，将过滤后的细胞悬液配平后进行离心分离，弃上清液；
9）将步骤8）中处理后的培养瓶先用3ml无抗生素的培养基吹散离心管底部细胞团，在加入17ml无抗生素培养基吹匀，取2~3滴细胞悬液用细胞计数仪计数，然后按照密度2.0~2.5*106个/T75瓶的细胞量进行细胞种植，添加无抗生素培养基至9ml每瓶后用十字交叉法晃匀，放入培养箱中进行培养；
10）待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时再次传代，重复步骤8）以及步骤9），使接种密度降低为1.5*106个/T75培养瓶；
11）待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时再次传代，重复步骤8）以及步骤9），将传代细胞按照2.5*106接种到T175培养瓶中，体积为25ml；
12）待T175培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时进行细胞冻存，将培养瓶中的培养基上清倒出，加入生理盐水冲洗细胞，冲洗完成后在每个培养瓶用胰酶进行消化处理，待瓶底细胞变圆脱落后加入20~30ml生理盐水终止消化，将细胞悬液倒入新的离心管中配平后进行离心分离，弃上清液；
13）取步骤12）处理后的离心管，先用3ml生理盐水吹散离心管底部细胞团，再用17ml生理盐水将细胞彻底吹打均匀，取2~3滴细胞悬液用细胞计数仪计数；
14）将步骤13）中取样后的细胞悬液定容至40ml，配平后离心分离，然后向离心管中细胞先加入2ml培养基吹打均匀，再加入2ml含有20%质量浓度DMSO的冻存培养基吹打均匀，然后均匀分装到3个细胞冻存管中即得成品干细胞。
2.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤3）与所述步骤4）中进行离心分离时，控制离心机转速为2000rpm，离心操作时间为5min。
3.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤4）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，且加入的胰酶与组织块体积比为3:1，并利用恒温振荡器在37℃的温度条件下消化15min。
4.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤4）中用胶原酶进行消化处理时，采用2.5mg/mL的胶原酶进行消化处理，且加入的胶原酶与组织块的体积比为4:1，并利用恒温振荡器在37℃的温度条件下消化45min。
5.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤5）、步骤8）、步骤12）、步骤14）中进行离心分离时，控制离心机在300G条件下离心10min，即完成离心分离操作。
6.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤8）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，而每个培养瓶中加入的胰酶量为3ml，消化时间为2分钟。
7.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤6）、步骤7）、步骤9）中利用培养箱进行培养时，控制培养箱温度在37℃恒温、CO2体积浓度为5%以获得最优的培养效果。
8.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤12）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，而每个培养瓶中加入的胰酶量为5ml，消化时间为2分钟。
9.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤14）中，往离心管中细胞中加入的培养基和冻存培养基均在4℃的冰箱中进行预冷。
10.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，分装到细胞冻存管中的成品干细胞在进行保存时，需要在封口后存入冻存盒进行程序性降温，最后转移至-196℃液氮储存罐中储存。
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