KR20090008784A - 저강도 초음파를 이용하여 조직 및 세포에서 중간엽줄기세포를 효율적으로 분리 증식하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재생치료를 위한 중간엽줄기세포를 충분히 확보하기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 40 kHz의 주파수로, 200 mW/cm² 이하의 강도를 갖는 초음파 발생장치를 이용하여 조직 혹은 세포에 50~150 mW/cm² 의 자극을 주어 세포를 기질에서 분리하고 또한 분리된 세포에서 증식 효율을 높이는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 제대조직에서 중간엽줄기세포를 유리시켜서 배양하여 증식시키고자 할 때, 고식적으로 사용되던 효소처리법과 비교하여 많은 수의 세포를 얻을 수 있어, 비용 효과면에서 유리하며, 효소와 같은 외부물질과의 접촉을 최소화하여 재생치료에 보다 적합한 안전한 중간엽줄기세포를 얻을 수 있다.

중간엽줄기세포, 저강도 초음파, 재생치료

Description

저강도 초음파를 이용하여 조직 및 세포에서 중간엽 줄기세포를 효율적으로 분리 증식하는 방법 {Method to isolate and culture of mesenchymal stem cells from human tissues and thier cells efficiently using low-intensity ultrasound}

본 발명은 기질이 많은 제대조직 속의 중간엽 줄기세포를 효과적으로 분리증식하기 위하여, 잘게 자른 제대 조직에 적절한 저강도 초음파 자극을 하게 되면, 일차배양에서 분리되는 중간엽 줄기세포의 수 및 증식정도가 높아지게 되는 배양방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 중간엽줄기세포의 분리는 제대뿐 아니라 태반, 양막등 세포외 기질이 존재하는 인체 조직에서 세포만을 분리하고자 할 때 기질과의 결합력을 느슨하게 하기 위한 효소를 대신하여, 그 보다 효율적으로 세포를 분리할 수 있다.

또한 조직 뿐 아니라 여타의 방법으로 분리된 중간엽 줄기세포에 적절한 저강도 초음파를 자극하여 줄기세포의 증식을 유도하는 방법에 관한 것이다.

더욱 자세히는, 본 발명은 재생치료용 중간엽줄기세포를 다량 확보하기 위한 초음파 처리방법에 대한 것으로, 상세히 기술하면, 잘게 자른 제대조직 혹은 확립 된 세포를 대상으로, 40 kHz의 주파수로, 200 mW/cm² 이하의 강도를 갖는 초음파 발생장치에 처리하여 50~150 mW/cm² 의 강도로 자극하면, 보다 많은 수의 중간엽줄기세포를 얻을 수 있도록 구성된 방법에 관한 것이다.

섬유아세포양 형태를 갖는 중간엽줄기세포는 손상된 조직의 재생이나 복구에 널리 이용되고 있다. 중간엽줄기세포 혹은 단핵구를 이용하여 연골손상이나 심근경색의 치료에 이용하는 중개연구는 일부 상용화되어 있거나 임상시험중으로 실용화 전단계까지 와 있는 것도 있다.

중간엽줄기세포를 실제 인체의 재생치료에 이용하기 위하여는 어느 조직에서 유래하는가도 중요하지만, 충분한 양의 일정량의, 질 높은 (노화가 적고 분화적응이 빠른) 중간엽 줄기세포의 확보가 관건이다.

중간엽줄기세포는 인체의 각 조직에 분포하지만, 그 접근성의 한계로 주로 골수, 지방조직, 제대혈, 제대, 태반 및 피부조직이 연구에 이용된다. 특히 이들중 가장 획득하기 쉬운 조직이 출산 부산물인 제대, 제대혈, 태반, 융모막 등이며, 이 세포는 또한 인체에서 가장 어린 세포이기도 하다.

제대혈은 조혈모세포원인 동시에 중간엽줄기세포원이지만 중간엽줄기세포를 분리하는데 한 달 이상의 시간이 걸리며, 현재까지의 분리 성공율도 50%가 되지 않는다. 이에 반해 제대에서는 100%의 중간엽줄기세포 분리 성공율이 보고되고 있어, 제대는 이상적인 중간엽줄기세포 공급원이다.

제대에는 두개의 동맥과 한개의 정맥이 포함되어 있으며, 그 주위를 Wharton's jelly라고 하는 결체조직이 둘러싸고 있다. 이 결체조직에 묻혀있는 세포 혹은 혈관주위세포들이 중간엽줄기세포로 생각되고 있으며, 이들 조직에서 세포를 효과적으로 분리하기 위하여 대부분의 연구자들은 collagenase라는 효소를 이용하고 있다 (Sarugaser et al, 2005; Lu et al, 2006; Karahuseyinoglu et al, 2007). 그러나 이 방법은 적어도 30분 이상의 처리시간이 소요되며, 세포 수득률이 적어 인간의 질병치료를 목적으로하는 재생의학에 치료제로서 쓰이기는 어렵다.

일반적으로 저강도 초음파는 그 기전은 정확히 알려진 바 없으나 골아세포와 섬유아세포의 성장에 관여하며, 골유합을 돕고, 체외 혹은 체외 배양에서 연골로의 분화를 촉진한다고 알려져 있다(Rubin et al, 2001).

본 발명자들은 이러한 저강도 초음파가 결체조직이 많은 제대에서 효과적으로 중간엽줄기세포를 분리시킴을 확인하였고, 조직 뿐 아니라 확보된 중간엽 줄기세포에서도 세포의 증식에 관여하여, 보다 많은 수의 세포를 확보할 수 있는 효율 좋은 방법임을 알아내었기에 본 방법을 완성하였다.

동일한 공여자에서 확보한 제대에서 보다 많은 수의 중간엽줄기세포를 효율 적으로 분리 증식 배양하여 재생치료에 필요한 충분한 수의 세포를 얻을 수 있었다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 혈액을 제거한 제대조직을 1~2 mm³ 이하의 작은 조직으로 잘라 배양액에 부유하여 조직부유액을 만드는 단계, (b) 조직부유액을, 40 kHz의 주파수로, 200 mW/cm² 이하의 강도를 갖는 초음파 발생장치에서 처리하여 50~150 mW/cm² 의 자극강도를 받게 하는 단계, (c) 초음파 처리된 조직부유액을 배양함에 있어, 조직에서 중간엽줄기세포가 유리되어 배양용기에 부착되는 초기 7~14일간 조직을 제외한 배양액만을 부분 치환하며 배양하는 단계를 포함하며, 또한 (d) 여타의 방법으로 여러 조직이나 세포에 상기 강도의 초음파를 처리하여 중간엽 줄기세포의 다량증식을 유도하거나 분리를 촉진시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 초음파를 1분 이내, 한번에 시행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 주파수 40~60 kHz, 강도 200 mW/cm² 의 일반적인 세척용 초음파기기를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 방법으로 생산된 중간엽줄기세포는 그 세포 자체를 이용하거나 분화시킨 후에 재생치료를 위하여 이용될 수 있다.

본 발명의 방법으로 생산된 중간엽 줄기세포는 그 세포 자체 혹은 분화시킨 후, 여타의 줄기세포와 혼합하여 재생치료에 있어 여타의 줄기세포 기능을 보완하는데 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명의 예시역할이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 해당 업계 통상 지식을 가진자에 있어 자명할 것이다.

특히 이들 실시예에서는 기질속에 존재하는 중간엽 줄기세포를 분리하기 위하여 제대를 사용하였으나, 태반, 양막 등 줄기세포를 세포외 기질에서 유리해야 하는 조직의 처리에 있어, 효소 처리 대신 사용할 수 있는 것은 해당 업계 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예1. 제대조직의 처리

제대는 재태연령 37주에서 42주 사이의 동의를 득한 만삭 산모로부터, 출산시 아기와 산모에 감염등의 이상소견이 없는 정상 육안소견을 보이는 제대를 수득하였다.

상기 제대조직을 무균적으로 1~2 mm³ 로 잘게 잘라, 항생제 및 10% 우태아혈청 (FBS, fetal bovine serum)이 포함된 low-glucose Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM-LG)에 현탁하여 조직부유액을 제조하였다.

실시예 2. 조직부유액의 배양

실시예 1에서의 조직부유액을 배양평판에 적정밀도로 분주한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 조직은 초기 7~14일 동안 충분한 정도의 세포가 유리되어 평판에 콜로니를 형성할 때 까지 유지하였으며, 삼일에 한 번씩 배양액만을 부분 교환하였다.

초음파 처리는 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1의 '조직부유액'을 같은 부피로 두 개의 무균 cone tube로 옮기고, 한 tube에는 주파수 40~60 kHz, 강도 200 mW/cm² 의 일반적인 세척용 초음파를 이용하여 조직부유액 내부의 강도를 50~150 mW/cm² 으로 유지하도록 하여 50~60초간 자극하였다.

초음파를 처리하거나 처리하지 않은 두 군 모두 21일 이내에 평판의 부착세포가 전체면적의 70~80% 정도를 차지하였을 때 0.5% trypsin-EDTA 로 처리하여 평판에서 떼어 낸 후 원심분리로 세포를 수득하였고, 다시 상기 배양액으로 부유하여 10⁴/cm²의 농도로 평판배양하고 일주일에 두 번씩 배지를 교환하였다.

평판에서 떼어낸 세포는 0.4% trypan blue 용액을 이용하여 viability를 측정하였고, Neubauer chanmer를 이용하여 세포수를 산정하였으며, Cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc, MA, USA)로 세포증식을 확인하였다

배양 2~3주째 제대 cm당 획득할 수 있던 중간엽줄기세포수는 초음파를 처리하지 않은 대조군(n=8)에서, 평균 311 x 10³/cm이었다. (range 6.7-1100x10³, SD 408 X 10³).

동량으로 처리된 대조군에 비하여 초음파 처리군에서는 3.3배의 P0 세포를 더 얻을 수 있었고 이는 통계적으로 유의하였다 (n=4, p=0.027).

대조군과 초음파 처리군의 CCK-8 측정으로 대표되는 세포증식능력은 도 1에서와 같이 초음파 처리군에서 높은 증식력을 보였다 (도 1). 또한 P1~P4까지 연속적으로 배양하였을 때, 대조군과 비교하여 높은 증식을 보였으며, 이러한 증식의 차이는 P3에서 가장 많이 관찰할 수 있었다 (도 2).

실시예 3. 제대에서 분리된 세포의 특성

실시예 2에서 수득된 세포는 형태상으로 평판배지에 붙어 자라는 섬유아세포와 같 은 길쭉한 부착세포였으며 역위현미경 관찰소견은 도 3 과 같다.

이러한 세포들이 중간엽 줄기세포와 같은 표면항원을 갖는지를 하기의 방법 (유세포분석 및 분화시험)으로 확인하였다.

얻어진 세포의 일부를 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후 각각 PE (phycoerythrin)와 결합된 CD13, CD34, CD45, CD73, HLA-ABC, CD 144와 반응시키고, FITC (fluoroscein iso thiocyanate)와 결합된 CD14, CD44, HLA-DR, CD31, CD105와 반응시킨후 유세포 분석기 (FACS Aria, BD, San hose, USA)로 형광 양성세포를 분석하였고, 대조군으로는 동일 동물 유래의 isotype control을 사용하였다. 제대에서 유래한 섬유아세포 모양의 부착세포는 CD13, CD44, CD73, CD105, HLA-ABC에 양성을 나타내었고 CD14, CD31, CD45, CD144, HLA-DR 에는 음성을 나타냈다 (도 4).

또한 실시예 2에서 수득된 세포의 분화 잠재력을 확인하기 위하여 골, 연골, 지방세포로 분화유도를 하기와 같이 시행하였다.

지방세포 분화유도를 위하여 3 x 10⁴ cells/9.6 cm² 의 밀도로 LG-DMEM (Gibco. BRL) supplemented 1 mM dexamethasone, 1% ITS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 0.2 mM indomethacin and 10% rabbit serum (Sigma-Aldrich)를 포함하는 지방세포 분화유도 배지에서 2주간 배양하였다. 유도 된 지방세포는 c/EBPα 유전자를 RT-PCR로 확인하고 oil red O 세포화학염색(도 5A, 도 6)으로 확인할 수 있었다.

골분화를 위해서는 획득한 중간엽줄기세포를 3 x 10⁴ cells/9.6cm² 의 밀도로 6-well plate에 분주하였고 10 mM glycerol 2-phosphate (Sigma-Aldrich), 100 nM dexamethasone (Sigma-Aldrich), 50 mM ascorbic-2-phosphate (Sigma-Aldrich)를 포함하는 골분화배양액에서 2주간 배양을 유도하였다.

유도된 골세포는 osteopontin 유전자의 RT-PCR과 von Kossa세포화학염색으로 확인할 수 있었다 (도 5B, 도 6).

연골세포분화를 위해서는 2.5 x 10⁵의 세포를 15 ml polypropylene tube에 pellet culture 하였다. 10 ng/mL TGF b-1 (R&D), 100 nM dexamethasone (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA), 50 mM ascorbic-2-phosphate (Sigma-Aldrich), 50 mM L-proline (Sigma-Aldrich), 1 mM sodium pyruvate, 1% ITS⁺ premix (Gibco: 6.25mg/ml insulin, 6.25 mg/mL tranferrin, 6.25 mg/mL selenious acid, 5.35 mg/mL linoleic acid, and 1.25mg/mL bovine serum albumin)을 포함하는 연골분화 유도배지를 이용하여 3주간 분화시켰다. 유도된 연골세포는 sox-9 유전자의 RT-PCR과 safranin O 세포화학염색으로 확인할 수 있었다(도 5C, 도 6).

실시예 4. 초음파 처리 시간에 따른 세포 분리 및 증식비교

실시예 1에서 얻어진 조직현탁액에 가해지는 가장 효율적인 초음파 자극을 한정하기 위해 상기 초음파를 각 50초, 150초, 300초 처리군으로 나누어 상기와 같이 배양였다. 초음파 처리시간이 길어질수록 현미경 관찰하의 세포수는 적었으며, 세포형태는 길쭉해지는 양상을 보였다 (도 7). Passage 1 (P1)에서의 증식도를 비교해 보면, 세포 증식도는 50초 처리군에서 가장 높고, 시간이 길어질수록 증식력이 감소하였으며 이는 통계적으로 유의하였다 (도 8).

실시예 5. 조직이 아닌 세포에서의 단계별 초음파 처리에 따른 영향 비교를 위하여, 대조군과 실험군에서 일차배양된 세포를 passage 1에서 다시 두 군으로 나누어 상기와 동일한 초음파를 처리하여, '대조-대조', '대조-초음파', '초음파-초음파'와 같이 총 3군으로 나누어 중간엽 줄기세포의 분리와 증식을 비교하였다. '대조-대조'보다 '대조-초음파'의 세포수와 증식이 유의하게 높아 P1 세포 자체에 대한 초음파의 증식유도효과를 확인하였다 (도 9). 그러나 '초음파-초음파' 처리군에서의 증식이 유의하게 낮아서 연속적으로 반복되는 초음파 처리는 오히려 증식에 방해됨을 확인하였다(도 9).

Passage 2 (P2) 세포을 다시 두 군으로 나누어, '대조-대조-대조', '대조-대조-초음파', '초음파-초음파-초음파'로 3개의 실험군을 생성하였을 때, 세포에 대한 증식력을 비교하였다 (도 10). 역시 P2 세포에서도 초음파에 의해서는 증식력이 증가되었으나, 초음파를 세번 처리한 군에서는 오히려 증식에 방해가 되었다.

실시예 6. 조직에서의 세포 유리법과 관련하여 초음파와 고식적인 collagenase법을 하기와 같이 비교하였다. 실시예 1에서의 조직부유액을 collagenase 처리군 (0.1% collagenase, 30분 처리한 후 배양)과 초음파군, 아무것도 처리하지 않은 대조군으로 나누어 비교하였을 때, 초음파 처리군에서 유의하게 높은 세포수를 얻을 수 있었다 (도 11).

도 1은 본 발명에 따라 초음파 처리군과 처리하지 않은 군에서의 P1 에서의 증식력을 비교한 것이다.

도 2는 P1, P2, P3, P4에서의 세포의 증식력을 연속하여 비교한 것이다. 모든 단계의 배양에서 초음파 처리군이 높은 세포의 증식을 보였으며, 이 증식의 차이는 P3에서 가장 많았다.

도 3은 본 발명에 따라 분리 배양된 중간엽줄기세포의 역위현미경 사진이다.

도 4는 배양된 중간엽줄기세포를 유세포 분석기로 표면항원을 분석하였을 때의 사진이다.

도 5는 본 발명에 따라 분리 배양된 중간엽줄기세포를 분화력을 확인한 것으로 지방세포분화를 oil red O 염색으로 확인한 사진 (A), 골세포 분화를 von Kossa 염색으로 확인한 사진 (B), 및 연골세포 분화를 safranin O 염색으로 확인한 사진이다 (C).

도 6은 지방, 골, 연골세포로의 분화를 각각 c/EBPα, osteopontin, 및 sox-9 유전자 발현으로 확인한 것이다.

도 7은 본 발명에 따른 초음파 처리배양법을 이용하여 각 대조군(A), 50초 (B), 150초 (C), 300초 (D) 씩 자극된 제대조직에서 분리 배양된 중간엽줄기세포의 형태학적 변화를 보여준다.

도 8은 도 7 세포의 P1에서의 증식을 비교한 도표이다.

도 9는 본 발명에 따를 초음파 처리배양법이 분리된 중간엽줄기세포의 증식에 미치 는 영향을 나타낸 것이다. P1에서도 초음파 처리군에서 초음파를 처리하지 않은 군보다 더 많은 수의 세포를 얻을 수 있었으며 증식 또한 증가하였으나, 두번 연속하여 처리한 군에서는 세포수와 증식이 감소하였다.

도 10은 도 9와 동일한 세포의 P2 상태에서 초음파 처리하였을 때 세포수 증식을 비교한 것으로, 역시 두 번 이상 처리군에 있어서는 증식력이 오히려 감소하였다.

도 11은 본 발명에 의한 초음파 처리가 제대조직에서의 중간엽줄기세포 분리 배양에 미치는 효과를 고식적인 collagenase 처리 방법과 비교하여 나타낸 것이다.

Claims (2)

1. 다음의 단계를 포함하는, 조직에서 중간엽 줄기세포를 분리 및 증식 자극하

   는 방법

   (가) 조직을 10 mm3 이하의 작은 조직으로 잘라 배양액에 부유하여 조직 부

   유액을 만드는 단계

   (나) 40 kHz의 주파수로 200 mW/cm2 이하의 강도를 갖는 pulsed 초음파 발생

   장치를 이용하여 처리하여, 총 exposure time을 조절하여, (가)항의 조직부유액에

   50~150 mW/cm2의 자극강도를 받게하는 단계

   (다) (나)항에서 초음파처리된 조직부유액을 배양함에 있어, 간엽줄기세포가

   분리되어 나오는 초기 14일간 조직을 동시배양(co-culture) 하는 단계

   (라) 본 단계는 제대조직에 한정하지 않고, 초음파를 이용하여 중간엽 줄기

   세포를 얻을 수 있는 모든 조직에 적용된다.
2. 다음의 단계를 포함하는, 여타의 배양방법으로 얻어진 중간엽 줄기세포에서

   증식 및 분화를 자극하는 방법

   (가) 40 kHz의 주파수로 200 mW/cm2 이하의 강도를 갖는 pulsed 초음파 발생

   장치를 이용하여 처리하여, 총 exposure time을 조절하여 줄기세포 부유액 혹은 배

   양중인 줄기세포에 50~150 mW/cm2의 자극강도를 받게하는 단계

   (나) 본 단계는 제대조직에 한정하지 않고, 그 원 source tissue에 관계없

   이, 얻어진 중간엽 줄기세포에 처리하는 모든 방법에 적용된다.

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