CN111893092A - 一种人脐带来源的间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，它是采用足月健康胎儿的脐带经过无菌处理，机械剪切，暴露华通胶，经过胶原酶消化后分离培养而成，经冻存复苏后细胞活力无明显下降，是临床使用的理想细胞来源。本发明还涉及经上述方法制备的间充质干细胞，按照国际干细胞研究协会(ISSCR)制定的间充质干细胞的标准进行形态学、免疫表型以及体外分化实验鉴定确认为间充质干细胞。其细胞数量、细胞活力、纯度及其倍增时间、增殖能力均明显高于骨髓来源的间充质干细胞。

Description

一种人脐带来源的间充质干细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及原始间充质干细胞的制备方法，尤其涉及以人脐带华通胶为材料制备人脐带来源的间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)间充质干细胞是来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，是一类具有多向分化潜能的组织干细胞。目前已经进行的临床试验研究证实，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞可以应用于多种疾病的治疗和康复。但是，所有的研究或治疗方案都必须建立在获得足量间充质干细胞的基础上，快速有效的分离间充质干细胞作为种子细胞具有非常重要的研究价值和经济利益。MSC可从成体骨髓、脂肪、牙髓、外周血等多种组织获得，也可从胎儿的脐带、胎盘、脐血等组织获得。脂肪、牙髓与骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，还会增加手术痛苦，并且成体间充质干细胞仅限于自体使用。其他方法如从脐血和外周血中培养MSC具有一定难度，且MSC在足月分娩的脐血或动员的外周血中数量尚存在争议。脐带间充质干细胞来源充足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，也不存在社会、伦理和法律方面的争议，从脐带中分离培养MSC是获得高质量、足够数量MSC的最有效方法，并进行形态学、分化功能和表面标志物等生物学表型鉴定其各种特征。脐带是连于胚胎脐部与胎盘问的索状结构，外被羊膜、内含分化的粘液性结缔组织，结缔组织内除闭锁的卵黄囊和尿囊外，还有脐动脉和脐静脉。脐带中的MSC来源分为四种：①来源于华通胶(Wharton’sjelly，WJ)，它是包裹血管周围的粘蛋白样组织，距血管外周大约3mm，富含透明质酸和葡萄糖胺聚糖，形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构；②来源于脐血管周围；③来源于脐血；④来源于脐静脉血管内皮下。

目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁法操作简便，对实验条件要求低，容易掌握。这种方法的缺点在于，获得原代细胞的周期长，液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，此外，产物中混有部分内皮细胞，需要通过后期的酶消化处理进行进一步的筛选。采用胶原酶消化法可在短时间内获得细胞，且杂细胞少，且操作方便，其中胶原酶消化法多以胶原酶II为主。

人脐带MSC在适当的诱导条件下能向多种组织细胞分化，是理想的组织工程种子细胞。MSC诱导植入有望成为较广泛的细胞治疗于段。研究表明MSC能够植入关节损伤部位可向软骨细胞分化，也能够降低宿主抗移植物的排异反应促进造血干细胞的移植效果；MSC还可应用于神经退行性疾病治疗，在临床研究中取得了不错的效果；也可能成为未来基因缺失的基因治疗载体细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种容易获得大量MSC的原材料，细胞倍增时间短的人脐带间充质干细胞的制备方法，按本发明方法制备的间充质干细胞具有更强的免疫调节、自我更新及多向分化潜能，而且冻存复数后其活率不会明显的降低。

实现本发明目的的技术方案，采用胎儿脐带为原材料制备间充质干细胞。制备方法为：从保存液取出脐带后，用75%的乙醇消毒也浸泡5min消毒，使用含双抗的PBS清洗三次，剪断双侧结扎部分，去除脐带血管内淤血，将脐带浸入含双抗的PBS中，用PBS反复冲洗脐带和脐静脉内腔3次，剔除血管，暴露华通胶，然后将脐带剪成1-3mm₃大小的组织块后放入50ml离心管中，加入质量体积百分比浓度为0.1％的消化液，置于37℃恒温震荡仪内持续消化4～10h，100目筛网过滤，离心收集细胞；加入PBS液冲洗细胞3次，用间充质干细胞培养基溶液重悬细胞，调整细胞密度5×10³～1×10⁴/cm₂，接种于T-175培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后更换培养基，以后每隔3天更换培养基一次，待细胞达到80％融合时，传代培养或冻存备用。

作为优化，制备的间充质干细胞为脐带华通胶、脐带血管周围和脐静脉血管内皮下的任何一种来源或全部。

用于清洗脐带及其血管残留血液的溶液是含有双抗的PBS溶液；冲洗华通胶组织块所用液体含有双抗的PBS溶液。

作为优化，脐带是经过PBS清洗并剔除血管后，剪成1-3mm³的组织块，进入下一分离程序。

用于间充质干细胞的制备方法，用II型胶原酶和胰酶联合消化脐带组织。

作为优化，用于消化脐带组织块的消化液为II型胶原酶和胰酶联合消化混合溶液，其质量体积百分比浓度为0.1％。

作为优化，接种细胞使用的培养基为含有25mmol/L谷氨酰胺与2%UltroserG的Ultraculture SF Medium培养基。

对于按照本发明上述方法制备的间充质干细胞，按照“国际干细胞研究协会”(ISSCR)制定的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征：

a在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；

b表达粘附分子受体标记物CD29、CD44，间质细胞标记CD73、CD105，干细胞标记物CD90；而不表达内皮细胞标记物CD31和造血干细胞标志CD34，也不表达HLA-DR；

c体外可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞。

上述鉴定结果表明被发明制备的间充质干细胞具有上述技术特征，符合间充质干细胞产品合格标准。

按本发明方法制备的间充质干细胞在6-7天的培养周期中，细胞量可增殖20倍，可得到大量富有高活性的间充质干细胞，并能够长时间储存而不失其活性，且操作简单易行，并且经过流式细胞仪检测、免疫抑制、细胞周期检测以及体外分化实验鉴定，获得的间充质干细胞纯度和细胞活性较高，具有良好增殖潜力，可快速建立细胞库，成本低廉，可直接用于科学实验研究和临床治疗，富有应用前景。

附图说明

图1是原代细胞贴壁后的细胞形态图，其中，A为第5天细胞形态；B为第7天细胞形态。

图2是第4代间充质干细胞流式细胞仪检测的免疫表型细胞图。

图3是第4代间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞形态图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不受限于下述实施例。

实施例：人脐带间充质干细胞的制备

经足月待产产妇签署脐带捐献知情同意书后，产妇接受艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体等检测，所有检测结果阴性后为合格，产妇分娩后采集胎儿脐带。

1、脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的0.9％生理盐水中，4℃保存运输至实验室；

2、在生物安全柜中从保存液取出脐带后，用75%的乙醇消毒也浸泡5min消毒，使用含双抗的PBS清洗三次，剪断双侧结扎部分，用PBS冲洗净表面残余血液；

3、剔除血管，暴露华通胶，并将脐带剪成1-3mm3大小的组织块后放入50mL离心管中，加入质量体积百分比浓度0.1％的消化液，置于37℃恒温振荡仪内持续消化6h；

4、100目筛网过滤收集细胞；

5、加入PBS液冲洗细胞3次，用含有25mmol/L谷氨酰胺与2%UltroserG的UltracultureSF Medium培养基重悬细胞，调整细胞密度为(5×10³～1×10⁴)/cm²，接种于T175瓶中，于37℃、5％的CO2孵箱内培养，24h后换液，图1。

人脐带间充质干细胞的细胞特征

1、免疫表型检：CD44，CD73，CD90，CD105，CD28，CD31，CD34，CD40，CD45，CD86，HLA-DR。将第4代人脐带来源的间充质干细胞接种于T175瓶中，待细胞达到80-90％融合时使用5ml胰酶稀释液消化，将细胞悬液转入50ml离心管中并以1200rpm离心5min。离心之后，弃掉上清，生理盐水洗涤2次，分成每管1×10⁶细胞，第一管为空白对照(只含间充质干细胞)，用于调节流式细胞仪的电压，第二管加入同型对照抗体(PE-MOUSEIgGl/FITC-MOUSEIgG1/APC-MouseIgG1κ)10μl，其余管中加入其它相应抗体10μl，混匀，4℃避光孵育30分钟，PBS洗涤1次，离心后弃上清，加入500μlPBS重悬，混匀，即可上机(流式细胞仪Cytoflex，贝克曼公司)检测。细胞免疫表型为：CD44，CD73，CD90，CD105为阳性标记，CD28，CD31，CD34，CD40，CD45，CD86，HLA-DR为阴性标记。

2、细胞的成骨细胞、软骨细胞与脂肪分化潜能及分化后鉴定

消化体外扩增的第4代间充质干细胞，以2×10⁴细胞总数接种于6孔板中，每孔加2ml含有25mmol/L谷氨酰胺与2%UltroserG的Ultraculture SF Medium培养基。在细胞达到60％-80％融合时，更换相应的诱导分化培养基。

2.1成骨诱导分化

诱导分化培养基为含有100nmol/L的地塞米松，10mmol/L的β-甘油磷酸钠，50μmol/L维生素C和10％FBS的α-MEM培养基，每隔2天更换诱导培养基1次，培养21天，PBS洗涤细胞1次，70％乙醇固定10分钟，行骨涎蛋白免疫组化染色，鉴定钙结节的产生。显微镜下观察，诱导后的细胞呈阳性表达。

2.2成软骨诱导分化

,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积为阳性。 min ,流水冲洗2 min ,麦氏苏木素复染5 min min,流水冲洗2 blue孵育5 诱导分化培养基为含有10mg/L的转化生长因子β1、50mg/L的（左旋）维生素C、0.1nmol/L地塞米松、50mg/ml的ITS、1mmol/L的丙酮酸钠、5.35μg/ml的亚油酸和10％FBS的α-MEM培养基，每隔2天更换诱导培养基1次，连续诱导21天，去除培养基，晾干，使用细胞通用Ⅱ型胶原检测试剂盒（晶美生物工程有限公司）免疫组化，按试剂盒说明书操作，用alcian

2.3成脂肪诱导分化

min，蒸馏水冲洗至背景干净，自然晾干后中性树脂封固，显微镜下观察并采集图片，油红O染色显示胞浆中充满红色的油滴为阳性。 min，油红O染液染色30 g/L多聚甲醛固定10诱导分化培养基为含有1μmol/L的地塞米松、10mg/L的胰岛素、0.5mmol/L的1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛和10％FBS的α-MEM培养基，每隔2天更换诱导培养基1次，连续诱导14天，取出盖玻片，PBS洗2次，40

上述方法扩增的间充质干细胞在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍，可得到大量富有活性的脐带间充质干细胞，并能够长时间冻存而不失其活性，且操作简单易行，并且经过流式细胞仪检测和体外分化实验鉴定，获得的间充质干细胞纯度和细胞活性较高，具有良好增殖潜力，可快速建立细胞库，成本低廉，可直接用于科学实验研究和临床治疗，富有应用前景。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (8)

1.一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，它是采用以下工艺方法制备：从保存液取出脐带后，用75%的乙醇消毒也浸泡5min消毒，使用含双抗的PBS清洗三次，剪断双侧结扎部分，去除脐带血管内淤血，将脐带浸入含双抗的PBS中，用PBS反复冲洗脐带和脐静脉内腔3次，剔除血管，暴露华通胶，然后将脐带剪成1-3mm₃大小的组织块后放入50ml离心管中，加入质量体积百分比浓度为0.1％的消化液，置于37℃恒温震荡仪内持续消化4～10h，100目筛网过滤，离心收集细胞；加入PBS液冲洗细胞3次，用间充质干细胞培养基溶液重悬细胞，调整细胞密度5×10³～1×10⁴/cm₂，接种于T-175培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后更换培养基，以后每隔3天更换培养基一次，待细胞达到80％融合时，传代培养或冻存备用。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，制备的间充质干细胞为脐带华通胶、脐带血管周围、脐血和脐静脉血管内皮下的任何一种来源或全部。

3.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脐带采用足月健康胎儿脐带，并且采集之前产妇已接收艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体检测，并全部检测结果为阴性。

4.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，采集后的脐带置于4℃保存，并于6h之内分离脐带。

5.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化液中加入II型胶原酶和胰酶混合液。

6.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，消化脐带组织块的时间为6h。

7.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞培养基为含有25mmol/L谷氨酰胺与2%UltroserG的Ultraculture SFMedium培养基。

8.如权利要求1～7任一项所述方法制备的间充质干细胞，其特征在于，在免疫学表型鉴定中，具有以下技术特征：

①在标准培养条件下在塑料制细胞培养瓶中贴壁生长；

②表达粘附分子受体标记物CD29/CD44，间质细胞标记CD73(SH3)/CD105(SH2)，及干细胞标记物CD90，而低表达或不表达内皮细胞标记物CD31、造血干细胞标志CD34和组织相容性II类抗原HLA-DR；

③体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞。

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