CN116144583A - 一种获取人胎盘胚源干细胞的方法及应用 - Google Patents

一种获取人胎盘胚源干细胞的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人胎盘的胚源干细胞的获取方法。本发明的发明人依据人胎盘的解剖学结构和血流特点，采用从人胎盘脐带动脉端或静脉端灌注蛋白消化酶方法，使胎盘胚源部液化，液化的组织经密度梯度离心，从人胎盘的胚源组织中成功分离和纯化了大量胚胎干细胞。经流式细胞和免疫组化鉴定：细胞表面标志物CD105、CD73、CD90阳性，CD45、CD34、CD14阴性。染色体分析为胎儿染色体。为获取人源大量胚胎干细胞建立了新的方法和途径。

Description

一种获取人胎盘胚源干细胞的方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种获取人胎盘的胚源干细胞的方法及应用。
背景技术
生老病死是自然规律，千百万年来人们试图终止或逆转这个进程，但是前期人为的努力一直是徒劳的，直到上个世纪60年代人类干细胞的发现，使人们看到了曙光。干细胞是指一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，是人体组织器官的起源细胞。随着干细胞的研究深入和临床实践，大多数疑难病症有了治愈的希望，人体组织和器官衰老过程将有可能被推迟或逆转[1]。
研究表明胎盘的部分组织来源于胚胎发育早期三胚层，人胎盘的胎膜有四种类型的干细胞可以分离用于研究，分别是：羊膜上皮细胞（hAEC）、羊毛膜间充质干细胞（hAMSC）、绒毛膜间充质细胞（hCMSC）、绒毛膜滋养层细胞（hCTC）[2]。
在细胞治疗的临床应用中，间充质干细胞无疑是最佳选择。大多数研究表明治疗效果与细胞数量相关。胎盘是由胚源分和母体部分组成的器官，是产生并制造大量异体间充质干细胞的理想材料，这些干细胞理论上是可以分离的[4]。胎盘组织包括丛密绒毛膜和血管及分泌功能的滋养层细胞，丛密绒毛浸在母体部分螺旋动脉的来源血液中，用于母体和胎儿之间营养、气体和激素进行交换。胎盘固定在母体子宫的内膜上，母体部分间充质干细胞和胚源分滋养层细胞分散排布在细胞外基质中，参见图1。
多数临床研究表明干细胞具有免疫调节和组织修复的作用。同种异体干细胞与自体干细胞一样有效。在临床研究中对于接受治疗的患者，异体来源的干细胞比自体来源干细胞具有明显的数量和经济上的优势。除此之外，胎盘在胎儿出生后是废弃的，可大量供应，并且这些细胞不涉及到供体侵入性损伤以及伦理学问题[3]。
文献报道假定从胎盘绒毛膜获得的干细胞是胚胎（胎儿）源，然而，实际的干细胞研究中只有50%是胚胎干细胞，其余的为母源干细胞和混源干细胞[5，6]。
CN1548529A专利采用培养液（DMEM）灌流胎盘血管分离获得MSC，所得干细胞数量增加了，但由于仅仅是血管内残留在血管中血液的干细胞，胎盘实体组织中干细胞无法分离，因此这种方式获得的细胞数量仍不能满足临床需要。
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发明内容
本发明的目的是提供一种胎胚胚胎源干细胞的提取方法，其没有经过体外增殖、数量可观、状态原始、种类较多。
本发明的技术方案详述如下：
第一方面，本发明提供了一种获取人胎盘胚源干细胞的方法，由胎盘脐带的血管端灌注蛋白消化酶，使胎盘的胚源组织液化，液化的组织经密度梯度离心方法分离和纯化获取不同类型的胚胎干细胞。
上述方法中，所述的灌注蛋白消化酶，是指灌注包含了蛋白消化酶的液体，除蛋白消化酶外，也可以增加其他有利成分，例如缓冲盐、DNA酶等。所述蛋白消化酶，是指可使蛋白水解的溶酶，本发明方法使用蛋白消化酶的目的是将细胞从组织中解离出来，在实际应用中，可根据不同需求进行选择添加。
可选或优选的，上述方法中，所述脐带血管端是脐带动脉端或脐带静脉端。
可选或优选的，上述方法中，在灌注蛋白消化酶前，还包括灌注清洗步骤，具体是用含有抗凝血药物液体从期待血管端灌注使胎盘血管内的血液流出，直至胎盘无血色。
可选或优选的，上述方法中，所述液化的组织在进行密度梯度离心前，还经过过滤和清洗的步骤。
可选或优选的，上述方法中，所述蛋白消化酶包括但不限于：（pronase）、Ⅰ型胶原酶（collagenase Ⅰ）、Ⅱ型胶原酶（collagenase Ⅱ）、Ⅲ型胶原酶（collagenase Ⅲ）、Ⅳ胶原酶（collagenase Ⅳ）、胰蛋白酶（trypsin）中的一种或几种。
可选或优选的，上述方法中，所述液化的组织在进行密度梯度离心前还包括添加DNA酶（DNase）继续消化的步骤。有利于使相互粘附的细胞进一步分离，成为游离状态细胞。
可选或优选的，上述方法中，所述密度梯度离心方法是使用细胞分离液纯化细胞，所述细胞分离液包括但不限于以下任何一种：胚胎间充质干细胞（hEMSC）分离液、羊膜上皮细胞（hAEC）分离液、绒毛膜细胞滋养层细胞（hCTC）分离液、血管内皮细胞（EPC）分离液。
密度梯度离心法是针对不同细胞的大小和密度差异进行分选的方法，上述方法中，根据所要获取的干细胞种类，选择适配的细胞分离液进行密度梯度离心即可获得相应种类的胚胎干细胞。
可选或优选的，上述方法中，所述胚胎干细胞包括但不限于以下任何一种：胚胎间充质干细胞（hEMSC，human Embryo Mesenchymal Stem Cell）、羊膜上皮细胞（hAEC，humanAmniotic Epithelial Cell）、绒毛膜细胞滋养层细胞（hCTC，human ChorionicTrophoblast Cell）、血管内皮细胞（EPC，Endothelial Progenitor Cell）。
第二方面，本发明提供了采用上述方法获得的胚胎干细胞在制备实验室用试剂或临床疾病治疗药物中的应用。
可选或优选的，上述应用中，所述实验室用试剂应用于以下任一研究方向：胚胎干细胞分化、胚胎干细胞逆分化、细胞损伤修复、细胞组织工程、抗衰老。
可选或优选的，上述应用中，所述疾病包括但不限于以下任意一种：肿瘤、骨关节疾病、牙疾病、眼疾病。
第三方面，本发明还提供了采用上述方法获得的胚胎干细胞在制定干细胞标准中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、应用本发明方法可以充分获取没有经过体外细胞增殖的细胞，即数量可观的原始状态的原代多种干细胞，这些细胞为胚胎源的多能干细胞，有利于细胞分化多向性研究和临床实践。
2、本发明方法获取的干细胞保持了干细胞遗传物质DNA稳定性及稳定的细胞表型，有利于分类研究和相关临床应用。
3、应用本发明方法，通过不同的细胞分离液进行密度梯度离心可分类获取多个细胞发育阶段干细胞：造血干细胞、周细胞干细胞、卵黄囊滋养层细胞等，不限于上述种类的细胞，还有许多目前研究没有认知到的早期发育细胞，为分别进行研究和临床实践创造了条件。
4、应用本发明方法减少了干细胞分离过程带来细胞损伤，有利于研究和临床实践。
5、应用本发明方法获取分离的干细胞，排除了母体部分（蜕膜）来源的干细胞，即为纯净胚胎源干细胞，细胞更具有增殖分化能力。
6、应用本发明方法获取干细胞方法学稳定，有利于研究和应用标准化，临床的应用和推广。
7、应用本发明方法获取的细胞为胎盘多种类型胚胎干细胞。胎盘作为胚早期生长发育的孵育器官，细胞的相互作用是发育成不同组织和器官的必要基础条件，例如血细胞发生于卵黄囊滋养层细胞。本发明方法提供了多类型细胞分化实现的可能性。
附图说明
图1为胎盘不同组织结构示意图；
图2为实施例1提取的干细胞核型分析结果图。
具体实施方式
下面结合较佳的实施例对本发明技术方案进行详细解释和说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施。
实施例1
1、设备、器具、材料和试剂
设备：二氧化碳培养箱（Thermo），恒温摇床(WB-1010A Water Bath)，流式细胞仪(Becton Dick-inson)，倒置显微镜(OLYMPUS CKX53)，离心机(Thermo)，蒸汽灭菌器(Tuttnauer)，万级的实验室和百级净化台，干热烘箱，常温冰箱，蠕动泵，恒温水浴箱(均为国产)。
常规湿热灭菌器械工具，包括刀、剪、镊和盘，无菌器皿，无菌袋、硅胶管、灌注双头针、离心管、培养瓶（75、175ml）。
材料：胎盘来源于某医院产科，正常足月顺产产妇的胎盘，胎盘所属胎儿健康，且在分娩后1小时之内被收集。经医院伦理委员会同意并备案，产妇签署知情同意书。经母血检测HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性。
试剂：DMEM/1640干粉培养基或间充质干细胞液体培养基，I型胶原酶(collagenase)，链霉蛋白酶(pronase)，胰蛋白酶(trypsin)， Nycodenz 均为 Sigma公司产品。双抗，CD73抗体、CD90抗体、CD105抗体、CD34抗体、CD14抗体、CD45抗体，男性Y抗体。
液体的制备
D-Hanks液配制（g/L）
每升注射用水含：CaCl20.4g，KH2PO40.06g，NaCl 8.0g，NaHCO20.35g，NaH2PO40.06g，酚红0.002g。
消化酶液配制
（1）2000ml D-Hanks液加pronase 2g，collagenase 1g，制成含0.1% pronase、0.05% collagenase的2000ml液体。
（2）400ml D-Hanks液加pronase 0.4g，collagenase 0.2g，DNase 0.04g，配制成内含protein0.1%、collagenase0.05%、DNase 0.01%的400ml液体。
密度梯度分离液（细胞分离液）配制
200ml D-Hanks液加入Nycodenz 36g。
干细胞培养液：间充质细胞培养基。
设备和器具洁净和无菌化处理。
2、胎盘中的胚胎源干细胞提取
（1）胎盘获取
随着胎儿娩出母体的胎盘入无菌20×28 cm自封袋中，置于直径15cm的深10cm盘中，羊膜面向上，脐带位于中央。
（2）动脉插管
截去过长脐带，硅胶三通管连接的两个18号针头（去尖）分别插入脐动脉，结扎牢固。
（3）三通管另一端与2000ml下口瓶相连，灌注液用D-hanks液1500ml（内含肝素12500单位），蠕动泵70ml/min，原位灌注在脐静脉端破口，便于液体流出，胎盘无血色后换蛋白消化酶剂。
（4）蛋白消化酶剂原位消化
D-Hanks液配制2000ml酶液（内含0.1%pronase, 0.05 collagenase），水浴至37℃，蠕动泵70ml/min，灌注至蛋白消化酶剂消耗尽，胎盘的胚胎源组织彻底液化了，将液化组织吸入500ml 三角烧瓶中，按收获体积溶入0.01%DNase。（5）三角烧瓶置入37℃恒温摇床，200r/min30分钟继续消化。
（6）经继续消化的三角烧瓶中液体通过200目滤网，过滤至4支50ml离心管中。
（7）离心重力500g，5min，取上清液，重新加入适量 D-Hanks液，吹悬起细胞，再次离心，此过程重复三遍，细胞悬液透明为止。
（8）密度梯度离心
含Nycodenz18%的D-Hanks与细胞混匀，轻轻覆盖15mm的D-Hanks液，离心重力500g，30min，取中间膜层，溶于培养液中。
（9）细胞培养及应用
镜下调整细胞数500/ml，培养，培养条件为5%二氧化碳，37℃。
3、干细胞鉴定
细胞表型分类：镜下观察离心管底部细胞根据细胞形态特征发现还有细胞滋养层细胞、血管周细胞。
用流式细胞仪对所获干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105，CD34、CD14、CD45分析，结果显示：CD105、CD73、CD90阳性，CD45、CD34、CD14阴性，为间充质干细胞。
对所获细胞进行核型分析，结果显示为胎儿染色体（性染色体为XY），参见图2。
通过上述方法我们获得了胚源绒毛膜间充细胞。
结果表明，通过脐动脉将蛋白消化酶灌注的方法，获得的干细胞均来自于胎盘的胚源，细胞具有广泛的试验前景和临床应用前途。
实施例2
与实施例1相同，不同之处如下：
（4）蛋白消化酶剂原位消化
蛋白消化酶剂采用含有0.25%的胰蛋白酶（trypsin）的D-Hanks液。配制方法是2000ml D-Hanks液加入胰蛋白酶5g。
结果表明，通过脐动脉将蛋白消化酶灌注的方法，获得的干细胞均来自于胎盘的胚源，细胞具有广泛的试验前景和临床应用前途。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种获取人胎盘胚源干细胞的方法，其特征是，由胎盘脐带的血管端灌注蛋白消化酶，使胎盘的胚源组织液化，液化的组织经密度梯度离心方法分离和纯化获取不同类型的胚胎干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述脐带血管端是脐带动脉端或脐带静脉端。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述蛋白消化酶包括但不限于：链霉蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、Ⅳ胶原酶、胰蛋白酶中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述密度梯度离心方法是使用细胞分离液纯化细胞，所述细胞分离液包括但不限于以下任何一种：胚源间充质干细胞分离液、羊膜上皮细胞分离液、绒毛膜细胞滋养层细胞分离液、血管内皮细胞分离液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述胚胎干细胞包括但不限于以下任何一种：胚胎间充质干细胞、羊膜上皮细胞、绒毛膜细胞滋养层细胞、血管内皮细胞。
6.权利要求1所述的方法获得的胚胎干细胞在制备实验室用试剂或临床疾病治疗药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述实验室用试剂应用于以下任一研究方向：胚胎干细胞分化、胚胎干细胞逆分化、细胞损伤修复、细胞组织工程、抗衰老。
8.根据权利要求6所述的应用，所述疾病包括但不限于以下任意一种：肿瘤、骨关节疾病、牙疾病、眼疾病。
9.权利要求1所述的方法获得的胚胎干细胞在制定干细胞标准中的应用。
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