CN104818243A - 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，属于生物技术领域，具体是取新鲜胎盘，用缓冲液洗去污物及血液；分离得到绒毛膜，使用缓冲液洗去绒毛膜中的红细胞；然后将绒毛膜剪碎，用PBS缓冲液进行重悬，然后加入红细胞裂解液，室温裂解3min；然后加入L-DMEM培养基洗涤，离心弃上清，在组织块沉淀中加入含10%-20%FBS的DMEM培养基混匀，接种至细胞培养皿中进行培养。本发明制备过程程序化，简化操作步骤，缩短操作时间，减少工作量，避免污染，减少试剂和耗材的使用量，同时增加了间充质干细胞的产量，所得细胞全部为单一来源的胎盘源胎儿间充质干细胞。

Description

一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简化的胎盘源胎儿干细胞的分离方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。MSC主要存在于结缔组织和器官间质中(如骨髓基质、脂肪、皮肤真皮、胎盘、骨骼肌、脐带血和脐带等)。MSC在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

研究表明，MSC不表达MHC-Ⅱ类分子和FasL，不表达共刺激分子B7-1、B7-2，低水平表达或不表达MHC-Ⅰ类分子、CD40和CD40L。此外，将MSC与异基因外周血单个核细胞或同种异体T淋巴细胞共培养后不能引起同种异体T淋巴细胞显著增殖，说明MSC具有低免疫原性和较低的抗原提呈能力。

鉴于MSC的多向分化潜能和其特殊的免疫学特征，MSC有着广阔的临床应用前景。应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，MSC在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。

2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①胎盘和脐带中的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。⑥潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。但胎盘间充质干细胞的分离提取过程繁琐且提取效率低，间充质干细胞的规模化制备成了其广泛应用的瓶颈。胎盘中细胞种类丰富，获取的间充质干细胞纯度不高也限制了胎盘间充质干细胞在临床上的应用。

目前胎盘间充质干细胞多采用酶消化法和灌流法来制备。酶消化法是将胎盘组织剪成碎块后，用胰蛋白酶或胶原酶消化1-2小时，用含胎牛血清的培养基终止酶消化，然后洗涤细胞弃去消化酶，洗涤后的细胞接种至培养器皿中进行培养扩增。洗涤细胞需时约1小时，且洗涤过程中对细胞损伤较重，操作步骤繁琐，耗时耗力；使用消化酶进行消化时需酶量大，耗材多，易污染，消化酶对细胞损伤亦较重，最终导致获得的细胞活力低、增殖慢。

灌流法是利用胎盘特殊的解剖结构，用灌流液孵育胎盘，从灌流液中分离单个核细胞，洗涤后用间充质干细胞培养基悬浮所获细胞，进行培养。该方法从胎盘组织中提取间充质干细胞，胎盘中血液含量非常多，冲洗时消耗试剂多，且易冲洗不彻底。

胎盘中细胞种类丰富，通过简单的方法获取单一的胎盘源胎儿间充质干细胞是一个亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，将制备过程程序化，简化操作步骤，缩短操作时间，减少工作量，从而也可在很大程度上避免污染，减少制备过程所需试剂和耗材的使用量，同时增加了间充质干细胞的产量，所得细胞全部为单一来源的胎盘源胎儿间充质干细胞。

本发明的一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，是取新鲜胎盘，经过病毒检测合格后，用缓冲液洗去污物及血液；从胎盘中分离得到绒毛膜，使用缓冲液洗去绒毛膜中的红细胞；然后将绒毛膜剪碎，用PBS缓冲液进行重悬，然后加入红细胞裂解液去除红细胞；然后加入L-DMEM培养基洗涤，离心弃上清液，在组织块沉淀中加入含10％-20％体积FBS的DMEM培养基混匀，接种后进行培养。

进一步的，所述接种后培养24h后补加含10％-20％体积FBS的DMEM培养基，继续培养，每3天换一次培养基；培养至8-9天组织块周围出现梭形细胞爬出；培养至16-19天细胞达80％左右融合时进行传代培养；以后每3天传代一次，传代至第三代进行鉴定。

进一步的，所述缓冲液为含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液。

进一步的，所述PBS缓冲液的成分为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L，pH为7.2-7.4。

进一步的，将绒毛膜剪碎成2-3mm³的组织块。

进一步的，所述离心的操作条件为在500-650g条件下离心5-10min。

进一步的，所述组织块沉淀与含10％-20％体积FBS的DMEM培养基的体积比为2.5-3:1。

进一步的，所述传代培养的培养基为L-DMEM和FBS，二者的体积比为9:1。

进一步的，所述培养是在37℃、5％体积CO₂的饱和湿度培养箱中。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明采用改进的组织贴壁法，代替传统的胎盘间充质干细胞分离的方法(即酶消化及灌注法)，从而不需要分离出单个核细胞进行培养，极大的简化了操作步骤，缩短了操作时间，获得同样数量的原代细胞，酶消化需要3h左右，本发明仅需要30min左右的时间，为胎盘源间充质干细胞的规模化生产提供了有力保障。

通过PBS冲洗和红细胞裂解液的裂解，胎盘中污物和红细胞充分去除，避免了污染和红细胞对间充质干细胞增殖的影响。确定了混匀组织块时添加培养基的最佳比例，避免了培养基不足或多余对细胞培养的影响。通过STR(short tandem repeat，短片段重复序列)检测，收获细胞全为单一来源的胎儿间充质干细胞，为细胞的临床应用提供了依据。

附图说明

图1：本发明中人胎盘源胎儿间充质干细胞的细胞形态图；

其中A-C是本发明中获得的间充质干细胞原代第12、15、18天的细胞形态；D是间充质干细胞第一代第3天的细胞形态；E是间充质干细胞第二代第3天的细胞形态；F是间充质干细胞第三代第3天的细胞形态；

图2：本发明中流式细胞术细胞表型分析图；

图3：本发明中细胞诱导分化图；其中A是成脂诱导分化，B是成骨诱导分化；

图4：本发明中STR检测图谱；其中A是胎儿脐带间充质干细胞(作为阳性对照)STR检测图谱，B是本发明培养的胎盘间充质干细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

本发明采用如下技术方案：一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，包括以下步骤：

1.胎盘源胎儿间充质干细胞分离方法：

1)取新鲜胎盘，经过病毒检测合格后，用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液洗去污物及血液。所述PBS缓冲液的成分为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L，pH为7.2-7.4。

2)从胎盘中将绒毛膜机械分离，分离时防止绒毛膜胎儿来源细胞与底蜕膜母体来源细胞相互污染。本发明仅采用绒毛膜，因为绒毛膜中只含有胎儿间充质干细胞，没有母体间充质干细胞，从而可以收获细胞全为单一来源的胎儿间充质干细胞。

3)胎盘绒毛膜中存在大量红细胞，需要将其去除；此时使用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液冲洗以去除大部分的红细胞。

4)将去除红细胞的胎盘绒毛膜剪碎成2-3mm³的组织块。

5)将剪碎的组织块用PBS缓冲液进行重悬，然后加入红细胞裂解液(购买自gibco,USA)室温裂解3min，进一步去除红细胞。

6)将剪碎组织加入L-DMEM培养基(购买自gibco，USA)洗涤，在500-650g条件下离心5-10min，弃上清，得到纯化的组织块沉淀。

7)在上述纯化的组织块沉淀中加入含10％-20％(体积)FBS的DMEM培养基混匀，所述组织块与含10％-20％(体积)FBS的DMEM培养基的体积比为2.5-3:1，接种至细胞培养皿中，置于37℃、5％(体积)CO₂的饱和湿度培养箱培养。本发明确定了混匀组织块时添加培养基的最佳比例，若培养基不足，细胞缺少营养，生长不好，若培养基过多，则组织块漂浮影响细胞贴壁。

8)培养24h后补加步骤7)中所述含10％-20％(体积)FBS的DMEM培养基，继续培养，每3天换一次培养基；培养至8-9天组织块周围出现梭形细胞爬出；培养至16-19天细胞达80％左右融合时进行传代培养；传代培养基为体积比为9:1的L-DMEM培养基和胎牛血清FBS；以后每3天传代一次，至第三代鉴定。

2.胎盘源胎儿间充质干细胞的成脂、成骨分化潜能及分化后鉴定：

收集体外扩增至第3代的间充质干细胞，以1×10⁴/cm²的密度接种于无菌的6孔板中，每孔加2ml上述含10％-20％(体积)FBS的DMEM培养基。细胞融合度达到70％-80％时，更换诱导分化培养基。

2.1成脂诱导分化

诱导分化培养基为含有10^-6mol/L的地塞米松，10μg/ml胰岛素，0.5mmol/L异丁基黄嘌呤(IBMX)，200μmol/L消炎痛(均为Sigma公司产品)和10％FBS的DMEM/F12培养液，每周换液2次，培养14天左右(镜下见到细胞中出现油滴)，染色镜检(PBS冲洗2次，75％酒精室温固定30min，油红O室温染色30min)。

2.2成骨诱导分化

诱导分化培养基为含有10^-7mol/L的地塞米松，10mmol/Lβ-磷酸甘油，0.05mmol/L2-磷酸抗坏血酸和10％FBS的DMEM/F12培养液，每周换液2次，培养21天左右，染色镜检(PBS冲洗1次，95％酒精室温固定30min，1％阿辛兰染色30min)。

各阶段的间充质干细胞的细胞形态、生长状况、细胞表型分析见图1、图2。如图1所示，细胞呈梭形，贴壁生长，涡旋细胞样，传代3天后细胞融合度可达80％-90％。如图2所示，细胞高表达CD44、CD105、CD146；不表达CD34、CD45、HLA-DR，符合间充质干细胞表型特征。

如图3所示，细胞在特定的诱导分化条件下，可以诱导分化为脂肪细胞、骨细胞，表明本发明所培养的细胞具有多向分化潜能。

如图4和下表所示，通过STR(short tandem repeat，短片段重复序列)检测，本发明培养的胎盘源间充质干细胞(3号样品)与胎儿的脐带间充质干细胞(2号样品)的20个STR位点100％匹配，证明本发明收获细胞全为单一来源的胎儿间充质干细胞，为细胞的临床应用提供了依据。

      

本发明改进传统的组织贴壁法，通过组织剪碎、PBS冲洗、红细胞裂解液裂解，充分去除了胎盘中的污物和红细胞，避免了污物和红细胞对间充质干细胞增殖的影响，使间充质干细胞更容易生长。

与现在常用的酶消化法相比较，以获取同样数量的间充质干细胞计算，能够明显减少成本、操作时间和细胞污染的几率，为胎盘源间充质干细胞的规模化生产提供了有力保障。

本发明所述方法不仅适用于从胎盘中分离培养间充质干细胞，还适用于脐带、脂肪、牙髓来源的间充质干细胞的分离培养，也可适用于其他组织、体液或其他动物间充质干细胞的分离培养。以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的一种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，取新鲜胎盘，经过病毒检测合格后，用缓冲液洗去污物及血液；从胎盘中分离得到绒毛膜，使用缓冲液洗去绒毛膜中的红细胞；然后将绒毛膜剪碎，用PBS缓冲液进行重悬，然后加入红细胞裂解液去除红细胞；然后加入L-DMEM培养基洗涤，离心弃上清液，在组织块沉淀中加入含10%-20%体积FBS的DMEM培养基混匀，接种后进行培养。

2.根据权利要求1所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，所述接种后培养24h后补加含10%-20%体积FBS的DMEM培养基，继续培养，每3天换一次培养基；培养至8-9天组织块周围出现梭形细胞爬出；培养至16-19天细胞达80%左右融合时进行传代培养；以后每3天传代一次，传代至第三代进行鉴定。

3. 根据权利要求1所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，所述缓冲液为含100 kU/ L 青霉素及100 mg/ L 链霉素的PBS缓冲液。

4.根据权利要求1或3所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的成分为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，pH为7.2-7.4。

5.根据权利要求1所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，将绒毛膜剪碎成2-3mm³的组织块。

6.根据权利要求1所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，所述离心的操作条件为在500-650g条件下离心5-10min。

7.根据权利要求1所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，所述组织块沉淀与含10%-20%体积FBS的DMEM培养基的体积比为2.5-3:1。

8.根据权利要求2所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，所述传代培养的培养基为L-DMEM和FBS，二者的体积比为9:1。

9.根据权利要求1或2所述一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，其特征在于，所述培养是在37 ℃、5 %体积CO₂的饱和湿度培养箱中。