CN104928234A - 一种提取胎盘多种干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞及组织工程领域，特别是一种提取胎盘多种干细胞的方法。针对现有胎盘多种干细胞提取中存在的问题与不足，本发明的目的是提供一种提取胎盘多种干细胞的方法,克服现有技术中存在的问题。其解决问题的技术方案是：一种提取胎盘多种干细胞的方法,由以下步骤组成：步骤一、胎盘收集前的处理：步骤二、胎盘的实验室处理：三、细胞处理阶段：步骤四、细胞进行质检：这个方法比较简单易行,不但可以得到胎盘干细胞，也可以通过消化等手段，从已经分离过胎盘干细胞的胎盘组织中，分离另外三种干细胞，即造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞。

Description

一种提取胎盘多种干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞提取领域,特别是一种提取胎盘多种干细胞的方法。

背景技术

胎盘中含有多种干细胞，包括间充质干细胞、造血干细胞、内皮干细胞和未知功能的多潜能干细胞等。

间充质干细胞，英文名称为mesenchymal stem cells(MSC)，也有其它名称，如骨髓基质细胞、脂肪干细胞、多潜能基质细胞等，是指单个或一群符合国际统一标准的细胞(Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,Slaper-Cortenbach I,Marini F,Krause D,Deans R,Keating A,Prockop Dj,Horwitz E.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromalcells.The International Society for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy,2006；8(4):315-7)。间充质干细胞存在于多种组织和器官中，包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘、肝脏、脑、骨质等，体内外均具有向骨、软骨和脂肪组织分化的能力，具有免疫调节、造血支持、促血管新生等作用。

造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源，它不仅可以分化为红细胞、白细胞、和血小板，还可以跨系统分化为各种组织器官的细胞，具有自我更新多向分化和归巢潜能。一般造血干细胞来源于三个渠道：骨髓造血干细胞；外周血造血干细胞；脐带血造血干细胞。

内皮干细胞排列在机体所有血管的内表面，不论是在胚胎还是在成体哺乳动物中，特异的内皮干细胞(endothelium stem cell)都很难鉴定。在胚胎发育过程中，受精卵形成原肠胚之后，中胚层来源的成血管细胞被认为是造血干细胞和内皮细胞的祖细胞。这个时期形成的由卵黄囊血岛构成的胚胎脉管系统是暂时的，但成血管细胞还没有从胚胎中分离出来，它们是否存在还是个问题。

胚胎中新血管的形成叫作血管发生(vasculogenesis)。

在成体中，从先前存在的血管形成血管的过程叫作血管生成(angiogenesis)。

成血管细胞存在的证据来自于鼠胚胎干细胞体外分化的研究，这些研究表明：一个来源于小鼠ES细胞并且能表达Flk-1(小鼠血管内皮细胞生长因子受体，VEGF)的祖细胞能形成血细胞和血管细胞。VEGF和FGF-2在体内内皮细胞分化中起重要作用。

报道称骨髓中含有一些细胞，这些细胞能在因血氧缺乏造成的缺血组织中形成新血管，但还不知道是骨髓中的哪些细胞诱导血管的发生。胎盘是胎儿和母亲血液交换的场所，含有非常丰富的血液微循环。人在母亲子宫内发育的阶段，胎盘是首先形成的器官之一。这表明在胚胎干细胞的发育、分化过程中，在胎盘中滞留有大量的早期干细胞，而且很有可能这些干细胞在胎盘内继续保持着造血干细胞的能力。

在探求诱导血管发生细胞的实验中，研究者发现在成人骨髓中含有类似胚胎成血管细胞的细胞，因此称其为内皮干细胞。将人骨髓来源的细胞通过尾静脉注入心肌缺血模型的大鼠，发现人的细胞迁移至鼠的心脏，而且在血管梗塞部位形成新的血管(类似血管形成的过程)，这也说明人骨髓来源的细胞能诱导血管发生。

内皮干细胞是CD34+(一个HSC的标志)，也表达转录因子GATA-2。用转入绿色荧光蛋白基因(示踪细胞)的小鼠进行同样的实验，发现骨髓衍生的细胞能够进入小鼠缺血的心肌区域，生成血管并整合人宿主组织的心肌细胞。

本发明涉及一种提取胎盘多种干细胞的方法，所获得的干细胞统称为胎盘干细胞。它是一个干细胞群，包括造血干细胞、内皮干细胞和间充质干细胞等。更为重要的是，细胞群中也包括胚胎干细胞样细胞；也就是说，这种干细胞的功能近似于胚胎干细胞。我们称之为类胚胎干细胞(embryonic-like stemcells，ELS细胞)。

发明内容

利用本方法分离的干细胞，可以表达胚胎干细胞特有的标记，如OCT-4，这是间充质干细胞和造血干细胞所不具备的标记，另外，这群细胞中，部分细胞表达CD133和CD34，两者是造血干细胞和内皮祖细胞的标记。

一种提取胎盘多种干细胞的方法,由以下步骤组成：

步骤一、胎盘收集前的处理：

胎盘娩出后十五分钟，结扎脐带,吸取50ml胎盘抗凝液，装置静脉插管接头，缓慢向胎盘注射,有少量血液从动脉流出即可,立即用血管夹夹住脐带，位置是胎盘上5厘米,夹紧后，轻轻颠倒胎盘数次，检查胎盘完整性，并使液体混匀；将胎盘放入胎盘保存液中，置于运输箱，温度在20度左右为宜；

步骤二、胎盘的实验室处理：

使用碘伏消毒脐带及胎盘表面；生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次；将脐带置于相对高处，高度20cm-30cm之间；打开血管夹，插入静脉导管和动脉导管，连接灌洗液瓶和细胞收集瓶及蠕动泵，进行第一次灌注，液体量在100ml-200ml左右，大部分血液流出，流出的液体变浅，夹住静脉导管，挤压胎盘，使残存血液流出，此时收集的细胞主要是造血干细胞，如果处理得当，此时收集的造血干细胞量相当于一个脐血单位，打开静脉导管，夹住动脉导管，将干细胞动员剂灌入胎盘，用量不超过100ml，将动脉导管和静脉导管夹住，将导管放入胎盘处理盒，将盒子放入37度培养箱，静置2小时；取出，放入超净台，连接动静脉导管、灌洗液瓶和细胞收集瓶；缓慢灌装，当收集的液体透明，说明所有的细胞均已收集，灌洗液用量500ml-800ml，停止灌洗。步骤三、细胞处理阶段：

将收集的细胞悬液大约1L，离心速度为600g，10分钟，离心去除大量的液体，用alpha-MEM悬浮细胞沉淀，利用3％醋酸计数有核细胞数；调整细胞浓度为1×10⁷/ml左右，淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单个核细胞，同时，去除细胞碎片，离心速度为800g，20分钟，离心洗涤；810g，10分钟；使用生理盐水离心洗涤，500g，10分钟，使用生理盐水；利用冻存液悬浮，常规方法冷冻；

步骤四、细胞进行质检：

流式细胞学分析：部分细胞表达CD133和CD34造血干细胞和内皮祖细胞标志物，PCR，可检测到胚胎干细胞特有标记OCT-4表达。

利用本方法分离的干细胞，可以表达胚胎干细胞特有的标记，如OCT-4，这是间充质干细胞和造血干细胞所不具备的标记；另外，这群细胞中，部分细胞表达CD133和CD34，两者是造血干细胞和内皮祖细胞的标记。

这个方法比较简单易行,不但可以得到胎盘干细胞，也可以通过消化等手段，从已经分离过胎盘干细胞的胎盘组织中，分离另外三种干细胞，即造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞。

所有实验均在相对无菌条件下进行。

胎盘收集前的处理：这是整个实验成败的关键,应在胎盘娩出后十几分钟内注射胎盘抗凝液。

获取这群干细胞的关键因素是胎盘的处理，即胎盘娩出后，在收集胎盘前，助产士必须对胎盘进行适当的处理；否则，无法开展后续实验工作。

另外，最好在24小时内收集胎盘及时处理，以保证细胞活性,在运输过程中，胎盘最好储存在20℃左右，浸泡在含抗生素和抗凝剂的培养液中。

另外，冲洗液中加入了趋化因子SDF-1 alpha(基质细胞衍生因子)，剂量为50ng/ml,目的在于促进胎盘组织中的干细胞迁徙至血管中，从而获得更多的干细胞。

为保存胎盘干细胞，将获得的细胞进行适当的处理是必需的。

具体实施方式

以下结合实施例对发明的内容作出详细的说明

实施利1

需要材料

1.器材：

(1)蠕动泵:速蠕动泵速度较快，不便于操作，低速蠕动泵，效果更好；

(2)医疗用带盖不锈钢桶储存和运输胎盘用；

(3)静脉穿刺置管套装。

有两个目的，一个用于在胎盘刚娩出后，吸取含抗凝剂-抗生素的培养基，沿脐带静脉注射；

另一个带管的装置，用于后续实验室操作中，一端插入脐带静脉中，丝线固定后，用于冲洗。

(3)血管导管注射接头

脐带有两条动脉和一条静脉；用静脉穿刺管将脐静脉穿刺，固定，另一端连接液体，用于冲洗；而两条动脉需要两根动脉导管，一端插入脐带动脉，丝线固定后，将另一端插入空的冲洗液收集容器内；由装冲洗液体的容器、蠕动泵、静脉穿刺针及其导管、胎盘、动脉导管、接收冲洗液体的容器，就可以组成一个完整的冲洗路线；连接顺序为1、装冲洗液的容器(不含干细胞的培养基)，可用1L的培养基瓶；2、蠕动泵；3、静脉插管管道及插管接头；4、脐带静脉；5、胎盘；6、动脉插管管道及接头；7、装已经冲洗的液体(含干细胞的培养基)。

(4)注射器(50ml，10ml)若干。

2.胎盘抗凝液

在胎盘刚刚娩出时，沿脐带静脉向胎盘组织中注射的培养基，目的在于：

(1)保证胎盘中的血液不凝固；

(2)提供一个相对杀菌环境；

(3)保证胎盘血管中细胞的活性。

胎盘抗凝液应至少包括三种成分：

(1)抗生素，青霉素、链霉素和两性霉素B，用量分别为100U/ml，100ug/ml和10ug/ml；

(2)肝素：临床用肝素钠，终浓度为50U/ml；

(3)培养基：可用IMDM，alpha-MEM。每个胎盘注射量为50ml±5ml；注射后立即用血管夹，在靠近胎盘侧夹住脐带，避免液体漏出。

3、胎盘保存液：

胎盘抗凝液，但是肝素用量减至10U/ml。或用盐水或PBS，加入抗生素和肝素。

4、灌洗液：

成份为alpha-MEM基础培养基、抗生素、肝素(10U/ml)；

初次灌洗用量为100-200ml左右；

后续用量在500ml左右，一个胎盘用量500-1000ml。

5.胎盘干细胞动员剂：

成分为在灌洗液基础上加入趋化因子SDF-1alpha，终浓度为50ng/ml，一般用量为一个胎盘100±5ml。

6.其它材料：

淋巴细胞分离液，比重为1.077g/ml；刻度吸管，镊子等细胞培养必需用品；70um细胞筛；胎盘注射液：抗凋亡因子(N-乙酰丝氨酸，NAC)

一种提取胎盘多种干细胞的方法,由以下步骤组成：

步骤一、胎盘收集前的处理：

胎盘娩出后十五分钟，结扎脐带,吸取50ml胎盘抗凝液，装置静脉插管接头，缓慢向胎盘注射,有少量血液从动脉流出即可,立即用血管夹夹住脐带，位置是胎盘上5厘米,夹紧后，轻轻颠倒胎盘数次，检查胎盘完整性，并使液体混匀；将胎盘放入胎盘保存液中，置于运输箱，温度在20度左右为宜；

步骤二、胎盘的实验室处理：

使用碘伏消毒脐带及胎盘表面；生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次；将脐带置于相对高处，高度20cm-30cm之间；打开血管夹，插入静脉导管和动脉导管，连接灌洗液瓶和细胞收集瓶及蠕动泵，进行第一次灌注，液体量在100ml-200ml左右，大部分血液流出，流出的液体变浅，夹住静脉导管，挤压胎盘，使残存血液流出，此时收集的细胞主要是造血干细胞，如果处理得当，此时收集的造血干细胞量相当于一个脐血单位，打开静脉导管，夹住动脉导管，将干细胞动员剂灌入胎盘，用量不超过100ml，将动脉导管和静脉导管夹住，将导管放入胎盘处理盒，将盒子放入37度培养箱，静置2小时；取出，放入超净台，连接动静脉导管、灌洗液瓶和细胞收集瓶；缓慢灌装，当收集的液体透明，说明所有的细胞均已收集，灌洗液用量500ml-800ml，停止灌洗。步骤三、细胞处理阶段：

将收集的细胞悬液大约1L，离心速度为600g，10分钟，离心去除大量的液体，用alpha-MEM悬浮细胞沉淀，利用3％醋酸计数有核细胞数；调整细胞浓度为1×10⁷/ml左右，淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单个核细胞，同时，去除细胞碎片，离心速度为800g，20分钟，离心洗涤；810g，10分钟；使用生理盐水离心洗涤，500g，10分钟，使用生理盐水；利用冻存液悬浮，常规方法冷冻；

步骤四、细胞进行质检：

流式细胞学分析：部分细胞表达CD133和CD34造血干细胞和内皮祖细胞标志物。

Claims (1)

1.一种提取胎盘多种干细胞的方法,由以下步骤组成：

步骤一、胎盘收集前的处理：

胎盘娩出后十五分钟，结扎脐带,吸取50ml胎盘抗凝液，装置静脉插管接头，缓慢向胎盘注射,有少量血液从动脉流出即可,立即用血管夹夹住脐带，位置是胎盘上5厘米,夹紧后，轻轻颠倒胎盘数次，检查胎盘完整性，并使液体混匀；将胎盘放入胎盘保存液中，置于运输箱，温度在20度左右为宜；

步骤二、胎盘的实验室处理：

使用碘伏消毒脐带及胎盘表面；生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次；将脐带置于相对高处，高度20cm-30cm之间；打开血管夹，插入静脉导管和动脉导管，连接灌洗液瓶和细胞收集瓶及蠕动泵，进行第一次灌注，液体量在100ml-200ml，大部分血液流出，流出的液体变浅，夹住静脉导管，挤压胎盘，使残存血液流出，此时收集的细胞主要是造血干细胞，如果处理得当，此时收集的造血干细胞量相当于一个脐血单位，打开静脉导管，夹住动脉导管，将干细胞动员剂灌入胎盘，用量不超过100ml，将动脉导管和静脉导管夹住，将导管放入胎盘处理盒，将盒子放入37度培养箱，静置2小时；取出，放入超净台，连接动静脉导管、灌洗液瓶和细胞收集瓶；缓慢灌装，当收集的液体透明，说明所有的细胞均已收集，灌洗液用量500ml-800ml，停止灌洗。步骤三、细胞处理阶段：

将收集的细胞悬液大约1L，离心速度为600g，10分钟，离心去除大量的液体，用alpha-MEM悬浮细胞沉淀，利用3％醋酸计数有核细胞数；调整细胞浓度为1×10⁷/ml左右，淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单个核细胞，同时，去除细胞碎片，离心速度为800g，20分钟，离心洗涤；810g，10分钟；使用生理盐水离心洗涤，500g，10分钟，使用生理盐水；利用冻存液悬浮，常规方法冷冻；

步骤四、细胞进行质检：

流式细胞学分析：部分细胞表达CD133和CD34造血干细胞和内皮祖细胞标志物，PCR，可检测到胚胎干细胞特有标记OCT-4表达。